JP2018509406A

JP2018509406A - フィロウイルス感染症の処置のための方法及び医薬組成物

Info

Publication number: JP2018509406A
Application number: JP2017545722A
Authority: JP
Inventors: アムラーヌ，サミール; メルニー，ジャン−ルイ; ベドラ，アミナ
Original assignee: アンスティチュナショナルドゥラサンテエドゥラルシェルシュメディカル; ユニヴェルシテ・ドゥ・ボルドー
Priority date: 2015-03-11
Filing date: 2016-03-10
Publication date: 2018-04-05
Also published as: US10160970B2; EP3268473B1; WO2016142449A1; US10435691B2; EP3268473A1; US20180051288A1; US20190062750A1; ES2797085T3

Abstract

本発明は、フィロウイルス感染症の処置のための方法及び医薬組成物に関する。特に、本発明は、フィロウイルス感染症を処置する必要のある対象において該処置を行う方法であって、対象に、配列番号：１〜配列番号：１５に示される配列を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドの治療有効量を投与することを含む方法に関する。

Description

発明の分野：
本発明は、フィロウイルス感染症の処置のための方法及び医薬組成物に関する。

発明の背景：
フィロウイルス科（フィロウイルス）は、線維状の感染性ウイルス粒子（ビリオン）を形成し、一本鎖ネガティブセンスＲＮＡの形態でゲノムをコードする、いくつかの関連ウイルスの分類学上の母体（home）である。一般的に知られているこのファミリーの２つのメンバーは、エボラウイルス及びマールブルグウイルスである。両方のウイルス及びそれらのあまり知られていない類縁ウイルスのいくつかが、ヒト及び非ヒト霊長類に重篤な疾患をウイルス性出血熱の形で引き起こす。エボラウイルスは、アフリカのザイールにあるエボラ川にちなんで名付けられた。ザイールのヤンブク（現在のコンゴ民主共和国）及び西スーダンのンザラの両方での重大な大発生の後、１９７６年にNgoy Mushola博士によってエボラ側の近くでの最初の大発生が注目された。ヒトに致命的疾患を引き起こす異なる３種のエボラウイルス：ザイールエボラウイルス（ＺＥＢＯＶ）（ＥＢＯＶとしても公知）、スーダンエボラウイルス（ＳＥＢＯＶ）及びアイボリーコーストエボラウイルス（ＩＣＥＢＯＶ）がある。エボラウイルスは、ヒトの間で血液などの感染した体液と直接接触することにより伝染する。エボラウイルス感染の潜伏期間は２日から４週間まで変動する。症状も可変であるが、発生は、通常、突然で、高熱、虚脱、筋痛、関節痛、腹痛及び頭痛によって特徴付けられる。これらの症状は、共存する壊死、タンパク尿、並びに内出血及び通常は消化管を通した外出血の両方により嘔吐、下痢、口咽頭病変、結膜炎、臓器障害（特に腎臓及び肝臓）に進行する。死亡又は回復期までの回復は、総合的症状の発生から６〜１０日以内に起こる。いくつかの抗ウイルス剤がエボラウイルス感染症に対してインビトロ又は動物モデルにおいて有効性を示したものの、エボラウイルス疾患のヒトにおいて評価された抗ウイルス剤は、まだほとんどない。したがって、当技術分野において、エボラウイルス疾患に対する有効な治癒的処置の膨大な必要性が存在する。

発明の概要：
本発明は、フィロウイルス感染症の処置のための方法及び医薬組成物に関する。特に、本発明は、特許請求の範囲により定義される。

発明の詳細な説明：
本発明は、フィロウイルス感染症を処置する必要のある対象において該処置を行う方法であって、対象に、配列番号：１〜配列番号：１５に示される配列を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドの治療有効量を投与することを含む方法に関する。

用語「フィロウイルス」は、エボラウイルス及びマールブルグウイルスを含むフィロウイルス科の一本鎖（−）ＲＮＡウイルスのメンバーを総称的に表す。本明細書に使用する用語「エボラウイルス」は、フィロウイルス科のメンバーを表し、ヒト及び非ヒト霊長類における高致死性出血熱の大発生と関連する。ヒト病原体には、エボラザイール、エボラスーダン、及びエボラアイボリーコーストが含まれる。エボラレストンはサル病原体であり、重大なヒト病原体と見なされていない。本発明のいくつかの実施態様では、該エボラウイルスは、アイボリーコーストエボラウイルス（ＩＣＥＢＯＶ）、ザイールエボラウイルス（ＺＥＢＯＶ若しくはＥＢＯＶ）、スーダンエボラウイルス（ＳＥＢＯＶ）、又はエボラウイルスの新しい株若しくは種である。

本発明の方法は、フィロウイルス疾患、特にエボラウイルス疾患の処置に特に適している。以前はエボラ出血熱として公知であった、本明細書に使用される用語「エボラウイルス疾患」（ＥＶＤ）は、重篤で、しばしば致命的なヒトの病気である。ウイルス感染から症状発生までの時間間隔である潜伏期間は、２〜２１日である。ヒトは、症状を発現するまで感染性ではない。最初の症状は、熱疲労、筋痛、頭痛及び咽喉炎の突然の発生である。これに、嘔吐、下痢、発疹、腎及び肝機能障害の症状、並びに場合により、内出血及び外出血の両方（例えば歯肉からの滲出、血便）が続く。検査所見には、低い白血球数及び血小板数並びに上昇した肝酵素が含まれる。

本明細書に使用される用語「処置」又は「処置する」は、予防的又は防止的処置と、該疾患に罹患するリスクがある又は罹患した疑いのある対象だけでなく、病気である又は疾患若しくは病状を患っていると診断された対象の処置を含む、治癒的又は疾患修飾的処置との両方を表し、臨床的再発の抑制を含む。処置は、障害若しくは再発性の障害の１つ以上の症状を予防する、治癒する、発生を遅延させる、重篤度を低下させる、若しくは改善するために、又はそのような処置の不在下で予期されるものを超えて対象の生存を延長するために、医学的障害を有する対象又は最終的に障害を獲得し得る対象に施される場合がある。「治療方式」は、病気の処置パターン、例えば、治療の間に使用される投薬パターンを意味する。治療方式は、導入方式及び維持方式を含み得る。語句「導入方式」又は「導入期間」は、疾患の初回処置のために使用される治療方式（又は治療方式の部分）を表す。導入方式の一般的な目標は、処置方式の初期期間に対象に高レベルの薬物を提供することである。導入方式は、（部分的又は全体的に）「負荷方式」を採用する場合があり、負荷方式は、医師が維持方式の間に採用するよりも大きな用量の薬物を投与すること、医師が維持方式の間に薬物を投与するよりも頻繁に薬物を投与すること、又はその両方を含む場合がある。語句「維持方式」又は「維持期間」は、病気の処置の間に対象の維持のために、例えば対象を長期間（数ヶ月又は数年）寛解状態に保つために、使用される治療方式（又は治療方式の部分）を表す。維持方式は、連続療法（例えば、薬物を規則的な間隔で、例えば、毎週、毎月、毎年などに投与すること）又は間欠療法（例えば、中断処置、間欠処置、再発時処置、又は特定の予め決定された基準に達したときの処置［例えば、疾患出現など］）を採用する場合がある。

いくつかの実施態様では、対象は、感染している、又はフィロウイルスに感染するリスクがある。診断は、任意の適切な手段により行われ得る。当業者は、本発明により処置されるべき対象が、標準的な検査を使用して同定される場合があり、又は試験なしに、１つ以上のリスク因子の存在（例えばエボラウイルスの曝露など）により高リスクの対象として同定された場合があることを理解している。いくつかの実施態様では、対象は、感染しているが、無症候性である（すなわち症状が検出されない）。いくつかの実施態様では、診断は、当業者が精通する任意の方法により対象から得られた試料中のフィロウイルスのウイルス性核酸を検出することにより行われる。そのような方法は、典型的にはフィロウイルスのウイルス性核酸の発現を検出することに基づく方法を含む。フィロウイルスの核酸は、ＲＮＡ試料中から好ましくは増幅後に検出され得る。例えば、単離されたＲＮＡが、フィロウイルスの核酸（例えば核タンパク質（ＮＰ）及び４つのビリオン構造タンパク質（ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、及びＶＰ２４）をコードする核酸など）に特異的な、特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、共役した逆転写及び増幅、例えばポリメラーゼ連鎖反応による逆転写及び増幅（ＲＴ−ＰＣＲ）に供される場合がある。例えば、ＲＴ−ＰＣＲアッセイ法は、フィロウイルスの臨床的及び／又は疫学的基準（例えば、フィロウイルスに関連する臨床徴候及び症状、フィロウイルスの高度疑い例又は確定例との接触、フィロウイルス例が検出された地理的位置への旅行歴、又は公衆衛生調査の一環としてフィロウイルス検査が指示され得る他の疫学的接点）に合致する個体からの全血、血清、血漿、及び尿を含む臨床標本からのフィロウイルスＲＮＡのインビトロ定性的検出のために意図される。

いくつかの実施態様では、本発明は、配列５’−ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧ−３’（配列番号：１）を有し、ＧＲ０２６Ｂ及びＡＧＲＯ１００としても公知のＡＳ１４１１（国際公開公報第２００９０９８４６４号に記載）の使用を考えている。ＡＳ１４１１は、未修飾のホスホジエステル結合を有する２６塩基長のＤＮＡアプタマーであり、血清酵素による分解に耐性の（Dapic, V. et al. 2002）Ｇ四重鎖構造を形成する（Dapic, V. et al. 2003）。

本発明のさらなる態様は、配列番号：２〜配列番号：１５に示される配列を含むオリゴヌクレオチドに関する。

本発明における使用のために、本発明のオリゴヌクレオチドは、当技術分野において周知のいくつかの手順のいずれかを使用してデノボ合成される。化学合成は、市場で入手可能な多様な自動核酸合成装置によって行うことができる。これらの核酸は、合成核酸と呼ばれ得る。あるいは、本発明のオリゴヌクレオチドを、プラスミド中に大規模に製造することができる。本発明のオリゴヌクレオチドを、制限酵素、エキソヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼを採用する技法などの公知の技法を使用して、既存の核酸配列から調製することができる。

別の実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ナノパーティクル−オリゴヌクレオチド結合体を形成させるために、ナノパーティクルと結合される。いくつかの実施態様では、ナノパーティクルは、国際公開公報第２００５１１３８１７号、Dam et al., 2015及びMalik et al., 2015に記載されているような金、銀、銅及び白金などの金属粒子である。

「治療有効量」は、フィロウイルス感染症を、任意の医学的処置に適用可能な合理的なベネフィット／リスク比で処置するために十分な本発明のオリゴヌクレオチドの量を意味する。本発明の化合物及び組成物の１日合計使用量は、担当医師により健全な医学的判断の範囲内で決定されることが理解されている。任意の特定の対象に特異的な治療有効用量のレベルは、処置される障害及び障害の重篤度；採用された特定の化合物の活性；採用された特定の組成物、対象の年齢、体重、全身の健康状態、性別及び食事；投与時間、投与経路、及び採用された特定の化合物の排泄速度；処置の持続時間；採用された特異的ポリペプチドと組み合わせて又は同時に使用される薬物；並びに医術において周知の同様の要因を含む多様な要因に依存する。例えば、所望の治療効果を達成するために必要な用量よりも低いレベルで化合物の用量を開始し、所望の効果が達成されるまで投薬量を徐々に増加させることは、十分に当業者の技能の範囲内である。しかし、製品の１日投薬量は、成人１人あたり１日０．０１〜１，０００mgの広い範囲を変動し得る。好ましくは、組成物は、処置されるべき対象への投薬量を症候から調整するために活性成分０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０及び５００mgを含有する。医薬は、典型的には活性成分約０．０１mg〜約５００mg、好ましくは活性成分１mg〜約１００mgを含有する。薬物の有効量は、通常、１日あたり０．０００２mg/kg体重〜約２０mg/kg体重、特に１日あたり約０．００１mg/kg体重〜７mg/kg体重の投薬レベルで供給される。

本発明のオリゴヌクレオチドを、静脈内投与、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液包内、髄腔内、経口、局所、又は吸入経路を含む公知の投与経路により投与することができる。アンタゴニスト又はアゴニストを投与するための有効な投薬量及びスケジュールは、当業者により一般的に認識されているガイドラインに従って経験的に決定される。単回又は多回投薬が採用され得る。

上述のように、本開示の方法に有用な本発明のオリゴヌクレオチドを、哺乳類などの動物への投与に適した医薬組成物に組み入れることができる。そのような組成物を製剤化するための方法は、一般的に周知である。手引きは、例えばRemington: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY, 19th Edition, Gennaro (ed.) 1995, Mack Publishing Company, Easton, Paから入手することができる。そのような組成物は、典型的には、少なくとも１つの抗ＲＴアプタマー及び薬学的に許容し得る担体を含む。用語「薬学的に許容し得る担体」は、医薬投与に適合性の任意及び全てのコーティング剤、賦形剤、溶媒、分散媒、吸収遅延剤などを表す。そのような担体は、また、例えば塩化ナトリウム、コロイド状シリカ、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース又はメチルセルロースなどのセルロースベースの化合物、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、及びポリエチレングリコールを含む様々なポリマー性担体を含む。剤形は、例えば、経口又は舌下錠、ペレット、マイクロカプセル及びナノカプセル、リポソーム、吸入形態、鼻スプレー、及び徐放調合剤を含む。本発明の核酸を投与するために使用される液剤又は懸濁剤は、以下の構成成分：注射用水、食塩水などの無菌希釈剤；固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒；ベンジルアルコール又はメチルパラベンなどの抗細菌剤；アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；ＥＤＴＡなどのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩などの緩衝剤及び塩化ナトリウム又はデキストロースなどの張性調整のための薬剤の１つ以上を含むことができる。いくつかの実施態様では、医薬組成物は、本発明の核酸又は体内の部位において若しくはその周辺での本発明の核酸の発現に適したＤＮＡ構築物を含む徐放製剤又はマトリックスを介して送達することができる。

本発明を以下の図面及び実施例によりさらに説明する。しかし、これらの実施例及び図面は、いかなる方法でも本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

Ａ．４つのグアニンヌクレオシドから構成されるテトラド（tetrad）の略図である。Ｂ．３つのテトラドの積み重ねはＧ四重鎖構造の形成を招く。Ｃ．Ｇ４構造の典型的なＵＶ融解プロファイル。Ｔｍは、特異的転移中点を定義する。ＥＢＯＶゲノム及びＭＢＧＶゲノム中のＧ４傾向配列の検索を示す図である。Ｇ４形成配列のバイオインフォマティクス検索。このグラフ表示は、ＥＢＯＶ及びＭＢＧＶの／からのアライメント済みゲノム配列の機能における平均スコアを示す。

実施例：
材料及び方法：
バイオインフォマティクス解析：１３個のＥＢＯＶ完全ゲノム配列及び２０個のＭＢＧＶ完全ゲノム配列をViral Bioinformatics Resource Centerから抽出した。ＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを使用してＦａｓｔａファイルのゲノムをアライメントした。ゲノムのアライメント中の保存されたＧ４形成配列を検出するために、本発明者らは、アルゴリズム「Ｇ４−ｈｕｎｔｅｒ」を使用した。このアルゴリズムは、本発明者らが研究室で開発したものである（Bedrat et al.、準備中）。このアルゴリズムは、アライメント中のＧ／Ｃ歪度及びＧ／Ｃブロックの存在を検索するものである。このアルゴリズムは、ヌクレオチド２５個のスライドウインドウを使用してゲノムを解析し、ウインドウの最初のヌクレオチドにスコアを帰属させる。ＬＯＧＯ表示を作製するためにＷｅｂＬｏｇｏソフトウェアを使用して配列保存の解析を行った。

オリゴヌクレオチドの調製：「Reverse-Phase Cartridge Gold purification」を用いてEurogentec（Seraing、Belgium）からオリゴヌクレオチドを購入した。全てのオリゴヌクレオチドを１００μM再蒸留水中に溶解し、−２０℃で保存した。製造業者によって提供された吸光係数を使用して紫外線（ＵＶ）吸収により濃度を決定した。

ＵＶ実験のために４μM オリゴヌクレオチドを１０mM カコジル酸リチウム緩衝液及び１００mM ＫＣｌ中に希釈した。

核磁気共鳴実験（ＮＭＲ）のために、各試料の濃度は、典型的には、７０mM ＫＣｌ及び１０％Ｄ２Ｏを含有する２０mM リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７中に１００μMであった。

ＵＶ融解実験：水浴温度制御付属品と連動したUvikon XS（Secomam）ＵＶ−可視分光光度計を用いてＵＶ融解測定を実施した。温度上昇速度０．２℃/minを適用し、吸光値を１℃毎に測定した。水を満たした対照石英セル中に浸した不活性ガラスセンサーで温度を測定した。光路長０．２又は１cm及び容積５８０μlの石英セルを使用して、２４０及び２９５nmで吸光度を監視した。Ｇ４構造の典型的なＵＶ−融解プロファイルを図１Ｃに示す。

結果
本発明者らは、以前にＧ−四重鎖オリゴヌクレオチドがデコイとして作用することができ、したがって、新しい抗ウイルス戦略の解決に適していることを示した。この戦略は、ＨＩＶ−１ウイルス及びいくつかのＧ４配列に関連して開発された（EP14305763）。この戦略では、本発明者らは、ＨＩＶゲノムから得られた合成Ｇ４形成オリゴヌクレオチドが、ＨｅＬａｐ４細胞に感染性の実際のＨＩＶウイルスを用いてインビボで実現されたウイルス感染性検査においてＨＩＶ−１の感染性を強く阻害することができることを示した。したがって、これらのＧ４は、デコイとして作用し、ウイルスゲノム中に存在する同じ配列の認識に関与する重要なタンパク質を捕捉し得る。本発明者らは、任意のウイルスゲノム中にＧ４配列が存在することが、ウイルスの複製サイクルに果たすこれらの構造の潜在的な役割を明らかにし得るという仮説を立てている。これが事実ならば、本発明者らがＨＩＶに対して開発したデコイ戦略が、所望のウイルスのためにも当てはまるはずである。

Ｇ４−ハンターアルゴリズムを使用して、本発明者らは、それぞれ１３個のＥＢＯＶ単離株及び２０個のＭＢＧＶ単離株からの完全ゲノム配列の２つのアライメントを解析した。それぞれ２５ntのウインドウについて得られた１３個又は２０個のスコアの平均をグラフに示す（図２）。本発明者らは、絶対値で１（−１又は＋１）よりも大きなスコアが、（−）鎖（正の値について）又は負の値については（＋）鎖において、潜在的にＤＮＡ又はＲＮＡのＧ４構造を形成することができると考えている。ＥＢＯＶから６個及びＭＢＧＶから２０個の保存された配列をＧ４傾向の配列として検出した。ＵＶ融解実験による完全な生物物理分析は、５個のＥＢＯＶ配列及び９個のＭＢＧＶ配列だけが実際に熱力学的に安定なＧ４をインビトロで形成したことを明らかにした（表１）。

結論
本発明者らは、ＥＢＯＶの５個のＧ４形成配列及びＭＢＧＶの９個のＧ４形成配列を同定した。ＨＩＶウイルスについて観察されたように、本発明者らは、これらの配列が、ＥＢＯＶ及びＭＢＧＶの複製サイクルの重要なステップに関与するウイルスタンパク質又は細胞タンパク質により認識されうるという仮説を立てている。したがって、ＨＩＶに関連して開発されたけれども、これらのオリゴヌクレオチドは、ＥＢＯＶ及びＭＢＧＶのウイルス複製を阻害するためのデコイとして使用することができる。より一般的には、他のＧ４形成配列、特に本発明者らが最近、ＨＩＶ複製に対するいくらかの阻害効果を示したＡＳ１４１１Ｇ４形成アプタマー（５’ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧ３’）（配列番号：１）も類似の抗ウイルス性質を有する可能性がある。

参考文献：
本出願にわたり、様々な参考文献が、本発明が属する技術の現状を記載している。これにより、これらの参考文献の開示は、参照により本開示に組み入れられる。

Claims

フィロウイルス感染症を処置する必要のある対象において該処置を行う方法であって、対象に、配列番号：１〜配列番号：１５に示される配列を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドの治療有効量を投与することを含む方法。
フィロウイルス感染症がエボラウイルス感染症である、請求項１記載の方法。
エボラウイルスが、アイボリーコーストエボラウイルス（ＩＣＥＢＯＶ）、ザイールエボラウイルス（ＺＥＢＯＶ若しくはＥＢＯＶ）、スーダンエボラウイルス（ＳＥＢＯＶ）、又はエボラウイルスの新しい株若しくは種である、請求項２記載の方法。
フィロウイルス疾患、特にエボラウイルス疾患の処置のための、請求項１記載の方法。
オリゴヌクレオチドがナノパーティクルに結合されている、請求項１記載の方法。
ナノパーティクルが金ナノパーティクルである、請求項５記載の方法。
配列番号：２〜配列番号：１５に示される配列を含むオリゴヌクレオチド。