JP2013535210A - パリンドローム配列を用いた閉鎖型直鎖状dnaの生成 - Google Patents
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Abstract
Description
プロテロメラーゼ標的配列内のパリンドローム配列に特異的に結合し、両方向において増幅を始動することができるプライマー。
閉鎖型直鎖状デオキシリボ核酸(DNA)を生成するためのインビトロ無細胞(cell-free)法(process)であって、
(a)少なくとも1つのプロテロメラーゼ標的配列を含むDNA鋳型を、少なくとも1つのDNAポリメラーゼと、少なくとも1種(one species)のプライマーの存在下、該鋳型の増幅を促進する条件下で接触させるステップであって、少なくとも1種のプライマーが、少なくとも1つのプロテロメラーゼ標的配列内のパリンドローム配列に特異的に結合することができ、両方向において増幅を始動することができるステップと、
(b)閉鎖型直鎖状DNAの生成を促進する条件下で、(a)で生成された増幅DNAを少なくとも1つのプロテロメラーゼと接触させるステップと
を含む方法。
デオキシリボ核酸(DNA)を増幅するためのインビトロ無細胞法であって、
少なくとも1つのプロテロメラーゼ標的配列を含むDNA鋳型を、少なくとも1つのDNAポリメラーゼと、少なくとも1種のプライマーの存在下、別の鎖の鎖置換複製(strand displacement replication)を介して複製された鎖の置換によって該鋳型の増幅を促進する条件下で接触させるステップであって、該少なくとも1種のプライマーが、少なくとも1つのプロテロメラーゼ標的配列内のパリンドローム配列に特異的に結合することができ、両方向において増幅を始動することができるステップ
を含む方法。
配列番号1は、バチルスバクテリオファージphi29 DNAポリメラーゼの核酸配列である。
配列番号2は、配列番号1によりコードされるバチルスバクテリオファージphi29 DNAポリメラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号3は、ピロコッカス属種Deep Vent DNAポリメラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号4は、バチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus)DNAポリメラーゼIの核酸配列である。
配列番号5は、配列番号4によりコードされるバチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus)DNAポリメラーゼIのアミノ酸配列である。
配列番号6は、ハロモナスファージphiHAP−1プロテロメラーゼ核酸配列の核酸配列である。
配列番号7は、配列番号6によりコードされるハロモナスファージphiHAP−1プロテロメラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号8は、エルシニアファージPY54プロテロメラーゼの核酸配列である。
配列番号9は、配列番号8によりコードされるエルシニアファージPY54プロテロメラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号10は、クレブシエラファージphiKO2プロテロメラーゼの核酸配列である。
配列番号11は、配列番号10によりコードされるクレブシエラファージphiKO2プロテロメラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号12は、ビブリオファージVP882プロテロメラーゼの核酸配列である。
配列番号13は、配列番号12によりコードされるビブリオファージVP882プロテロメラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号14は、大腸菌(Escherichia coli)バクテリオファージN15プロテロメラーゼ(telN)および二次免疫リプレッサー(cA)核酸配列の核酸配列である。
配列番号15は、配列番号14によりコードされる大腸菌(Escherichia coli)バクテリオファージN15プロテロメラーゼ(telN)のアミノ酸配列である。
配列番号16は、バクテリオファージプロテロメラーゼ標的配列中に存在する完全逆方向反復のコンセンサス核酸配列である。
配列番号17は、大腸菌(E. coli)ファージN15およびクレブシエラファージphiKO2由来の22塩基の完全逆方向反復核酸配列である。
配列番号18は、エルシニアファージPY54由来の22塩基の完全逆方向反復核酸配列である。
配列番号19は、ハロモナスファージphiHAP−1由来の22塩基の完全逆方向反復核酸配列である。
配列番号20は、ビブリオファージVP882由来の22塩基の完全逆方向反復核酸配列である。
配列番号21は、ボレリア・ブルグドルフェリ(Borrelia burgdorferi)プラスミドlpB31.16由来の14塩基の完全逆方向反復核酸配列である。
配列番号22は、ビブリオファージVP882由来の24塩基の完全逆方向反復核酸配列である。
配列番号23は、エルシニアファージPY54由来の42塩基の完全逆方向反復核酸配列である。
配列番号24は、ハロモナスファージphiHAP−1由来の90塩基の完全逆方向反復核酸配列である。
配列番号25は、プロテロメラーゼ標的配列を含む大腸菌(E. coli)ファージN15由来の核酸配列である。
配列番号26は、プロテロメラーゼ標的配列を含むクレブシエラファージphiKO2由来の核酸配列である。
配列番号27は、プロテロメラーゼ標的配列を含むエルシニアファージPY54由来の核酸配列である。
配列番号28は、プロテロメラーゼ標的配列を含むビブリオファージVP882由来の核酸配列である。
配列番号29は、プロテロメラーゼ標的配列を含むボレリア・ブルグドルフェリ(Borrelia burgdorferi)プラスミドlpB31.16由来の核酸配列である。
配列番号30は、配列番号25のプロテロメラーゼ標的配列への結合に適した本発明によるプライマーの例である。
配列番号31は、配列番号25のプロテロメラーゼ標的配列への結合に適した本発明によるプライマーの例である。
配列番号32は、配列番号25または配列番号26のプロテロメラーゼ標的配列への結合に適した本発明によるプライマーの例である。
配列番号33は、配列番号25または配列番号26のプロテロメラーゼ標的配列への結合に適した本発明によるプライマーの例である。
配列番号34は、配列番号25のプロテロメラーゼ標的配列への結合に適した本発明によるプライマーの例である。
配列番号35は、配列番号25のプロテロメラーゼ標的配列への結合に適した本発明によるプライマーの例である。
配列番号36は、配列番号27のプロテロメラーゼ標的配列への結合に適した本発明によるプライマーの例である。
配列番号37は、配列番号27のプロテロメラーゼ標的配列への結合に適した本発明によるプライマーの例である。
配列番号38は、配列番号28のプロテロメラーゼ標的配列への結合に適した本発明によるプライマーの例である。
配列番号39は、配列番号28のプロテロメラーゼ標的配列への結合に適した本発明によるプライマーの例である。
配列番号40は、配列番号29のプロテロメラーゼ標的配列への結合に適した本発明によるプライマーの例である。
配列番号41は、配列番号29のプロテロメラーゼ標的配列への結合に適した本発明によるプライマーの例である。
本発明は、プロテロメラーゼ標的配列を含むDNA鋳型を増幅するための、典型的には、閉鎖型直鎖状DNA分子を生成するためのプライマー、それらのプライマーを用いた方法、およびそれらのプライマーを含むキットに関する。
配列番号18(GCATACTACGCGCGTAGTATGC)、
配列番号19(CCATACTATACGTATAGTATGG)、
配列番号20(GCATACTATACGTATAGTATGC)、
は、それぞれ、エルシニアファージPY54(配列番号9)、ハロモナスファージphiHAP−1(配列番号7)、およびビブリオファージVP882(配列番号13)由来のプロテロメラーゼとの使用に関して、特に好ましい完全逆方向反復配列である。配列番号21(ATTATATATATAAT)は、ボレリア・ブルグドルフェリ(Borrelia burgdorferi)プロテロメラーゼとの使用に関して、特に好ましい完全逆方向反復配列である。この完全逆方向反復配列は、ボレリア・ブルグドルフェリ(Borrelia burgdorferi)に含まれる直鎖状共有結合閉鎖型プラスミドであるlpB31.16に由来する。この14塩基の配列は、バクテリオファージの22bpのコンセンサス完全逆方向反復(配列番号16)よりも短く、これは、細菌のプロテロメラーゼ同士が、バクテリオファージプロテロメラーゼに対する特異的標的配列の要件において異なっている場合があることを示している。しかしながら、全てのプロテロメラーゼ標的配列は、完全逆方向反復という共通の構造モチーフを共有している。
配列番号22(GGCATACTATACGTATAGTATGCC)
配列番号23
(ACCTATTTCAGCATACTACGCGCGTAGTATGCTGAAATAGGT)
配列番号24
(CCTATATTGGGCCACCTATGTATGCACAGTTCGCCCATACTATACGTATAGTATGGGCGAACTGTGCATACATAGGTGGCCCAATATAGG)
配列番号22〜24およびその変異体は、それぞれ、ビブリオファージVP882(配列番号13)、エルシニアファージPY54(配列番号9)およびハロモナスファージphi HAP−1(配列番号7)に由来するプロテロメラーゼとの使用に関して特に好ましい。
配列番号25:
(TATCAGCACACAATTGCCCATTATACGCGCGTATAATGGACTATTGTGTGCTGATA)
配列番号26
(ATGCGCGCATCCATTATACGCGCGTATAATGGCGATAATACA)
配列番号27
(TAGTCACCTATTTCAGCATACTACGCGCGTAGTATGCTGAAATAGGTTACTG)
配列番号28:
(GGGATCCCGTTCCATACATACATGTATCCATGTGGCATACTATACGTATAGTATGCCGATGTTACATATGGTATCATTCGGGATCCCGTT)
配列番号29
(TACTAAATAAATATTATATATATAATTTTTTATTAGTA)
配列番号30 CGCATATTACCT/CGA/TTAACACAC
配列番号31 GCGTATAATGGA/GCT/AATTGTGTG
配列番号32 GCGTATAATGG
配列番号33 CCATTATACGC
配列番号34 CACACAATA/TGC/TCCAT
配列番号35 ATGGA/GCA/TATTGTGTG
配列番号36 CGCATCATACGACTTTATCCA
配列番号37 GCGTAGTATGCTGAAATAGGT
配列番号38 CATATCATACGGCTACAATGTATACC
配列番号39 GTATAGTATGCCGATGTTACATATGG
配列番号40 TATATTAA/TAAAA/TT/AAATCAT
配列番号41 ATATAATT/ATTTT/AA/TTTAGTA
から選択される配列を含んでもよく、またはその配列からなってもよい。
(a)少なくとも1つのプロテロメラーゼ標的配列を含むDNA鋳型を、少なくとも1つのDNAポリメラーゼと、少なくとも1種のプライマーの存在下、前記鋳型の増幅を促進する条件下で接触させるステップと、
(b)閉鎖型直鎖状DNAの生成を促進する条件下で、(a)で生成された増幅DNAを少なくとも1つのプロテロメラーゼと接触させるステップと
を含むことができる。
(a)少なくとも1つのプロテロメラーゼ標的配列を含むDNA鋳型を、少なくとも1つのDNAポリメラーゼと、1種または複数種のプライマーの存在下、前記鋳型の増幅を促進する条件下で接触させるステップと、
(b)閉鎖型直鎖状DNAの生成を促進する条件下で、(a)で生成された増幅DNAを少なくとも1つのプロテロメラーゼと接触させるステップと、
(c)ステップ(a)を繰り返すステップであって、DNA鋳型がステップ(b)の閉鎖型直鎖状DNA産物であるステップと、
(d)(c)で生成された増幅DNAについてステップ(b)を繰り返すステップと、場合により、
(e)さらなるラウンドのステップ(c)および(d)を行うステップであって、ステップ(c)の各繰り返しについての鋳型がステップ(d)の従前の繰り返しの産物を含むステップと
を含んでもよい。
配列番号30 CGCATATTACCT/CGA/TTAACACAC
配列番号31 GCGTATAATGGA/GCT/AATTGTGTG
配列番号32 GCGTATAATGG
配列番号33 CCATTATACGC
配列番号34 CACACAATA/TGC/TCCAT
配列番号35 ATGGA/GCA/TATTGTGTG
配列番号36 CGCATCATACGACTTTATCCA
配列番号37 GCGTAGTATGCTGAAATAGGT
配列番号38 CATATCATACGGCTACAATGTATACC
配列番号39 GTATAGTATGCCGATGTTACATATGG
配列番号40 TATATTAA/TAAAA/TT/AAATCAT
配列番号41 ATATAATT/ATTTT/AA/TTTAGTA
二本鎖環状DNA鋳型からの閉鎖型直鎖状DNAの生成
プロテロメラーゼTelN結合配列を含む二本鎖環状DNAをDNA鋳型として用いる。プロテロメラーゼTelN結合部位を含むパリンドローム配列の半分の部分に相補的な単一のパリンドロームオリゴヌクレオチドを用いて、両鎖を特異的に始動する。適切なプライマーの例には、配列番号30〜35が含まれる。二本鎖環状鋳型の変性、および単一のプライマーのアニーリングは、例えば、30mM Tris−HCl pH7.5、20mM KCl、2.5mM MgCl2を含むアニーリング/変性緩衝液中で行われる。変性は、95℃まで加熱し、この温度にて1〜10分間維持し、続いて、特異的プライマーの鋳型への最大結合のために最適化された、注意深く制御された冷却プロフィールによって行われる。次に、温度は、適切なDNAポリメラーゼによるDNA増幅に最適となるように下げられる。適切な酵素は、30℃にて最適に作用する枯草菌(Bacillus subtilis)ファージphi29から単離されたphi29である。
閉鎖型直鎖状DNA鋳型からの閉鎖型直鎖状DNAの生成
プロテロメラーゼTelNの結合配列を含むテロメア末端を含有する閉鎖型直鎖状DNAをDNA鋳型として用いる。鋳型のテロメア末端を含むパリンドローム配列の半分の部分に相補的な単一のパリンドロームオリゴヌクレオチドを特異的プライマーとして用いる。プライマーは、DNA鋳型上の2つの同一部位に結合する。適切なプライマーの例には、配列番号30〜35が含まれる。
DNA増幅のための条件
プロテロメラーゼTelN結合配列およびHindIII制限エンドヌクレアーゼ部位を含む4.3kbの環状二本鎖DNAをDNA鋳型として用いた。TelN結合配列は、逆方向パリンドロームを構成する。パリンドロームTelN結合部位の半分における配列に相補的な異なる長さのオリゴヌクレオチドを単一の特異的プライマーとして用いた。このようなプライマーは、DNA鋳型のTelN配列内の反対鎖上の同一部位に結合し、反対方向にDNA合成を開始する。こうして、ただ単一のオリゴヌクレオチドが、各鎖を始動するために必要とされる。試験されるプライマーの例には、配列番号30〜42から選択される。
HindIII消化について、コンカテマーDNAの反応試料は、PicoGreenアッセイ(Invitrogen)を用いて定量され、可能であれば、40U HindIII制限酵素、20mM Tris−OAc、pH7.9、50mM KOAc、10mM Mg(OAc)2および1mMジチオスレイトールを含む20μlの緩衝液/酵素あたり250ngに調整された。反応物を30分間、37℃にてインキュベートした。
TelN切断/結合について、コンカテマーDNAの試料は、PicoGreenアッセイ(Invitrogen)を用いて定量され、可能であれば、8pmol TelNプロテロメラーゼ、10mM Tris HCl pH7.6、5mM CaCl2、50mMグルタミン酸カリウム、0.1mM EDTA、1mMジチオスレイトールを含む20μlの緩衝液/酵素あたり250ngに調整された。反応物を30℃にて1.5時間インキュベートした。
20μlの消化されたDNA産物は、4μlのゲルローディング緩衝液と混合され、0.8%アガロースゲルにローディングされた。混合物を電気泳動によって分離し、DNAを視覚化するために臭化エチジウムを用いて染色した。参照のための5μl DNAラダーのローディングは、4.3kb DNA産物の同定を可能にした。
画像分析は、SynGene GeneSnapソフトウェアを用いて、UV条件下で行われた。ゲル画像の濃度測定量は、ImageJ分析ソフトウェア(http://imagej.nih.gov/ij/)を用いて行われた。濃度測定画像は、ランダムヘキサマーと比較して、単一の特異的プライマー由来の4.3kb産物の純度のより明確な比較を可能にする。
30℃でのDNAのローリングサークル増幅における単一のオリゴヌクレオチドプライマーとランダムヘキサマーとの比較
RCAによる鋳型DNA増幅反応は、30℃にてランダムヘキサマー、11マーのプライマー(配列番号32および33)(各プライマーについて融解温度は約32℃)、および15マーのプライマー(配列番号34および35)(融解温度は36℃〜39℃)を用いて行われた。
図7Aに示されるように、30℃にて、単一の特異的プライマー(11マーの配列番号32と33、および15マーの配列番号34と35)の各々は、phi29 DNAポリメラーゼによる4.3kbの環状二本鎖DNA鋳型の増幅を始動することができた。各プライマーについての反応速度を示す。使用された単一のプライマーの濃度(10mM)にて、プライマーの配列番号32(11マー)および配列番号34(15マー)は、プライマーの配列番号33(11マー)および配列番号35(15マー)よりも良好に機能した。プライマーの配列番号32と34を用いたDNA増幅の速度は、ランダムヘキサマーと比較して遅かったが、それらは同じ最終DNA収量に達した。
34℃でのDNAのローリングサークル増幅における単一オリゴヌクレオチドプライマーとランダムヘキサマーとの比較
RCAによる鋳型DNA増幅反応は、ランダムヘキサマー、ならびに11マーのプライマー(配列番号32および33)(融解温度は約32℃である)を用いて、34℃にて行われた。反応物は、1時間、2時間、4時間、6時間および9時間後に分析された。反応物からの別々のコンカテマーDNA試料をHindIIIおよびプロテロメラーゼTelN処理に供し、従前に記載したようにゲル電気泳動によって産物を分離した。記載した通りに画像分析ソフトウェアを用いてゲルを分析した。結果は、HindIII消化物については図8Bに示され、TelN消化されたコンカテマーDNAについては図8Cに示される。
34℃は、ランダムヘキサマーのアニーリングよりも鋳型に対する11マーのアニーリングについてより最適な温度であることが期待されたが、phi29 DNAポリメラーゼ活性については最適な30℃を超える。
Claims (19)
- 閉鎖型直鎖状デオキシリボ核酸(DNA)を生成するためのインビトロ無細胞法であって、
(a)少なくとも1つのプロテロメラーゼ標的配列を含むDNA鋳型を、少なくとも1つのDNAポリメラーゼと、少なくとも1種のプライマーの存在下、前記鋳型の増幅を促進する条件下で接触させるステップであって、前記少なくとも1種のプライマーが、少なくとも1つのプロテロメラーゼ標的配列内のパリンドローム配列に特異的に結合することができ、両方向において増幅を始動することができるステップと、
(b)閉鎖型直鎖状DNAの生成を促進する条件下で、(a)で生成された増幅DNAを少なくとも1つのプロテロメラーゼと接触させるステップと
を含む方法。 - 前記DNA鋳型が、別の鎖の鎖置換複製を介して複製された鎖の置換によって前記鋳型の増幅を促進する条件下でインキュベートされる、請求項1に記載の方法。
- 前記DNAポリメラーゼが配列番号2のphi29もしくはその変異体であり、かつ/または前記プロテロメラーゼが配列番号15のバクテリオファージN15 TelNもしくはその変異体である、請求項1または2に記載の方法。
- デオキシリボ核酸(DNA)を増幅するためのインビトロ無細胞法であって、
少なくとも1つのプロテロメラーゼ標的配列を含むDNA鋳型を、少なくとも1つのDNAポリメラーゼと、少なくとも1種のプライマーの存在下、別の鎖の鎖置換複製を介して複製された鎖の置換によって前記鋳型の増幅を促進する条件下で接触させるステップであって、前記少なくとも1種のプライマーが、少なくとも1つのプロテロメラーゼ標的配列内のパリンドローム配列に特異的に結合することができ、両方向において増幅を始動することができるステップ
を含む方法。 - 前記鋳型の増幅が、ローリングサークル増幅(RCA)によって行われる、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記鋳型の増幅が、単一種のプライマーの存在下で行われる、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プライマーが、下記:
配列番号30 CGCATATTACCT/CGA/TTAACACAC
配列番号31 GCGTATAATGGA/GCT/AATTGTGTG
配列番号32 GCGTATAATGG
配列番号33 CCATTATACGC
配列番号34 CACACAATA/TGC/TCCAT
配列番号35 ATGGA/GCA/TATTGTGTG
配列番号36 CGCATCATACGACTTTATCCA
配列番号37 GCGTAGTATGCTGAAATAGGT
配列番号38 CATATCATACGGCTACAATGTATACC
配列番号39 GTATAGTATGCCGATGTTACATATGG
配列番号40 TATATTAA/TAAAA/TT/AAATCAT
配列番号41 ATATAATT/ATTTT/AA/TTTAGTA
から選択される配列からなる、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。 - 増幅されたDNAが、前記DNA鋳型から増幅されたDNA配列のタンデム単位を含むコンカテマーを含む、先行のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜3に従属している場合、または請求項1〜3に従属している請求項5〜7に従属している場合、前記コンカテマーが、前記プロテロメラーゼによって増幅されたDNA配列の単一単位に分解される、請求項8に記載の方法。
- 請求項4に従属している場合、または請求項4に従属している請求項5〜7に従属している場合、前記コンカテマーが、制限エンドヌクレアーゼによって増幅されたDNA配列の単一単位に分解される、請求項8に記載の方法。
- プロテロメラーゼ標的配列内のパリンドローム配列に特異的に結合し、両方向において増幅を始動することができるプライマー。
- 場合によりホスホロチオエート結合を含む、長さにして6〜50ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドである、請求項11に記載のプライマー。
- 前記パリンドローム配列の半分にのみ特異的に結合する、請求項11または12に記載のプライマー。
- 配列番号25〜29の配列のいずれか1つに結合することができる、請求項11〜13のいずれか一項に記載のプライマー。
- 下記:
配列番号30 CGCATATTACCT/CGA/TTAACACAC
配列番号31 GCGTATAATGGA/GCT/AATTGTGTG
配列番号32 GCGTATAATGG
配列番号33 CCATTATACGC
配列番号34 CACACAATA/TGC/TCCAT
配列番号35 ATGGA/GCA/TATTGTGTG
配列番号36 CGCATCATACGACTTTATCCA
配列番号37 GCGTAGTATGCTGAAATAGGT
配列番号38 CATATCATACGGCTACAATGTATACC
配列番号39 GTATAGTATGCCGATGTTACATATGG
配列番号40 TATATTAA/TAAAA/TT/AAATCAT
配列番号41 ATATAATT/ATTTT/AA/TTTAGTA
から選択される配列からなる、請求項11〜14のいずれか一項に記載のプライマー。 - 請求項11〜15のいずれか一項に記載の少なくとも1つのプライマー、および少なくとも1つのDNAポリメラーゼを含むキット。
- (a)前記DNAポリメラーゼが、鎖置換型DNAポリメラーゼであり、かつ/または
(b)キットが、少なくとも1つのプロテロメラーゼ、および場合により請求項1〜3、もしくは請求項1〜3に従属している請求項5〜9のいずれか一項に記載の方法において使用するための使用説明書をさらに含む、
請求項16に記載のキット。 - 宿主における抗原に対する免疫応答を誘導する方法であって、
前記抗原をコードする前記DNA鋳型を用いて、請求項1〜3または請求項1〜3に従属している請求項5〜9のいずれか一項に記載の方法を行うステップと、
前記抗原が前記宿主において発現され、前記抗原に対する免疫応答を誘導するように、前記抗原をコードする、得られた閉鎖型直鎖状DNAを前記宿主に投与するステップと
を含む方法。 - 閉鎖型直鎖状DNA分子を含む医薬組成物を製造するための方法であって、請求項1〜3または請求項1〜3に従属している請求項5〜9のいずれか一項に記載の方法を行うステップと、薬学的に許容される担体または賦形剤とともに、得られた閉鎖型直鎖状DNAを製剤化するステップとを含む方法。
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