CN103571823A - 用离子液体增强生物材料的核酸扩增效率和灵敏度的方法 - Google Patents

用离子液体增强生物材料的核酸扩增效率和灵敏度的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103571823A
CN103571823A CN201310050007.XA CN201310050007A CN103571823A CN 103571823 A CN103571823 A CN 103571823A CN 201310050007 A CN201310050007 A CN 201310050007A CN 103571823 A CN103571823 A CN 103571823A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
ionic liquid
acid amplification
thiazolinyl
aryl
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201310050007.XA
Other languages
English (en)
Inventor
权圣弘
池圣敏
黄奎渊
金俊镐
郑善玉
郑盛旭
郑元淙
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Samsung Electronics Co Ltd
Original Assignee
Samsung Electronics Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Samsung Electronics Co Ltd filed Critical Samsung Electronics Co Ltd
Publication of CN103571823A publication Critical patent/CN103571823A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明是用离子液体增强生物材料的核酸扩增效率和灵敏度的方法。用于核酸扩增的方法和装置、遏制核酸扩增抑制物的组合物和试剂盒，以及核酸扩增抑制物的遏制剂。可使用它们来高灵敏度地检测目标微生物、细胞或基因，和用于精确的分子诊断。

Description

用离子液体增强生物材料的核酸扩增效率和灵敏度的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2012年7月26日向韩国知识产权局提交的韩国专利申请10-2012-0081967号的权益，该申请通过引用而全文并入作为参考。
发明领域
本申请涉及用于核酸扩增的方法、遏制核酸扩增抑制物的组合物和试剂盒，以及核酸扩增抑制物的遏制剂。
背景技术
核酸扩增用于快速、准确地诊断生物材料的传染性疾病，并因此其重要性日益增大。然而，诊断性核酸扩增方法受以下因素影响：细胞裂解活动的干扰，复杂生物材料中各种核酸扩增抑制物对聚合酶和DNA稳定性的影响。因此，对于核酸扩增的分子诊断方法而言，期望有除去各种复杂生物材料中存在的核酸扩增抑制物的方法，以助于更准确和精确的诊断。
对于分子诊断而言，可使用多种生物物质，如粘液、血液、粪便和肉。在粪便的情况中，难以实施精确的分子诊断，因为不但样本差异很大，而且还存在血红素、胆红素、胆盐及多种复杂多糖。已进行了除去粪便样本中存在的多种核酸扩增抑制物的研究。
根据处理的顺序，可将除去核酸扩增抑制物的方法分为两条路线。一条路线是在样品制备的预处理期间除去核酸扩增抑制物。然而，该方法是有瑕疵的，因为其不但复杂，而且也受到反应、结合及洗脱缓冲液的严重影响，且其不能防止在大多数核酸扩增抑制物的预处理步骤中出现靶细胞的损失。另一种除去核酸扩增抑制物的路线是(样品制备的)后处理法；例如，将除去核酸扩增抑制物的物质加入到聚合酶链反应(PCR)主混合物中。在预处理步骤中观测到的靶细胞或DNA的损失未明显弱化是有优势的。然而，尽管已对除去核酸扩增抑制物的物质进行了研究，且已有多个产物实现了商业化，但它们的效果是不显著的。已研究了多种化学物质(乙酰胺、甜菜碱、葡聚糖、二甲基亚砜、甲酰胺、丙三醇、PEG、PVP-10等)、表面活性剂(吐温、SDS等)和生物分子(gp32单链结合蛋白、蛋白酶抑制因子等)，但它们的效果是不明显的。只有当加入BSA时，证实了轻微的除去核酸扩增抑制物的效果。然而，在该情况中，尽管材料之间的差异足够大以至于能施加BSA对核酸扩增抑制物的除去效应，但在少数样品中的效果是不明显的。
因此，仍然需要快速、准确的核酸扩增方法来检测来自于生物物质包括粪便样品中的痕量目标物质。
发明简述
本发明提供了使用离子液体的核酸扩增方法。
本发明提供了包含离子液体的核酸扩增特异性组合物。
本发明提供了包含离子液体的核酸扩增特异性试剂盒。
本发明提供了核酸扩增抑制物的遏制剂，其含有离子液体。
本发明提供了核酸扩增方法，包括制备生物材料和核酸扩增混合物，并向所述生物材料和所述核酸扩增混合物的至少一个中加入离子液体；将所述生物材料与所述核酸扩增混合物混合，制备核酸扩增反应混合物；并扩增核酸，其中所述离子液体遏制了核酸扩增抑制物。
术语“反应效率”表示，在给定条件下，聚合酶链式反应(PCR)每一循环中目标核酸的扩增反应平均数(平均倍增/循环数)。PCR反应的效率受材料纯度、目标物质的量、反应条件、反应遏制剂的存在等的影响。PCR通过重复足够多的循环数来检测产物，所述循环通常如下组成：变性(其将DNA模板分离成单链)、结合引物与模板退火，以及聚合酶酶促延伸。扩增效率越高，扩增达到可检测水平所耗费的时间越少。例如，可将核酸扩增效率理解成重复整个循环所花的时间，或为了将目标核酸扩增至可检测水平以完成反应所必需的循环所花费的时间。
术语“反应灵敏度”或“检测极限(LOD)”表示，在给定PCR条件下，能进行可靠的检测和定量的目标核酸的最低量或最少拷贝。在实时-PCR(RT-PCR)中，检测极限表示为最大反应单元(Max Rn)或循环阈值(Ct)。此外，Ct值表示循环数，是在分析了从PCR每个循环中发出的荧光信号后，发现荧光信号从估计的初步基线点(基础信号)开始显著增大的点，绘制每种材料的目标核酸拷贝数和Ct值之间的图像。
所述方法包括制备生物材料和核酸扩增混合物，以及向它们至少一个中加入离子液体。
术语“生物材料”表示可从活体生物获得的任何样品。所述生物材料可以是，哺乳动物(包括人)或微生物衍生的细胞、体液、或核酸。例如，它们可以是：粪便(feces)、尿、血液、粘液(mucus)、唾液、粘冻物(slime)、汗液、体液、组织、肉(flesh)或核酸中的任何一种，或是被稀释、洗涤、溶解或冻干的样品。可使用从水环境(hydrosphere)或肉体(corporal)收集的样品作为生物材料，因为它们不涉及额外的核酸分离过程。使用未处理过的样品直接进行核酸扩增是有利的，因为在核酸分离期间可损失大量样品且需要耗时/费钱，尤其当所述样品量很少时。
术语“用于核酸扩增的混合物”或“用于核酸扩增的组合物”表示，除包括模板外，包括实施核酸扩增必需的所有组分的混合物，其经常称为“主混合物(master mix)”或“预混合物(pre mix)”。所述组合物可另外包括目标核酸扩增所需要的已知物质。例如，所述组合物可另外包括核酸聚合酶、其活化必需的缓冲液、辅因子和/或底物。所述核酸聚合酶可以是DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶或它们的组合。逆转录酶合成了与RNA序列互补的DNA链作为模板。所述核酸聚合酶可具有链替换活性。例如，所述核酸聚合酶可以是至少一种来自于逆转录病毒如HIV，MMLV或AMV的逆转录酶。所述核酸聚合酶可不具有3'→5'核酸外切酶活性。所述混合物可包括逆转录或PCR扩增所必需的物质。例如，用于核酸扩增的混合物可包括用于聚合反应的每个约1μM-50μM缓冲液的正向引物和反向引物，例如pH约8.0-9.0的10mM Tris HCl、约40mM KCl、约1.5mM MgCl2、每个约250μM的四种dNTP和约0.5-1U的DNA聚合酶。根据反应的量和速度，用于核酸扩增的混合物可以以高密度倍数(例如×2-×10)来使用。
术语“离子液体”表示在室温尽管与离子键合但以液态存在的物质。从化学上来分析其类似于盐；但与盐不同的是，其在室温下以液态存在且能很好地溶解多种物质。其也被评定为对环境友好的溶剂，因为在室温其不易气化从而不释放出气化的有毒物质，且因为比有机溶剂更易于获取而可再生。其可以作为催化剂的电解质来用，或用于电池工业领域。例如，离子液体的阳离子可以是下面的一种：
Figure BDA00002832525300041
在公式中，R1可以是H、苯基、C1-C20烷基、C1-C20烯基或C1-C20芳基；R2为H、苯基、C1-C20烷基、C1-C20烯基或C1-C20芳基；R3为H、苯基、C1-C20烷基、C1-C20烯基或C1-C20芳基；或R4为H、苯基、C1-C20烷基、C1-C20烯基或C1-C20芳基。例如，离子液体的阴离子可以是卤离子、SCN-、BH4 -、PF6 -、CF3COO-、C6H5COO-、(CF3SO2)2N-、CH3OSO3 -、(CN)2N-、NO3 -、CH3COO-、CF3SOO-、(CH3O)2PO2 -或CH3OSO3 -。此外，例如离子液体可具有以下结构：
Figure BDA00002832525300042
制备了生物材料和核酸扩增混合物，并向生物材料、核酸扩增混合物、或者生物材料和核酸扩增混合物的反应混合物这三者的至少一种中加入离子液体。
所述方法包括，将生物材料和核酸扩增混合物混合，制得用于核酸扩增的反应混合物。
所述术语“用于核酸扩增的反应混合物”是指，除包括模板外、包括实施核酸扩增所需的所有组分的反应混合物。
用于核酸扩增的反应混合物中离子液体的浓度可在0.001%(v/v)-50%(v/v)的范围内。例如，其可在0.001%-30%、0.001%-10%或0.0001%-5%的范围内。
用于核酸扩增的反应液可包括选自如下的至少一种：牛血清清蛋白(BSA)、乙酰胺、甜菜碱、葡聚糖、DMSO、甲酰胺、丙三醇、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、Tween-20、Triton-X、十二烷基硫酸钠(SDS)、gp32单链结合蛋白、和蛋白酶抑制因子。可将这些加入到生物材料或用于核酸扩增的混合物中，例如PCR主混合物中。
所述方法包括实施核酸扩增。
术语“核酸扩增”是指，在短期内将特定的核酸序列从成百上千个碱基扩增至数百万个碱基的技术。其为用于核酸扩增的已知方法。扩增例如可以是DNA或RNA的扩增。扩增方法可需要热循环或等温下进行。所述扩增方法可包括PCR、基于核酸序列的扩增(NASBA)、连接酶链式反应(LCR)、链替换扩增(SDA)、滚环扩增(RCA)等。所述扩增方法还可以是RNA扩增方法。例如，它可包括逆转录或逆转录-PCR。“PCR”可通过引物对与目标特异性结合而用聚合酶扩增目标核酸。例如，核酸扩增中反复进行变性、退火和延伸。术语“退火”与“杂交”可交替使用。此外，所述扩增例如可以是DNA扩增或RNA扩增。核酸扩增例如可以是实时PCR。术语“实时PCR”是指一种方法，其中在每个PCR循环中实时观测到PCR产物增加。RT-PCR方法通过检测和定量与PCR产物反应的荧光材料而分析样品。
在所述方法中，离子液体抑制了核酸扩增抑制物。术语“核酸扩增抑制物”是指，未出现核酸扩增信号的物质，或导致信号降低的物质。所述核酸扩增抑制物可以是存在于多种生物材料或食物中的物质。例如，其可以是胆酸、胆盐、多糖、胆红素、肝素、蛋白水解酶、酚化合物、核酸酶、多胺、血红素、氯高铁血红素(hemin)、胶原、黑色素、真黑素(eumelanin)、肌红蛋白、蛋白酶、钙离子、脲、血红蛋白、乳铁蛋白、免疫球蛋白G、腐殖酸、手套粉末(glove powder)、氯化钙、乙二胺四乙酸(EDTA)和FeCl3。
术语“遏制”是指防止或降低核酸扩增抑制物的功能，经常与术语“除去”交替使用。
本发明提供了用于生物材料的核酸扩增的组合物，其包括抑制核酸扩增抑制物的离子液体。
所述核酸扩增抑制物可存在于例如生物材料或食物中。所述核酸扩增抑制物例如可以是胆酸、胆盐、多糖、胆红素、肝素、蛋白水解酶、酚化合物、核酸酶、多胺、血红素、氯高铁血红素、胶原、黑色素、真黑素、肌红蛋白、蛋白酶、钙离子、脲、血红蛋白、乳铁蛋白、免疫球蛋白G、腐殖酸、手套粉末、氯化钙、EDTA或FeCl3。
离子液体可以是所描述的离子液体。
生物材料可以是所描述的生物材料。
例如，所述核酸扩增组合物的离子液体浓度可在0.001%(v/v)-50%(v/v)的范围内。例如，其可在0.001%-30%、0.001%-10%或0.0001%-5%的范围内。
所述组合物可另外包括目标核酸扩增所需要的已知物质。例如，所述组合物可另外包括核酸聚合酶、用于其活化的缓冲液、辅因子和/或底物。所述核酸聚合酶可以是DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶或它们的组合。逆转录酶以RNA为模板并将互补的DNA链结合到RNA序列上。所述核酸聚合酶可具有链替换活性。例如，所述核酸聚合酶可以是至少一种来自逆转录病毒如HIV，MMLV或AMV的逆转录酶。所述核酸聚合酶可不具有3'→5'核酸外切酶活性。所述组合物可包括逆转录或PCR扩增所必需的物质。
此外，所述组合物可包括选自如下的至少一种：牛血清清蛋白(BSA)、乙酰胺、甜菜碱、葡聚糖、DMSO、甲酰胺、丙三醇、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、Tween-20、Triton-X、十二烷基硫酸钠(SDS)、gp32单链结合蛋白、和蛋白酶抑制因子。可将这些加入到生物材料或用于核酸扩增的混合物中，例如PCR主混合物中。
本发明提供了用于生物材料的核酸扩增的试剂盒，其包括遏制核酸扩增抑制物的离子液体。
所述核酸扩增抑制物可以是存在于多种生物材料或食品中的物质。例如，其可以是胆酸、胆盐、多糖、胆红素、肝素、蛋白水解酶、酚化合物、核酸酶、多胺、血红素、氯高铁血红素、胶原、黑色素、真黑素、肌红蛋白、蛋白酶、钙离子、脲、血红蛋白、乳铁蛋白、免疫球蛋白G、腐殖酸、手套粉末、氯化钙、EDTA和FeCl3。
离子液体可以是所描述的离子液体。
生物材料可以是所描述的生物材料。
所述试剂盒可另外包括目标核酸扩增所需要的已知物质。例如，所述试剂盒可另外包括核酸聚合酶、用于其活化的缓冲液、辅因子和/或底物。所述核酸聚合酶可以是DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶或它们的组合。逆转录酶以RNA为模板并合成与RNA序列互补的DNA链。所述核酸聚合酶可具有链替换活性。例如，所述核酸聚合酶可以是逆转录酶。例如，所述核酸聚合酶可以是至少一种来自逆转录病毒如HIV，MMLV或AMV的逆转录酶。所述核酸聚合酶可不具有3'→5'核酸外切酶活性。所述组合物可包括逆转录或PCR扩增所必需的物质。另外，所述试剂盒可另外包括用于目标核酸扩增的说明书。
此外，所述试剂盒可包括选自如下的至少一种：BSA、乙酰胺、甜菜碱、葡聚糖、DMSO、甲酰胺、丙三醇、PEG、PVP、Tween-20、Triton-X、SDS、gp32单链结合蛋白和蛋白酶抑制因子。可将这些加入到生物材料或用于核酸扩增的混合物中，例如PCR主混合物中。
本发明提供了核酸扩增抑制物的遏制剂，其包括离子液体。
例如，所述核酸扩增抑制物可存在于生物材料或食品中。例如，核酸扩增抑制物可以是胆酸、胆盐、多糖、胆红素、肝素、蛋白水解酶、酚化合物、核酸酶、多胺、血红素、氯高铁血红素、胶原、黑色素、真黑素、肌红蛋白、蛋白酶、钙离子、脲、血红蛋白、乳铁蛋白、免疫球蛋白G、腐殖酸、手套粉末、氯化钙、EDTA或FeCl3。
离子液体可以是所描述的离子液体。
根据使用离子液体的核酸扩增方法，可以高效率和高灵敏度地精确检测出目标微生物、细胞或基因。
根据包括离子液体的核酸扩增组合物和试剂盒，可以高效率和高灵敏度地快速检测生物材料中的目标微生物、细胞或基因。例如，可通过降低或遏制存在于生物材料中的多种核酸扩增抑制物，而改进PCR效率和灵敏度及可用于精确的分子诊断。
同时，通过包括离子液体的遏制核酸扩增抑制物的遏制剂，可以高效率和高灵敏度地快速检测出生物材料中的目标微生物、细胞或基因。
附图简述
从下面的实施例描述，结合附图，这些和/或其它方面变得明显和更容易理解，其中：
图1显示离子液体本身未抑制聚合酶链式反应(PCR)；
图2A显示与离子液体对粪便样品中PCR的影响有关的扩增谱曲线；
图2B显示了从与离子液体对粪便样品中PCR的影响有关的扩增谱计算的最大Rn值；
图2C显示了与离子液体对粪便样品中PCR的影响有关的PCR扩增产物的电泳结果；
图2D显示了根据电泳结果计算的扩增产物的量；
图3A-图3C是离子液体对粪便样品中PCR的影响；图3A是102拷贝的基因组DNA的扩增谱曲线，图3B是101拷贝的基因组DNA的扩增谱曲线，图3C是从图3A和图3B计算得到的最大Rn值；和
图4A-图4B是离子液体或BSA对粪便样品中PCR的影响；图4A显示了103拷贝的基因组DNA的扩增谱曲线；图4B是从图4A计算的最大Rn值。
发明详述
下文用实际操作进行进一步解释。然而，这些操作是被设计用于解释的，只作为举例，本发明的范围并不限于所述操作。
实施例1
检测离子液体对聚合酶链式反应(PCR)的抑制
研究了需要经蒸馏的核酸样品的PCR是否被离子液体抑制。
用四氟硼酸1-丁基-3-甲基咪唑
Figure BDA00002832525300081
(BMITF)作为离子液体，将BMITF溶于蒸馏水，所用的PCR反应混合物的最终反应浓度如下：
103拷贝的基因组DNA
1×PCR主混合物，和
0.5%(v/v)离子液体或蒸馏水
所述PCR主混合物包括引物/探针、z-taq聚合酶(TaKara)、dNTP和z-taq缓冲液。
正向引物：5'-CGGGTTGTGTTAATTGAAC-3'(SEQ ID NO:1)
反向引物：5'-GAAGCGGCTGAAAAAACCGCA-3'(SEQ ID NO:2)
探针：5'-agaGcaTttAagAttAtgcg-3'(SEQ ID NO:3)
PCR用TMC1000(Samsung)进行总共45个循环，每个循环为95℃1秒，和60℃5秒。
在图1中显示了由扩增谱曲线表示的对应于PCR循环数目的Rn(粗实线：含0.5%(v/v)的离子液体，虚线：不含离子液体)。
如图1所示，离子液体本身没有对PCR施加任何抑制效果。
实施例2
来自粪便样品的离子液体对PCR的影响
研究了在粪便样品中离子液体的存在是否影响了PCR的扩增效率和敏感度。
所用的离子液体如实施例1所述，所使用的PCR反应混合物的最终反应浓度显示如下：
粪便洗脱样品，
103拷贝的基因组DNA，
1×PCR主混合物，和
0.5%(v/v)离子液体或蒸馏水。
PCR主混合物的组成和PCR条件见实施例1。
得到了扩增谱曲线，其指示对应于PCR循环数的Rn，并从所述曲线计算最大Rn值(粗实线：包括0.5%(v/v)的离子液体，虚线：不包括离子液体)。
同时，PCR扩增产物用琼脂糖凝胶进行电泳分离，对目标扩增产物的量进行比较(Bioanalyzer2100,Agilent)。图2C显示扩增产物的电泳结果，图2D显示扩增产物的产量(A：离子液体+粪便样品，B：离子液体缺乏+粪便样品，C：离子液体+在缓冲液中的基因组DNA，D：离子液体缺乏+在缓冲液中的基因组DNA)。
如图2A-2D所示，当实验中使用离子液体时，证实PCR扩增谱曲线的最大Rn值增大。在使用离子液体的情况中，PCR扩增产物浓度的升高通过电泳得到证实，因为Rn值的增大并非仅仅是信号增强，而是因除去或遏制了PCR抑制物而导致PCR扩增效率增加。
实施例3
目标DNA拷贝数少时离子液体对粪便样品中PCR的影响
研究了含少量目标拷贝的粪便样品中离子液体的存在是否增大了PCR的扩增效率和敏感度。
所用的离子液体如实施例1所述，所用的PCR试剂的最终反应浓度显示如下：
粪便洗脱样品，
102或101拷贝的基因组DNA，
1×PCR主混合物，和
0.5%(v/v)离子液体或蒸馏水。
PCR主混合物的组成和PCR条件见实施例1。
得到了扩增谱曲线，其代表相对于PCR循环数的Rn，见图3A(102拷贝的基因组DNA的扩增谱曲线)和图3B(101拷贝的基因组DNA的扩增谱曲线)(粗实线：包括0.5%(v/v)的离子液体，虚线：不包括离子液体)。图3C显示了从图3A和图3B得到的最大Rn值。
如图3A-3C所示，当实验中对于低浓度目标DNA未使用离子液体时，不能获得足够的Ct值，但使用离子液体的实验中测到了Ct值。由于粪便样品中PCR抑制物的影响，PCR扩增效率和灵敏度很低，但使用离子液体使PCR扩增效率和灵敏度变好，提高了LOD。
实施例4
比较BSA和离子液体对粪便样品中PCR的影响
比较了BSA和来自粪便样品的离子液体对PCR扩增效率和灵敏度的影响。
所用的离子液体如实施例1所述，所用的PCR试剂的最终反应浓度显示如下：
103拷贝的基因组DNA，
1×PCR主混合物，和
0.5%(v/v)离子液体、0.1%(v/v)BSA或蒸馏水。
PCR主混合物的组成和PCR条件见实施例1。
得到了扩增谱曲线，其代表相对于PCR循环数的Rn，见图4A，从图4A得到的最大Rn值示于图4B(粗实线：包括0.5%(v/v)的离子液体，虚线：不包括离子液体)。
如图4A和图4B所示，与仅使用常用来除去或遏制粪便样品的PCR抑制物的BSA在总体上相比，使用离子液体的实验中Rn值至少增加了1个反应单元。因此，证实不能被单独的BSA除去的PCR抑制剂能被离子液体除去。
实施例5
筛选具有除去或遏制PCR抑制物的效果的离子液体
Figure BDA00002832525300111
Figure BDA00002832525300121
在表中，△Rn是有离子液体时的最大Rn值减去无离子液体时的值。
在表中，观察到的核酸扩增抑制物的除去效果或遏制效果依次为BMITF>EMIDC>BMPDC>MPPDC>BMIDC。
Figure IDA00002832526000011
Figure IDA00002832526000021

Claims (21)

1.扩增核酸的方法，所述方法包含：
制备生物材料和核酸扩增混合物，是通过向它们中的至少一个加入离子液体来制备；
将生物材料和所述核酸扩增混合物混合，制备用于核酸扩增的反应混合物；和
扩增核酸，
其中所述离子液体遏制了核酸扩增抑制物。
2.权利要求1所述的方法，其中所述离子液体的阳离子是选自如下的至少一种：
Figure FDA00002832525200011
其中R1可以是H、苯基、C1-C20烷基、C1-C20烯基或C1-C20芳基；R2可以是H、苯基、C1-C20烷基、C1-C20烯基或C1-C20芳基；R3可以是H、苯基、C1-C20烷基、C1-C20烯基或C1-C20芳基；或R4可以是H、苯基、C1-C20烷基、C1-C20烯基或C1-C20芳基，和
所述离子液体的阴离子为选自卤离子、SCN-、BH4 -、PF6 -、CF3COO-、C6H5COO-、(CF3SO2)2N-、CH3OSO3-、(CN)2N-、NO3 -、CH3COO-、CF3SOO-、(CH3O)2PO2 -和CH3OSO3 -中的至少一种。
3.权利要求1所述的方法，其中所述生物材料是选自如下的至少一种：粪便、尿、血液、粘液、唾液、粘冻物、汗液、体液、组织、肉和核酸，或被稀释、洗涤、溶解或冻干的样品。
4.权利要求1所述的方法，其中用于核酸扩增的所述反应混合物中的离子液体浓度在约0.001%(v/v)-50%(v/v)范围内。
5.权利要求1所述的方法，其中所述核酸扩增抑制物是选自如下的至少一种：胆酸、胆盐、多糖、胆红素、肝素、蛋白水解酶、酚化合物、核酸酶、多胺、血红素、氯高铁血红素、胶原、黑色素、真黑素、肌红蛋白、蛋白酶、钙离子、脲、血红蛋白、乳铁蛋白、免疫球蛋白G、腐殖酸、手套粉末、氯化钙、乙二胺四乙酸(EDTA)和FeCl3。
6.权利要求1所述的方法，其中用于核酸扩增的所述反应混合物还包含选自如下的至少一种：牛血清清蛋白(BSA)、乙酰胺、甜菜碱、葡聚糖、二甲基亚砜(DMSO)、甲酰胺、丙三醇、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)-10、Tween-20、Triton-X、十二烷基硫酸钠(SDS)、gp32单链结合蛋白、和蛋白酶抑制因子。
7.用于生物材料的核酸扩增的组合物，其包含遏制核酸扩增抑制物的离子液体。
8.权利要求7所述的组合物，其中所述离子液体的阳离子是选自如下的至少一种：
其中R1可以是H、苯基、C1-C20烷基、C1-C20烯基或C1-C20芳基；R2可以是H、苯基、C1-C20烷基、C1-C20烯基或C1-C20芳基；R3可以是H、苯基、C1-C20烷基、C1-C20烯基或C1-C20芳基；或R4可以是H、苯基、C1-C20烷基、C1-C20烯基或C1-C20芳基，和所述离子液体的阴离子为选自卤离子、SCN-、BH4 -、PF6 -、CF3COO-、C6H5COO-、(CF3SO2)2N-、CH3OSO3 -、(CN)2N-、NO3 -、CH3COO-、CF3SOO-、(CH3O)2PO2 -和CH3OSO3 -中的至少一种。
9.权利要求7所述的组合物，其中所述生物材料选自粪便、尿、血液、粘液、唾液、粘冻物、汗液、体液、组织、肉和核酸，或被稀释、洗涤、溶解或冻干的样品。
10.权利要求7所述的组合物，其中在用于核酸扩增的所述组合物中的离子液体浓度在0.001%(v/v)-50%(v/v)范围内。
11.权利要求7所述的组合物，其中所述核酸扩增抑制物是选自如下的至少一种：胆酸、胆盐、多糖、胆红素、肝素、蛋白水解酶、酚化合物、核酸酶、多胺、血红素、氯高铁血红素、胶原、黑色素、真黑素、肌红蛋白、蛋白酶、钙离子、脲、血红蛋白、乳铁蛋白、免疫球蛋白G、腐殖酸、手套粉末、氯化钙、乙二胺四乙酸(EDTA)和FeCl3。
12.权利要求7所述的组合物，其中所述组合物还包含选自如下的至少一种：BSA、乙酰胺、甜菜碱、葡聚糖、DMSO、甲酰胺、丙三醇、PEG、PVP-10、Tween-20、Triton-X、SDS、gp32单链结合蛋白、和蛋白酶抑制因子。
13.用于生物材料的核酸扩增的试剂盒，其包含遏制核酸扩增抑制物的离子液体。
14.权利要求13所述的试剂盒，其中所述离子液体的阳离子是选自如下的至少一种：
Figure FDA00002832525200031
其中R1可以是H、苯基、C1-C20烷基、C1-C20烯基或C1-C20芳基；R2可以是H、苯基、C1-C20烷基、C1-C20烯基或C1-C20芳基；R3可以是H、苯基、C1-C20烷基、C1-C20烯基或C1-C20芳基；或R4可以是H、苯基、C1-C20烷基、C1-C20烯基或C1-C20芳基，和
所述离子液体的阴离子为选自卤离子、SCN-、BH4 -、PF6 -、CF3COO-、C6H5COO-、(CF3SO2)2N-、CH3OSO3-、(CN)2N-、NO3 -、CH3COO-、CF3SOO-、(CH3O)2PO2 -和CH3OSO3 -中的至少一种。
15.权利要求13所述的试剂盒，其中所述生物材料选自粪便、尿、血液、粘液、唾液、粘冻物、汗液、体液、组织、肉和核酸，或被稀释、洗涤、溶解或冻干的样品。
16.权利要求13的所述试剂盒，其中所述核酸扩增抑制物是选自如下的至少一种：胆酸、胆盐、多糖、胆红素、肝素、蛋白水解酶、酚化合物、核酸酶、多胺、血红素、氯高铁血红素、胶原、黑色素、真黑素、肌红蛋白、蛋白酶、钙离子、脲、血红蛋白、乳铁蛋白、免疫球蛋白G、腐殖酸、手套粉末、氯化钙、乙二胺四乙酸(EDTA)和FeCl3。
17.权利要求13所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含选自如下的至少一种：BSA、乙酰胺、甜菜碱、葡聚糖、DMSO、甲酰胺、丙三醇、PEG、PVP-10、Tween-20、Triton-X、SDS、gp32单链结合蛋白和蛋白酶抑制因子。
18.核酸扩增抑制物的遏制剂，包含离子液体。
19.权利要求18所述的遏制剂，其中所述离子液体的阳离子是选自如下的至少一种：
其中R1可以是H、苯基、C1-C20烷基、C1-C20烯基或C1-C20芳基；R2可以是H、苯基、C1-C20烷基、C1-C20烯基或C1-C20芳基；R3可以是H、苯基、C1-C20烷基、C1-C20烯基或C1-C20芳基；或R4可以是H、苯基、C1-C20烷基、C1-C20烯基或C1-C20芳基，和
所述离子液体的阴离子为选自卤离子、SCN-、BH4 -、PF6 -、CF3COO-、C6H5COO-、(CF3SO2)2N-、CH3OSO3-、(CN)2N-、NO3 -、CH3COO-、CF3SOO-、(CH3O)2PO2 -和CH3OSO3 -中的至少一种。
20.权利要求18所述的遏制剂，其中所述核酸扩增抑制物是存在于生物材料中的遏制剂。
21.权利要求18所述的遏制剂，其中所述核酸扩增抑制物是选自如下的至少一种：胆酸、胆盐、多糖、胆红素、肝素、蛋白水解酶、酚化合物、核酸酶、多胺、血红素、氯高铁血红素、胶原、黑色素、真黑素、肌红蛋白、蛋白酶、钙离子、脲、血红蛋白、乳铁蛋白、免疫球蛋白G、腐殖酸、手套粉末、氯化钙、乙二胺四乙酸(EDTA)和FeCl3。
CN201310050007.XA 2012-07-26 2013-02-08 用离子液体增强生物材料的核酸扩增效率和灵敏度的方法 Pending CN103571823A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120081967A KR101935367B1 (ko) 2012-07-26 2012-07-26 이온성 액체를 사용하여 생물학적 시료로부터 핵산 증폭의 증폭 효율 및 감도를 증가시키는 방법
KR10-2012-0081967 2012-07-26

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN103571823A true CN103571823A (zh) 2014-02-12

Family

ID=48047899

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310050007.XA Pending CN103571823A (zh) 2012-07-26 2013-02-08 用离子液体增强生物材料的核酸扩增效率和灵敏度的方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US9598726B2 (zh)
EP (1) EP2690180B1 (zh)
JP (1) JP2014027934A (zh)
KR (1) KR101935367B1 (zh)
CN (1) CN103571823A (zh)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016058126A1 (zh) * 2014-10-14 2016-04-21 深圳华大基因科技有限公司 一种核酸的转座酶打断一站式处理方法及试剂
WO2016106111A1 (en) 2014-12-23 2016-06-30 Ge Healthcare Uk Limited Methods and reagents for reverse-transcription polymerase chain reaction
WO2016106113A1 (en) * 2014-12-23 2016-06-30 Ge Healthcare Uk Limited Methods and reagents for reverse-transcription polymerase chain reaction
WO2016106129A2 (en) 2014-12-23 2016-06-30 Ge Healthcare Uk Limited Methods and reagents for reverse-transcription polymerase chain reaction
CN106681067B (zh) * 2016-12-20 2019-01-22 深圳市华星光电技术有限公司 显示装置
WO2020055507A1 (en) * 2018-09-10 2020-03-19 Florida Gulf Coast University Board Of Trustees Long-term dna preservation and storage at ambient temperature
EP3650554A1 (en) * 2018-11-06 2020-05-13 Technische Universität Wien Methods, apparatus and kits for bacterial cell lysis
KR102454254B1 (ko) * 2021-12-23 2022-10-14 주식회사 에스엠엘제니트리 다당류에 단백질이 포합된 폴리머, 그 제조 방법, 이를 포함하는 효소 안정화 조성물 및 이를 이용한 표적 핵산 분자 검출 방법

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5620869A (en) * 1995-09-28 1997-04-15 Becton, Dickinson And Company Methods for reducing inhibition of nucleic acid amplification reactions
WO1998006877A2 (en) 1996-08-15 1998-02-19 Abbott Laboratories Method for removing amplification inhibitors from test samples
DE19900638C2 (de) 1999-01-11 2002-12-19 Max Planck Gesellschaft Methode zur Isolierung von DNA aus biologischen Materialien
EP1205555A1 (de) 2000-11-08 2002-05-15 Solvent Innovation GmbH Enzymkatalyse in Gegenwart ionischer Flüssigkeiten
WO2004058987A2 (en) 2002-12-20 2004-07-15 Qiagen Gmbh Nucleic acid amplification
WO2005090563A1 (ja) 2004-03-23 2005-09-29 Nisshinbo Industries, Inc. 核酸溶解用溶媒、核酸含有溶液および核酸保存方法
JP5112064B2 (ja) 2004-05-21 2013-01-09 エムオー バイオ ラボラトリーズ インコーポレイテッド 環境サンプルおよび生物学的サンプル中の核酸から夾雑物を除去するためのキットおよび方法
JP4719455B2 (ja) 2004-12-07 2011-07-06 シスメックス株式会社 直接核酸増幅方法用生体試料処理液および直接核酸増幅方法
US20090004662A1 (en) 2007-06-18 2009-01-01 Applera Corporation Method and compositions for nucleic acid amplification
WO2010064634A1 (ja) 2008-12-05 2010-06-10 オリンパス株式会社 糞便試料の調製方法、糞便試料調製用溶液、及び採便用キット
JP6198184B2 (ja) * 2011-05-25 2017-09-20 学校法人甲南学園 核酸分子の安定性を制御するためのイオン液体の利用

Also Published As

Publication number Publication date
JP2014027934A (ja) 2014-02-13
EP2690180B1 (en) 2015-06-03
US9598726B2 (en) 2017-03-21
US20140030719A1 (en) 2014-01-30
KR20140014848A (ko) 2014-02-06
EP2690180A1 (en) 2014-01-29
KR101935367B1 (ko) 2019-01-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103571823A (zh) 用离子液体增强生物材料的核酸扩增效率和灵敏度的方法
US20240229134A9 (en) Cell lysis assay for cell-free dna analysis
US11633732B2 (en) CRISPR effector system based diagnostics
Korlević et al. Reducing microbial and human contamination in DNA extractions from ancient bones and teeth
EP3728613A2 (en) Crispr effector system based multiplex diagnostics
EP3087202B1 (en) Nucleic acid detection method and kit
WO2019051318A1 (en) DIAGNOSTIC SYSTEMS BASED ON MULTI-EFFECT CRISPRASE
EP3252174A1 (en) Compositions, methods, systems and kits for target nucleic acid enrichment
Albani et al. Developmental validation of an enhanced mRNA-based multiplex system for body fluid and cell type identification
Geng et al. Minimizing inhibition of PCR-STR typing using digital agarose droplet microfluidics
Bogatyrev et al. Quantitative microbiome profiling in lumenal and tissue samples with broad coverage and dynamic range via a single-step 16S rRNA gene DNA copy quantification and amplicon barcoding
EP3201357A2 (en) Methods and kits
EP0989192A2 (en) Method for synthesis of nucleic acids
JP6728657B2 (ja) 核酸増幅法
Sierocinski et al. The most efficient microbial community dominates during community coalescence
EP4435115A1 (en) Improved padlock probes for nucleic acid detection by hyperbranched rolling circle amplification
Eraky et al. Assessment of diagnostic performance of a commercial direct blood PCR kit for the detection of Schistosoma mansoni infection in mice compared with the pre-extracted PCR assay
Liu et al. A colorimetric tandem combination of CRISPR/Cas12a with dual functional hybridization chain reaction for ultra-sensitive detection of Mycobacterium bovis
Harbrow A direct route to forensic body fluid identification
Le et al. Estimation and Preparation of the Hypervariable Regions I/II Templates for Mitochondrial DNA Typing From Human Bones and Teeth Remains Using Singleplex Quantitative Polymerase Chain Reaction
Feng et al. Mating-compatibility genes employed as diagnostic markers to identify novel incursions of the myrtle rust pathogen Austropuccinia psidii
KR20140062197A (ko) 직접 핵산 증폭용 조성물 및 이를 이용한 직접 핵산의 증폭방법
JP4187057B2 (ja) 核酸合成法
WO2013110916A2 (en) Analytical method
EP3625381A1 (en) System and method for isolation and qualification of nucleic acids

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20140212