KR20170045349A - Dna의 합성 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 바람직하게 대규모로, DNA, RNA, 단백질 및 유사 분자의 합성, 특히 DNA의 무세포 효소적 합성을 위한 개선된 방법에 관한 것이다. 본 발명은 가닥-치환 복제를 사용하는 DNA의 합성에 관한 것이고, 상기 반응 혼합물로 뉴클레오티드의 첨가가 조절되어서, 수득율을 조절한다. 상기 반응 혼합물은 뉴클레오티드, 폴리머라제 및 DNA 주형의 개시 양을 포함하고, 상기에 부가의 뉴클레오티드가 조절된 방식으로 공급된다.

Description

DNA의 합성{SYNTHESIS OF DNA}
본 발명은 바람직하게 대규모로, DNA, RNA, 단백질 및 유사 분자의 합성, 특히 DNA의 무세포 효소적 (cell-free enzymatic) 합성을 위한 개선된 방법에 관한 것이다.
데옥시리보핵산 (deoxyribonucleic acid: DNA)의 증폭이 세포-기반 공정들의 사용을 통해 실시될 수 있으며, 예컨대 발효기에서 증폭될 DNA를 증식하는 박테리아의 배양에 의해서 실시될 수 있다. 폴리머라제 연쇄 반응 (polymerase chain reaction: PCR) 및 가닥-치환 반응 (strand-displacement reactions)을 포함하는, 개시 주형 (starting template)으로부터 DNA의 증폭을 위한 무세포 효소적 방법이 또한 개시되었다.
과거에는, 마이크로적정 플레이트 (microtitre plates) 및 필요에 따라 반응 성분들을 첨가하기 위한 로봇-제어 피펫을 기반으로 한 장치를 사용하여 시험 규모 (test scale)로 DNA 증폭이 실시되었다. 상기 장치 및 방법은 시험 목적을 위한 소량의 DNA 분자를 제조하는데 적당하지만, 그러나 다른 목적을 위해 충분한 양을 제공하지 못했다. 특정 핵산 및 단백질의 대규모 증폭 및 제조가 세포-기반 공정을 통해서 대부분 실시되었다. 상기 방법들은 매우 많은 양의 생성물의 제조에 일반적으로 효과적이지만, 셋업하는데 비용이 많이 든다.
상기 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 실시하기 위해 서모사이클 방법 (thermocyclic method)을 사용하여 DNA 시료를 증폭하기 위해 특별히 조정된 이용가능한 많은 장치가 있다. 이러한 장치들은 상기 반응에 이상적으로 적합하지만, 그러나 융통성이 없어서 다른 반응을 실시하기 위해서 조정될 수 없다. 이러한 장치의 예가 US 8,163,489에 개시되었다.
화학 합성, 예컨대 포스포르아미디트 (phosphoramidite) 방법을 사용하는 대규모 DNA 합성이 알려져 있지만, 그러나 결점이 없지 않다. 상기 반응은 유기 용매중에서 일반적으로 실시되어야 하며, 이는 많은 것이 독성이 있거나, 또는 그렇지 않다면 유해하다. 화학 합성에 대한 다른 단점은 완벽하게 효율적이지는 않다는 것이며, 이는 각 뉴클레오티드 첨가 이후에, 성장하는 올리고뉴클레오티드 사슬의 적어도 2%가 캡핑 (capping)되어, 수득율 손실을 일으키기 때문이다. 그러므로 합성되는 상기 뉴클레오티드 사슬에 대한 전체 수득율 손실은, 각 뉴클레오티드가 상기 서열로 첨가되면 증가한다. 올리고뉴클레오티드의 화학 합성에서 이러한 고유 비효율성 (inherent inefficiency)에 의해서, 50개 이하의 핵산 잔기를 갖는 올리고뉴클레오티드로 효과적으로 제조될 수 있는 올리고뉴클레오티드의 길이가 궁극적으로 제한된다.
지금까지, 폴리머라제와 같은 생물학적 촉매가 DNA 생성물의 산업적 규모 제조를 위해 관례적으로 활용되지 못했고, 반응들이 주로 마이크로리터 규모의 부피로 제한되었다. DNA의 효소적 합성을 사용하여 공정을 스케일업 (scaling up)하는 것은 특히 DNA 생성물의 수득율이 실망스럽다는 문제점이 드러났다.
그러므로, 상당한 규모로 DNA 및 유사한 분자를 합성하는데 사용될 수 있는 공정이 필요하다.
본 발명은 DNA의 무세포 제조를 위한 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 밀폐 회분식 (closed batch) 방법을 포함하는 현재 방법들과 비교하여 DNA의 생산을 향상시킬 수 있다. 이는 생산성 (productivity)을 현저하게 증가시키면서, 특히 대규모로 DNA를 합성하는 비용을 감소시켰다. 본 발명은 일반적으로, 가열 및 냉각을 통해 온도가 순환될 필요가 없이 DNA를 증폭하는 등온 방법 (isothermal methods)에 관한 것이다.
따라서, DNA 주형의 증폭을 다른 가닥의 가닥-치환 복제를 통해 복제된 가닥의 치환에 의해 촉진시키는 조건하에, 하나 이상의 프라이머 (primers) 및 뉴클레오티드의 존재하에, DNA 주형을 적어도 하나의 폴리머라제와 접촉시켜서 반응 혼합물을 형성하는 단계를 포함하고, 부가의 뉴클레오티드가 상기 반응 혼합물에 조절된 방식으로 공급되는 DNA를 합성하기 위한 무세포 공정이 제공된다.
그러므로, 상기 무세포 공정은 가닥 치환 복제를 통한 상기 주형의 증폭을 포함한다. DNA 주형의 증폭을 가닥-치환 복제에 의해서 촉진하는 조건하에, 하나 이상의 프라이머 및 뉴클레오티드의 존재하에, DNA 주형을 적어도 하나의 폴리머라제와 접촉시켜서 반응 혼합물을 형성하는 단계를 포함하고, 부가의 뉴클레오티드가 상기 반응 혼합물에 조절된 방식으로 공급되는 DNA를 합성하기 위한 무세포 공정이 제공된다.
따라서, DNA 주형의 증폭을 다른 가닥의 가닥-치환 복제를 통해 복제된 가닥의 치환에 의해서 촉진하는 조건하에, 뉴클레오티드의 존재하에, DNA 주형을 적어도 하나의 폴리머라제와 접촉시켜서 반응 혼합물을 형성하는 단계를 포함하고, 부가의 뉴클레오티드가 상기 반응 혼합물에 조절된 방식으로 공급되는 DNA를 합성하기 위한 무세포 공정이 또한 제공된다.
그러므로, 상기 무세포 공정은 가닥 치환 복제를 통한 상기 주형의 증폭을 포함한다. DNA 주형의 증폭을 가닥-치환 복제에 의해서 촉진하는 조건하에, 뉴클레오티드의 존재하에, DNA 주형을 적어도 하나의 폴리머라제와 접촉시켜서 반응 혼합물을 형성하는 단계를 포함하고, 부가의 뉴클레오티드가 상기 반응 혼합물에 조절된 방식으로 공급되는 DNA를 합성하기 위한 무세포 공정이 제공된다.
그러므로, 상기 반응 혼합물로 부가의 뉴클레오티드의 조절된 공급을 제공하는 것이 유익하고, 이는 상기 합리적인 조절 전략으로 상기 DNA의 합성 속도 및/또는 DNA 수득율을 향상시킬 수 있기 때문이다. 이러한 향상을 모든 뉴클레오티드가 개시 시에 상기 반응 혼합물에 공급되는 유사한 반응 혼합물과 비교하였다. 부가의 뉴클레오티드의 조절된 공급으로 상기 폴리머라제 효소의 생산성 및/또는 진행성 (processivity)을 증가시킬 수 있다.
대안으로서, DNA 주형의 증폭을 다른 가닥의 가닥-치환 복제를 통해 복제된 가닥의 치환에 의해서 촉진하는 조건하에, 하나 이상의 프라이머, 뉴클레오티드 및 금속 양이온의 존재하에, DNA 주형을 적어도 하나의 폴리머라제와 접촉시켜서 반응 혼합물을 형성하는 단계를 포함하고, 부가의 금속 양이온이 상기 반응 혼합물에 조절된 방식으로 공급되는 DNA를 합성하기 위한 무세포 공정이 제공된다.
그러므로, 상기 무세포 공정은 가닥 치환 복제를 통한 상기 주형의 증폭을 포함한다. DNA 주형의 증폭을 가닥 치환 복제에 의해서 촉진하는 조건하에, 하나 이상의 프라이머, 뉴클레오티드 및 금속 양이온의 존재하에, DNA 주형을 적어도 하나의 폴리머라제와 접촉시켜서 반응 혼합물을 형성하는 단계를 포함하고, 부가의 금속 이온이 상기 반응 혼합물에 조절된 방식으로 공급되는 DNA를 합성하기 위한 무세포 공정이 제공된다.
대안으로서, DNA 주형의 증폭을 다른 가닥의 가닥-치환 복제를 통해 복제된 가닥의 치환에 의해서 촉진하는 조건하에, 뉴클레오티드 및 금속 양이온의 존재하에, DNA 주형을 적어도 하나의 폴리머라제와 접촉시켜서 반응 혼합물을 형성하는 단계를 포함하고, 부가의 금속 양이온이 상기 반응 혼합물에 조절된 방식으로 공급되는 DNA를 합성하기 위한 무세포 공정이 제공된다.
그러므로, 상기 무세포 공정은 가닥 치환 복제를 통한 상기 주형의 증폭을 포함한다. DNA 주형의 증폭을 가닥 치환 복제에 의해서 촉진하는 조건하에, 뉴클레오티드 및 금속 양이온의 존재하에, DNA 주형을 적어도 하나의 폴리머라제와 접촉시켜서 반응 혼합물을 형성하는 단계를 포함하고, 부가의 금속 이온이 상기 반응 혼합물에 조절된 방식으로 공급되는 DNA를 합성하기 위한 무세포 공정이 제공된다.
그러므로, 상기 반응 혼합물로 부가의 금속 양이온의 조절된 공급의 제공이 유익하고, 이는 상기 합리적인 조절 전략으로 상기 DNA의 합성 속도를 향상시킬 수 있기 때문이다. 이러한 향상을 모든 금속 양이온이 개시 시에 상기 반응 혼합물에 공급되는 유사한 반응 혼합물과 비교하였다. 부가의 금속 양이온의 조절된 공급으로 상기 폴리머라제 효소의 생산성 및/또는 진행성을 증가시킬 수 있다.
또한, DNA 주형의 증폭을 다른 가닥의 가닥-치환 복제를 통해 복제된 가닥의 치환에 의해서 촉진하는 조건하에, 하나 이상의 프라이머, 뉴클레오티드 및 금속 양이온의 존재하에, DNA 주형을 적어도 하나의 폴리머라제와 접촉시켜서 반응 혼합물을 형성하는 단계를 포함하고, 부가의 뉴클레오티드 및 금속 양이온이 상기 반응 혼합물에 조절된 방식으로 공급되는 DNA를 합성하기 위한 무세포 공정이 제공된다.
그러므로, 상기 무세포 공정은 가닥 치환 복제를 통한 상기 주형의 증폭을 포함한다. DNA 주형의 증폭을 가닥 치환 복제에 의해서 촉진하는 조건하에, 하나 이상의 프라이머, 뉴클레오티드 및 금속 이온의 존재하에, DNA 주형을 적어도 하나의 폴리머라제와 접촉시켜서 반응 혼합물을 형성하는 단계를 포함하고, 부가의 뉴클레오티드 및 부가의 금속 양이온이 상기 반응 혼합물에 조절된 방식으로 공급되는 DNA를 합성하기 위한 무세포 공정이 제공된다.
또한, DNA 주형의 증폭을 다른 가닥의 가닥-치환 복제를 통해 복제된 가닥의 치환에 의해서 촉진하는 조건하에, 뉴클레오티드 및 금속 양이온의 존재하에, DNA 주형을 적어도 하나의 폴리머라제와 접촉시켜서 반응 혼합물을 형성하는 단계를 포함하고, 부가의 뉴클레오티드 및 금속 양이온이 상기 반응 혼합물에 조절된 방식으로 공급되는 DNA를 합성하기 위한 무세포 공정이 제공된다.
그러므로, 상기 무세포 공정은 가닥 치환 복제를 통한 상기 주형의 증폭을 포함한다. DNA 주형의 증폭을 가닥 치환 복제에 의해서 촉진하는 조건하에, 뉴클레오티드 및 금속 이온의 존재하에, DNA 주형을 적어도 하나의 폴리머라제와 접촉시켜서 반응 혼합물을 형성하는 단계를 포함하고, 부가의 뉴클레오티드 및 부가의 금속 양이온이 상기 반응 혼합물에 조절된 방식으로 공급되는 DNA를 합성하기 위한 무세포 공정이 제공된다.
부가의 뉴클레오티드 및 부가의 금속 양이온이 함께 또는 개별로 공급될 수 있다. 상기 뉴클레오티드 및 금속 이온이 상기 반응 혼합물로 공급되기 이전에 함께 혼합되지 않는 것이 바람직하다. 상기 부가의 뉴클레오티드 및 부가의 금속 양이온 각각은 서로 독립적으로 상기 반응 혼합물에 요구될 때, 첨가될 수 있다.
그러므로, 상기 반응 혼합물로 부가의 뉴클레오티드 및 부가의 금속 양이온의 조절된 공급의 제공이 유익하고, 이는 상기 합리적인 조절 전략으로 상기 DNA의 합성 속도 및/또는 DNA 수득율을 향상시킬 수 있기 때문이다. 이러한 향상을 모든 뉴클레오티드 및 금속 양이온이 개시 시에 상기 반응 혼합물에 공급되는 유사한 반응 혼합물과 비교하였다. 부가의 뉴클레오티드의 조절된 공급으로 상기 폴리머라제 효소의 생산성 및/또는 진행성을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 몇 가지 부가의 양태들의 각각에 따르면, 본 발명의 제1, 제2 또는 제3 양태에 따른 방법을 실시하도록 구성된 장치가 제공된다. 상기 장치가 본 발명의 임의의 양태에 따른 공정을 실시하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 부가의 양태에 따르면, 상기 DNA 주형은 하나 이상의 처리 효소 표적 부위 (processing enzyme target sites)를 포함할 수 있다. 상기 반응 혼합물이 하나 이상의 처리 효소와 임의의 시점에서 접촉될 수 있다. 상기 효소가 조절된 방식으로 상기 반응 혼합물로 제공될 수 있다. 바람직하게, 상기 처리 효소는 프로텔로머라제 (protelomerase) 효소이다.
독립적으로, 본 발명의 임의의 양태의 선택적 특성은 하기일 수 있다: 상기 DNA 주형은 원형(circular)일 수 있다. 상기 DNA 주형의 상기 가닥 치환 증폭이 롤링 서클 증폭 (rolling circle amplification: RCA)에 의해서 실시될 수 있다. 상기 DNA 폴리머라제는 Phi29 또는 그 변이체일 수 있다. 상기 DNA의 증폭은 등온 증폭 (isothermal amplification)일 수 있다. 상기 하나 이상의 프라이머는 무작위의 프라이머 (random primers)일 수 있다. 상기 합성된 DNA는 상기 DNA 주형으로부터 증폭된 DNA 서열의 탠덤 단위 (tandem units)를 포함하는 콘카타머 (concatamers)를 포함할 수 있다. 상기 DNA 주형이 닫힌 선형 (closed linear) DNA일 수 있고; 바람직하게, 상기 DNA 주형이 변성 조건하에서 인큐베이션되어서 닫힌 원형 단일가닥 DNA가 형성된다. 상기 DNA 주형은 적어도 하나의 처리 효소 표적 서열, 바람직하게 재조합효소 표적 서열 (recombinase target sequence) 또는 프로텔로머라제 표적 서열을 포함할 수 있다. 상기 DNA 주형은 원하는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 진핵세포 프로모터 (eukaryotic promoter), 및 선택적으로 진핵세포 전사 종결 서열 (eukaryotic transcription termination sequence)을 포함하는 발현 카세트 (expression cassette)를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트가 처리 효소 표적 서열, 바람직하게 재조합효소 표적 서열 또는 프로텔로머라제 표적 서열에 의해서 양 쪽에서 사이에 놓 일 (flank) 수 있다. 상기 증폭된 DNA가 재조합효소 또는 프로텔로머라제 효소와 적당하게 접촉될 수 있다.
합성될 수 있는 DNA의 양은 반응 혼합물의 리터 당 1 g 이상이다.
상기 부가의 뉴클레오티드 및/또는 부가의 금속 이온이 복수의 분취량 (aliquots)으로 상기 반응 혼합물로 공급될 수 있다. 상기 부가의 뉴클레오티드 및/또는 부가의 금속 이온이 상기 공정 기간 전체를 통해서 규칙적인 간격으로, 선택적으로 적어도 30분 마다 공급될 수 있다. 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10회의 분취량이 상기 반응 혼합물로 공급될 수 있다. 상기 부가의 뉴클레오티드 및/또는 부가의 금속 이온이 상기 반응 혼합물로 연속 방식 (continuous manner)으로 공급될 수 있다. 상기 부가의 금속 이온 및/또는 부가의 뉴클레오티드가 선택적으로 펌프를 사용하여 외부 공급원으로부터 상기 반응 혼합물로 공급될 수 있거나, 또는 삼투압 펌프 (osmotic pump)의 사용에 의해 상기 반응 혼합물로 공급된다.
상기 뉴클레오티드 또는 부가의 뉴클레오티드는 생물학적 비활성 뉴클레오티드를 포함할 수 있고; 선택적으로, 상기 생물학적 비활성 뉴클레오티드가 바람직하게 화학적 또는 물리적 수단에 의한 활성화 (activation)를 통해, 상기 반응 혼합물로 공급된다. 상기 생물학적 비활성 뉴클레오티드는 광분해 (photolysis)에 의해서 활성화되는 케이지된 (caged) 뉴클레오티드일 수 있다.
상기 부가의 뉴클레오티드 및/또는 부가의 금속 이온 및/또는 처리 효소가 상기 반응 혼합물내 DNA의 농도와 관련된 신호 (signal)에 대응하여 공급될 수 있고, 이는 상기 반응 혼합물 또는 그 일부의 압력에서 차이를 측정함으로써 선택적으로 모니터될 수 있고, 신호를 생성하는 것이 가능하다. DNA의 농도를 나타내는 신호가, 선택적으로 압력 센서 (pressure sensor) 상에서, 상기 반응 혼합물의 일부를 제거 및 복귀시키는 왕복 펌프 (reciprocating pump)에 의해서 형성된 압력 차이를 측정함에 의해서 생성될 수 있다.
상기 금속 양이온 또는 부가의 금속 양이온은 하기로 이루어진 목록으로부터 선택된 하나 이상의 금속을 포함할 수 있다: Mg2 +, Be2 +, Ca2 +, Sr2 +, Li+, Na+, K+, Mn2+ 또는 Zn2 +, 바람직하게 Mg2+. 상기 부가의 금속 양이온이 상기 부가의 뉴클레오티드와 공급될 수 있다. 상기 금속 양이온과 상기 뉴클레오티드 사이의 비율이 상기 반응 혼합물에서 약 3:1로 유지될 수 있다. 본원에서 토의된 금속 이온의 농도, 특히 상기 유리 금속 이온 농도는 원하는 특정 금속 양이온 (즉, Mg2 +)과 관련이 있고, 상기 반응 혼합물에서 금속 이온의 모든 종류의 농도와는 관련이 없다.
상기 반응 혼합물은 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 하나 이상의 부가의 뉴클레오티드가 그 후에 첨가될 수 있다. 상기 뉴클레오티드 또는 부가의 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트 (deoxyribonucleoside triphosphates: dNTPs), 또는 그 유도체 또는 변형된 버젼이다. 상기 뉴클레오티드 또는 부가의 뉴클레오티드는 데옥시아데노신 트리포스페이트 (deoxyadenosine triphosphate: dATP), 데옥시구아노신 트리포스페이트 (deoxyguanosine triphosphate: dGTP), 데옥시시티딘 트리포스페이트 (deoxycytidine triphosphate: dCTP), 데옥시티미딘 트리포스페이트 (deoxythymidine triphosphate: dTTP) 및 그 유도체 중 하나 이상이다. 상기 뉴클레오티드 또는 부가의 뉴클레오티드가 하나 이상의 유리 산, 그 염 또는 그 킬레이트로 제공된다. 상기 염 또는 킬레이트는 하기 금속 이온의 하나 이상을 포함할 수 있다: Mg2 +, Be2 +, Ca2 +, Sr2 +, Li+, Na+, K+, Mn2 + 또는 Zn2+. 상기 반응 혼합물 중 뉴클레오티드의 농도가 O.OO1 mM 내지 6 mM 사이, 선택적으로 약 3 mM로 유지될 수 있다.
상기 방법은 회분식 (batch) 공정 또는 연속 유동 (continuous flow) 공정일 수 있다. 부가의 선택적 특성은 종속항에서 개시된 바와 같다.
부가의 장점이 하기에 개시된다.
본 발명은 예시되는 구현예들 및 수반된 도면을 참조로 하기에 부가로 개시될 것이다:
도 1은 본 발명의 구현예에 따라 유용한 합성 장치의 사시도이다. 이해를 용이하게 하고, 주요 구성 요소를 보다 잘 보이게 하기 위해서, 특정 구성 요소 및 연결 도관이 본 도면에서 생략되었다;
도 2는 도 1의 장치의 개략도이다;
도 3은 본 발명의 구현예에 따라 유용한 반응 용기의 단면도이다;
도 4는 시간에 대하여 Phi29 DNA 폴리머라제를 사용하는 표준 DNA 증폭 반응으로부터 생성된 데이터 (다이아몬드)와 물-단독의 대조군 반응에 대한 압력 차이 데이터 (사각형)를 비교한 데이터를 나타내는 그래프이다 (표 1에 기재된 바와 같음). 상기 압력 차이 단위는 임의적 (arbitrary)이고, 상기 시간의 단위는 분 (min)이다;
도 5는 압력 차이 대 Qubit® BR dsDNA 형광 분석 (fluorometric assay)에 의해 측정된 DNA 농도의 그래프이다. 상기 압력 차이 단위는 임의적이고, 상기 DNA 농도의 단위는 μg/ml이다;
도 6은 2 mM, 4 mM 및 8 mM의 개시 dNTP 농도로 DNA 증폭 반응에서 공유결합으로 닫힌 선형 DNA 생성물 (2.6 kbases 및 2 kbases)의 전기영동 겔의 사진이다;
도 7은 개시 농도 2 mM dNTPs (첨가된 부가의 dNTPs가 없음) (흰색 원), 2 mM dNTPs와 부가의 2 mM dNTPs 공급 (삼각형), 개시로부터 4 mM dNTPs (첨가된 부가의 dNTPs가 없음) (다이아몬드) 및 2 mM dNTPs와 세번의 부가된 dNTPs 2 mM 농도 공급 (십자형)에 의한 반응에 있어서 압력 차이 측정 대 시간 (분)의 그래프이다. 화살표는 각 반응에 대해 dNTP 첨가 시간을 나타낸다;
도 8은 개시 농도 2 mM dNTPs와 세번의 부가된 2 mM dNTPs의 공급에 의한 반응에 있어서, 마그네슘 이온 대 dNTPs의 비율에 대한 상기 초기 반응 속도 (압력 차이 단위/분)의 그래프이다;
도 9는 상기 proTLx-N3X2 Cal 09 HA DNA 주형을 나타낸다;
도 10은 상기 proTLx B5X4 Cal 09 HA DNA 주형을 나타낸다;
도 11은 상기 proTLx-K N3X2 ova DNA 주형을 나타낸다;
도 12는 상기 proTLx-K N3X2 lux DNA 주형을 나타낸다; 또한
도 13은 2 mM dNTPs 및 7.5 mM Mg2 +를 초기에 포함하는 반응에 있어서 시간 (분)에 대한 압력 차이 측정값의 그래프를 나타내고, 상기는 2mM dNTPs와 충분한 Mg2+에 의해 지시된 시점 (300분, 600분, 900분, 1080분, 1230분 및 1440분 - 흰색 삼각형)에서 뉴클레오티드 및 Mg2 +의 조절된 첨가 ("공급")를 가져서, 상기 제1 공급 후에 3:1의 Mg2 +:dNTPS의 비율을 유지하고, 이에 프로텔로머라제의 조절된 첨가가 지시된 바와 같이 (사각형) 1050분 (2μM TelN)에서 실시된다. 화살표는 각 dNTP 첨가 직후에 Mg2 +의 첨가 및 TelN의 첨가를 나타낸다.
본 발명은 DNA를 합성하기 위한 무세포 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 DNA의 고수득율 합성을 가능하게 할 수 있다.
본 발명에 따라 합성된 상기 데옥시리보핵산 (DNA)은 임의의 DNA 분자일 수 있다. 상기 DNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 상기 DNA는 선형일 수 있다. 상기 DNA가 원형, 특히 미니서클 (minicircles), 단일 가닥 닫힌 원형, 이중 가닥 닫힌 원형, 이중 가닥 개방 원형, 또는 닫힌 선형 이중 가닥 DNA를 형성하도록 처리될 수 있다. 상기 DNA가 특정 2차 구조, 예컨대, 이에 한정되는 것은 아니지만, 헤어핀 루프 (hairpin loops) (줄기 루프 (stem loops)), 불완전한 헤어핀 루프 (imperfect hairpin loops), 유사매듭 (pseudoknots), 또는 이중 나선의 다양한 형태 중 어느 하나 (A-DNA, B-DNA, 또는 Z-DNA)를 형성하도록 하거나 또는 이를 형성하도록 처리될 수 있다. 상기 DNA는 또한 헤어핀 구조를 형성할 수 있다.
합성된 DNA는 임의의 적당한 길이를 가질 수 있다. 77 킬로베이스 (kilobases: kb 또는 kbase) 미만 또는 초과의 길이는 본 발명의 방법을 사용하여 가능할 수 있다. 특히, 본 발명의 방법에 따라 합성될 수 있는 DNA의 길이는 대략 60 킬로베이스 미만, 또는 50 킬로베이스 미만, 또는 40 킬로베이스 미만, 또는 30 킬로베이스 미만일 수 있다. 바람직하게, 상기 합성된 DNA는 100 베이스 내지 60 킬로베이스, 200 베이스 내지 20 킬로베이스, 더 바람직하게 200 베이스 내지 15 킬로베이스, 가장 바람직하게 2 킬로베이스 내지 15 킬로베이스일 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 합성된 DNA의 양은 반응 혼합물의 1O g/l 를 초과할 수 있다. 상기 합성된 DNA의 양은 10, 9, 8, 7, 6 또는 5 g/l 미만인 것이 바람직하다. 합성된 DNA의 바람직한 양은 0.2 내지 5 g/l, 바람직하게 1 내지 5 g/l 이다. 제조된 DNA의 양이 대규모 (large-scale) 또는 대량 (mass) 생산에 있어서 산업적 또는 상업적 양으로 기재될 수 있다. 상기 방법에 의해서 제조된 DNA는 품질에 있어서, 즉 DNA 길이 및 서열에 있어서 균일할 수 있다. 그러므로, 상기 방법은 DNA의 대규모 합성에 적당할 수 있다.
DNA를 합성하는 현재 이용가능한 기술에 있어서, 대부분은 소량 또는 실험실-기반 규모이고, 상기 반응들이 마이크로리터 부피로 발생된다. PCR을 스케일업하려는 노력도 여전히 DNA의 수득율이 떨어지며, 예컨대 반응 혼합물 (Vandalia)의 리터 당 약 20-40 mg이고, 이는 상기 반응이 뉴클레오티드의 개시 양으로만 발생되고, 부가의 뉴클레오티드가 공급되지 않아서, 상기 생성물 형성이 상기 반응을 억제하기 때문이다.
상기 DNA 주형은 임의의 적당한 주형일 수 있다. 상기 DNA 주형은 단일 가닥 (single stranded: ss) 또는 이중 가닥 (double stranded: ds)일 수 있다. 상기 DNA 주형은 선형 또는 원형일 수 있다. 이중 가닥 DNA 주형은 개방 원형 ds DNA, 닫힌 원형 ds DNA, 닫힌 선형 ds DNA 또는 개방 선형 ds DNA 일 수 있다. 단일 가닥 DNA 주형은 선형 ss DNA 또는 닫힌 원형 ss DNA 일 수 있다. 상기 후자의 DNA 주형은 닫힌 선형 ds DNA를 변성시킴으로써 제조될 수 있다. 닫힌 선형 DNA, 즉 선형 ds 공유결합으로 닫힌 DNA 분자는 통상적으로 공유결합으로 닫힌 말단, 즉, 헤어핀형 말단을 포함하고, 여기서 상보적 DNA 가닥들 사이의 염기쌍이 존재하지 않는다. 상기 헤어핀형 루프는 상보적 DNA 가닥의 말단에 연결된다. 특히 상기 루프가 상기 프로텔로머라제 표적 서열의 일부를 포함하는 경우에는, 상기 루프 그 자체는 상보적 서열을 포함할 수 있다. 상기 닫힌 선형 ds DNA는 플라스미드 (plasmid) 일 수 있다.
상기 DNA 주형은 임의의 서열로, 자연 유래 또는 인공 서열을 포함할 수 있다. 상기 DNA 주형은 적어도 하나의 처리 효소 표적 서열, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 처리 효소 표적 부위를 포함할 수 있다. 이러한 표적 서열은 합성 후에 상기 DNA가 선택적으로 추가로 처리되는 것을 가능하게 하기 위함이다. 처리 효소는 그 표적 부위를 인식하고, 상기 DNA를 처리하는 효소이다. 상기 처리 효소 표적 서열은 제한 효소에 대한 표적 서열일 수 있다. 제한 효소, 즉 제한 엔도뉴클레아제 (restriction endonuclease)는 표적 서열에 결합되고, 특정 지점에서 절단된다. 상기 처리 효소 표적 서열은 재조합효소에 대한 표적일 수 있다. 각 재조합효소에 특이적인 짧은 (30-40개의 뉴클레오티드) 표적 부위 서열들 사이에서 재조합효소는 DNA 교환 반응을 방향성 있게 촉매화한다. 재조합효소의 예로는 Cre 재조합효소 (표적 서열로서 loxP를 가짐) 및 FLP 재조합효소 (짧은 플립파제 인식 표적 (flippase recognition target: FRT) 부위를 가짐)를 포함한다. 상기 처리 효소 표적 서열은 부위-특이적 인테그라제 (site-specific integrase), 예컨대 phiC31 인테그라제에 대한 표적일 수 있다. 상기 처리 효소 표적 서열은 프로텔로머라제 효소에 대한 표적일 수 있다. 프로텔로머라제 표적 서열이 DNA 주형 중에 존재하면, 프로텔로머라제의 효소적 활성에 의해서 DNA 주형이 닫힌 선형 DNA로 전환될 수 있는 임의의 DNA 서열이다. 즉, 상기 프로텔로머라제 표적 서열은, 공유결합으로 닫힌 선형 DNA를 형성하기 위해서, 프로텔로머라제에 의한 이중 가닥 DNA의 절단 및 재결찰에 필요하다. 통상적으로, 프로텔로머라제 표적 서열은 임의의 회문구조 (palindromic) 서열, 즉 본원에서 역위 반복 (inverted repeat)으로 기재되는, 2-폴드 회전 대칭성 (two-fold rotational symmetry)을 갖는 임의의 이중-가닥 DNA 서열을 포함한다. 상기 역위 반복의 길이는 상기 특정 생물체에 따라서 다르다. 상기 회문구조 또는 역위 반복은 완전할 수 있거나 또는 불완전할 수 있다. 프로텔로머라제 표적 서열은 바람직하게 길이가 적어도 14개의 염기쌍을 갖는 이중 가닥 회문구조 (역위 반복) 서열을 포함한다. 적당한 프로텔로머라제 표적 부위가 당분야에 알려져 있고, EP2,391,731에서 토의되었고, 참조로 본원에 포함된다. 적당한 프로텔로머라제 효소는 에스케리치아 콜리 파아지 (Escherichia coli phage) N15로부터 유래된 TelN 일 수 있다. 상기 처리 효소 표적 부위는 프로텔로머라제 표적 부위인 것이 바람직하다.
상기 처리 효소 표적 서열은 RNA 폴리머라제에 대한 표적 서열일 수 있고, 상기 DNA는 폴리펩티드 합성에 대한 주형이 될 수 있다. 이 경우, 상기 처리 효소 표적 부위는 프로모터, 바람직하게 진핵세포 프로모터이다.
상기 방법은 처리 효소와 상기 반응 혼합물을 접촉시키는 부가의 단계를 포함할 수 있다. 상기 반응 혼합물이 언제든지 처리 효소와 접촉될 수 있다. 바람직하게, DNA 합성이 완료되었을 때 상기 반응 혼합물이 처리 효소와 접촉된다. 상기 처리 효소는 RNA 폴리머라제, 재조합효소, 제한 엔도뉴클레아제 또는 프로텔로머라제일 수 있다. 바람직하게, 상기 처리 효소는 프로텔로머라제이다.
본 발명에서 사용될 수 있는 바와 같이, 프로텔로머라제는 공유결합으로 닫힌 선형 DNA 분자를 생성하기 위해서 프로텔로머라제 표적 부위를 포함하는 주형을 절단 및 재연결할 수 있는 임의의 폴리펩티드이다. 그러므로, 상기 프로텔로머라제는 DNA 분해 및 결찰 기능을 갖는다. 프로텔로머라제-타입 활성을 갖는 효소가 또한 텔로미어 레솔바제 (telomere resolvases) (예를 들어, 보렐리아 부르그도르페 리 (Borrelia burgdorferi)에서)로 기재되었다. 프로텔로머라제에 대한 통상적인 기질은 원형 이중 가닥 DNA 이다. 상기 DNA가 프로텔로머라제 표적 부위를 포함한다면, 상기 효소는 상기 부위에서 상기 DNA를 절단할 수 있고, 그 말단들을 결찰하여서 선형 이중 가닥 공유결합으로 닫힌 DNA 분자를 형성할 수 있다. 프로텔로머라제 표적 부위에 대한 요건이 상기에 토의되었다. 상기에서 또한 약술한 바와 같이, 프로텔로머라제 표적 부위를 포함하는 주형으로부터 닫힌 선형 DNA의 제조를 촉매화하기 위한 주어진 폴리펩티드의 능력이 당분야에 개시된 임의의 적당한 분석을 사용하여 결정될 수 있다.
DNA의 처리는 적어도 하나의 프로텔로머라제의 사용을 필요로 할 수 있다. 본 발명의 방법은 하나 초과의 프로텔로머라제, 예컨대 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 상이한 프로텔로머라제의 사용을 포함할 수 있다. 적당한 프로텔로머라제의 예로는 할로모나스 쿠아마리나 (Halomonas quamarina)로부터 phiHAP-1, 여시니아 엔테 로리티카 (Yersinia enterolytica)로부터 PY54, 클레브시엘라 옥시토카 (Klebsiella oxytoca)로부터 phiK02 및 비브리오종 (Vibrio sp.)으로부터 VP882, 및 에스케리치아 콜리 (Escherichia coli)로부터 N15 (서열 번호: 15), 또는 그 임의의 변이체와 같은 박테리오파아지 (bacteriophages)로부터 유래된 것을 포함한다. 박테리오파아지 N15 프로텔로머라제 또는 그 변이체의 사용이 특히 바람직하다. 상기 효소는 또한 TelN 이라 한다. 상기 효소가 또한 WO2012/017210에 기재되었고, 본원에 참조로 포함된다.
상기 방법은 그러므로 처리 효소를 포함하는 DNA 주형에서 실시될 수 있고, 또한 상기 처리 효소가 상기 반응 혼합물에 조절된 방식으로 공급될 수 있다. 상기 처리 효소가 상기 반응 혼합물로 임의의 적당한 시간에 공급될 수 있고; 이는 신호에 대응할 수 있다. 처리 효소의 1회 이상의 첨가가 이루어질 수 있다. 상기 처리 효소가 분취량으로 공급되는 것이 바람직하고, 이는 상기 반응 혼합물로 별개로 첨가된다. 처리 효소의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 분취량이 상기 반응 혼합물로 첨가될 수 있다. 부가의 뉴클레오티드 및/또는 부가의 금속 이온의 분취량이 요구되기 직전에 상기 처리 효소를 첨가하는 것이 유익할 수 있다. 대안으로서, 부가의 뉴클레오티드의 분취량이 상기 반응 혼합물로 첨가됨과 동시에 또는 그 후에 상기 처리 효소가 첨가될 수 있다. 상기 반응 혼합물 중 DNA가 원하는 농도에 도달할 때의 신호에 대응하여 상기 처리 효소가 첨가될 수 있다. DNA의 농도가 본원에 개시되는 바와 같이 검출될 수 있다.
상기 DNA 주형은, 원하는 단백질을 봉입하는 서열에 작동가능하게 연결된 진핵세포 프로모터 및 선택적으로 진핵세포 전사 종결 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 이로 필수적으로 이루어진 발현 카세트를 포함할 수 있다. 선택적으로, 상기 발현 카세트는 최소의 카세트일 수 있고, 이는 통상적으로 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 박테리아 또는 벡터 서열들이 결여된다: (i) 박테리아 복제 기원 (bacterial origins of replication); (ii) 박테리아 선택 마커 (예컨대, 항생제 내성 유전자), 및 (iii) 비메틸화 (unmethylated) CpG 모티프 (motifs). "프로모터 (promoter)"는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 조절하는 뉴클레오티드 서열이다. 프로모터는 유도성 프로모터 (inducible promoters) (여기서, 상기 프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현이 분석물 (analyte), 보조인자 (co factor), 조절 단백질 등에 의해서 유도됨), 억제성 프로모터 (repressible promoters) (여기서, 상기 프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현은 분석물, 보조인자, 조절 단백질 등에 의해서 억제됨), 및 항시성 프로모터 (constitutive promoters)를 포함할 수 있다. 상기 용어 "프로모터 (promoter)" 또는 "조절 인자 (control element)"는 전장 (full-length) 프로모터 영역 및 상기 영역 중 기능적 (예컨대, 전사 또는 번역의 조절) 세그먼트를 포함한다. "작동가능하게 연결된 (operably linked)"은, 기재된 성분들이 그들의 통상의 기능을 실시하도록 구성되는 요소들의 배열을 나타낸다. 그러므로, 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 주어진 프로모터는, 상기 적당한 효소가 존재하는 경우에 상기 서열의 발현에 영향을 줄 수 있다. 상기 프로모터는 그 발현을 지시하는 기능을 하는 한, 상기 프로모터가 상기 서열에 인접할 필요는 없다. 그러므로, 예를 들어, 개재된 번역되지 않은 전사된 서열이 상기 프로모터 서열과 상기 핵산 서열 사이에 존재할 수 있고, 상기 프로모터 서열은 상기 코딩 서열에 "작동가능하게 연결된"것으로 여전히 고려될 수 있다. 그러므로, 상기 용어 "작동가능하게 연결된"은, 전사 복합체에 의해 상기 프로모터 요소를 인식할 때 원하는 DNA 서열의 전사를 개시하는 원하는 DNA 서열 및 프로모터 요소의 임의의 간격 또는 배향성을 포함하는 것으로 의도된다.
상기 DNA 주형은 임의의 적당한 길이를 가질 수 있다. 특히 상기 DNA 주형은 60 킬로베이스 미만, 또는 50 킬로베이스 미만, 또는 40 킬로베이스 미만, 또는 30 킬로베이스 미만일 수 있다. 바람직하게, 상기 DNA 주형은 100 베이스 내지 60 킬로베이스, 200 베이스 내지 20 킬로베이스, 더 바람직하게 200 베이스 내지 15 킬로베이스, 가장 바람직하게 2 킬로베이스 내지 15 킬로베이스 일 수 있다.
상기 DNA 주형이, 당분야에 알려져 있는 임의의 방법에 의한 공정에서 사용하기에 충분한 양으로 제공될 수 있다. 예를 들면, 상기 주형은 PCR에 의해서 제조될 수 있다.
상기 DNA 주형의 전체 또는 선택된 부분이 상기 공정에서 증폭될 수 있다.
상기 DNA 주형은 발현을 위한 DNA 서열을 포함할 수 있다. 상기 DNA는 세포 (즉, 인 비트로 또는 인 비보에서 형질감염된 세포)에서 발현될 수 있거나, 또는 무세포 시스템 (즉, 단백질 합성)에서 발현될 수 있다. 발현을 위한 DNA 서열은 치료 목적, 즉, DNA 백신의 유전자 요법을 위한 것일 수 있다. 발현을 위한 서열은 유전자일 수 있고, 상기 유전자는 DNA 백신, 치료적 단백질 등을 인코딩할 수 있다. 상기 DNA 서열은 활성 RNA 형태 즉, 작은 간섭 RNA 분자 (small interfering RNA molecule: siRNA)로 전사되는 서열을 포함할 수 있다.
상기 DNA 주형이 적어도 하나의 폴리머라제와 접촉된다. 1, 2, 3, 4 또는 5개의 상이한 폴리머라제가 사용될 수 있다. 상기 폴리머라제는 임의의 적당한 폴리머라제일 수 있고, 이는 DNA의 폴리머를 합성한다. 상기 폴리머라제는 DNA 폴리머라제일 수 있다. 임의의 상업적으로 이용가능한 DNA 폴리머라제를 포함하는, 임의의 DNA 폴리머라제가 사용될 수 있다. 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 상이한 DNA 폴리머라제가 사용될 수 있고, 예를 들면, 하나는 프루프리딩 (proofreading) 기능을 제공하고, 하나 이상의 다른 것은 이를 제공하지 않는다. 예를 들어, 가닥 치환 타입 폴리머라제 및 다른 방법에 의해서 DNA를 복제하는 DNA 폴리머라제와 같은 상이한 기작을 갖는 DNA 폴리머라제가 사용될 수 있다. 가닥 치환 활성을 갖지 않는 DNA 폴리머라제의 적당한 예는 T4 DNA 폴리머라제이다.
폴리머라제는 매우 안정할 수 있어서, 그 활성이 공정 조건 하에 연장된 인큐베이션에 의해서 실질적으로 감소되지 않는다. 그러므로, 이에 한정되는 것은 아니지만, 온도 및 pH를 포함하는 공정 조건의 범위 하에 상기 효소는 바람직하게 긴 반감기 (half-life)를 갖는다. 상기 폴리머라제는 또한 제조 공정에 적당한 하나 이상의 특성을 갖는 것이 바람직하다. 예를 들어 프루프리딩 활성을 통해서 상기 폴리머라제는 바람직하게 높은 충실도 (fidelity)를 갖는다. 또한, 폴리머라제는 높은 진행성, 높은 가닥-치환 활성, 및 dNTPs 및 DNA에 대한 낮은 Km을 나타내는 것이 바람직하다. 폴리머라제는 주형으로서 원형 및/또는 선형 DNA를 사용할 수 있다. 상기 폴리머라제는 주형으로서 dsDNA 또는 ssDNA를 사용할 수 있다. 폴리머라제는 그 프루프리딩 활성과 관련이 없는 DNA 엑소뉴클레아제 활성을 나타내지 않는 것이 바람직하다.
당분야의 통상의 지식을 가진 자라면, 상업적으로 이용가능한 폴리머라제들, 예컨대, Phi29 (New England Biolabs, Inc., Ipswich, MA, US), Deep Vent® (New England Biolabs, Inc.), 바실루스 스테아로더모필루스 (Bacillus stearothermophilus: Bst) DNA 폴리머라제 I (New England Biolabs, Inc.), DNA 폴리머라제 I의 클레나우 단편 (Klenow fragment) (New England Biolabs, Inc.), M-MuLV 리버스 트란스크립타제 (reverse transcriptase) (New England Biolabs, Inc.), VentR®(exo-minus) DNA 폴리머라제 (New England Biolabs, Inc.), VentR® DNA 폴리머라제 (New England Biolabs, Inc.), Deep Vent® (exo-) DNA 폴리머라제 (New England Biolabs, Inc.) 및 Bst DNA 폴리머라제 큰 단편 (New England Biolabs, Inc.)에 의해서 나타내는 성질들과 비교함으로써, 주어진 폴리머라제가 전술한 특성들을 나타내는지 여부를 결정할 수 있다. 높은 진행성을 나타내는 경우에, 상기는 통상적으로 상기 주형과 결합/해리 당 폴리머라제 효소에 의해 첨가된 뉴클레오티드의 평균수, 즉 단일 결합 사건으로부터 수득된 프라이머 연장의 길이를 나타낸다.
가닥 치환-타입 폴리머라제가 바람직하다. 바람직한 가닥 치환-타입 폴리머라제는 Phi 29, Deep Vent 및 Bst DNA 폴리머라제 I 또는 그 임의의 변이체이다. "가닥 치환 (strand displacement)"은 합성 중에 이중 가닥 DNA의 영역을 만났을 때 상보적 가닥을 치환하기 위한 폴리머라제의 능력을 서술한다. 그러므로 상기 주형이 상보적 가닥을 치환하고, 또한 신규한 상보적 가닥을 합성함으로써 증폭된다. 그러므로, 가닥 치환 복제 중에, 상기 폴리머라제가 부가의 상보적인 가닥을 복제하기 위한 길을 만들기 위해서, 신규하게 복제된 가닥이 치환될 것이다. 프라이머 또는 단일 가닥 주형의 3' 자유 말단이 주형에서 상보적 서열에 어닐 (anneal)하는 때에 (둘 다 프라이밍 사건 (priming events)임) 상기 증폭 반응이 개시된다. DNA 합성이 진행될 때, 또한 폴리머라제가 부가의 프라이머 또는 상기 주형에 어닐된 다른 가닥을 만나는 경우, 상기 폴리머라제는 이를 치환하고, 그 가닥의 신장을 계속한다. 상기 가닥 치환으로 신규하게 합성된 단일 가닥 DNA를 생성하고, 이는 더 프라이밍하는 경우에 대해서 주형으로 작용할 수 있다. 상기 신규하게 합성된 DNA의 프라이밍으로 생성물의 고-분지쇄화 (hyper-branching) 및 고수득율을 유도한다. 가닥 치환 증폭 방법은, 변성의 사이클이 효율적인 DNA 증폭을 위해 필수적이지 않다는 점에서, PCR-기반 방법과는 상이한 바, 이중-가닥 DNA는 신규한 DNA 가닥의 계속되는 합성에 장애가 되지 않는다. 초기 주형이 이중 가닥인 경우 가닥 치환 증폭은 상기 초기 주형을 변성시켜서, 프라이머가 사용되는 경우 상기 프라이머를 상기 프라이머 결합 부위에 어닐시키기 위해서 한번의 초기 가열 라운드만을 필요로 할 수 있다. 그 후에, 상기 증폭은 등온으로 서술될 수 있는데, 이는 부가의 가열 또는 냉각이 요구되지 않기 때문이다. 대조적으로, PCR 방법은, 이중-가닥 DNA를 용융하고, 신규한 단일 가닥 주형을 제공하기 위해 증폭 공정 중에 변성의 사이클이 필요하다 (즉, 온도를 94 ℃ 이상으로 증가시킴). 가닥 치환 중에, 상기 폴리머라제는 이미 합성된 DNA의 가닥을 치환할 것이다. 또한, 상기는 주형으로서 신규하게 합성된 DNA를 사용하여, DNA를 빠르게 증폭시킬 것이다.
본 발명의 방법에 사용된 가닥 치환 폴리머라제는 바람직하게 적어도 20 kb, 더 바람직하게 적어도 30 kb, 적어도 50 kb, 또는 적어도 70 kb, 또는 그 이상의 진행성을 갖는다. 하나의 구현예에서, 상기 가닥 치환 DNA 폴리머라제는 phi29 DNA 폴리머라제에 상응하거나 또는 이를 초과하는 진행성을 갖는다.
그러므로, 가닥 치환 복제가 바람직하다. 가닥 치환 복제 중에, 상기 주형이 상기 폴리머라제의 작용에 의해서 합성되어진 이미 복제된 가닥을 치환하고, 이어서 이중 가닥 주형의 원래 상보적 가닥일 수 있거나 또는 신규하게 합성된 상보적 가닥일 수 있는 다른 가닥을 치환함으로써 증폭되고, 이때 후자는 상기 주형에 어닐된 초기 프라이머에 대한 폴리머라제의 작용에 의해서 합성된다. 그러므로, 상기 주형의 증폭은 다른 가닥의 가닥 치환 복제를 통해서 복제된 가닥의 치환에 의해서 발생될 수 있다. 상기 공정이 가닥 치환 증폭 또는 가닥 치환 복제로 서술될 수 있다.
바람직한 가닥 치환 복제 공정은 루프-매개 등온 증폭 (Loop-mediated isothermal amplification) 또는 LAMP 이다. LAMP는 상기 주형 DNA의 6-8개의 구별되는 영역을 인식하는 4-6개의 프라이머를 일반적으로 사용한다. 간단하게, 가닥-치환 DNA 폴리머라제는 합성을 개시하고, 상기 프라이머들 중 2개는 루프 구조를 형성하여 그 후의 증폭 라운드를 촉진한다. 상기 표적 DNA의 센스 (sense) 및 안티센스 (antisense) 가닥의 서열을 포함하는 내부 프라이머는 LAMP를 개시한다. 외부 프라이머에 의해서 프라임된 후속 가닥 치환 DNA 합성은 단일-가닥 DNA를 방출한다. 이는 상기 표적의 다른 말단에 혼성화 (hybridise)되는 제2 내부 및 외부 프라이머에 의해서 프라임된 DNA 합성을 위한 주형으로 제공되고, 이는 줄기-루프 (stem-loop) DNA 구조를 생성한다. 그 후 LAMP 순환에서, 하나의 내부 프라이머는 상기 생성물 상의 상기 루프에 혼성화되고, 치환 DNA 합성을 개시하여, 원래의 줄기-루프 DNA와 줄기의 길이가 2배인 신규한 줄기-루프 DNA를 수득한다.
바람직한 가닥 치환 복제 공정은 롤링 서클 증폭 (RCA)이다. 상기 용어 RCA는, 혼성화된 프라이머를 연장하면서, 원형 DNA 주형 가닥 주위로 연속적으로 진행하는 RCA-타입 폴리머라제의 능력을 서술한다. 상기는 증폭된 DNA의 다수의 반복을 갖는 선형 단일 가닥 생성물의 형성을 유도한다. 상기 원형 주형 (단일 유닛)의 서열이 선형 생성물내에서 다수 반복된다. 원형 주형에 있어서, 상기 가닥 치환 증폭의 초기 생성물은 단일 가닥 콘카타머이고, 이는 상기 주형의 극성에 따라 센스 또는 안티센스이다. 상기 선형 단일 가닥 생성물은 다중 혼성화, 프라이머 연장 및 가닥 치환 경우에 대해 기본으로 제공하여서, 증폭된 DNA의 다수의 반복을 포함하는 콘카타머 이중 가닥 DNA 생성물을 형성한다. 그러므로, 상기 콘카타머 이중 가닥 DNA 생성물에서 각 증폭된 "단일 유닛" DNA의 다수의 카피가 있다. RCA 폴리머라제는 본 발명의 방법에 사용하기에 특히 바람직하다. RCA-타입 가닥 치환 복제 공정의 생성물은 단일 유닛의 DNAs를 방출하기 위한 처리를 필요로 할 수 있다. 상기는 DNA의 단일 유닛이 필요한 경우에 바람직하다.
증폭을 위해서, 상기 DNA 주형이 또한 하나 이상의 프라이머와 접촉된다. 상기 프라이머는 비-특이적 (즉, 서열이 무작위적임)이거나, 또는 상기 DNA 주형내에 포함된 하나 이상의 서열들에 대해서 특이적일 수 있다. 상기 프라이머가 무작위의 서열을 갖는 경우, 상기 DNA 주형에서 임의의 부위에서 비특이적으로 개시될 수 있다. 상기는 각 주형 가닥으로부터 다수의 개시 반응을 통해서 고효율로 증폭시킬 수 있다. 무작위의 프라이머의 예로는 헥사머 (hexamers), 헵타머 (heptamers), 옥타머 (octamers), 노나머 (nonamers), 데카머 (decamers) 또는 길이가 더 긴 서열, 예를 들어, 길이가 12, 15, 18, 20 또는 30개의 뉴클레오티드이다. 무작위의 프라이머는 길이가 6 내지 30, 8 내지 30 또는 12 내지 30개의 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 무작위의 프라이머는, 예컨대 상기 DNA 주형 중 헥사머, 헵타머, 옥타머 또는 노나머의 모든 가능한 조합을 대표하는 올리고뉴클레오티드의 혼합으로써 통상적으로 제공된다.
하나의 구현예에서, 상기 프라이머들 또는 하나 이상의 상기 프라이머들은 특이적이다. 상기는 증폭의 개시를 원하는 곳으로부터 상기 DNA 주형에서 서열에 상보적인 서열을 갖는 것을 의미한다. 상기 구현예에서, 상기 2개의 프라이머 결합 부위의 내부에 상기 DNA 주형의 일부를 특히 증폭하는데 한쌍의 프라이머가 사용될 수 있다. 대안으로서, 단일 특이적 프라이머가 사용될 수 있다.
하나의 구현예에서, 상기 DNA 주형은 하나 이상의 프로텔로머라제 표적 서열을 포함한다. 상기 표적 서열은 자연에서 회문성이다. 상기 구현예에서, 프로텔로머라제 결합 부위내에서 상기 회문성 서열에 결합하는 특정 프라이머를 사용할 수 있고, 그러므로 상기 DNA 주형의 양쪽 가닥에서 증폭을 프라임할 수 있다. 이러한 공정이 WO2012/017210에 상세하게 개시된다. 그러므로, 단일 프라이머가 증폭에 충분하다.
프라이머가 표지되지 않을 수 있거나 또는 하나 이상의 표지 (labels), 예를 들어 방사성핵종 (radionuclides) 또는 형광 염료 (fluorescent dyes)를 포함할 수 있다. 프라이머는 또한 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 프라이머가 캡핑되어서, 상기 캡 (cap)이, 즉 화학적 또는 물리적 수단에 의해서 제거될 때까지 DNA 합성의 개시가 방지될 수 있다. 프라이머 길이/서열이 통상적으로 온도 고려에 기반하여 선택될 수 있고, 즉 증폭 단계에서 사용된 온도에서 상기 주형에 결합될 수 있는 것이 선택될 수 있다.
상기 폴리머라제 및 하나 이상의 프라이머와 상기 DNA 주형의 접촉은, 상기 DNA 주형에 프라이머의 어닐링을 촉진하는 조건하에 실시될 수 있다. 상기 조건은 상기 프라이머의 혼성화를 위해 단일-가닥 DNA의 존재를 포함한다. 상기 조건은 상기 주형에 상기 프라이머의 어닐링을 위해 온도 및 완충액을 포함한다. 적당한 어닐링/혼성화 조건이 상기 프라이머의 특성에 따라 선택될 수 있다. 본 발명에 사용된 바람직한 어닐링 조건의 예로는 완충액 30mM Tris-HCl pH 7.5, 20mM KCl, 8mM MgCl2 를 포함한다. 상기 어닐링이, 열을 사용한 변성 이후에, 상기 원하는 반응 온도로 서서히 냉각시킴으로써 실시될 수 있다.
그러나, 가닥 치환 복제를 사용한 증폭은 또한 프라이머 없이 실시할 수 있고, 그러므로 혼성화 및 프라이머 연장의 실시가 필요하지 않다. 대신에, 상기 단일 가닥 DNA 주형이 헤어핀을 형성함으로써 자기-프라이밍되어서, 연장을 위해서 이용가능한 자유 3' 말단을 갖는다. 상기 증폭의 나머지 단계는 동일하게 유지한다.
상기 DNA 주형 및 폴리머라제가 또한 뉴클레오티드와 접촉된다. DNA 주형, 폴리머라제 및 뉴클레오티드의 조합은 반응 혼합물을 형성한다. 상기 반응 혼합물은 또한 하나 이상의 프라이머를 포함할 수 있다. 상기 반응 혼합물은 독립적으로 하나 이상의 금속 양이온을 또한 포함할 수 있다.
뉴클레오티드는 핵산의 모노머, 또는 단일 유닛이고, 뉴클레오티드는 질소성 염기, 5탄당 (리보스 또는 데옥시리보스) 및 적어도 하나의 포스페이트기로 이루어진다. 임의의 적당한 뉴클레오티드가 사용될 수 있다.
상기 뉴클레오티드가 유리산, 그 염 또는 킬레이트, 또는 유리 산 및/또는 염 또는 킬레이트의 혼합물로 존재할 수 있다.
상기 뉴클레오티드가 1가 금속 이온 뉴클레오티드 염 또는 2가 금속 이온 뉴클레오티드 염으로 존재할 수 있다. 상기 염은 2가 금속 이온의 염, 예컨대, 이에 한정되는 것은 아니지만, 마그네슘 (Mg2 +), 망간 (Mn2 +), 칼슘 (Ca2 +), 베릴륨 (Be2 +), 아연 (Zn2 +) 및 스트론튬 (Sr2 +), 또는 1가 금속 이온의 염, 이에 한정되는 것은 아니지만, 리튬 (Li+), 나트륨 (Na+) 또는 칼륨 (K+)을 포함할 수 있다.
상기 질소성 염기는 아데닌 (A), 구아닌 (G), 티민 (T), 시토신 (C), 및 우라실 (U)일 수 있다. 상기 질소성 염기는 또한 변형된 염기, 예컨대 5-메틸시토신 (5-methylcytosine: m5C), 슈도우리딘 (pseudouridine: Ψ), 디히드로우리딘 (dihydrouridine: D), 이노신 (inosine: I), 및 7-메틸구아노신 (7-methylguanosine: m7G)일 수 있다.
상기 5탄당은 데옥시리보스인 것이 바람직하고, 상기 뉴클레오티드는 데옥시뉴클레오티드이다.
상기 뉴클레오티드는, dNTP로 나타내는, 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트의 형태일 수 있다. 상기는 본 발명의 바람직한 구현예이다. 적당한 dNTPs는 dATP (데옥시아데노신 트리포스페이트), dGTP (데옥시구아노신 트리포스페이트), dTTP (데옥시티미딘 트리포스페이트), dUTP (데옥시우리딘 트리포스페이트), dCTP (데옥시시티딘 트리포스페이트), dITP (데옥시이노신 트리포스페이트), dXTP (데옥시크산토신 트리포스페이트), 및 그 유도체 및 변형된 버젼을 포함할 수 있다. 상기 dNTPs는 dATP, dGTP, dTTP 또는 dCTP, 또는 그 변형된 버젼 또는 유도체의 하나 이상을 포함하는 것이 바람직하다. dATP, dGTP, dTTP 및 dCTP 또는 그 변형된 버젼의 혼합물을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 뉴클레오티드는 용액으로 존재할 수 있거나, 또는 동결건조된 형태로 제공될 수 있다. 뉴클레오티드의 용액이 바람직하다.
상기 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 상기 변형된 뉴클레오티드는 생물학적 비활성 형태일 수 있다. 그러므로, 상기 변형된 뉴클레오티드는 생물학적 비활성 뉴클레오티드일 수 있다. 생물학적 비활성 뉴클레오티드는 상기 뉴클레오티드의 기, 예컨대 3' 탄소 산소 또는 상기 말단 포스페이트 산소를 보호하는 제거가능한 모이어티를 가질 수 있다. 생물학적 비활성인 뉴클레오티드는 케이지된 뉴클레오티드 또는 블록된 (blocked) 뉴클레오티드일 수 있다. 적당한 모이어티는, 이에 한정되는 것은 아니지만, α-카르복시-2-니트로벤질 (CNB), 1-(2-니트로페닐)에틸 (NPE), 4,5-디메톡시-2-니트로벤질 (DMNB), 1-(4,5-디메톡시-2-니트로페닐)에틸 (DMNPE) 및 5-카르복시메톡시-2-니트로벤질 (CMNB) (Molecular Probes)을 포함하는, 광활성가능성 (photoactivatable) (케이징 (caging)) 기를 포함한다. 상기 기들은 일반적으로 말단 포스페이트 산소를 통해서 부착된다. 상기 모이어티가 임의의 적당한 수단에 의해서 제거될 수 있다. 예를 들면, 상기 모이어티가 광분해성인 경우에, 자외선 광에 의한 상기 모이어티의 섬광분해 (flash photolysis)가 조사 부위에서 생물학적 활성 뉴클레오티드의 빠르고 고도한 국소화된 방출이 이루어진다. 상기 모이어티는 열 분해성 (heat labile)일 수 있으므로, 상기 생물학적 활성 뉴클레오티드가 열에 의해서 방출될 수 있다. 열이 상기 뉴클레오티드를 생물학적으로 활성화하기 위해서 사용된다면, 상기 폴리머라제의 온도 요건이 고려되어야 하고, 이는 당분야의 통상의 지식을 가진 자의 권한 내에 있다. 예를 들면, 상기 말단 포스페이트가 케이징 또는 블록킹 모이어티에 의해서 에스테르화될 수 있다.
상기 뉴클레오티드가 하나 이상의 적당한 염기, 바람직하게 하나 이상의 아데닌 (A), 구아닌 (G), 티민 (T), 시토신 (C)의 혼합물에 제공될 수 있다. 2, 3 또는 바람직하게 모두 4개의 뉴클레오티드 (A, G, T, 및 C)가 DNA를 합성하기 위한 방법에 사용된다.
상기 뉴클레오티드는 모두 천연 뉴클레오티드 (즉, 비변형된) 일 수 있고, 상기는 생물학적 활성이 있고 천연 뉴클레오티드와 같이 작용하는 변형된 뉴클레오티드일 수 있고 (즉, LNA 뉴클레오티드 - 잠금 핵산 (locked nucleic acid)), 상기는 변형되고, 생물학적으로 비활성일 수 있거나, 또는 상기는 비변형 및 변형된 뉴클레오티드의 혼합물, 및/또는 생물학적 활성 및 생물학적 비활성 뉴클레오티드의 혼합물일 수 있다. 각 뉴클레오티드의 타입 (즉, 염기)이 하나 이상의 형태, 즉 비변형 및 변형, 또는 생물학적 활성 및 생물학적 비활성의 형태로 제공될 수 있다.
본 발명의 하나의 양태에서, 상기 뉴클레오티드가 상기 반응 혼합물에 포함되고, 상기 반응 혼합물로 부가의 뉴클레오티드의 공급이 조절된다. 상기 양태에 따르면, 상기 뉴클레오티드가 8mM 미만, 7mM 미만, 6mM 미만, 5mM 미만, 4mM 미만, 3mM 미만, 2mM 미만 또는 1mM 미만의 개시 농도로 상기 반응 혼합물내에 존재할 수 있다. 그러므로, 상기 반응 혼합물 중 뉴클레오티드의 개시 농도가 8mM 이하, 바람직하게 5mM 이하, 더 바람직하게 4mM 이하가 되도록 상기 반응 혼합물을 형성하기 위해서 상기 뉴클레오티드가 첨가된다. 상기 개시 농도는 상기 반응의 개시에서 상기 반응 혼합물 중 뉴클레오티드의 전체 농도 (모든 염기)를 나타낸다.
상기 뉴클레오티드가 적어도 0.3 g/l의 DNA를 합성하기에 충분한 개시 농도로 상기 반응 혼합물 중에 존재할 수 있다. 상기 개시 농도는 0.5 g/l의 DNA, 더 바람직하게 0.6 g/l 또는 0.65 g/l의 DNA를 합성하기에 충분한 것이 바람직하다. 주어진 부피는 상기 반응 혼합물의 부피이다. 상기 뉴클레오티드의 개시 농도는 상기 반응 혼합물로부터 원하는 양의 DNA를 합성하기에 충분하지 않을 것이고, 즉, 상기는 최종 수득율을 달성하기에 충분하지 않을 수 있다. 상기 뉴클레오티드의 개시 농도가 상기 반응 혼합물에서 하나 이상의 폴리머라제의 기준으로 결정될 수 있다.
대안 또는 부가로, 상기 뉴클레오티드의 개시 농도가 상기 폴리머라제의 농도와 상기 뉴클레오티드의 농도 사이의 비율로 정의될 수 있다. 상기 개시에서 뉴클레오티드 분자의 수와 각 폴리머라제 효소 사이의 비율은 500,000:1 미만, 300,000:1 미만 또는 200,000:1 미만 또는 5,000:1 내지 100,000:1, 바람직하게 20,000:1 내지 90,000:1, 더 바람직하게 30,000:1 내지 80,000:1, 더 바람직하게 40,000:1 내지 60,000:1 일 수 있다. 뉴클레오티드 분자의 수와 각 폴리머라제 사이의 비율은 5,000:1 초과인 것이 바람직하다. 바람직한 양태에서, 상기 개시에서 뉴클레오티드:폴리머라제의 비율은 50,000:1이다.
상기 반응 혼합물이 상기 주형의 증폭을 촉진하는 조건 하에 인큐베이션된다. 가닥 치환 증폭이 바람직하다. 바람직하게, 상기 조건은 다른 가닥의 가닥 치환 복제를 통한 복제된 가닥의 치환에 의해서 상기 주형의 증폭을 촉진한다. 상기 조건은 DNA를 증폭시키는 임의의 온도, 통상적으로 20 ℃ 내지 90 ℃의 범위로 사용하는 것을 포함한다. 바람직한 온도 범위는 약 20 ℃ 내지 약 40 ℃ 또는 약 25 ℃ 내지 약 35 ℃ 일 수 있다. LAMP 증폭에 대한 바람직한 온도는 약 50 ℃ 내지 약 70 ℃ 이다.
통상적으로, 적당한 온도가 특정 폴리머라제가 최적 활성을 갖는 온도에 기반하여 선택된다. 상기 정보는 통상적으로 이용가능하고, 당업자의 일반적 지식의 일부를 형성한다. 예를 들면, phi29 DNA 폴리머라제가 사용되는 경우, 적당한 온도 범위는 약 25 ℃ 내지 약 35 ℃, 바람직하게 약 30 ℃일 수 있다. 당분야의 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 방법에 따른 효과적인 증폭을 위한 적당한 온도를 관례적으로 동정할 수 있다. 예를 들면, 상기 방법은 온도 범위에서 실시될 수 있고, 증폭된 DNA의 수득율이 주어진 폴리머라제에 대한 최적 온도 범위를 동정하기 위해서 모니터될 수 있다. 상기 증폭이 일정 온도에서 실시될 수 있고, 상기 공정이 등온인 것이 바람직하다. 가닥 치환 증폭이 바람직하기 때문에, DNA 가닥을 분리하기 위해서 온도를 변경하는 요건이 없다. 그러므로, 상기 공정은 등온 공정일 수 있다.
DNA 주형의 증폭을 촉진하는 다른 조건은 적당한 완충제/pH 및 효소 성능 또는 안정성에 대해서 요구되는 다른 인자들의 존재를 포함한다. 적당한 조건은 당분야에 알려져 있는 폴리머라제 효소의 활성을 제공하기 위해서 사용된 임의의 조건을 포함한다.
예를 들면, 상기 반응 혼합물의 pH는 3 내지 10, 바람직하게 5 내지 8의 범위내 또는 약 7, 예컨대 약 7.5 일 수 있다. pH가 하나 이상의 완충제의 사용에 의해서 상기 범위 중에 유지될 수 있다. 상기 완충제는, 이에 한정되는 것은 아니지만, MES, 비스-트리스 (Bis-Tris), ADA, ACES, PIPES, MOBS, MOPS, MOPSO, 비스-트리스 프로판, BES, TES, HEPES, DIPSO, TAPSO, 트리즈마 (Trizma), HEPPSO, POPSO, TEA, EPPS, 트리신 (Tricine), Gly-Gly, 비신 (Bicine), HEPBS, TAPS, AMPD, TABS, AMPSO, CHES, CAPSO, AMP, CAPS, CABS, 포스페이트, 시트르산-소듐 수소 포스페이트, 시트르산-소듐 시트레이트, 소듐 아세테이트-아세트산, 이미다졸 및 소듐 카르보네이트-소듐 비카르보네이트를 포함한다.
이중 가닥 DNA를 변성시키기 위해서 열의 적용 (수 분 동안 95 ℃에 노출됨)이 사용되면서, DNA 합성에 더 적당한 다른 접근법이 사용될 수 있다. 이중 가닥 DNA가 높거나 또는 낮은 pH 환경에 노출시킴으로써 용이하게 변성될 수 있거나 또는 탈이온수와 같이 양이온이 부재하거나 또는 매우 낮은 농도로 존재한다. 상기 폴리머라제는 그 복제를 개시하기 위해서 상기 DNA 주형의 단일 가닥 영역에 짧은 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열을 결합시키는 것이 필요하다. 상기 상호 작용의 안정성 및 DNA 증폭의 효율성이, 상기 공정의 필수적인 부분으로 간주될 수 있는 금속 양이온 및 특히 2가 양이온, 예컨대 Mg2 + 이온의 농도에 의해서 특히 영향을 받을 수 있다.
상기 반응 혼합물은 또한 금속 이온을 포함할 수 있다. 상기 반응 혼합물은 또한 금속염, 예컨대 이에 한정되는 것은 아니지만, 2가 금속 이온의 염: 마그네슘 (Mg2+), 망간 (Mn2 +), 칼슘 (Ca2 +), 베릴륨 (Be2 +), 아연 (Zn2 +) 및 스트론튬 (Sr2 +), 또는 1가 금속 이온의 염, 이에 한정되는 것은 아니지만, 리튬 (Li+), 나트륨 (Na+) 또는 칼륨 (K+)을 포함할 수 있다. 상기 염은 클로리드, 아세테이트 및 술페이트를 포함할 수 있다. 포함될 수 있는 다른 염은 암모늄 염, 특히 암모늄 술페이트이다. 당분야의 통상의 지식을 가진 자라면 금속 이온 염의 형태로 뉴클레오티드의 공급은 상기 반응 혼합물에서 금속 이온의 농도에 영향을 줄 수 있다는 것을 알 수 있고, 필요하다면 금속 이온의 부가의 공급원을 고려할 수 있다. 상기 반응 혼합물 중 금속 이온의 전체 농도는 금속 이온의 모든 공급원을 포함하는 것이 바람직하다.
세정제 (detergents)가 또한 상기 반응 혼합물 중에 포함될 수 있다. 적당한 세정제의 예로는 Triton X-100, Tween 20 및 그 각각의 유도체를 포함한다. 안정화제 (stabilising agents)가 또한 상기 반응 혼합물 중에 포함될 수 있다. 임의의 적당한 안정화제가, 특히 소의 혈청 알부민 (bovine serum albumin: BSA) 및 다른 안정화 단백질이 사용될 수 있다. 반응 조건이 또한 DNA를 이완시키고, 또한 주형 변성을 더 쉽게 할 수 있는 제제를 첨가함으로써 개선될 수 있다. 상기 제제는, 예를 들면, 디메틸 술폭시드 (DMSO), 포름아미드, 글리세롤 및 베타인을 포함한다. DNA 축합제 (condensing agents)가 또한 상기 반응 혼합물 중에 포함될 수 있다. 상기 제제는, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜 또는 양이온성 지질 또는 양이온성 폴리머를 포함한다.
당분야의 통상의 지식을 가진 자는, 그들의 일반적 지식에 기반하여 상기 부가의 성분들 및 조건들을 사용하여 본 발명의 방법에 대한 증폭 및 인큐베이션 조건을 변형 및 최적화할 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 마찬가지로, 특별한 제제의 특정 농도가 당분야에서 이전의 실시예의 기반하여 선택될 수 있고, 일반적 지식의 기반하여 더 최적화될 수 있다. 예로서, 상기 반응 혼합물에 존재하는 폴리머라제의 양이 최적화될 수 있다. 상기는 DNA 합성 중에 상기 반응 혼합물로 폴리머라제 효소의 부가적 첨가를 포함할 수 있다. 부가의 실시예로서, 상기 DNA 주형의 양이 최적화될 수 있다. 상기는 DNA 합성 중에 상기 반응 혼합물로 DNA 주형의 부가적 첨가를 포함할 수 있다. 폴리머라제 효소 및/또는 DNA 주형의 부가적 공급은 연속적 또는 비연속적, 바람직하게는 비연속적일 수 있다.
실시예로서, 당분야에서 RCA-기반 방법에서 사용된 적당한 반응 완충액은 50mM Tris HCl, pH 7.5, 1OmM MgCl2, 20mM (NH4)2S04, 5% 글리세롤, 0.2mM BSA, 1mM dNTPs이다. 본 발명의 RCA 증폭에서 사용된 바람직한 반응 완충액은 30mM Tris-HCl pH 7.4, 30mM KCl, 7.5mM MgCl2, 1OmM (NH4)2S04, 4mM DTT, 2mM dNTPs이다. 상기 완충액은 Phi29 RCA 폴리머라제에 사용하기에 특히 적당하다.
상기 반응 혼합물은 또한 하나 이상의 부가의 단백질의 사용을 포함할 수 있다. 상기 DNA 주형이 적어도 하나의 피로포스파타제 (pyrophosphatase), 예컨대 이스트 무기 피로포스파타제 (Yeast Inorganic pyrophosphatase)의 존재하에 증폭될 수 있다. 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 상이한 피로포스파타제가 사용될 수 있다. 상기 효소가, 가닥 복제 중에 dNTPs로부터 상기 폴리머라제에 의해서 생성된 피로포스페이트를 분해할 수 있다. 상기 반응에서 피로포스페이트의 빌드-업 (build-up)은 DNA 폴리머라제의 억제를 야기할 수 있고, 또한 DNA 증폭의 속도 및 효율성을 감소시킬 수 있다. 피로포스파타제는 피로포스페이트를 비-억제성 포스페이트로 분해시킬 수 있다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 적당한 피로포스파타제의 예로는 New England Biolabs, Inc.로부터 상업적으로 이용가능한, 사카로마 이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 피로포스파타제이다.
임의의 단일-가닥 결합 단백질 (single-stranded binding protein: SSBP)이 본 발명의 방법에서, 단일-가닥 DNA를 안정화시키기 위해서 사용될 수 있다. SSBPs는 살아 있는 세포의 필수 성분들이고, ssDNA와 관련된 모든 공정, 예컨대 DNA 복제, 복구 및 재조합에 참여한다. 상기 공정에서, SSBPs가 일시적으로 형성된 ssDNA에 결합하고, 또한 ssDNA 구조를 안정화하는데 도움을 줄 수 있다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 적당한 SSBP의 예로는 New England Biolabs, Inc.으로부터 상업적으로 이용가능한 T4 유전자 32 단백질이다.
상기 반응 혼합물이 전술한 바와 같이 상기 DNA 주형의 증폭을 촉진하기 위한 조건하에 인큐베이션될 수 있다. 상기 증폭은 바람직하게 가닥 치환 복제이다. 상기 반응 혼합물은 바람직하게 전술한 개시 농도 또는 (폴리머라제에 대한) 개시 비율로 뉴클레오티드를 포함한다. 상기 반응 혼합물은 금속 이온을 더 포함할 수 있다.
DNA를 합성하기 위해서, 부가의 뉴클레오티드의 공급이 본 발명의 하나의 양태에 따라 필요하다. 상기 반응 혼합물로 뉴클레오티드의 공급이 본 발명의 제1 양태에 따라 조절된다. 그러므로, DNA의 합성을 위해 요구되는 모든 뉴클레오티드가 상기 공정의 개시 시에 상기 반응 혼합물로 첨가되지 않는다. 부가의 뉴클레오티드가 상기 반응 혼합물로 임의의 적당한 시점에 공급 또는 제공될 수 있다. 상기 반응 혼합물로 부가의 뉴클레오티드의 공급의 시기 및/또는 상기 반응 혼합물로 공급된 뉴클레오티드의 양이 조절되거나 또는 지시되었다. 그러므로, 상기 반응 자체가 뉴클레오티드의 정확한 공급에 의해서 조절될 수 있다. 상기 조절은 상기 효소 키네틱스의 이론적 산출에 기반할 수 있거나, 또는 상기 조절이 상기 반응 혼합물의 측정가능한 파라미터에 기반할 수 있어서, 이들이 상기 폴리머라제에 의해서 요구될 때 부가의 뉴클레오티드가 공급된다.
상기 반응 혼합물이 상기 DNA 주형의 증폭을 촉진하는 조건하에 형성 및 인큐베이션되어질 때 부가의 뉴클레오티드가 공급될 수 있다. 상기 증폭이 시작 또는 개시된 후에 상기 부가의 뉴클레오티드가 공급될 수 있다. 하나의 구현예에서, 뉴클레오티드의 부가의 공급은, 상기 개시 뉴클레오티드가 제공되고 적어도 20분 후, 또는 적어도 30분 후, 또는 적어도 40분 후에 착수한다. 그러나, 특히 상기 뉴클레오티드의 공급이 연속되는 경우 상기 반응의 개시에서 공급이 시작될 수 있다.
하나의 구현예에서, 상기 반응 혼합물 중 뉴클레오티드의 농도 또는 양은 상기 공정 중에 상위 역치 (threshold)를 초과하지 않는다. 뉴클레오티드의 농도 또는 양이 상기 상위 역치를 초과하지 않도록 상기 뉴클레오티드의 공급이 조절된다. 상기 상위 역치는 상기 반응 혼합물 중 8mM, 또는 7mM 또는 6mM 또는 5mM 또는 4mM 또는 3mM 또는 2mM의 뉴클레오티드일 수 있다. 바람직하게, 상기 상위 역치는 상기 반응 혼합물 중 약 4mM의 뉴클레오티드이다. 유사하게, 하나의 구현예에서, 상기 관련 혼합물 중 뉴클레오티드의 농도 또는 양은 상기 공정 중에 하위 역치 아래로 떨어지지 않을 수 있다. 뉴클레오티드의 농도 또는 양이 상기 하위 역치 아래로 떨어지지 않도록 상기 뉴클레오티드의 공급이 조절된다. 상기 하위 역치는 상기 반응 혼합물 중 0.1μM, 0.5μM, 1μM, 5μM 또는 10μM의 뉴클레오티드일 수 있다. 상기 반응 혼합물 중 뉴클레오티드의 농도가 상기 공정 중에 상위 역치와 하위 역치 사이에서 유지되는 것이 바람직하다. 그러므로, 상기 반응 혼합물 중 뉴클레오티드의 농도가 0.0001mM 내지 8mM, 바람직하게 0.001mM 내지 6mM, 가장 바람직하게 0.01mM 내지 5mM 사이로 유지될 수 있다. 상기 뉴클레오티드의 농도가 상기 반응 혼합물로 부가의 뉴클레오티드의 공급을 조절함으로써 유지될 수 있다. 하나의 구현예에서, 상기 반응 혼합물 중 상기 뉴클레오티드의 농도가 이온 크로마토그래피에 의해서 추정될 수 있다. 대안으로서, 상기 뉴클레오티드의 대략의 농도가 전술한 바와 같이 합성된 DNA의 양을 추정함으로써 산출될 수 있다.
대안으로서, 상기 상위 및 하위 역치가 상기 반응 혼합물 중 존재하는 뉴클레오티드의 양과 폴리머라제의 양 사이의 비율과 관련하여 개시될 수 있다. 그러므로, 상기 상위 역치는 500,000:1 (뉴클레오티드:폴리머라제), 200,000:1, 150,000:1, 100,000:1 또는 80,000:1 일 수 있다. 상기 하위 역치는 1,000:1, 1,500:1 또는 2,000:1 일 수 있다. 그러므로, 뉴클레오티드 대 폴리머라제의 비율이 1,000:1 내지 500,000:1, 바람직하게 2,000:1 내지 450,000:1, 더 바람직하게 5,000:1 내지 400,000:1, 가장 바람직하게 10,000:1 내지 100,000:1 사이로 유지될 수 있다. 가장 바람직하게, 상기 비율이 40,000:1 내지 70,000:1 사이, 약 50,000:1 로 유지된다.
하나의 구현예에서, 상기 부가의 뉴클레오티드가 상기 반응 혼합물로 하나 이상의 개별 첨가로, 즉 분취량으로 공급된다. 첨가 또는 분취량의 임의의 수가 상기 구현예의 범위내에 있다. 그러므로, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상, 즉, 20-25, 25-30, 35-40회의 첨가 또는 분취량이 상기 반응 혼합물로 첨가될 수 있다. 그러므로, 1-50, 1-40, 1-30 또는 1-20회의 분취량이, 상기 뉴클레오티드를 공급하기 위해서 사용될 수 있다. 분취량은 상기 공정을 위해 요구되거나 또는 상기 공정으로 첨가되는 뉴클레오티드의 전체 양의 일부일 수 있다. 상기 분취량 중 뉴클레오티드의 부피 및/또는 농도는 상기 공정의 요건에 따라 가변될 수 있다. 분취량은 소량의 뉴클레오티드, 즉 뉴클레오티드의 특정 농도 또는 양이 상기 반응 혼합물 중에 존재하도록 하기에 충분한 양을 포함할 수 있다. 상기 뉴클레오티드가 규칙적 간격으로 분취량으로 상기 반응 혼합물에 공급될 수 있다 (즉, 30분 마다, 60분 마다, 90분 마다, 120분 마다, 180분 마다 또는 240분 마다 또는 임의의 다른 적당한 시간). 상기 뉴클레오티드가 불규칙한 간격으로 분취량으로 상기 반응 혼합물로 공급될 수 있다. 예를 들면, 뉴클레오티드들의 각 공급 사이의 시간 간격은 초기에 더 짧을 수 있고, 그 후에 상기 공정이 진행되면 증가될 수 있거나, 또는 그 반대의 경우도 가능하다. 상기 분취량이 상기 반응 혼합물 중 뉴클레오티드의 일정 농도를 유지하기 위해서 제공될 수 있거나, 또는 상기 개시 농도로 뉴클레오티드의 농도를 보충하기 위해서 제공될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 반응 혼합물 중 상기 농도가 8mM, 또는 7mM 또는 6mM 또는 5mM 또는 4mM을 초과하지 않도록 상기 뉴클레오티드가 공급된다. 바람직한 구현예에서, 상기 반응 혼합물 중 뉴클레오티드의 농도 또는 양이 상기 상위 역치 및 하위 역치내에 있도록 상기 뉴클레오티드가 공급된다.
상기 분취량이 분석 또는 시험을 위해서 취해진 반응 혼합물의 부피를 대체하기 위해서 단독으로 공급되지 않지만, 그러나 상기 반응이 부가의 뉴클레오티드를 필요로 하기 때문에 공급되는 것이 바람직하다. 상기 반응 혼합물의 시험은 비-침입적 (non-invasive)이고, 상기 반응이 완료될 때까지 상기 반응 혼합물로부터 물질이 회수되지 않는 것이 바람직하다.
상기 반응 혼합물에서 더 많은 뉴클레오티드에 대한 필요에 대응하여 부가의 뉴클레오티드가 공급될 수 있다. 이에 한정되는 것은 아니지만, DNA 합성 속도, 합성된 DNA의 농도 또는 상기 반응 혼합물의 점도 또는 부피를 포함하는 몇가지 파라미터에 의해서 상기가 결정될 수 있다. 상기 DNA 합성 속도가 경시적으로 합성된 DNA의 농도로부터 산출될 수 있다. DNA의 합성 속도가 감소되기 시작하면, 부가의 뉴클레오티드가 공급될 수 있다. 대안으로서, 합성된 DNA의 농도가 하기에 부가로 토의되는 방법에 의해서 모니터될 수 있다. DNA의 농도가 역치 수준으로 증가될 때, 부가의 뉴클레오티드가 공급될 수 있다. 상기 반응 혼합물의 점도가 측정될 수 있고, 점도의 증가는 부가의 뉴클레오티드에 대한 요건을 나타낼 수 있다. 상기 반응의 점도가 점도계 (viscometer)에 의해서 측정될 수 있다.
하나의 구현예에서, 상기 부가의 뉴클레오티드가 상기 반응 혼합물로 연속적으로 공급되고, 즉 이들이 상기 반응 혼합물로 연속적 방식으로 첨가된다. 대안으로서, 상기 뉴클레오티드가 드립-공급 (drip-fed)되거나 또는 일정하게 공급될 수 있다. 상기 뉴클레오티드의 공급이 부가의 뉴클레오티드에 대한 상기 폴리머라제에 의해서 상기 요건을 만족시키도록, 상기 구현예에 따른 부가의 뉴클레오티드의 공급이 충분히 소량으로 존재할 수 있다. 상기 구현예에서, 상기 뉴클레오티드의 일정한 공급은 상기 반응 혼합물 중 뉴클레오티드의 거의 일정한 농도를 유지한다. 상기 반응 혼합물 중 뉴클레오티드의 농도가 상기 상위 및 하위 역치 내에서 유지되도록 상기 반응 혼합물로 부가의 뉴클레오티드의 공급을 일정하게 하는 것이 바람직하다.
상기 부가의 뉴클레오티드가 상기 반응 혼합물로 물리적으로 제공될 수 있고, 즉 이들은 상기 반응 혼합물의 외부에 있다. 그러므로, 상기 공급은 외부 공급원, 예컨대 저장소 (reservoir)로부터 유래될 수 있다. 상기 저장소가 상기 반응 혼합물로 연결될 수 있다. 상기 뉴클레오티드가 상기 반응 혼합물로 펌프될 수 있다. 그러므로, 상기 뉴클레오티드 및 상기 반응 혼합물이 물리적으로 분리되고, 또한 부가의 뉴클레오티드의 공급은 뉴클레오티드의 물리적 공급이다. 대안으로서, 상기 뉴클레오티드가 삼투압 펌프에 의해서 공급될 수 있다. 삼투압 펌프는 조절되고 연속된 뉴클레오티드 공급을 위한 방법을 제공한다.
상기 뉴클레오티드가 대안으로서 전술한 바와 같은 생물학적으로 비활성화된 뉴클레오티드를 활성화시킴으로써 상기 반응 혼합물로 제공될 수 있다. 상기 반응 혼합물로 상기 뉴클레오티드를 공급하기 위해서, 상기 생물학적 비활성 뉴클레오티드가 적당한 수단에 의해서 활성화된다. 그러므로, 부가의 뉴클레오티드는 임의의 적당한 생물학적 비활성 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 생물학적 비활성 뉴클레오티드가 상기 개시에서 상기 반응 혼합물에 포함될 수 있지만, 그러나 조절된 활성화에 의해서 상기 반응 혼합물로 공급될 수 있다. 대안으로서, 상기 생물학적 비활성 뉴클레오티드가 분취량으로 또는 연속적으로 상기 반응 혼합물로 물리적으로 첨가될 수 있고, 또한 그 후에 상기 반응 혼합물로 상기 뉴클레오티드를 공급하기 위해서 활성화될 수 있다. 상기 활성화가 물리적 (즉, 열 또는 광) 또는 화학적일 수 있고, 상기 뉴클레오티드의 공급을 조절하는 활성화의 조절이다.
상기 DNA의 합성이 완료될 때까지, 예를 들면, DNA 주형이 소비되고, 부가의 혼입이 가능하지 않을 때에, 상기 반응 혼합물로 뉴클레오티드의 공급이 조절될 수 있다. 대안으로서, DNA의 기대되거나 또는 원하는 수득율이 합성되어졌을 때, 상기 반응이 완료될 수 있다. 상기 수득율은 첨가된 뉴클레오티드의 양에 기반될 수 있다. 요구되는 DNA의 양이 합성되어질 때, 예컨대 반응 혼합물의 리터 당 1g, 2g/l, 3g/l, 4g/l, 5g/l 또는 1Og/l 미만 또는 초과할 때, DNA의 합성이 완료될 수 있다. DNA의 합성 속도가 감소되고, 또한 뉴클레오티드의 부가적 공급이 상기 속도를 증가시키지 못하고, 상기 반응 혼합물이 다른 성분 (예컨대, 이에 한정되는 것은 아니지만, 프라이머)을 고갈시키고, 상기 폴리머라제 효소가 비활성화되고, 상기 무기 피로포스파타제가 비활성화되고, 부가의 단일 가닥 주형이 이용가능하지 않고, 금속 양이온과 같은 필요한 보조-인자들이 소모되고, 상기 반응 혼합물의 점도가 특정 역치에 도달되고, 상기 반응 혼합물의 부피가 특정 역치에 도달되거나 또는 상기 폴리머라제가 억제될 때 상기 DNA의 합성이 완료될 수 있다.
상기 반응의 수득율은 합성된 DNA의 양과 관련된다. 본 발명에 따른 방법으로부터 기대된 수득율이 10 g/반응 혼합물의 리터를 초과하거나, 또는 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1g/l일 수 있다. 본 발명은 DNA의 효소적 합성으로부터 수득율을 향상시킬 수 있다. 본 발명의 목적은 무세포 효소적 DNA 합성 방법의 수득율을 향상시키는 것이고, DNA가 비용-효율적 방법으로 대규모로 합성될 수 있다. 본 발명은 폴리머라제에 의해서 촉매화된 효소적 방법을 사용하여 산업적 규모로 DNA을 경제적으로 제조/합성하도록 한다. 본 방법은 상기 DNA 생성물로 뉴클레오티드를 효과적으로 혼입시킨다. 본 발명의 방법은 반응 혼합물을 수 리터, 수십 리터까지 스케일업시킬 것이다. 개선된 수득율, DNA 합성 속도, 생산성 또는 진행성이, 모든 뉴클레오티드가 개시 시에 공급되는 동일한 반응 혼합물과 비교될 수 있다. 실시예에서 입증되는 바와 같이, 상기 반응 혼합물로 부가의 뉴클레오티드의 공급을 조절함으로써 상기 수득율이 향상될 수 있다고 사료된다.
DNA 합성 속도는, 공정의 분(min)당 합성된 DNA의 양 또는 농도와 관련이 있다. 실시예에서, DNA의 합성 속도는 상기 공정이 진행될 때 점진적으로 느려지는 것을 볼 수 있을 것이다.
상기 공정의 생산성, 또는 공급된 뉴클레오티드의 유닛 당 DNA의 산출 속도가, 본 발명의 공정 또는 공정들을 사용하여 증가될 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 DNA의 합성을 증강하기 위한 방법에 관한 것이다. 상기 증강이 동일한 반응 혼합물과 비교될 수 있고, 뉴클레오티드를 포함하는 필요한 성분들 모두가 상기 개시 시에 첨가되는 것은 예외이다. 상기 반응 혼합물을 조절하기 위한 부가의 첨가는 이루어지지 않았다.
하나의 양태에서, DNA 주형의 증폭을 다른 가닥의 가닥-치환 복제를 통해서 복제된 가닥의 치환에 의해서 촉진하는 조건하에서, 하나 이상의 프라이머, 뉴클레오티드 및 금속 양이온의 존재하에, DNA 주형을 적어도 하나의 폴리머라제와 접촉시켜서 반응 혼합물을 형성하는 단계를 포함하고, 부가의 금속 양이온이 상기 반응 혼합물에 조절된 방식으로 공급되는 DNA를 합성하기 위한 무세포 방법이 제공된다.
대안으로서, 상기 주형의 가닥 치환 복제에 의해서 증폭이 실시된다. 그러므로, 본 발명은, DNA 주형의 가닥 치환 복제를 촉진하는 조건하에서, 하나 이상의 프라이머, 뉴클레오티드 및 금속 양이온의 존재하에, DNA 주형을 적어도 하나의 폴리머라제와 접촉시켜서 반응 혼합물을 형성하는 단계를 포함하고, 부가의 뉴클레오티드 및 부가의 금속 양이온이 상기 반응 혼합물에 조절된 방식으로 공급되는 DNA를 합성하기 위한 무세포 방법을 제공된다.
DNA를 합성하기 위한 무세포 방법의 반응 속도가 상기 반응 혼합물에 조절된 방식으로 부가의 양이온을 공급함으로써 조절되는 것이 바람직하다.
상기 반응 혼합물로 금속 양이온의 공급이 본 발명의 양태에 따라 조절될 수 있다. 이러한 조절이 특히 대규모 공정에서 DNA 합성의 속도를 향상시키는 것으로 사료된다. 하나 이상의 금속 양이온이 상기 개시 시에 상기 반응 혼합물 중에 존재할 수 있다. 그러므로, 상기 반응 혼합물은, 바람직하게 염으로 공급되는, 하나 이상의 금속 양이온을 또한 포함할 수 있다. 상기 반응 혼합물로 부가의 금속 양이온의 공급이 조절될 수 있다. 하나 이상의 금속 양이온이 공급될 수 있다. 적당한 금속 양이온은 2가 금속 이온: 마그네슘 (Mg2 +), 망간 (Mn2 +), 칼슘 (Ca2 +), 베릴륨 (Be2 +), 아연 (Zn2 +) 및 스트론튬 (Sr2 +), 또는 1가 금속 이온, 이에 한정되는 것은 아니지만, 리튬 (Li+), 나트륨 (Na+) 또는 칼륨 (K+)을 포함한다. 상기 금속 양이온이 염으로 바람직하게 공급된다. 상기 염은 클로리드, 아세테이트 및 술페이트를 포함할 수 있고, 상기 금속 양이온이 클로리드 염으로 공급되는 것이 바람직하다. 포함될 수 있는 다른 염은 암모늄염, 특히 암모늄 술페이트이다. 상기 금속 양이온은 마그네슘 또는 망간, 가장 바람직하게 마그네슘인 것이 바람직하다. 가장 바람직한 구현예에서, 상기 금속 양이온이 마그네슘 클로리드로 제공된다.
DNA를 합성하기 위해서, 부가의 금속 양이온의 공급이 본 발명의 하나의 양태에 따라 필요하다. 상기 반응 혼합물로 금속 양이온의 공급이 본 발명의 제2 양태에 따라 조절된다. 그러므로, DNA의 합성을 위해서 필요한 모든 금속 양이온이 상기 공정의 개시 시에 상기 반응 혼합물로 첨가되는 것은 아니다. 상기 부가의 금속 양이온이 상기 반응 혼합물로 임의의 적당한 시간에 공급 또는 제공될 수 있다. 상기 반응 혼합물로 부가의 금속 양이온의 공급 시기 및/또는 상기 반응 혼합물로 공급된 금속 이온의 양이 조절 또는 지시된다. 그러므로, 상기 반응 자체가 금속 이온의 정확한 공급에 의해서 조절될 수 있다. 상기 조절은 효소 키네틱스의 이론적 산출에 기반할 수 있거나, 또는 상기 조절은 상기 반응 혼합물의 측정가능한 파라미터에 기반할 수 있고, 부가의 금속 이온이 이들이 필요할 때 공급된다. 상기 부가의 금속 양이온의 공급이, 부가의 뉴클레오티드의 조절된 공급과 병행하거나 또는 조합하여 조절될 수 있다. 상기 공급은 독립적으로 조절되거나 또는 함께 조절될 수 있다.
상기 DNA 주형의 증폭을 촉진하는 조건하에, 상기 반응 혼합물이 형성 및 인큐베이션되어질 때 부가의 금속 양이온이 공급될 수 있다. 상기 증폭이 시작되거나 또는 개시된 후에 부가의 금속 양이온이 공급될 수 있다. 하나의 구현예에서, 상기 금속 양이온의 개시 농도가 제공되고 적어도 20분 후, 또는 적어도 30분 후, 또는 적어도 40분 후에 금속 양이온의 부가의 공급을 착수한다. 그러나, 특히 금속 양이온의 공급이 연속된다면, 상기 반응의 개시 시에 공급이 개시될 수 있다.
하나의 구현예에서, 상기 반응 혼합물 중 유리 또는 결합되지 않은 금속 양이온의 농도 또는 양은 상기 공정 중에 상위 역치를 초과하지 않는다. 유리 또는 결합되지 않은 금속 양이온의 농도 또는 양이 상한 역치를 초과하지 않도록 금속 양이온의 공급이 조절된다. 상기 상위 역치는 상기 반응 혼합물에서 4mM, 3mM 또는 2mM 일 수 있다. 바람직하게, 상기 상한 역치는 상기 반응 혼합물에서 약 3mM이다. 유사하게, 하나의 구현예에서, 상기 반응 혼합물에서 유리 금속 양이온의 농도 또는 양이 상기 공정 중에 하한 역치 아래로 떨어지지 않을 수 있다. 유리 금속 양이온의 농도 또는 양이 상기 하한 역치 아래로 떨어지지 않도록 금속 양이온의 공급이 조절된다. 상기 하한 역치는 상기 반응 혼합물에서 0.03μM, 0.15μM, 0.3μM, 1.5μM, 또는 3μM 일 수 있다. 상기 반응 혼합물 중 유리 금속 양이온의 농도가 상기 공정 중에 상한 역치와 하한 역치 사이에서 유지되는 것이 바람직하다. 그러므로, 상기 반응 혼합물 중 유리 금속 양이온의 농도가 0.03μM 내지 4mM, 또는 0.5μM 내지 3mM 또는 1μM 내지 2mM 또는 10μM 내지 1mM 사이로 유지될 수 있다. 바람직하게, 상기 반응 혼합물 중 유리 금속 양이온의 농도가 1mM 내지 1.5mM 사이로 유지된다.
대안으로서, 상기 상한 역치는 상기 반응 혼합물 중 1OmM, 8mM, 6mM, 4mM, 3mM 또는 2mM 일 수 있다. 바람직하게, 상기 상한 역치는 상기 반응 혼합물에서 약 3mM 이다. 유사하게, 하나의 구현예에서, 상기 반응 혼합물 중 유리 금속 양이온의 농도 또는 양이 상기 공정 중에 하한 역치 아래로 떨어지지 않을 수 있다. 유리 금속 양이온의 농도 또는 양이 상기 하한 역치 아래로 떨어지지 않도록 금속 양이온의 공급이 조절된다. 상기 하한 역치는 상기 반응 혼합물에서 0.03μM, 0.15μM, 0.3μM, 1.5μM, 3μM 및 5μM 일 수 있다. 상기 반응 혼합물 중 유리 금속 양이온의 농도가 상기 공정 중에 상한 역치와 하한 역치 사이에서 유지되는 것이 바람직하다. 그러므로, 상기 반응 혼합물 중 유리 금속 양이온의 농도가 0.03μM 내지 1OmM, 또는 0.15μM 내지 8mM 또는 0.3μM 내지 6mM 또는 1.5μM 내지 3mM 사이로 유지될 수 있다. 바람직하게, 상기 반응 혼합물 중 유리 금속 양이온의 농도가 0.15μM 내지 5μM 사이로 유지된다.
유리 금속 양이온의 농도가 상기 반응 혼합물로 상기 부가의 금속 이온의 공급을 조절함으로써 유지될 수 있다. 하나의 구현예에서, 상기 반응 혼합물 중 유리 금속 이온의 농도가 원자 흡수 분광학 (atomic absorption spectroscopy), 이온 크로마토그래피 (ion chromatography) 및 당분야에 알려져 있는 다른 방법에 의해서 추정될 수 있다. 대안으로서, 상기 유리 금속 양이온의 대략의 농도가 본원에서 토의된 바와 같이 합성된 DNA의 양을 추정함으로써 산출될 수 있다. 의심의 소지를 없애기 위해서, 금속 양이온, 예컨대 마그네슘 이온이, 이에 한정되는 것은 아니지만 피로포스페이트, 포스페이트 및 DNA를 포함하는 상기 반응 혼합물 중 상이한 실체 (entities)로 결합될 수 있다. 상기 이온들이 결합되고, 또한 유리되지 않는다.
하나의 구현예에서, 부가의 금속 양이온이 하나 이상의 개별의 첨가, 즉 분취량으로 상기 반응 혼합물로 공급된다. 첨가 또는 분취량의 임의의 수가 상기 구현예의 범위내에 있다. 그러므로, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상, 즉 20-25, 25-30, 35-40회의 첨가 또는 분취량이 상기 반응 혼합물로 첨가될 수 있다. 그러므로, 1-50, 1-40, 1-30 또는 1-20회의 분취량이 상기 금속 양이온을 공급하기 위해서 사용될 수 있다. 분취량은 상기 공정을 위해서 요구되거나 또는 상기 공정으로 첨가된 금속 양이온의 전체 양의 일부일 수 있다. 상기 분취량 중 금속 양이온의 부피 및/또는 농도는 상기 공정의 요건에 따라 가변할 수 있다. 분취량은 소량의 금속 양이온, 즉 금속 양이온의 특정 농도 또는 양이 상기 반응 혼합물에 존재하도록 하기에 충분한 양으로 포함할 수 있다. 상기 금속 양이온이 규칙적 간격으로 분취량으로서 상기 반응 혼합물에 공급될 수 있다 (즉, 30분 마다, 60분 마다, 90분 마다, 120분 마다, 180분 마다, 또는 240분 마다 또는 임의의 다른 적당한 기간). 상기 금속 양이온이 불규칙 간격으로 분취량으로 상기 반응 혼합물로 공급될 수 있다. 예를 들면, 금속 양이온들의 각 공급들 사이에 시간 간격은 초기에 더 짧을 수 있고, 그 후에 상기 공정이 진행되면 증가할 수 있거나, 또는 그 반대의 경우도 가능하다. 상기 분취량이 상기 반응 혼합물 중 금속 양이온의 일정 농도를 유지하기 위해서 제공될 수 있거나, 또는 상기 개시 농도로 금속 양이온의 농도, 바람직하게 상기 최적 유리 금속 이온 농도를 보충하기 위해서 제공될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 상기 반응 혼합물 중 유리 금속 양이온의 농도 또는 양이 상기 상한 및 하한 역치 내에 떨어지도록 하는 방법으로 상기 금속 양이온이 공급된다.
부가의 금속 양이온이 상기 반응 혼합물 중 이러한 필요에 대응하여 공급될 수 있다. 상기가 전술한 바와 같이 몇가지 파라미터에 의해서 결정될 수 있다.
하나의 구현예에서, 상기 부가의 금속 양이온이 상기 반응 혼합물로 연속적으로 공급된다.
상기 부가의 금속 양이온이 상기 반응 혼합물로 물리적으로 제공될 수 있고, 즉 이들은 상기 반응 혼합물의 외부에 있다.
부가의 뉴클레오티드의 공급이 또한 조절되는 것이 바람직하다.
부가의 양태에서, DNA 주형의 증폭을 다른 가닥의 가닥-치환 복제를 통해 복제된 가닥의 치환에 의해서 촉진하는 조건하에, 하나 이상의 프라이머, 뉴클레오티드 및 금속 양이온의 존재하에, DNA 주형을 적어도 하나의 폴리머라제와 접촉시켜서 반응 혼합물을 형성하는 단계를 포함하고, 부가의 뉴클레오티드 및 금속 양이온이 상기 반응 혼합물에 조절된 방식으로 공급되는 DNA를 합성하기 위한 무세포 공정이 제공된다.
DNA 주형의 가닥 치환 증폭을 촉진하는 조건하에, 뉴클레오티드 및 금속 양이온의 존재하에, DNA 주형을 적어도 하나의 폴리머라제와 접촉시켜서 반응 혼합물을 형성하는 단계를 포함하고, 부가의 뉴클레오티드 및 부가의 금속 양이온이 상기 반응 혼합물에 조절된 방식으로 공급되는 DNA를 합성하기 위한 무세포 공정이 또한 제공된다.
부가의 뉴클레오티드 및 부가의 금속 이온이 함께 또는 개별적으로 공급될 수 있다. 상기 부가의 뉴클레오티드 또는 부가의 금속 양이온의 조절된 공급이 상기 전문과 관련하여 전술한 바와 같이 달성될 수 있다.
상기 금속 양이온 또는 부가의 금속 양이온의 공급이 상기 뉴클레오티드의 공급과 병행될 수 있거나, 또는 상기 뉴클레오티드의 공급에 대해 상이한 시간일 수 있다.
상기 부가의 금속 양이온이 상기 뉴클레오티드의 공급과 함께 상기 반응 혼합물로 공급될 수 있는 것이 바람직하고, 특히 상기 금속 양이온은 1가이다. 그러므로, 상기 금속 양이온 및 상기 뉴클레오티드가 혼합물로서 공급될 수 있다. 그러므로 이들이 개별적으로 유지되는 것이 바람직할지라고, 금속 양이온 및 뉴클레오티드의 공급이 조합될 수 있다.
부가의 금속 양이온 및/또는 부가의 뉴클레오티드의 공급이 상기 실체들의 각각에 대해서 개별적으로 개시될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 금속 양이온:뉴클레오티드의 비율 (양)은 9:1 내지 1:9 사이, 또는 6:1 내지 1:6 사이 또는 3:1 또는 1:3, 또는 1:1이 되도록 상기 금속 양이온 및 뉴클레오티드가 공급된다. 바람직하게, 상기 반응 혼합물 중 이들의 양들 사이의 비율은 약 3:1 내지 1:3의 사이, 바람직하게 약 3:1 이다. 상기 금속 양이온은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 마그네슘 (Mg2 +), 망간 (Mn2 +), 칼슘 (Ca2 +), 베릴륨 (Be2 +), 아연 (Zn2 +) 및 스트론튬 (Sr2 +)과 같은 2가 금속 양이온인 경우에 상기 비율이 특히 바람직하다.
금속 양이온:뉴클레오티드, 바람직하게 마그네슘 양이온의 비율을 유지하는 것이 DNA 합성 속도를 조절하는데 중요할 수 있다고 사료된다. 뉴클레오티드:폴리머라제의 비율이 전술한 바와 같이 또한 유지될 수 있다. 그러므로, 상기 뉴클레오티드 및 금속 양이온의 공급을 조절함으로써, 상기 2개의 비율들을 조절하는 것은 DNA의 합성을 조절할 수 있다.
본 발명의 임의의 양태와 관련하여, 상기 뉴클레오티드가 금속 양이온의 염으로서 공급된다면, 상기 반응 혼합물로 공급된 상기 염들 중 금속 양이온의 농도는 상기 금속 양이온을 포함할 것이다. 당분야의 통상의 지식을 가진 자라면, 금속 양이온 염의 형태로 뉴클레오티드를 공급하는 것은 상기 반응 혼합물 중 금속 양이온의 농도에 영향을 줄 것이라는 것을 알 수 있고, 상기 부가의 양을 고려할 수 있다.
그 화학적 특성에 의해 뉴클레오시드 트리포스페이트 (ATP, GTP, CTP 및 TTP)는, DNA 생성물 수득율을 증가시키기 위해서 고농도가 사용되는 많은 방법 중 DNA 증폭을 방해할 가능성을 갖는다. 고농도는 상기 반응 혼합물 중 4mM 초과의 dNTPs의 농도인 것으로 고려될 수 있다. dNTPs의 포스페이트기는 1가 및 2가 금속 양이온과 반응할 수 있고, 또한 Mg2 +에 대한 가장 강한 친화도를 포함할 수 있다. 예를 들면, Mg2 +에 대한 ATP의 친화도는 Na+ 보다 700배 이상 더 크고, Li+ 보다 거의 400배 더 크다.
증폭하는 동안, 폴리머라제는 뉴클레오티드로부터 피로포스페이트를 방출하여서 상기 성장하는 DNA 사슬로 혼입된다. 피로포스페이트는 ATP와 유사한 Mg2 + 이온에 대한 결합 친화도 (binding affinity)를 가지므로, 유리 Mg2 + 이온이 상기 공정에 의해서 방출되지 않는다. 증폭하는 동안 뉴클레오티드의 높은 개시 농도를 사용한 결과로 유리 Mg2 + 이온의 수준을 감소시킬 것이다. Mg2 + 이온이 폴리머라제 촉매적 활성을 위해 요구될 수 있기 때문에, 포스페이트 또는 포스페이트기와 반응에 의해서 야기된 하위최적 수준 (suboptimal levels)이 효율적인 증폭에 유해할 수 있다. 그러나, 반대로, 고농도의 Mg2 + 이온이 일부의 DNA 폴리머라제의 충실도에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 그러므로, Mg2 + 이온의 반응 농도는 DNA 수득율 및 품질에 매우 중요한 것으로 생각될 수 있다.
피로포스페이트 분해가 효소에 의해서 촉매화될 수 있고, 상기 피로포스페이트로부터 결합된 Mg2 + 이온을 방출할 것으로 기대될 수 있다. 그러나, Mg2 + 이온은 P04 3- 이온과 결합하여, 본질적으로 불용성인 Mg3(P04)2 (20 ℃에서 수중 0.01mM의 용해도)를 형성한다.
Mg2 + 이온은 또한 합성된 DNA에 결합할 것이다.
임의의 특정 시점에서 임의의 DNA 폴리머라제 촉매화 반응에서 유리 Mg2 + 이온의 수준은 개시 농도, 상기 양이온을 결합할 수 있는 분자의 전체 농도 및 상기 반응의 pH에 의존할 것이다. 상기 공정이 평형상태에 있기 때문에, 항상 약간의 유리 Mg2 +가 존재할 수 있다. 하나의 구현예에서, 유리 Mg2 +의 수준이 상기 반응 혼합물로, 바람직하게, 마그네슘 염으로서 유리 Mg2 + 이온의 공급을 조절함으로써 조절된다.
폴리머라제는 롤링 서클, 가닥 치환 기작을 통한 원형 DNA 주형을 증폭할 수 있고, 또한 상기 주형의 장쇄 선형 콘카타머 반복을 생성할 수 있다. 상기 롤링 서클 가닥 치환 폴리머라제가 바람직하다. 예를 들면, Phi29 DNA 폴리머라제는 원형 DNA 주형을 증폭하여, 길이가 77 킬로베이스 미만의 선형 반복을 생성할 수 있다고 보고되었다. 상기 매우 긴 분자는 폴리머와 같이 거동하고, 상기 점도를 증가시킴으로써 상기 반응의 유동 특성을 현저하게 변경할 수 있다. 상기 점도의 증가는 합성된 DNA의 농도와 직접 관련될 수 있는 압력에서의 변화에 의해서 측정될 수 있다. 상기 측정이 연속적으로 이루어질 수 있거나, 또는 설정된 시간에서 상기 반응의 상태를 나타내는데 사용될 수 있는 신호, 바람직하게는 온라인 신호를 제공할 수 있다. 부가의 뉴클레오티드의 공급이 상기 압력 신호에 대응하여 조절될 수 있다. 상기 반응 혼합물의 파라미터를 나타내는 신호에 대응하여, 뉴클레오티드의 공급이 상기 반응 혼합물의 수득율 및/또는 생산성을 증가시키기 위해서 이루어질 수 있다.
DNA 농도를 추정하기 위한 압력 차이 측정은 Syto 염료와 같은 형광 화학 시약의 결합에 기반한 분석에 대해서 중요한 장점을 갖는다. 이중 가닥 DNA에만 결합하는 상기 시약과는 달리, 압력 차이 측정은 단일 가닥 형태를 포함하는 시료에서 DNA의 오차 추정 (erroneous estimates)을 제공하지 않는다.
하나의 구현예에서, 뉴클레오티드의 공급이 신호에 대응하여 조절된다. 상기 신호는 임의의 적당한 신호일 수 있고, 또한 온라인 신호일 수 있다. 상기 신호는 DNA의 농도에 관련이 있고, 특히 상기 반응 혼합물 중 DNA의 전체 농도의 추정에 기반하는 것이 바람직하다. 상기 신호는 대안으로서 상기 반응 혼합물의 부피와 관련될 수 있다. 부가의 금속 이온의 공급이 신호에 대응하여 유사하게 조절될 수 있다. 상기 신호는 동일하거나 또는 상이할 수 있다.
바람직한 신호는 상기 반응 혼합물의 점도와 관련된 것이다. 상기 반응 혼합물의 점도는 상기 반응 혼합물 중 DNA의 농도의 추정을 제공할 수 있다. 상기 점도가 임의의 적당한 수단으로 점도계에 의해서 측정될 수 있다. 상기 점도가 압력에서 변화에 의해서 측정되는 것이 바람직하다. 상기 압력 차이가 압력 센서 (pressure sensor), 압력 트란스듀서 (pressure transducers), 압력 트란스미터 (pressure transmitters), 압력 인디케이터 (pressure indicators), 간극수압계 (piezometers) 또는 마노미터 (manometers)에 의해서 측정될 수 있다. 하나의 구현예에서, 상기 압력 차이가, 상기 반응 혼합물의 일부를 제거 및 대체하는 왕복 펌프를 사용하여 형성될 수 있다. 본원에 개시된 바와 같이 비-침입적 형태로 실시간으로 상기 반응이 모니터되는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법이 회분식 반응으로 실시될 수 있다. 상기 구현예에서, 상기 반응 혼합물이 반응기 중에 존재한다. 부가의 뉴클레오티드 및/또는 부가의 금속 양이온의 공급이 상기 반응기로 공급될 수 있다. 그러므로, 상기 공정이 공급-회분식 반응기 (fed-batch reactor)에서 실시될 수 있다. 대안으로서, 상기 공정이 연속식 유동 반응기에서 실시될 수 있다. 상기 반응기는 당분야의 통상의 지식을 가진 자에게 알려져 있다. 특히 바람직한 형태가 하기에 제시되었다.
구현예에서, 하나 이상의 처리 효소가 하나 이상의 개별 첨가, 즉 분취량으로 상기 반응 혼합물로 공급된다. 첨가 또는 분취량의 임의의 수가 상기 구현예의 범위내에 있다. 그러므로, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상, 즉 20-25, 25-30, 35-40회의 첨가 또는 분취량이 상기 반응 혼합물로 첨가될 수 있다. 그러므로, 1-50, 1-40, 1-30 또는 1-20회의 분취량이 상기 처리 효소를 공급하기 위해서 사용될 수 있다. 분취량은 상기 공정에 대해서 요구되거나 또는 상기 공정으로 첨가된 처리 효소의 전체 양의 일부일 수 있다. 상기 분취량 중 처리 효소의 부피 및/또는 농도가 상기 공정의 요건에 따라 가변할 수 있다. 분취량은 소량의 처리 효소, 즉 처리 효소의 특정 농도 또는 양이 상기 반응 혼합물 중에 존재하기에 충분한 양으로 포함할 수 있다. 상기 처리 효소가 규칙적 간격 (즉, 30분 마다, 60분 마다, 90분 마다, 120분 마다, 180분 마다 또는 240분 마다 또는 임의의 다른 적당한 시간)으로 분취량으로서 상기 반응 혼합물로 공급될 수 있다. 상기 처리 효소가 불규칙한 간격으로 분취량으로서 상기 반응 혼합물로 공급될 수 있다. 예를 들면, 처리 효소의 각 공급들 사이의 시간은 초기에 더 길 수 있고, 그 후에 상기 공정이 진행되면 감소될 수 있거나, 또는 그 반대의 경우도 가능하다.
처리 효소가 상기 반응 혼합물에서 그러한 필요에 대응하여 공급될 수 있다. 전술한 바와 같이, 상기 반응 혼합물 중 DNA의 농도 및/또는 DNA 합성 속도를 포함하는 몇가지 파라미터에 의해서 상기가 결정될 수 있다.
상기 처리 효소가 상기 반응 혼합물로 물리적으로 제공될 수 있고, 즉 이는 상기 반응 혼합물의 외부에 있다. 상기 효소가 개별 저장소에 보유될 수 있고, 또한 상기 반응 혼합물에 조절된 방식으로 방출될 수 있다.
상기 처리 효소, 예컨대 프로텔로머라제는 단일 전환수 (turnover)를 가지며, 처리 효소의 양을 조절하는 것은 상기 효소에 의해 처리된 DNA의 양을 직접 조절하는 것이 바람직하다. 상기 처리 효소가 상기 부가의 뉴클레오티드와 함께 첨가되거나 또는 상기 뉴클레오티드의 부가 후에 첨가될 수 있다. 부가의 금속 이온이 또한 요구된다면, 상기 처리 효소의 첨가 후에 이들이 첨가되는 것이 바람직하며, 상기 DNA의 처리는 부가의 금속 이온이 첨가되기 전에 실시된다.
상기 공정이 임의의 적당한 장치에서 실시될 수 있다. 상기 공정을 실시하기에 적당한 특정 장치가 하기에 개시될 것이다. 합성 장치(1)가 일체형 섀시 (self-contained chassis, 11) 상에 구성되고, 주요 구성 요소에 접근할 수 있도록 개방가능한 프론트 커버 (front cover, 12)가 구비된다. 상기 프론트 커버(12)가 바람직하게 투명한 물질로 이루어졌지만, 과도한 광 수준으로부터 상기 반응 성분들을 보호하기 위해서 음영 (tint)을 줄 수 있다. 또한, 오염 물질 유입을 제한하는 역할을 한다. 상기 장치에, 예를 들어, 상기 장치의 측면에, 외부적으로 접근가능한 전원 스위치 및 전원 입력(13)이 구비된다. 또한, 미국 텍사스 National Instruments Corporation에 의해 공급되는 LabviewTM와 같은 실험실 자동화 소프트웨어 (laboratory automation software)를 실행하는 범용 컴퓨터와 상기 장치를 통신하고 및/또는 이에 의해 조절되도록 하는 입력/출력 포트(14)가 있다. 조작 표시 등(15)이 장치의 정면에서 볼 수 있는 위치에 제공되고, 상기 장치가 작동 중인지의 여부를 표시한다.
상기 합성 장치의 중심 요소는 30 ml 초과, 예컨대, 50 ml, 75 ml 또는 120 ml의 부피를 가질 수 있는 자켓이 달린 (jacketed) 반응 용기(2)이다. 상기 반응 용기의 부피는 300 ml 미만일 수 있다. 상기 반응 용기의 부피는 상기 장치의 의도된 용도 및 회분식으로 의도된 생성물의 양, 또는 연속 공정에서 생산 속도에 따라 선택될 수 있다. 분명하게, 상기 반응 용기의 크기는 회분식으로 제조될 수 있는 생성물의 양으로 상한이 설정된다.
상기 반응 용기의 애스펙트비 (aspect ratio)는 8:1 이하, 또는 7:1, 6:1 또는 5:1 이하일 수 있다. 상기 반응 용기가 너무 길면, 반응 혼합물의 회수 및 복귀에 의해서 상기 내용물을 철저히 혼합하는 것이 더 어려워진다. 상기 반응 용기가 너무 넓으면, 특히 더 작은 반응 부피로 온도를 전체에 균일하게 유지하는 것이 더욱 어려워진다. 특히 상기 반응 혼합물이 95 ℃로 가열되는 경우 상기 혼합물 전체에 걸쳐 원하는 온도를 얻는데 상기 혼합물의 교반이 도움을 줄 수 있다. 상기 한계내의 애스펙트비를 갖는 반응 용기는 반응 성분의 상이한 양으로 조정가능하다.
본 발명의 구현예에서 사용될 수 있는 반응 용기(2)는 도 3에서 단면도로 개시된다. 상기 반응 용기(2)는 자켓(25)으로 둘러싸인 내부 용기(23)를 포함한다. 내부 용기(23)의 내용물의 온도를 조절하기 위해서, 내부 용기(23)와 자켓(25) 사이의 공간(26)을 통해서 온도 조절 유체가 순환된다. 하부 포트(27) 및 상부 포트(28)가 상기 내부 용기를 선택 밸브들 (32b, 32a) 각각에 연결하도록 제공된다.
상기 내부 용기(23)는 예를 들어 20 내지 50 mm의 범위, 바람직하게 25 내지 35 mm의 범위의 직경(D1)의 실린더 형태를 갖는 주요 부분, 및 상기 하부 포트(27)에 상기 원통형 부분를 연결하는 테이퍼링 부분 (tapering part, 24)을 가질 수 있다. 상기 내부 용기의 전체 높이(H1)는 150 mm 내지 300 mm, 바람직하게 200 mm 내지 250 mm의 범위내에 있을 수 있다. 상기 테이퍼링 부분(24)의 높이는 5 mm 내지 20 mm, 바람직하게는 10 mm 내지 15 mm의 범위일 수 있다. 상기 테이퍼링 부분의 측벽의 각도는 상기 내부 용기의 축에 대해 30°내지 60°의 범위, 바람직하게는 약 45°일 수 있다. 상기 하부 포트(27)의 직경(D2)은 5 mm 내지 10 mm의 범위내에 있을 수 있다.
상기 반응 용기는, 예를 들어 그 높이를 통해서 하향하는 테이퍼 또는 중앙 팽창부를 갖는 비-일정한 단면을 가질 수 있다.
상기 반응 용기로 외부 자켓을 통해서 온도 조절 유체의 흐름에 의해서 상기 반응 용기의 온도가 조절될 수 있다. 상기 온도 조절 유체가 재순환하는 온도 조절 장치(22)에 의해서, 유입구(2a)에 의해서 공급되고, 출구(2b)로부터 제거될 수 있다. 상기 재순환하는 온도 조절 장치가, 상기 유체를 가열 및/또는 냉각에 의해서 온도 조절 유체의 온도를 조절한다. 상기 반응 용기가 예컨대, 흡열 또는 발열 반응이 발생함에도 불구하고, 일정 온도로 유지될 수 있거나, 또는 원하는 온도 프로파일을 따르도록 조절될 수 있다. 상기 온도 조절 유체는 물 또는 오일일 수 있다. 상기 온도 조절 유체가 상기 장치의 섀시에 구비된 포트(16)를 통해서 공급될 수 있다. 적당한 재순환하는 온도 조절 장치는 미국 펜실바니아주의 Julabo USA에 의해서 제조된 Presto A30 온도 조절 시스템이다. 본 발명의 구현예에서, 상기 재순환하는 온도 조절 장치(22)는 옴 가열기 (ohmic heaters) 및/또는 펠티어 장치 (Peltier devices)를 포함한다. 구현예에서, 상기 반응 용기의 온도가 0.01 ℃의 정확도 (precision)로 4 ℃ 내지 95 ℃의 범위의 온도로 조절가능하다.
온도-조절된 저장소(4a-4c)가 상기 합성 반응에 사용될 반응 성분들을 위해 제공될 수 있다. 상기 반응 성분들이 시린지들(42a-42c), 예컨대 일회용 폴리프로필렌 시린지에 보유되고, 온도 조절 장치(41a-41c)에 장착된다. 상기 구현예에서 온도 조절 장치는 상기 시린지(42a-42c)를 밀접하게 수납하기 위한 보어 (bores)를 갖춘, 알루미늄과 같은 전도성 물질의 블록을 포함한다. 상기 블록과 상기 시린지 사이에 열 전도성을 증가시키는 것을 원한다면 열전도성 페이스트가 제공될 수 있다. 옴 가열기 또는 펠티어 장치와 같은 가열/냉각 장치가 열 전도성 블록에 부착되어, 그 온도를 조절하여, 상기 저장소(42a-42c)에 보관된 상기 반응 성분들의 온도를 조절한다.
온도 조절 장치(41a-41c)가 상기 보관된 반응 성분들을 가열 또는 냉각하는데 사용될 수 있다. 일부 반응 성분들이 그 분해를 방지하기 위해서 저온, 예컨대 약 4 ℃로 바람직하게 유지된다. 프라이머가 증가된 온도에서 보관될 수 있어서, 프라이머 다이밍 (primer diming)을 방지 및/또는 감소시킬 수 있다. 상기 반응 용기로 첨가되기 전에 주형 및 프라이머를 변성 및 어닐 (anneal)하기 위해 상기 저장소가 또한 가열될 수 있다. 상기 반응 용기의 주요 온도 조절에 의해서, 상기 온도 조절된 저장소가 일정 온도로 유지될 수 있거나, 또는 원하는 온도 프로파일에 따라서 상기 반응 용기에 첨가되기 직전에 반응 성분을 가열시킬 수 있다. 구현예에서, 상기 온도-조절된 저장소의 온도가 0.01 ℃의 정확도로 4 ℃ 내지 95 ℃의 범위내에서 독립적으로 조절가능하다.
하나 이상의 인-라인 가열기 (in-line heaters) (도시되지 않음)가, 상기 반응 용기로 첨가되기 전에 프라이머와 같은 반응 성분의 온도를 예컨대 95 ℃까지 올리기 위해서 제공될 수 있다. 저장소(4a-c, 5a-g) 및 선택 밸브(32c) 사이 및/또는 선택 밸브(32a) 및 반응 용기(2) 사이 도관 (conduit)에 상기/또는 임의의 가열기가 제공된다.
상기 구체화에서, 상기 온도 조절된 저장소들 중 하나(4c)는, 단일 온도 조절 블록(41c)과 열 접촉되는 2개의 저장소 시린지(42c 및 42c')를 포함한다. 2개의 반응 성분들이 동일한 온도에서 유지될 필요가 있는 경우 또는 단일 반응 성분의 더 큰 부피가 원하는 반응을 위해 필요한 경우에 상기가 유용하다.
상기 장치는 또한 온도 조절 장치를 구비하지 않은 복수의 부가의 저장소(5a-5g)를 포함한다. 상기 구현예에서, 7개의 이러한 저장소가 있고, 다른 구현예에서, 더 많거나 또는 더 적게 제공된다. 상기 부가의 저장소들(5a-5g)은 또한 시린지, 예컨대 유리 또는 폴리프로필렌 시린지를 포함할 수 있고, 비었을 때 제거되거나 또는 폐기될 수 있다. 상기 시린지의 사용은, 반응 성분들이 회수될 때, 상기 저장소의 부피가 자동으로 감소되기 때문에 유익하다. 접을 수 있는 (collapsible) 백(bags) 또는 튜브(tubes)에 의해서 유사한 효과가 달성될 수 있다. 견고한 용기가 사용된다면, 오염물이 유입되는 것을 방지하기 위해서 대기로의 임의의 통풍구에 필터가 제공되는 것이 바람직하다.
편리하게, 회전 스탠드(51)가 저장소(5)를 장착하기 위해서 제공된다. 반응 성분이 다량으로 필요한 경우, 상기 장치에 외부 저장소로 연결하기 위한 포트가 제공될 수 있다. 바람직하게, 상기 저장소를 상기 선택 밸브에 연결하기 위해 필요한 도관의 길이를 최소화하도록 상기 장치가 배치된다. 상기 도관이 상기 저장소로부터 분리가능할 수 있으며, 그 후에 헹굼 (rinsing)을 위한 세척액 또는 물의 공급에 연결되는 매니폴드 (manifold)에 부착될 수 있다. 이러한 방식으로, 상기 전체 장치가 인 시추 (in situ)로, 즉 해체되지 않고 씻어내려 세척될 수 있다.
저장소들 (4a-c 및 5a-g)이 3 ml 내지 10 ml, 예컨대 약 5 ml의 용량 (capacity)을 가질 수 있다. 하나 이상의 더 큰 저장소가 예컨대 버퍼 용액을 위해서 제공될 수 있고, 상기는 10 ml 내지 500 ml, 예컨대 약 250 ml의 용량을 갖는다.
상기 반응 용기로 반응 성분의 공급이 왕복 시린지 펌프 (3a)에 의해서 실시될 수 있다. 상기 펌프를 공급 펌프라고 한다. 상기는 시린지(31a), 예컨대 유리 또는 폴리프로필렌 시린지를 포함하고, 이는 솔레노이드(33a)에 의해서 구동되고, 조절가능한 선택 밸브(32a)에 연결되어서 상기 저장소 및 상기 반응 용기 각각에 상기 솔레노이드를 선택적으로 연결한다. 상기 반응 용기에 반응 성분의 조절된 양을 첨가하기 위해서, 상기 선택 밸브(32a)가, 먼저 상기 관련 저장소에 상기 펌프 시린지를 연결하기 위해서 사용되고, 그 후에 상기 솔레노이드가 상기 반응 성분의 적절한 부피를 시린지로 끌어들이기 위해 작동된다. 다음, 상기 선택 밸브(32a)가 상기 반응 용기(2)로 상기 시린지(31a)를 연결하기 위해서 사용되고, 상기 솔레노이드가 반대로 상기 시린지 내용물을 상기 반응 용기로 밀어내었다. 이러한 배치로, 상기 반응 용기에 다수의 시린지 펌프 및 다수의 유입구를 필요로 하지 않고 원하는 반응 성분의 양을 순차로 상기 반응 용기에 신속하게 첨가하는 것이 가능하다. 그러나, 다수의 반응 성분들을 상기 반응 용기에 동시에 첨가하는 것이 바람직하다면, 다수의 공급 펌프(3a)를 제공하는 것이 가능하다. 이는 상기 반응 용기에 첨가하기 전에 특정 반응 성분을 절대적으로 분리할 필요가 있는 경우에 바람직할 수 있다.
또한, 상기 반응 용기의 내용물을 교반할 뿐만 아니라 반응 공정 중에 시료채취를 목적으로 또는 상기 반응 종료시, 반응 혼합물 또는 생성물을 제거하기 위해서 제2 왕복 시린지 펌프(3b)가 사용될 수 있다. 상기 펌프는 회수 펌프 (withdrawal pump)라고 하고, 솔레노이드(33b)에 의해서 구동되는 시린지(31b)를 포함한다. 상기 제2 시린지 펌프(3b)가 제2 선택 밸브(32b)를 통해서 상기 반응 용기의 바닥부에서 출구에 연결된다. 상기 반응 용기의 내용물을 교반하기 위해서, 상기 제2 선택 밸브(32b)가, 상기 시린지(31b)를 상기 반응 용기로 연결하기 위해서 사용되고, 상기 반응 혼합물의 양이 상기 반응 용기로부터 회수되고, 그 후에 상기로 복귀시킨다. 회수된 상기 반응 혼합물의 양 및 복귀되는 속도가 실시되는 교반의 정도를 조절하기 위해서 조절될 수 있다. 이러한 교반이 반응 과정을 통해서 연속적으로, 주기적으로 또는 반응 성분의 첨가와 관련된 특정 시간에 실시될 수 있다.
대안으로서 또는 부가로, 상기 제2 왕복 시린지 펌프(3b)가 또한 저장소(4a)로 연결될 수 있고, 또한 상기 반응 용기(2)로 상기 저장소내 보관된 상기 반응 성분을 공급하기 위해서 사용될 수 있다.
반응 용기(2)와 선택 밸브(32b) 사이 또는 선택 밸브(32b)와 회수 펌프(3b) 사이의 도관에 연결된 짧은 스퍼 (spur) 상에 압력 센서(82)가 제공될 수 있다. 상기 반응 용기(2)로부터 또는 상기 반응 용기(2)로 물질을 회수 및 복귀하는 중에, 상기 센서(82)에 의해 측정된 압력은 전달될 혼합물의 점도를 나타내고: 압력이 높을수록, 점도도 더 높아진다. 특히, 물질의 순환하는 회수 및 복귀 중에 압력 변화의 진폭은 상기 반응 혼합물의 점도를 나타낸다. 압력과 점도 사이의 정확한 관계는 물질의 회수 또는 복귀 속도, 사용된 도관의 직경 및 상기 반응 용기의 기하학적 구조를 포함하는 다양한 요소에 따라 달라진다. 상기 관계는 이론적으로 또는 검정에 의해 결정될 수 있다. 일 구현예에서, 정확한 관계가 반드시 필요한 것은 아니고, 압력 센서(82)로부터의 신호가 그 정확한 점도를 알지 못하고 상기 반응 혼합물에서 변화를 검출하는데 간단하게 사용될 수 있다. 생성물 형성으로 인해 점도가 증가하는 반응에서, 상기 압력 센서로부터의 신호를 사용하여 상기 반응을 조절할 수 있다. 상기 압력 신호에 기반하여 적당한 양 또는 적당한 속도로 상기 하나 이상의 저장소들로부터 하나 이상의 적당한 시약들을 전달하기 위해 상기 펌프를 작동시킴으로써, 생성물 수득율을 증가시킬 수 있다. 다른 경우에, 상기 압력 신호는 상기 반응의 완료 또는 상기 반응에서 단계를 나타낼 수 있으므로 생성물의 수득 또는 다음 단계를 위한 성분들의 첨가를 유발시키는데 사용될 수 있다.
상기 혼합물 중 DNA 물질이 전단력에 의해 손상되지 않도록, 상기 반응 용기로 혼합물의 회수 및/또는 복귀의 속도를 조절하는데 상기 압력 센서(82)로부터의 신호가 사용될 수 있다. 압력 한계가 초과되지 않도록 혼합물의 회수 및/또는 복귀의 속도가 조절될 수 있다. 상기 압력 한계는 점도에 따라 달라질 수 있다.
예를 들어 상기 반응 용기로부터 반응 생성물인 물질을 제거하기 위해, 상기 회수 펌프(3b)가 상기 제2 선택 밸브(32b)에 의해서 상기 반응 용기로 먼저 연결되고, 상기 솔레노이드가 상기 반응 용기(2)로부터 물질을 회수하기 위해서 상기 시린지의 피스톤을 인출하도록 작동한다. 상기 회수 펌프가 그 후에 상기 제2 선택 펌프에 의해서 출구 포트(7)에 연결되고, 상기 솔레노이드(33b)가 상기 출구 포트(7)를 통해서 상기 수집된 물질을 배출하도록 작동된다.
출구 포트(7)는 예를 들어 반응 생성물용 용기, 시료 용기, 측정 장치 또는 임의의 다른 장치에 연결될 수 있다. 또한, 측정을 위해 제거된 시료가 측정 후에 상기 반응 용기로 복귀될 수 있다.
회수 펌프(3b)는 공급 펌프(3a)보다 더 큰 용량을 가질 수 있으므로, 예를 들어, 1회의 펌핑 작업으로 전체 반응 용기를 비울 수 있다. 상기 회수 펌프(3b)를 위한 그러한 큰 용량은 또한 전체 시스템을 통해 다량의 세척 용액 및/또는 탈이온수를 플러싱함으로써 장치를 세정하는데 도움을 줄 수 있다. 이를 위해, 상기 장치는 충분한 양의 세척 용액 및 탈이온수를 보유하기 위한 부가의 대형 저장소가 구비될 수 있다.
단일 펌프가 반응 성분들을 공급하고, 상기 반응 혼합물을 교반하고, 또한 반응 혼합물 및/또는 생성물을 회수하기 위해 사용될 수 있다.
상기 공급 펌프(3a) 및/또는 회수 펌프(3b)는 연동 펌프 (peristaltic pump)와 같은 펌프의 다른 형태를 포함할 수 있다.
상기 장치는 일방향 밸브가 구비될 수 있는 통풍구(62)를 통해 대기로 연결되는 폐기물 용기(6)를 또한 포함한다. 폐기물 용기(6)가 반응 용기(2)의 상부에 연결되어 통풍구를 제공하고, 또한 반응 용기(2)에서 압력이 상승되는 것을 방지한다. 또한, 선택 밸브들(32a, 32b)과 폐기물 용기(6)를 연결하기 위한 도관이 제공되어서, 상기 반응 용기로부터 생성물 및 임의의 사용되지 않고, 또한 원하지 않는 반응 성분들을 덤핑 (dumping)시킬 수 있다. 상기 반응 용기로 원하는 양을 정확하게 전달할 수 있도록 도관의 프라이밍으로부터 소량의 반응 성분들 뿐만 아니라 인-시추로 세척 및 헹굼 중에 세척액 및 헹굼액을 수용하기 위해서 상기 폐기물 용기가 또한 사용될 수 있다.
폐기물 용기(6)가 생략될 수 있다. 이 경우, 반응 용기(2)에 안전 밸브를 제공하고, 선택 밸브들(32a, 32b)로부터 외부 배수구로의 연결을 제공하는 것이 바람직하다.
상기 온도 조절 장치(41a-c), 선택 시린지(32a-b), 솔레노이드(33a-b), 온도 조절 장치(22) 및 압력 센서(82)에 전기적으로 연결되는 조절기(8)에 의해서 상기 장치의 작동이 조절되어서, 상기 장치의 구성요소들을 조절할 수 있다. 조절기(8)는 또한 실시될 공정의 전체 조절을 위해 외부 컴퓨터(9)에 연결할 수 있는 인터페이스(81)를 포함한다.
프라이밍 (priming), 시료채취 (sampling), 수득 (harvesting), 헹굼 (rinsing) 및 세척 (cleaning)과 같은 일반적으로 사용되는 특정 실시를 수행하도록 상기 조절기(8)가 미리 프로그램될 수 있다. 일 구현예에서, 조절기(8)는 단순히 외부 컴퓨터(9)로부터 장치의 상이한 구성 요소로 명령을 전달한다. 전술된 실시가 외부 컴퓨터의 제어하에 또는 수동으로 수행될 수 있다.
상기 장치를 프라이밍하는 단계는 사용될 각각의 저장소로부터 반응 성분을 회수하여, 상기 저장소와 상기 선택 밸브 사이의 도관이 각각의 반응 성분들로 충전되도록 하는 단계를 포함할 수 있다. 이는 상기 반응 용기로 전달되는 반응 성분들의 양에서 정확도를 증가시키고, 오염 가능성을 감소시키기에 바람직하다. 한 구현예에서, 상기 반응 혼합물을 시료채취하는 단계는 상기 반응 과정 중에 외부 용기 또는 센서로 선정된 양의 상기 반응 성분을 제거하는 단계를 포함한다. 상기 반응 용기에 시료를 복귀시키는 것이 몇가지 경우에서 가능하다. 수득은 회분식 공정의 종료시 또는 연속 공정의 적절한 시점에 상기 반응 생성물의 일부 또는 전부를 회수하는 단계를 포함할 수 있다. 헹굼은 사용된 도관 및 저장소를 순수한 물로 헹굼하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 장치를 세척하는 단계는 도관 및 저장소를 세척 용액으로 헹구는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, DNA 주형, 적어도 하나의 폴리머라제, 하나 이상의 프라이머 및 뉴클레오티드가 반응 용기에 첨가되어서 반응 혼합물을 형성한다. 상기 반응 혼합물의 일부 또는 부분이 상기 반응 용기로부터 회수하고, 이로 복귀되어서, 상기 반응 혼합물을 교반하고, 이를 혼합시킨다. 상기 반응 종료시, DNA가 상기 반응 용기로부터 회수된다. 한 구현예에서, 상기 반응 혼합물이 상기 반응 용기의 하부에, 바람직하게 상기 반응 용기의 최하부에 구비된 포트로부터 회수된다. 한 구현예에서, 상기 반응 혼합물의 일부가 전체 반응 혼합물의 50% 이하, 바람직하게는 40% 이하, 바람직하게는 30% 이하까지 양이 제거된다. 한 구현예에서, 상기 반응 혼합물의 일부가 상기 전체 반응 혼합물의 5% 이상, 바람직하게는 10% 이상, 바람직하게는 20% 이상까지 양이 제거된다.
한 구현예에서, 상기 반응 혼합물의 개시 부피는 10ml 내지 10ℓ, 바람직하게 10ml 내지 100ml, 100ml 내지 1000ml 또는 1ℓ 내지 10ℓ이다.
본 발명은 몇 개의 비제한적인 실시예를 참조로 서술될 것이다.
실시예
물질 및 방법
하기 실시예에서 실시된 DNA 증폭은 프로텔로머라제 TelN에 대한 표적 부위를 포함하는 ds 원형 주형에 작용하는 Phi29 DNA 폴리머라제를 사용하여 실시되었다. 상기 Phi29 폴리머라제는 프로텔로머라제 TelN (Touchlight Genetics)에 의해 원하는 닫힌 선형 DNA 생성물로 처리될 수 있는 상기 원형 주형(콘카타머)의 긴 선형 반복을 생성한다. Phi29 DNA 폴리머라제에 의한 콘카타머 DNA의 형성으로 그 장쇄 길이(최대 77킬로베이스까지 보고됨)에 의해 상기 반응 점도를 증가시키고, 상기 이중가닥 콘카타머 DNA를 프로텔로머라제 TelN으로 처리하여, 훨씬 짧은 길이 (하기 실시예에서 2 킬로베이스 내지 3 킬로베이스) 때문에 점도가 감소된다.
실시예 1 및 3에서, DNA가 본원에 개시되고, 도 1 내지 3을 참조로 하는 장치에서 제조된다.
실시예 1: 압력 차이 측정으로부터 반응에서 제조된 DNA의 온라인 정량화
먼저, 상기 장치가 세척되고, 오염물질이 제거되었다. 튜브들이 상기 10개의 시약 저장소(42a, 42b, 42c', 42c, 5a 내지 5g)로부터 분리되고, 루어 피팅 (Luer fittings)을 통해 10% 소듐 히포클로리트 (sodium hypochlorite) 용액을 포함하는 120ml의 저장소로부터 공급되는 10개의 포지션 매니폴드 (position manifold)에 재연결되었다. 유사하게, 10% 소듐 히포클로리트 용액의 60ml의 저장소가 선택 밸브(32b)로부터 출구 포트(7)에 부착되었다. 상기 선택 밸브들(32a 및 32b)의 위치 및 각각 5ml의 유리 시린지들(31a 및 31b)에서 솔레노이드들(33a 및 33b)의 작용을 조절함으로써, 상기 반응 용기(2) 자체를 포함하는 전체 시스템에 소듐 히포클로리트 용액으로 완전히 채워서, 죽은 공간을 없앴다. 각 튜브를 통해 최소 5ml의 용액이 채취되었다. 상기 반응 용기 (용량 120ml)가 열 순환기(22)상의 조절 작용에 의해 50℃로 가열되고, 상기 시스템이 30분 동안 상기 상태로 유지되었다. 상기 과정으로 모든 공급 튜브 및 상기 반응 용기 자체내의 모든 오염된 DNA가 완전히 분해되도록 하였다.
유사하게, 전술한 상기 선택 밸브 및 솔레노이드를 조절하기 위한 적당한 프로그램을 사용함으로써, 소듐 히포클로리트 용액을 상기 폐기물 용기(6)로 분배시킴으로써 상기 전체 시스템을 비웠다. 상기 저장소내 소듐 히포클로리트를 탈이온수로 대체한 후 상기 과정을 5회 반복하여서, 상기 전체 시스템으로부터 임의의 잔류하는 소듐 히포클로리트를 완전히 제거하여, 사용 준비되었다.
그 후에 상기 튜브들이 상기 매니폴드로부터 분리되고, 루어 락 피팅 (Luer lock fittings) (용량 5ml 내지 20ml)에 의해 멸균 일회용 폴리프로필렌 시린지를 포함하는 10개의 시약 저장소에 재연결되었다. 하기에 개시된 바와 같이, 상기 시린지들은 개별 반응 성분을 최소부피 2ml로 포함하였다. 그렇지 않으면, 상기는 플런저 (plungers)를 완전하게 낮추면서 비웠다. 저장소(5d)는 병렬로 두 개의 60ml의 시린지로 이루어지고, 총 120ml 용량의 탈이온수를 제공할 수 있다. 시약들을 포함하는 시린지에서, 충전 후에 액체가 상기 시린지 출구로부터 배출될 때까지 상기 플런저를 수동으로 낮춤으로써 각 시린지 배럴내 공기가 배출되었다. 상기 과정 중에, 상기 시린지 출구가 상기 시린지 플런저 위로 수직으로 유지되어서, 상기 배럴 중 모든 공기를 배출시켰다.
첨가 순서 저장소 저장소 온도 ℃ 시약 농도 분배된 부피 반응 혼합물 중 농도
1 5a 실내온도 원형 DNA 주형
proTLx-K N3X2 Cal09 HA
(도 9)
(Touchlight Genetics)		 100㎍/ml 7ml 7㎍/ml
2 5b 실내온도 단일
올리고뉴클레오티드 프라이머(11-mer)
5' gcgtataat*g*g 3'
* 포스포로티오에이트 연결
(Oligo Factory)		 4.5mM 555㎕ 25μM
3 5c 실내온도 NaOH 1M 1ml 10mM
4 5f 실내온도 10x 완충액
300mM Tris-HCl, pH 7.5
300mM KCl
75mM MgCl2
50mM (NH4)2SO4
20mM DTT		 10ml
30mM Tris-HCl, pH 7.5
30mM KCl
7.5mM MgCl2
5mM (NH4)2SO4
2mM DTT
5 42c 4.0 Phi 29 DNA 폴리머라제
(Touchlight Genetics)		 1 mg/ml 1.2ml 12/㎍/ml
6 42c' 4.0 피로포스파타제
(Enzymatics)		 4483유닛/ml 20㎕ 0.9유닛/ml
7 5e 실내온도 dNTPs
Li+ 염
(Bioline)		 100mM 2ml 2mM
(각dNTP의 0.5mM)
8 5d 실내온도 H2O 78.225ml
저장소들(42c 및 42c') 각각에서 상기 효소 시약인 Phi29 DNA 폴리머라제 및 피로포스파타제가 온도 조절 장치(41c)에 의해 4 ℃로 안정한 조건하에 유지되었다. 모든 다른 시약들이 실내 온도에서 유지되었다.
반응 용기(2)로 시약들을 정확하게 분배하기 위해서, 상기 시약 저장소와 상기 선택 밸브들(32a 및 32b) 사이의 튜브들이 순차적으로 매우 적은 양의 시약을 회수하고, 또한 폐기물 용기(6)로 분배시킴으로써 프라이밍되었다.
상기 DNA 주형을 변성시키고, 또한 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머를 결합시키기 위해서, 저장소들(5a, 5b 및 5c)로부터의 시약들이 (시린지(31a)상에 솔레노이드(33a)의 작용에 의해서) 선택 밸브(32a)를 통해서 밀폐된 빈 5ml의 시린지(저장소(42b))로 분배되었다. 상기 저장소의 온도가 온도 조절 장치(41b)에 의해서 조절되었다. 41b 상에서 조절 작용이 사용되어서 3분동안 95 ℃로 그 온도를 올리고, 그 후에 30 ℃로 냉각시켰다. 저장소(42b) 중 조합된 반응 성분들이 선택 밸브(32a)에 의해서 반응 용기(2)로 분배되었다. 남아 있는 5개의 반응 성분들이 표 1에 보여진 순서로 선택 밸브(32a)에 의해서 순차로 분배되어서, 반응 용기(2) 중 최종 부피가 100ml이었다. 반응 용기(2)의 온도가 열순환기(22)에서 조절 작용에 의해서 30 ℃로 설정되었다. 상기 반응 성분들이 상기 설정된 온도보다 2 ℃ 초과 더 높은 표면 온도에 노출되지 않았다.
상기 반응 성분들의 혼합이 솔레노이드(33b)에서 조절 작용에 이어서 혼합 시린지(31b)의 이동에서 조절 작용에 의해 달성되었다. 상기 시린지 작용이 5ml의 반응 성분들을 반응 용기(2)로부터 회수되고, 또한 이로 복귀되도록 조절되었다. 상기 혼합은 55ml/분의 회수/분배 속도로 29분의 간격으로 1분 동안 작동되는 상기 시린지에 의해서 불연속적이었다.
반응 용기(2)와 시린지(31b) 사이의 튜브에서의 압력 변화가 진공 및 압력 센서 (Model PX409-2.5CGUSBH, Omega Engineering Limited, Manchester, M44 5BD, UK)에 의해서 측정되었다. 상기 센서는 -2.5 내지 + 2.5 psi의 압력 차이를 측정하고, 1/8 인치 직경 PTFE 튜브의 짧은 부분을 사용하여 T-피스를 통해 연결되었다. 상기 센서로부터의 출력 신호가 실시간으로 모니터링되고, 제조자에 의한 소프트웨어 서플라이어 (software supplier)를 사용하여 상기 반응기를 조절하는 컴퓨터에 로그온되었다. 상기 혼합 시린지의 왕복 작용은 양의 값과 음의 값 사이에서 진동하는 압력 센서의 출력을 발생한다 (혼합 시린지의 당김/밀기 스트로크). 각 혼합 시점에서 기록된 압력 데이터의 각 분에 있어서, 최소 및 최대 압력 판독값이 20초의 3 세트에 대해서 산출되었다. 각 세트에 대해 상기 최소값을 상기 최대값으로부터 빼고, 평균이 산출되었다. 예컨대 시린지 속도, 튜브 재료, 내부 직경 및 길이, 및 선택 밸브 크기 및 기하학적 형태와 같은 모든 다른 변수를 고정한 경우, 피크 높이에서 임의의 변화는 상기 반응 성분의 점도 변화로 인한 것일 수 있다. 주위 온도와 압력 변동에 기인한 매우 작은 압력 변화는 압력 차이 계산에서 보정되지 않았다. 분석에 사용된 첫 번째 데이터 포인트는 상기 시스템이 완전히 평형을 유지하는 약 45 분 이후였다.
도 4는 Phi29 DNA 폴리머라제에 의해서 촉매화된 DNA 증폭 반응에 대한 시간에 따른 압력 차이의 증가를 명확하게 보여준다. Qubit™ BR dsDNA 형광 분석 (Life Technologies, Paisley, UK)을 사용하여, DNA에 대해 상기 반응으로부터 채취된 시료가 또한 직접 분석되었다. 상기 분석은 이중 가닥 DNA만 측정하였다. 상기 반응에서 생성된 콘카타머 DNA가 프로텔로머라제 TelN으로 처리되어, 3개의 공유결합으로 닫힌 선형 DNA 분자가 생성되었다. 상기 처리된 DNA가 각각 5% 및 2M의 최종 농도로 PEG 8000 및 NaCl로 침전되었다. 상기 침전된 DNA가 14,000g에서 20분간 원심분리되었고, 뉴클레아제가 없는 탈이온수의 동등한 부피 중에 재현탁되었다.
도 5는 상기 반응 과정 중의 압력 차이 신호에서의 증가가 DNA 농도에서의 증가와 직접적으로 관련됨을 명확하게 보여준다. 압력과 측정된 DNA 사이의 직접적인 선형 관계는 또한 상기 반응 기간에 걸쳐서 상기 DNA가 이중 가닥 형태로 우세하게 존재하는 것을 나타낸다.
실시예 2: DNA로 dNTP의 혼입의 효율에 있어서 개시 dNTP 농도의 효과
본 실험에서, DNA 증폭 반응 (5ml 부피)이 50ml의 폴리프로필렌 원심분리 튜브에서 실시되었다. 상기 성분들이 하기 표 2에 나타낸 순서로 순차적으로 상기 튜브에 첨가되어서, 지시된 최종 농도가 수득되었다. DNA 증폭에 있어서 개시 dNTP 농도의 효과가 2mM, 4mM 및 8mM에서 시험되었다.
첨가순서 시약 반응 혼합물에서 농도
1 원형 DNA 주형
proTLx-K B5X4 Cal09 HA (도 10)
(Touchlight Genetics)		 5㎍/ml
2 단일 올리고뉴클레오티드 프라이머 (14-mer 5' atggrgcwattgt*g*t 3')
r = a 또는 g
w = t 또는 a
*는 포스포로티오에이트 연결을 나타냄
(Oligo Factory)		 50μM
3 H2O 최대 5ml
4 NaOH 10mM
5 dNTPs
Li+ 염
(Bioline)		 2mM
4mM
8mM
6 10x 완충액
300mM Tris-HCl, pH 7.5
300mM KCl
75mM MgCl2
50mM (NH4)2SO4
20mM DTT
30mM Tris-HCl, pH 7.5
30mM KCl
7.5mM MgCl2
5mM (NH4)2SO4
2mM DTT
7 Phi 29 DNA 폴리머라제
(Enzymatics)		 200유닛/ml
8 피로포스파타제
(Enzymatics)		 0.4유닛/ml
모든 튜브가 61.5 시간의 기간동안 최소 교반하면서 오비탈 인큐베이터에서 30℃로 인큐베이션되었다. 상기 기간은 2mM dNTPs가 공급된 DNA 증폭 반응의 완료에 필요한 시간의 약 10배에 해당한다. 상기 반응 종료시, 각 조건하에 생성된 콘카타머 DNA가 프로텔로머라제 TelN으로 처리되어 2개의 상이한 공유결합으로 닫힌 선형 DNA 분자가 생성되었다. 상기 처리된 DNA가, 각각 5% 및 2M의 최종 농도로 PEG 8000 및 NaCl로 침전되었다. 상기 침전된 DNA가 14,000g에서 20분 동안 원심 분리되고, 5ml의 뉴클레아제가 없는 탈이온수 중에 재현탁되었다. 상기 DNA 생성물의 시료가 탈이온수 중에 1/50으로 희석되고, 75℃로 1분 동안 가열되었다. 상기 희석된 DNA의 10μl의 시료가 2μl의 로딩 염료 (loading dye) (Novel Juice, Newmarket Scientific Ltd., UK)와 혼합되고, 10μl의 시료가 0.8%의 아가로스 겔로 적용되어서, DNA 성분이 명확하게 분리될 때까지 표준 전기영동 조건하에 실시되었다 (도 6).
도 6에서 전기영동 겔은, 상기 출발 dNTP 농도가 8mM이었을 때, 2개의 공유결합으로 닫힌 선형 DNA 생성물에 대한 생성물 수득율에서 현저한 감소를 명확하게 보여주었다. 상기 반응이 장시간에 걸쳐 실시되었기 때문에, DNA 증폭에 있어서 매우 강력한 억제 효과를 나타내었다. 상기 반응 종료시에 수득된 시료가 260nm에서 흡광도 측정을 사용하여 DNA에 대해 또한 분석되었고, 그 결과는 하기 표 3에 나타내었다.
반응 혼합물 중 반응 dNTP (Li+ 염) 농도 (mM) 최대 이론적 DNA 수득율 (㎍/ml) 상기 최대 이론적 수득율의 퍼센트로서 DNA의 수득율(%)
2 650 100
4 1300 85
8 2600 15
표 3: 반응의 종료시 전체 처리된 DNA의 농도가 260nm에서의 흡광도 측정으로부터 산출되었고, dNTPs의 상이한 수준으로부터 최대 이론적 DNA 수득율의 퍼센트로 표시되었다.
표 3은 4mM 초과의 개시 dNTP 농도가 Phi 29 DNA 폴리머라제 촉매화된 반응에서 DNA의 수득율을 크게 감소시킬 수 있다는 것을 도 6에 개시된 전기영동 결과를 확인하였다. 8mM의 개시 dNTP 농도로 2개의 주요 생성물 밴드 주위에서 스미어(smearing)함으로써 입증된 생성물 순도에서 상당한 감소가 또한 있었다는 것이 또한 명백했다.
dNTPs의 출발 농도를 증가시킴으로써 관찰된 DNA 수득율의 감소는 상기 반응에서 수많은 효과에 기인될 수 있다. 이는 하기를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다: 상기 효소의 기질 억제; DNA 가닥 상호작용, 주로 프라이머 주형 상호작용의 안정성에 있어서 Li+ 또는 뉴클레오티드 효과 및/또는 dNTPs에 Mg2 + 결합의 결과로서 효소 활성을 위해 이용가능한 유리 Mg2 + 수준. DNA 증폭의 억제가 직접 또는 간접 방식으로 기능하는 단일 인자 또는 다수 인자에 의해 야기될 수 있다. 분명하게, 산업적 제조를 위해 허용가능한 수준으로 상기 반응에서 DNA의 수득율을 증가시키는 것이 dNTPs의 개시 농도를 증가시킴으로써 간단히 달성될 수 없었다.
실시예 3: DNA 증폭 반응을 촉매화하는 Phi29 DNA 폴리머라제에 dNTPs 공급의 효과
Phi29로 촉매화된 DNA 증폭 반응에 부가량의 dNTPs를 보충하는 효과를 비교하기 위한 실험이 실시되었다. 반응들이 실시예 1에 기재된 바와 같이 실시되었지만, DNA 농도가 260nm에서 흡광도 측정으로부터 산출되었다. 2mM의 dNTPs 및 첨가된 부가의 dNTPs가 없는 반응 (반응 1), 2mM의 dNTPs 및 530분에서 부가의 2mM의 dNTPs가 공급된 반응 (반응 2), 개시로부터 4mM의 dNTPs (첨가된 부가의 dNTPs 없음)에 의한 반응 (반응 3) 및 2mM의 dNTPs와 부가의 dNTPs의 2mM 농도를 세번 공급하는 (500분, 1430분 및 4340분에서)의 반응 사이에서 비교가 이루어졌다. 임의의 첨가된 dNTPs를 공급하기 위한 트리거 (trigger)는 압력 차이 신호의 수준이 떨어지는 것이다. 상기 반응기에서 dNTPs의 농도가 2mM 만큼씩 증가되도록, 저장소로부터 dNTP 용액의 적당한 부피를 첨가하도록 작동되었다.
상기 반응 조건들 각각에 있어서, 압력 차이 대 시간의 그래프가 도 7에 도시되었다.
도 7에 제시된 데이터로부터, dNTP 첨가 이전, 그 사이 및 그 후에, 초기 속도가 적당하게 산출되었다. 이는 표 4에 개시되었다. 또한, 각 반응의 종료시에, DNA의 최종 수득율이 추정되고, 첨가된 dNTPs의 농도로부터 최대 이론적 수득율의 퍼센트로서 산출되었다. 상기 데이터가 표 5에 개시되었다.
반응 1 반응 2 반응 3 반응 4 반응 4에 대한 금속 양이온:포스페이트 비율
2mM dNTPs 4mM dNTPs 2mM dNTPs + 2mM dNTPs의 1번 첨가 2mM dNTPs + 2mM dNTPs의 3번 첨가 Mg2 +/PO4 3- 비율
[dNTP] mM 반응의 초기 속도 (압력 차이 단위/분)
2 0.3143 0.2646 0.3588 1.25
4 0.0761 0.0598 0.0593 0.625
6 0.0226 0.417
8 0.0135 0.313
표 4: 압력 차이 측정으로부터 추정된 반응들 1 내지 4에 대한 DNA 증폭의 초기 속도
반응 1 반응 2 반응 3 반응 4
2mM dNTPs 4mM dNTPs 2mM dNTPs + 2mM dNTPs의 1번 첨가 2mM dNTPs + 2mM dNTPs의 3번 첨가
전체[dNTP] mM 2 4 4 8
최종 DNA 수득율 (㎍/ml) 405 763 760 1400
최대 이론적 수득율의 퍼센트로서 DNA의 수득율 (%) 62 59 58 54
표 5: 반응들 1 내지 4에 대한 최종 DNA 수득율이 260 nm에서 흡광도 측정으로부터 산출되었다.
표 4는 dNTPs의 농도를 증가시키면 Phi29 DNA 폴리머라제에 의해서 DNA가 증폭되는 속도를 현저하게 감소시킨다는 것을 명확히 보여준다. 상기 반응 속도에 있어서 효과가 누적되며, 부가의 dNTPs가 첨가될 때와 무관하다.
실시예 2에서, 8mM의 개시 dNTP 농도에 의한 반응은 최대 이론적 수득율의 15%만을 생성하여 매우 느린 반응을 나타내는 것으로 보였다. 표 5에서, 8mM의 dNTPs가 2mM 분취량으로 첨가된 반응(반응 4)은 최대 이론적 수득율의 54%의 DNA 수득율을 달성하는데, 이는 매우 현저하게 향상된 것이다. dNTPs의 점차적 공급은 반응 속도의 점진적인 감소를 유도하는 것으로 보이지만, 상기 반응의 개시 시에 dNTPs의 고농도를 도입하는 것보다 전체 속도가 더 빠르고 수득율이 더 높은 것을 보여준다.
표 4는 또한 dNTPs를 공급하는 과정에서, Mg2 + 이온 대 dNTP 포스페이트기의 몰비 (Mg2 +/PO4 3- 비율)가 현저하게 감소되고, 반응 속도에서 관찰된 감소와 일치함을 보여준다. 이는 도 8에 도시되었다.
그러므로, dNTPs를 공급하는 것은 효소 촉매화 반응에서 산업적으로 허용가능한 수준으로 DNA 생성을 증가시킬 수 있다. 그러나 더 높은 반응 속도를 얻기 위해서, Mg2 + 이온 대 dNTP P04 3-기의 몰비가 Mg2 + 이온을 dNTPs와 공급함으로써 최적 수준으로 유지시킬 필요가 있다는 것을 알 수 있다.
실시예 4: DNA로 dNTPs의 혼입의 효율에 있어서 마그네슘 이온 농도의 효과
본 실험에서, DNA 증폭 반응 (5ml 부피)이 50ml의 폴리프로필렌 원심분리 튜브에서 실시되었다. 상기 성분들이 30℃로 예열되고, 표 6에 개시된 순서대로 상기 튜브로 순차적으로 첨가되어서, 지시된 최종 농도를 제공하였다. 3mM의 개시 dNTP 농도와 조합하여, 2.24mM, 4.52mM, 9mM 및 11.24mM의 Mg2 +의 개시 농도는 각각 0.25, 0.5, 1 및 1.25의 Mg2 +/PO4 3- 비율을 나타내었다. 상기 튜브가 19시간 동안 30℃로 인큐베이션되고, 그 후에 부가의 분취량의 dNTPs 및 MgCl2가 첨가되어서, dNTPs의 반응 농도를 6mM까지 증가시키고, 또한 Mg2 + 농도를 4.48mM, 9.04mM, 18mM 및 22.48mM까지 증가시켜서, Mg2 +/P04 3- 비율을 0.25, 0.5, 1 및 1.25로 유지시켰다. 상기 반응을 24시간 동안 더 진행시켜서, DNA 생성물이 수득되고, 그 농도가 추정되었다. DNA가 충분한 양의 프로텔로머라제 TelN으로 분해되고, 500mM의 NaCl, 100mM의 MgCl2를 함유하는 완충액에서 6% PEG 8000을 사용하여 DNA가 침전되었다. DNA를 4ml의 부피에 재현탁시키고, 흡광도 260nm 측정을 사용하여 DNA가 정량화되었다.
첨가 순서 시약 반응 혼합물에서 농도
1 원형 DNA 주형
proTLx-K N3X2 ova (도 11)
(Touchlight Genetics)		 2㎍/ml
2 단일 올리고뉴클레오티드 프라이머 (11-mer)
5' gcgtataat*g*g 3'
*포스포로티오에이트 연결
(Oligo Factory)		 50μM
3 H2O 최대 5ml
4 MgCl2 2.24mM
4.52mM
9mM
11.24mM
5 NaOH 2mM
6 dNTPs
Li+ 염
(Bioline)		 3mM
7 10x 완충액
300mM Tris-HCl, pH 7.9
300mM KCl
50mM (NH4)2SO4
20mM DTT
1% Tween-20
30mM Tris-HCl, pH 7.9
30mM KCl
5mM (NH4)2SO4
2mM DTT
0.1% TweenTM 20
8 Phi 29 DNA 폴리머라제
(Enzymatics)		 200유닛/ml
9 피로포스파타제
(Enzymatics)		 0.4유닛/ml
표 6. 반응 혼합물의 성분 및 첨가 순서
전체 Mg2 + 농도 (mM)
전체 dNTP 농도 (mM)
 Mg2 +/
PO4 3- 비율		 Mg2 +/
dNTP 비율		 DNA
수득율 (mg)		 DNA 수득율
(mg/mmole dNTPs)		 % 최대 이론적 수득율 DNA 농도
(g/l)
4.48 6.0 0.25 0.75 2.67 89.0 27.4 0.53
9.04 6.0 0.50 1.5 5.40 180.0 55.4 1.08
18 6.0 1.00 3 5.49 183.1 56.3 1.10
22.48 6.0 1.25 3.75 4.77 159.0 48.9 0.95
표 7: 고정된 Mg2 +/P04 3- 비율을 유지하는 dNTP 공급 반응에서 반응 중 DNA 수득율
표 7에서 결과는 dNTP 공급 반응에서 43시간 후의 DNA 수득율에 있어서 상이한 Mg2 +/P04 3- 비율의 효과를 보여주었다. 0.25의 Mg2 +/P04 3- 비율을 갖는 시간 이후에 얻어진 DNA 수득율은 더 낮으며, 이는 Mg2 + 이온의 불충분한 농도에 의해서 반응 속도가 더 느려지거나 또는 반응이 억제되는 것을 나타낸다. 어느 쪽이든, 상기 데이터는 산업적 사용을 위한 효율적인 DNA 증폭 반응을 위해 유지될 필요가 있는 최적의 Mg2 +/P04 3- 비율이 있음을 나타낸다. 상기 데이터는 상기 최적 비율이 0.5 내지 1.25 사이일 수 있음을 나타낸다. 상기 데이터는 또한 dNTPs가 반응에 공급되면 부가의 Mg2 + 이온을 첨가하여 최적의 Mg2 +/P04 3- 비율 (이상적으로 1)을 유지함으로써 DNA로의 효율적인 전환이 가능함을 나타낸다.
실시예 5: dNTPs의 다수의 분취량이 공급된, Phi29 DNA 폴리머라제로 촉매화된 DNA 증폭 반응에 있어서 프로텔로머라제 TelN 첨가의 효과
실험은 플라스미드 ProTLx-K N3X2 Lux (도 13)에서 Phi29 촉매화된 DNA 증폭 반응에 dNTPs 및 상기 프로텔로머라제 TelN의 부가의 양을 보충하는 효과를 비교하기 위해 실시되었다. 실시예 1에 기재된 바와 같이 반응이 본질적으로 실시되었지만, 저장소(42b)는 12mM Tris-HCl (pH 7.4), 90mM NaCl, 0.1mM EDTA. 1mM DTT, 50% 글리세롤 중의 25μM TelN 용액을 포함하고, 4 ℃에서 유지하고, 저장소(5g)는 탈이온수 중 100mM의 MgCl2 용액을 포함한다. 상기 주형 ProTLx-K_N3X2 Lux의 개시 농도는 5μg/ml이었다.
상기 반응의 회분식 단계 후에, dNTPs의 분취량이 시린지(31a)를 통해 상기 반응 용기(2)에 첨가되어서, 300분, 600분, 900분, 1080분, 1230분 및 1440분의 선택된 시간 간격으로 2mM의 농도 증가가 실시되었다. 동일한 시간 간격 및 dNTPs의 첨가 직후, MgCl2의 분취량이 첨가되어 [Mg2+]:[dNTPs]의 3:1 비율이 수득되었다. 1050분에서, 프로텔로머라제 TelN이 상기 반응 용기(2)로 분배되어서, 2μM의 최종 농도를 제공하였다.
상기 반응의 초기 회분식 단계 (최대 300 분) 후, 콘카타머 DNA 합성에 해당하는 압력 차이 측정에서 꾸준한 증가가 있었다. 1050 분에서 상기 반응으로 프로텔로머라제 TelN을 첨가한 후에, DNA 합성에서 현저한 증가에 해당하는 압력 변화율이 3.6배 증가되었다. 상기 반응의 dNTP/Mg2 + 공급 단계 중에 TelN을 한 번 첨가하면 부가의 DNA 증폭을 위한 주형으로 작용할 수 있는 닫힌 선형 DNA의 생성을 유도한다고 제안되었다. 상기 시점 이후에 Mg2 +/dNTPs의 부가의 공급은 DNA 합성 속도가 증가되는 것이 관찰되므로 중요하다.

Claims (26)

  1. DNA 주형 (template)의 증폭을 다른 가닥의 가닥-치환 복제 (strand-displacement replication)를 통해 복제된 가닥의 치환에 의해 촉진시키는 조건하에, 뉴클레오티드의 존재하에, DNA 주형을 적어도 하나의 폴리머라제와 접촉시켜서 반응 혼합물을 형성하는 단계를 포함하고, 부가의 뉴클레오티드가 상기 반응 혼합물에 조절된 방식으로 공급되는 DNA를 합성하기 위한 무세포 방법 (cell-free process).
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 반응 혼합물은 하나 이상의 프라이머 (primers)를 더 포함하는 것인 방법.
  3. DNA 주형의 증폭을 다른 가닥의 가닥-치환 복제를 통해 복제된 가닥의 치환에 의해 촉진시키는 조건하에, 뉴클레오티드 및 적어도 하나의 프라이머의 존재하에, DNA 주형을 적어도 하나의 폴리머라제와 접촉시켜서 반응 혼합물을 형성하는 단계를 포함하고, 부가의 뉴클레오티드가 상기 반응 혼합물에 조절된 방식으로 공급되는 DNA를 합성하기 위한 무세포 방법.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응 혼합물은 하나 이상의 금속 양이온을 더 포함하고, 부가의 금속 양이온이 상기 반응 혼합물에 조절된 방식으로 공급되는 것인 방법.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 부가의 뉴클레오티드 및 부가의 금속 양이온이 상기 반응 혼합물에 독립적으로 공급되는 것인 방법.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 주형은 원형 (circular)이고, 상기 DNA 주형의 증폭이 롤링 서클 증폭 (rolling circle amplification)에 의한 것인 방법.
  7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 주형은 닫힌 선형 (closed linear) DNA이고, 바람직하게 상기 DNA 주형이 변성 조건 (denaturing conditions)하에 인큐베이션되어, 닫힌 원형 (closed circular) 단일 가닥 DNA가 형성되는 것인 방법.
  8. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 주형은 적어도 하나의 처리 효소 표적 서열 (processing enzyme target sequence), 바람직하게 재조합효소 표적 서열 (recombinase targeting sequence), 또는 프로텔로머라제 표적 서열 (protelomerase target sequence)을 포함하는 것인 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 처리 효소가 상기 반응 혼합물에 조절된 방식으로 공급되는 것인 방법.
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 부가의 뉴클레오티드가 상기 반응 혼합물에 복수의 분취량 (aliquotes)으로 공급되는 것인 방법.
  11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 부가의 뉴클레오티드가 상기 공정의 기간 전체에 걸쳐서 규칙적 간격으로, 선택적으로 적어도 30분 마다 분취량으로 공급되는 것인 방법.
  12. 청구항 4에 있어서, 상기 부가의 금속 이온이 상기 공정의 기간 전체에 걸쳐서 규칙적 간격으로, 선택적으로 적어도 30분 마다 분취량으로 공급되는 것인 방법.
  13. 청구항 11 또는 12에 있어서, 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10회의 분취량으로 상기 반응 혼합물에 공급되는 것인 방법.
  14. 청구항 10 내지 13 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분취량이 펌프를 사용하는 외부 공급원으로부터 공급되거나, 또는 삼투압 펌프 (osmotic pump)의 사용에 의해 상기 반응 혼합물에 공급되는 것인 방법.
  15. 청구항 1 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 또는 부가의 뉴클레오티드는 생물학적 비활성 뉴클레오티드를 포함하고, 바람직하게 활성화 (activation)를 통해서 상기 반응 혼합물에 공급되는 것인 방법.
  16. 청구항 1 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, 상기 부가의 뉴클레오티드가 상기 반응 혼합물 중 DNA의 농도와 관련된 신호 (signal)에 대응하여 공급되고, 바람직하게 상기 반응 혼합물 중 상기 DNA의 농도가, 선택적으로 신호를 발생시킬 수 있는, 상기 반응 혼합물, 또는 그 일부의 압력의 차이를 측정함으로써 모니터되는 것인 방법.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 DNA의 농도를 나타내는 신호가, 선택적으로 압력 센서 (pressure sensor) 상에서, 상기 반응 혼합물의 일부를 제거 및 복귀하는 왕복 펌프 (reciprocating pump)에 의해서 형성된 압력 차이를 측정함으로써 발생되는 것인 방법.
  18. 청구항 1 내지 17 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 합성 장치에서 실시되고, 상기 장치는:
    적어도 제1 포트 및 제2 포트를 갖는 반응 용기 (reaction vessel);
    상기 반응 용기의 온도를 조절하기 위한 온도 조절 장치 (temperature control device);
    반응 성분들을 보유하기 위한 복수의 저장소 (reservoirs);
    복수의 도관 (conduits)으로서, 상기 복수의 도관의 각각은 상기 반응 용기의 상기 제1 포트를 상기 복수의 저장소들의 개별 저장소와 연결하는 것인 도관;
    상기 반응 용기의 상기 제1 포트 또는 제2 포트에 근접하게 위치한 적어도 하나의 압력 센서;
    상기 저장소들내 보유된 반응 성분들의 조절된 양을 상기 반응 용기로 선별적으로 공급하기 위한 공급 수단 (supply means);
    상기 제2 포트를 통해서 상기 반응 용기로부터 내용물의 양을 선별적으로 회수하고, 또한 상기 제2 포트를 통해서 상기 반응 용기로 상기 반응 용기의 내용물을 선별적으로 복귀시키기 위한 교반 수단 (agitation means); 및
    상기 공급 수단 및 상기 교반 수단을 조절하기 위한 조절 수단 (control means)을 포함하고,
    상기 압력 센서는 상기 반응 용기의 외부에서 압력 변화를 검출하고, 신호를 상기 조절 수단으로 송신하고, 상기 조절 수단은 관찰된 압력에서의 변화에 대응하여 상기 공급 수단 및/또는 교반 수단을 조절하는 것인 방법.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 반응 성분들은 상기 부가의 뉴클레오티드 및/또는 부가의 금속 이온을 포함하는 것인 방법.
  20. 청구항 4 또는 19에 있어서, 상기 금속 양이온은 마그네슘 (Mg2 +), 망간 (Mn2+), 칼슘 (Ca2 +), 베릴륨 (Be2 +), 아연 (Zn2 +) 및 스트론튬 (Sr2 +), 리튬 (Li+), 나트륨 (Na+) 또는 칼륨 (K+)으로 이루어진 목록으로부터 선택된 하나 이상의 금속, 바람직하게 Mg2+를 포함하는 것인 방법.
  21. 청구항 4, 또는 청구항 20 또는 21에 있어서, 상기 금속 양이온은 2가 양이온이고, 상기 2가 금속 양이온과 상기 뉴클레오티드 사이의 비율이 상기 반응 혼합물 중 약 3:1로 유지되는 것인 방법.
  22. 청구항 1 내지 21 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응 혼합물 중 상기 뉴클레오티드의 농도가 0.001mM 내지 6mM 사이, 선택적으로 약 3mM로 유지되는 것인 방법.
  23. 청구항 1 내지 22 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 및/또는 부가의 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트 (deoxyribonucleoside triphosphates: dNTPs), 또는 그 유도체 또는 변형된 버젼인 것인 방법.
  24. 청구항 1 내지 23 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 및/또는 부가의 뉴클레오티드는 데옥시아데노신 트리포스페이트 (deoxyadenosine triphosphate: dATP), 데옥시구아노신 트리포스페이트 (deoxyguanosine triphosphate: dGTP), 데옥시시티딘 트리포스페이트 (deoxycytidine triphosphate: dCTP), 데옥시티미딘 트리포스페이트 (deoxythymidine triphosphate: dTTP) 및 그 유도체의 하나 이상인 것인 방법.
  25. 청구항 1 내지 24 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드가 하나 이상의 유리 산 (free acids), 그 염 또는 그 킬레이트로 제공되고, 선택적으로 상기 염 또는 킬레이트는 Mg2 +, Be2 +, Ca2 +, Sr2 +, Li+, Na+, K+, Mn2 + 또는 Zn2 +의 금속 이온들의 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  26. 청구항 8에 있어서, 상기 처리 효소가 상기 반응 혼합물 중 상기 DNA의 농도와 관련된 신호에 대응하여 공급되는 것인 방법.
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