JP6198184B2 - 核酸分子の安定性を制御するためのイオン液体の利用 - Google Patents
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2.鋳型となる核酸分子、核酸合成酵素、少なくとも一対のプライマー、又は1種類以上のヌクレオチドを少なくとも含む混合物を、前記一般式(1)で示されるイオン液体を含む溶液に溶解させ、ポリメラーゼ連鎖反応により核酸分子の増幅を行う方法。
本発明において使用するイオン液体は、下記一般式(1)で示されるイオン液体である。
ここで、「イオン液体」とは、イオン性液体、常温溶融塩と交換可能に使用される。
(2−1.G−C塩基対を不安定化、及び/又は、A−T塩基対等を安定化する方法)
本発明に係る方法は、前記一般式(1)で示されるイオン液体中において、第1の核酸分子と第2の核酸分子を接触させる工程を含み、前記第1の核酸分子と第2の核酸分子とがハイブリダイズした際に形成される2本鎖核酸分子に含まれるG−C塩基対を不安定化させる、及び/又は、A−T塩基対(あるいはA−U塩基対)を安定化させる方法であればよく、その他の具体的な工程、条件、材料、使用機器等については特に限定されるものではない。なお、「G」はグアニン、「C」はシトシン、「A」はアデニン、「T」はチミン、「U」はウラシルを示す。
前述したように、前記イオン液体はPCR法において利用可能である。すなわち、本発明には、鋳型となる核酸分子、核酸合成酵素、少なくとも一対のプライマー、又は1種類以上のヌクレオチドを少なくとも含む混合物を、前記一般式(1)で示されるイオン液体を含む溶液に溶解させ、PCRにより核酸分子の増幅を行う方法も含まれる。本方法に関しては、上記(2−1)の説明を適宜援用し、異なる部分のみここで説明する。
本発明に係る方法として、前記一般式(1)で示されるイオン液体を含む溶液中において、第1の核酸分子と、第2の核酸分子とを接触させる工程と、前記第1の核酸分子と第2の核酸分子とのハイブリダイズ状態を検出する工程と、を含む方法も含まれる。
上述したように、核酸分子を溶液から抽出する際に、ポリAとポリTのハイブリダイゼーションを利用することが知られている。この手法に本発明を利用すれば、核酸分子の抽出を効率的に行うことができる。すなわち、本発明には、前記一般式(1)で示されるイオン液体を含む溶液中に溶存している核酸分子を、ポリA配列とポリT配列のハイブリダイゼーションを利用して抽出する工程を有する、核酸分子を抽出する方法も含まれる。例えば、ポリA領域を有する核酸分子(ターゲット)を、ポリT領域を有する核酸分子を用いて抽出する方法を挙げることができる。ポリT領域を有する核酸分子を磁気粒子等に固定化しておけば、磁石を用いて簡易にターゲット核酸分子を分離・抽出することができる。なお、ポリA配列とポリT配列のハイブリダイゼーションを利用して核酸分子を抽出する技術は、当業者にとって周知であり、磁気粒子への固定化する態様に限られず、本発明の技術思想を体現できる範囲で、当業者に知られた各種の抽出技術を適宜利用可能である。
本発明には、上述したいずれかの方法を実施するためのキットも含まれる。かかるキットには、少なくとも前記一般式(1)で示されるイオン液体を備えていればよく、その他の具体的な構成については限定されない。前記イオン液体以外のキットの構成物としては、例えば、イオン液体を水和させるための水、イオン液体を入れるための容器・チューブ等のほか、PCR用の核酸合成酵素やヌクレオチド等を挙げることができる。また、核酸分子が固定化された担体(例えば、DNAチップ等)が含まれていてもよい。
イオン液体中でのDNA塩基対の安定性の評価を行った。具体的には、イオン液体(4M リン酸二水素コリンの水和イオン液体)と、標準水溶液として4M NaCl水溶液とにおいて、配列(G−C塩基対含量)の異なる2種類のDNA2本鎖(12塩基対)について、UV融解挙動による熱安定性を評価した。なお、4M リン酸二水素コリンの水和イオン液体は、リン酸二水素コリンに対して、20wt%の水を加えて調製した。また、使用したDNA2本鎖を以下に示す。
<AT2本鎖>
5’→3’:AGAAGAAAAAAA(配列番号1)
3’→5’:TCTTCTTTTTTT(配列番号2)
<GC2本鎖>
5’→3’:CGGCACCAGCGC(配列番号3)
3’→5’:GCCGTGGTCGCG(配列番号4)
結果を図1に示す。融解曲線が高温で遷移するほどDNA2本鎖の熱安定性が高いと評価できる。図1(b)の左側に示すように、標準水溶液中では、AT2本鎖に比べて、GC2本鎖の方が高い熱安定性を示す。しかし、イオン液体中では、AT2本鎖が、GC2本鎖に比べて、より高い熱安定性を示した。より詳細には、イオン液体中における5μM のGC2本鎖の融解温度は、標準水溶液中と比べて7.7℃不安定化したが、5μM AT2本鎖は、23.7℃安定化した。よって、イオン液体中での核酸分子の挙動は、NaCl水溶液と全く異なることが示された。
モレキュラービーコン法を用いて、ミスマッチ塩基対に及ぼすイオン液体の影響の評価した。モレキュラービーコン法に用いるプローブDNAとして、両末端に蛍光剤と消光剤とを修飾付加し、ターゲットDNAが存在しない場合は、プローブDNAはヘアピン型構造を形成しており蛍光を発しないが、ターゲットDNAが共存する場合、プローブDNAとターゲットDNAとが2本鎖を形成し、蛍光を発するように設計した。具体的なプローブDNAとターゲットDNAの配列を以下に示す。
<プローブDNA>
CGAATCGCCAAAAAAAAAAACCCGATTCG(配列番号5)
<ターゲットDNA>
・ターゲットA:GGTTTTTATTTTTGG(配列番号6)
・ターゲットC:GGTTTTTCTTTTTGG(配列番号7)
・ターゲットG:GGTTTTTGTTTTTGG(配列番号8)
・ターゲットT:GGTTTTTTTTTTTGG(配列番号9)
ターゲットDNAは、「ターゲットT」がフルマッチとなるように、これ以外はミスマッチとなるように設計した。
イオン液体中における核酸分子の抽出を評価した。ターゲットDNAとして、アデニン(A)の連続配列(poly A tail模倣配列(アデニンが10塩基以上連続しているDNA鎖))を有し、3’末端に蛍光物質を修飾したものを設計した。また、チミンを20個連続させたプローブ配列(dT20)を付加した磁気ビーズを調製した。実験の具体的な手法としては、ターゲットDNAが溶けたイオン溶液又は標準水溶液を調製し、これらの溶液に磁気ビーズを混ぜ、チューブ外側から磁石を近づけ、溶液から磁気ビーズのみを取り出した(図4の左側参照)。なお、標準水溶液及びイオン液体は、上記(1)と同様のものを用いた。
イオン液体と標準水溶液とで、実験溶液の蒸発速度を評価した。チューブに10μlの溶液を分取し、フタをせず、60℃にて放置した。時間経過に伴う全容量を測定した。なお、標準水溶液としては、高温での反応が必要であるPCR反応で用いる溶液を使用した。具体的な組成は、東洋紡績社製の「KOD−Plus−」の付属溶液を使用した。イオン液体は、上記(1)と同様のものを用いた。
Claims (11)
- 下記一般式(1)で示されるイオン液体を含む溶液中において、第1の核酸分子と第2の核酸分子とを接触させる工程を含み、
前記第1の核酸分子と第2の核酸分子とがハイブリダイズした際に形成される2本鎖核酸分子に含まれるG−C塩基対を熱安定的に不安定化させる、及び/又は、A−T塩基対(あるいはA−U塩基対)を熱安定的に安定化させる方法。
- 鋳型となる核酸分子、核酸合成酵素、少なくとも一対のプライマー、又は1種類以上のヌクレオチドを少なくとも含む混合物を、下記一般式(1)で示されるイオン液体を含む溶液に溶解させ、ポリメラーゼ連鎖反応により核酸分子の増幅を行う方法。
- 下記一般式(1)で示されるイオン液体を含む溶液中において、第1の核酸分子と、第2の核酸分子とを接触させる工程と、
前記第1の核酸分子と第2の核酸分子とのハイブリダイズ状態を検出する工程と、を含む、核酸分子のハイブリダイズ状態を検出する方法。
- 前記第1の核酸分子と第2の核酸分子とは、ミスマッチ塩基対を形成するものである請求項3に記載の方法。
- 前記ミスマッチ塩基対が、G−G、G−A、G−T、G−U、C−C、C−A、C−T、C−U、及びA−Aからなる群より選択される少なくとも1つである請求項4に記載の方法。
- 下記一般式(1)で示されるイオン液体を含む溶液中に溶存している核酸分子を、ポリA配列とポリT配列のハイブリダイゼーションを利用して抽出する工程を有する、核酸分子を抽出する方法。
- ハイブリダイズした核酸分子に含まれるG−C塩基対を熱安定的に不安定化させる、及び/又は、A−T塩基対(あるいはA−U塩基対)を熱安定的に安定化させるための、前記核酸分子を溶解させる溶液として、下記一般式(1)で示されるイオン液体を使用する方法。
- 前記式(1)中、R1〜R3がメチル基であり、Xが二水素リン酸である請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記イオン液体は、5〜80wt%の水を含有する水和イオン液体である請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法を実施するためのキットであって、下記一般式(1)で示されるイオン液体を備えるキット。
- 下記一般式(1)で示されるイオン液体を含む、ハイブリダイズした核酸分子に含まれるG−C塩基対を熱安定的に不安定化させる、及び/又は、A−T塩基対(あるいはA−U塩基対)を熱安定的に安定化させるための組成物。
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