JP2002065263A - ｃＤＮＡの増幅方法及び標識ｃＤＮＡの調製方法 - Google Patents
ｃＤＮＡの増幅方法及び標識ｃＤＮＡの調製方法Info
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- JP2002065263A JP2002065263A JP2000252835A JP2000252835A JP2002065263A JP 2002065263 A JP2002065263 A JP 2002065263A JP 2000252835 A JP2000252835 A JP 2000252835A JP 2000252835 A JP2000252835 A JP 2000252835A JP 2002065263 A JP2002065263 A JP 2002065263A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】微量の核酸から、簡便に効率よく核酸を増幅す
る方法及び標識核酸の調製方法ならびにそのための試薬
を提供する。 【解決手段】ポリＡ+ＲＮＡから、５'末端にアンカー配
列１を有するオリゴｄＴプライマーを用いて逆転写反応
により一本鎖ｃＤＮＡを調製し、該ｃＤＮＡに、５'末
端にアンカー配列２が付加されたランダムオリゴヌクレ
オチドプライマーをアニーリングさせ、プライマーを伸
長して二本鎖ｃＤＮＡを合成し、アンカー配列部分と少
なくとも部分的に同じ塩基配列部分を有するプライマー
を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う工程を含むことを
特徴とするｃＤＮＡの増幅方法。
る方法及び標識核酸の調製方法ならびにそのための試薬
を提供する。 【解決手段】ポリＡ+ＲＮＡから、５'末端にアンカー配
列１を有するオリゴｄＴプライマーを用いて逆転写反応
により一本鎖ｃＤＮＡを調製し、該ｃＤＮＡに、５'末
端にアンカー配列２が付加されたランダムオリゴヌクレ
オチドプライマーをアニーリングさせ、プライマーを伸
長して二本鎖ｃＤＮＡを合成し、アンカー配列部分と少
なくとも部分的に同じ塩基配列部分を有するプライマー
を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う工程を含むことを
特徴とするｃＤＮＡの増幅方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はｃＤＮＡの増幅方法
及びそのための試薬に関する。さらに詳しくは、アンカ
ー配列が付加したオリゴｄＴプライマー及びランダムプ
ライマーを用いて二本鎖ｃＤＮＡを調製し、アンカープ
ライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲ
とも示す）を行うことによって、簡便に微量核酸をポピ
ュレーションとして増幅する方法ならびにそのための試
薬に関する。
及びそのための試薬に関する。さらに詳しくは、アンカ
ー配列が付加したオリゴｄＴプライマー及びランダムプ
ライマーを用いて二本鎖ｃＤＮＡを調製し、アンカープ
ライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲ
とも示す）を行うことによって、簡便に微量核酸をポピ
ュレーションとして増幅する方法ならびにそのための試
薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】数々のゲノムプロジェクトの進展によ
り、その構造、すなわちデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の
塩基配列が解明されつつあり、ヒトにおいてもここ数年
で完了するといわれ、およそ３０億塩基の中に１０万種
程度の遺伝子がコードされていると考えられている。し
かしながら、機能が判明している遺伝子はその１０％程
度であり、９０％は依然としてその機能は未知である。
続くポストゲノムプロジェクトの一つとして、この膨大
な数の未知遺伝子の機能を個別に検索する従来の手法に
代わって、遺伝子の動的状態（発現情報）を包括的に捉
え、例えば、臓器の相違、刺激への応答の相違等、生体
システムとしてこれら遺伝子の機能を記述する手法が取
られつつある。
り、その構造、すなわちデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の
塩基配列が解明されつつあり、ヒトにおいてもここ数年
で完了するといわれ、およそ３０億塩基の中に１０万種
程度の遺伝子がコードされていると考えられている。し
かしながら、機能が判明している遺伝子はその１０％程
度であり、９０％は依然としてその機能は未知である。
続くポストゲノムプロジェクトの一つとして、この膨大
な数の未知遺伝子の機能を個別に検索する従来の手法に
代わって、遺伝子の動的状態（発現情報）を包括的に捉
え、例えば、臓器の相違、刺激への応答の相違等、生体
システムとしてこれら遺伝子の機能を記述する手法が取
られつつある。
【０００３】ここで着目される技術がＤＮＡアレイであ
る。ＤＮＡアレイとは支持体上に高密度に多数の核酸が
配置、固定化されたもので、ナイロン膜を用いたマクロ
アレイやガラスやシリコンなどの小型の基盤上により高
密度に核酸を配置したＤＮＡチップなどがある。従来の
ノザンブロット解析ではハイブリダイゼーションを行う
際のプローブ核酸の数に限りがあったため、一度の実験
から得られる情報は限られていた。一方、リバースノザ
ンブロット解析法を用いたＤＮＡアレイでは多数のプロ
ーブを固定化しておくことによって、一度の実験から固
定化されたプローブの種類に相当するだけの情報量が得
られる。また、固定化するプローブについてもゲノムプ
ロジェクトの結果、膨大な数の遺伝子について設計が可
能となっているため、生命現象を解明する有効な手段と
いえる。ＤＮＡアレイはまた、癌の個性診断等の疾患診
断、薬効や副作用の予測等、医療の分野においても重要
な役割を果たすことが期待される。
る。ＤＮＡアレイとは支持体上に高密度に多数の核酸が
配置、固定化されたもので、ナイロン膜を用いたマクロ
アレイやガラスやシリコンなどの小型の基盤上により高
密度に核酸を配置したＤＮＡチップなどがある。従来の
ノザンブロット解析ではハイブリダイゼーションを行う
際のプローブ核酸の数に限りがあったため、一度の実験
から得られる情報は限られていた。一方、リバースノザ
ンブロット解析法を用いたＤＮＡアレイでは多数のプロ
ーブを固定化しておくことによって、一度の実験から固
定化されたプローブの種類に相当するだけの情報量が得
られる。また、固定化するプローブについてもゲノムプ
ロジェクトの結果、膨大な数の遺伝子について設計が可
能となっているため、生命現象を解明する有効な手段と
いえる。ＤＮＡアレイはまた、癌の個性診断等の疾患診
断、薬効や副作用の予測等、医療の分野においても重要
な役割を果たすことが期待される。
【０００４】ＤＮＡアレイを用いて遺伝子の発現量を調
べる方法として、一般的に生体試料からポリＡ+ＲＮＡ
あるいはTotal ＲＮＡを単離し、標識ヌクレオチド存在
下で逆転写反応によって標識ｃＤＮＡターゲットを調製
する。これをＤＮＡアレイにハイブリダイズさせ、支持
体上のプローブと結合した標識ターゲット量を直接的あ
るいは間接的に検出することによってそれぞれの遺伝子
の発現量を相対値化する方法が用いられる。この方法は
簡便で、かつ相対的な遺伝子の発現量を良く反映する一
方、ポリＡ+ＲＮＡの場合は２〜５μｇ、Total ＲＮＡ
の場合は５０〜２００μｇと比較的多量のＲＮＡを使用
する。そのためには、１０ｍｇ程度の組織もしくは細胞
が必要とされるという問題がある。手術などで摘出され
る臨床材料の場合や大量の細胞が可能な場合は有効な手
段であるが、微小な生検試料や少量の細胞培養サンプル
からμｇ単位でのポリＡ+ＲＮＡの抽出は困難で、ＤＮ
Ａアレイの障害となっていた。
べる方法として、一般的に生体試料からポリＡ+ＲＮＡ
あるいはTotal ＲＮＡを単離し、標識ヌクレオチド存在
下で逆転写反応によって標識ｃＤＮＡターゲットを調製
する。これをＤＮＡアレイにハイブリダイズさせ、支持
体上のプローブと結合した標識ターゲット量を直接的あ
るいは間接的に検出することによってそれぞれの遺伝子
の発現量を相対値化する方法が用いられる。この方法は
簡便で、かつ相対的な遺伝子の発現量を良く反映する一
方、ポリＡ+ＲＮＡの場合は２〜５μｇ、Total ＲＮＡ
の場合は５０〜２００μｇと比較的多量のＲＮＡを使用
する。そのためには、１０ｍｇ程度の組織もしくは細胞
が必要とされるという問題がある。手術などで摘出され
る臨床材料の場合や大量の細胞が可能な場合は有効な手
段であるが、微小な生検試料や少量の細胞培養サンプル
からμｇ単位でのポリＡ+ＲＮＡの抽出は困難で、ＤＮ
Ａアレイの障害となっていた。
【０００５】一方、微量ＲＮＡから標識サンプルを調製
する方法として、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ増幅法が用
いられる。この方法では、ＲＮＡより５'末端側にＴ７
プロモーター配列を付加されたオリゴｄＴプライマーを
用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成し、二本鎖化後、Ｔ７ Ｒ
ＮＡポリメラーゼで転写反応を行うことによって、１分
子のｃＤＮＡ（１分子のｍＲＮＡに相当）から１００分
子程度のＲＮＡが合成する。このＲＮＡを鋳型として、
ランダムヘキサマー、標識ヌクレオチドを用いて再び逆
転写反応を行って調製された標識ｃＤＮＡターゲットを
ＤＮＡアレイにハイブリダイズさせ、解析を可能にする
ものである。この方法で懸念されるのは、遺伝子毎の増
幅効率が同じでないため、増幅したものを利用した結果
はそうでない場合と必ずしも同一でがない。しかしなが
ら、ＤＮＡアレイでは、遺伝子間の発現量を比較するも
のではなく、同一遺伝子の発現量を２種類以上のサンプ
ルの間で比較するものであるので、サンプル間で同じ遺
伝子が同じように増幅されるのであれば、増幅効率の差
が結果に及ぼす影響はさほど大きくないとされる。とは
いえ、このＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ増幅法では反応過
程で不安定なＲＮＡを扱うことになるため、ＲＮＡ分解
酵素の混入等によるサンプルの分解が懸念される。ま
た、逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素とい
う一連の反応において複数の酵素が用いられ、遺伝子間
で増幅効率のバイアスが生じる可能性が高くなる上、一
連の反応での増幅効率が十分でないため、特にサンプル
が微量の場合、複数回このような反応過程を繰り返さな
ければならない。そこで、これらの問題点を克服した方
法の開発が必要とされていた。
する方法として、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ増幅法が用
いられる。この方法では、ＲＮＡより５'末端側にＴ７
プロモーター配列を付加されたオリゴｄＴプライマーを
用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成し、二本鎖化後、Ｔ７ Ｒ
ＮＡポリメラーゼで転写反応を行うことによって、１分
子のｃＤＮＡ（１分子のｍＲＮＡに相当）から１００分
子程度のＲＮＡが合成する。このＲＮＡを鋳型として、
ランダムヘキサマー、標識ヌクレオチドを用いて再び逆
転写反応を行って調製された標識ｃＤＮＡターゲットを
ＤＮＡアレイにハイブリダイズさせ、解析を可能にする
ものである。この方法で懸念されるのは、遺伝子毎の増
幅効率が同じでないため、増幅したものを利用した結果
はそうでない場合と必ずしも同一でがない。しかしなが
ら、ＤＮＡアレイでは、遺伝子間の発現量を比較するも
のではなく、同一遺伝子の発現量を２種類以上のサンプ
ルの間で比較するものであるので、サンプル間で同じ遺
伝子が同じように増幅されるのであれば、増幅効率の差
が結果に及ぼす影響はさほど大きくないとされる。とは
いえ、このＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ増幅法では反応過
程で不安定なＲＮＡを扱うことになるため、ＲＮＡ分解
酵素の混入等によるサンプルの分解が懸念される。ま
た、逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素とい
う一連の反応において複数の酵素が用いられ、遺伝子間
で増幅効率のバイアスが生じる可能性が高くなる上、一
連の反応での増幅効率が十分でないため、特にサンプル
が微量の場合、複数回このような反応過程を繰り返さな
ければならない。そこで、これらの問題点を克服した方
法の開発が必要とされていた。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、微量
の核酸から、簡便に効率よく核酸を増幅する方法及び標
識核酸の調製方法ならびにそのための試薬を提供する。
の核酸から、簡便に効率よく核酸を増幅する方法及び標
識核酸の調製方法ならびにそのための試薬を提供する。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、微量核酸
の遺伝子集団構成を維持しつつ、かつ効率よく増幅する
方法に着目し、鋭意検討を重ねた結果、ポリＡ+ＲＮＡ
よりｃＤＮＡを合成する際、及び二本鎖ｃＤＮＡの合成
の際に、アンカー配列が付加されたオリゴｄＴプライマ
ーやランダムプライマーを使用することによって、ＰＣ
Ｒを行うことにより簡便かつ効率よく微量核酸を増幅で
きることを見出し、本発明を完成させるに至った。
の遺伝子集団構成を維持しつつ、かつ効率よく増幅する
方法に着目し、鋭意検討を重ねた結果、ポリＡ+ＲＮＡ
よりｃＤＮＡを合成する際、及び二本鎖ｃＤＮＡの合成
の際に、アンカー配列が付加されたオリゴｄＴプライマ
ーやランダムプライマーを使用することによって、ＰＣ
Ｒを行うことにより簡便かつ効率よく微量核酸を増幅で
きることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】すなわち、本発明は以下のような構成から
なる、 （１）以下の工程を含むことを特徴とするｃＤＮＡの増
幅方法。 ポリＡ+ＲＮＡから、５'末端にアンカー配列１を有す
るオリゴｄＴプライマーを用いて逆転写反応により一本
鎖ｃＤＮＡを調製し、 該ｃＤＮＡに、５'末端にアンカー配列２が付加され
たランダムオリゴヌクレオチドプライマーをアニーリン
グさせ、 プライマーを伸長して二本鎖ｃＤＮＡを合成し、 アンカー配列部分と少なくとも部分的に同じ塩基配列
部分を有するプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応
を行う （２）アンカー配列１及びアンカー配列２が少なくとも
部分的に同じ塩基配列を有する（１）に記載のｃＤＮＡ
の増幅方法。 （３）オリゴｄＴプライマーのｄＴストレッチが１５〜
３０塩基よりなる（１）または（２）に記載のｃＤＮＡ
の増幅方法。 （４）オリゴｄＴプライマーの３'末端に少なくとも１
残基の混合塩基を有する（１）〜（３）のいずれかに記
載のｃＤＮＡの増幅方法。 （５）ランダムオリゴヌクレオチドプライマー中のラン
ダム塩基配列が５〜１５塩基よりなる（１）〜（４）の
いずれかに記載のｃＤＮＡの増幅方法。 （６）ランダムオリゴヌクレオチドプライマー中のラン
ダム塩基配列が９塩基よりなる（５）に記載のｃＤＮＡ
の増幅方法。 （７）ランダムオリゴヌクレオチドプライマーのアニー
リング温度が１０〜５０℃である（１）〜（６）のいず
れかに記載のｃＤＮＡの増幅方法。 （８）ランダムオリゴヌクレオチドプライマーのアニー
リング温度が２５〜４５℃である（７）に記載のｃＤＮ
Ａの増幅方法。 （９）５'末端にアンカー配列２が付加されたランダム
オリゴヌクレオチドプライマー、アンカー配列部分と少
なくとも部分的に同じ塩基配列を有するプライマーを反
応液に同時に加え、二本鎖ｃＤＮＡの合成、ポリメラー
ゼ連鎖反応を連続的に行う（１）〜（８）のいずれかに
記載のｃＤＮＡの増幅方法。 （１０）５'末端にアンカー配列２が付加されたランダ
ムオリゴヌクレオチドプライマー、アンカー配列部分と
少なくとも部分的に同じ塩基配列を有するプライマーの
混合比が０．１：１００〜１０：１００である（１）〜
（９）のいずれかに記載のｃＤＮＡの増幅方法。 （１１）該混合比が１：１００である（１０）に記載の
ｃＤＮＡの増幅方法。 （１２）以下の工程を含むことを特徴とする標識ｃＤＮ
Ａの調製方法。 ポリＡ+ＲＮＡから、５'末端にアンカー配列１を有す
るオリゴｄＴプライマーを用いて逆転写反応により一本
鎖ｃＤＮＡを調製し、 ｃＤＮＡに、５'末端にアンカー配列２が付加された
ランダムオリゴヌクレオチドプライマーをアニーリング
させ、 該プライマーを伸長して二本鎖ｃＤＮＡを合成し、 アンカー配列部分と少なくとも部分的に同じ塩基配列
を有するプライマーを用いて標識ヌクレオチド存在下で
ポリメラーゼ連鎖反応を行う （１３）アンカー配列１及びアンカー配列２が少なくと
も部分的に同じ塩基配列を有する（１２）に記載の標識
ｃＤＮＡの調製方法。 （１４）オリゴｄＴプライマーのｄＴストレッチが１５
〜３０塩基よりなる（１２）または（１３）に記載の標
識ｃＤＮＡの調製方法。 （１５）オリゴｄＴプライマーの３'末端に少なくとも
１残基の混合塩基を有する（１２）〜（１４）のいずれ
かに記載の標識ｃＤＮＡの調製方法。 （１６）ランダムオリゴヌクレオチドプライマー中のラ
ンダム塩基配列が５〜１５塩基よりなる（１２）〜（１
５）のいずれかに記載の標識ｃＤＮＡの調製方法。 （１７）ランダムオリゴヌクレオチドプライマー中のラ
ンダム塩基配列が９塩基よりなる（１６）に記載の標識
ｃＤＮＡの調製方法。 （１８）ランダムオリゴヌクレオチドプライマーのアニ
ーリング温度が１０〜５０℃である（１２）〜（１７）
のいずれかに記載の標識ｃＤＮＡの調製方法。 （１９）ランダムオリゴヌクレオチドプライマーのアニ
ーリング温度が２５〜４５℃である（１８）に記載の標
識ｃＤＮＡの調製方法。 （２０）５'末端にアンカー配列２が付加されたランダ
ムオリゴヌクレオチドプライマー、アンカー配列部分と
少なくとも部分的に同じ塩基配列を有するプライマーを
反応液に同時に加え、二本鎖ｃＤＮＡの合成、ポリメラ
ーゼ連鎖反応を連続的に行う（１２）〜（１９）のいず
れかに記載の標識ｃＤＮＡの調製方法。 （２１）５'末端にアンカー配列２が付加されたランダ
ムオリゴヌクレオチドプライマー、アンカー配列部分と
少なくとも部分的に同じ塩基配列を有するプライマーの
混合比が０．１：１００〜１０：１００である（１２）
〜（２０）のいずれかに記載の標識ｃＤＮＡの調製方
法。 （２２）該混合比が１：１００である（２１）に記載の
標識ｃＤＮＡの調製方法。 （２３）５'末端にアンカー配列１を有するオリゴｄＴ
プライマー、逆転写酵素、５'末端にアンカー配列２が
付加されたランダムオリゴヌクレオチドプライマー、ア
ンカー配列部分と少なくとも部分的に同じ塩基配列を有
するプライマー、ＰＣＲ酵素を含むことを特徴とする
（１）〜（１１）のいずれかに記載の方法によりｃＤＮ
Ａを増幅するためのｃＤＮＡ増幅用キット。 （２４）５'末端にアンカー配列１を有するオリゴｄＴ
プライマー、逆転写酵素、５'末端にアンカー配列２が
付加されたランダムオリゴヌクレオチドプライマー、ア
ンカー配列部分と少なくとも部分的に同じ塩基配列を有
するプライマー、ＰＣＲ酵素、標識ヌクレオチドを含む
ことを特徴とする（１２）〜（２２）のいずれかに記載
の方法により標識ｃＤＮＡを調製するための標識ｃＤＮ
Ａ調製用キット。
なる、 （１）以下の工程を含むことを特徴とするｃＤＮＡの増
幅方法。 ポリＡ+ＲＮＡから、５'末端にアンカー配列１を有す
るオリゴｄＴプライマーを用いて逆転写反応により一本
鎖ｃＤＮＡを調製し、 該ｃＤＮＡに、５'末端にアンカー配列２が付加され
たランダムオリゴヌクレオチドプライマーをアニーリン
グさせ、 プライマーを伸長して二本鎖ｃＤＮＡを合成し、 アンカー配列部分と少なくとも部分的に同じ塩基配列
部分を有するプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応
を行う （２）アンカー配列１及びアンカー配列２が少なくとも
部分的に同じ塩基配列を有する（１）に記載のｃＤＮＡ
の増幅方法。 （３）オリゴｄＴプライマーのｄＴストレッチが１５〜
３０塩基よりなる（１）または（２）に記載のｃＤＮＡ
の増幅方法。 （４）オリゴｄＴプライマーの３'末端に少なくとも１
残基の混合塩基を有する（１）〜（３）のいずれかに記
載のｃＤＮＡの増幅方法。 （５）ランダムオリゴヌクレオチドプライマー中のラン
ダム塩基配列が５〜１５塩基よりなる（１）〜（４）の
いずれかに記載のｃＤＮＡの増幅方法。 （６）ランダムオリゴヌクレオチドプライマー中のラン
ダム塩基配列が９塩基よりなる（５）に記載のｃＤＮＡ
の増幅方法。 （７）ランダムオリゴヌクレオチドプライマーのアニー
リング温度が１０〜５０℃である（１）〜（６）のいず
れかに記載のｃＤＮＡの増幅方法。 （８）ランダムオリゴヌクレオチドプライマーのアニー
リング温度が２５〜４５℃である（７）に記載のｃＤＮ
Ａの増幅方法。 （９）５'末端にアンカー配列２が付加されたランダム
オリゴヌクレオチドプライマー、アンカー配列部分と少
なくとも部分的に同じ塩基配列を有するプライマーを反
応液に同時に加え、二本鎖ｃＤＮＡの合成、ポリメラー
ゼ連鎖反応を連続的に行う（１）〜（８）のいずれかに
記載のｃＤＮＡの増幅方法。 （１０）５'末端にアンカー配列２が付加されたランダ
ムオリゴヌクレオチドプライマー、アンカー配列部分と
少なくとも部分的に同じ塩基配列を有するプライマーの
混合比が０．１：１００〜１０：１００である（１）〜
（９）のいずれかに記載のｃＤＮＡの増幅方法。 （１１）該混合比が１：１００である（１０）に記載の
ｃＤＮＡの増幅方法。 （１２）以下の工程を含むことを特徴とする標識ｃＤＮ
Ａの調製方法。 ポリＡ+ＲＮＡから、５'末端にアンカー配列１を有す
るオリゴｄＴプライマーを用いて逆転写反応により一本
鎖ｃＤＮＡを調製し、 ｃＤＮＡに、５'末端にアンカー配列２が付加された
ランダムオリゴヌクレオチドプライマーをアニーリング
させ、 該プライマーを伸長して二本鎖ｃＤＮＡを合成し、 アンカー配列部分と少なくとも部分的に同じ塩基配列
を有するプライマーを用いて標識ヌクレオチド存在下で
ポリメラーゼ連鎖反応を行う （１３）アンカー配列１及びアンカー配列２が少なくと
も部分的に同じ塩基配列を有する（１２）に記載の標識
ｃＤＮＡの調製方法。 （１４）オリゴｄＴプライマーのｄＴストレッチが１５
〜３０塩基よりなる（１２）または（１３）に記載の標
識ｃＤＮＡの調製方法。 （１５）オリゴｄＴプライマーの３'末端に少なくとも
１残基の混合塩基を有する（１２）〜（１４）のいずれ
かに記載の標識ｃＤＮＡの調製方法。 （１６）ランダムオリゴヌクレオチドプライマー中のラ
ンダム塩基配列が５〜１５塩基よりなる（１２）〜（１
５）のいずれかに記載の標識ｃＤＮＡの調製方法。 （１７）ランダムオリゴヌクレオチドプライマー中のラ
ンダム塩基配列が９塩基よりなる（１６）に記載の標識
ｃＤＮＡの調製方法。 （１８）ランダムオリゴヌクレオチドプライマーのアニ
ーリング温度が１０〜５０℃である（１２）〜（１７）
のいずれかに記載の標識ｃＤＮＡの調製方法。 （１９）ランダムオリゴヌクレオチドプライマーのアニ
ーリング温度が２５〜４５℃である（１８）に記載の標
識ｃＤＮＡの調製方法。 （２０）５'末端にアンカー配列２が付加されたランダ
ムオリゴヌクレオチドプライマー、アンカー配列部分と
少なくとも部分的に同じ塩基配列を有するプライマーを
反応液に同時に加え、二本鎖ｃＤＮＡの合成、ポリメラ
ーゼ連鎖反応を連続的に行う（１２）〜（１９）のいず
れかに記載の標識ｃＤＮＡの調製方法。 （２１）５'末端にアンカー配列２が付加されたランダ
ムオリゴヌクレオチドプライマー、アンカー配列部分と
少なくとも部分的に同じ塩基配列を有するプライマーの
混合比が０．１：１００〜１０：１００である（１２）
〜（２０）のいずれかに記載の標識ｃＤＮＡの調製方
法。 （２２）該混合比が１：１００である（２１）に記載の
標識ｃＤＮＡの調製方法。 （２３）５'末端にアンカー配列１を有するオリゴｄＴ
プライマー、逆転写酵素、５'末端にアンカー配列２が
付加されたランダムオリゴヌクレオチドプライマー、ア
ンカー配列部分と少なくとも部分的に同じ塩基配列を有
するプライマー、ＰＣＲ酵素を含むことを特徴とする
（１）〜（１１）のいずれかに記載の方法によりｃＤＮ
Ａを増幅するためのｃＤＮＡ増幅用キット。 （２４）５'末端にアンカー配列１を有するオリゴｄＴ
プライマー、逆転写酵素、５'末端にアンカー配列２が
付加されたランダムオリゴヌクレオチドプライマー、ア
ンカー配列部分と少なくとも部分的に同じ塩基配列を有
するプライマー、ＰＣＲ酵素、標識ヌクレオチドを含む
ことを特徴とする（１２）〜（２２）のいずれかに記載
の方法により標識ｃＤＮＡを調製するための標識ｃＤＮ
Ａ調製用キット。
【０００９】
【発明の実施の形態】以下に本発明を詳細に説明する。
本発明においてポリＡ+ＲＮＡは、単離されたポリＡ+Ｒ
ＮＡサンプルの他、Total ＲＮＡなどに含有されるポリ
Ａ+ＲＮＡ等も含まれる。
本発明においてポリＡ+ＲＮＡは、単離されたポリＡ+Ｒ
ＮＡサンプルの他、Total ＲＮＡなどに含有されるポリ
Ａ+ＲＮＡ等も含まれる。
【００１０】本発明では、まず、試料より分離されたポ
リＡ+ＲＮＡをｃＤＮＡに変換する。試料より核酸を分
離する方法としては、常法に従い行うことができ、ＡＧ
ＰＣ法[Analytical Biochemistry Vol.162、pp156−15
9]や、市販の試薬を用いてTotal ＲＮＡを単離すれば良
い。さらに、市販の試薬を用いて試料より直接ポリＡ +
ＲＮＡを単離する他、上記Total ＲＮＡよりオリゴｄＴ
セファロース等の担体を利用してポリＡ+ＲＮＡを単
離、精製しておくことがより好ましい。
リＡ+ＲＮＡをｃＤＮＡに変換する。試料より核酸を分
離する方法としては、常法に従い行うことができ、ＡＧ
ＰＣ法[Analytical Biochemistry Vol.162、pp156−15
9]や、市販の試薬を用いてTotal ＲＮＡを単離すれば良
い。さらに、市販の試薬を用いて試料より直接ポリＡ +
ＲＮＡを単離する他、上記Total ＲＮＡよりオリゴｄＴ
セファロース等の担体を利用してポリＡ+ＲＮＡを単
離、精製しておくことがより好ましい。
【００１１】上記ポリＡ+ＲＮＡのｃＤＮＡへの変換に
は、逆転写酵素、ｄＮＴＰ、及び５'末端にアンカー配
列１を有するオリゴｄＴプライマーを反応させる。オリ
ゴｄＴプライマーはポリＡ+ＲＮＡのポリアデニル化領
域（ポリＡテール）に特異的にアニーリングし得る長
さ、つまりｄＴストレッチが１５〜３０塩基よりなるも
のであれば好ましく、２０〜２５塩基程度がより好まし
い。
は、逆転写酵素、ｄＮＴＰ、及び５'末端にアンカー配
列１を有するオリゴｄＴプライマーを反応させる。オリ
ゴｄＴプライマーはポリＡ+ＲＮＡのポリアデニル化領
域（ポリＡテール）に特異的にアニーリングし得る長
さ、つまりｄＴストレッチが１５〜３０塩基よりなるも
のであれば好ましく、２０〜２５塩基程度がより好まし
い。
【００１２】上記反応で使用するオリゴｄＴの５'末端
に付加されるアンカー配列１は、ＰＣＲ時のプライマー
アニーリング部位を含むため、少なくとも１５塩基以上
あることが望ましい。また、アンカー配列１中にパリン
ドローム構造を有しないものが好ましい。これは、ＰＣ
Ｒを行う際にパリンドローム構造を有するアンカー配列
に相補的なプライマーを使用すると、セルフアニーリン
グにより反応効率が低下することが懸念されるからであ
る。なお、アンカー配列中の塩基配列にパリンドローム
配列がある場合でも本法を行うことが可能であるが、ア
ンカー配列全体がパリンドローム配列からなるようなあ
まり長いパリンドローム配列を有するものでない方が好
ましい。
に付加されるアンカー配列１は、ＰＣＲ時のプライマー
アニーリング部位を含むため、少なくとも１５塩基以上
あることが望ましい。また、アンカー配列１中にパリン
ドローム構造を有しないものが好ましい。これは、ＰＣ
Ｒを行う際にパリンドローム構造を有するアンカー配列
に相補的なプライマーを使用すると、セルフアニーリン
グにより反応効率が低下することが懸念されるからであ
る。なお、アンカー配列中の塩基配列にパリンドローム
配列がある場合でも本法を行うことが可能であるが、ア
ンカー配列全体がパリンドローム配列からなるようなあ
まり長いパリンドローム配列を有するものでない方が好
ましい。
【００１３】さらに、ポリＡ+ＲＮＡのポリＡテールは
数百残基に及ぶこともあり、逆転写酵素や後工程のＰＣ
Ｒ酵素による伸長反応時に同一塩基が連続すると酵素が
スリップし、反応効率が低下する。これを防ぐため、オ
リゴｄＴプライマーの３'末端には少なくとも１残基以
上の混合塩基を付加し、ポリＡテールの最上流部分にオ
リゴｄＴプライマーをアニーリングさせることにより、
一本鎖ｃＤＮＡの合成をポリＡテール最上流より開始さ
せることが好ましい。
数百残基に及ぶこともあり、逆転写酵素や後工程のＰＣ
Ｒ酵素による伸長反応時に同一塩基が連続すると酵素が
スリップし、反応効率が低下する。これを防ぐため、オ
リゴｄＴプライマーの３'末端には少なくとも１残基以
上の混合塩基を付加し、ポリＡテールの最上流部分にオ
リゴｄＴプライマーをアニーリングさせることにより、
一本鎖ｃＤＮＡの合成をポリＡテール最上流より開始さ
せることが好ましい。
【００１４】本発明においては、上記ｃＤＮＡに、５'
末端にアンカー配列２が付加されたランダムオリゴヌク
レオチドプライマーをアニーリングさせ、上記プライマ
ーを伸長して二本鎖ｃＤＮＡを合成する。アンカー配列
２はアンカー配列１と全く同じ塩基配列を含まない場
合、２種類のプライマーを用いて次工程のＰＣＲを行う
ことが可能であるが、少なくとも部分的に同じ塩基配列
を有する配列を用いることでＰＣＲを共通配列プライマ
ー１種類で行うことが出来る。このため、少なくとも部
分的に同じ塩基配列が１５塩基以上からなることが好ま
しく、特に必要がなければアンカー配列１およびアンカ
ー配列２はが全く同じものを使用すればよい。さらに、
２０塩基以上のＴｍ値の高い塩基配列をＰＣＲプライマ
ーとし、ＰＣＲ時のアニーリング温度を６０℃、好まし
くは６５℃以上に設定することで、ランダムプライマー
がＰＣＲ時に存在してもアニーリングできないため、増
幅断片の短鎖化を防ぐことが可能になる。
末端にアンカー配列２が付加されたランダムオリゴヌク
レオチドプライマーをアニーリングさせ、上記プライマ
ーを伸長して二本鎖ｃＤＮＡを合成する。アンカー配列
２はアンカー配列１と全く同じ塩基配列を含まない場
合、２種類のプライマーを用いて次工程のＰＣＲを行う
ことが可能であるが、少なくとも部分的に同じ塩基配列
を有する配列を用いることでＰＣＲを共通配列プライマ
ー１種類で行うことが出来る。このため、少なくとも部
分的に同じ塩基配列が１５塩基以上からなることが好ま
しく、特に必要がなければアンカー配列１およびアンカ
ー配列２はが全く同じものを使用すればよい。さらに、
２０塩基以上のＴｍ値の高い塩基配列をＰＣＲプライマ
ーとし、ＰＣＲ時のアニーリング温度を６０℃、好まし
くは６５℃以上に設定することで、ランダムプライマー
がＰＣＲ時に存在してもアニーリングできないため、増
幅断片の短鎖化を防ぐことが可能になる。
【００１５】本発明におけるランダムヌクレオチドプラ
イマーのランダムヌクレオチド配列部分は好ましくは５
〜１５塩基、さらに好ましくは９塩基よりなる。該プラ
イマーのアニーリング温度は、好ましくは１０〜５０
℃、より好ましくは２５〜４０℃で行う。該ランダムヌ
クレオチド配列が短すぎると、アニーリング効率が低下
する。これを反応温度を低下させることによって補正し
ようとした場合、ＰＣＲ酵素類の活性が低下するので好
ましくない。一方、ランダムヌクレオチド配列が長すぎ
ると、これが次工程のＰＣＲにキャリーオーバーされた
場合、プライマーとして使用され得るので増幅断片の短
鎖化を招く。
イマーのランダムヌクレオチド配列部分は好ましくは５
〜１５塩基、さらに好ましくは９塩基よりなる。該プラ
イマーのアニーリング温度は、好ましくは１０〜５０
℃、より好ましくは２５〜４０℃で行う。該ランダムヌ
クレオチド配列が短すぎると、アニーリング効率が低下
する。これを反応温度を低下させることによって補正し
ようとした場合、ＰＣＲ酵素類の活性が低下するので好
ましくない。一方、ランダムヌクレオチド配列が長すぎ
ると、これが次工程のＰＣＲにキャリーオーバーされた
場合、プライマーとして使用され得るので増幅断片の短
鎖化を招く。
【００１６】本発明では、上記ｃＤＮＡを鋳型としてア
ンカー配列部分と少なくとも部分的に同じ塩基配列部分
を有するプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、
ｃＤＮＡを増幅する。この際、前工程から持ち込まれた
ランダムオリゴヌクレオチドプライマーによる短鎖化を
防ぐため、前工程反応産物を精製し、ランダムオリゴヌ
クレオチドプライマーを除去しておくとよい。あるいは
ＰＣＲサイクルのアニーリング温度を高くするか、シャ
トルＰＣＲを行うことによっても回避できる。また、ビ
オチン−ｄＵＴＰ等の標識ヌクレオチド存在下でＰＣＲ
を行うことにより、ＤＮＡアレイなどのリバースノザン
ブロットの標識サンプルとして利用できる。図１に本発
明の概略を示す。
ンカー配列部分と少なくとも部分的に同じ塩基配列部分
を有するプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、
ｃＤＮＡを増幅する。この際、前工程から持ち込まれた
ランダムオリゴヌクレオチドプライマーによる短鎖化を
防ぐため、前工程反応産物を精製し、ランダムオリゴヌ
クレオチドプライマーを除去しておくとよい。あるいは
ＰＣＲサイクルのアニーリング温度を高くするか、シャ
トルＰＣＲを行うことによっても回避できる。また、ビ
オチン−ｄＵＴＰ等の標識ヌクレオチド存在下でＰＣＲ
を行うことにより、ＤＮＡアレイなどのリバースノザン
ブロットの標識サンプルとして利用できる。図１に本発
明の概略を示す。
【００１７】さらに、一本鎖ｃＤＮＡ、５'末端にアン
カー配列２が付加されたランダムオリゴヌクレオチドプ
ライマー、アンカー配列部分と少なくとも部分的に同じ
塩基配列部分を有する、好ましくは２０〜３５塩基が同
じ配列であるようなプライマーを反応液に同時に加え、
二本鎖ｃＤＮＡの合成、ポリメラーゼ連鎖反応を簡便に
連続的に行うことも可能である。本発明者らは、上記反
応液に耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰを添加後、
サーマルサイクラーにセットし、例えば（９４℃・３０
秒、３０〜４５℃・１０秒、７２℃・５分）×２サイク
ル、（９４℃・３０秒、７２℃・５分）×２５サイクル
の反応を連続的に行わせることにより、二本鎖ｃＤＮＡ
の合成及び増幅が可能であることを見出した。さらに、
添加する５'末端にアンカー配列２が付加されたランダ
ムオリゴヌクレオチドプライマーとアンカー配列部分と
少なくとも部分的に、好ましくは２０〜３５塩基が同じ
塩基配列部分を有するプライマーの量比は、０．１：１
００〜１０：１００が適当である。さらに好ましくは
１：１００である。
カー配列２が付加されたランダムオリゴヌクレオチドプ
ライマー、アンカー配列部分と少なくとも部分的に同じ
塩基配列部分を有する、好ましくは２０〜３５塩基が同
じ配列であるようなプライマーを反応液に同時に加え、
二本鎖ｃＤＮＡの合成、ポリメラーゼ連鎖反応を簡便に
連続的に行うことも可能である。本発明者らは、上記反
応液に耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰを添加後、
サーマルサイクラーにセットし、例えば（９４℃・３０
秒、３０〜４５℃・１０秒、７２℃・５分）×２サイク
ル、（９４℃・３０秒、７２℃・５分）×２５サイクル
の反応を連続的に行わせることにより、二本鎖ｃＤＮＡ
の合成及び増幅が可能であることを見出した。さらに、
添加する５'末端にアンカー配列２が付加されたランダ
ムオリゴヌクレオチドプライマーとアンカー配列部分と
少なくとも部分的に、好ましくは２０〜３５塩基が同じ
塩基配列部分を有するプライマーの量比は、０．１：１
００〜１０：１００が適当である。さらに好ましくは
１：１００である。
【００１８】本発明による核酸の増幅方法は微量核酸よ
り効率よく核酸を増幅することが可能であり、特定の核
酸ではなく、核酸を集団として増幅することができるの
で、ｃＤＮＡクローニングの際等の核酸ソースの増幅あ
るいはライブラリーの作製に利用される。さらに、ＰＣ
Ｒの際に標識ヌクレオチドあるいは標識プライマーを使
用することで簡便にＤＮＡアレイの標識核酸サンプルを
調製することが可能である。
り効率よく核酸を増幅することが可能であり、特定の核
酸ではなく、核酸を集団として増幅することができるの
で、ｃＤＮＡクローニングの際等の核酸ソースの増幅あ
るいはライブラリーの作製に利用される。さらに、ＰＣ
Ｒの際に標識ヌクレオチドあるいは標識プライマーを使
用することで簡便にＤＮＡアレイの標識核酸サンプルを
調製することが可能である。
【００１９】本発明の一実施態様は、５'末端にアンカ
ー配列１を有するオリゴｄＴプライマー、逆転写酵素、
５'末端にアンカー配列２が付加されたランダムオリゴ
ヌクレオチドプライマー、アンカー配列部分と少なくと
も部分的に同じ塩基配列部分を有するプライマー、ＰＣ
Ｒ酵素を含む、（１）ポリＡ+ＲＮＡから、５'末端にア
ンカー配列１を有するオリゴｄＴプライマーを用いて逆
転写反応により一本鎖ｃＤＮＡを調製し、（２）該ｃＤ
ＮＡに、５'末端にアンカー配列２が付加されたランダ
ムオリゴヌクレオチドプライマーをアニーリングさせ、
（３）該プライマーを伸長して二本鎖ｃＤＮＡを合成
し、（４）アンカー配列部分と少なくとも部分的に同じ
塩基配列を有するプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖
反応を行うことを特徴とするｃＤＮＡ増幅用キットであ
る。ここで、ＰＣＲ酵素とは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラ
ーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポ
リメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ｄ
ａｓｈ（東洋紡績）などの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを
いうものである。
ー配列１を有するオリゴｄＴプライマー、逆転写酵素、
５'末端にアンカー配列２が付加されたランダムオリゴ
ヌクレオチドプライマー、アンカー配列部分と少なくと
も部分的に同じ塩基配列部分を有するプライマー、ＰＣ
Ｒ酵素を含む、（１）ポリＡ+ＲＮＡから、５'末端にア
ンカー配列１を有するオリゴｄＴプライマーを用いて逆
転写反応により一本鎖ｃＤＮＡを調製し、（２）該ｃＤ
ＮＡに、５'末端にアンカー配列２が付加されたランダ
ムオリゴヌクレオチドプライマーをアニーリングさせ、
（３）該プライマーを伸長して二本鎖ｃＤＮＡを合成
し、（４）アンカー配列部分と少なくとも部分的に同じ
塩基配列を有するプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖
反応を行うことを特徴とするｃＤＮＡ増幅用キットであ
る。ここで、ＰＣＲ酵素とは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラ
ーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポ
リメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ｄ
ａｓｈ（東洋紡績）などの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを
いうものである。
【００２０】また、本発明の別な実施態様は、５'末端
にアンカー配列１を有するオリゴｄＴプライマー、逆転
写酵素、５'末端にアンカー配列２が付加されたランダ
ムオリゴヌクレオチドプライマー、アンカー配列部分と
少なくとも部分的に同じ塩基配列部分を有するプライマ
ー、ＰＣＲ酵素、標識ヌクレオチドを含む、（１）ポリ
Ａ+ＲＮＡから、５'末端にアンカー配列１を有するオリ
ゴｄＴプライマーを用いて逆転写反応により一本鎖ｃＤ
ＮＡを調製し、（２）該ｃＤＮＡに、５'末端にアンカ
ー配列２が付加されたランダムオリゴヌクレオチドプラ
イマーをアニーリングさせ、（３）該プライマーを伸長
して二本鎖ｃＤＮＡを合成し、（４）アンカー配列部分
と少なくとも部分的に同じ塩基配列を有するプライマー
を用いて標識ヌクレオチド存在下でポリメラーゼ連鎖反
応を行うことを特徴とする標識ｃＤＮＡ調製用キットで
ある。ここで、標識に用いる化合物としては、ビオチ
ン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、ローダミン、Ｃ
ｙ３、Ｃｙ５、放射性ヌクレオチド等が例示される。
にアンカー配列１を有するオリゴｄＴプライマー、逆転
写酵素、５'末端にアンカー配列２が付加されたランダ
ムオリゴヌクレオチドプライマー、アンカー配列部分と
少なくとも部分的に同じ塩基配列部分を有するプライマ
ー、ＰＣＲ酵素、標識ヌクレオチドを含む、（１）ポリ
Ａ+ＲＮＡから、５'末端にアンカー配列１を有するオリ
ゴｄＴプライマーを用いて逆転写反応により一本鎖ｃＤ
ＮＡを調製し、（２）該ｃＤＮＡに、５'末端にアンカ
ー配列２が付加されたランダムオリゴヌクレオチドプラ
イマーをアニーリングさせ、（３）該プライマーを伸長
して二本鎖ｃＤＮＡを合成し、（４）アンカー配列部分
と少なくとも部分的に同じ塩基配列を有するプライマー
を用いて標識ヌクレオチド存在下でポリメラーゼ連鎖反
応を行うことを特徴とする標識ｃＤＮＡ調製用キットで
ある。ここで、標識に用いる化合物としては、ビオチ
ン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、ローダミン、Ｃ
ｙ３、Ｃｙ５、放射性ヌクレオチド等が例示される。
【００２１】
【実施例】以下に、本発明の実施例を例示することによ
って、本発明の効果をより一層明確なものとする。
って、本発明の効果をより一層明確なものとする。
【００２２】実施例１ ポリＡ+ＲＮＡの調製 培養細胞ＨｅＬａＳ３及びＫ５６２は、それぞれ１０％
牛胎児血清（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）を含むダルベッコ変
法イーグル培地（ニッスイ）、ＲＰＭＩ１６４０培地
（ニッスイ）でコンフルエントになるまで培養し、細胞
を回収した。各々５×１０6cellより、ポリＡ+ＲＮＡを
市販のキット（MagExtractor -mRNA-；東洋紡績）を用
い、添付のプロトコールに従って調製した。回収量は２
６０ｎｍの吸光度を元に算出され、それぞれ２．１９μ
ｇ、１．１２μｇであった。
牛胎児血清（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）を含むダルベッコ変
法イーグル培地（ニッスイ）、ＲＰＭＩ１６４０培地
（ニッスイ）でコンフルエントになるまで培養し、細胞
を回収した。各々５×１０6cellより、ポリＡ+ＲＮＡを
市販のキット（MagExtractor -mRNA-；東洋紡績）を用
い、添付のプロトコールに従って調製した。回収量は２
６０ｎｍの吸光度を元に算出され、それぞれ２．１９μ
ｇ、１．１２μｇであった。
【００２３】実施例２ 一本鎖ｃＤＮＡの調製 一本鎖ｃＤＮＡの調製のために、配列番号１に示すよう
な、５'末端にアンカー配列１（GAAATGTCCGTTCGGTTGGCA
G）を有するオリゴｄＴプライマー（アマシャムファル
マシアバイオテク）を用いた。
な、５'末端にアンカー配列１（GAAATGTCCGTTCGGTTGGCA
G）を有するオリゴｄＴプライマー（アマシャムファル
マシアバイオテク）を用いた。
【００２４】ＨｅＬａ及びＫ５６２培養細胞より調製さ
れた上記ポリＡ+ＲＮＡ１００ｎｇに、上記オリゴｄＴ
プライマー（１０ｐｍｏｌ）、逆転写酵素（ReverTra A
ce（１００Ｕ）；東洋紡績）、及び終濃度１ｍＭのｄＮ
ＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）を
添加し（反応液量２０μｌ）、４２℃で６０分間インキ
ュベートし、一本鎖ｃＤＮＡを調製した。
れた上記ポリＡ+ＲＮＡ１００ｎｇに、上記オリゴｄＴ
プライマー（１０ｐｍｏｌ）、逆転写酵素（ReverTra A
ce（１００Ｕ）；東洋紡績）、及び終濃度１ｍＭのｄＮ
ＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）を
添加し（反応液量２０μｌ）、４２℃で６０分間インキ
ュベートし、一本鎖ｃＤＮＡを調製した。
【００２５】実施例３ 標識ｃＤＮＡターゲットの調製 上記一本鎖ｃＤＮＡより標識ｃＤＮＡターゲットの調製
のために、上記反応液２μｌに、配列番号２に示すよう
な、５'末端にアンカー配列２（GAAATGTCCGTTCGGTTGGCA
G）が付加されたランダムオリゴヌクレオチドプライマ
ー（アマシャムファルマシアバイオテク）、配列番号３
に示すような、アンカー配列部分と少なくとも部分的に
同じ塩基配列部分を有するＰＣＲプライマー（アマシャ
ムファルマシアバイオテク）を用いた。
のために、上記反応液２μｌに、配列番号２に示すよう
な、５'末端にアンカー配列２（GAAATGTCCGTTCGGTTGGCA
G）が付加されたランダムオリゴヌクレオチドプライマ
ー（アマシャムファルマシアバイオテク）、配列番号３
に示すような、アンカー配列部分と少なくとも部分的に
同じ塩基配列部分を有するＰＣＲプライマー（アマシャ
ムファルマシアバイオテク）を用いた。
【００２６】上記一本鎖ｃＤＮＡ反応液２μｌに、１ｐ
ｍｏｌ ランダムオリゴヌクレオチドプライマー、１０
０ｐｍｏｌ ＰＣＲプライマー、ｄＮＴＰ（０．２ｍＭ
ｄＡＴＰ，０．２ｍＭ ｄＣＴＰ，０．２ｍＭ ｄＧ
ＴＰ，０．１５ｍＭ ｄＴＴＰ）、０．０５ｍＭ ｂｉ
ｏｔｉｎ−１６−ｄＵＴＰ（ロッシュ・ダイアグノステ
ィクス）、ＰＣＲ酵素（２．５Ｕ ＫＯＤ Ｄａｓｈ；
東洋紡績）を添加し（反応液量５０μｌ）、サーマルサ
イクラーにセットし、（９８℃・２０秒、４０℃・ １
０秒、７４℃・５分）×２サイクル、（９８℃・２０
秒、７４℃・５分）×２５サイクルの反応を行った。反
応終了後、未反応のｂｉｏｔｉｎ−１６−ｄＵＴＰを除
去するためにエタノール沈澱を行い、滅菌水に再溶解し
た。
ｍｏｌ ランダムオリゴヌクレオチドプライマー、１０
０ｐｍｏｌ ＰＣＲプライマー、ｄＮＴＰ（０．２ｍＭ
ｄＡＴＰ，０．２ｍＭ ｄＣＴＰ，０．２ｍＭ ｄＧ
ＴＰ，０．１５ｍＭ ｄＴＴＰ）、０．０５ｍＭ ｂｉ
ｏｔｉｎ−１６−ｄＵＴＰ（ロッシュ・ダイアグノステ
ィクス）、ＰＣＲ酵素（２．５Ｕ ＫＯＤ Ｄａｓｈ；
東洋紡績）を添加し（反応液量５０μｌ）、サーマルサ
イクラーにセットし、（９８℃・２０秒、４０℃・ １
０秒、７４℃・５分）×２サイクル、（９８℃・２０
秒、７４℃・５分）×２５サイクルの反応を行った。反
応終了後、未反応のｂｉｏｔｉｎ−１６−ｄＵＴＰを除
去するためにエタノール沈澱を行い、滅菌水に再溶解し
た。
【００２７】実施例４ ｃＤＮＡアレイフィルターへの
ハイブリダイゼーション及び検出 ｃＤＮＡアレイフィルター（Gene Navigator cDNA Arra
y Filter -human cancer selected-；東洋紡績）をハイ
ブリダイゼーションボトルに入れ、ハイブリダイゼーシ
ョン溶液（PerfectHyb Hybridization Solution；東洋
紡績）１０ｍｌを添加し、ハイブリダイゼーションオー
ブンで６８℃で３０分間インキュベートした（プレハイ
ブリダイゼーション）。標識ｃＤＮＡターゲットを変性
するため、５分間煮沸処理し、氷上で急冷した。プレハ
イブリダイゼーション溶液を除去後、６８℃に加温して
おいたハイブリダイゼーション溶液１０ｍｌに標識ｃＤ
ＮＡターゲット溶液を加え、ハイブリブリダイゼーショ
ンボトルに入れ、６８℃で一晩インキュベートした（ハ
イブリダイゼーション）。続いて、ハイブリダイゼーシ
ョン溶液を除去し、６８℃のまま、２×ＳＳＣ，０．１
％ ＳＤＳ ２０ｍｌで１０分間インキュベートし、こ
の操作を２回行った。さらに、０．１×ＳＳＣ、０．１
％ＳＤＳで同様に繰り返した。続いて、市販のビオチン
標識核酸キット（Imaging high -Chemilumi for GeneNa
vigator ver.；東洋紡績）を用いて添付のプロトコール
に従い、化学発光をＸ線フィルム（Scientific Imaging
Film、X-OMAT AR；Ｋｏｄａｋ社）で検出した。この結
果を図１に示す。１００ｎｇ以下の少ないポリＡ+ＲＮ
Ａから十分な強度のシグナルが検出され、２種類の細胞
間で相対的シグナル強度が異なる遺伝子も確認された。
ハイブリダイゼーション及び検出 ｃＤＮＡアレイフィルター（Gene Navigator cDNA Arra
y Filter -human cancer selected-；東洋紡績）をハイ
ブリダイゼーションボトルに入れ、ハイブリダイゼーシ
ョン溶液（PerfectHyb Hybridization Solution；東洋
紡績）１０ｍｌを添加し、ハイブリダイゼーションオー
ブンで６８℃で３０分間インキュベートした（プレハイ
ブリダイゼーション）。標識ｃＤＮＡターゲットを変性
するため、５分間煮沸処理し、氷上で急冷した。プレハ
イブリダイゼーション溶液を除去後、６８℃に加温して
おいたハイブリダイゼーション溶液１０ｍｌに標識ｃＤ
ＮＡターゲット溶液を加え、ハイブリブリダイゼーショ
ンボトルに入れ、６８℃で一晩インキュベートした（ハ
イブリダイゼーション）。続いて、ハイブリダイゼーシ
ョン溶液を除去し、６８℃のまま、２×ＳＳＣ，０．１
％ ＳＤＳ ２０ｍｌで１０分間インキュベートし、こ
の操作を２回行った。さらに、０．１×ＳＳＣ、０．１
％ＳＤＳで同様に繰り返した。続いて、市販のビオチン
標識核酸キット（Imaging high -Chemilumi for GeneNa
vigator ver.；東洋紡績）を用いて添付のプロトコール
に従い、化学発光をＸ線フィルム（Scientific Imaging
Film、X-OMAT AR；Ｋｏｄａｋ社）で検出した。この結
果を図１に示す。１００ｎｇ以下の少ないポリＡ+ＲＮ
Ａから十分な強度のシグナルが検出され、２種類の細胞
間で相対的シグナル強度が異なる遺伝子も確認された。
【００２８】実施例８ 半定量ＲＴ−ＰＣＲによる裏付
け 上記ｃＤＮＡアレイへのハイブリダイゼーションの結
果、ＨｅＬａＳ３細胞とＫ５６２細胞において異なる相
対的シグナル強度が認められた遺伝子の一部、ＨＬＡ−
Ａ、ｐ１６ｉｎｋ４ａ（ＭＴＳ１）、及びコントロール
としてハウスキーピング遺伝子Ｇ３ＰＤＨ（Glyceralde
hyde 3-Phosphate Dehydrogenase）について、ＲＴ−Ｐ
ＣＲを行った。テンプレートとして、それぞれの細胞よ
りＡＧＰＣ法[Analytical Biochemistry Vol.162、pp1
56−159（1987）]により調製されたTotal ＲＮＡ１、
０．１、０．０１μｇを用い、上記反応は市販のＲＴ−
ＰＣＲキット（ReverTra Dash；東洋紡績）を用いて添
付のプロトコールに従って行われた。ただし、プライマ
ーとして、逆転写反応にはキット添付のランダムプライ
マー、続くＰＣＲにはそれぞれの遺伝子に配列特異的な
プライマーを用いた。ＲＴ−ＰＣＲ反応産物１／１０量
について、１％アガロース電気泳動を行った結果を図２
に示す。
け 上記ｃＤＮＡアレイへのハイブリダイゼーションの結
果、ＨｅＬａＳ３細胞とＫ５６２細胞において異なる相
対的シグナル強度が認められた遺伝子の一部、ＨＬＡ−
Ａ、ｐ１６ｉｎｋ４ａ（ＭＴＳ１）、及びコントロール
としてハウスキーピング遺伝子Ｇ３ＰＤＨ（Glyceralde
hyde 3-Phosphate Dehydrogenase）について、ＲＴ−Ｐ
ＣＲを行った。テンプレートとして、それぞれの細胞よ
りＡＧＰＣ法[Analytical Biochemistry Vol.162、pp1
56−159（1987）]により調製されたTotal ＲＮＡ１、
０．１、０．０１μｇを用い、上記反応は市販のＲＴ−
ＰＣＲキット（ReverTra Dash；東洋紡績）を用いて添
付のプロトコールに従って行われた。ただし、プライマ
ーとして、逆転写反応にはキット添付のランダムプライ
マー、続くＰＣＲにはそれぞれの遺伝子に配列特異的な
プライマーを用いた。ＲＴ−ＰＣＲ反応産物１／１０量
について、１％アガロース電気泳動を行った結果を図２
に示す。
【００２９】図１においてシグナル強度が異なった遺伝
子においてＲＴ−ＰＣＲにおいても発現量に差が認めら
れ、本発明を応用したＤＮＡアレイの標識ｃＤＮＡター
ゲットの調製法が微量なサンプル間の遺伝子発現の比較
に有効な手段であることが確認された。
子においてＲＴ−ＰＣＲにおいても発現量に差が認めら
れ、本発明を応用したＤＮＡアレイの標識ｃＤＮＡター
ゲットの調製法が微量なサンプル間の遺伝子発現の比較
に有効な手段であることが確認された。
【００３０】
【発明の効果】上述したように、本発明の方法により、
ｃＤＮＡ等の核酸試料をポピュレーションとして効率よ
く増幅することが可能になった。この方法により得られ
た増幅核酸は、ライブラリーのソース、ＤＮＡアレイの
標識ターゲットなどに利用することが可能である。
ｃＤＮＡ等の核酸試料をポピュレーションとして効率よ
く増幅することが可能になった。この方法により得られ
た増幅核酸は、ライブラリーのソース、ＤＮＡアレイの
標識ターゲットなどに利用することが可能である。
【００３１】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110>TOYO BOSEKI KABUSHIKI KAISHA <120>A METHOD OF AMPLIFYING CDNA AND A METHOD OF PREPARAING LABELED CDNA <130>00-0549 <140> <141> <160>3 <170>PatentIn Ver.2.1 <210>1 <211>49 <212>DNA <220> <223>Description of Artificial Sequence <400>1 gaaatgtccg ttcggttggc agtttttttt tttttttttt tttttttvn 49
【００３２】 <210>2 <211>31 <212>DNA <220> <223>Description of Artificial Sequence <400>2 gaaatgtccg ttcggttggc agnnnnnnnn n 31
【００３３】 <210>3 <211>22 <212>DNA <220> <223>Description of Artificial Sequence <400>3 gaaatgtccg ttcggttggc ag 22
【図１】本法を模式的に示した図である。
【図２】本法により、ＨｅＬａＳ３細胞及びＫ５６２細
胞のポリＡ+ＲＮＡから調製した標識ｃＤＮＡターゲッ
トのｃＤＮＡアレイへのハイブリダイゼーション結果を
示す図面に代わる写真である。
胞のポリＡ+ＲＮＡから調製した標識ｃＤＮＡターゲッ
トのｃＤＮＡアレイへのハイブリダイゼーション結果を
示す図面に代わる写真である。
【図３】ｃＤＮＡアレイへのハイブリダイゼーションの
結果、２つの細胞間で異なる相対的シグナル強度を示し
た遺伝子に関するＲＴ−ＰＣＲの電気泳動解析結果を示
す図面に代わる写真である。
結果、２つの細胞間で異なる相対的シグナル強度を示し
た遺伝子に関するＲＴ−ＰＣＲの電気泳動解析結果を示
す図面に代わる写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 川上 文清 福井県敦賀市東洋町10番24号 東洋紡績株 式会社敦賀バイオ研究所内 (72)発明者 川村 良久 福井県敦賀市東洋町10番24号 東洋紡績株 式会社敦賀バイオ研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA04 FA01 HA19 4B029 AA07 AA23 FA12 4B063 QA13 QQ42 QQ49 QQ50 QQ52 QR32 QR62 QS25
Claims (24)
- 【請求項１】 以下の工程を含むことを特徴とするｃＤ
ＮＡの増幅方法。 （１）ポリＡ+ＲＮＡから、５'末端にアンカー配列１を
有するオリゴｄＴプライマーを用いて逆転写反応により
一本鎖ｃＤＮＡを調製し、（２）該ｃＤＮＡに、５'末
端にアンカー配列２が付加されたランダムオリゴヌクレ
オチドプライマーをアニーリングさせ、（３）該プライ
マーを伸長して二本鎖ｃＤＮＡを合成し、（４）アンカ
ー配列部分と少なくとも部分的に同じ塩基配列部分を有
するプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う - 【請求項２】 アンカー配列１及びアンカー配列２が少
なくとも部分的に同じ塩基配列を有する請求項１に記載
のｃＤＮＡの増幅方法。 - 【請求項３】 オリゴｄＴプライマーのｄＴストレッチ
が１５〜３０塩基よりなる請求項１または２に記載のｃ
ＤＮＡの増幅方法。 - 【請求項４】 オリゴｄＴプライマーの３'末端に少な
くとも１残基の混合塩基を有する請求項１〜３のいずれ
かに記載のｃＤＮＡの増幅方法。 - 【請求項５】 ランダムオリゴヌクレオチドプライマー
中のランダム塩基配列が５〜１５塩基よりなる請求項１
〜４のいずれかに記載のｃＤＮＡの増幅方法。 - 【請求項６】 ランダムオリゴヌクレオチドプライマー
中のランダム塩基配列が９塩基よりなる請求項５に記載
のｃＤＮＡの増幅方法。 - 【請求項７】 ランダムオリゴヌクレオチドプライマー
のアニーリング温度が１０〜５０℃である請求項１〜６
のいずれかに記載のｃＤＮＡの増幅方法。 - 【請求項８】 ランダムオリゴヌクレオチドプライマー
のアニーリング温度が２５〜４５℃である請求項７に記
載のｃＤＮＡの増幅方法。 - 【請求項９】 ５'末端にアンカー配列２が付加された
ランダムオリゴヌクレオチドプライマー、アンカー配列
部分と少なくとも部分的に同じ塩基配列を有するプライ
マーを反応液に同時に加え、二本鎖ｃＤＮＡの合成、ポ
リメラーゼ連鎖反応を連続的に行う請求項１〜８のいず
れかに記載のｃＤＮＡの増幅方法。 - 【請求項１０】 ５'末端にアンカー配列２が付加され
たランダムオリゴヌクレオチドプライマー、アンカー配
列部分と少なくとも部分的に同じ塩基配列を有するプラ
イマーの混合比が０．１：１００〜１０：１００である
請求項１〜９のいずれかに記載のｃＤＮＡの増幅方法。 - 【請求項１１】 該混合比が１：１００である請求項１
０に記載のｃＤＮＡの増幅方法。 - 【請求項１２】 以下の工程を含むことを特徴とする標
識ｃＤＮＡの調製方法。 （１）ポリＡ+ＲＮＡから、５'末端にアンカー配列１を
有するオリゴｄＴプライマーを用いて逆転写反応により
一本鎖ｃＤＮＡを調製し、（２）ｃＤＮＡに、５'末端
にアンカー配列２が付加されたランダムオリゴヌクレオ
チドプライマーをアニーリングさせ、（３）該プライマ
ーを伸長して二本鎖ｃＤＮＡを合成し、（４）アンカー
配列部分と少なくとも部分的に同じ塩基配列を有するプ
ライマーを用いて標識ヌクレオチド存在下でポリメラー
ゼ連鎖反応を行う - 【請求項１３】 アンカー配列１及びアンカー配列２が
少なくとも部分的に同じ塩基配列を有する請求項１２に
記載の標識ｃＤＮＡの調製方法。 - 【請求項１４】 オリゴｄＴプライマーのｄＴストレッ
チが１５〜３０塩基よりなる請求項１２または１３に記
載の標識ｃＤＮＡの調製方法。 - 【請求項１５】 オリゴｄＴプライマーの３'末端に少
なくとも１残基の混合塩基を有する請求項１２〜１４の
いずれかに記載の標識ｃＤＮＡの調製方法。 - 【請求項１６】 ランダムオリゴヌクレオチドプライマ
ー中のランダム塩基配列が５〜１５塩基よりなる請求項
１２〜１５のいずれかに記載の標識ｃＤＮＡの調製方
法。 - 【請求項１７】 ランダムオリゴヌクレオチドプライマ
ー中のランダム塩基配列が９塩基よりなる請求項１６に
記載の標識ｃＤＮＡの調製方法。 - 【請求項１８】 ランダムオリゴヌクレオチドプライマ
ーのアニーリング温度が１０〜５０℃である請求項１２
〜１７のいずれかに記載の標識ｃＤＮＡの調製方法。 - 【請求項１９】 ランダムオリゴヌクレオチドプライマ
ーのアニーリング温度が２５〜４５℃である請求項１８
に記載の標識ｃＤＮＡの調製方法。 - 【請求項２０】 ５'末端にアンカー配列２が付加され
たランダムオリゴヌクレオチドプライマー、アンカー配
列部分と少なくとも部分的に同じ塩基配列を有するプラ
イマーを反応液に同時に加え、二本鎖ｃＤＮＡの合成、
ポリメラーゼ連鎖反応を連続的に行う請求項１２〜１９
のいずれかに記載の標識ｃＤＮＡの調製方法。 - 【請求項２１】 ５'末端にアンカー配列２が付加され
たランダムオリゴヌクレオチドプライマー、アンカー配
列部分と少なくとも部分的に同じ塩基配列を有するプラ
イマーの混合比が０．１：１００〜１０：１００である
請求項１２〜２０のいずれかに記載の標識ｃＤＮＡの調
製方法。 - 【請求項２２】 該混合比が１：１００である請求項２
１に記載の標識ｃＤＮＡの調製方法。 - 【請求項２３】 ５'末端にアンカー配列１を有するオ
リゴｄＴプライマー、逆転写酵素、５'末端にアンカー
配列２が付加されたランダムオリゴヌクレオチドプライ
マー、アンカー配列部分と少なくとも部分的に同じ塩基
配列を有するプライマー、ＰＣＲ酵素を含むことを特徴
とする請求項１〜１１のいずれかに記載の方法によりｃ
ＤＮＡを増幅するためのｃＤＮＡ増幅用キット。 - 【請求項２４】 ５'末端にアンカー配列１を有するオ
リゴｄＴプライマー、逆転写酵素、５'末端にアンカー
配列２が付加されたランダムオリゴヌクレオチドプライ
マー、アンカー配列部分と少なくとも部分的に同じ塩基
配列を有するプライマー、ＰＣＲ酵素、標識ヌクレオチ
ドを含むことを特徴とする請求項１２〜２２のいずれか
に記載の方法により標識ｃＤＮＡを調製するための標識
ｃＤＮＡ調製用キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000252835A JP2002065263A (ja) | 2000-08-23 | 2000-08-23 | ｃＤＮＡの増幅方法及び標識ｃＤＮＡの調製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000252835A JP2002065263A (ja) | 2000-08-23 | 2000-08-23 | ｃＤＮＡの増幅方法及び標識ｃＤＮＡの調製方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002065263A true JP2002065263A (ja) | 2002-03-05 |
Family
ID=18742018
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000252835A Pending JP2002065263A (ja) | 2000-08-23 | 2000-08-23 | ｃＤＮＡの増幅方法及び標識ｃＤＮＡの調製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002065263A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003018784A1 (fr) * | 2001-08-24 | 2003-03-06 | Toray Industries, Inc. | Procede de production de lymphocytes t humains specifiques d'un antigene et medicaments associes |
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| WO2010131645A1 (ja) * | 2009-05-14 | 2010-11-18 | 和光純薬工業株式会社 | Rnaに対応する二本鎖dnaの合成方法及び増幅方法 |
| JP2021505157A (ja) * | 2017-12-07 | 2021-02-18 | マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー | 単一細胞分析 |
-
2000
- 2000-08-23 JP JP2000252835A patent/JP2002065263A/ja active Pending
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| US20120058520A1 (en) * | 2009-05-14 | 2012-03-08 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Method for synthesis of double-stranded dna corresponding to rna, and method for amplification of the dna |
| CN102428180A (zh) * | 2009-05-14 | 2012-04-25 | 和光纯药工业株式会社 | 与rna对应的双链dna的合成方法以及扩增方法 |
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| US11767557B2 (en) | 2017-12-07 | 2023-09-26 | Massachusetts Institute Of Technology | Single cell analyses |
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| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20070315 |