JP2002051784A - 核酸の増幅方法及び標識核酸の調製方法 - Google Patents
核酸の増幅方法及び標識核酸の調製方法Info
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- JP2002051784A JP2002051784A JP2000241741A JP2000241741A JP2002051784A JP 2002051784 A JP2002051784 A JP 2002051784A JP 2000241741 A JP2000241741 A JP 2000241741A JP 2000241741 A JP2000241741 A JP 2000241741A JP 2002051784 A JP2002051784 A JP 2002051784A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】微量の核酸から簡便に効率よく核酸を増幅する
方法及び標識核酸の調製方法、ならびにそのための試薬
を提供する。 【解決手段】核酸を直鎖状二本鎖ＤＮＡの形状にし、制
限酵素によって断片化し、該核酸断片に合成リンカー１
を付加し、該リンカー部分の塩基配列に相補的に結合可
能な塩基配列部分を有するプライマーを用いてポリメラ
ーゼ連鎖反応を行う、の工程を含むことを特徴とする核
酸の増幅方法。
方法及び標識核酸の調製方法、ならびにそのための試薬
を提供する。 【解決手段】核酸を直鎖状二本鎖ＤＮＡの形状にし、制
限酵素によって断片化し、該核酸断片に合成リンカー１
を付加し、該リンカー部分の塩基配列に相補的に結合可
能な塩基配列部分を有するプライマーを用いてポリメラ
ーゼ連鎖反応を行う、の工程を含むことを特徴とする核
酸の増幅方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、核酸の増幅方法及
びそのための試薬に関する。さらに詳しくは、直鎖状二
本鎖ＤＮＡを制限酵素で切断後、リンカーを付加し、ポ
リメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲとも示す）を行うこ
とによって、簡便に微量核酸を増幅する方法、ならびに
そのための試薬に関する。
びそのための試薬に関する。さらに詳しくは、直鎖状二
本鎖ＤＮＡを制限酵素で切断後、リンカーを付加し、ポ
リメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲとも示す）を行うこ
とによって、簡便に微量核酸を増幅する方法、ならびに
そのための試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】数々のゲノムプロジェクトの進展によ
り、その構造、すなわちデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の
塩基配列が解明され、ヒトにおいてもここ数年で完了す
るといわれ、およそ３０億塩基の中に１０万種程度の遺
伝子がコードされていると考えられている。しかしなが
ら、機能が判明している遺伝子はその１０％程度であ
り、９０％は依然としてその機能は未知である。続くポ
ストゲノムプロジェクトの一つとして、この膨大な数の
未知遺伝子の機能を個別に検索する従来の手法に代わっ
て遺伝子の動的状態（発現情報）を包括的に捉え、例え
ば、臓器の相違、刺激への応答の相違等、生体システム
としてこれら遺伝子の機能を記述する手法が採られつつ
ある。ここで着目される技術がＤＮＡアレイである。
り、その構造、すなわちデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の
塩基配列が解明され、ヒトにおいてもここ数年で完了す
るといわれ、およそ３０億塩基の中に１０万種程度の遺
伝子がコードされていると考えられている。しかしなが
ら、機能が判明している遺伝子はその１０％程度であ
り、９０％は依然としてその機能は未知である。続くポ
ストゲノムプロジェクトの一つとして、この膨大な数の
未知遺伝子の機能を個別に検索する従来の手法に代わっ
て遺伝子の動的状態（発現情報）を包括的に捉え、例え
ば、臓器の相違、刺激への応答の相違等、生体システム
としてこれら遺伝子の機能を記述する手法が採られつつ
ある。ここで着目される技術がＤＮＡアレイである。
【０００３】ＤＮＡアレイとは支持体上に高密度に多数
の核酸が配置、固定化されたもので、ナイロン膜を用い
たマクロアレイやガラスやシリコンなどの小型の基盤上
により高密度に核酸を配置したＤＮＡチップなどがあ
る。従来のノザンブロット解析ではハイブリダイゼーシ
ョンを行う際のプローブ核酸の数に限りがあったため、
一度の実験から得られる情報は限られていた。一方、リ
バースノザンブロット解析法を用いたＤＮＡアレイでは
多数のプローブを固定化しておくことによって、一度の
実験から固定化されたプローブの種類に相当するだけの
情報量が得られる。また、固定化するプローブについて
もゲノムプロジェクトの結果、膨大な数の遺伝子につい
て設計が可能となっているため、生命現象を解明する有
効な手段といえる。ＤＮＡアレイはまた癌の個性診断等
の疾患診断、薬効や副作用の予測等、医療の分野におい
ても重要な役割を果たすことが期待される。
の核酸が配置、固定化されたもので、ナイロン膜を用い
たマクロアレイやガラスやシリコンなどの小型の基盤上
により高密度に核酸を配置したＤＮＡチップなどがあ
る。従来のノザンブロット解析ではハイブリダイゼーシ
ョンを行う際のプローブ核酸の数に限りがあったため、
一度の実験から得られる情報は限られていた。一方、リ
バースノザンブロット解析法を用いたＤＮＡアレイでは
多数のプローブを固定化しておくことによって、一度の
実験から固定化されたプローブの種類に相当するだけの
情報量が得られる。また、固定化するプローブについて
もゲノムプロジェクトの結果、膨大な数の遺伝子につい
て設計が可能となっているため、生命現象を解明する有
効な手段といえる。ＤＮＡアレイはまた癌の個性診断等
の疾患診断、薬効や副作用の予測等、医療の分野におい
ても重要な役割を果たすことが期待される。
【０００４】ＤＮＡアレイを用いて遺伝子の発現量を調
べる方法として、一般的に生体試料からポリＡ+ＲＮＡ
あるいはTotal ＲＮＡを単離し、標識ヌクレオチド存在
下で逆転写反応によって標識ｃＤＮＡターゲットを調製
する。これをＤＮＡアレイにハイブリダイズさせ、支持
体上のプローブと結合した標識ターゲット量を直接的あ
るいは間接的に検出することによってそれぞれの遺伝子
の発現量を相対値化する方法が用いられる。この方法は
簡便で、かつ相対的な遺伝子の発現量を良く反映する一
方、ポリＡ+ＲＮＡの場合は２〜５μｇ、Total ＲＮＡ
の場合は５０〜２００μｇと比較的多量のＲＮＡを使用
する。そのためには１０ｍｇ程度の組織もしくは細胞が
必要とされるという問題がある。手術などで摘出される
臨床材料の場合や大量の細胞が可能な場合は有効な手段
であるが、微小な生検試料や少量の培養細胞サンプルか
らμｇ単位でのポリＡ+ＲＮＡの抽出は困難である。
べる方法として、一般的に生体試料からポリＡ+ＲＮＡ
あるいはTotal ＲＮＡを単離し、標識ヌクレオチド存在
下で逆転写反応によって標識ｃＤＮＡターゲットを調製
する。これをＤＮＡアレイにハイブリダイズさせ、支持
体上のプローブと結合した標識ターゲット量を直接的あ
るいは間接的に検出することによってそれぞれの遺伝子
の発現量を相対値化する方法が用いられる。この方法は
簡便で、かつ相対的な遺伝子の発現量を良く反映する一
方、ポリＡ+ＲＮＡの場合は２〜５μｇ、Total ＲＮＡ
の場合は５０〜２００μｇと比較的多量のＲＮＡを使用
する。そのためには１０ｍｇ程度の組織もしくは細胞が
必要とされるという問題がある。手術などで摘出される
臨床材料の場合や大量の細胞が可能な場合は有効な手段
であるが、微小な生検試料や少量の培養細胞サンプルか
らμｇ単位でのポリＡ+ＲＮＡの抽出は困難である。
【０００５】一方、微量ＲＮＡから標識サンプルを調製
する方法として、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ増幅法が用
いられる。この方法では、ＲＮＡより５'末端側にＴ７
プロモーター配列を付加されたオリゴｄＴプライマーを
用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成し、二本鎖化後、Ｔ７ Ｒ
ＮＡポリメラーゼで転写反応を行うことによって、１分
子のｃＤＮＡ（１分子のｍＲＮＡに相当）から１００分
子程度のＲＮＡが合成される。このＲＮＡを鋳型とし
て、ランダムヘキサマー、標識ヌクレオチドを用いて再
び逆転写反応を行って調製された標識ｃＤＮＡターゲッ
トをＤＮＡアレイにハイブリダイズさせ解析を可能にす
るものである。
する方法として、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ増幅法が用
いられる。この方法では、ＲＮＡより５'末端側にＴ７
プロモーター配列を付加されたオリゴｄＴプライマーを
用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成し、二本鎖化後、Ｔ７ Ｒ
ＮＡポリメラーゼで転写反応を行うことによって、１分
子のｃＤＮＡ（１分子のｍＲＮＡに相当）から１００分
子程度のＲＮＡが合成される。このＲＮＡを鋳型とし
て、ランダムヘキサマー、標識ヌクレオチドを用いて再
び逆転写反応を行って調製された標識ｃＤＮＡターゲッ
トをＤＮＡアレイにハイブリダイズさせ解析を可能にす
るものである。
【０００６】この方法で懸念されるのは、遺伝子毎の増
幅効率が同じでないため、増幅したものを利用した結果
はそうでない場合と必ずしも同一でない。しかしなが
ら、ＤＮＡアレイでは遺伝子間の発現量を比較するもの
ではなく、同一遺伝子の発現量を２種類以上のサンプル
の間で比較するものであるので、比較されるサンプル間
で同じ遺伝子が同じように増幅されるのであれば、増幅
効率の差が結果に及ぼす影響はさほど大きくないとされ
る。とはいえ、このＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ増幅法で
は反応過程で不安定なＲＮＡを扱うことになるため、Ｒ
ＮＡ分解酵素の混入等によるサンプルの分解の影響が懸
念される。また、逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼ、逆
転写酵素という一連の反応において複数の酵素が用いら
れ、遺伝子間で増幅効率のバイアスが生じる可能性が高
くなる上、一連の反応での増幅効率が十分でないため、
特にサンプルが微量の場合、複数回このような反応過程
を繰り返さなければならない。そこで、これらの問題点
を克服した方法の開発が必要とされていた。
幅効率が同じでないため、増幅したものを利用した結果
はそうでない場合と必ずしも同一でない。しかしなが
ら、ＤＮＡアレイでは遺伝子間の発現量を比較するもの
ではなく、同一遺伝子の発現量を２種類以上のサンプル
の間で比較するものであるので、比較されるサンプル間
で同じ遺伝子が同じように増幅されるのであれば、増幅
効率の差が結果に及ぼす影響はさほど大きくないとされ
る。とはいえ、このＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ増幅法で
は反応過程で不安定なＲＮＡを扱うことになるため、Ｒ
ＮＡ分解酵素の混入等によるサンプルの分解の影響が懸
念される。また、逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼ、逆
転写酵素という一連の反応において複数の酵素が用いら
れ、遺伝子間で増幅効率のバイアスが生じる可能性が高
くなる上、一連の反応での増幅効率が十分でないため、
特にサンプルが微量の場合、複数回このような反応過程
を繰り返さなければならない。そこで、これらの問題点
を克服した方法の開発が必要とされていた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、微量
の核酸から簡便に効率よく核酸を増幅する方法及び標識
核酸の調製方法、ならびにそのための試薬を提供するこ
とにある。
の核酸から簡便に効率よく核酸を増幅する方法及び標識
核酸の調製方法、ならびにそのための試薬を提供するこ
とにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
を重ねた結果、微量核酸の遺伝子集団構成を維持しつ
つ、かつ効率よく増幅する方法に着目し、種々検討を重
ねた結果、二本鎖ＤＮＡを合成後、制限酵素処理による
断片化を行い、合成リンカーの付加及びＰＣＲを行うこ
とにより、簡便かつ効率よく微量核酸を増幅できること
を見出し、本発明を完成させるに至った。
を重ねた結果、微量核酸の遺伝子集団構成を維持しつ
つ、かつ効率よく増幅する方法に着目し、種々検討を重
ねた結果、二本鎖ＤＮＡを合成後、制限酵素処理による
断片化を行い、合成リンカーの付加及びＰＣＲを行うこ
とにより、簡便かつ効率よく微量核酸を増幅できること
を見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】すなわち、本発明は以下のような構成から
なる。 （１）以下の工程を含むことを特徴とする核酸の増幅方
法。 核酸を直鎖状二本鎖ＤＮＡの形状にし、 制限酵素によって断片化し、 該核酸断片に合成リンカー１を付加し、 該リンカー部分の塩基配列に相補的に結合可能な塩基
配列部分を有するプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖
反応を行う （２）ポリＡ+ＲＮＡよりオリゴｄＴプライマーを用い
て一本鎖ｃＤＮＡを合成し、一本鎖ｃＤＮＡを直鎖状二
本鎖ｃＤＮＡの形状にする（１）に記載の核酸の増幅方
法。 （３）オリゴｄＴプライマーが、合成リンカー１の一方
の鎖と少なくとも部分的に同じ塩基配列で、かつポリメ
ラーゼ連鎖反応のプライマーと少なくとも部分的に同じ
塩基配列を５'末端に有する（１）または（２）に記載
の核酸の増幅方法。 （４）該直鎖状二本鎖ＤＮＡの、断片化前、断片化後、
もしくは合成リンカー１の付加と同時に、該直鎖状二本
鎖ＤＮＡの末端に合成リンカー２を付加する（１）〜
（３）のいずれかに記載の核酸の増幅方法。 （５）制限酵素が４〜８塩基認識の制限酵素である
（１）〜（４）のいずれかに記載の核酸の増幅方法。 （６）制限酵素が５塩基認識の制限酵素である（５）に
記載の核酸の増幅方法。 （７）制限酵素がＢｓｓＫＩ、ＭａｅIII、ＤｄｅＩ、
ＨｉｎｆＩ、Ｓａｕ９６Ｉ（ＡｓｕＩ，Ｃｆｒ１３
Ｉ）、ＳｃｒＦＩ、Ｆｎｕ４ＨＩ、ＥｃｏＲII、Ｔｆｉ
Ｉ、ＴｓｅＩ、Ｅｃｏ４７Ｉ（ＡｖａII）、ＭｖａＩ、
Ｔｓｐ４５Ｉ、ＮｃｉＩ（ＢｃｎＩ、ＣａｕII）からな
る群より選択される（５）に記載の核酸の増幅方法。 （８）合成リンカー１が二本の一本鎖合成ＤＮＡがアニ
ーリングにより二本鎖ＤＮＡとなった際に、一方が平滑
末端であるが他方は突出末端であるような合成リンカー
である（１）〜（７）のいずれかに記載の核酸の増幅方
法。 （９）合成リンカー１の突出末端が５'末端の方が１塩
基以上突出した形状である（８）に記載の核酸の増幅方
法。 （１０）合成リンカー１の突出末端が３'末端の方が１
塩基以上突出した形状である（８）に記載の核酸の増幅
方法。 （１１）合成リンカー２が合成リンカー１と少なくとも
部分的に同じ塩基配列を有する（４）に記載の核酸の増
幅方法。 （１２）合成リンカー２の少なくとも一方の末端が平滑
末端である（１１）に記載の核酸の増幅方法。 （１３）合成リンカー１および合成リンカー２がその塩
基配列中にパリンドローム構造を含まない塩基配列であ
る（４）に記載の核酸の増幅方法。 （１４）以下の工程を含むことを特徴とする標識核酸の
調製方法。 核酸を直鎖状二本鎖ＤＮＡの形状にし、 制限酵素によって断片化し、 該核酸断片に合成リンカー１を付加し、 該リンカー部分の塩基配列の相補的に結合可能な塩基
配列部分を有するプライマーを用いて標識ヌクレオチド
存在下ポリメラーゼ連鎖反応を行う （１５）以下の工程を含むことを特徴とする標識核酸の
調製方法。 核酸を直鎖状二本鎖ＤＮＡの形状にし、 制限酵素によって断片化し、 この核酸断片に合成リンカー１を付加し、 該リンカー部分の塩基配列に相補的に結合可能な塩基
配列部分を有する標識プライマーを用いてポリメラーゼ
連鎖反応を行う （１６）ポリＡ+ＲＮＡよりオリゴｄＴプライマーを用
いて一本鎖ｃＤＮＡを合成し、一本鎖ｃＤＮＡを直鎖状
二本鎖ｃＤＮＡの形状にする（１４）または（１５）に
記載の標識核酸の調製方法。 （１７）オリゴｄＴプライマーが、合成リンカー１の一
方の鎖と少なくとも部分的に同じ塩基配列で、かつポリ
メラーゼ連鎖反応のプライマーに相補的に結合可能な塩
基配列を５'末端に有する（１６）に記載の標識核酸の
調製方法。 （１８）該直鎖状二本鎖ＤＮＡの、断片化前、断片化
後、もしくは合成リンカー１の付加と同時に、該直鎖状
二本鎖ＤＮＡの末端に合成リンカー２を付加する（１
４）〜（１７）のいずれかに記載の標識核酸の調製方
法。 （１９）制限酵素が４〜８塩基認識の制限酵素である
（１４）〜（１８）のいずれかに記載の標識核酸の調製
方法。 （２０）制限酵素が５塩基認識の制限酵素である（１
９）に記載の標識核酸の調製方法。 （２１）制限酵素がＢｓｓＫＩ、ＭａｅIII、Ｄｄｅ
Ｉ、ＨｉｎｆＩ、Ｓａｕ９６Ｉ（ＡｓｕＩ，Ｃｆｒ１３
Ｉ）、ＳｃｒＦＩ、Ｆｎｕ４ＨＩ、ＥｃｏＲII、Ｔｆｉ
Ｉ、ＴｓｅＩ、Ｅｃｏ４７Ｉ（ＡｖａII）、ＭｖａＩ、
Ｔｓｐ４５Ｉ、ＮｃｉＩ（ＢｃｎＩ、ＣａｕII）からな
る群より選択される（１９）に記載の標識核酸の調製方
法。 （２２）合成リンカー１が、二本の一本鎖合成ＤＮＡが
アニーリングにより二本鎖ＤＮＡとなった際に、一方が
平滑末端であるが他方は突出末端であるような合成リン
カーである（１４）〜（２１）のいずれかに記載の標識
核酸の調製方法。 （２３）合成リンカー１の突出末端が５'末端の方が１
塩基以上突出した形状である（２１）に記載の標識核酸
の調製方法。 （２４）合成リンカー１の突出末端が３'末端の方が１
塩基以上突出した形状である請求項２１に記載の標識核
酸の調製方法。 （２５）合成リンカー２が合成リンカー１と少なくとも
部分的に同じ塩基配列を有する（１８）に記載の標識核
酸の調製方法。 （２６）合成リンカー２の少なくとも一方の末端が平滑
末端である（２５）に記載の標識核酸の調製方法。 （２７）合成リンカー１および合成リンカー２がその塩
基配列中にパリンドローム構造を含まない塩基配列であ
る（１８）に記載の標識核酸の調製方法。 （２８）ＤＮＡポリメラーゼ、制限酵素、合成リンカー
１、ＤＮＡリガーゼ、該合成リンカー１に相補的に結合
可能な塩基配列部分を有するプライマー、ＰＣＲ酵素を
含むことを特徴とする（１）に記載の方法により核酸の
増幅を行うための核酸増幅用キット。 （２９）直鎖状二本鎖ＤＮＡの末端に合成リンカー２を
付加することを含む（２８）に記載の核酸増幅用キッ
ト。 （３０）ＤＮＡポリメラーゼ、制限酵素、合成リンカー
１、ＤＮＡリガーゼ、該合成リンカー１に相補的に結合
可能な塩基配列部分を有するプライマー、ＰＣＲ酵素、
標識ヌクレオチドを含むことを特徴とする（１４）に記
載の方法により標識核酸を調製するための標識核酸調製
用キット。 （３１）ＤＮＡポリメラーゼ、制限酵素、合成リンカー
１、ＤＮＡリガーゼ、該合成リンカー１に相補的に結合
可能な塩基配列部分を有する標識プライマー、ＰＣＲ酵
素を含むことを特徴とする（１５）に記載の方法により
標識核酸を調製するための標識核酸調製用キット。 （３２）直鎖状二本鎖ＤＮＡの末端に合成リンカー２を
付加することを含む（３０）または（３１）に記載の標
識核酸調製用キット。 （３３）逆転写酵素、オリゴｄＴプライマー、ＤＮＡポ
リメラーゼ、リボヌクレアーゼＨ、制限酵素、合成リン
カー１、ＤＮＡリガーゼ、該合成リンカー１に相補的に
結合可能な塩基配列部分を有するプライマー、ＰＣＲ酵
素を含むことを特徴とする（１）に記載の方法により核
酸の増幅を行うためのｃＤＮＡ増幅用キット。 （３４）逆転写酵素、オリゴｄＴプライマー、ＤＮＡポ
リメラーゼ、リボヌクレアーゼＨ、制限酵素、合成リン
カー１、ＤＮＡリガーゼ、該合成リンカー１に相補的に
結合可能な塩基配列部分を有するプライマー、ＰＣＲ酵
素、標識ヌクレオチドを含むことを特徴とする（１４）
に記載の方法により標識ｃＤＮＡを調製するための標識
ｃＤＮＡ調製用キット。 （３５）逆転写酵素、オリゴｄＴプライマー、ＤＮＡポ
リメラーゼ、リボヌクレアーゼＨ、制限酵素、合成リン
カー１、ＤＮＡリガーゼ、該合成リンカー１に相補的に
結合可能な塩基配列部分を有する標識プライマー、ＰＣ
Ｒ酵素、を含むことを特徴とする（１５）に記載の方法
により標識ｃＤＮＡを調製するための標識ｃＤＮＡ調製
用キット。 （３６）直鎖状二本鎖ＤＮＡの末端に合成リンカー２を
付加することを含む（３３）〜（３５）のいずれかに記
載の標識ｃＤＮＡ調製用キット。 （３７）オリゴｄＴプライマーが、合成リンカー１の一
方の鎖と少なくとも部分的に同じ塩基配列で、かつポリ
メラーゼ連鎖反応のプライマーに相補的に結合可能な塩
基配列を５’末端に有する（３４）〜（３６）のいずれ
かに記載の標識ｃＤＮＡ調製用キット。
なる。 （１）以下の工程を含むことを特徴とする核酸の増幅方
法。 核酸を直鎖状二本鎖ＤＮＡの形状にし、 制限酵素によって断片化し、 該核酸断片に合成リンカー１を付加し、 該リンカー部分の塩基配列に相補的に結合可能な塩基
配列部分を有するプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖
反応を行う （２）ポリＡ+ＲＮＡよりオリゴｄＴプライマーを用い
て一本鎖ｃＤＮＡを合成し、一本鎖ｃＤＮＡを直鎖状二
本鎖ｃＤＮＡの形状にする（１）に記載の核酸の増幅方
法。 （３）オリゴｄＴプライマーが、合成リンカー１の一方
の鎖と少なくとも部分的に同じ塩基配列で、かつポリメ
ラーゼ連鎖反応のプライマーと少なくとも部分的に同じ
塩基配列を５'末端に有する（１）または（２）に記載
の核酸の増幅方法。 （４）該直鎖状二本鎖ＤＮＡの、断片化前、断片化後、
もしくは合成リンカー１の付加と同時に、該直鎖状二本
鎖ＤＮＡの末端に合成リンカー２を付加する（１）〜
（３）のいずれかに記載の核酸の増幅方法。 （５）制限酵素が４〜８塩基認識の制限酵素である
（１）〜（４）のいずれかに記載の核酸の増幅方法。 （６）制限酵素が５塩基認識の制限酵素である（５）に
記載の核酸の増幅方法。 （７）制限酵素がＢｓｓＫＩ、ＭａｅIII、ＤｄｅＩ、
ＨｉｎｆＩ、Ｓａｕ９６Ｉ（ＡｓｕＩ，Ｃｆｒ１３
Ｉ）、ＳｃｒＦＩ、Ｆｎｕ４ＨＩ、ＥｃｏＲII、Ｔｆｉ
Ｉ、ＴｓｅＩ、Ｅｃｏ４７Ｉ（ＡｖａII）、ＭｖａＩ、
Ｔｓｐ４５Ｉ、ＮｃｉＩ（ＢｃｎＩ、ＣａｕII）からな
る群より選択される（５）に記載の核酸の増幅方法。 （８）合成リンカー１が二本の一本鎖合成ＤＮＡがアニ
ーリングにより二本鎖ＤＮＡとなった際に、一方が平滑
末端であるが他方は突出末端であるような合成リンカー
である（１）〜（７）のいずれかに記載の核酸の増幅方
法。 （９）合成リンカー１の突出末端が５'末端の方が１塩
基以上突出した形状である（８）に記載の核酸の増幅方
法。 （１０）合成リンカー１の突出末端が３'末端の方が１
塩基以上突出した形状である（８）に記載の核酸の増幅
方法。 （１１）合成リンカー２が合成リンカー１と少なくとも
部分的に同じ塩基配列を有する（４）に記載の核酸の増
幅方法。 （１２）合成リンカー２の少なくとも一方の末端が平滑
末端である（１１）に記載の核酸の増幅方法。 （１３）合成リンカー１および合成リンカー２がその塩
基配列中にパリンドローム構造を含まない塩基配列であ
る（４）に記載の核酸の増幅方法。 （１４）以下の工程を含むことを特徴とする標識核酸の
調製方法。 核酸を直鎖状二本鎖ＤＮＡの形状にし、 制限酵素によって断片化し、 該核酸断片に合成リンカー１を付加し、 該リンカー部分の塩基配列の相補的に結合可能な塩基
配列部分を有するプライマーを用いて標識ヌクレオチド
存在下ポリメラーゼ連鎖反応を行う （１５）以下の工程を含むことを特徴とする標識核酸の
調製方法。 核酸を直鎖状二本鎖ＤＮＡの形状にし、 制限酵素によって断片化し、 この核酸断片に合成リンカー１を付加し、 該リンカー部分の塩基配列に相補的に結合可能な塩基
配列部分を有する標識プライマーを用いてポリメラーゼ
連鎖反応を行う （１６）ポリＡ+ＲＮＡよりオリゴｄＴプライマーを用
いて一本鎖ｃＤＮＡを合成し、一本鎖ｃＤＮＡを直鎖状
二本鎖ｃＤＮＡの形状にする（１４）または（１５）に
記載の標識核酸の調製方法。 （１７）オリゴｄＴプライマーが、合成リンカー１の一
方の鎖と少なくとも部分的に同じ塩基配列で、かつポリ
メラーゼ連鎖反応のプライマーに相補的に結合可能な塩
基配列を５'末端に有する（１６）に記載の標識核酸の
調製方法。 （１８）該直鎖状二本鎖ＤＮＡの、断片化前、断片化
後、もしくは合成リンカー１の付加と同時に、該直鎖状
二本鎖ＤＮＡの末端に合成リンカー２を付加する（１
４）〜（１７）のいずれかに記載の標識核酸の調製方
法。 （１９）制限酵素が４〜８塩基認識の制限酵素である
（１４）〜（１８）のいずれかに記載の標識核酸の調製
方法。 （２０）制限酵素が５塩基認識の制限酵素である（１
９）に記載の標識核酸の調製方法。 （２１）制限酵素がＢｓｓＫＩ、ＭａｅIII、Ｄｄｅ
Ｉ、ＨｉｎｆＩ、Ｓａｕ９６Ｉ（ＡｓｕＩ，Ｃｆｒ１３
Ｉ）、ＳｃｒＦＩ、Ｆｎｕ４ＨＩ、ＥｃｏＲII、Ｔｆｉ
Ｉ、ＴｓｅＩ、Ｅｃｏ４７Ｉ（ＡｖａII）、ＭｖａＩ、
Ｔｓｐ４５Ｉ、ＮｃｉＩ（ＢｃｎＩ、ＣａｕII）からな
る群より選択される（１９）に記載の標識核酸の調製方
法。 （２２）合成リンカー１が、二本の一本鎖合成ＤＮＡが
アニーリングにより二本鎖ＤＮＡとなった際に、一方が
平滑末端であるが他方は突出末端であるような合成リン
カーである（１４）〜（２１）のいずれかに記載の標識
核酸の調製方法。 （２３）合成リンカー１の突出末端が５'末端の方が１
塩基以上突出した形状である（２１）に記載の標識核酸
の調製方法。 （２４）合成リンカー１の突出末端が３'末端の方が１
塩基以上突出した形状である請求項２１に記載の標識核
酸の調製方法。 （２５）合成リンカー２が合成リンカー１と少なくとも
部分的に同じ塩基配列を有する（１８）に記載の標識核
酸の調製方法。 （２６）合成リンカー２の少なくとも一方の末端が平滑
末端である（２５）に記載の標識核酸の調製方法。 （２７）合成リンカー１および合成リンカー２がその塩
基配列中にパリンドローム構造を含まない塩基配列であ
る（１８）に記載の標識核酸の調製方法。 （２８）ＤＮＡポリメラーゼ、制限酵素、合成リンカー
１、ＤＮＡリガーゼ、該合成リンカー１に相補的に結合
可能な塩基配列部分を有するプライマー、ＰＣＲ酵素を
含むことを特徴とする（１）に記載の方法により核酸の
増幅を行うための核酸増幅用キット。 （２９）直鎖状二本鎖ＤＮＡの末端に合成リンカー２を
付加することを含む（２８）に記載の核酸増幅用キッ
ト。 （３０）ＤＮＡポリメラーゼ、制限酵素、合成リンカー
１、ＤＮＡリガーゼ、該合成リンカー１に相補的に結合
可能な塩基配列部分を有するプライマー、ＰＣＲ酵素、
標識ヌクレオチドを含むことを特徴とする（１４）に記
載の方法により標識核酸を調製するための標識核酸調製
用キット。 （３１）ＤＮＡポリメラーゼ、制限酵素、合成リンカー
１、ＤＮＡリガーゼ、該合成リンカー１に相補的に結合
可能な塩基配列部分を有する標識プライマー、ＰＣＲ酵
素を含むことを特徴とする（１５）に記載の方法により
標識核酸を調製するための標識核酸調製用キット。 （３２）直鎖状二本鎖ＤＮＡの末端に合成リンカー２を
付加することを含む（３０）または（３１）に記載の標
識核酸調製用キット。 （３３）逆転写酵素、オリゴｄＴプライマー、ＤＮＡポ
リメラーゼ、リボヌクレアーゼＨ、制限酵素、合成リン
カー１、ＤＮＡリガーゼ、該合成リンカー１に相補的に
結合可能な塩基配列部分を有するプライマー、ＰＣＲ酵
素を含むことを特徴とする（１）に記載の方法により核
酸の増幅を行うためのｃＤＮＡ増幅用キット。 （３４）逆転写酵素、オリゴｄＴプライマー、ＤＮＡポ
リメラーゼ、リボヌクレアーゼＨ、制限酵素、合成リン
カー１、ＤＮＡリガーゼ、該合成リンカー１に相補的に
結合可能な塩基配列部分を有するプライマー、ＰＣＲ酵
素、標識ヌクレオチドを含むことを特徴とする（１４）
に記載の方法により標識ｃＤＮＡを調製するための標識
ｃＤＮＡ調製用キット。 （３５）逆転写酵素、オリゴｄＴプライマー、ＤＮＡポ
リメラーゼ、リボヌクレアーゼＨ、制限酵素、合成リン
カー１、ＤＮＡリガーゼ、該合成リンカー１に相補的に
結合可能な塩基配列部分を有する標識プライマー、ＰＣ
Ｒ酵素、を含むことを特徴とする（１５）に記載の方法
により標識ｃＤＮＡを調製するための標識ｃＤＮＡ調製
用キット。 （３６）直鎖状二本鎖ＤＮＡの末端に合成リンカー２を
付加することを含む（３３）〜（３５）のいずれかに記
載の標識ｃＤＮＡ調製用キット。 （３７）オリゴｄＴプライマーが、合成リンカー１の一
方の鎖と少なくとも部分的に同じ塩基配列で、かつポリ
メラーゼ連鎖反応のプライマーに相補的に結合可能な塩
基配列を５’末端に有する（３４）〜（３６）のいずれ
かに記載の標識ｃＤＮＡ調製用キット。
【００１０】
【発明の実施の形態】以下に本発明を詳細に説明する。
本発明における核酸としては、ＤＮＡ及びＲＮＡのいず
れでも構わない。その中には、例えば、ゲノムＤＮＡ、
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ；真核生物では特にポ
リＡ+ＲＮＡ）、ウイルスＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ等す
べてが含まれる。
本発明における核酸としては、ＤＮＡ及びＲＮＡのいず
れでも構わない。その中には、例えば、ゲノムＤＮＡ、
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ；真核生物では特にポ
リＡ+ＲＮＡ）、ウイルスＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ等す
べてが含まれる。
【００１１】本発明では、まず試料より分離された核酸
を直鎖状二本鎖ＤＮＡの形状にする。試料より核酸を分
離する方法は常法に従い行うことができ、ＳＤＳ−プロ
テアーゼ法やグアニジンチオシアネート法がその代表的
な方法であるが、市販の試薬を用いても良い。核酸が一
本鎖ＤＮＡあるいはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの場
合、多くの制限酵素は次工程における配列特異的な切断
を行うことができない、あるいは切断効率が極めて低い
ことから、核酸の直鎖状二本鎖ＤＮＡ化が重要なステッ
プとなる。本法を図１にまとめる。
を直鎖状二本鎖ＤＮＡの形状にする。試料より核酸を分
離する方法は常法に従い行うことができ、ＳＤＳ−プロ
テアーゼ法やグアニジンチオシアネート法がその代表的
な方法であるが、市販の試薬を用いても良い。核酸が一
本鎖ＤＮＡあるいはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの場
合、多くの制限酵素は次工程における配列特異的な切断
を行うことができない、あるいは切断効率が極めて低い
ことから、核酸の直鎖状二本鎖ＤＮＡ化が重要なステッ
プとなる。本法を図１にまとめる。
【００１２】核酸の二本鎖ＤＮＡの形状にする方法の一
つには、一本鎖ＤＮＡに相補的に結合可能なプライマー
あるいはランダムオリゴヌクレオチドをアニーリングさ
せ、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応によって相補鎖
を合成する方法がある。特にランダムオリゴヌクレオチ
ドを用いて合成された場合、二本鎖ＤＮＡがニック（切
れ目）を含むため、ＤＮＡリガーゼによって連結させる
ことが望ましい。
つには、一本鎖ＤＮＡに相補的に結合可能なプライマー
あるいはランダムオリゴヌクレオチドをアニーリングさ
せ、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応によって相補鎖
を合成する方法がある。特にランダムオリゴヌクレオチ
ドを用いて合成された場合、二本鎖ＤＮＡがニック（切
れ目）を含むため、ＤＮＡリガーゼによって連結させる
ことが望ましい。
【００１３】さらに、試料中の核酸がポリＡ+ＲＮＡの
場合、直鎖状二本鎖ＤＮＡの合成は、例えば一般的なＲ
ＮａｓｅＨ（リボヌクレアーゼＨ）法を用いて行っても
よい。すなわち、まずオリゴｄＴプライマーをＲＮＡの
ポリＡ領域にアニーリングさせ、逆転写酵素で一本鎖ｃ
ＤＮＡを合成することによって、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブ
リッドを生成する。オリゴｄＴプライマーは、ＰＣＲの
際におけるプライマーのアニーリングをせしめる点か
ら、合成リンカー１の一方の鎖と少なくとも部分的に、
好ましくは１５塩基以上、より好ましくは２０塩基以上
が同じ塩基配列で、かつポリメラーゼ連鎖反応のプライ
マーと少なくとも部分的に同じ塩基配列を５'末端に有
することが好ましい。続いて、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮＡポ
リメラーゼを反応させて、ＲＮＡにニックを挿入しなが
ら、このＲＮＡ断片をプライマーとして二本鎖ｃＤＮＡ
を合成する。この伸長反応後、あるいは伸長反応と同時
にＤＮＡリガーゼを反応させて、ニックを埋めて二本鎖
ｃＤＮＡが合成される。ただし、ポリＡ+ＲＮＡの場
合、本法を用いる前にＤＮａｓｅ処理などの適当な処理
を行ってゲノムＤＮＡなどの不必要なＤＮＡを除いた後
でｃＤＮＡの合成を行うことが望ましい。
場合、直鎖状二本鎖ＤＮＡの合成は、例えば一般的なＲ
ＮａｓｅＨ（リボヌクレアーゼＨ）法を用いて行っても
よい。すなわち、まずオリゴｄＴプライマーをＲＮＡの
ポリＡ領域にアニーリングさせ、逆転写酵素で一本鎖ｃ
ＤＮＡを合成することによって、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブ
リッドを生成する。オリゴｄＴプライマーは、ＰＣＲの
際におけるプライマーのアニーリングをせしめる点か
ら、合成リンカー１の一方の鎖と少なくとも部分的に、
好ましくは１５塩基以上、より好ましくは２０塩基以上
が同じ塩基配列で、かつポリメラーゼ連鎖反応のプライ
マーと少なくとも部分的に同じ塩基配列を５'末端に有
することが好ましい。続いて、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮＡポ
リメラーゼを反応させて、ＲＮＡにニックを挿入しなが
ら、このＲＮＡ断片をプライマーとして二本鎖ｃＤＮＡ
を合成する。この伸長反応後、あるいは伸長反応と同時
にＤＮＡリガーゼを反応させて、ニックを埋めて二本鎖
ｃＤＮＡが合成される。ただし、ポリＡ+ＲＮＡの場
合、本法を用いる前にＤＮａｓｅ処理などの適当な処理
を行ってゲノムＤＮＡなどの不必要なＤＮＡを除いた後
でｃＤＮＡの合成を行うことが望ましい。
【００１４】本発明における上記工程では、直鎖状二本
鎖ＤＮＡの両端が平滑末端で、かつ核酸断片の両端も平
滑末端の場合、平滑末端を有する合成リンカーを用いれ
ばいずれの核酸断片の両端にも合成リンカーを付加さ
れ、ほぼ同等に効率よく増幅される。一方、該直鎖状二
本鎖ＤＮＡの断片化の際、好ましい平均鎖長を与える制
限酵素は突出末端を生ずるものが多く。さらに、合成リ
ンカーを付加する際には突出末端の方が効率が良い。し
かしながら、上記の制限酵素を用いる方法では直鎖状二
本鎖ＤＮＡの両端に相当する末端には合成リンカーが付
加されず、該両端にあたる核酸断片の増幅が十分に行わ
れないことが考えられる。そこで、核酸がポリＡ+ＲＮ
Ａの場合、一本鎖ｃＤＮＡを合成する工程において、オ
リゴｄＴプライマーの５'末端に合成リンカー１の一方
の鎖のポリメラーゼ連鎖反応に用いるプライマーと少な
くとも部分的に同じ塩基配列部分を付加することによっ
て、ポリＡ+ＲＮＡの３'末端に相当する二本鎖ｃＤＮＡ
断片に対しても両端にリンカー配列が付加され効率よく
増幅することが可能になる。上記工程を図２に示す。ｃ
ＤＮＡアレイ固定化されるプローブとしては、ＥＳＴク
ローンをはじめポリＡ +ＲＮＡの３‘末端に近い領域の
ものが多く上記の方法は特に有効である。
鎖ＤＮＡの両端が平滑末端で、かつ核酸断片の両端も平
滑末端の場合、平滑末端を有する合成リンカーを用いれ
ばいずれの核酸断片の両端にも合成リンカーを付加さ
れ、ほぼ同等に効率よく増幅される。一方、該直鎖状二
本鎖ＤＮＡの断片化の際、好ましい平均鎖長を与える制
限酵素は突出末端を生ずるものが多く。さらに、合成リ
ンカーを付加する際には突出末端の方が効率が良い。し
かしながら、上記の制限酵素を用いる方法では直鎖状二
本鎖ＤＮＡの両端に相当する末端には合成リンカーが付
加されず、該両端にあたる核酸断片の増幅が十分に行わ
れないことが考えられる。そこで、核酸がポリＡ+ＲＮ
Ａの場合、一本鎖ｃＤＮＡを合成する工程において、オ
リゴｄＴプライマーの５'末端に合成リンカー１の一方
の鎖のポリメラーゼ連鎖反応に用いるプライマーと少な
くとも部分的に同じ塩基配列部分を付加することによっ
て、ポリＡ+ＲＮＡの３'末端に相当する二本鎖ｃＤＮＡ
断片に対しても両端にリンカー配列が付加され効率よく
増幅することが可能になる。上記工程を図２に示す。ｃ
ＤＮＡアレイ固定化されるプローブとしては、ＥＳＴク
ローンをはじめポリＡ +ＲＮＡの３‘末端に近い領域の
ものが多く上記の方法は特に有効である。
【００１５】さらに本発明者らは、直鎖状二本鎖ｃＤＮ
Ａの５'末端断片や制限酵素の認識配列を含まないＤＮ
Ａの増幅が必要な場合、及び核酸がポリＡ+ＲＮＡでな
い場合に上記問題を解消する方法を見出した。つまり、
エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを
用いて二本鎖ＤＮＡの両端を平滑末端化し、平滑末端を
有する合成リンカー２を付加するものであるが、上記付
加反応は突出末端を生じる制限酵素による断片化後でも
可能である。さらに、上記付加反応は制限酵素による切
断部位の突出末端への合成リンカー１の付加反応と同時
に行うことで操作はより簡略化できるが、この際大腸菌
由来のリガーゼは平滑末端を連結できないため、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼなど平滑末端の連結可能なリガーゼを使
用することが好ましい。上記工程を図３に示す。
Ａの５'末端断片や制限酵素の認識配列を含まないＤＮ
Ａの増幅が必要な場合、及び核酸がポリＡ+ＲＮＡでな
い場合に上記問題を解消する方法を見出した。つまり、
エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを
用いて二本鎖ＤＮＡの両端を平滑末端化し、平滑末端を
有する合成リンカー２を付加するものであるが、上記付
加反応は突出末端を生じる制限酵素による断片化後でも
可能である。さらに、上記付加反応は制限酵素による切
断部位の突出末端への合成リンカー１の付加反応と同時
に行うことで操作はより簡略化できるが、この際大腸菌
由来のリガーゼは平滑末端を連結できないため、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼなど平滑末端の連結可能なリガーゼを使
用することが好ましい。上記工程を図３に示す。
【００１６】本発明においては、ＰＣＲによる増幅を行
うに際して、制限酵素を使用することにより該直鎖状二
本鎖ＤＮＡの断片化を行うことを特徴とする。本発明で
使用する制限酵素は好ましくは４〜８塩基のパリンドロ
ームを認識し、かつ突出末端を生じるものであれば特に
限定されないが、５塩基認識程度のものがより好まし
い。４塩基認識の制限酵素の場合、二本鎖ＤＮＡが細分
化し過ぎてしまうため、例えばＤＮＡアレイの標識ｃＤ
ＮＡターゲットとしては望ましくない。６塩基以上を認
識する制限酵素では断片化が十分行われないため、特に
長鎖の断片ではＰＣＲの際に増幅効率が低く、さらに短
鎖のものが専ら増幅され、増幅効率に偏りも生じること
が考えられる。一方、５塩基認識の制限酵素では断片の
平均鎖長が５００塩基程度と予想され、ＰＣＲによる増
幅効率も問題なく、ハイブリダイゼーションのプローブ
長としても最適である。５塩基のパリンドロームを認識
し、かつ突出末端を生じる制限酵素としては、例えば、
ＢｓｓＫＩ、ＭａｅIII、ＤｄｅＩ、ＨｉｎｆＩ、Ｓａ
ｕ９６Ｉ（ＡｓｕＩ，Ｃｆｒ１３Ｉ）、ＳｃｒＦＩ、Ｆ
ｎｕ４ＨＩ、ＥｃｏＲII、ＴｆｉＩ、ＴｓｅＩ、Ｅｃｏ
４７Ｉ（ＡｖａII）、ＭｖａＩ、Ｔｓｐ４５Ｉ、Ｎｃｉ
Ｉ（ＢｃｎＩ、ＣａｕII）等が挙げられるが、特に限定
されない。このようにして断片化処理を行った後、増幅
された産物は、ＤＮＡアレイ実験のような遺伝子プロフ
ァイリングを行うのに適している。
うに際して、制限酵素を使用することにより該直鎖状二
本鎖ＤＮＡの断片化を行うことを特徴とする。本発明で
使用する制限酵素は好ましくは４〜８塩基のパリンドロ
ームを認識し、かつ突出末端を生じるものであれば特に
限定されないが、５塩基認識程度のものがより好まし
い。４塩基認識の制限酵素の場合、二本鎖ＤＮＡが細分
化し過ぎてしまうため、例えばＤＮＡアレイの標識ｃＤ
ＮＡターゲットとしては望ましくない。６塩基以上を認
識する制限酵素では断片化が十分行われないため、特に
長鎖の断片ではＰＣＲの際に増幅効率が低く、さらに短
鎖のものが専ら増幅され、増幅効率に偏りも生じること
が考えられる。一方、５塩基認識の制限酵素では断片の
平均鎖長が５００塩基程度と予想され、ＰＣＲによる増
幅効率も問題なく、ハイブリダイゼーションのプローブ
長としても最適である。５塩基のパリンドロームを認識
し、かつ突出末端を生じる制限酵素としては、例えば、
ＢｓｓＫＩ、ＭａｅIII、ＤｄｅＩ、ＨｉｎｆＩ、Ｓａ
ｕ９６Ｉ（ＡｓｕＩ，Ｃｆｒ１３Ｉ）、ＳｃｒＦＩ、Ｆ
ｎｕ４ＨＩ、ＥｃｏＲII、ＴｆｉＩ、ＴｓｅＩ、Ｅｃｏ
４７Ｉ（ＡｖａII）、ＭｖａＩ、Ｔｓｐ４５Ｉ、Ｎｃｉ
Ｉ（ＢｃｎＩ、ＣａｕII）等が挙げられるが、特に限定
されない。このようにして断片化処理を行った後、増幅
された産物は、ＤＮＡアレイ実験のような遺伝子プロフ
ァイリングを行うのに適している。
【００１７】本発明で使用する合成リンカー１は特に制
限されるものではないが、一方は平滑末端であるが他方
は制限酵素により断片化された二本鎖ＤＮＡの突出末端
と相補的な突出末端を有する合成リンカーであることが
望ましい。二本の一本鎖合成ＤＮＡがアニーリングによ
り二本鎖ＤＮＡとなった際に、一方が核酸断片の突出末
端に相補的に結合可能な突出末端であれば、他方の末端
の態様は特に限定されない。しかしながら、もう一方と
同様な突出末端の場合、リンカーの重合やパリンドロー
ムの原因となるため、平滑末端であることが好ましい。
断片化で使用した制限酵素が５塩基認識の場合の３塩基
目として、または７塩基認識の場合４塩基目として複数
種類の塩基の認識が可能であり、生じる突出末端も複数
種類になる場合がある。この場合、合成リンカーも突出
末端を形成する一本鎖ｃＤＮＡを複数種混ぜて相補鎖と
アニーリングさせるか、複数種の突出末端を持つ合成リ
ンカーを混ぜて付加することが望ましい。
限されるものではないが、一方は平滑末端であるが他方
は制限酵素により断片化された二本鎖ＤＮＡの突出末端
と相補的な突出末端を有する合成リンカーであることが
望ましい。二本の一本鎖合成ＤＮＡがアニーリングによ
り二本鎖ＤＮＡとなった際に、一方が核酸断片の突出末
端に相補的に結合可能な突出末端であれば、他方の末端
の態様は特に限定されない。しかしながら、もう一方と
同様な突出末端の場合、リンカーの重合やパリンドロー
ムの原因となるため、平滑末端であることが好ましい。
断片化で使用した制限酵素が５塩基認識の場合の３塩基
目として、または７塩基認識の場合４塩基目として複数
種類の塩基の認識が可能であり、生じる突出末端も複数
種類になる場合がある。この場合、合成リンカーも突出
末端を形成する一本鎖ｃＤＮＡを複数種混ぜて相補鎖と
アニーリングさせるか、複数種の突出末端を持つ合成リ
ンカーを混ぜて付加することが望ましい。
【００１８】本発明で使用する合成リンカー２は特に制
限されるものではないが、一種類のプライマーでＰＣＲ
反応が行えるように、合成リンカー１と少なくとも部分
的に同じ塩基配列を有するものが望ましい。異なる塩基
配列の合成リンカーで２種類のプライマーを使用するこ
とも可能であるが、アニーリングの効率の相違などによ
りＰＣＲの際にバイアスを生じる原因となるため好まし
くない。
限されるものではないが、一種類のプライマーでＰＣＲ
反応が行えるように、合成リンカー１と少なくとも部分
的に同じ塩基配列を有するものが望ましい。異なる塩基
配列の合成リンカーで２種類のプライマーを使用するこ
とも可能であるが、アニーリングの効率の相違などによ
りＰＣＲの際にバイアスを生じる原因となるため好まし
くない。
【００１９】さらに、上記合成リンカー２は、少なくと
も一方の末端が二本鎖ＤＮＡの平滑末端と連結可能な平
滑末端を有することが望ましい。また、上記合成リンカ
ー２は、合成リンカー１と部分的に、好ましくは１５塩
基以上、より好ましくは２０塩基以上が同じ塩基配列を
有することが好ましい。
も一方の末端が二本鎖ＤＮＡの平滑末端と連結可能な平
滑末端を有することが望ましい。また、上記合成リンカ
ー２は、合成リンカー１と部分的に、好ましくは１５塩
基以上、より好ましくは２０塩基以上が同じ塩基配列を
有することが好ましい。
【００２０】さらに、上記合成リンカー１および合成リ
ンカー２は、リンカー中の塩基配列の中にパリンドロー
ム構造を有しないものが好ましい。これは、ＰＣＲを行
う際にパリンドロームを有する合成リンカーに相補的な
プライマーを使用すると、セルフアニーリングによる反
応効率の低下が懸念されるためである。尚、合成リンカ
ー中の塩基配列にパリンドローム配列がある場合でも本
法を行うことは可能であるが、リンカー全体がパリンド
ローム配列からなるようなあまり長いパリンドローム配
列を有するものではない方が好ましい。
ンカー２は、リンカー中の塩基配列の中にパリンドロー
ム構造を有しないものが好ましい。これは、ＰＣＲを行
う際にパリンドロームを有する合成リンカーに相補的な
プライマーを使用すると、セルフアニーリングによる反
応効率の低下が懸念されるためである。尚、合成リンカ
ー中の塩基配列にパリンドローム配列がある場合でも本
法を行うことは可能であるが、リンカー全体がパリンド
ローム配列からなるようなあまり長いパリンドローム配
列を有するものではない方が好ましい。
【００２１】また、合成リンカー１及び合成リンカー２
の核酸断片へ連結する末端の５'末端は、二本鎖ＤＮＡ
断片への付加反応の際リン酸化されていなければならな
い。そこで、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて合
成リンカーの５'末端をリン酸化しておくことが必要だ
が、この方法では連結しない末端の５'末端もリン酸化
されセルフライゲーション等を招く。そのため、より好
ましくはアニーリング反応前に、連結する末端の５'末
端側となる一本鎖合成ヌクレオチドのみをＴ４ポリヌク
レオチドキナーゼで処理し、連結する末端側のみをリン
酸化しておくことが望ましい。
の核酸断片へ連結する末端の５'末端は、二本鎖ＤＮＡ
断片への付加反応の際リン酸化されていなければならな
い。そこで、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて合
成リンカーの５'末端をリン酸化しておくことが必要だ
が、この方法では連結しない末端の５'末端もリン酸化
されセルフライゲーション等を招く。そのため、より好
ましくはアニーリング反応前に、連結する末端の５'末
端側となる一本鎖合成ヌクレオチドのみをＴ４ポリヌク
レオチドキナーゼで処理し、連結する末端側のみをリン
酸化しておくことが望ましい。
【００２２】本発明においては、上記合成リンカーを常
法、例えばＴ４ファージあるいは大腸菌由来のＤＮＡリ
ガーゼによる結合反応を用いて、断片化二本鎖ＤＮＡの
末端に結合させる。平滑末端同士を連結する場合は大腸
菌由来のＤＮＡリガーゼを使用することはできない。合
成リンカーを結合させる場合の量的条件としては、二本
鎖ＤＮＡ断片に対して合成リンカーを過剰量加えて結合
反応を行うと良い。可能であれば、二本鎖ＤＮＡ断片量
を算出し、モル比で１００倍以上添加することが好まし
い。しかしながら、本法で増幅した核酸を例えばＤＮＡ
アレイの標識試料として用いる場合、過剰量をハイブリ
ダイゼーションさせると非特異的吸着の原因となる。そ
こで、ハイブリダイゼーションを行う前に増幅核酸中に
取り込まれた標識ヌクレオチド量を調べ、ハイブリダイ
ゼーションへの核酸の添加量を調製することが望まし
い。しかし、二本鎖ＤＮＡ断片の量にかかわらず、合成
リンカー１の添加量を１ｆｍｏｌ〜１ｐｍｏｌに抑える
ことによって増幅効率を抑え、過剰量の増幅核酸のハイ
ブリダイゼーションへの添加を防止することも可能であ
る。さらに、大過剰の合成リンカーはＰＣＲの際、プラ
イマーに対してターゲット（合成リンカーが付加された
二本鎖ＤＮＡ断片）と競合するため、増幅効率を低下さ
せるので、精製によりプライマーを除去することが望ま
しい。
法、例えばＴ４ファージあるいは大腸菌由来のＤＮＡリ
ガーゼによる結合反応を用いて、断片化二本鎖ＤＮＡの
末端に結合させる。平滑末端同士を連結する場合は大腸
菌由来のＤＮＡリガーゼを使用することはできない。合
成リンカーを結合させる場合の量的条件としては、二本
鎖ＤＮＡ断片に対して合成リンカーを過剰量加えて結合
反応を行うと良い。可能であれば、二本鎖ＤＮＡ断片量
を算出し、モル比で１００倍以上添加することが好まし
い。しかしながら、本法で増幅した核酸を例えばＤＮＡ
アレイの標識試料として用いる場合、過剰量をハイブリ
ダイゼーションさせると非特異的吸着の原因となる。そ
こで、ハイブリダイゼーションを行う前に増幅核酸中に
取り込まれた標識ヌクレオチド量を調べ、ハイブリダイ
ゼーションへの核酸の添加量を調製することが望まし
い。しかし、二本鎖ＤＮＡ断片の量にかかわらず、合成
リンカー１の添加量を１ｆｍｏｌ〜１ｐｍｏｌに抑える
ことによって増幅効率を抑え、過剰量の増幅核酸のハイ
ブリダイゼーションへの添加を防止することも可能であ
る。さらに、大過剰の合成リンカーはＰＣＲの際、プラ
イマーに対してターゲット（合成リンカーが付加された
二本鎖ＤＮＡ断片）と競合するため、増幅効率を低下さ
せるので、精製によりプライマーを除去することが望ま
しい。
【００２３】本発明では、上記の合成リンカーを付加し
た断片をリンカー部分の塩基配列に相補的に結合可能な
プライマーを用いて、ＰＣＲにより増幅する。該プライ
マーの長さは通常のＰＣＲで使用する程度のもので良
く、好ましくは１０〜３５塩基程度のＤＮＡ断片であ
る。
た断片をリンカー部分の塩基配列に相補的に結合可能な
プライマーを用いて、ＰＣＲにより増幅する。該プライ
マーの長さは通常のＰＣＲで使用する程度のもので良
く、好ましくは１０〜３５塩基程度のＤＮＡ断片であ
る。
【００２４】本発明による核酸の増幅方法は、微量核酸
より効率よく核酸を増幅することが可能であり、特定の
核酸ではなく、核酸をポピュレーションとして増幅する
ことができるので、ｃＤＮＡクローニング等の際におけ
る核酸ソースの増幅あるいはライブラリーの作成に有用
である。さらに、ＰＣＲの際に標識ヌクレオチドあるい
は標識プライマーを使用することで簡便にＤＮＡアレイ
の標識核酸を調製することが可能である。標識に用いら
れる化合物としては、ビオチン、ジゴキシゲニン、フル
オレセイン、ローダミン、Cy3、Cy5、放射性ヌクレオチ
ド等が例示される。
より効率よく核酸を増幅することが可能であり、特定の
核酸ではなく、核酸をポピュレーションとして増幅する
ことができるので、ｃＤＮＡクローニング等の際におけ
る核酸ソースの増幅あるいはライブラリーの作成に有用
である。さらに、ＰＣＲの際に標識ヌクレオチドあるい
は標識プライマーを使用することで簡便にＤＮＡアレイ
の標識核酸を調製することが可能である。標識に用いら
れる化合物としては、ビオチン、ジゴキシゲニン、フル
オレセイン、ローダミン、Cy3、Cy5、放射性ヌクレオチ
ド等が例示される。
【００２５】本発明の一実施態様は、ＤＮＡポリメラー
ゼ、制限酵素、合成リンカー１、ＤＮＡリガーゼ、該合
成リンカー１に相補的に結合可能な塩基配列部分を有す
るプライマー、ＰＣＲ酵素を含む、（１）核酸を直鎖状
二本鎖ＤＮＡの形状にし、（２）制限酵素によって断片
化し、（３）該核酸断片に合成リンカーを付加し、
（４）該リンカー部分の塩基配列に相補的に結合可能な
塩基配列部分を有するプライマーを用いてポリメラーゼ
連鎖反応を行うための核酸増幅用キットである。制限酵
素としては、上述したようなものを用いるのが好まし
い。ここで、ＰＣＲ酵素とは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラ
ーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤＤＮＡポリ
メラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ｄａ
ｓｈ（東洋紡績）などの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをい
う。
ゼ、制限酵素、合成リンカー１、ＤＮＡリガーゼ、該合
成リンカー１に相補的に結合可能な塩基配列部分を有す
るプライマー、ＰＣＲ酵素を含む、（１）核酸を直鎖状
二本鎖ＤＮＡの形状にし、（２）制限酵素によって断片
化し、（３）該核酸断片に合成リンカーを付加し、
（４）該リンカー部分の塩基配列に相補的に結合可能な
塩基配列部分を有するプライマーを用いてポリメラーゼ
連鎖反応を行うための核酸増幅用キットである。制限酵
素としては、上述したようなものを用いるのが好まし
い。ここで、ＰＣＲ酵素とは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラ
ーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤＤＮＡポリ
メラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ｄａ
ｓｈ（東洋紡績）などの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをい
う。
【００２６】また、本発明の別な実施態様として、ＤＮ
Ａポリメラーゼ、制限酵素、合成リンカー１、ＤＮＡリ
ガーゼ、該合成リンカー１に相補的に結合可能な塩基配
列部分を有するプライマー、ＰＣＲ酵素、標識ヌクレオ
チドを含む、（１）核酸を直鎖状二本鎖ＤＮＡの形状に
し、（２）制限酵素によって断片化し、（３）該核酸断
片に合成リンカーを付加し、（４）該リンカー部分の塩
基配列の相補的に結合可能な塩基配列部分を有するプラ
イマーを用いて標識ヌクレオチド存在下、ポリメラーゼ
連鎖反応を行うための標識核酸調製用キットである。
Ａポリメラーゼ、制限酵素、合成リンカー１、ＤＮＡリ
ガーゼ、該合成リンカー１に相補的に結合可能な塩基配
列部分を有するプライマー、ＰＣＲ酵素、標識ヌクレオ
チドを含む、（１）核酸を直鎖状二本鎖ＤＮＡの形状に
し、（２）制限酵素によって断片化し、（３）該核酸断
片に合成リンカーを付加し、（４）該リンカー部分の塩
基配列の相補的に結合可能な塩基配列部分を有するプラ
イマーを用いて標識ヌクレオチド存在下、ポリメラーゼ
連鎖反応を行うための標識核酸調製用キットである。
【００２７】さらに、本発明の別な実施様態は、ＤＮＡ
ポリメラーゼ、制限酵素、合成リンカー１、ＤＮＡリガ
ーゼ、該合成リンカー１に相補的に結合可能な塩基配列
部分を有する標識プライマー、ＰＣＲ酵素を含む、
（１）核酸を直鎖状二本鎖ＤＮＡの形状にし、（２）制
限酵素によって断片化し、（３）該核酸配列に合成リン
カーを付加し、（４）該リンカー部分の塩基配列の相補
的に結合可能な塩基配列部分を有する標識プライマーを
用いてポリメラーゼ連鎖反応を行うための標識核酸調製
用キットである。
ポリメラーゼ、制限酵素、合成リンカー１、ＤＮＡリガ
ーゼ、該合成リンカー１に相補的に結合可能な塩基配列
部分を有する標識プライマー、ＰＣＲ酵素を含む、
（１）核酸を直鎖状二本鎖ＤＮＡの形状にし、（２）制
限酵素によって断片化し、（３）該核酸配列に合成リン
カーを付加し、（４）該リンカー部分の塩基配列の相補
的に結合可能な塩基配列部分を有する標識プライマーを
用いてポリメラーゼ連鎖反応を行うための標識核酸調製
用キットである。
【００２８】また、本発明の別な実施様態は、逆転写酵
素、オリゴｄＴプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、リボ
ヌクレアーゼＨ、制限酵素、合成リンカー１、ＤＮＡリ
ガーゼ、該合成リンカー１に相補的に結合可能な塩基配
列部分を有するプライマー、ＰＣＲ酵素を含む、（１）
ポリＡ+ＲＮＡよりオリゴｄＴプライマーを用いて一本
鎖ｃＤＮＡを合成し、（２）一本鎖ｃＤＮＡを直鎖状二
本鎖ｃＤＮＡの形状にし、（３）制限酵素によって断片
化し、（４）該断片化ｃＤＮＡに合成リンカーを付加
し、（５）該リンカー部分の塩基配列の相補的に結合可
能な塩基配列部分を有するプライマーを用いてポリメラ
ーゼ連鎖反応を行うためのｃＤＮＡ増幅用キットであ
る。上記オリゴｄＴプライマーは、合成リンカー１の一
方の鎖と少なくとも部分的に同じ塩基で、かつＰＣＲ反
応のプライマーと少なくとも部分的に同じ塩基配列を
５’末端に有することが好ましい。
素、オリゴｄＴプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、リボ
ヌクレアーゼＨ、制限酵素、合成リンカー１、ＤＮＡリ
ガーゼ、該合成リンカー１に相補的に結合可能な塩基配
列部分を有するプライマー、ＰＣＲ酵素を含む、（１）
ポリＡ+ＲＮＡよりオリゴｄＴプライマーを用いて一本
鎖ｃＤＮＡを合成し、（２）一本鎖ｃＤＮＡを直鎖状二
本鎖ｃＤＮＡの形状にし、（３）制限酵素によって断片
化し、（４）該断片化ｃＤＮＡに合成リンカーを付加
し、（５）該リンカー部分の塩基配列の相補的に結合可
能な塩基配列部分を有するプライマーを用いてポリメラ
ーゼ連鎖反応を行うためのｃＤＮＡ増幅用キットであ
る。上記オリゴｄＴプライマーは、合成リンカー１の一
方の鎖と少なくとも部分的に同じ塩基で、かつＰＣＲ反
応のプライマーと少なくとも部分的に同じ塩基配列を
５’末端に有することが好ましい。
【００２９】また、本発明の別な実施様態は、逆転写酵
素、オリゴｄＴプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、リボ
ヌクレアーゼＨ、制限酵素、合成リンカー１、ＤＮＡリ
ガーゼ、該合成リンカー１に相補的に結合可能な塩基配
列部分を有するプライマー、ＰＣＲ酵素、標識ヌクレオ
チドを含む、（１）ポリＡ+ＲＮＡよりオリゴｄＴプラ
イマーを用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成し、（２）一本鎖
ｃＤＮＡを直鎖状二本鎖ｃＤＮＡの形状にし、（３）制
限酵素によって断片化し、（４）該断片化ｃＤＮＡに合
成リンカーを付加し、（５）該リンカー部分の塩基配列
の相補的に結合可能な塩基配列部分を有するプライマー
を用いて標識ヌクレオチド存在下でポリメラーゼ連鎖反
応を行うための標識ｃＤＮＡ調製キットである。
素、オリゴｄＴプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、リボ
ヌクレアーゼＨ、制限酵素、合成リンカー１、ＤＮＡリ
ガーゼ、該合成リンカー１に相補的に結合可能な塩基配
列部分を有するプライマー、ＰＣＲ酵素、標識ヌクレオ
チドを含む、（１）ポリＡ+ＲＮＡよりオリゴｄＴプラ
イマーを用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成し、（２）一本鎖
ｃＤＮＡを直鎖状二本鎖ｃＤＮＡの形状にし、（３）制
限酵素によって断片化し、（４）該断片化ｃＤＮＡに合
成リンカーを付加し、（５）該リンカー部分の塩基配列
の相補的に結合可能な塩基配列部分を有するプライマー
を用いて標識ヌクレオチド存在下でポリメラーゼ連鎖反
応を行うための標識ｃＤＮＡ調製キットである。
【００３０】また、本発明の別な実施様態は、逆転写酵
素、オリゴｄＴプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、リボ
ヌクレアーゼＨ、制限酵素、合成リンカー１、ＤＮＡリ
ガーゼ、該合成リンカー１に相補的に結合可能な塩基配
列部分を有する標識プライマー、ＰＣＲ酵素を含む、
（１）ポリＡ+ＲＮＡよりオリゴｄＴプライマーを用い
て一本鎖ｃＤＮＡを合成し、（２）一本鎖ｃＤＮＡを直
鎖状二本鎖ｃＤＮＡの形状にし、（３）制限酵素によっ
て断片化し、（４）該断片化ｃＤＮＡに合成リンカーを
付加し、（５）該リンカー部分の塩基配列の相補的に結
合可能な塩基配列を有する標識プライマーを用いてポリ
メラーゼ連鎖反応を行うための標識ｃＤＮＡ調製キット
である。
素、オリゴｄＴプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、リボ
ヌクレアーゼＨ、制限酵素、合成リンカー１、ＤＮＡリ
ガーゼ、該合成リンカー１に相補的に結合可能な塩基配
列部分を有する標識プライマー、ＰＣＲ酵素を含む、
（１）ポリＡ+ＲＮＡよりオリゴｄＴプライマーを用い
て一本鎖ｃＤＮＡを合成し、（２）一本鎖ｃＤＮＡを直
鎖状二本鎖ｃＤＮＡの形状にし、（３）制限酵素によっ
て断片化し、（４）該断片化ｃＤＮＡに合成リンカーを
付加し、（５）該リンカー部分の塩基配列の相補的に結
合可能な塩基配列を有する標識プライマーを用いてポリ
メラーゼ連鎖反応を行うための標識ｃＤＮＡ調製キット
である。
【００３１】さらに、本発明の別な実施様態としては、
上記のようなキットにおいて、直鎖状二本鎖ＤＮＡの末
端に合成リンカー２を付加することが好ましい。
上記のようなキットにおいて、直鎖状二本鎖ＤＮＡの末
端に合成リンカー２を付加することが好ましい。
【００３２】
【実施例】以下に、本発明の実施例を例示することによ
って、本発明の効果をより一層明確なものとする。
って、本発明の効果をより一層明確なものとする。
【００３３】実施例１ ポリＡ+ＲＮＡの調製 培養細胞ＨｅＬａＳ３及びＫ５６２は、それぞれ１０％
牛胎児血清（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）を含むダルベッコ変
法イーグル培地（ニッスイ）、ＲＰＭＩ１６４０培地
（ニッスイ）でコンフルエントになるまで培養し、細胞
を回収した。各々５×１０6cellより、ポリＡ+ＲＮＡを
市販のキット（MagExtractor -mRNA-；東洋紡績）を用
い、添付のプロトコールに従って調製した。回収量は２
６０ｎｍの吸光度を元に算出され、それぞれ２．１９μ
ｇ、１．１２μｇであった。
牛胎児血清（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）を含むダルベッコ変
法イーグル培地（ニッスイ）、ＲＰＭＩ１６４０培地
（ニッスイ）でコンフルエントになるまで培養し、細胞
を回収した。各々５×１０6cellより、ポリＡ+ＲＮＡを
市販のキット（MagExtractor -mRNA-；東洋紡績）を用
い、添付のプロトコールに従って調製した。回収量は２
６０ｎｍの吸光度を元に算出され、それぞれ２．１９μ
ｇ、１．１２μｇであった。
【００３４】実施例２ 直鎖状二本鎖ｃＤＮＡの調製 一本鎖ｃＤＮＡの調製のため、オリゴヌクレオチド１
（アマシャムファルマシアバイオテク）を用いた（配列
番号１）。培養細胞ＨｅＬａＳ３及びＫ５６２より調製
された上記ポリＡ+ＲＮＡに、上記オリゴヌクレオチド
１（１０ｐｍｏｌ）、逆転写酵素１００Ｕ（ReverTra A
ce；東洋紡績）、及び終濃度１ｍＭのｄＮＴＰ（ｄＡＴ
Ｐ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）を添加し、４２
℃で６０分間インキュベートし、一本鎖ｃＤＮＡを調製
した。さらに、上記反応液に、ＤＮＡポリメラーゼＩ
（１０Ｕ；東洋紡績）、エシェリヒア・コリ（Esherich
ia coli）ＲＮａｓｅＨ（１Ｕ；東洋紡績）、Ｔ４ Ｄ
ＮＡリガーゼ（４Ｕ；東洋紡績）、５０μＭ ｒＡＴＰ
を添加し、１６℃で２時間インキュベートし、二本鎖ｃ
ＤＮＡを調製した。続いてエタノール沈澱を行い、１
７．５μｌの滅菌水に再懸濁した。
（アマシャムファルマシアバイオテク）を用いた（配列
番号１）。培養細胞ＨｅＬａＳ３及びＫ５６２より調製
された上記ポリＡ+ＲＮＡに、上記オリゴヌクレオチド
１（１０ｐｍｏｌ）、逆転写酵素１００Ｕ（ReverTra A
ce；東洋紡績）、及び終濃度１ｍＭのｄＮＴＰ（ｄＡＴ
Ｐ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）を添加し、４２
℃で６０分間インキュベートし、一本鎖ｃＤＮＡを調製
した。さらに、上記反応液に、ＤＮＡポリメラーゼＩ
（１０Ｕ；東洋紡績）、エシェリヒア・コリ（Esherich
ia coli）ＲＮａｓｅＨ（１Ｕ；東洋紡績）、Ｔ４ Ｄ
ＮＡリガーゼ（４Ｕ；東洋紡績）、５０μＭ ｒＡＴＰ
を添加し、１６℃で２時間インキュベートし、二本鎖ｃ
ＤＮＡを調製した。続いてエタノール沈澱を行い、１
７．５μｌの滅菌水に再懸濁した。
【００３５】実施例３ 二本鎖ｃＤＮＡの断片化 上記二本鎖ｃＤＮＡ溶液に５塩基認識制限酵素Ｅｃｏ４
７Ｉ（５Ｕ；東洋紡績）を添加し、３７℃で１時間イン
キュベートした。続いてエタノール沈澱を行い、５μｌ
の滅菌水に溶解した。
７Ｉ（５Ｕ；東洋紡績）を添加し、３７℃で１時間イン
キュベートした。続いてエタノール沈澱を行い、５μｌ
の滅菌水に溶解した。
【００３６】実施例４ リンカーの調製 制限酵素Ｅｃｏ４７Ｉの認識切断部位は５'−Ｇ↓ＧＷ
ＣＣ−３'（Ｗ＝Ａ，Ｔ）であるため、上記のように調
製された核酸断片の突出末端は２種類生じる。そこで、
これらに対応した混合リンカーを調製するために、配列
番号２，３及び４に記載されるようなオリゴヌクレオチ
ド（アマシャムファルマシアバイオテク）を用いた（以
下、それぞれオリゴヌクレオチド２，３及び４と示
す）。まず、リンカーの突出末端の５'末端となるオリ
ゴヌクレオチド２及び３の５'末端をリン酸化するた
め、オリゴヌクレオチド２及び３（１ｎｍｏｌ）に各々
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１０Ｕ；東洋紡績）、
０．４３ｍＭ ｒＡＴＰを添加し（反応液量３０μ
ｌ）、３７℃で４５分間インキュベートし、続いて６５
℃で１０分間インキュベートし、Ｔ４ポリヌクレオチド
キナーゼを失活させた。上記反応液各３μｌ（５'−リ
ン酸化オリゴヌクレオチド２または３；１００ｐｍｏｌ
相当）にオリゴヌクレオチド４（１００ｐｍｏｌ）及び
２×ＳＳＣ（３００ｍＭ塩化ナトリウム、３０ｍＭクエ
ン酸ナトリウム；ｐＨ７．０）を添加し（反応液量５μ
ｌ）、９８℃で２０秒間、５５℃で１分間インキュベー
トし、図４に示すような下記２種類のリンカーを調製し
た。
ＣＣ−３'（Ｗ＝Ａ，Ｔ）であるため、上記のように調
製された核酸断片の突出末端は２種類生じる。そこで、
これらに対応した混合リンカーを調製するために、配列
番号２，３及び４に記載されるようなオリゴヌクレオチ
ド（アマシャムファルマシアバイオテク）を用いた（以
下、それぞれオリゴヌクレオチド２，３及び４と示
す）。まず、リンカーの突出末端の５'末端となるオリ
ゴヌクレオチド２及び３の５'末端をリン酸化するた
め、オリゴヌクレオチド２及び３（１ｎｍｏｌ）に各々
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１０Ｕ；東洋紡績）、
０．４３ｍＭ ｒＡＴＰを添加し（反応液量３０μ
ｌ）、３７℃で４５分間インキュベートし、続いて６５
℃で１０分間インキュベートし、Ｔ４ポリヌクレオチド
キナーゼを失活させた。上記反応液各３μｌ（５'−リ
ン酸化オリゴヌクレオチド２または３；１００ｐｍｏｌ
相当）にオリゴヌクレオチド４（１００ｐｍｏｌ）及び
２×ＳＳＣ（３００ｍＭ塩化ナトリウム、３０ｍＭクエ
ン酸ナトリウム；ｐＨ７．０）を添加し（反応液量５μ
ｌ）、９８℃で２０秒間、５５℃で１分間インキュベー
トし、図４に示すような下記２種類のリンカーを調製し
た。
【００３７】実施例５ 二本鎖ｃＤＮＡ断片へのリンカ
ーの付加 上記二本鎖ｃＤＮＡ断片溶液５μｌに、上記リンカー１
及び２の溶液を２．５μｌ（５０ｎｍｏｌ相当）ずつ、
さらにＴ４ ＤＮＡリガーゼ（４Ｕ；東洋紡績）、１ｍ
Ｍ ｒＡＴＰを添加し（反応液量２０μｌ）、１６℃で
３０分間インキュベートし、二本鎖ｃＤＮＡ断片にリン
カーを付加した。
ーの付加 上記二本鎖ｃＤＮＡ断片溶液５μｌに、上記リンカー１
及び２の溶液を２．５μｌ（５０ｎｍｏｌ相当）ずつ、
さらにＴ４ ＤＮＡリガーゼ（４Ｕ；東洋紡績）、１ｍ
Ｍ ｒＡＴＰを添加し（反応液量２０μｌ）、１６℃で
３０分間インキュベートし、二本鎖ｃＤＮＡ断片にリン
カーを付加した。
【００３８】実施例６ 二本鎖ｃＤＮＡ断片のＰＣＲに
よる増幅（標識ｃＤＮＡターゲットの調製） 上記リンカーを付加した二本鎖ｃＤＮＡ断片２μｌ（ポ
リＡ+ＲＮＡ１０ｎｇに相当）を鋳型として、ＤＮＡポ
リメラーゼ（ＫＯＤ ｄａｓｈ（２．５Ｕ）；東洋紡
績）、ｄＮＴＰ（終濃度０．２ｍＭ ｄＡＴＰ，ｄＣＴ
Ｐ，ｄＧＴＰ、及び０．１５ｍＭ ｄＴＴＰ）、ｂｉｏ
ｔｉｎ−１６−ｄＵＴＰ（終濃度０．０５ｍＭ；ロシュ
・ダイアグノスティクス）、オリゴヌクレオチド４（５
０ｐｍｏｌ）を添加し（反応液量５０μｌ）、９８℃・
２０秒間、６５℃・１０秒間、７４℃・５分間の反応サ
イクルを２５サイクル行った。ＰＣＲ反応後、エタノー
ル沈澱を行い、未反応のｂｉｏｔｉｎ−１６−ｄＵＴＰ
を除去後、滅菌水１００μｌに懸濁した。
よる増幅（標識ｃＤＮＡターゲットの調製） 上記リンカーを付加した二本鎖ｃＤＮＡ断片２μｌ（ポ
リＡ+ＲＮＡ１０ｎｇに相当）を鋳型として、ＤＮＡポ
リメラーゼ（ＫＯＤ ｄａｓｈ（２．５Ｕ）；東洋紡
績）、ｄＮＴＰ（終濃度０．２ｍＭ ｄＡＴＰ，ｄＣＴ
Ｐ，ｄＧＴＰ、及び０．１５ｍＭ ｄＴＴＰ）、ｂｉｏ
ｔｉｎ−１６−ｄＵＴＰ（終濃度０．０５ｍＭ；ロシュ
・ダイアグノスティクス）、オリゴヌクレオチド４（５
０ｐｍｏｌ）を添加し（反応液量５０μｌ）、９８℃・
２０秒間、６５℃・１０秒間、７４℃・５分間の反応サ
イクルを２５サイクル行った。ＰＣＲ反応後、エタノー
ル沈澱を行い、未反応のｂｉｏｔｉｎ−１６−ｄＵＴＰ
を除去後、滅菌水１００μｌに懸濁した。
【００３９】実施例７ ｃＤＮＡアレイフィルターへの
ハイブリダイゼーション及び検出 ｃＤＮＡアレイフィルター（Gene Navigator cDNA Arra
y Filter -human cancer selected-；東洋紡績）をハイ
ブリダイゼーションボトルに入れ、ハイブリダイゼーシ
ョン溶液（PerfectHyb Hybridization Solution；東洋
紡績）１０ｍｌを添加し、ハイブリダイゼーションオー
ブンで６８℃、３０分間インキュベートした（プレハイ
ブリダイゼーション）。標識ｃＤＮＡターゲットを変性
するため、５分間煮沸処理し、氷上で急冷した。プレハ
イブリダイゼーション溶液を除去後、６８℃に加温して
おいたハイブリダイゼーション溶液１０ｍｌに標識ｃＤ
ＮＡターゲット溶液を加え、ハイブリブリダイゼーショ
ンボトルに入れ、６８℃で一晩インキュベートした（ハ
イブリダイゼーション）。続いてハイブリダイゼーショ
ン溶液を除去し、６８℃のまま、２×ＳＳＣ，０．１％
ＳＤＳ２０ｍｌの条件で１０分間インキュベートし、こ
の操作を２回行った。さらに、０．１×ＳＳＣ、０．１
％ ＳＤＳで同様に繰り返した。続いて、市販のビオチ
ン標識核酸キット（Imaging high -Chemilumi- for Gen
e Navigator ver.；東洋紡績）を用いて添付のプロトコ
ールに従い、化学発光をＸ線フィルム（Scientific Ima
ging Film、Ｘ−ＯＭＡＴ ＡＲ；Ｋｏｄａｋ社）で検
出した。この結果を図５に示す。１００ｎｇ以下の少な
いポリＡ+ＲＮＡから十分な強度のシグナルが検出さ
れ、２種類の細胞間で相対的シグナル強度が異なる遺伝
子も確認された。
ハイブリダイゼーション及び検出 ｃＤＮＡアレイフィルター（Gene Navigator cDNA Arra
y Filter -human cancer selected-；東洋紡績）をハイ
ブリダイゼーションボトルに入れ、ハイブリダイゼーシ
ョン溶液（PerfectHyb Hybridization Solution；東洋
紡績）１０ｍｌを添加し、ハイブリダイゼーションオー
ブンで６８℃、３０分間インキュベートした（プレハイ
ブリダイゼーション）。標識ｃＤＮＡターゲットを変性
するため、５分間煮沸処理し、氷上で急冷した。プレハ
イブリダイゼーション溶液を除去後、６８℃に加温して
おいたハイブリダイゼーション溶液１０ｍｌに標識ｃＤ
ＮＡターゲット溶液を加え、ハイブリブリダイゼーショ
ンボトルに入れ、６８℃で一晩インキュベートした（ハ
イブリダイゼーション）。続いてハイブリダイゼーショ
ン溶液を除去し、６８℃のまま、２×ＳＳＣ，０．１％
ＳＤＳ２０ｍｌの条件で１０分間インキュベートし、こ
の操作を２回行った。さらに、０．１×ＳＳＣ、０．１
％ ＳＤＳで同様に繰り返した。続いて、市販のビオチ
ン標識核酸キット（Imaging high -Chemilumi- for Gen
e Navigator ver.；東洋紡績）を用いて添付のプロトコ
ールに従い、化学発光をＸ線フィルム（Scientific Ima
ging Film、Ｘ−ＯＭＡＴ ＡＲ；Ｋｏｄａｋ社）で検
出した。この結果を図５に示す。１００ｎｇ以下の少な
いポリＡ+ＲＮＡから十分な強度のシグナルが検出さ
れ、２種類の細胞間で相対的シグナル強度が異なる遺伝
子も確認された。
【００４０】実施例８ 半定量ＲＴ−ＰＣＲによる裏付
け 上記ｃＤＮＡアレイへのハイブリダイゼーションの結
果、ＨｅＬａＳ３細胞とＫ５６２細胞において異なる相
対的シグナル強度が認められた遺伝子の一部、ＨＬＡ−
Ａ、ｐ１６ｉｎｋ４ａ（ＭＴＳ１）、Ｐｉｍ−１、ＴＧ
Ｆβ、及びコントロールとしてハウスキーピング遺伝子
Ｇ３ＰＤＨ（Glyceraldehyde 3-phosphatedehydrogenas
e）についてＲＴ−ＰＣＲを行った。テンプレートとし
て、それぞれの細胞よりＡＧＰＣ法[Analytical Bioche
mistry Vol.162、pp156-159（1987）]により調製され
たTotal ＲＮＡ １、０．１、０．０１μｇを用い、上
記反応は市販のＲＴ−ＰＣＲキット（ReverTra Dash；
東洋紡績）を用いて添付のプロトコールに従って行われ
た。ただし、プライマーとして、逆転写反応にはキット
添付のランダムプライマー、続くＰＣＲにはそれぞれの
遺伝子に配列特異的なプライマーを用いた。ＲＴ−ＰＣ
Ｒ反応産物１／１０量を１％アガロース電気泳動を行っ
た結果を図６に示す。図５においてシグナル強度が異な
った遺伝子においてＲＴ−ＰＣＲにおいても発現量に差
が認められ、本発明を応用したＤＮＡアレイの標識ｃＤ
ＮＡターゲットの調製法が微量なサンプル間の遺伝子発
現の比較に有効な手段であることが確認された。
け 上記ｃＤＮＡアレイへのハイブリダイゼーションの結
果、ＨｅＬａＳ３細胞とＫ５６２細胞において異なる相
対的シグナル強度が認められた遺伝子の一部、ＨＬＡ−
Ａ、ｐ１６ｉｎｋ４ａ（ＭＴＳ１）、Ｐｉｍ−１、ＴＧ
Ｆβ、及びコントロールとしてハウスキーピング遺伝子
Ｇ３ＰＤＨ（Glyceraldehyde 3-phosphatedehydrogenas
e）についてＲＴ−ＰＣＲを行った。テンプレートとし
て、それぞれの細胞よりＡＧＰＣ法[Analytical Bioche
mistry Vol.162、pp156-159（1987）]により調製され
たTotal ＲＮＡ １、０．１、０．０１μｇを用い、上
記反応は市販のＲＴ−ＰＣＲキット（ReverTra Dash；
東洋紡績）を用いて添付のプロトコールに従って行われ
た。ただし、プライマーとして、逆転写反応にはキット
添付のランダムプライマー、続くＰＣＲにはそれぞれの
遺伝子に配列特異的なプライマーを用いた。ＲＴ−ＰＣ
Ｒ反応産物１／１０量を１％アガロース電気泳動を行っ
た結果を図６に示す。図５においてシグナル強度が異な
った遺伝子においてＲＴ−ＰＣＲにおいても発現量に差
が認められ、本発明を応用したＤＮＡアレイの標識ｃＤ
ＮＡターゲットの調製法が微量なサンプル間の遺伝子発
現の比較に有効な手段であることが確認された。
【００４１】
【発明の効果】上述したように、本発明における方法
は、核酸を制限酵素により断片化したものをＰＣＲによ
る増幅を行うことにより、ｃＤＮＡ等の核酸試料をポピ
ュレーションとして効率よく増幅することが可能になっ
た。この方法により得られた増幅核酸は、従来はＰＣＲ
増幅産物では、適用することが困難であったライブラリ
ーのソース、ＤＮＡアレイの標識ターゲットなどに利用
することが可能である。
は、核酸を制限酵素により断片化したものをＰＣＲによ
る増幅を行うことにより、ｃＤＮＡ等の核酸試料をポピ
ュレーションとして効率よく増幅することが可能になっ
た。この方法により得られた増幅核酸は、従来はＰＣＲ
増幅産物では、適用することが困難であったライブラリ
ーのソース、ＤＮＡアレイの標識ターゲットなどに利用
することが可能である。
【００４２】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110>TOYO BOSEKI KABUSHIKI KAISHA <120>A METHOD OF AMPLIFYING NUCLEIC ACID AND A METHOD OF PREPARAING LABE LED NUCLEIC ACID <130>00-0518 <140> <141> <160>4 <170>PatentIn Ver.2.1 <210>1 <211>49 <212>DNA <220> <223>Description of Artificial Sequence <400>1 gaaatgtccg ttcggttggc agtttttttt tttttttttt tttttttvn 49
【００４３】 <210>2 <211>25 <212>DNA <220> <223>Description of Artificial Sequence <400>2 gtcctgccaa ccgaacggac atttc 25
【００４４】 <210>3 <211>25 <212>DNA <220> <223>Description of Artificial Sequence <400>3 gacctgccaa ccgaacggac atttc 25
【００４５】 <210>4 <211>22 <212>DNA <220> <223>Description of Artificial Sequence <400>4 gaaatgtccg ttcggttggc ag 22
【図１】本発明における核酸増幅方法の概略を示す図で
ある。
ある。
【図２】核酸がポリＡ+ＲＮＡの場合に、合成リンカー
１の一方の鎖と少なくとも部分的に同じ塩基配列で、か
つポリメラーゼ連鎖反応のプライマーの少なくとも部分
的に同じ塩基配列を５'末端に有するオリゴｄＴプライ
マーを用いた本発明における核酸増幅方法の概略を示す
図である。
１の一方の鎖と少なくとも部分的に同じ塩基配列で、か
つポリメラーゼ連鎖反応のプライマーの少なくとも部分
的に同じ塩基配列を５'末端に有するオリゴｄＴプライ
マーを用いた本発明における核酸増幅方法の概略を示す
図である。
【図３】直鎖状二本鎖ＤＮＡの断片化前、または合成リ
ンカー１の付加と同時に、直鎖状二本鎖ＤＮＡの末端に
合成リンカー２を付加する本発明における核酸増幅方法
の概略を示す図である。
ンカー１の付加と同時に、直鎖状二本鎖ＤＮＡの末端に
合成リンカー２を付加する本発明における核酸増幅方法
の概略を示す図である。
【図４】実施例４において調製したリンカーオリゴヌク
レオチドを示す図である。
レオチドを示す図である。
【図５】本発明の方法により、ＨｅＬａＳ３細胞及びＫ
５６２細胞のポリＡ+ＲＮＡから調製した標識ｃＤＮＡ
ターゲットのｃＤＮＡアレイへのハイブリダイゼーショ
ン結果を示す図面に代わる写真である。
５６２細胞のポリＡ+ＲＮＡから調製した標識ｃＤＮＡ
ターゲットのｃＤＮＡアレイへのハイブリダイゼーショ
ン結果を示す図面に代わる写真である。
【図６】ｃＤＮＡアレイへのハイブリダイゼーションの
結果、２つの細胞間で異なる相対的シグナル強度を示し
た遺伝子に関するＲＴ−ＰＣＲの電気泳動解析結果を示
す図面に代わる写真である。
結果、２つの細胞間で異なる相対的シグナル強度を示し
た遺伝子に関するＲＴ−ＰＣＲの電気泳動解析結果を示
す図面に代わる写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 川上 文清 福井県敦賀市東洋町10番24号 東洋紡績株 式会社敦賀バイオ研究所内 (72)発明者 川村 良久 福井県敦賀市東洋町10番24号 東洋紡績株 式会社敦賀バイオ研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA19 AA20 CA04 FA10 HA14 HA19 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ02 QQ05 QQ15 QQ16 QQ17 QQ18 QQ42 QR08 QR32 QR42 QR56 QR63 QS25 QS34 QS39 QX02
Claims (37)
- 【請求項１】 以下の工程を含むことを特徴とする核酸
の増幅方法。 （１）核酸を直鎖状二本鎖ＤＮＡの形状にし、（２）制
限酵素によって断片化し、（３）該核酸断片に合成リン
カー１を付加し、（４）該リンカー部分の塩基配列に相
補的に結合可能な塩基配列部分を有するプライマーを用
いてポリメラーゼ連鎖反応を行う - 【請求項２】 ポリＡ+ＲＮＡよりオリゴｄＴプライマ
ーを用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成し、一本鎖ｃＤＮＡを
直鎖状二本鎖ｃＤＮＡの形状にする請求項１に記載の核
酸の増幅方法。 - 【請求項３】 オリゴｄＴプライマーが、合成リンカー
１の一方の鎖と少なくとも部分的に同じ塩基配列で、か
つポリメラーゼ連鎖反応のプライマーと少なくとも部分
的に同じ塩基配列を５'末端に有する請求項１または２
に記載の核酸の増幅方法。 - 【請求項４】 該直鎖状二本鎖ＤＮＡの、断片化前、断
片化後、もしくは合成リンカー１の付加と同時に、該直
鎖状二本鎖ＤＮＡの末端に合成リンカー２を付加する請
求項１〜３のいずれかに記載の核酸の増幅方法。 - 【請求項５】 制限酵素が４〜８塩基認識の制限酵素で
ある請求項１〜４のいずれかに記載の核酸の増幅方法。 - 【請求項６】 制限酵素が５塩基認識の制限酵素である
請求項５に記載の核酸の増幅方法。 - 【請求項７】 制限酵素がＢｓｓＫＩ、ＭａｅIII、Ｄ
ｄｅＩ、ＨｉｎｆＩ、Ｓａｕ９６Ｉ（ＡｓｕＩ，Ｃｆｒ
１３Ｉ）、ＳｃｒＦＩ、Ｆｎｕ４ＨＩ、ＥｃｏＲII、Ｔ
ｆｉＩ、ＴｓｅＩ、Ｅｃｏ４７Ｉ（ＡｖａII）、Ｍｖａ
Ｉ、Ｔｓｐ４５Ｉ、ＮｃｉＩ（ＢｃｎＩ、ＣａｕII）か
らなる群より選択される請求項５に記載の核酸の増幅方
法。 - 【請求項８】 合成リンカー１が二本の一本鎖合成ＤＮ
Ａがアニーリングにより二本鎖ＤＮＡとなった際に、一
方が平滑末端であるが他方は突出末端であるような合成
リンカーである請求項１〜７のいずれかに記載の核酸の
増幅方法。 - 【請求項９】 合成リンカー１の突出末端が５'末端の
方が１塩基以上突出した形状である請求項８に記載の核
酸の増幅方法。 - 【請求項１０】 合成リンカー１の突出末端が３'末端
の方が１塩基以上突出した形状である請求項８に記載の
核酸の増幅方法。 - 【請求項１１】 合成リンカー２が合成リンカー１と少
なくとも部分的に同じ塩基配列を有する請求項４に記載
の核酸の増幅方法。 - 【請求項１２】 合成リンカー２の少なくとも一方の末
端が平滑末端である請求項１１に記載の核酸の増幅方
法。 - 【請求項１３】 合成リンカー１および合成リンカー２
がその塩基配列中にパリンドローム構造を含まない塩基
配列である請求項４に記載の核酸の増幅方法。 - 【請求項１４】 以下の工程を含むことを特徴とする標
識核酸の調製方法。 （１）核酸を直鎖状二本鎖ＤＮＡの形状にし、（２）制
限酵素によって断片化し、（３）該核酸断片に合成リン
カー１を付加し、（４）該リンカー部分の塩基配列の相
補的に結合可能な塩基配列部分を有するプライマーを用
いて標識ヌクレオチド存在下ポリメラーゼ連鎖反応を行
う - 【請求項１５】 以下の工程を含むことを特徴とする標
識核酸の調製方法。 （１）核酸を直鎖状二本鎖ＤＮＡの形状にし、（２）制
限酵素によって断片化し、（３）この核酸断片に合成リ
ンカー１を付加し、（４）該リンカー部分の塩基配列に
相補的に結合可能な塩基配列部分を有する標識プライマ
ーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う - 【請求項１６】 ポリＡ+ＲＮＡよりオリゴｄＴプライ
マーを用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成し、一本鎖ｃＤＮＡ
を直鎖状二本鎖ｃＤＮＡの形状にする請求項１４または
１５に記載の標識核酸の調製方法。 - 【請求項１７】 オリゴｄＴプライマーが、合成リンカ
ー１の一方の鎖と少なくとも部分的に同じ塩基配列で、
かつポリメラーゼ連鎖反応のプライマーと少なくとも部
分的に同じ塩基配列を５'末端に有する請求項１６に記
載の標識核酸の調製方法。 - 【請求項１８】 該直鎖状二本鎖ＤＮＡの、断片化前、
断片化後、もしくは合成リンカー１の付加と同時に、該
直鎖状二本鎖ＤＮＡの末端に合成リンカー２を付加する
請求項１４〜１７のいずれかに記載の標識核酸の調製方
法。 - 【請求項１９】 制限酵素が４〜８塩基認識の制限酵素
である請求項１４〜１８のいずれかに記載の標識核酸の
調製方法。 - 【請求項２０】 制限酵素が５塩基認識の制限酵素であ
る請求項１９に記載の標識核酸の調製方法。 - 【請求項２１】 制限酵素がＢｓｓＫＩ、ＭａｅIII、
ＤｄｅＩ、ＨｉｎｆＩ、Ｓａｕ９６Ｉ（ＡｓｕＩ，Ｃｆ
ｒ１３Ｉ）、ＳｃｒＦＩ、Ｆｎｕ４ＨＩ、ＥｃｏＲII、
ＴｆｉＩ、ＴｓｅＩ、Ｅｃｏ４７Ｉ（ＡｖａII）、Ｍｖ
ａＩ、Ｔｓｐ４５Ｉ、ＮｃｉＩ（ＢｃｎＩ、ＣａｕII）
からなる群より選択される請求項１９に記載の標識核酸
の調製方法。 - 【請求項２２】 合成リンカー１が、二本の一本鎖合成
ＤＮＡがアニーリングにより二本鎖ＤＮＡとなった際
に、一方が平滑末端であるが他方は突出末端であるよう
な合成リンカーである請求項１４〜２１のいずれかに記
載の標識核酸の調製方法。 - 【請求項２３】 合成リンカー１の突出末端が５'末端
の方が１塩基以上突出した形状である請求項２１に記載
の標識核酸の調製方法。 - 【請求項２４】 合成リンカー１の突出末端が３'末端
の方が１塩基以上突出した形状である請求項２１に記載
の標識核酸の調製方法。 - 【請求項２５】 合成リンカー２が合成リンカー１と少
なくとも部分的に同じ塩基配列を有する請求項１８に記
載の標識核酸の調製方法。 - 【請求項２６】 合成リンカー２の少なくとも一方の末
端が平滑末端である請求項２５に記載の標識核酸の調製
方法。 - 【請求項２７】 合成リンカー１および合成リンカー２
がその塩基配列中にパリンドローム構造を含まない塩基
配列である請求項１８に記載の標識核酸の調製方法。 - 【請求項２８】 ＤＮＡポリメラーゼ、制限酵素、合成
リンカー１、ＤＮＡリガーゼ、該合成リンカー１に相補
的に結合可能な塩基配列部分を有するプライマー、ＰＣ
Ｒ酵素を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法に
より核酸の増幅を行うための核酸増幅用キット。 - 【請求項２９】 直鎖状二本鎖ＤＮＡの末端に合成リン
カー２を付加することを含む請求項２８に記載の核酸増
幅用キット。 - 【請求項３０】 ＤＮＡポリメラーゼ、制限酵素、合成
リンカー１、ＤＮＡリガーゼ、該合成リンカー１に相補
的に結合可能な塩基配列部分を有するプライマー、ＰＣ
Ｒ酵素、標識ヌクレオチドを含むことを特徴とする請求
項１４に記載の方法により標識核酸を調製するための標
識核酸調製用キット。 - 【請求項３１】 ＤＮＡポリメラーゼ、制限酵素、合成
リンカー１、ＤＮＡリガーゼ、該合成リンカー１に相補
的に結合可能な塩基配列部分を有する標識プライマー、
ＰＣＲ酵素を含むことを特徴とする請求項１５に記載の
方法により標識核酸を調製するための標識核酸調製用キ
ット。 - 【請求項３２】 直鎖状二本鎖ＤＮＡの末端に合成リン
カー２を付加することを含む請求項３０または３１に記
載の標識核酸調製用キット。 - 【請求項３３】 逆転写酵素、オリゴｄＴプライマー、
ＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼＨ、制限酵素、
合成リンカー１、ＤＮＡリガーゼ、該合成リンカー１に
相補的に結合可能な塩基配列部分を有するプライマー、
ＰＣＲ酵素を含むことを特徴とする請求項１に記載の方
法により核酸の増幅を行うためのｃＤＮＡ増幅用キッ
ト。 - 【請求項３４】 逆転写酵素、オリゴｄＴプライマー、
ＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼＨ、制限酵素、
合成リンカー１、ＤＮＡリガーゼ、該合成リンカー１に
相補的に結合可能な塩基配列部分を有するプライマー、
ＰＣＲ酵素、標識ヌクレオチドを含むことを特徴とする
請求項１４に記載の方法により標識ｃＤＮＡを調製する
ための標識ｃＤＮＡ調製用キット。 - 【請求項３５】 逆転写酵素、オリゴｄＴプライマー、
ＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼＨ、制限酵素、
合成リンカー１、ＤＮＡリガーゼ、該合成リンカー１に
相補的に結合可能な塩基配列部分を有する標識プライマ
ー、ＰＣＲ酵素、を含むことを特徴とする請求項１５に
記載の方法により標識ｃＤＮＡを調製するための標識ｃ
ＤＮＡ調製用キット。 - 【請求項３６】 直鎖状二本鎖ＤＮＡの末端に合成リン
カー２を付加することを含む請求項３３〜３５のいずれ
かに記載の標識ｃＤＮＡ調製用キット。 - 【請求項３７】 オリゴｄＴプライマーが、合成リンカ
ー１の一方の鎖と少なくとも部分的に同じ塩基配列で、
かつポリメラーゼ連鎖反応のプライマーと少なくとも部
分的に同じ塩基配列を５’末端に有する請求項３４〜３
６のいずれかに記載の標識ｃＤＮＡ調製用キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000241741A JP2002051784A (ja) | 2000-08-09 | 2000-08-09 | 核酸の増幅方法及び標識核酸の調製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000241741A JP2002051784A (ja) | 2000-08-09 | 2000-08-09 | 核酸の増幅方法及び標識核酸の調製方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002051784A true JP2002051784A (ja) | 2002-02-19 |
Family
ID=18732888
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000241741A Pending JP2002051784A (ja) | 2000-08-09 | 2000-08-09 | 核酸の増幅方法及び標識核酸の調製方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002051784A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106338539A (zh) * | 2016-11-03 | 2017-01-18 | 上海市计量测试技术研究院 | 基于多腺嘌呤的dna捕获探针、生物传感器及其检测方法 |
| JP2017035102A (ja) * | 2010-08-04 | 2017-02-16 | タッチライト ジェネティックス リミテッド | パリンドローム配列を用いた閉鎖型直鎖状ｄｎａの生成 |
-
2000
- 2000-08-09 JP JP2000241741A patent/JP2002051784A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2017035102A (ja) * | 2010-08-04 | 2017-02-16 | タッチライト ジェネティックス リミテッド | パリンドローム配列を用いた閉鎖型直鎖状ｄｎａの生成 |
| CN106338539A (zh) * | 2016-11-03 | 2017-01-18 | 上海市计量测试技术研究院 | 基于多腺嘌呤的dna捕获探针、生物传感器及其检测方法 |
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