JP2017525384A - Ｄｎａの合成 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質および類似の分子を合成するための改善されたプロセス、特定には、好ましくはラージスケールでの、ＤＮＡの無細胞の酵素的合成に関する。本発明は、鎖置換での複製を使用するＤＮＡの合成に関し、反応混合物へのヌクレオチドの添加が制御され、したがって収量が制御される。反応混合物は、開始の量のヌクレオチド、ポリメラーゼおよびＤＮＡテンプレートを含有し、そこにさらなるヌクレオチドが制御された方法で供給される。【選択図】図７

Description

本発明は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質および類似の分子を合成するための改善されたプロセス（process: 製法、製造方法、工程）、特定には、好ましくはラージスケールでの、ＤＮＡの無細胞の酵素的合成に関する。

デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の増幅は、細胞ベースのプロセスの使用を介して、例えば発酵槽で増幅させようとするＤＮＡを増殖させる細菌の培養によって行うことができる。また、ポリメラーゼ連鎖反応や鎖置換反応などの開始のテンプレートからＤＮＡを増幅させるための無細胞の酵素的なプロセスも説明されている。

これまでに、試験スケールでのＤＮＡ増幅は、マイクロタイタープレートをベースとした装置と必要に応じて反応要素を添加するためのロボット制御されたピペットとを使用して実行されてきた。このような装置およびプロセスは、試験目的で少量のＤＮＡ分子を製造することには好適であるが、他の目的にとっては十分な量を提供しない。特定の核酸およびタンパク質のラージスケールでの増幅および製造は、主として細胞ベースのプロセスを介して行われてきた。このような方法は、一般的に、非常に大きい体積の生成物を生産するには有効であるが、構築が高価である。

また、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実行するのに熱サイクルによる方法を使用してＤＮＡサンプルを増幅するのに具体的に適合させた利用可能な多くの装置もある。これらの装置は、その反応には理想的に適しているが、融通性がなく、他の反応を実行するのに適合させることはできない。このような装置の例は、ＵＳ８，１６３，４８９に開示されている。

化学合成を使用したラージスケールのＤＮＡ合成は、例えばホスホアミダイト方法が公知であるが、欠点がないわけではない。この反応は、一般的に有機溶媒中で実行されなければならず、有機溶媒の多くは毒性であるかまたは別の様式で有害である。化学合成の別の欠点は、各ヌクレオチド付加後、成長するオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも２パーセントがキャッピングされ、結果として収量の損失が起こるため、十分効率的とは言えないことである。したがって、配列に各ヌクレオチドが付加されるにつれて、合成中のヌクレオチド鎖の合計の収量損失は増加する。最終的に、オリゴヌクレオチドの化学合成におけるこの生来的な非効率性が、効率的に生産できるオリゴヌクレオチドの長さを、５０核酸残基またはそれ未満のオリゴヌクレオチドに制限する。

これまで、ポリメラーゼなどの生物学的な触媒は、ＤＮＡ生成物の工業スケールでの製造には慣例的に活用されておらず、反応は、主としてマイクロリットルスケールでの体積に限定されてきた。ＤＮＡの酵素的合成を使用したプロセスのスケールアップは、とりわけＤＮＡ生成物収量が期待外れであるという問題があることが証明されてきた。

ＵＳ８，１６３，４８９

したがって、ＤＮＡおよび類似の分子を相当なスケールで合成するのに使用できるプロセスへの必要性がある。

概要
本発明は、ＤＮＡの無細胞生産のためのプロセスに関する。本プロセスは、閉鎖系のバッチプロセスを含む現在の手法と比較して強化されたＤＮＡ生産を可能にする。これは、特にラージスケールでＤＮＡを合成するコストを下げながら、生産性を有意に増加させる。本発明は、一般的に、加熱および冷却を介して温度をサイクリングする必要がない、等温のＤＮＡ増幅方法に関する。

したがって、ＤＮＡを合成するための無細胞プロセスであって、１種またはそれより多くのプライマーおよびヌクレオチドの存在下で、ＤＮＡテンプレートを少なくとも１種のポリメラーゼと接触させて、前記テンプレートの増幅を促進する条件下で、別の鎖の鎖置換での複製（strand-displacement replication）により複製された鎖を置換することによって反応混合物を形成することを含み、さらなるヌクレオチドが、制御された方法で反応混合物に供給される、上記プロセスが提供される。

したがって、無細胞プロセスは、鎖置換（strand-displacement）での複製を介するテンプレートの増幅を含む。ＤＮＡを合成するための無細胞プロセスであって、１種またはそれより多くのプライマーおよびヌクレオチドの存在下で、ＤＮＡテンプレートを少なくとも１種のポリメラーゼと接触させて、前記テンプレートの増幅を促進する条件下で、鎖置換での複製により反応混合物を形成することを含み、さらなるヌクレオチドが、制御された方法で反応混合物に供給される、上記プロセスが提供される。

したがって、ＤＮＡを合成するための無細胞プロセスであって、ヌクレオチドの存在下で、ＤＮＡテンプレートを少なくとも１種のポリメラーゼと接触させて、前記テンプレートの増幅を促進する条件下で、別の鎖の鎖置換での複製により複製された鎖を置換することによって反応混合物を形成することを含み、さらなるヌクレオチドが、制御された方法で反応混合物に供給される、上記プロセスも提供される。

したがって、無細胞プロセスは、鎖置換での複製によるテンプレートの増幅を含む。ＤＮＡを合成するための無細胞プロセスであって、ヌクレオチドの存在下で、ＤＮＡテンプレートを少なくとも１種のポリメラーゼと接触させて、前記テンプレートの増幅を促進する条件下で、鎖置換での複製により反応混合物を形成することを含み、さらなるヌクレオチドが、制御された方法で反応混合物に供給される、上記プロセスが提供される。

したがって、この合理的な制御方策はＤＮＡの合成速度および／または改善されたＤＮＡ収量の改善を可能にするため、反応混合物へのさらなるヌクレオチドの制御された供給の提供が有利である。これらの改善は、開始時に全てのヌクレオチドが反応混合物中に供給されている類似の反応混合物と比較される。さらなるヌクレオチドの制御された供給は、ポリメラーゼ酵素の生産性および／または処理能力（processivity）の増加をもたらす可能性がある。

代替として、ＤＮＡを合成するための無細胞プロセスであって、１種またはそれより多くのプライマー、ヌクレオチドおよび金属カチオンの存在下で、ＤＮＡテンプレートを少なくとも１種のポリメラーゼと接触させて、前記テンプレートの増幅を促進する条件下で、別の鎖の鎖置換での複製により複製された鎖を置換することによって反応混合物を形成することを含み、さらなる金属カチオンが、制御された方法で反応混合物に供給される、上記プロセスが提供される。

したがって、無細胞プロセスは、鎖置換での複製によるテンプレートの増幅を含む。ＤＮＡを合成するための無細胞プロセスであって、１種またはそれより多くのプライマー、ヌクレオチドおよび金属カチオンの存在下で、ＤＮＡテンプレートを少なくとも１種のポリメラーゼと接触させて、前記テンプレートの増幅を促進する条件下で、鎖置換での複製により反応混合物を形成することを含み、さらなる金属イオンは、制御された方法で反応混合物に供給される、上記プロセスが提供される。

代替として、ＤＮＡを合成するための無細胞プロセスであって、ヌクレオチドおよび金属カチオンの存在下で、ＤＮＡテンプレートを少なくとも１種のポリメラーゼと接触させて、前記テンプレートの増幅を促進する条件下で、別の鎖の鎖置換での複製により複製された鎖を置換することによって反応混合物を形成することを含み、さらなる金属カチオンが、制御された方法で反応混合物に供給される、上記プロセスが提供される。

したがって、無細胞プロセスは、鎖置換での複製によるテンプレートの増幅を含む。ＤＮＡを合成するための無細胞プロセスであって、ヌクレオチドおよび金属カチオンの存在下で、ＤＮＡテンプレートを少なくとも１種のポリメラーゼと接触させて、前記テンプレートの増幅を促進する条件下で、鎖置換での複製により反応混合物を形成することを含み、さらなる金属イオンは、制御された方法で反応混合物に供給される、上記プロセスが提供される。

したがって、この合理的な制御方策はＤＮＡの合成速度の改善を可能にするため、反応混合物へのさらなる金属カチオンの制御された供給の提供が有利である。これらの改善は、開始時に全ての金属カチオンが反応混合物中に供給されている類似の反応混合物と比較される。さらなる金属カチオンの制御された供給は、ポリメラーゼ酵素の生産性および／または処理能力の増加をもたらす可能性がある。

ＤＮＡを合成するための無細胞プロセスであって、１種またはそれより多くのプライマー、ヌクレオチドおよび金属カチオンの存在下で、ＤＮＡテンプレートを少なくとも１種のポリメラーゼと接触させて、前記テンプレートの増幅を促進する条件下で、別の鎖の鎖置換での複製により複製された鎖を置換することによって反応混合物を形成することを含み、さらなるヌクレオチドおよび金属カチオンは、制御された方法で反応混合物に供給される、上記プロセスも提供される。

したがって、無細胞プロセスは、鎖置換での複製によるテンプレートの増幅を含む。ＤＮＡを合成するための無細胞プロセスであって、１種またはそれより多くのプライマー、ヌクレオチドおよび金属イオンの存在下で、ＤＮＡテンプレートを少なくとも１種のポリメラーゼと接触させて、前記テンプレートの増幅を促進する条件下で、鎖置換での複製により反応混合物を形成することを含み、さらなるヌクレオチドおよびさらなる金属カチオンは、制御された方法で反応混合物に供給される、上記プロセスが提供される。

ＤＮＡを合成するための無細胞プロセスであって、ヌクレオチドおよび金属カチオンの存在下で、ＤＮＡテンプレートを少なくとも１種のポリメラーゼと接触させて、前記テンプレートの増幅を促進する条件下で、別の鎖の鎖置換での複製により複製された鎖を置換することによって反応混合物を形成することを含み、さらなるヌクレオチドおよび金属カチオンは、制御された方法で反応混合物に供給される、上記プロセスも提供される。

したがって、無細胞プロセスは、鎖置換での複製によるテンプレートの増幅を含む。ＤＮＡを合成するための無細胞プロセスであって、ヌクレオチドおよび金属イオンの存在下で、ＤＮＡテンプレートを少なくとも１種のポリメラーゼと接触させて、前記テンプレートの増幅を促進する条件下で、鎖置換での複製により反応混合物を形成することを含み、さらなるヌクレオチドおよびさらなる金属カチオンは、制御された方法で反応混合物に供給される、上記プロセスが提供される。

さらなるヌクレオチドおよびさらなる金属カチオンは、一緒にまたは別々に供給され得る。ヌクレオチドおよび金属イオンは、反応混合物に供給される前に一緒に混合されないことが好ましい。さらなるヌクレオチドおよびさらなる金属カチオンは、互いに独立して、それぞれ必要に応じて反応混合物に添加されてもよい。

したがって、この合理的な制御方策は、ＤＮＡの合成速度および／または改善されたＤＮＡ収量の改善を可能にするため、反応混合物へのさらなるヌクレオチドおよびさらなる金属カチオンの制御された供給の提供が有利である。これらの改善は、開始時に全てのヌクレオチドおよび金属カチオンが反応混合物中に供給されている類似の反応混合物と比較される。さらなるヌクレオチドの制御された供給は、ポリメラーゼ酵素の生産性および／または処理能力の増加をもたらす可能性がある。

本発明の数々のさらなる形態のそれぞれによれば、本発明の第１、第２または第３の形態に係るプロセスを実行するように設計された装置が提供される。本装置は、本発明のいずれかの形態に係るプロセスを実行するのに使用することができる。

本発明のさらなる形態によれば、ＤＮＡテンプレートは、１つまたはそれより多くのプロセシング酵素の標的部位を含んでいてもよい。反応混合物は、１つまたはそれより多くのプロセシング酵素といつ接触させてもよい。前記酵素は、制御された方法で、前記反応混合物に提供されてもよい。好ましくは、プロセシング酵素は、プロテロメラーゼ酵素である。

独立して、本発明のいずれかの形態の任意の特徴は、以下の通りであり得る：ＤＮＡテンプレートは、環状であってもよい。前記ＤＮＡテンプレートの鎖置換増幅は、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）によって行われてもよい。ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｈｉ２９またはそれらの変異体であってもよい。ＤＮＡの増幅は、等温増幅であってもよい。１種またはそれより多くのプライマーは、ランダムプライマーであってもよい。合成されたＤＮＡは、ＤＮＡテンプレートから増幅されたＤＮＡ配列のタンデム単位を含むコンカテマーを含んでいてもよい。ＤＮＡテンプレートは、閉じた直鎖状ＤＮＡであってもよく、好ましくはＤＮＡテンプレートは、変性条件下でインキュベートされて、閉じた環状一本鎖ＤＮＡを形成する。ＤＮＡテンプレートは、少なくとも１つのプロセシング酵素の標的配列、好ましくはリコンビナーゼ標的配列またはプロテロメラーゼ標的配列を含んでいてもよい。ＤＮＡテンプレートは、目的のコード配列に機能するように連結した真核生物プロモーター、および任意に真核生物転写終結配列を含む発現カセットを含んでいてもよい。発現カセットは、その両端に、プロセシング酵素の標的配列、好ましくはリコンビナーゼ標的配列またはプロテロメラーゼ標的配列を有していてもよい。増幅されたＤＮＡは、必要に応じて、リコンビナーゼ酵素またはプロテロメラーゼ酵素と接触させてもよい。

合成され得るＤＮＡの量は、反応混合物１リットル当たり１グラムに等しいかまたはそれより高い。
さらなるヌクレオチドおよび／またはさらなる金属イオンは、複数のアリコートで反応混合物に供給されてもよい。さらなるヌクレオチドおよび／またはさらなる金属イオンは、プロセスの持続時間中にわたり一定間隔で、任意に少なくとも３０分毎に供給されてもよい。少なくとも３、４、５、６、７、８、９または１０個のアリコートが、反応混合物に供給されてもよい。さらなるヌクレオチドおよび／またはさらなる金属イオンは、連続的な方式で反応混合物に供給されてもよい。さらなる金属イオンおよび／またはさらなるヌクレオチドは、任意にポンプを使用して外部源から反応混合物にフィードされてもよいし、または浸透圧ポンプの使用により反応混合物に供給される。

ヌクレオチドまたはさらなるヌクレオチドは、生物学的に不活性なヌクレオチドを含んでいてもよく、任意にこれらの生物学的に不活性なヌクレオチドは、好ましくは化学的または物理的手段による活性化を経て反応混合物に供給される。生物学的に不活性なヌクレオチドは、光分解により活性化されるケージドヌクレオチドであってもよい。

さらなるヌクレオチドおよび／またはさらなる金属イオンおよび／またはプロセシング酵素は、反応混合物中のＤＮＡの濃度に関するシグナルに応答して供給されてもよく、このシグナルは、シグナルを生成する可能性がある反応混合物またはそれらの一部の圧力差を測定することによって、任意にモニターされていてもよい。ＤＮＡの濃度を示すシグナルは、任意に圧力センサーで、反応混合物の一部を取り出したり戻したりする往復ポンプによって生じた圧力差を測定することによって生成されてもよい。

金属カチオンまたはさらなる金属カチオンは、Ｍｇ^２＋、Ｂｅ^２＋、Ｃａ^２＋、Ｓｒ^２＋、Ｌｉ^＋、Ｎａ^＋、Ｋ^＋、Ｍｎ^２＋またはＺｎ^２＋からなる列挙から選択される１種またはそれより多くの金属、好ましくはＭｇ^２＋を含んでいてもよい。さらなる金属カチオンが、さらなるヌクレオチドと共に供給されてもよい。金属カチオンとヌクレオチドとの比率は、反応混合物中で約３：１に維持されてもよい。本明細書で論じられた金属イオンの濃度、特に遊離の金属イオンの濃度は、反応混合物中の金属イオンの全ての種の濃度ではなく、目的とする特定の金属カチオン（すなわちＭｇ^２＋）に関する。

反応混合物は、少なくとも１種のヌクレオチドを含有していてもよい。次いで１種またはそれより多くのさらなるヌクレオチドが添加されてもよい。ヌクレオチドまたはさらなるヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、またはそれらの誘導体もしくは改変されたバージョンである。ヌクレオチドまたはさらなるヌクレオチドは、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）およびそれらの誘導体の１種またはそれより多くである。ヌクレオチドまたはさらなるヌクレオチドは、遊離酸の１種またはそれより多く、それらの塩またはそれらのキレートとして提供される。塩またはキレートとしては、以下の金属イオン：Ｍｇ^２＋、Ｂｅ^２＋、Ｃａ^２＋、Ｓｒ^２＋、Ｌｉ^＋、Ｎａ^＋、Ｋ^＋、Ｍｎ^２＋またはＺｎ^２＋の１種またはそれより多くを挙げることができる。反応混合物中のヌクレオチドの濃度は、０．００１ｍＭから６ｍＭの間、任意に約３ｍＭに維持されてもよい。

本プロセスは、バッチプロセスまたは連続フロープロセスであってもよい。さらなる任意の特徴は、従属項で説明されている通りである。
さらなる利点は、後述される。

図面の簡単な説明
以下、例示的な実施態様および添付の図面を参照しながら本発明をさらに説明する。

図１は、本発明の実施態様に係る有用な合成装置の斜視図である。理解のためと主要な構成要素をより見やすくするために、この図において、特定の構成要素および接続用コンジットは省略されている。 図２は、図１の装置の概略図である。 図３は、本発明の実施態様に係る有用な反応容器の断面図である。 図４は、時間（表１で説明される）に対する、水のみの制御反応の場合の差圧データ（四角）を、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ（ひし形）を使用した標準的なＤＮＡ増幅反応から作成したデータと比較するデータを示すグラフである。圧力差の単位は任意であり、時間は分単位である； 図５は、Ｑｕｂｉｔ（登録商標）ＢＲ ｄｓＤＮＡ蛍光アッセイによって測定された圧力差対ＤＮＡ濃度のプロットである。圧力差の単位は任意であり、ＤＮＡ濃度はμｇ／ｍｌ単位である。 図６は、２ｍＭ、４ｍＭおよび８ｍＭのｄＮＴＰ濃度で開始したＤＮＡ増幅反応における、共有結合で閉じた直鎖状ＤＮＡ生成物（２．６ｋベースおよび２ｋベース）の電気泳動ゲルの写真である。 図７は、２ｍＭのｄＮＴＰの開始濃度（追加のｄＮＴＰ添加なし）（白丸）、追加の２ｍＭのｄＮＴＰがフィードされた２ｍＭのｄＮＴＰ（三角）、開始からの４ｍＭのｄＮＴＰ（追加のｄＮＴＰ添加なし）（ひし形）および２ｍＭの濃度の追加のｄＮＴＰが３回フィードされた２ｍＭのｄＮＴＰ（十字）を用いた反応に関する、時間（分）に対する差圧測定のプロットである。矢印は、各反応におけるｄＮＴＰ添加の時間を示す。 図８は、２ｍＭのｄＮＴＰが追加の３回フィードされた２ｍＭのｄＮＴＰの開始濃度を用いた反応における、マグネシウムイオンとｄＮＴＰとの比率に対する最初の反応速度（差圧単位／分）のプロットである。 図９は、ｐｒｏＴＬｘ−Ｎ３Ｘ２ Ｃａｌ０９ＨＡ ＤＮＡテンプレートを描写する。 図１０は、ｐｒｏＴＬｘ Ｂ５Ｘ４ Ｃａｌ０９ＨＡ ＤＮＡテンプレートを描写する。 図１１は、ｐｒｏＴＬｘ−Ｋ Ｎ３Ｘ２ ｏｖａ ＤＮＡテンプレートを描写する。 図１２は、ｐｒｏＴＬｘ−Ｋ Ｎ３Ｘ２ ｌｕｘ ＤＮＡテンプレートを描写する。 図１３は、初期において２ｍＭのｄＮＴＰおよび７．５ｍＭのＭｇ^２＋を含有する反応に関する時間（分）に対する差圧測定のプロットを描写し、この反応は、示されたポイント（３００分、６００分、９００分、１０８０分、１２３０分および１４４０分、白色の三角）における、第１のフィードの後に２ｍＭのｄＮＴＰと３：１のＭｇ^２＋：ｄＮＴＰの比率を維持するのに十分なＭｇ^２＋とを用いたヌクレオチドおよびＭｇ^２＋の制御された添加（「フィード」）を含み、それへのプロテロメラーゼの制御された添加は、示されたように（四角）１０５０分（２μＭのＴｅｌＮ）でなされる。矢印は、Ｍｇ^２＋添加およびＴｅｌＮ添加直後の各ｄＮＴＰ添加の時間を示す。

詳細な説明
本発明は、ＤＮＡを合成するための無細胞プロセスに関する。本発明のプロセスは、ＤＮＡのハイスループット合成を可能にする。

本発明に従って合成されるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）は、あらゆるＤＮＡ分子であり得る。ＤＮＡは、一本鎖または二本鎖であってもよい。ＤＮＡは、直鎖状であってもよい。ＤＮＡは、プロセシングされて、環、特に小環、一本鎖の閉じた環、二本鎖の閉じた環、二本鎖の開いた環、または閉じた直鎖状の二本鎖ＤＮＡを形成してもよい。ＤＮＡは、特定の二次構造、例えば、これらに限定されないが、ヘアピンループ（ステムループ）、不完全なヘアピンループ、シュードノット、または様々な種類の二重らせんのいずれか１つ（Ａ−ＤＮＡ、Ｂ−ＤＮＡ、またはＺ−ＤＮＡ）を形成できるようにされていてもよいし、またはそれらを形成できるようにプロセシングされていてもよい。またＤＮＡは、ヘアピンを形成していてもよい。

合成されたＤＮＡは、あらゆる好適な長さを有していてもよい。本発明のプロセスを使用した場合、最大７７キロベース（ｋｂまたはｋベース）またはそれを超える長さが考えられる。より特定には、本プロセスに従って合成され得るＤＮＡの長さは、およそで最大６０キロベース、または最大５０キロベース、または最大４０キロベース、または最大３０キロベースであってもよい。好ましくは、合成されたＤＮＡは、１００ベースから６０キロベース、２００ベースから２０キロベース、より好ましくは２００ベースから１５キロベース、最も好ましくは２キロベースから１５キロベースであってもよい。

本発明のプロセスに従って合成されたＤＮＡの量は、反応混合物１ｌ当たり１０ｇを超えてもよい。合成されたＤＮＡの量は、最大１０、９、８、７、６または５ｇ／ｌであることが好ましい。合成されたＤＮＡの好ましい量は、０．２から５ｇ／ｌ、好ましくは１から５ｇ／ｌである。生産されたＤＮＡの量は、ラージスケールの生産または大量生産での工業的または商業的な量として説明される場合もある。本プロセスによって生産されたＤＮＡは、品質において、すなわちＤＮＡの長さおよび配列において一様であってもよい。したがって本プロセスは、ラージスケールのＤＮＡ合成に好適であり得る。

現在利用可能なＤＮＡ合成技術において、ほとんどは小規模または実験室ベースのスケールであり、反応はマイクロリットルレベルの体積で起こる。それでもなおＰＣＲをスケールアップしようとする試みも、反応はヌクレオチドの開始量でのみ起こり、さらなるヌクレオチドが供給されず、生成物の形成は反応を阻害するために、不十分なＤＮＡ収量、例えば反応混合物１リットル当たりおよそ２０〜４０ｍｇにしかならない（ヴァンダリア（Vandalia））。

ＤＮＡテンプレートは、あらゆる好適なテンプレートであってもよい。ＤＮＡテンプレートは、一本鎖（ｓｓ）または二本鎖（ｄｓ）であってもよい。ＤＮＡテンプレートは、直鎖状または環状であってもよい。二本鎖ＤＮＡテンプレートは、開いた環状ｄｓＤＮＡ、閉じた環状ｄｓＤＮＡ、開いた直鎖状ｄｓＤＮＡまたは閉じた直鎖状ｄｓＤＮＡであってもよい。一本鎖のＤＮＡテンプレートは、直鎖状ｓｓＤＮＡまたは閉じた環状ｓｓＤＮＡであってもよい。後者のＤＮＡテンプレートは、閉じた直鎖状ｄｓＤＮＡを変性させることによって生産することができる。閉じた直鎖状ＤＮＡ、すなわち直鎖状ｄｓの共有結合で閉じたＤＮＡ分子は、典型的には、共有結合で閉じた末端、すなわちヘアピン末端を含み、ここで相補的ＤＮＡ鎖間の塩基対は存在しない。ヘアピンループは、相補的ＤＮＡ鎖の末端を合体させる。特にループがプロテロメラーゼ標的配列の一部を含む場合、ループはそれ自身が、相補配列を含有していてもよい。閉じた直鎖状ｄｓＤＮＡは、プラスミドであってもよい。

ＤＮＡテンプレートは、天然に誘導された、または人工のあらゆる配列を含んでいてもよい。ＤＮＡテンプレートは、少なくとも１つのプロセシング酵素の標的配列、例えば１つ、２つ、３つ、４つまたはそれより多くのプロセシング酵素の標的部位を含んでいてもよい。このような標的配列は、任意に合成後にさらにＤＮＡをプロセシングすることを可能にすると予想される。プロセシング酵素は、その標的部位を認識してＤＮＡをプロセシングする酵素である。プロセシング酵素の標的配列は、制限酵素に関する標的配列であってもよい。制限酵素、すなわち制限エンドヌクレアーゼは、標的配列に結合して、特異的なポイントで切断する。プロセシング酵素の標的配列は、リコンビナーゼに関する標的であってもよい。リコンビナーゼは、各リコンビナーゼに特異的な短い（３０〜４０ヌクレオチドの）標的部位配列間のＤＮＡ交換反応を指向的に触媒する。リコンビナーゼの例としては、Ｃｒｅリコンビナーゼ（標的配列としてｌｏｘＰを有する）およびＦＬＰリコンビナーゼ（短いフリッパーゼ認識標的（ＦＲＴ）部位を有する）が挙げられる。プロセシング酵素の標的配列は、部位特異的なインテグラーゼ、例えばｐｈｉＣ３１インテグラーゼのための標的であってもよい。プロセシング酵素の標的配列は、プロテロメラーゼ酵素のための標的であってもよい。プロテロメラーゼ標的配列は、ＤＮＡテンプレート中にそれが存在することにより、プロテロメラーゼの酵素活性により閉じた直鎖状ＤＮＡへの変換が可能になるあらゆるＤＮＡ配列である。言い換えれば、プロテロメラーゼ標的配列は、共有結合で閉じた直鎖状ＤＮＡを形成するための、プロテロメラーゼによる二本鎖のＤＮＡの切断および再ライゲーションに必要である。典型的には、プロテロメラーゼ標的配列は、あらゆるパリンドローム配列、すなわち２倍の回転対称性を有するあらゆる二本鎖ＤＮＡ配列を含み、これらはまた、本明細書では逆方向反復配列としても記載される。逆方向反復配列の長さは、具体的な生物に応じて異なる。パリンドロームまたは逆方向反復配列は、完全であってもよいし、または不完全であってもよい。プロテロメラーゼ標的配列は、好ましくは、長さが少なくとも１４塩基対の二本鎖のパリンドローム（逆方向反復配列）配列を含む。好適なプロテロメラーゼ標的部位は、当業界において公知であり、参照により本明細書に組み入れられるＥＰ２，３９１，７３１で論じられている。好適なプロテロメラーゼ酵素は、大腸菌（Escherichia coli）ファージＮ１５からのＴｅｌＮであってもよい。プロセシング酵素の標的部位は、プロテロメラーゼの標的部位であることが好ましい。

プロセシング酵素の標的配列は、ＤＮＡがポリペプチド合成のためのテンプレートになるように、ＲＮＡポリメラーゼのための標的配列であってもよい。この例において、プロセシング酵素の標的部位は、プロモーター、好ましくは真核生物プロモーターである。

本プロセスは、反応混合物をプロセシング酵素と接触させる追加の工程を含んでいてもよい。反応混合物は、プロセシング酵素といつ接触させてもよい。好ましくは、反応混合物は、ＤＮＡ合成が完了したら、プロセシング酵素と接触する。プロセシング酵素は、ＲＮＡポリメラーゼ、リコンビナーゼ、制限エンドヌクレアーゼまたはプロテロメラーゼであってもよい。好ましくは、プロセシング酵素は、プロテロメラーゼである。

プロテロメラーゼは、本発明で使用できることからも、共有結合で閉じた直鎖状ＤＮＡ分子を生産するために、プロテロメラーゼの標的部位を含むテンプレートを切断し再び合体させることが可能なあらゆるポリペプチドである。したがって、プロテロメラーゼは、ＤＮＡ切断およびライゲーション機能を有する。プロテロメラーゼタイプの活性を有する酵素はまた、テロメアレゾルバーゼ（例えばボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）におけるもの）としても説明されている。プロテロメラーゼの典型的な基質は、環状の二本鎖ＤＮＡである。このＤＮＡがプロテロメラーゼの標的部位を含有する場合、酵素は、ＤＮＡをこの部位で切断して、末端をライゲートして、直鎖状の二本鎖の共有結合で閉じたＤＮＡ分子を作り出すことができる。プロテロメラーゼの標的部位に関する必要条件は、上記で論じられている。上記で概説したように、プロテロメラーゼの標的部位を含むテンプレートから閉じた直鎖状ＤＮＡの生産を触媒する所与のポリペプチドの能力は、当業界で説明されるあらゆる好適なアッセイを使用して決定することができる。

ＤＮＡのプロセシングは、少なくとも１種のプロテロメラーゼの使用を必要とする場合がある。本発明のプロセスは、１種より多くのプロテロメラーゼ、例えば２、３、４、５種またはそれより多くの異なるプロテロメラーゼの使用を含んでいてもよい。好適なプロテロメラーゼの例としては、バクテリオファージからのもの、例えばハロモナス・クアマリナ（Halomonas quamarina）からのｐｈｉＨＡＰ−１、エルシニア・エンテロリティカ（Yersinia enterolytica）からのＰＹ５４、クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）からのｐｈｉＫ０２、およびビブリオ属種からのＶＰ８８２、および大腸菌（配列番号１５）からのＮ１５、またはそれらのあらゆる変異体が挙げられる。バクテリオファージＮ１５プロテロメラーゼまたはそれらの変異体の使用が特に好ましい。この酵素は、ＴｅｌＮとも称される。これらの酵素は、参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１２／０１７２１０でさらに説明されている。

したがって本プロセスは、プロセシング酵素を包含するＤＮＡテンプレート上で実行することができ、プロセシング酵素は、制御された方法で反応混合物に供給することができる。プロセシング酵素は、あらゆる適切な時間で反応混合物に供給することができ、これは、シグナルに応答してなされてもよい。プロセシング酵素の１回またはそれより多くの添加がなされてもよい。プロセシング酵素は、アリコートで供給され、それらは不連続的に反応混合物に添加されることが好ましい。１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれより多くのプロセシング酵素のアリコートが反応混合物に添加されてもよい。さらなるヌクレオチドおよび／またはさらなる金属イオンのアリコートが必要になる直前に、プロセシング酵素を添加することが有利な場合がある。代替として、プロセシング酵素は、さらなるヌクレオチドのアリコートが反応混合物に添加されると共に、またはその後に添加されてもよい。プロセシング酵素は、反応混合物中のＤＮＡが望ましい濃度に達したというシグナルに応答して添加されてもよい。このＤＮＡ濃度は、本明細書で説明されるように検出してもよい。

ＤＮＡテンプレートは、目的のタンパク質、および任意に真核生物転写終結配列を包含する配列に機能するように連結した真核生物プロモーターを含む、それからなる、またはそれから本質的になる発現カセットを含んでいてもよい。任意に、発現カセットは、典型的には（ｉ）細菌の複製起点；（ｉｉ）細菌の選択マーカー（例えば抗生物質耐性遺伝子）、および（ｉｉｉ）非メチル化ＣｐＧモチーフからなる群より選択される１つまたはそれより多くの細菌またはベクター配列を欠失した最小カセットであってもよい。「プロモーター」は、ポリヌクレオチドの転写を開始および調節するヌクレオチド配列である。プロモーターとしては、誘導性プロモーター（この場合、プロモーターに機能するように連結したポリヌクレオチド配列の発現は、分析物、補因子、調節タンパク質などによって誘導される）、抑制性プロモーター（この場合、プロモーターに機能するように連結したポリヌクレオチド配列の発現は、分析物、補因子、調節タンパク質などによって抑制される）、および構成的プロモーターを挙げることができる。用語「プロモーター」または「制御要素」は、全長プロモーター領域およびこれらの領域の機能的な（例えば、転写または翻訳を制御する）セグメントを包含することが意図される。「機能するように連結した」は、要素の配列を指しており、そのようにして説明される構成要素は、それらの通常の機能が発揮されるように設計される。したがって、核酸配列に機能するように連結した所与のプロモーターは、適した酵素が存在するときにその配列の発現を実行することが可能である。プロモーターは、配列の発現を指示するように機能する限り、必ずしも配列と隣接していなくてもよい。したがって、例えば、翻訳されないが転写される配列の介在が、プロモーター配列と核酸配列との間に存在していてもよく、プロモーター配列は、それでもなおコード配列に「機能するように連結した」とみなすことができる。したがって、用語「機能するように連結した」は、転写複合体によりプロモーター要素が認識されたときに目的のＤＮＡ配列の転写の開始を可能にする、プロモーター要素と目的のＤＮＡ配列とのあらゆる間隔または方向を包含することが意図される。

ＤＮＡテンプレートは、あらゆる好適な長さを有していてもよい。特に、ＤＮＡテンプレートは、最大６０キロベース、または最大５０キロベース、または最大４０キロベース、または最大３０キロベースであってもよい。好ましくはＤＮＡテンプレートは、１００ベースから６０キロベース、２００ベースから２０キロベース、より好ましくは２００ベースから１５キロベース、最も好ましくは２キロベースから１５キロベースであってもよい。

ＤＮＡテンプレートは、当業界において公知のあらゆる方法によって、本プロセスでの使用に十分な量で提供されてもよい。例えば、テンプレートは、ＰＣＲによって生産されてもよい。

本プロセスにおいて、ＤＮＡテンプレートの全体または選択された部分が増幅されてもよい。
ＤＮＡテンプレートは、発現のためのＤＮＡ配列を含んでいてもよい。ＤＮＡは、細胞（すなわちインビトロまたはインビボでトランスフェクトされた細胞）における発現のためであってもよいし、または無細胞系における発現（すなわちタンパク質合成）のためであってもよい。発現のためのＤＮＡ配列は、目的とする治療、すなわちＤＮＡワクチンの遺伝子治療のためであってもよい。発現のための配列は遺伝子であってもよく、前記遺伝子は、ＤＮＡワクチン、治療用タンパク質および同種のものをコードしていてもよい。ＤＮＡ配列は、活性なＲＮＡの形態、すなわち短鎖干渉ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）に転写される配列を含んでいてもよい。

ＤＮＡテンプレートは、少なくとも１種のポリメラーゼと接触する。１、２、３、４または５種の異なるポリメラーゼが使用されてもよい。ポリメラーゼは、ＤＮＡのポリマーを合成するあらゆる好適なポリメラーゼであってもよい。ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼであってもよい。あらゆる市販のＤＮＡポリメラーゼを包含するあらゆるＤＮＡポリメラーゼが使用されてもよい。２、３、４、５種またはそれより多くの異なるＤＮＡポリメラーゼが使用されてもよく、例えば校正機能やそれ以外の１種またはそれより多くの機能を提供するＤＮＡポリメラーゼが使用されてもよい。異なるメカニズムを有するＤＮＡポリメラーゼ、例えば鎖置換型のポリメラーゼおよび他の方法でＤＮＡを複製するＤＮＡポリメラーゼが使用されてもよい。鎖置換活性を有さないＤＮＡポリメラーゼの好適な例は、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼである。

ポリメラーゼは、プロセス条件下での持続的なインキュベーションによってその活性が実質的に低減されないように、高度に安定していてもよい。それゆえに、酵素は、好ましくは、これらに限定されないが温度およびｐＨなどの様々なプロセス条件下で、長い半減期を有する。またポリメラーゼは、製造プロセスにとって好適な１つまたはそれより多くの特徴を有することも好ましい。ポリメラーゼは、好ましくは、例えば校正活性を有することにより高い忠実度を有する。さらに、ポリメラーゼは、高い処理能力、高い鎖置換活性、およびｄＮＴＰとＤＮＡとに関して低いＫｍを示すことが好ましい。ポリメラーゼは、テンプレートとして環状および／または直鎖状ＤＮＡを使用することが可能であってもよい。ポリメラーゼは、テンプレートとしてｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡを使用することが可能であってもよい。ポリメラーゼは、その校正活性に関連しないＤＮＡエキソヌクレアーゼ活性を示さないことが好ましい。

当業者は、市販のポリメラーゼ、例えばＰｈｉ２９（ニューイングランドバイオラボ社（New England Biolabs, Inc.）、米国マサチューセッツ州イプスウィッチ）、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（登録商標）（ニューイングランドバイオラボ社）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）（Ｂｓｔ）ＤＮＡポリメラーゼＩ（ニューイングランドバイオラボ社）、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメント（ニューイングランドバイオラボ社）、Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素（ニューイングランドバイオラボ社）、ＶｅｎｔＲ（登録商標）（エキソマイナス）ＤＮＡポリメラーゼ（ニューイングランドバイオラボ社）、ＶｅｎｔＲ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（ニューイングランドバイオラボ社）、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（登録商標）（エキソ−）ＤＮＡポリメラーゼ（ニューイングランドバイオラボ社）およびＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ大フラグメント（ニューイングランドバイオラボ社）によって示された特性との比較によって、所与のポリメラーゼが上記で定義されたような特徴を示すかどうかを決定することができる。高い処理能力と述べられる場合、これは、典型的には、テンプレートとの会合／解離１回当たりのポリメラーゼ酵素によって付加されたヌクレオチドの平均数、すなわち単一の会合事象から得られたプライマー伸長の長さを示す。

鎖置換型のポリメラーゼが好ましい。好ましい鎖置換型のポリメラーゼは、Ｐｈｉ２９、Ｄｅｅｐ ＶｅｎｔおよびＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼＩまたはそれらのあらゆる変異体である。「鎖置換」は、合成中に二本鎖ＤＮＡの領域と遭遇したときに相補鎖を置換するポリメラーゼの能力を説明する。したがってテンプレートは、相補鎖を置換して新しい相補鎖を合成することによって増幅される。したがって、鎖置換での複製中、新たに複製された鎖が置換されて、ポリメラーゼにさらなる相補鎖を複製するための進路をもたらすことになる。一本鎖テンプレートのプライマーまたは３’の遊離末端がテンプレート上で相補配列にアニールすると、増幅反応が開始する（両方ともプライミング事象である）。ＤＮＡ合成が進行して、さらなるプライマーまたはテンプレートにアニールした他の鎖と遭遇すると、ポリメラーゼはこれを置換して、その鎖の伸長を継続する。鎖置換は、より多くのプライミング事象のためにテンプレートとして作用することができる新たに合成された一本鎖ＤＮＡを生成する。新たに合成されたＤＮＡのプライミングは、超分岐、および高い生成物収量をもたらす。二本鎖ＤＮＡが新しいＤＮＡ鎖の継続的な合成への妨害にならないために、変性のサイクルが効率的なＤＮＡ増幅にとって必須ではないという点で、鎖置換増幅方法は、ＰＣＲベースの方法とは異なることが理解されるはずである。鎖置換増幅は、プライマーが使用される場合にそれをプライマー結合部位にアニールさせるために、最初のテンプレートが二本鎖である場合、それを変性させるための１回の最初の加熱ラウンドのみを必要とすることがある。これ以降、増幅は、さらなる加熱または冷却が必要ではないため等温と記載される場合もある。対照的に、ＰＣＲ方法は、二本鎖ＤＮＡを溶融させて新しい一本鎖テンプレートを提供するために、増幅プロセス中に変性（すなわち温度を９４℃またはそれより高く高めること）のサイクルを必要とする。鎖置換中、ポリメラーゼは、すでに合成されたＤＮＡの鎖を置換することになる。さらに、新たに合成されたＤＮＡをテンプレートとして使用することになり、ＤＮＡの急速な増幅を確実にする。

本発明のプロセスで使用される鎖置換ポリメラーゼは、好ましくは、少なくとも２０ｋｂ、より好ましくは、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、または少なくとも７０ｋｂまたはそれより多くの処理能力を有する。一実施態様において、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼは、ｐｈｉ２９のＤＮＡポリメラーゼに匹敵するかまたはそれより高い処理能力を有する。

それゆえに、鎖置換での複製が好ましい。鎖置換での複製中、テンプレートは、ポリメラーゼの作用によって合成されたすでに複製された鎖を置換し、順に別の鎖を置換することによって増幅され、ここで別の鎖は、二本鎖テンプレートの元の相補鎖か、または新たに合成された相補鎖であってもよく、後者は、テンプレートにアニールした最初のプライマー上でポリメラーゼの作用によって合成されたものである。したがって、テンプレートの増幅は、別の鎖の鎖置換での複製により複製された鎖を置換することによって起こり得る。このプロセスは、鎖置換増幅または鎖置換での複製と記載される場合もある。

好ましい鎖置換での複製プロセスは、ループ介在等温増幅、またはＬＡＭＰである。ＬＡＭＰは、一般的に、テンプレートＤＮＡの６〜８種の別個の領域を認識する４〜６種のプライマーを使用する。簡単に言えば、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼが合成を開始させると、プライマーの２つがループ構造を形成して、それに続く増幅ラウンドを容易にする。標的ＤＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖の配列を含有する内部プライマーが、ＬＡＭＰを開始させる。それに続く外部プライマーによってプライミングされる鎖置換ＤＮＡ合成は、一本鎖ＤＮＡを放出する。これは、標的の他の末端にハイブリダイズしてステム−ループＤＮＡ構造を生じさせる第２の内部および外部プライマーによってプライミングされるＤＮＡ合成のためのテンプレートとして役立つ。それに続くＬＡＭＰサイクルにおいて、１つの内部プライマーが生成物上でループにハイブリダイズして、置換ＤＮＡ合成が開始すると、元のステム−ループＤＮＡおよびステムが２倍長い新しいステム−ループＤＮＡが生じる。

好ましい鎖置換での複製プロセスは、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）である。ＲＣＡという用語は、ハイブリダイズしたプライマーを伸長させながら環状ＤＮＡテンプレート鎖の周辺で連続的に進行するＲＣＡ型のポリメラーゼの能力を説明している。これは、増幅したＤＮＡの複数の反復を有する直鎖状の一本鎖生成物の形成を引き起こす。環状テンプレート（単一ユニット）の配列は、直鎖状生成物中で多重的に繰り返される。環状テンプレートの場合、最初の鎖置換増幅生成物は、テンプレートの極性に応じてセンスまたはアンチセンスのいずれかの一本鎖のコンカテマーである。これらの直鎖状の一本鎖生成物は、同様に増幅したＤＮＡの複数の反復を含むコンカテマー様の二本鎖ＤＮＡ生成物の形成を引き起こす、複数のハイブリダイゼーション、プライマー伸長および鎖置換事象の基準として役立つ。したがって、コンカテマー様の二本鎖ＤＮＡ生成物中に、増幅された「単一ユニット」ＤＮＡそれぞれの複数のコピーが存在する。ＲＣＡポリメラーゼが、本発明のプロセスでの使用に特に好ましい。ＲＣＡ型の鎖置換での複製プロセスの生成物は、単一ユニットのＤＮＡを放出するためにプロセシングを必要とする場合がある。これは、ＤＮＡの単一ユニットが必要な場合に望ましい。

増幅を可能にするために、ＤＮＡテンプレートは、１種またはそれより多くのプライマーとも接触する。プライマーは、ＤＮＡテンプレート内に含まれる１つまたはそれより多くの配列に、非特異的（すなわち配列中でランダム）であってもよいし、または特異的であってもよい。プライマーがランダム配列を有する場合、それらはＤＮＡテンプレート上のあらゆる部位で非特異的な開始を可能にする。これは、各テンプレート鎖からの複数の開始反応による高い効率の増幅を可能にする。ランダムプライマーの例は、六量体、七量体、八量体、九量体、十量体であるか、またはそれより長さが大きい配列であり、例えば１２、１５、１８、２０または３０ヌクレオチドの長さを有する。ランダムプライマーは、６から３０、８から３０または１２から３０ヌクレオチドの長さを有していてもよい。ランダムプライマーは、典型的には、ＤＮＡテンプレートにおいて例えば六量体、七量体、八量体または九量体の全ての可能な組合せを代表するオリゴヌクレオチドの混合物として提供される。

一実施態様において、プライマーまたはプライマーの１つもしくはそれより多くは、特異的である。これは、プライマーが、そこから増幅が開始されることが望ましいＤＮＡテンプレート中の配列に相補的な配列を有することを意味する。この実施態様において、プライマーの対は、２つのプライマー結合部位の内側にあるＤＮＡテンプレートの部分を特異的に増幅するのに使用される可能性がある。代替として、単一の特異的なプライマーが使用される可能性がある。

一実施態様において、ＤＮＡテンプレートは、１つまたはそれより多くのプロテロメラーゼ標的配列を包含する。このような標的配列は、パリンドロームの性質を有する。この実施態様において、プロテロメラーゼ結合部位内のパリンドローム配列に結合する特異的なプライマーを使用することが可能になり、したがってＤＮＡテンプレートの両方の鎖で増幅をプライミングすることができる。このようなプロセスは、ＷＯ２０１２／０１７２１０で詳細に説明されている。したがって、単一のプライマーは、増幅するのに十分である。

プライマーは、標識されていなくてもよいし、または１種またはそれより多くの標識、例えば放射性核種または蛍光色素を含んでいてもよい。またプライマーは、化学的に改変されたヌクレオチドを含んでいてもよい。例えば、キャップが除去されるまで、すなわち化学的または物理的手段によって除去されるまでＤＮＡ合成の開始を防ぐために、プライマーはキャップされていてもよい。プライマーの長さ／配列は、典型的には、温度の検討に基づき、すなわち増幅工程において使用される温度でテンプレートに結合することができるように選択されてもよい。

ＤＮＡテンプレートとポリメラーゼおよび１種またはそれより多くのプライマーとを接触させることは、ＤＮＡテンプレートへのプライマーのアニーリングを促進する条件下で起こしてもよい。この条件は、プライマーのハイブリダイゼーションを可能にする一本鎖ＤＮＡの存在を包含する。またこの条件は、テンプレートへのプライマーのアニーリングを可能にする温度および緩衝液も包含する。適切なアニーリング／ハイブリダイゼーション条件は、プライマーの性質に応じて選択されてもよい。本発明で使用される好ましいアニーリング条件の例は、緩衝液として３０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２０ｍＭのＫＣｌ、８ｍＭのＭｇＣｌ_２を包含する。アニーリングは、熱を使用する変性後に、望ましい反応温度に段階的に冷却することによって行われてもよい。

しかしながら、鎖置換での複製を使用する増幅はまた、プライマーなしでも起こすことができ、したがってハイブリダイゼーションおよびプライマー伸長を起こす必要がない。その代わりに、一本鎖ＤＮＡテンプレートは、伸長に利用可能な遊離の３’末端を有するヘアピンを形成するによって自己プライミングする。残りの増幅工程は同じままである。

ＤＮＡテンプレートおよびポリメラーゼは、ヌクレオチドとも接触する。ＤＮＡテンプレート、ポリメラーゼおよびヌクレオチドの組合せは、反応混合物を形成する。反応混合物はまた、１種またはそれより多くのプライマーを含んでいてもよい。反応混合物はまた、独立して、１種またはそれより多くの金属カチオンを包含していてもよい。

ヌクレオチドは、核酸の単量体または単一ユニットであり、ヌクレオチドは、窒素塩基、五炭糖（リボースまたはデオキシリボース）、および少なくとも１つのリン酸基で構成される。あらゆる好適なヌクレオチドが使用される可能性がある。

ヌクレオチドは、遊離酸、それらの塩もしくはキレート、または遊離酸および／もしくは塩またはキレートの混合物として存在していてもよい。
ヌクレオチドは、１価金属イオンのヌクレオチド塩または２価金属イオンのヌクレオチド塩として存在していてもよい。塩としては、２価金属イオンの塩、例えば、これらに限定されないが、マグネシウム（Ｍｇ^２＋）、マンガン（Ｍｎ^２＋）、カルシウム（Ｃａ^２＋）、ベリリウム（Ｂｅ^２＋）、亜鉛（Ｚｎ^２＋）およびストロンチウム（Ｓｒ^２＋）などの塩、または１価金属イオンの塩、これらに限定されないが、リチウム（Ｌｉ^＋）、ナトリウム（Ｎａ^＋）もしくはカリウム（Ｋ^＋）などの塩を挙げることができる。

窒素塩基は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）であってもよい。また窒素塩基は、改変された塩基、例えば５−メチルシトシン（ｍ５Ｃ）、プソイドウリジン（Ψ）、ジヒドロウリジン（Ｄ）、イノシン（Ｉ）、および７−メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）であってもよい。

五炭糖は、ヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドになるように、デオキシリボースであることが好ましい。
ヌクレオチドは、ｄＮＴＰと表されるデオキシヌクレオシド三リン酸の形態であってもよい。これは、本発明の好ましい実施態様である。好適なｄＮＴＰとしては、ｄＡＴＰ（デオキシアデノシン三リン酸）、ｄＧＴＰ（デオキシグアノシン三リン酸）、ｄＴＴＰ（デオキシチミジン三リン酸）、ｄＵＴＰ（デオキシウリジン三リン酸）、ｄＣＴＰ（デオキシシチジン三リン酸）、ｄＩＴＰ（デオキシイノシン三リン酸）、ｄＸＴＰ（デオキシキサントシン三リン酸）、ならびにそれらの誘導体および改変型を挙げることができる。ｄＮＴＰは、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰもしくはｄＣＴＰ、またはそれらの改変型もしくは誘導体の１つまたはそれより多くを含むことが好ましい。ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰまたはそれらの改変型の混合物を使用することが好ましい。

ヌクレオチドは、溶液中であってもよいし、または凍結乾燥した形態で提供されてもよい。ヌクレオチドの溶液が好ましい。
ヌクレオチドは、改変されたヌクレオチドを含んでいてもよく、これらの改変されたヌクレオチドは、生物学的に不活性な型であってもよい。したがって改変されたヌクレオチドは、生物学的に不活性なヌクレオチドであってもよい。生物学的に不活性化されたヌクレオチドは、ヌクレオチドの基、例えば３’の炭素・酸素または末端のリン酸・酸素を保護する取り外し可能な部分を有していてもよい。生物学的に不活性なヌクレオチドは、ケージドヌクレオチドまたはブロックされたヌクレオチドであってもよい。好適な部分としては、これらに限定されないが、光活性化可能な（ケージング）基、例えば、α−カルボキシ−２−ニトロベンジル（ＣＮＢ）、１−（２−ニトロフェニル）エチル（ＮＰＥ）、４，５−ジメトキシ−２−ニトロベンジル（ＤＭＮＢ）、１−（４，５−ジメトキシ−２−ニトロフェニル）エチル（ＤＭＮＰＥ）および５−カルボキシメトキシ−２−ニトロベンジル（ＣＭＮＢ）（モレキュラープローブス（Molecular Probes））などが挙げられる。これらの基は、一般的に、末端のリン酸・酸素を介して結合する。この部分は、あらゆる好適な手段によって除去され得る。例えばこの部分が光不安定性である場合、紫外光によるこの部分の閃光光分解が、照射部位における急速で高度に局所的な生物学的に活性なヌクレオチドの放出をもたらす。この部分は熱不安定性であってもよく、その場合に生物学的に活性なヌクレオチドは、熱によって放出されてもよい。ヌクレオチドを生物学的に活性化するのに熱が使用される場合、ポリメラーゼの温度必要条件を考慮しなければならず、これは、当業者の権限の範囲内である。例えば末端のリン酸は、ケージングまたはブロッキング部分でエステル化されていてもよい。

ヌクレオチドは、１種またはそれより多くの好適な塩基、好ましくは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）の１種またはそれより多くの混合物で提供されてもよい。ＤＮＡを合成するためのプロセスでは、２、３または好ましくは４種全てのヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｔ、およびＣ）が使用される。

ヌクレオチドは、全て天然ヌクレオチド（すなわち改変されていない）であってもよく、ヌクレオチドは、天然ヌクレオチドのように作用し、生物学的に活性な改変されたヌクレオチドであってもよく（すなわちＬＮＡヌクレオチド−ロックト核酸）、ヌクレオチドは、改変されており、生物学的に不活性であってもよく、またはそれらは、改変されていないヌクレオチドと改変されたヌクレオチドとの混合物、および／または生物学的に活性なヌクレオチドと生物学的に不活性なヌクレオチドとの混合物であってもよい。ヌクレオチドの各タイプ（すなわち塩基）は、１つまたはそれより多くの形態で、すなわち改変されていない形態および改変された形態、または生物学的に活性な形態および生物学的に不活性な形態で提供されてもよい。

本発明の一形態において、ヌクレオチドは反応混合物中に包含されており、反応混合物へのさらなるヌクレオチドの供給が制御される。この形態によれば、ヌクレオチドは、８ｍＭ未満、７ｍＭ未満、６ｍＭ未満、５ｍＭ未満、４ｍＭ未満、３ｍＭ未満、２ｍＭ未満または１ｍＭ未満の開始濃度で反応混合物中に存在していてもよい。したがって、反応混合物中のヌクレオチドの開始濃度が、８ｍＭまたはそれ未満、好ましくは５ｍＭまたはそれ未満、より好ましくは４ｍＭまたはそれ未満になるように、ヌクレオチドが添加されて、反応混合物が形成される。開始濃度は、反応開始時における反応混合物中のヌクレオチド（全ての塩基）の総濃度を指す。

ヌクレオチドは、少なくとも０．３ｇ／ｌのＤＮＡを合成するのに十分な開始濃度で反応混合物中に存在していてもよい。開始濃度は、０．５ｇ／ｌのＤＮＡのＤＮＡを合成するのに十分であることが好ましく、より好ましくは０．６ｇ／ｌまたは０．６５ｇ／ｌのＤＮＡを合成するのに十分である。示される体積は、反応混合物の体積である。ヌクレオチドの開始濃度は、反応混合物から望ましい量のＤＮＡを合成するには十分ではないことがと予想され、すなわち最終的な収量を達成するのに十分ではない可能性がある。ヌクレオチドの開始濃度は、反応混合物中の１種またはそれより多くのポリメラーゼに基づいて決定されてもよい。

代替として、またはそれに加えて、ヌクレオチドの開始濃度は、ポリメラーゼの濃度とヌクレオチドの濃度との比率と定義される場合もある。開始時のヌクレオチド分子の数と各ポリメラーゼ酵素との比率は、最大５００，０００：１、最大３００，０００：１または最大２００，０００：１であってもよいし、あるいは５，０００：１から１００，０００：１まで、好ましくは２０，０００：１から９０，０００：１まで、より好ましくは３０，０００：１から８０，０００：１まで、より好ましくは４０，０００：１から６０，０００：１までであってもよい。ヌクレオチド分子の数と各ポリメラーゼとの比率は、好ましくは５，０００：１よりも大きい。好ましい形態において、開始時におけるヌクレオチド：ポリメラーゼ酵素の比率は、５０，０００：１である。

反応混合物は、前記テンプレートの増幅を促進する条件下でインキュベートされる。鎖置換増幅が好ましい。好ましくは、この条件は、別の鎖の鎖置換での複製により複製された鎖を置換することによって前記テンプレートの増幅を促進する。この条件は、ＤＮＡの増幅を可能にするあらゆる温度、一般的に２０から９０℃の範囲の温度の使用を含む。好ましい温度範囲は、約２０から約４０または約２５から約３５℃であり得る。ＬＡＭＰ増幅にとって好ましい温度は、約５０から約７０℃である。

典型的には、適切な温度は、特異的なポリメラーゼが最適な活性を有する温度に基づき選択される。この情報は、一般的に入手可能であり、当業者の一般的な知識の一部を形成する。例えば、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼが使用される場合、好適な温度範囲は、約２５から約３５℃、好ましくは約３０℃と予想される。当業者であれば、本発明のプロセスによる効率的な増幅にとって好適な温度を慣例的に確認することができると予想される。例えば、本プロセスは、様々な温度で行うことができ、増幅されたＤＮＡの収量をモニターして、所与のポリメラーゼごとに最適な温度範囲を確認することができる。増幅は一定温度で行うことができ、本プロセスは等温であることが好ましい。鎖置換増幅が好ましいことから、ＤＮＡ鎖を分離するために温度を変更する必要はない。したがって、本プロセスは、等温プロセスであってもよい。

ＤＮＡテンプレートの増幅を促進する他の条件は、好適な緩衝剤の存在／酵素の性能または安定性に必要なｐＨおよび他の因子を含む。好適な条件は、当業界において公知のポリメラーゼ酵素の活性をもたらすのに使用されるあらゆる条件を包含する。

例えば、反応混合物のｐＨは、３から１０の範囲内、好ましくは５から８の範囲内、または約７、例えば約７．５であってもよい。ｐＨは、１種またはそれより多くの緩衝剤の使用によってこの範囲に維持されてもよい。このような緩衝液としては、これらに限定されないが、ＭＥＳ、ビス−トリス、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＢＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ビス−トリスプロパン、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、トリズマ（Trizma）、ＨＥＰＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＴＥＡ、ＥＰＰＳ、トリシン（Tricine）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、ビシン（Bicine）、ＨＥＰＢＳ、ＴＡＰＳ、ＡＭＰＤ、ＴＡＢＳ、ＡＭＰＳＯ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳＯ、ＡＭＰ、ＣＡＰＳ、ＣＡＢＳ、リン酸塩、クエン酸−リン酸水素ナトリウム、クエン酸−クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム−酢酸、イミダゾールおよび炭酸ナトリウム−重炭酸ナトリウムが挙げられる。

熱の適用（数分にわたる９５℃への暴露）を使用して二本鎖ＤＮＡを変性させる一方で、ＤＮＡ合成により好適な他のアプローチを使用してもよい。二本鎖ＤＮＡは、高いまたは低いｐＨ環境への暴露によって、あるいはカチオンが存在しないかまたは例えば脱イオン水中など非常に低濃度で存在する場合に、容易に変性させることができる。ポリメラーゼは、その複製を開始させるために、ＤＮＡテンプレートの一本鎖領域への短いオリゴヌクレオチドプライマー配列の結合を必要とする。この相互作用の安定性、したがってＤＮＡ増幅効率は、本プロセスの肝要な部分とみなされ得る金属カチオン、特に２価カチオン、例えばＭｇ^２＋イオンの濃度によって、特に影響を受ける可能性がある。

反応混合物はまた、金属イオンを含んでいてもよい。反応混合物はまた、金属の塩、例えば、これらに限定されないが、２価金属イオン：マグネシウム（Ｍｇ^２＋）、マンガン（Ｍｎ^２＋）、カルシウム（Ｃａ^２＋）、ベリリウム（Ｂｅ^２＋）、亜鉛（Ｚｎ^２＋）およびストロンチウム（Ｓｒ^２＋）の塩、または１価金属イオン、例えば、これらに限定されないが、リチウム（Ｌｉ^＋）、ナトリウム（Ｎａ^＋）またはカリウム（Ｋ^＋）などの塩を含んでいてもよい。塩としては、塩化物、酢酸塩および硫酸塩を挙げることができる。包含され得る他の塩は、アンモニウム塩、特定には硫酸アンモニウムである。当業者であれば、金属イオン塩の形態でのヌクレオチドの供給が、反応混合物中における金属イオンの濃度に影響を与え、必要があればこの金属イオンの追加源を考慮に入れることができることを認識していると予想される。反応混合物中における金属イオンの総濃度は、好ましくは全ての金属イオン源を包含する。

また洗浄剤も、反応混合物中に包含されていてもよい。好適な洗浄剤の例としては、トリトン（Triton）Ｘ−１００、トウィーン（Tween）２０およびそれらのいずれかの誘導体が挙げられる。また安定化剤も、反応混合物中に包含されていてもよい。あらゆる好適な安定化剤を使用してもよく、特定には、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および他の安定化タンパク質である。また反応条件は、ＤＮＡを緩和させテンプレートをより簡単に変性させる薬剤を添加することによって改善されてもよい。このような薬剤としては、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ホルムアミド、グリセロールおよびベタインが挙げられる。またＤＮＡ縮合剤も、反応混合物中に包含されていてもよい。このような薬剤としては、例えば、ポリエチレングリコールまたはカチオン脂質またはカチオン性ポリマーが挙げられる。

当業者は、その一般的な知識に基づきこれらの追加の要素および条件を使用して、本発明のプロセスのために増幅およびインキュベーション条件を改変して最適化することができることが理解されるものとする。同様に、特定の薬剤の具体的な濃度は、当業界における以前の例に基づき選択され、一般的な知識に基づきさらに最適化されてもよい。一例として、反応混合物中に存在するポリメラーゼの量は、最適化されてもよい。これは、ＤＮＡ合成中、反応混合物にポリメラーゼ酵素をさらに添加することを含んでいてもよい。さらなる例として、ＤＮＡテンプレートの量は、最適化されてもよい。これは、ＤＮＡ合成中に反応混合物にＤＮＡテンプレートをさらに添加することを含んでいてもよい。ポリメラーゼ酵素および／またはＤＮＡテンプレートのさらなる供給は、連続でもまたは不連続でもよく、好ましくは不連続である。

一例として、当業界においてＲＣＡベースの方法で使用される好適な反応緩衝液は、ｐＨ７．５の５０ｍＭのトリスＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、２０ｍＭの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、５％グリセロール、０．２ｍＭのＢＳＡ、１ｍＭのｄＮＴＰである。本発明のＲＣＡ増幅で使用される好ましい反応緩衝液は、３０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、３０ｍＭのＫＣｌ、７．５ｍＭのＭｇＣ１_２、１０ｍＭの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、４ｍＭのＤＴＴ、２ｍＭのｄＮＴＰである。この緩衝液は、Ｐｈｉ２９ ＲＣＡポリメラーゼとの使用に特に好適である。

反応混合物はまた、１種またはそれより多くの追加のタンパク質の使用を含んでいてもよい。ＤＮＡテンプレートは、少なくとも１種のピロホスファターゼ、例えば酵母の無機ピロホスファターゼの存在下で増幅されてもよい。２、３、４、５種またはそれより多くの異なるピロホスファターゼが使用されてもよい。これらの酵素は、鎖複製中にポリメラーゼによってｄＮＴＰから生成したピロホスフェートを分解することができる。反応中のピロホスフェート蓄積は、ＤＮＡポリメラーゼの阻害を引き起こし、ＤＮＡ増幅の速度および効率を低下させる可能性がある。ピロホスファターゼは、ピロホスフェートを崩壊させて阻害作用のないホスフェートにすることができる。本発明のプロセスでの使用に好適なピロホスファターゼの例は、ニューイングランドバイオラボ社から市販されているサッカロミセス・セレビジエのピロホスファターゼである。

一本鎖ＤＮＡを安定化するために、あらゆる一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢＰ）が本発明のプロセスで使用されてもよい。ＳＳＢＰは、生細胞の必須の要素であり、ｓｓＤＮＡを含む全てのプロセス、例えばＤＮＡ複製、修復および組換えに参加している。これらのプロセスにおいて、ＳＳＢＰは、一時的に形成されたｓｓＤＮＡに結合し、ｓｓＤＮＡ構造の安定化を助けることができる。本発明のプロセスでの使用に好適なＳＳＢＰの例は、ニューイングランドバイオラボ社から市販されているＴ４遺伝子３２タンパク質である。

反応混合物は、上述したように、ＤＮＡテンプレートの増幅を促進する条件下でインキュベートされてもよい。増幅は、好ましくは鎖置換での複製である。反応混合物は、好ましくはこれまでに論じられた開始濃度または開始時の比率（ポリメラーゼに対する）で、ヌクレオチドを含む。反応混合物は、金属イオンをさらに含んでいてもよい。

本発明の一形態によれば、ＤＮＡを合成するために、さらなるヌクレオチドの供給が必要である。反応混合物へのヌクレオチドの供給は、本発明の第１の形態に従って制御される。したがって、プロセスの開始時に、ＤＮＡ合成に必要なヌクレオチドの全てが反応混合物に添加されるわけではない。さらなるヌクレオチドは、あらゆる好適な時間に、反応混合物に供給または提供されてもよい。反応混合物にさらなるヌクレオチドを供給するタイミングおよび／または反応混合物に供給されるヌクレオチドの量は、制御または指示される。したがって、反応それ自体は、ヌクレオチドの正確な供給によって制御され得る。この制御は、酵素反応速度論の理論上の計算に基づいていてもよいし、または制御は、ポリメラーゼによってさらなるヌクレオチドが必要とされるときにそれらが供給されるように、反応混合物の測定可能なパラメーターに基づいていてもよい。

反応混合物が形成されたら、さらなるヌクレオチドを供給して、ＤＮＡテンプレートの増幅を促進する条件下でインキュベートしてもよい。さらなるヌクレオチドは、増幅が開始または始動した後に供給されてもよい。一実施態様において、ヌクレオチドのさらなる供給は、開始時のヌクレオチドが提供されてから少なくとも２０分、または少なくとも３０分または少なくとも４０分後に始まる。しかしながら、特にヌクレオチドの供給が連続的である場合、供給は、反応開始時に開始させることができる。

一実施態様において、反応混合物中におけるヌクレオチドの濃度または量は、プロセス中において上の閾値を超えない。ヌクレオチドの供給は、ヌクレオチドの濃度または量が上の閾値を超えないように制御される。上の閾値は、反応混合物中、８ｍＭ、または７ｍＭ、または６ｍＭ、または５ｍＭ、または４ｍＭ、または３ｍＭ、または２ｍＭのヌクレオチドであってもよい。好ましくは、上の閾値は、反応混合物中、約４ｍＭのヌクレオチドである。同様に、一実施態様において、反応混合物中におけるヌクレオチドの濃度または量は、プロセス中に下の閾値を下回らない可能性がある。ヌクレオチドの供給は、ヌクレオチドの濃度または量が下の閾値を下回らないように制御される。この下の閾値は、反応混合物中、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、５μＭのまたは１０μＭのヌクレオチドであってもよい。反応混合物中のヌクレオチドの濃度は、プロセス中、上の閾値と下の閾値との間に維持されることが好ましい。したがって、反応混合物中のヌクレオチドの濃度は、０．０００１ｍＭから８ｍＭの間、好ましくは０．００１ｍＭから６ｍＭの間、最も好ましくは０．０１ｍＭから５ｍＭの間に維持されてもよい。ヌクレオチドの濃度は、反応混合物へのさらなるヌクレオチドの供給を制御することによって維持されてもよい。一実施態様において、反応混合物中のヌクレオチドの濃度は、イオンクロマトグラフィーによって推測されてもよい。代替として、およそのヌクレオチド濃度は、本明細書で論じられるように、合成されたＤＮＡの量を推測することによって計算することができる。

代替として、上および下の閾値は、反応混合物中に存在するヌクレオチドの量とポリメラーゼの量との比率に関して説明されていてもよい。したがって上の閾値は、５００，０００：１（ヌクレオチド：ポリメラーゼ）、２００，０００：１、１５０，０００：１、１００，０００：１または８０，０００：１であり得る。下の閾値は、１，０００：１、１，５００：１または２，０００：１であってもよい。したがって、ヌクレオチドとポリメラーゼとの比率は、１，０００：１から５００，０００：１の間、好ましくは２，０００：１から４５０，０００：１の間、より好ましくは５，０００：１から４００，０００：１の間、最も好ましくは１０，０００：１から１００，０００：１の間に維持されてもよい。最も好ましくは、比率は、４０，０００：１から７０，０００：１の間、約５０，０００：１に維持される。

一実施態様において、さらなるヌクレオチドは、１回またはそれより多くの別々の添加で、すなわちアリコートとして反応混合物に供給される。あらゆる数の添加またはアリコートがこの実施態様の範囲内である。したがって、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれより多くの、すなわち２０〜２５、２５〜３０、３５〜４０の添加またはアリコートが、反応混合物に添加されてもよい。したがって、１〜５０、１〜４０、１〜３０または１〜２０個のアリコートが、ヌクレオチドを供給するのに使用されてもよい。アリコートは、プロセスに必要な、またはプロセスに添加されるヌクレオチド総量の一部であってもよい。アリコート中のヌクレオチドの体積および／または濃度は、プロセスの必要条件に応じて様々であり得る。アリコートは、少量のヌクレオチド、すなわち特定の濃度または量のヌクレオチドが反応混合物中に確実に存在するのに十分な量のヌクレオチドを含んでいてもよい。ヌクレオチドは、一定間隔で（すなわち３０分毎、６０分毎、９０分毎、１２０分毎、１８０分毎または２４０分毎または他のあらゆる好適な期間で）アリコートとして反応混合物に供給されてもよい。ヌクレオチドは、不規則な間隔で、アリコートとして反応混合物に供給されてもよい。例えば、ヌクレオチドのそれぞれの供給間の期間は、初期ではより短く、次いでプロセスが進行するにつれて長くしてもよく、または逆もまた同様である。アリコートは、反応混合物中に一定のヌクレオチド濃度を維持するために提供されてもよいし、またはヌクレオチドの濃度を、開始濃度まで補給するために提供されてもよい。好ましい実施態様において、ヌクレオチドは、反応混合物中の濃度が８ｍＭ、または７ｍＭ、または６ｍＭ、または５ｍＭ、または４ｍＭを超えないように供給される。好ましい実施態様において、ヌクレオチドは、反応混合物中におけるヌクレオチドの濃度または量が上の閾値と下の閾値の範囲内に確実に含まれるように供給される。

アリコートは、分析または試験のために採取された反応混合物の体積を補充するためだけに供給されるのではなく、反応がさらなるヌクレオチドを必要とするという理由で供給されることが好ましい。反応混合物の試験は非侵襲的であること、さらに、反応が完了するまで反応混合物から材料が引き出されないことが好ましい。

さらなるヌクレオチドは、反応混合物中におけるより多くのヌクレオチドへの必要性に応答して供給されてもよい。これは、これらに限定されないが、ＤＮＡ合成の速度、合成されたＤＮＡの濃度、または反応混合物の粘度もしくは体積などの数種のパラメーターによって決定することができる。ＤＮＡ合成の速度は、所定期間にわたり合成されたＤＮＡの濃度から計算することができる。ＤＮＡ合成の速度が減少し始めたら、さらなるヌクレオチドが供給されてもよい。代替として、合成されたＤＮＡの濃度は、以下でさらに論じられる方法によってモニターされてもよい。ＤＮＡの濃度が閾値レベルに増加したら、さらなるヌクレオチドが供給されてもよい。反応混合物の粘度が測定されてもよく、粘度の増加は、さらなるヌクレオチドの必要性を示し得る。反応物の粘度は、粘度計で測定されてもよい。

一実施態様において、さらなるヌクレオチドは、連続的に反応混合物に供給され、すなわちそれらは連続的な方式で反応混合物に添加される。しかしながら代替として、ヌクレオチドは、滴注されてもよいし、または絶えず供給されてもよい。この実施態様によるさらなるヌクレオチドの供給は、ヌクレオチドの供給がポリメラーゼによるさらなるヌクレオチドの要求量と合致するような十分少ない量であってもよい。この実施態様において、ヌクレオチドの一定供給は、反応混合物中ほぼ一定のヌクレオチド濃度を維持する。反応混合物へのさらなるヌクレオチドの一定供給により、反応混合物中のヌクレオチド濃度が、上の閾値と下の閾値の範囲内に確実に維持されることが好ましい。

さらなるヌクレオチドは、物理的に反応混合物に提供されてもよく、すなわちそれらは、反応混合物の外部にある。したがって、供給は、外部源、例えば貯蔵容器から発生していてもよい。この貯蔵容器は、反応混合物に接続されていてもよい。ヌクレオチドは、反応混合物にポンプ注入されてもよい。したがって、ヌクレオチドおよび反応混合物は、物理的に別々であり、さらなるヌクレオチドの供給は、ヌクレオチドの物理的な供給である。代替として、ヌクレオチドは、浸透圧ポンプを介して供給されてもよい。浸透圧ポンプは、制御された連続的なヌクレオチド供給のための方法を提供する。

代替として、ヌクレオチドは、これまでに論じられたものなどの生物学的に不活性化されたヌクレオチドを活性化することによって、反応混合物に提供されてもよい。反応混合物にヌクレオチドを供給するために、生物学的に不活性なヌクレオチドは、好適な手段によって活性化される。したがって、さらなるヌクレオチドは、あらゆる好適な生物学的に不活性なヌクレオチドを含んでいてもよい。開始時に生物学的に不活性なヌクレオチドが反応混合物中に包含されていてもよいが、活性化の制御によってのみ反応混合物に供給される。代替として、生物学的に不活性なヌクレオチドは、アリコートで、または連続的に反応混合物に物理的に添加され、その後活性化されて、反応混合物にヌクレオチドを供給することもできる。活性化は、物理的（すなわち熱または光）であってもよいし、または化学的であってもよく、ヌクレオチドの供給を制御するのは、活性化の制御である。

ＤＮＡの合成が完了するまで、例えば、ＤＮＡテンプレートが使い尽くされ、さらなる取り込みが不可能になったら、反応混合物へのヌクレオチドの供給が制御されてもよい。代替として、期待されるまたは望ましいＤＮＡ収量が合成されたら、反応は完了し得る。このような収量は、添加されたヌクレオチドの量に基づいていてもよい。必要な量、例えば、反応混合物１リットル当たり１ｇ、２ｇ／ｌ、３ｇ／ｌ、４ｇ／ｌ、５ｇ／ｌ、または最大１０ｇ／ｌもしくはそれより多くのＤＮＡが合成されたら、ＤＮＡの合成は完了し得る。ＤＮＡ合成の速度が減少して、ヌクレオチドをさらに供給してもこの速度が上昇しない、反応混合物が別の要素（例えば、これらに限定されないが、プライマーなど）を使い果たす、ポリメラーゼ酵素が不活性化される、無機ピロホスファターゼが不活性化される、これ以上の一本鎖テンプレートが利用できなくなる、金属カチオンなどの必要な補因子が使い尽くされる、反応混合物の粘度が特定の閾値に達する、反応混合物の体積が特定の閾値に達する、またはポリメラーゼが阻害されると、ＤＮＡの合成は完了し得る。

反応の収量は、合成されたＤＮＡの量に関する。本発明に係るプロセスからの期待される収量は、反応混合物１リットル当たり１０グラムを超えていてもよいし、または１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｇ／ｌであってもよい。本発明は、ＤＮＡの酵素的合成から可能な収量を改善する。本発明の目的は、費用効率が高い方法によりラージスケールでＤＮＡが合成できるように、無細胞での酵素によるＤＮＡ合成プロセスの収量を改善することである。本発明は、ポリメラーゼによって触媒される酵素的なプロセスを使用して、工業スケールで経済的にＤＮＡを製造／合成することを可能にする。本発明のプロセスは、ＤＮＡ生成物への効率的なヌクレオチド取り込みを可能にする。本発明のプロセスは、反応混合物を数リットル、例えば数十リットルにスケールアップさせると考えられる。改善された収量、ＤＮＡ合成速度、生産性または処理能力は、開始時にヌクレオチドの全てが供給される同一な反応混合物と比較され得る。実施例で実証されたように反応混合物へのさらなるヌクレオチドの供給を制御することによって、収量を改善することができると考えられる。

ＤＮＡ合成の速度は、本プロセスの１分当たりの合成されたＤＮＡの量または濃度に関する。実施例において、ＤＮＡ合成の速度は、プロセスが進行するにつれて次第に遅くなっているのがわかる。

プロセスの生産性、または供給されるヌクレオチド単位当たりのＤＮＡの出力速度は、本発明の１つまたは複数のプロセスを使用することによって増加させることができる。
一実施態様において、本発明は、ＤＮＡの合成を強化するためのプロセスに関する。この強化は、開始時にヌクレオチドなどの必要な要素の全てが添加されることを除いて同一な反応混合物と比較され得る。この対照反応混合物にはさらなる添加はなされない。

一形態において、ＤＮＡを合成するための無細胞プロセスであって、１種またはそれより多くのプライマー、ヌクレオチドおよび金属カチオンの存在下で、ＤＮＡテンプレートを少なくとも１種のポリメラーゼと接触させて、前記テンプレートの増幅を促進する条件下で、別の鎖の鎖置換での複製により複製された鎖を置換することによって反応混合物を形成することを含み、さらなる金属カチオンが、制御された方法で反応混合物に供給される、上記プロセスが提供される。

しかしながら代替として、増幅は、テンプレートの鎖置換での複製により起こる。したがって本発明は、ＤＮＡを合成するための無細胞プロセスであって、１種またはそれより多くのプライマー、ヌクレオチドおよび金属カチオンの存在下で、ＤＮＡテンプレートを少なくとも１種のポリメラーゼと接触させて、前記テンプレートの鎖置換での複製を促進する条件下で、反応混合物を形成することを含み、さらなるヌクレオチドおよびさらなる金属カチオンは、制御された方法で反応混合物に供給される、上記プロセスを提供する。

ＤＮＡを合成するための無細胞プロセスの反応速度は、制御された方法で反応混合物にさらなるカチオンを供給することによって制御されることが好ましい。
反応混合物への金属カチオンの供給は、本発明のこの形態に従って制御されてもよい。このような制御は、特にラージスケールのプロセスにおいて、ＤＮＡ合成の速度を改善すると考えられる。開始時に、１種またはそれより多くの金属カチオンが反応混合物中に存在していてもよい。したがって、反応混合物はまた、好ましくは塩として供給される１種またはそれより多くの金属カチオンを含んでいてもよい。反応混合物へのさらなる金属カチオンの供給は、制御されてもよい。１種またはそれより多くの金属カチオンが供給されてもよい。好適な金属カチオンとしては、２価金属イオン：マグネシウム（Ｍｇ^２＋）、マンガン（Ｍｎ^２＋）、カルシウム（Ｃａ^２＋）、ベリリウム（Ｂｅ^２＋）、亜鉛（Ｚｎ^２＋）およびストロンチウム（Ｓｒ^２＋）、または１価金属イオン、例えば、これらに限定されないが、リチウム（Ｌｉ^＋）、ナトリウム（Ｎａ^＋）またはカリウム（Ｋ^＋）などが挙げられる。金属カチオンは、好ましくは塩として供給される。塩としては、塩化物、酢酸塩および硫酸塩を挙げることができ、金属カチオンが塩化物の塩として供給されることが好ましい。包含され得る他の塩は、アンモニウム塩であり、特定には硫酸アンモニウムである。金属カチオンは、好ましくはマグネシウムまたはマンガンであり、最も好ましくはマグネシウムである。最も好ましい実施態様において、金属カチオンは、塩化マグネシウムとして提供される。

本発明の一形態によれば、ＤＮＡを合成するために、さらなる金属カチオンの供給が必要である。反応混合物への金属カチオンの供給は、本発明の第２の形態に従って制御される。したがって、プロセスの開始時に、ＤＮＡの合成に必要な金属カチオンの全てが反応混合物に添加されるわけではない。さらなる金属カチオンは、あらゆる好適な時間に反応混合物に供給または提供されてもよい。反応混合物にさらなる金属カチオンを供給するタイミングおよび／または反応混合物に供給される金属イオンの量は、制御または指示される。したがって、反応それ自体は、金属イオンの正確な供給によって制御され得る。この制御は、酵素反応速度論の理論上の計算に基づいていてもよいし、または制御は、さらなる金属イオンが必要とされるときにそれらが供給されるように、反応混合物の測定可能なパラメーターに基づいていてもよい。さらなる金属カチオンの供給は、さらなるヌクレオチドの制御された供給と平行して、またはそれと共に制御されてもよい。供給は、独立して制御されてもよいし、または一緒に制御されてもよい。

反応混合物が形成されたら、さらなる金属カチオンを供給して、ＤＮＡテンプレートの増幅を促進する条件下でインキュベートしてもよい。さらなる金属カチオンは、増幅が開始または始動した後に供給されてもよい。一実施態様において、金属カチオンのさらなる供給は、金属カチオンの開始濃度が提供されてから少なくとも２０分、または少なくとも３０分または少なくとも４０分後に始まる。しかしながら、特に金属カチオンの供給が連続的である場合、供給は、反応開始時に開始させることができる。

一実施態様において、反応混合物中における遊離または未結合の金属カチオンの濃度または量は、プロセス中において上の閾値を超えない。金属カチオンの供給は、遊離または未結合の金属カチオンの濃度または量が最大の閾値を超えないように制御される。最大の閾値は、反応混合物中、４ｍＭ、３ｍＭまたは２ｍＭであってもよい。好ましくは、最大の閾値は、反応混合物中、約３ｍＭである。同様に、一実施態様において、反応混合物中における遊離の金属カチオンの濃度または量は、プロセス中に最小の閾値を下回らない可能性がある。金属カチオンの供給は、遊離の金属カチオンの濃度または量が最小の閾値を下回らないように制御される。この最小の閾値は、反応混合物中、０．０３μＭ、０．１５μＭ、０．３μＭ、１．５μＭ、または３μＭであってもよい。反応混合物中における遊離の金属カチオンの濃度は、プロセス中、最大の閾値と最小の閾値との間に維持されることが好ましい。したがって、反応混合物中における遊離の金属カチオンの濃度は、０．０３μＭから４ｍＭの間、または０．５μＭから３ｍＭ、または１μＭから２ｍＭ、または１０μＭから１ｍＭに維持されてもよい。好ましくは、反応混合物中における遊離の金属カチオンの濃度は、１ｍＭから１．５ｍＭの間に維持される。

代替として、最大の閾値は、反応混合物中、１０ｍＭ、８ｍＭ、６ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭまたは２ｍＭであってもよい。好ましくは、最大の閾値は、反応混合物中、約３ｍＭである。同様に、一実施態様において、反応混合物中における遊離の金属カチオンの濃度または量は、プロセス中に最小の閾値を下回らない可能性がある。金属カチオンの供給は、遊離の金属カチオンの濃度または量が最小の閾値を下回らないように制御される。この最小の閾値は、反応混合物中、０．０３μＭ、０．１５μＭ、０．３μＭ、１．５μＭ、３μＭおよび５μＭであってもよい。反応混合物中における遊離の金属カチオンの濃度は、プロセス中、最大の閾値と最小の閾値との間に維持されることが好ましい。したがって、反応混合物中における遊離の金属カチオンの濃度は、０．０３μＭから１０ｍＭの間、または０．１５μＭから８ｍＭ、または０．３μＭから６ｍＭ、または１．５μＭから３ｍＭに維持されてもよい。好ましくは、反応混合物中における遊離の金属カチオンの濃度は、０．１５μＭから５μＭの間に維持される。

遊離の金属カチオンの濃度は、反応混合物へのさらなる金属イオンの供給を制御することによって維持されてもよい。一実施態様において、反応混合物中における遊離の金属イオンの濃度は、原子吸光分析、イオンクロマトグラフィーおよび当業界において公知の他の方法によって推測されてもよい。代替として、およその遊離の金属カチオン濃度は、本明細書で論じられるように、合成されたＤＮＡの量を推測することによって計算することができる。誤解を避けるために言えば、金属カチオン、例えばマグネシウムイオンは、これらに限定されないが、ピロホスフェート、ホスフェートおよびＤＮＡなどの反応混合物中の異なる物体に結合することができる。これらのイオンは結合して、遊離ではなくなる。

一実施態様において、さらなる金属カチオンは、１回またはそれより多くの別々の添加で、すなわちアリコートとして反応混合物に供給される。あらゆる数の添加またはアリコートがこの実施態様の範囲内である。したがって、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれより多くの、すなわち２０〜２５、２５〜３０、３５〜４０の添加またはアリコートが、反応混合物に添加されてもよい。したがって、１〜５０、１〜４０、１〜３０または１〜２０個のアリコートが、金属カチオンを供給するのに使用されてもよい。アリコートは、プロセスに必要な、またはプロセスに添加される金属カチオン総量の一部であってもよい。アリコート中の金属カチオンの体積および／または濃度は、プロセスの必要条件に応じて様々であり得る。アリコートは、少量の金属カチオン、すなわち特定の濃度または量の金属カチオンが反応混合物中に確実に存在するのに十分な量の金属カチオンを含んでいてもよい。金属カチオンは、一定間隔で（すなわち３０分毎、６０分毎、９０分毎、１２０分毎、１８０分毎または２４０分毎または他のあらゆる好適な期間で）アリコートとして反応混合物に供給されてもよい。金属カチオンは、不規則な間隔で、アリコートとして反応混合物に供給されてもよい。例えば、金属カチオンのそれぞれの供給間の期間は、初期ではより短く、次いでプロセスが進行するにつれて長くしてもよく、または逆もまた同様である。アリコートは、反応混合物中に一定の金属カチオン濃度を維持するために提供されてもよいし、または金属カチオンの濃度を、開始濃度まで、好ましくは最適な遊離の金属イオンの濃度まで補給するために提供されてもよい。

好ましい実施態様において、金属カチオンは、反応混合物中における遊離の金属カチオンの濃度または量が最大の閾値から最小の閾値の範囲内に確実に含まれるように供給される。

さらなる金属カチオンは、反応混合物中におけるそれらへの必要性に応答して供給されてもよい。これは、これまでに論じられたように、数種のパラメーターによって決定することができる。

一実施態様において、さらなる金属カチオンは、連続的に反応混合物に供給される。
さらなる金属カチオンは、物理的に反応混合物に提供されてもよく、すなわちそれらは、反応混合物の外部にある。

さらなるヌクレオチドの供給も制御されることが好ましい。
さらなる形態において、ＤＮＡを合成するための無細胞プロセスであって、１種またはそれより多くのプライマー、ヌクレオチドおよび金属カチオンの存在下で、ＤＮＡテンプレートを少なくとも１種のポリメラーゼと接触させて、前記テンプレートの増幅を促進する条件下で、別の鎖の鎖置換での複製により複製された鎖を置換することによって反応混合物を形成することを含み、さらなるヌクレオチドおよび金属カチオンは、制御された方法で反応混合物に供給される、上記プロセスが提供される。

ＤＮＡを合成するための無細胞プロセスであって、ヌクレオチドおよび金属カチオンの存在下で、ＤＮＡテンプレートを少なくとも１種のポリメラーゼと接触させて、前記テンプレートの鎖置換での増幅を促進する条件下で、反応混合物を形成することを含み、さらなるヌクレオチドおよびさらなる金属カチオンは、制御された方法で反応混合物に供給される、上記プロセスも提供される。

さらなるヌクレオチドおよびさらなる金属イオンは、一緒にまたは別々に供給され得る。さらなるヌクレオチドまたはさらなる金属カチオンの制御された供給は、これらの物体に関してこれまでに論じられたようにして達成されてもよい。

金属カチオンまたはさらなる金属カチオンの供給は、ヌクレオチドの供給と平行してなされてもよいし、またはヌクレオチドの供給と異なる時間になされてもよい。
特に金属カチオンが１価である場合、さらなる金属カチオンが、ヌクレオチドの供給と共に反応混合物に供給され得ることが好ましい。したがって金属カチオンおよびヌクレオチドは、混合物として供給されてもよい。したがって、それらは分離状態を維持することが好ましいが、金属カチオンの供給およびヌクレオチドは組み合わされていてもよい。

さらなる金属カチオンおよび／またはさらなるヌクレオチドの供給は、これらの物体のそれぞれについて個々に説明された通りであってもよい。
本発明の好ましい実施態様において、金属カチオンおよびヌクレオチドは、金属カチオン：ヌクレオチドの比率（量）が、９：１から１：９、もしくは６：１から１：６の間、または３：１、または１：３、または１：１になるように供給される。好ましくは、反応混合物中におけるこれらの量間の比率は、約３：１から１：３の間であり、好ましくは約３：１である。これらの比率は、金属カチオンが、２価の金属カチオン、例えば、これらに限定されないが、マグネシウム（Ｍｇ^２＋）、マンガン（Ｍｎ^２＋）、カルシウム（Ｃａ^２＋）、ベリリウム（Ｂｅ^２＋）、亜鉛（Ｚｎ^２＋）およびストロンチウム（Ｓｒ^２＋）である場合に特に好ましい。

ヌクレオチドに対する金属カチオン、好ましくはマグネシウムカチオンの比率を維持することは、ＤＮＡ合成の速度を制御することにおいて重要であり得ると考えられる。ヌクレオチド：ポリメラーゼの比率はまた、これまでに論じられたように維持されてもよい。したがって、ヌクレオチドおよび金属カチオンの供給を制御することによってこれらの２つの比率を制御することは、ＤＮＡの合成を制御することができる。

本発明のいずれかの形態に関連して、ヌクレオチドが金属カチオンの塩として供給される場合、反応混合物に供給されるこれらの塩中における金属カチオンの濃度は、これらの金属カチオンを包含すると予想される。当業者であれば、金属カチオンの塩の形態におけるヌクレオチドを供給することは、反応混合物中における金属カチオンの濃度に影響を与え、この追加の量を考慮に入れることができることを認識していると予想される。

ヌクレオシド三リン酸（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰおよびＴＴＰ）は、それらの化学特性により、ＤＮＡ生成物収量を増加させるために高濃度が使用される場合、様々な方法でＤＮＡ増幅に干渉する可能性を有する。高濃度は、反応混合物中、４ｍＭより高いｄＮＴＰ濃度とみなすことができる。ｄＮＴＰのリン酸基は、１価および２価の金属カチオンと相互作用することができ、Ｍｇ^２＋に最も強い親和性を有する。例えば、Ｍｇ^２＋へのＡＴＰの親和性は、Ｎａ^＋の７００倍を超え、Ｌｉ^＋よりほぼ４００倍大きい。

増幅中、ポリメラーゼは、成長するＤＮＡ鎖に取り込まれるヌクレオチドからピロホスフェートを放出する。ピロホスフェートは、ＡＴＰに類似するＭｇ^２＋イオンに結合親和性を有することから、遊離のＭｇ^２＋イオンは、このプロセスによって放出されない。増幅中にヌクレオチドの高い開始濃度を使用することの結果は、遊離のＭｇ^２＋イオンのレベルを低下させることであると予想される。Ｍｇ^２＋イオンはポリメラーゼの触媒活性に必要であり得るため、ホスフェートまたはリン酸基との相互作用によって引き起こされる最善とは言えないレベルは、効率的な増幅にとって有害である可能性が高い。しかしながら、逆に言えば、高濃度のＭｇ^２＋イオンは、一部のＤＮＡポリメラーゼの忠実度に影響を与えることが示されている。それゆえにＭｇ^２＋イオンの反応濃度は、ＤＮＡの収量および品質にとって重要であると考えられる場合がある。

ピロホスフェートの破壊は、酵素によって触媒されてもよく、ピロホスフェートから結合したＭｇ^２＋イオンを放出することが予想できる。しかしながら、Ｍｇ^２＋イオンはＰＯ_４ ^３−イオンと結合して、本質的に不溶性のＭｇ_３（ＰＯ_４）^２（２０℃で、水中に０．０１ｍＭの溶解性）を形成する。

Ｍｇ^２＋イオンは、合成されたＤＮＡにも結合すると予想される。
あらゆるＤＮＡポリメラーゼが触媒する反応におけるあらゆる特定のタイムポイントでの遊離のＭｇ^２＋イオンのレベルは、開始濃度、カチオンと結合することが可能な分子の総濃度、および反応物のｐＨに依存すると予想される。プロセスは平衡状態にあるため、多少の遊離のＭｇ^２＋が存在する可能性が常にある。一実施態様において、遊離のＭｇ^２＋のレベルは、好ましくはマグネシウム塩としての、遊離のＭｇ^２＋イオンの反応混合物への供給を制御することによって制御される。

ローリングサークル、鎖置換メカニズムを介して環状ＤＮＡテンプレートを増幅することができるポリメラーゼは、テンプレートの長い直鎖状コンカテマー様の反復を生産することが可能である。このようなローリングサークル鎖を置換するポリメラーゼが好ましい。例えば、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼは、環状ＤＮＡテンプレートを増幅して、長さが最大７７キロベースの直鎖状の反復を生産できることが報告されている。これらの非常に長い分子はポリマーのような挙動を示し、粘度を増加させることによって反応物のレオロジー特性を有意に変更することができる。この粘度の増加は、合成されたＤＮＡの濃度と直接的に相関する可能性がある圧力の変化によって測定できる。このような測定を連続的にまたは設定時間で行い、シグナル、好ましくは反応の状態を示すのに使用される可能性があるオンラインのシグナルを提供することができる。さらなるヌクレオチドの供給は、圧力シグナルに応答して制御されてもよい。このような反応混合物のパラメーターを示すシグナルに応答するヌクレオチドの供給は、反応混合物の収量および／または生産性を増加させるためになされてもよい。

ＤＮＡ濃度を推測するための圧力差の測定は、Ｓｙｔｏ色素などの蛍光性化学試薬の結合をベースとしたアッセイを超える重要な利点を有する。二本鎖ＤＮＡにのみ結合するこれらの試薬とは異なり、圧力差の測定は、一本鎖の形態を含有するサンプル中のＤＮＡの誤った推測を生じない。

一実施態様において、ヌクレオチドの供給は、シグナルに応答して制御される。シグナルは、あらゆる好適なシグナルであってもよく、オンラインのシグナルであってもよい。シグナルは、ＤＮＡの濃度に関するものが好ましく、特に、反応混合物中におけるＤＮＡの総濃度の推測に基づく。代替として、シグナルは、反応混合物の体積に関するものでもよい。さらなる金属イオンの供給も同様に、シグナルに応答して制御されてもよい。シグナルは、同一でもよいし、または異なっていてもよい。

好ましいシグナルは、反応混合物の粘度に関するものである。反応混合物の粘度は、反応混合物中のＤＮＡの濃度の推測を提供し得る。粘度は、粘度計などのあらゆる好適な手段によって測定されてもよい。粘度は、圧力の変化によって測定されることが好ましい。圧力差は、圧力センサー、圧力トランスデューサー、圧力送信器、圧力計、ピエゾメーターまたはマノメーターによって測定されてもよい。一実施態様において、圧力差は、反応混合物の一部を取り出し入れ替える往復ポンプを使用して作り出されてもよい。反応は、ここで示されたように非侵襲的な様式で、リアルタイムでモニターされることが好ましい。

本発明のプロセスは、バッチ反応として実行さてもよい。この実施態様において、反応混合物は、リアクター中に存在する。さらなるヌクレオチドの供給および／またはさらなる金属カチオンは、リアクターにフィードされてもよい。したがって、本プロセスは、流加培養リアクターで実行されてもよい。代替として、本プロセスは、連続フローリアクターで実行されてもよい。このようなリアクターは、当業者の知識の範囲内である。特に好ましい様式を以下に示す。

一実施態様において、１種またはそれより多くのプロセシング酵素は、１回またはそれより多くの別々の添加で、すなわちアリコートとして反応混合物に供給される。あらゆる数の添加またはアリコートがこの実施態様の範囲内である。したがって、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれより多くの、すなわち２０〜２５、２５〜３０、３５〜４０の添加またはアリコートが、反応混合物に添加されてもよい。したがって、１〜５０、１〜４０、１〜３０または１〜２０個のアリコートが、プロセシング酵素を供給するのに使用されてもよい。アリコートは、プロセスに必要な、またはプロセスに添加されるプロセシング酵素総量の一部であってもよい。アリコート中のプロセシング酵素の体積および／または濃度は、プロセスの必要条件に応じて様々であり得る。アリコートは、少量のプロセシング酵素、すなわち特定の濃度または量のプロセシング酵素が反応混合物中に確実に存在するのに十分な量のプロセシング酵素を含んでいてもよい。プロセシング酵素は、一定間隔で（すなわち３０分毎、６０分毎、９０分毎、１２０分毎、１８０分毎または２４０分毎または他のあらゆる好適な期間で）アリコートとして反応混合物に供給されてもよい。プロセシング酵素は、不規則な間隔で、アリコートとして反応混合物に供給されてもよい。例えば、プロセシング酵素のそれぞれの供給間の期間は、初期ではより長く、次いでプロセスが進行するにつれて減少させてもよく、または逆もまた同様である。

プロセシング酵素は、反応混合物中におけるそれらへの必要性に応答して供給されてもよい。これは、これまでに論じられたように、反応混合物中のＤＮＡの濃度および／またはＤＮＡ合成の速度などの数種のパラメーターによって決定することができる。

プロセシング酵素は、物理的に反応混合物に提供されてもよく、すなわちそれらは、反応混合物の外部にある。これらの酵素は、別々の貯蔵容器に保持されて、制御された方法で反応混合物に放出されてもよい。

プロテロメラーゼなどのプロセシング酵素は、シングルターンオーバーを有することが好ましく、その場合、プロセシング酵素の量を制御することは、酵素によってプロセシングされたＤＮＡの量を直接的に制御する。プロセシング酵素は、さらなるヌクレオチドと共に、またはさらなるヌクレオチドの後に添加されてもよい。さらなる金属イオンも必要になると予想され、その場合、ＤＮＡのプロセシングがさらなる金属イオンの添加の前に起こるように、これらはプロセシング酵素添加の後に添加されることが好ましいことがある。

本プロセスは、あらゆる好適な装置で実行されてもよい。ここで、本プロセスを行うのに好適な特定の装置を説明する。合成装置１は、内蔵型のシャシー１１に構築され、主要な要素にアクセスするための開閉式のフロントカバー１２が備えられている。フロントカバー１２は、望ましくは透明な材料で作製されるが、過剰な光レベルから反応要素を保護するために着色されていてもよい。これはまた、汚染物質の進入を制限するのにも役立つ。装置は、例えば装置の側面に、外部から操作可能な電源スイッチおよび電源入力１３が備えられている。加えて、例えば米国テキサス州のナショナルインスツルメンツ社（National Instruments Corporation）によって供給されるＬａｂｖｉｅｗ（商標）などの実験用オートメーションソフトウェアを実行する汎用のコンピューターと装置を連通させる、および／またはそれにより制御するための、入力／出力ポート１４がある。装置の前から見える位置に、操作表示灯１５が備えられ、これは、装置が作動中であるかどうかを示す。

合成装置の中央の要素は、ジャケット付き反応容器２であり、これは、３０ｍｌより大きい体積、例えば５０ｍｌ、７５または１２０ｍｌの体積を有していてもよい。反応容器の体積は、３００ｍｌ未満であってもよい。反応容器の体積は、装置の意図された使用、およびバッチでの達成が意図される生成物の量、または連続プロセスでの生産速度に従って選択されてもよい。明らかに、反応容器のサイズが、バッチで生産できる生成物の量に上限を課す。

反応容器のアスペクト比は、８：１以下であるか、または７：１、６：１もしくは５：１以下であってもよい。反応容器の高さが高すぎる場合、反応混合物の引き抜きと戻しにより内容物の徹底的な混合を行うことがより難しくなる。反応容器の幅が広すぎる場合、特により小さい反応体積の場合、全体で一定の温度を確実にすることがより困難になる。混合物の撹拌は、特に反応混合物が９５℃に加熱される場合、混合物全体で望ましい温度を達成することを助けることができる。上記の範囲内のアスペクト比を有する反応容器は、異なる量の反応要素にも適用することができる。

図３において、本発明の実施態様において使用され得る反応容器２を断面で示す。反応容器２は、ジャケット２５で取り囲まれた内部容器２３を含む。内部容器２３の内容物の温度を制御するために、温度制御流体は、内部容器２３とジャケット２５との間のスペース２６を通って循環する。下部ポート２７および上部ポート２８は、内部容器をそれぞれ選択バルブ３２ｂ、３２ａに接続するために備えられている。

内部容器２３は、例えば２０から５０ｍｍ、好ましくは２５から３５ｍｍの範囲の直径Ｄ１の円柱の形態を有する主要部分と、円柱形の部分を下部ポート２７に接続する先細部分２４とを有していてもよい。内部容器の全体的な高さＨ１は、１５０ｍｍから３００ｍｍ、望ましくは２００ｍｍから２５０ｍｍの範囲であってもよい。先細部分２４の高さは、５から２０ｍｍ、好ましくは１０から１５ｍｍの範囲であってもよい。先細部分の側壁の角度は、内部容器の軸に対して３０から６０°の範囲であってもよく、好ましくは約４５°である。下部ポート２７の直径Ｄ２は、５から１０ｍｍの範囲であってもよい。

反応容器は、一定ではない断面を有していてもよく、例えば、その高さ全体で漸減する断面を有するか、または中央のふくらんだ部分を有する。
反応容器の温度は、外部ジャケットを介した反応容器への温度制御流体のフローによって制御されてもよい。温度制御流体は、入口２ａによって供給され、再循環式の温度制御デバイス２２によって出口２ｂから除去されてもよい。再循環式の温度制御デバイスは、流体を加熱および／または冷却することによって温度制御流体の温度を制御する。反応容器は、例えば吸熱または発熱反応の出現に関係なく一定温度に維持されてもよいし、または望ましい温度プロファイルに従うように制御されてもよい。温度制御流体は、水または油であってもよい。温度制御流体は、装置のシャシーに備えられたポート１６を介して供給されてもよい。好適な再循環式の温度制御デバイスは、米国ペンシルベニア州のユラボＵＳＡ社（Julabo USA, Inc.）によって製造されたＰｒｅｓｔｏ Ａ３０温度制御システムである。本発明の実施態様において、再循環式の温度制御デバイス２２は、オームヒーターおよび／またはペルチエデバイスを含む。一実施態様において、反応容器の温度は、４℃から９５℃の範囲の温度に０．０１℃の精度で制御することができる。

温度制御された貯蔵容器４ａ〜４ｃは、合成反応で使用される反応要素ごとに備えられていてもよい。温度制御デバイス４１ａ〜４１ｃ中に搭載されたシリンジ４２ａ〜４２ｃ中、例えば使い捨てのポリプロピレンシリンジ中に、反応要素が保持される。この実施態様において、温度制御デバイスは、シリンジ４２ａ〜４２ｃをぴったりと受け入れるボアを有する、導電材料、例えばアルミニウムのブロックを含む。ブロックとシリンジとの間の熱伝導率を増加させる必要がある場合、熱伝導性ペーストが提供されてもよい。熱伝導性ブロックの温度、したがって貯蔵容器４２ａ〜４２ｃ中に貯蔵された反応要素の温度を制御するために、加熱／冷却デバイス、例えばオームヒーターまたはペルチエデバイスが熱伝導性ブロックに取り付けられる。

温度制御デバイス４１ａ〜４１ｃは、貯蔵された反応要素を加熱するかまたは冷却するために使用されてもよい。一部の反応要素は、それらの劣化を防ぐために、望ましくは低温で、例えば約４℃で保持される。プライマーは、プライマーの二量体化（diming）を防ぐおよび／または低減するように、高温で貯蔵することができる。また貯蔵容器を加熱して、反応容器に添加される前にテンプレートとプライマーとを変性させてアニールさせることもできる。反応容器の主要な温度制御の場合と同様に、温度制御された貯蔵容器は、一定温度に維持されてもよいし、または望ましい温度プロファイルに従ってもよく、例えば反応容器に添加する直前に反応要素を加熱してもよい。一実施態様において、温度制御された貯蔵容器の温度は、４℃から９５℃の範囲内で０．０１℃の精度で独立して制御することができる。

反応容器に添加する前にプライマーなどの反応要素の温度を、例えば９５℃に上昇させるために、１つまたはそれより多くのインラインヒーター（示されていない）が備えられていてもよい。ヒーターは、貯蔵容器４ａ〜ｃ、５ａ〜ｇと選択バルブ３２ｃとの間および／または選択バルブ３２ａと反応容器２との間のコンジットに備えられている。

この具体化において、温度制御された貯蔵容器４ｃの１つは、単一の温度制御ブロック４１ｃと熱接触している２つの貯蔵容器のシリンジ４２ｃおよび４２ｃ’を含む。これは、２つの反応要素が同じ温度に維持される必要がある場合、またはより大きい体積の単一の反応要素が望ましい反応に必要な場合に有用である。

装置はまた、温度制御デバイスと共に提供されない複数のさらなる貯蔵容器５ａ〜５ｇも含む。この実施態様では、７つのこのような貯蔵容器が存在し、他の実施態様では、それより多いまたは少ない貯蔵容器が提供される。さらなる貯蔵容器５ａ〜５ｇはまた、シリンジ、例えば、空のときに取り出して処分することができるガラスまたはポリプロピレンシリンジを含んでいてもよい。シリンジの使用は、反応要素が引き出されると貯蔵容器の体積が自動的に低減されるために有利である。折り畳み可能なバッグまたはチューブでも類似の作用を達成することができる。硬いコンテナーが使用される場合、汚染物質の進入を防ぐために、大気に通じるあらゆる通気孔中にフィルターが備えられていることが望ましい。

都合のよい形態としては、貯蔵容器５を搭載するための回転式スタンド５１が備えられている。反応要素が大量に必要となる場合、装置は、外部の貯蔵容器に接続するためのポートが備えられていてもよい。望ましくは、装置は、貯蔵容器を選択バルブに接続するのに必要なコンジットの長さを最小化するようにレイアウトされる。コンジットは、貯蔵容器から取り外し可能であってもよく、したがってクリーニング用流体または濯ぎのための水の供給源に接続されるマニホールドに取り付けられることができる。この方式によれば、装置全体を、その場で、すなわち分解することなく洗い流すことができる。

貯蔵容器４ａ〜ｃおよび５ａ〜ｇは、３から１０ｍｌ、例えば約５ｍｌの容量を有していてもよい。１つまたはそれより多くのより大きい貯蔵容器が備えられていてもよく、例えば緩衝溶液のためには、１０から５００ｍｌ、例えば約２５０ｍｌの容量である。

反応容器への反応要素の供給は、往復シリンジポンプ３ａによって実行されてもよい。このポンプは、供給ポンプと称される。これは、シリンジ３１ａ、例えばガラスまたはポリプロピレンシリンジを含み、ソレノイド３３ａによって駆動され、貯蔵容器および反応容器のそれぞれにソレノイドを選択的に接続するための制御可能な選択バルブ３２ａに接続されている。反応容器に制御された量の反応要素を添加するために、まず選択バルブ３２ａを使用してポンプのシリンジを関連する貯蔵容器に接続し、次いでソレノイドを作動させてシリンジに関連する体積の反応要素を引き込む。次に、選択バルブ３２ａを使用してシリンジ３１ａを反応容器２に接続し、ソレノイドを逆に作動させてシリンジの内容物を反応容器に吐出させる。この配列を用いれば、複数のシリンジポンプおよび反応容器への複数の入口を必要とせずに、反応容器に多量の望ましい反応要素を逐次的に迅速添加することが可能である。しかしながら、反応容器に複数の反応要素を同時に添加することが望ましい場合、複数の供給ポンプ３ａを備えることが可能である。これはまた、それらを反応容器に添加する前、特定の反応要素を絶対的に分離し続けることが必要な場合にも望ましいこともある。

さらに、第２の往復シリンジポンプ３ｂは、反応容器の内容物を撹拌したり、同様に反応の最後、または反応プロセス中のサンプリング目的のいずれかで反応混合物または生成物を取り出したりするのに使用されてもよい。このポンプは引き抜きポンプと称され、ソレノイド３３ｂによって駆動するシリンジ３１ｂを含む。第２のシリンジポンプ３ｂは、反応容器の底部で、第２の選択バルブ３２ｂを介して出口に接続される。反応容器の内容物を撹拌するために、第２の選択バルブ３２ｂを使用して反応容器にシリンジ３１ｂを接続し、その間に反応容器から所定量の反応混合物を引き出して、次いでそこに戻す。実行される撹拌の程度を制御するために、引き出される反応混合物の量および反応混合物を戻す速度を制御してもよい。このような撹拌は、反応経過中ずっと連続的に、一定間隔で、または反応要素の添加に関する特定の時間で実行することができる。

代替として、またはそれに加えて、第２の往復シリンジポンプ３ｂは貯蔵容器４ａに接続されていてもよく、その貯蔵容器に貯蔵された反応要素を反応容器２に供給するのに使用することができる。

圧力センサー８２は、反応容器２と選択バルブ３２ｂとの間または選択バルブ３２ｂと引き抜きポンプ３ｂとの間のコンジットに接続された短いスプール上に備えられていてもよい。反応容器２からの材料の引き抜きおよび反応容器２への戻し中、センサー８２によって測定された圧力が、移動中の混合物の粘度の指標になり、すなわち圧力が高いほど、粘度はより高くなる。特定には、材料の周期的な引き抜きおよび戻し中の圧力変化の振幅が、反応混合物の粘度の指標になる。圧力と粘度との正確な関係は、材料の引き抜きまたは戻しの速度、使用されるコンジットの直径、および反応容器の幾何学的配置などの様々な要因に依存する。この関係は、理論的に決定することもでき、または較正によって決定することもできる。一実施態様において、正確な関係は必ずしも必要ではなく、圧力センサー８２からのシグナルは、その正確な粘度を知らないまま反応混合物中における変化を検出するのに単に使用することもできる。生成物形成により粘度が増加する反応において、圧力センサーからのシグナルは、反応を制御するのに使用することができる。圧力シグナルをベースとして、適切な速度または適切な量で、貯蔵容器の１つまたはそれより多くから１種またはそれより多くの適切な試薬を送達するのにポンプを駆動させることによって、生成物収量を増加させることができる。他のケースにおいて、圧力シグナルは、反応の完了または反応中の段階を示す場合があることから、生成物の回収または次の段階のための要素の添加を開始させるのに使用することができる。

圧力センサー８２からのシグナルは、混合物中のＤＮＡ材料が剪断力によってダメージを受けないように反応容器への混合物の引き抜きおよび／または戻しの速度を制御するのに使用することができる。混合物の引き抜きおよび／または戻しの速度は、圧力の限界を超えないように制御されてもよい。圧力の限界は、粘度依存性であり得る。

反応容器から材料、例えば反応生成物を取り出すために、まず引き抜きポンプ３ｂを第２の選択バルブ３２ｂによって反応容器に接続して、ソレノイドを作動させて、反応容器２から材料が引き抜かれるようにシリンジのピストンを引き出す。次いで引き抜きポンプを第２の選択ポンプによって出口ポート７に接続し、ソレノイド３３ｂを駆動させて、出口ポート７を介して収集された材料を排出する。

出口ポート７は、例えば、反応生成物のためのコンテナー、サンプルコンテナー、測定デバイスまたは他のあらゆる装置に接続されてもよい。測定目的で取り出されたサンプルを測定後に反応容器に戻すことも可能である。

引き抜きポンプ３ｂは、例えば反応容器全体が１回のポンピング操作で空にすることができるように、供給ポンプ３ａより大きい容量を有していてもよい。またこのような引き抜きポンプ３ｂの大きい容量は、システム全体に大量のクリーニング溶液および／または脱イオン水をフラッシングさせることによる装置のクリーニングを助けるためにも望ましい。この目的を達成するために、装置は、十分な量のクリーニング溶液および脱イオン水を保持するための追加の大きい貯蔵容器が備えられていてもよい。

反応混合物を撹拌するために、さらに反応混合物および／または生成物を引き出すために、単一のポンプを反応要素を供給するのに使用してもよい。
供給ポンプ３ａおよび／または引き抜きポンプ３ｂは、別の形態のポンプ、例えば蠕動ポンプを含んでいてもよい。

また装置は、通気孔６２を介して大気に接続される廃棄物容器６も含み、ここで通気孔は、一方向バルブと共に備えられていてもよい。廃棄物容器６は、通気孔を備えることにより反応容器２中の圧力上昇を防ぐように、反応容器２の上部に接続される。反応容器からの生成物ならびにあらゆる未使用のおよび望ましくない反応要素の放出が可能になるように、廃棄物容器６を選択バルブ３２aおよび３２bを用いて接続するためのコンジットも備えられる。廃棄物容器はまた、その場での洗い流しの間に洗い流しの流体を受け取ったり、加えて、反応容器への望ましい量の正確な送達を可能にするために、コンジットのプライミングから少量の反応要素を受け取ったりするのに使用することができる。

廃棄物容器６は、省略されてもよい。その場合、反応容器２に安全バルブを備えていること、および選択バルブ３２a、３２bから外部のドレインへの接続部を備えていることが望ましい。

装置の操作は、制御器８によって制御され、ここで制御器８は、温度制御デバイス４１ａ〜ｃに、選択シリンジ３２ａ〜ｂに、ソレノイド３３ａ〜ｂに、温度制御デバイス２２に、および圧力センサー８２に、これらの装置の要素を制御するように電気的に接続される。制御器８はまた、全体的なプロセス制御を行うために外部のコンピューター９への接続を可能にするインターフェース８１も含む。

制御器８は、プライミング、サンプリング、回収、濯ぎ、およびクリーニングなどの、具体的な一般的に使用されるルーチンを実行するために事前にプログラム化されていてもよい。一実施態様において、制御器８は単に、外部のコンピューター９から装置の異なる要素にコマンドを送る。上述のルーチンは、外部のコンピューターの制御下で、または手動で実行することができる。

装置のプライミングは、貯蔵容器と選択バルブとの間のコンジットがそれぞれの反応要素で充填されるように、使用される貯蔵容器のそれぞれから反応要素を引き出すことを含んでいてもよい。これは、反応容器に送達される反応要素の量の精度を増加させて、汚染の可能性を低下させるのに望ましい。一実施態様において、反応混合物のサンプリングは、反応の経過中に、予め決定された量の反応要素を、外部の容器またはセンサーに取り出すことを含む。いくつかのケースにおいて、反応容器へのサンプルの戻しが可能性である。回収は、バッチプロセスの最後に、または連続プロセス中の適切な時間に、反応生成物の一部または全てを引き出すことを含んでいてもよい。濯ぎは、使用されるコンジットおよび貯蔵容器を純水で濯ぐことを含んでいてもよい。装置のクリーニングは、コンジットおよび貯蔵容器をクリーニング溶液で濯ぐことを含んでいてもよい。

本発明の実施態様において、ＤＮＡテンプレート、少なくとも１種のポリメラーゼ、１種またはそれより多くのプライマーおよびヌクレオチドが反応容器に添加されて、反応混合物が形成される。反応混合物の部分または一部は、反応混合物を撹拌してそれらの混合を確実にするために、反応容器から引き出され、そこに戻される。反応の最後に、ＤＮＡは、反応容器から引き出される。一実施態様において、反応混合物は、反応容器のより低い部分に、好ましくは反応容器の最も低いポイントに備えられたポートから引き出される。一実施態様において、取り出される反応混合物の一部は、反応混合物全体の５０％またはそれ未満、望ましくは４０％またはそれ未満、好ましくは３０％またはそれ未満の量である。一実施態様において、取り出される反応混合物の一部は、反応混合物全体の５％またはそれより多く、望ましくは１０％またはそれより多く、好ましくは２０％またはそれより多くの量である。

一実施態様において、反応混合物の開始時の体積は、１０ｍｌから１０リットルの間であり、好ましくは１０〜１００ｍｌ、１００ｍｌ〜１０００ｍｌまたは１〜１０リットルである。

以下、数々の非限定的な例を参照しながら本発明を説明する。

材料および方法
以下の実施例で行われたＤＮＡ増幅は、プロテロメラーゼＴｅｌＮの標的部位を含有するｄｓ環状テンプレートに作用するＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼを使用して行われた。Ｐｈｉ２９ポリメラーゼは、プロテロメラーゼＴｅｌＮ（タッチライトジェネティクス（Touchlight Genetics））で望ましい閉じた直鎖状ＤＮＡ生成物にプロセシングされ得る環状テンプレート（コンカテマー）の長い直鎖状の反復を生産する。Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼによりコンカテマー様のＤＮＡを作り出すことにより、それらの長さが長いことから（報告によれば最大７７キロベース）反応物の粘度増加が起こり、一方でプロテロメラーゼＴｅｌＮで二本鎖のコンカテマー様ＤＮＡをプロセシングすることにより、それらの長さがより一層短いことから（所与の実施例では２から３キロベースの間）粘度減少が起こる。

実施例１および３において、ＤＮＡは、本明細書で説明され、図１〜３に示されるような装置で生産される。
実施例１：圧力差測定による反応で生産されたＤＮＡのオンラインの定量
まず装置をクリーニングし汚染を除去した。チューブを１０個の試薬貯蔵容器（４２ａ、４２ｂ、４２ｃ’、４２ｃ、５ａ〜５ｇ）から切り離し、１０％次亜塩素酸ナトリウム溶液を含有する１２０ｍｌの貯蔵容器からのフィードを受ける１０個の位置のマニホールドに、ルアー式はめ込みを介して再度接続した。同様に、１０％次亜塩素酸ナトリウム溶液の６０ｍｌの貯蔵容器を、選択バルブ３２ｂからの出口ポート７に取り付けた。それぞれ５ｍｌのガラスシリンジ３１ａおよび３１ｂにおける選択バルブ３２ａおよび３２ｂの位置ならびにソレノイド３３ａおよび３３ｂの作用を制御することによって、反応容器２それ自体を包含するシステム全体を、デッドスペースを作らずに次亜塩素酸ナトリウム溶液で完全に充填した。各チューブを介して最小限の溶液５ｍｌを引き出した。反応容器（容量１２０ｍｌ）をサーモサーキュレーター２２での制御動作によって５０℃に加熱し、この状況で３０分間にわたりシステムを維持した。この手順により、全てのフィードチューブおよび反応容器それ自体の中における全ての汚染ＤＮＡの完全な破壊を確実にした。

同様に、上述した選択バルブおよびソレノイドを制御するのに適切なプログラムを使用することによって、次亜塩素酸ナトリウム溶液を廃棄物容器６に分配することによりシステム全体を空にした。貯蔵容器中の次亜塩素酸ナトリウム溶液を脱イオン水で交換した後、上記のプロセスを５回繰り返すことによって、残留した全ての次亜塩素酸ナトリウムのシステム全体からの完全な除去を確実にし、システムをすぐ使える状態にした。

次いでチューブをマニホールドから切り離し、ルアーロック式のはめ込みを備えた滅菌の使い捨てポリプロピレンシリンジ（容量５ｍｌ〜２０ｍｌ）を含む１０個の試薬貯蔵容器に再度接続した。以下で示される場合、これらのシリンジは、個々の反応要素を最小限の体積の２ｍｌで含有していた。そうでなければ、プランジャーを完全に押し下げてシリンジを空のままにした。貯蔵容器５ｄは、総容量１２０ｍｌの脱イオン水が得られるように、並列して２つの６０ｍｌシリンジからなっていた。試薬を含有するシリンジにおいて、充填後に、シリンジ出口から液体が少しだけ漏れるまでプランジャーを手動で押し下げることによって、各シリンジ外筒中の空気を追い出した。この手順中、シリンジ出口をシリンジプランジャーの上で垂直に維持して、外筒中の全ての空気が排除されるようにした。

それぞれ貯蔵容器４２ｃおよび４２ｃ’中の酵素試薬Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼおよびピロホスファターゼを、温度制御デバイス４１ｃにより、安定な条件下、４℃で維持した。全ての他の試薬を室温で維持した。

反応容器２への正確な試薬の分配を達成するために、極めて少量の試薬を引き出し廃棄物容器６に分配することによって、試薬貯蔵容器と選択バルブ３２ａおよび３２ｂとの間のチューブを逐次的にプライミングした。

ＤＮＡテンプレートを変性させてオリゴヌクレオチドプライマーと結合させるために、貯蔵容器５ａ、５ｂおよび５ｃからの試薬を、選択バルブ３２ａを介して、閉じた空の５ｍｌシリンジ（貯蔵容器４２ｂ）に分配した（シリンジ３１ａでのソレノイド３３ａの作動により）。この貯蔵容器の温度を、温度制御デバイス４１ｂによって制御した。４１ｂでの制御動作を使用して、その温度を３分にわたり９５℃に高め、次いで３０℃に冷却した。次いで貯蔵容器４２ｂ中の組み合わされた反応要素を選択バルブ３２ａを介して反応容器２に分配した。反応容器２の最終容量が１００ｍｌになるように、残りの５種の反応要素を、選択バルブ３２ａを介して表１に示された順番で逐次的に分配した。反応容器２の温度をサーモサーキュレーター２２での制御動作によって３０℃に設定した。反応要素は、設定値より２℃高い表面温度に晒されなかった。

反応要素の混合は、ソレノイド３３ｂでの制御動作とそれに続くシリンジ３１ｂの混合動作によって達成された。５ｍｌの反応要素を反応容器２から引き出しそこに戻すようにシリンジの動作を制御した。混合は不連続であり、シリンジは、２９分の間隔で１分にわたり、５５ｍｌ／分の引き抜き／分配速度で駆動させた。

反応容器２とシリンジ３１ｂとの間のチューブにおける圧力変化を、真空および圧力センサー（モデルＰＸ４０９−２．５ＣＧＵＳＢＨ、オメガエンジニアリング社（Omega Engineering Limited）、マンチェスター、M44 5BD、英国）によって測定した。このセンサーは、−２．５から＋２．５ｐｓｉの圧力差を測定し、直径１／８インチのＰＴＦＥチューブの短い断片を使用したＴ型部品を介して接続された。センサーからの出力シグナルをリアルタイムでモニターし、製造元により供給されたソフトウェアを使用して、リアクターを制御するコンピューターにログオンした。混合シリンジの往復動作が、プラス値とマイナス値（混合シリンジの押す／引くストローク）の間で往復する圧力センサーの出力を発生させる。各混合タイムポイントで記録された１分毎の圧力データにつき、最小および最大圧力の記録を、２０秒を３セットで計算した。各セットにつき最大値から最小値を引き、平均を計算した。シリンジ速度、チューブ材料、内径および長さ、ならびに選択バルブのサイズおよび幾何学的配置などの他の全ての変数を固定することにより、ピーク高さのいかなる変化も、反応要素の粘度変化のみに起因するようにできる。環境温度や圧力変動に起因し得る非常に小さい圧力変化は、圧力差の計算において補正しなかった。システムの完全な平衡化を確実にするために、分析に使用された第１のデータポイントは、およそ４５分後であった。

図４は明らかに、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼによって触媒されたＤＮＡ増幅反応の経過とともに圧力差が増加したことを示す。この反応から採取されたサンプルも、Ｑｕｂｉｔ（商標）ＢＲ ｄｓＤＮＡ蛍光アッセイ（ライフテクノロジーズ（Life Technologies）、英国ペイズリー）を使用して、ＤＮＡに関して直接分析した。このアッセイは、二本鎖ＤＮＡのみを測定する。反応で生産されたコンカテマー様のＤＮＡをプロテロメラーゼＴｅｌＮを用いてプロセシングして、３種の共有結合で閉じた直鎖状ＤＮＡ分子を生産した。プロセシングされたＤＮＡを、それぞれ５％および２Ｍの最終濃度のＰＥＧ８０００およびＮａＣｌで沈殿させた。沈殿したＤＮＡを１４，０００ｇで２０分遠心分離し、等しい体積のヌクレアーゼ非含有の脱イオン水に再懸濁した。

図５は明らかに、反応の経過中の圧力差シグナルの増加は、ＤＮＡの濃度増加と直接的に相関することを示す。また圧力と測定されたＤＮＡとの間の直接的な直線関係は、この反応期間にわたり、ＤＮＡが二本鎖の形態で優勢に存在することも示す。

実施例２：開始のｄＮＴＰ濃度の、それらのＤＮＡへの取り込み効率への作用
この実験において、ＤＮＡ増幅反応（体積５ｍｌ）を５０ｍｌのポリプロピレン遠沈管で実行した。表２に示した順番で遠沈管に要素を逐次的に添加して、示された最終濃度を得た。ＤＮＡ増幅への開始のｄＮＴＰ濃度の作用を、２ｍＭ、４ｍＭのおよび８ｍＭで試験した。

全てのチューブを、オービタルインキュベーターにおいて、６１．５時間の最短の撹拌時間で、３０℃でインキュベートした。この期間は、２ｍＭのｄＮＴＰが供給されたＤＮＡ増幅反応の完了に必要な期間のおよそ１０倍に相当する。反応の最後に、各条件下で生産されたコンカテマー様のＤＮＡを、プロテロメラーゼＴｅｌＮを用いてプロセシングして、２種の異なる共有結合で閉じた直鎖状ＤＮＡ分子を生産した。プロセシングされたＤＮＡを、それぞれ５％および２Ｍの最終濃度のＰＥＧ８０００およびＮａＣｌで沈殿させた。沈殿したＤＮＡを１４，０００ｇで２０分遠心分離し、５ｍｌのヌクレアーゼ非含有の脱イオン水に再懸濁した。このＤＮＡ生成物のサンプルを脱イオン水５０に対して１に希釈し、７５℃に１分加熱した。この希釈したＤＮＡの１０μｌのサンプルを、２μｌのローディング色素（ノーベルジュース（Novel Juice）、ニューマーケットサイエンティフィック社（Newmarket Scientific Ltd.）、英国）と混合し、１０μｌのサンプルを０．８％アガロースゲルに適用し、ＤＮＡ要素がはっきりと分離するまで標準的な電気泳動条件下で泳動した（図６）。

図６の電気泳動ゲルは明らかに、開始のｄＮＴＰ濃度が８ｍＭであった場合、２種の共有結合で閉じた直鎖状ＤＮＡ生成物に関して生成物収量の劇的な減少を示す。反応を長い期間にわたり行ったため、これは、ＤＮＡ増幅に対して非常に強い阻害作用を示す。また反応の最後に採取されたサンプルも、２６０ｎｍでの吸光度測定を使用してＤＮＡに関してアッセイし、結果を表３に示した。

Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼによって触媒される反応における４ｍＭを超える開始のｄＮＴＰ濃度はＤＮＡの収量を劇的に低減する可能性があることを図６において示した電気泳動結果が、表３で確認される。また、８ｍＭの開始のｄＮＴＰ濃度は、２つの主要な生成物のバンド周辺が滲んでいることから明らかなように（図６）、生成物の純度も有意に低減することが明白となった。

ｄＮＴＰの開始濃度を増加させることによる観察されたＤＮＡ収量の低減は、反応における様々な作用が原因の可能性がある。これらの作用としては、これらに限定されないが、酵素の基質の阻害、ＤＮＡ鎖相互作用、主にプライマーとテンプレートとの相互作用の安定性に対するＬｉ^＋またはヌクレオチドの作用、および／またはｄＮＴＰへのＭｇ^２＋結合の結果として酵素活性に利用可能な遊離のＭｇ^２＋のレベルが挙げられる。ＤＮＡ増幅の阻害は、直接または間接的な方式で機能する単一の要因または複数の要因によって引き起こされる可能性がある。明らかに、工業的生産にとって許容できるとみなされるレベルに反応におけるＤＮＡの収量を増加させることは、単にｄＮＴＰの開始濃度を増加させることでは達成できない。

実施例３：Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼによって触媒されるＤＮＡ増幅反応にｄＮＴＰをフィードすることの作用
実験を行って、Ｐｈｉ２９によって触媒されるＤＮＡ増幅反応に追加量のｄＮＴＰを補充することの作用を比較した。２６０ｎｍでの吸光度測定からＤＮＡ濃度を計算したこと以外は、実施例１で説明されるようにして反応を行った。２ｍＭのｄＮＴＰを用い、追加のｄＮＴＰを添加しなかった反応（反応１）、２ｍＭのｄＮＴＰを用い、５３０分で追加の２ｍＭのｄＮＴＰをフィードした反応（反応２）、開始から４ｍＭのｄＮＴＰを用いた（追加のｄＮＴＰを添加しなかった）反応、および２ｍＭのｄＮＴＰを用い、２ｍＭ濃度の追加のｄＮＴＰを３回（５００、１４３０および４３４０分で）フィードした反応の間で比較を行った。あらゆる追加のｄＮＴＰをフィードするためのきっかけは、圧力差シグナルが横ばいになったときであった。それにより、リアクター中のｄＮＴＰ濃度が２ｍＭに増加するように、貯蔵容器から適切な体積のｄＮＴＰ溶液の添加が開始された。

これらの反応条件のそれぞれについて、図７に圧力差対時間のプロットを示す。
図７に示したデータから、必要に応じてｄＮＴＰ添加前、添加の間および添加後の初速度を計算した。これらは表４に示される。各反応の最後にも、ＤＮＡの最終的な収量を推測し、添加されたｄＮＴＰ濃度から、理論上の最大収量のパーセンテージとして計算した。表５にデータを示す。

表４は明らかに、ｄＮＴＰの濃度を増加させることは、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼによってＤＮＡが増幅される速度を劇的に低減することを示す。反応速度への作用は累積的であり、いつ追加のｄＮＴＰが添加されるかは無関係である。

実施例２において、８ｍＭのｄＮＴＰ開始濃度を用いた反応は、理論上の最大収量の１５％しか生産しなかったことが示され、これは、反応が極めて遅かったことを示す。表５において、８ｍＭのｄＮＴＰが２ｍＭのアリコートで添加される反応（反応４）は、理論上の最大収量の５４％のＤＮＡ収量を達成しており、これは、極めて有意な改善である。段階的なｄＮＴＰのフィードにより連続的な反応速度低減が起こると考えられるが、反応開始時に高濃度のｄＮＴＰを導入するよりも、全体的な速度は速く、収量も多い。

表４はまた、ｄＮＴＰをフィードするプロセスにおいて、Ｍｇ^２＋イオンとｄＮＴＰリン酸基とのモル比（Ｍｇ^２＋／ＰＯ_４ ^３−の比率）が有意に低減し、観察された反応速度の減少と一致することも示す。これは、図８で例示される。

したがってｄＮＴＰをフィードすることは、酵素によって触媒される反応で、ＤＮＡ生産を工業的に許容されるレベルに増加させることができる。しかしながら、より高い反応速度を達成するために、Ｍｇ^２＋イオンとｄＮＴＰＰＯ_４ ^３−基とのモル比を、ｄＮＴＰと共にＭｇ^２＋イオンをフィードすることによって最適なレベルに維持することが必要であると考えられる。

実施例４：ＤＮＡへのｄＮＴＰの取り込み効率に対するマグネシウムイオン濃度の作用
この実験において、ＤＮＡ増幅反応（体積５ｍｌ）を５０ｍｌのポリプロピレン遠沈管中で実行した。要素を３０℃に予熱し、表６に示した順番で遠沈管に逐次的に添加して、示された最終濃度を得た。２．２４ｍＭ、４．５２ｍＭ、９ｍＭのおよび１１．２４ｍＭのＭｇ^２＋の開始濃度と、３ｍＭの開始のｄＮＴＰ濃度との組合せにより、それぞれ０．２５、０．５、１および１．２５のＭｇ^２＋／ＰＯ_４ ^３−の比率を得た。チューブを３０℃で１９時間インキュベートした後、さらなるｄＮＴＰおよびＭｇＣｌ_２のアリコートを添加して、ｄＮＴＰの反応濃度を６ｍＭに増加させ、Ｍｇ^２＋濃度を４．４８ｍＭ、９．０４ｍＭ、１８ｍＭおよび２２．４８ｍＭに増加させて、０．２５、０．５、１および１．２５のＭｇ^２＋／ＰＯ_４ ^３−の比率を維持した。反応をさらに２４時間進行させた後、回収されたＤＮＡ生成物とその濃度を推測した。ＤＮＡを十分な量のプロテロメラーゼＴｅｌＮで消化し、５００ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのＭｇＣｌ_２を含有する緩衝液中の６％ＰＥＧ８０００を使用してＤＮＡを沈殿させた。ＤＮＡを４ｍｌの体積に再懸濁し、２６０ｎｍでの吸光度測定を使用してＤＮＡを定量した。

表７の結果は、ｄＮＴＰフィード反応の４３時間後における異なるＭｇ^２＋／ＰＯ_４ ^３−の比率のＤＮＡ収量への作用を示す。この時間の後に０．２５のＭｇ^２＋／ＰＯ_４ ^３−の比率で達成されたより低いＤＮＡ収量は、Ｍｇ^２＋イオン濃度が不十分なことによるより遅い反応速度または反応阻害を示す。いずれにせよ、データから、工業用途のための効率的なＤＮＡ増幅反応のために維持されることが求められる最適なＭｇ^２＋／ＰＯ_４ ^３−の比率があることが示される。データから、最適な比率は、０．５から１．２５の間であり得ることが示される。またデータから、ｄＮＴＰが反応にフィードされる場合、追加のＭｇ^２＋イオンの添加は、最適なＭｇ^２＋／ＰＯ_４ ^３−の比率（理想的には１）を維持し、ＤＮＡへの効率的な変換を可能にすることも示される。

実施例５：複数のｄＮＴＰアリコートがフィードされたＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼによって触媒されるＤＮＡ増幅反応へのプロテロメラーゼＴｅｌＮ添加の作用
実験を行って、プラスミドＰｒｏＴＬｘ−Ｋ Ｎ３Ｘ２ ＬｕｘにおけるＰｈｉ２９によって触媒されるＤＮＡ増幅反応に、追加量のｄＮＴＰおよびプロテロメラーゼＴｅｌＮを補充する作用を比較した（図１３）。反応は本質的に実施例１で説明されるようにして行われたが、貯蔵容器４２ｂは、１２ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、９０ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ中の２５μＭのＴｅｌＮ溶液を含有していた。１ｍＭのＤＴＴ、５０％グリセロールを４℃で維持し、貯蔵容器５ｇに脱イオン水中の１００ｍＭのＭｇＣｌ_２溶液を入れた。テンプレートＰｒｏＴＬｘ−Ｋ＿Ｎ３Ｘ２Ｌｕｘの開始濃度は５μｇ／ｍｌであった。

反応のバッチ相の後、３００分、６００分、９００分、１０８０分、１２３０分および１４４０分の選択された時間間隔で２ｍＭの濃度増加を達成するために、ｄＮＴＰのアリコートをシリンジ３１ａを介して反応容器２に添加した。ｄＮＴＰ添加の同じ間隔で、およびその直後に、ＭｇＣｌ_２のアリコートを添加して、［Ｍｇ^２＋］：［ｄＮＴＰ］の３：１の比率を達成した。１０５０分に、プロテロメラーゼＴｅｌＮを反応容器２に分配して、２μＭの最終濃度を得た。

反応の最初のバッチ相（最大３００分）の後、コンカテマー様のＤＮＡ合成に対応する差圧の測定において安定した増加がみられる。１０５０分で反応にプロテロメラーゼＴｅｌＮを添加した後、ＤＮＡ合成の劇的な増加に対応する圧力変化の速度の３．６倍の増加がみられる。反応のｄＮＴＰ／Ｍｇ^２＋フィード相中における単一のＴｅｌＮ添加により、さらなるＤＮＡ増幅のためのテンプレートとして作用できる閉じた直鎖状ＤＮＡの生産が起こることが提唱される。このポイント後におけるＭｇ^２＋／ｄＮＴＰのさらなるフィードは、観察されたＤＮＡ合成速度の増加を確実にするために重要である。

１ 合成装置
２ 反応容器
２ａ 入口
２ｂ 出口
３ａ、３ｂ 往復シリンジポンプ（供給ポンプ、引き抜きポンプ）
４ａ〜４ｃ 貯蔵容器
５ 貯蔵容器
５ａ〜ｇ 貯蔵容器
６ 廃棄物容器
７ 出口ポート
８ 制御器
９ コンピューター
１１ シャシー
１２ フロントカバー
１３ 電源入力
１４ 入力／出力ポート
１５ 操作表示灯
１６ ポート
２２ 温度制御デバイス
２３ 内部容器
２４ 先細部分
２５ ジャケット
２６ スペース
２７ 下部ポート
２８ 上部ポート
３１ａ〜３１ｃ シリンジ
３２ａ〜ｃ 選択バルブ、選択シリンジ
３３ａ〜ｂ ソレノイド
４１ａ〜ｃ 温度制御デバイス
４２ａ〜４２ｃ、４２ｃ’ 貯蔵容器（シリンジ）
５１ 回転式スタンド
６２ 通気孔
８１ インターフェース
８２ 圧力センサー

Claims (26)

1. ＤＮＡを合成するための無細胞製法であって、ヌクレオチドの存在下で、ＤＮＡテンプレートを少なくとも１種のポリメラーゼと接触させて、別の鎖の鎖置換での複製を介して複製された鎖を置換することによって前記テンプレートの増幅を促進する条件下で、反応混合物を形成することを含み、さらなるヌクレオチドが、制御された方法で反応混合物に供給される、上記製法。
2. 前記反応混合物が、１種またはそれより多くのプライマーをさらに含む、請求項１に記載の製法。
3. ＤＮＡを合成するための無細胞製法であって、ヌクレオチドおよび少なくとも１つのプライマーの存在下で、ＤＮＡテンプレートを少なくとも１種のポリメラーゼと接触させて、別の鎖の鎖置換での複製を介して複製された鎖を置換することによって前記テンプレートの増幅を促進する条件下で、反応混合物を形成することを含み、さらなるヌクレオチドが、制御された方法で反応混合物に供給される、上記製法。
4. 反応混合物が、１種またはそれより多くの金属カチオンをさらに含み、さらなる金属カチオンは、制御された方法で反応混合物に供給される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＤＮＡを合成するための無細胞製法。
5. 前記さらなるヌクレオチドおよびさらなる金属カチオンが、独立して反応混合物に供給される、請求項４に記載の製法。
6. 前記ＤＮＡテンプレートが、環状であり、前記ＤＮＡテンプレートの増幅が、ローリングサークル増幅による、請求項１〜５のいずれか一項に記載の製法。
7. 前記ＤＮＡテンプレートが、閉じた直鎖状ＤＮＡであり、好ましくは、前記ＤＮＡテンプレートが、変性条件下でインキュベートされて、閉じた環状一本鎖ＤＮＡを形成する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の製法。
8. 前記ＤＮＡテンプレートが、少なくとも１つのプロセシング酵素の標的配列、好ましくはリコンビナーゼ標的配列またはプロテロメラーゼ標的配列を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の製法。
9. プロセシング酵素が、制御された方法で反応混合物に供給される、請求項８に記載の製法。
10. 前記さらなるヌクレオチドが、複数のアリコートで反応混合物に供給される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の製法。
11. 前記さらなるヌクレオチドが、製法の持続時間中にわたり一定間隔で、任意に少なくとも３０分毎に、アリコートとして供給される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の製法。
12. 前記さらなる金属イオンが、製法の持続時間中にわたり一定間隔で、任意に少なくとも３０分毎に、アリコートとして供給される、請求項４に記載の製法。
13. 少なくとも３、４、５、６、７、８、９または１０個のアリコートが、反応混合物に供給される、請求項１１または１２に記載の製法。
14. 前記アリコートが、ポンプを使用して外部源からフィードされるか、または浸透圧ポンプの使用により反応混合物に供給される、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の製法。
15. 前記ヌクレオチドまたはさらなるヌクレオチドが、生物学的に不活性なヌクレオチドを含み、好ましくは活性化を介して前記反応混合物に供給される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の製法。
16. 前記さらなるヌクレオチドが、反応混合物中のＤＮＡの濃度に関するシグナルに応答して供給される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の製法であって、好ましくは、反応混合物中におけるＤＮＡの濃度は、反応混合物またはそれらの一部の圧力差を測定することによってモニターされ、任意にシグナルを生成する可能性があってもよい、前記製法。
17. ＤＮＡの濃度を示すシグナルが、任意に圧力センサーで、反応混合物の一部を取り出したり戻したりする往復ポンプによって生じた圧力差を測定することによって生成される、請求項１６に記載の製法。
18. 前記製法が、合成装置中で実行され、前記装置が、
    少なくとも第１のポートおよび第２のポートを有する反応容器；
    反応容器の温度を制御するための温度制御デバイス；
    反応要素を保持するための複数の貯蔵容器；
    複数のコンジットであって、それぞれが反応容器の第１のポートを複数の貯蔵容器の１つのそれぞれに接続する、コンジット；
    反応容器の第１のポートまたは第２のポートの近傍に配置された少なくとも１つの圧力センサー；
    反応容器に、貯蔵容器中に保持された制御された量の反応要素を選択的に供給するための供給手段；
    反応容器から、それらの第２のポートを介して所定量の内容物を選択的に引き出し、反応容器に、それらの第２のポートを介して反応容器の内容物を選択的に戻すための撹拌手段；および
    供給手段と撹拌手段とを制御するための制御手段
    を含み、
    ここで圧力センサーは、反応容器の外部から圧力の変化を検出し、
    シグナルを制御手段に送り、制御手段は、観察された圧力の変化に応答して供給手段および／または撹拌手段を制御する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の製法。
19. 前記反応要素が、前記さらなるヌクレオチドおよび／またはさらなる金属イオンを含む、請求項１８に記載の製法。
20. 前記金属カチオンが、マグネシウム（Ｍｇ^２＋）、マンガン（Ｍｎ^２＋）、カルシウム（Ｃａ^２＋）、ベリリウム（Ｂｅ^２＋）、亜鉛（Ｚｎ^２＋）およびストロンチウム（Ｓｒ^２＋）、リチウム（Ｌｉ^＋）、ナトリウム（Ｎａ^＋）またはカリウム（Ｋ^＋）からなるリストから選択される１種またはそれより多くの金属、好ましくはＭｇ^２＋を含む、請求項４または１９に記載の製法。
21. 前記金属カチオンが、２価カチオンであり、前記２価の金属カチオンとヌクレオチドとの比率は、反応混合物中で約３：１に維持される、請求項４、または請求項２０もしくは２１に記載の製法。
22. 前記反応混合物中のヌクレオチドの濃度が、０．００１ｍＭから６ｍＭの間、任意に約３ｍＭに維持される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の製法。
23. 前記ヌクレオチドおよび／またはさらなるヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、またはそれらの誘導体もしくは改変型である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の製法。
24. 前記ヌクレオチドおよび／またはさらなるヌクレオチドが、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）およびそれらの誘導体の１種またはそれより多くである、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の製法。
25. 前記ヌクレオチドが、遊離酸、それらの塩またはそれらのキレートの１種以上として提供され、前記塩またはキレートに含まれるものは、任意に以下の金属イオン：Ｍｇ^２＋、Ｂｅ^２＋、Ｃａ^２＋、Ｓｒ^２＋、Ｌｉ^＋、Ｎａ^＋、Ｋ^＋、Ｍｎ^２＋またはＺｎ^２＋であってよい、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の製法。
26. 前記プロセシング酵素が、反応混合物中のＤＮＡの濃度に関するシグナルに応答して供給される、請求項８に記載の製法。