JP6301260B2

JP6301260B2 - Ｒｎａ調製法

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Publication number: JP6301260B2
Application number: JP2014543359A
Authority: JP
Inventors: 創太郎佐野; 重彦宮本; 友野　潤; 潤友野; 哉平塚
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Priority date: 2012-10-26
Filing date: 2013-10-25
Publication date: 2018-03-28
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Description

本発明は、生物試料中のＲＮＡを非分解で抽出する方法であって、アルカリ金属塩及び界面活性剤を含むＲＮＡ抽出試薬を用いる方法に関する。

遺伝子工学の発展に伴い、ウイルスの検出、細胞動態の解析、体質検査、医薬品の奏効検査などへ遺伝子検査が利用されている。これら遺伝子検査での解析対象の１つであるＲＮＡはＤＮＡに比べて不安定であり、生物試料中に含まれる内在性リボヌクレアーゼや高温・アルカリ処理により容易に分解する。そのため、ＲＮＡの調製にはその分解を防ぐための高度な技能、多段階に渡る実験工程、高価な専用機器・試薬が必要であった。

例えば、生物試料からＲＮＡを回収する一般的な方法として、タンパク質変性剤と有機溶媒を併用することで検体を溶解し、内在性リボヌクレアーゼを失活させることにより非分解のＲＮＡを回収するＡｃｉｄＧｕａｎｉｄｉｕｍＰｈｅｎｏｌＣｈｌｏｒｏｆｏｒｍ（ＡＧＰＣ）法（非特許文献１）やホットフェノール法（非特許文献２）が知られている。しかし、いずれの方法も、核酸増幅反応などの酵素反応を阻害する有機溶媒や高濃度の変性剤を含むため、危険性が高いだけでなく、それらを除去するための多段階に渡る工程と長い処理時間が必要で、コストや簡便さの点で問題がある。

一方、ＲＮＡの調製を簡便化する目的で、有機溶媒を使用せず、タンパク質変性剤として強カオトロピック物質と界面活性剤を用いてＲＮＡを抽出し、抽出液を直接酵素反応に供する手法も開発されている。例えば、変性剤としてグアニジンチオシアネートとサルコシルを用いて生物試料を溶解し、ＲＮＡを内在性リボヌクレアーゼによる分解から保護しながら抽出する方法（特許文献１）が知られている。この抽出液は直接酵素反応に供することができる。この手法によれば、抽出液を酵素反応に供する前に、変性剤を除去する工程を必要とせず、従来法より簡便にＲＮＡを抽出できる。しかし、グアニジンチオシアネートなどの強カオトロピック物質やサルコシルはタンパク質の強い変性剤であり、酵素反応系におけるこれら強い変性剤の存在は、効率的な酵素反応という観点において好ましくない。

これに対し、その後の酵素反応を阻害しない核酸抽出法としてはコール酸、グリコール酸を使用した手法（特許文献２）が知られている。本手法によれば、生物試料より抽出された核酸は精製工程や希釈工程を必要とせず、直接核酸増幅法などの酵素反応に供することができる。しかし、本手法は内在性リボヌクレアーゼによるＲＮＡの分解を防ぐことができず、非分解のＲＮＡの抽出は不可能であった。

特許第４８３６７９５号公報国際公開第２００７／１１６４５０号

Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ＆Ｓａｃｃｈｉ（１９８７）ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１６２：１５６−１５９．水野貴之（２００３）バイオ実験イラストレイテッド（７）

本発明は、従来法より簡便に、酵素反応に供試可能なＲＮＡを調製する手段を提供することを目的とする。

本発明は、アルカリ金属塩及び界面活性剤を含むことを特徴とする、生物試料中のＲＮＡを抽出するための試薬に関する。

アルカリ金属塩が、アルカリ金属ハロゲン化物であることが好ましい。

アルカリ金属塩が、塩化リチウムであることが好ましい。

界面活性剤が、グリコール酸類を含むことが好ましい。

界面活性剤が、さらに、デオキシコール酸類を含むことが好ましい。

また、本発明は、前記試薬を有することを特徴とする、ＲＮＡ抽出キットに関する。

また、本発明は、前記試薬、又はＲＮＡ抽出キットを用いることを特徴とする、生物試料中のＲＮＡを抽出する方法に関する。

本発明によれば、従来法より簡便に、酵素・化学反応などに供試可能なＲＮＡを非分解状態で調製できる。

細胞を検体としてＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲに供した結果を示す図である。

以下、本発明を詳細に記載する。
本発明において、生物試料から非分解のＲＮＡを調製するために、アルカリ金属塩と界面活性剤を使用し、検体に内在するリボヌクレアーゼによるＲＮＡの分解を防止しながら、その後の酵素反応に供試可能なＲＮＡを調製する。

本発明において、生物試料とは動物又は植物の細胞、組織、全血、血清、リンパ液、組織液、尿、精液、膣液、羊水、涙、唾液、汗などの体液、エキソソームなどの細胞に由来する小胞、糞便、痰、細菌、ウイルスなどが例示されるが、核酸を含有するものであればこれに限定されない。

本発明において、ＲＮＡとはｍｅｓｓｅｎｇｅｒＲＮＡやｔｒａｎｓｆｅｒＲＮＡ、ｒｉｂｏｓｏｍａｌＲＮＡ、ｓｍａｌｌｎｕｃｌｅａｒＲＮＡ、ｓｍａｌｌｎｕｃｌｅｏｌａｒＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡなどのｎｏｎ−ｔｒａｎｓｌａｔａｂｌｅＲＮＡなどが例示されるが、リボヌクレオチドの重合体を含有するものであればこれに限定されない。

ＲＮＡの一般的な調製法である固相担体へのＲＮＡの吸着を利用した手法や、有機溶媒や水溶性高分子、界面活性剤の添加によるＲＮＡの不溶化を利用した手法においては、処理液を精製するための煩雑な操作を必要とするだけでなく、ＲＮＡの分子量によって回収効率に差があり、目的とするＲＮＡが得られない場合がある。一方、本発明におけるＲＮＡ調製法は、ＲＮＡ抽出液をその後の解析に直接供試可能であり、処理液は検体に含まれていた全ての分子量のＲＮＡを損失無く含むという利点を有する。

本発明において、ＲＮＡを抽出するためのＲＮＡ抽出試薬は、ＲＮＡ保護剤としてアルカリ金属塩を含む。

本発明におけるアルカリ金属塩とは、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、ルビジウム塩、セシウム塩が例示される。好ましくは塩化リチウム、臭化リチウム、ヨウ化リチウム、酢酸リチウム、水酸化リチウム、フッ化ナトリウム、塩化ナトリウム、臭化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、酢酸ナトリウム、ピロリン酸ナトリウム、チオシアン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、二亜硫酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、酒石酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、フッ化カリウム、塩化カリウム、臭化カリウム、ヨウ化カリウム、酢酸カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸カリウム、フッ化ルビジウム、塩化ルビジウム、臭化ルビジウム、ヨウ化ルビジウム、酢酸ルビジウム、塩化セシウム、臭化セシウム、ヨウ化セシウム、酢酸セシウムが例示されるがこれに限定されない。より好ましくは、アルカリ金属ハロゲン化物が例示される。さらに好ましくは、ハロゲン化物のうち、カオトロピック効果が小さい塩化リチウムが例示される。これらのアルカリ金属塩は、単独で使用しても、組み合わせて使用しても良い。

アルカリ金属塩はＲＮＡ保護効果を有する一方、核酸関連酵素の補因子とならず、他の、補因子となりうる多価陽イオンを生ずる金属塩より、酵素活性に与える影響が小さいという利点を有する。

ＲＮＡ抽出試薬に含まれるアルカリ金属塩の濃度は、当業者によれば容易に最適値を決定することができるが、一例として０．２Ｍ以上、飽和濃度以下が好ましく、０．３Ｍ以上、５．０Ｍ以下がより好ましく、０．３Ｍ以上、２．５Ｍ以下がさらに好ましい。アルカリ金属塩の濃度が低すぎると、ＲＮＡを内在性リボヌクレアーゼによる分解から保護することができず、濃度が高すぎると、ＲＮＡを保護することはできるが、その後の酵素反応を阻害する傾向がある。

本発明において、ＲＮＡ抽出試薬は、検体溶解剤として界面活性剤を含む。本発明における界面活性剤とはイオン性・非イオン性・両イオン性界面活性剤が例示される。好ましくはＴｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０などのＴｗｅｅｎ類、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４、ＴｒｉｔｏｎＸＬ−８０ＮなどのＴｒｉｔｏｎ類、Ｎｏｎｉｄｅｔ類、ＮＰ−４０などの非イオン性界面活性剤、コール酸類、デオキシコール酸類、グリコール酸類などの陰イオン性界面活性剤が例示され、より好ましくはＴｗｅｅｎ２０、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、デオキシコール酸、グリコール酸が例示されるが、酵素反応を阻害しない界面活性剤であればこれに限定されない。これらの界面活性剤は単独で使用しても、組み合わせて使用しても良い。

ＲＮＡ抽出試薬に含まれる界面活性剤の濃度は、当業者によれば容易に最適値を決定することができるが、コール酸類、デオキシコール酸類、グリコール酸類を用いる場合、その濃度は１ｍＭ以上であることが好ましい。界面活性剤の濃度が低すぎると、生物試料を溶解させることができない傾向がある。

本発明において、ＲＮＡ抽出試薬は緩衝剤を含んでいても良い。本発明における緩衝剤としては、リン酸緩衝液やグッド緩衝液等の緩衝剤が好適に用いられる。これらの中でも、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｓ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳＯ、ＣＡＰＳ等のグッド緩衝液が好ましく、ＴＡＰＳが特に好ましい。これらの緩衝剤は単独で使用しても、組み合わせて使用しても良い。

本発明において、ＲＮＡ抽出試薬は、生物試料に由来する夾雑物による酵素反応阻害を低減させる効果を有するアルブミンなどのタンパク質成分、ポリアミン、シクロデキストリン、トレハロース、ＰＶＰ（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）、ポリエチレングリコールなどの水溶性高分子を含んでいても良い。

本発明において、ＲＮＡ抽出試薬は、氷点下での凍結を防止するためのグリセロール、ベタイン、スクロースなどの不凍剤を含んでいても良い。

本発明において、ＲＮＡ抽出試薬は、ヌクレアーゼ活性の失活をさらに確実にするためのキレート剤やヌクレアーゼインヒビター、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）等の還元剤、その後の酵素反応のためのＤＭＳＯやホルムアミドといった有機溶媒を含んでいても良い。

生物試料とＲＮＡ抽出試薬の混合比は、９：１〜１：９９９であることが好ましく、４：１〜１：４９９であることがより好ましく、１：１〜１：９９であることがさらに好ましい。

本発明において、生物試料とＲＮＡ抽出試薬を混合した後、ＲＮＡ抽出処理時に、生物試料を物理的に破砕しても良く、例えば、凍結融解による破砕や、ホモジナイザーによる物理的破砕法などと組み合わせることが可能である。また、本発明によれば、生物試料とＲＮＡ抽出試薬を混合する以前に、破砕操作せずともＲＮＡを抽出することが可能である。

生物試料とＲＮＡ抽出試薬を混合した後、生物試料からＲＮＡを抽出するために、熱処理を実施しても良い。熱処理温度は好ましくは０℃以上、１００℃以下であり、より好ましくは３０℃以上、９０℃以下であり、さらに好ましくは５０℃以上、８０℃以下である。温度が低すぎると抽出効率が低くなる傾向があり、高すぎるとＲＮＡが分解する傾向がある。熱処理時間は好ましくは３０分以下であり、より好ましくは１５分以下である。処理時間が短すぎると抽出効率が低くなる傾向があり、長すぎるとＲＮＡが分解する傾向がある。

本発明において、ＲＮＡ抽出液に対して、さらなる精製工程や希釈工程などを必要とせず、ＲＮＡ抽出液を酵素反応溶液に直接基質として混合し、核酸増幅反応などの酵素反応を開始することが可能である。反応させる酵素として、例えば、デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼなどのヌクレアーゼ、プロテイナーゼ、ペプチダーゼなどのプロテアーゼ、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、耐熱性ポリメラーゼ、鎖置換ポリメラーゼ、ターミナルトランスフェラーゼなどのポリメラーゼ、リガーゼ、リコンビナーゼ、リゾチーム、セルラーゼなどが挙げられる。ＲＮＡ抽出液と酵素反応溶液との混合比は、１：９９９〜９９９：１であることが好ましく、１：９９〜９９：１であることがより好ましく、１：４９〜４９：１であることがさらに好ましい。

本発明において、ＲＮＡ抽出液は、エチジウムブロマイド、ＳＹＢＲ（Ｒ）Ｇｒｅｅｎ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（Ｒ）などの核酸蛍光標識試薬や蛍光標識プローブと混合し、含有するＲＮＡを検出することができる。また、ＲＮＡ抽出液を蛍光標識試薬存在下で核酸増幅反応に供し、リアルタイムで増幅反応をモニターすることも可能である。また、ＲＮＡ抽出液をシーケンス反応に供することも可能である。

本発明において、核酸増幅反応とは、ＰＣＲ法に代表される核酸配列を増幅させる手法であり、例えば、ＰＣＲ法以外にＬＣＲ（ＬｉｇａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（ＳｔｒａｎｄＤｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＲＣＡ（ＲｏｌｌｉｎｇＣｉｒｃｌｅＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＣＰＴ（ＣｙｃｌｉｎｇＰｒｏｂｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）法、Ｑ−ＢｅｔａＲｅｐｌｉｃａｓｅＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ法、ＩＣＡＮ（ＩｓｏｔｈｅｒｍａｌａｎｄＣｈｉｍｅｒｉｃｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ）法、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ＭｅｄｉａｔｅｄＩｓｏｔｈｅｒｍａｌＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｏｎｏｆＤＮＡ）法、ＮＡＳＢＡ（ＮｕｃｌｅｉｃａｃｉｄＳｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ）法、及びＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｍｅｄｉａｔｅｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ）法等の公知の方法が例示されるが、これらに限定されるものではない。

本発明において、ＲＮＡ抽出液に含まれる目的の核酸に一部相補的な核酸を有する分子、抗体、或いは一本鎖核酸結合タンパク質などの、特異的結合能を有する分子と、目的の核酸を混合し、特異的に結合させることが可能である。つまり、ＲＮＡ抽出液を用いて、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング、リアルタイムＰＣＲ、標識核酸プローブなどによる特異的核酸の標識、検出、精製、分離などが可能である。

本発明において、ＲＮＡ抽出液をイオン交換カラム・ゲル濾過カラムなどの各種クロマトグラフィーや、遠心、濾過、透析、固相担体への吸着処理に供し、夾雑物を分離し、ＲＮＡ抽出液に含まれるＲＮＡを精製することも可能である。またこれら手段を適宜組み合わせ、ＲＮＡ精製キットとして利用することも可能である。

本発明のキットは、前記ＲＮＡ抽出試薬を有する。その他に、例えば検体洗浄液、デオキシリボヌクレアーゼ、プロテアーゼ、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ及びその基質、オリゴヌクレオチドを有していても良い。

本発明の試薬やキットを、核酸調製装置、核酸増幅装置、核酸自動解析装置などに組み込むことも可能である。

以下、実施例により本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

［実施例１］
マウス血液から、以下の手順でＲＮＡを抽出し、抽出したＲＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲを行い、ＲＮＡに由来する増幅断片をアガロースゲル電気泳動により確認した。

（ＲＮＡ抽出試薬の調製）
以下の組成のＲＮＡ抽出試薬を調製した。
塩化リチウム、７５ｍＭＴＡＰＳ（ｐＨ８．０）、２．２５ｍＭＣａＣｌ_２、１５ｍＭＭｇＣｌ_２、１７５ｍＭグリコール酸、５ｍＭデオキシコール酸、５０ｍＭＥＤＴＡ、０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００

塩化リチウムは０Ｍ、０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．５Ｍ、１．０Ｍ、２．０Ｍ、３．０Ｍ、４．０Ｍ、５．０Ｍ、６．０Ｍ、７．０Ｍの濃度にてＲＮＡ抽出試薬を調製した。

（ＲＮＡの抽出）
マウスより血液を回収した。抗凝固剤としてはヘパリンを用いた。このマウス血液２μｌにＲＮＡ抽出試薬を１８μｌ添加し、７５℃にて５分間インキュベートした。インキュベート後の溶液を室温まで冷却した後、２μｌのＤＮａｓｅＩ（１０Ｕｎｉｔｓに相当する量）を添加し、４２℃／５分間→７５℃／１０分間インキュベートした。

（ＲＴ−ＰＣＲ）
上記にて調製したＲＮＡ試料を室温まで冷却し、それを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲを行い、検体に由来する核酸の増幅断片を得た。ＲＴ−ＰＣＲは、Ｈ３Ｆ３ＡｍＲＮＡを標的とし、フォワードプライマーＦ１（５’−ＧＧＣＣＴＣＡＣＴＴＧＣＣＴＣＣＴＧＣＡＡ−３’；配列番号１）、リバースプライマーＲ１（５’−ＧＣＡＡＧＡＧＴＧＣＧＣＣＣＴＣＴＡＣＴＧ−３’；配列番号２）をプライマーセットとして用いた。ＲＴ−ＰＣＲはＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＯｎｅＳｔｅｐＲＴ−ＰＣＲＫｉｔＶｅｒ．２（タカラバイオ社製）を用い、上記で調製したＲＮＡ試料を反応溶液に対して２％容量添加し行った。反応は、５０℃／３０分間の逆転写反応、９４℃／１分間の逆転写酵素の失活処理の後、９４℃／１５秒間→６２℃／１５秒間→７２℃／１５秒間のＰＣＲサイクルを３０サイクル行った。また、ネガティブコントロールとして増幅断片がＤＮＡに由来するものではないことを確認するために、逆転写反応をせずに、９４℃／１５秒間→６０℃／１５秒間→７２℃／１５秒間のＰＣＲサイクルを３０サイクル行った。次に、ＲＴ−ＰＣＲ産物を常法に基づきアガロースゲル電気泳動に供し、増幅断片を可視化した。

アガロースゲル電気泳動により可視化した増幅断片の結果を表１に示す。塩化リチウム濃度が０．５〜５．０ＭであるＲＮＡ抽出試薬を用いた場合、ＲＴ−ＰＣＲの場合のみ増幅断片が確認され、ＲＮＡが適切に抽出されたことが分かった。

［実施例２］
マウス血液から、以下の手順でＲＮＡを抽出し、抽出したＲＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲを行い、ＲＮＡに由来する増幅断片をアガロースゲル電気泳動により確認した。

（ＲＮＡ抽出試薬の調製）
以下の組成のアルカリ金属塩を含むＲＮＡ抽出試薬を調製した。
０．７Ｍアルカリ金属塩、７５ｍＭＴＡＰＳ（ｐＨ８．０）、２．２５ｍＭＣａＣｌ_２、１５ｍＭＭｇＣｌ_２、１７５ｍＭグリコール酸、５ｍＭデオキシコール酸、５０ｍＭＥＤＴＡ、０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００

アルカリ金属塩としては塩化リチウム、臭化リチウム、ヨウ化リチウム、塩化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、塩化カリウム、ヨウ化カリウム、塩化ルビジウム、塩化セシウム、酢酸リチウム、リン酸二水素ナトリウム、酒石酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、酢酸カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸カリウムを用いた。

また、アルカリ金属塩として塩化リチウムを用い、界面活性剤としてデオキシコール酸を省いたＲＮＡ抽出試薬を調製した。

（ＲＮＡの抽出）
調製したＲＮＡ抽出試薬を用いて、実施例１と同様の手法により、マウスより血液を回収し、ＲＮＡを抽出した。

（ＲＴ−ＰＣＲ）
実施例１と同様の手法により、上記にて抽出したＲＮＡ試料を鋳型としてＲＴ−ＰＣＲを行い、各検体に由来する核酸の増幅断片を得た。

アガロースゲル電気泳動により可視化した、増幅の有無の検討結果を表２に示す。アルカリ金属塩を含むＲＮＡ抽出試薬を用いた場合、ＲＴ−ＰＣＲの場合のみ増幅断片が確認され、ＲＮＡが適切に抽出されたことが分かった。また、アルカリ金属塩の中では、アルカリ金属ハロゲン化物を含むＲＮＡ抽出試薬を用いた場合、ＲＴ−ＰＣＲにおける増幅効率が高かった。また、これらＲＮＡ抽出試薬はＤＮａｓｅＩ処理やＲＴ反応、ＰＣＲを阻害しないことが分かった。

［比較例１］
マウス血液から、以下の手順でＲＮＡを抽出し、抽出したＲＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲを行い、増幅断片をアガロースゲル電気泳動により確認した。

（ＲＮＡ抽出試薬の調製）
以下の組成の強カオトロピック物質もしくは多価金属塩もしくはアンモニウム塩を含むＲＮＡ抽出試薬を調製した。
０．７Ｍ強カオトロピック物質もしくは多価金属塩もしくはアンモニウム塩、７５ｍＭＴＡＰＳ（ｐＨ８．０）、２．２５ｍＭＣａＣｌ_２、１５ｍＭＭｇＣｌ_２、１７５ｍＭグリコール酸、５ｍＭデオキシコール酸、５０ｍＭＥＤＴＡ、０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００

強カオトロピック物質としてはグアニジンチオシアネート、塩酸グアニジン、尿素を用いた。多価金属塩としては塩化マグネシウム、塩化カルシウム、塩化ニッケル、塩化マンガンを用いた。アンモニウム塩としてはリン酸水素二アンモニウムを用いた。また、ＲＮＡ保護剤としての塩を含まず、界面活性剤のみを含むＲＮＡ抽出試薬を調製した。

（ＲＴ−ＰＣＲ）
実施例１と同様の手法により、上記にて抽出したＲＮＡ試料を鋳型としてＲＴ−ＰＣＲを行った。

アガロースゲル電気泳動により可視化した増幅断片の結果を表２に示す。多価金属塩を用いた場合、増幅断片はＲＴ−ＰＣＲ、ＰＣＲにおいても確認されなかった。これより、多価金属イオンがＲＮＡ保護剤として機能しなかった、もしくは酵素反応を阻害したことが分かった。つまり、本系において多価陽イオンは、ＲＮＡ抽出試薬の添加剤として好ましくない。強カオトロピック物質、アンモニウム塩を用いた場合、増幅断片はＲＴ−ＰＣＲ、ＰＣＲにおいて確認された。これより、強カオトロピック物質やアンモニウム塩によりＤＮａｓｅＩ処理が阻害されたことが分かった。つまり、本系において強カオトロピック物質及びアンモニウム塩はＲＮＡ抽出試薬の添加剤として好ましくない。ＲＮＡ保護剤としての塩を含まない場合、ＲＮＡが分解され、増幅断片はＲＴ−ＰＣＲ、ＰＣＲにおいても確認されなかった。

［比較例２］
マウス血液から、以下の手順でＲＮＡを抽出し、抽出したＲＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲを行い、増幅断片をアガロースゲル電気泳動により確認した。

（ＲＮＡ抽出試薬の調製）
以下の組成の界面活性剤を含まないＲＮＡ抽出試薬を調製した。
０．７Ｍ塩化リチウム、７５ｍＭＴＡＰＳ（ｐＨ８．０）、２．２５ｍＭＣａＣｌ_２、１５ｍＭＭｇＣｌ_２、５０ｍＭＥＤＴＡ

（ＲＮＡの抽出）
調製したＲＮＡ抽出試薬を用いて、実施例１と同様の手法により、マウスより血液を回収し、検体からＲＮＡを抽出した。

アガロースゲル電気泳動により可視化した増幅断片の結果を表２に示す。界面活性剤を含まないＲＮＡ抽出試薬を用いた場合、増幅断片はＲＴ−ＰＣＲ、ＰＣＲにおいて確認された。これは、界面活性剤を含まないことにより、検体が完全に溶解せず、ＤＮａｓｅＩによりＤＮＡを除去しきれなかったためである。

［実施例３］培養細胞からのＲＮＡ抽出
ヒト培養細胞であるＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びＪｕｒｋａｔ細胞から、以下の手順でＲＮＡを抽出し、その存在をアガロースゲル電気泳動により確認した。

（ＲＮＡ抽出試薬の調製）
以下の組成の塩化リチウムを含むＲＮＡ抽出試薬を調製した。
０．７Ｍ塩化リチウム、７５ｍＭＴＡＰＳ（ｐＨ８．０）、２．２５ｍＭＣａＣｌ_２、１５ｍＭＭｇＣｌ_２、１７５ｍＭグリコール酸、５ｍＭデオキシコール酸、５０ｍＭＥＤＴＡ、０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００

（ＲＮＡの抽出）
１０^３〜１０^５個分の培養細胞を遠心分離し、ペレットとして回収した。この細胞ペレットにＲＮＡ抽出試薬を１８μｌ添加し、７５℃にて５分間インキュベートした。インキュベート後の溶液を室温まで冷却した後、２μｌのＤＮａｓｅＩ（１０Ｕｎｉｔｓ分）を添加し、４２℃／５分間→７５℃／１０分間インキュベートした。

（ＲＴ−ＰＣＲ）
上記にて抽出したＲＮＡ試料を室温まで冷却し、それぞれを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲを行い、細胞に由来する核酸の増幅断片を得た。ＲＴ−ＰＣＲは、ＡＣＴＢｍＲＮＡを標的とし、フォワードプライマーＦ２（５’−ＡＧＡＴＧＧＣＣＡＣＧＧＣＴＧＣＴ−３’；配列番号３）、リバースプライマーＲ２（５’−ＡＡＣＣＧＣＴＣＡＴＴＧＣＣＡＡＴＧＧ−３’；配列番号４）をプライマーセットとして用いた。ＲＴ−ＰＣＲはＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＯｎｅＳｔｅｐＲＴ−ＰＣＲＫｉｔＶｅｒ．２（タカラバイオ社製）を用い、上記で調製したＲＮＡ試料を反応溶液に対して２％容量添加し行った。反応は、５０℃／３０分間の逆転写反応、９４℃／１分間の逆転写酵素の失活処理の後、９４℃／１５秒間→６０℃／１５秒間→７２℃／１５秒間のＰＣＲサイクルを３０サイクル行った。また、ネガティブコントロールとして、逆転写反応をせずに、９４℃／１５秒間→６０℃／１５秒間→７２℃／１５秒間のＰＣＲサイクルを３０サイクル行った。次に、ＲＴ−ＰＣＲ産物を常法に基づきアガロースゲル電気泳動に供し、増幅断片を可視化した。

アガロースゲル電気泳動により可視化した増幅断片を図１に示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞を検体とした場合、共に特異的増幅断片が確認され、ＲＮＡが適切に抽出されたことが分かった。

Claims

アルカリ金属塩、並びにグリコール酸類及びデオキシコール酸類を含む界面活性剤を含み、アルカリ金属塩の濃度が０．３〜５．０Ｍである
ことを特徴とする、生物試料中のＲＮＡを抽出するための試薬。
アルカリ金属塩が、アルカリ金属ハロゲン化物である、請求項１に記載の試薬。
アルカリ金属塩が、塩化リチウムである、請求項１又は２に記載の試薬。
請求項１〜３のいずれかに記載の試薬を有することを特徴とする、ＲＮＡ抽出キット。
請求項１〜３のいずれかに記載の試薬、又は請求項４に記載のＲＮＡ抽出キットを用いることを特徴とする、生物試料中のＲＮＡを抽出する方法。
下記工程（ａ）〜（ｂ）：
（ａ）請求項１〜３のいずれかに記載の試薬を用いて、生物試料からＲＮＡを抽出する工程、および
（ｂ）工程（ａ）で得られたＲＮＡ抽出液を、さらなる精製工程または希釈工程を行うことなく、酵素反応溶液に直接基質として混合し、酵素反応を開始する工程
を含む、生物試料中のＲＮＡを抽出する方法。