JP6128371B2 - 核酸抽出液の製造方法 - Google Patents
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Description
項1. 下記工程を含む核酸抽出液の製造方法:
リトコール酸、デオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、コール酸、グリココール酸、タウロコール酸及びそれらの塩よりなる群から選択される少なくとも1種のコール酸類、グリコール酸及びその塩よりなる群から選択される少なくとも1種のグリコール酸類、並びに二価陽イオンのキレート剤を、被検試料に接触させて核酸を抽出処理する第1工程、並びに
第1工程で得られた抽出液にアルブミンを添加する第2工程。
項2. 更に、第1工程において、被検試料にタンパク質分解酵素を接触させる、項1に記載の核酸抽出液の製造方法。
項3. 更に、第1工程において、被検試料に界面活性剤を接触させる、項1又は2に記載の核酸抽出液の製造方法。
項4. 更に、第2工程において、第1工程で使用した二価陽イオンのキレート剤により捕捉される二価の金属塩を添加する、項1乃至3のいずれかに記載の核酸抽出液の製造方法。
項5. 更に、第2工程において、緩衝剤を添加する、項1乃至4のいずれかに記載の核酸抽出液の製造方法。
項6. 被検試料が全血である、項1乃至5に記載の核酸抽出液の製造方法。
項7. リトコール酸、デオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、コール酸、グリココール酸、タウロコール酸及びそれらの塩よりなる群から選択される少なくとも1種のコール酸類、グリコール酸及びその塩よりなる群から選択される少なくとも1種のグリコール酸類、二価陽イオンのキレート剤、並びにアルブミンを含む、核酸抽出液製造用のキット。
項8. リトコール酸、デオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、コール酸、グリココール酸、タウロコール酸及びそれらの塩よりなる群から選択される少なくとも1種のコール酸類、グリコール酸及びその塩よりなる群から選択される少なくとも1種のグリコール酸類、並びに二価陽イオンのキレート剤を含む第1試薬と、
アルブミンを含む第2試薬と、
を含む、項7に記載の核酸抽出液製造用のキット。
項9. リトコール酸、デオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、コール酸、グリココール酸、タウロコール酸及びそれらの塩よりなる群から選択される少なくとも1種のコール酸類、グリコール酸及びその塩よりなる群から選択される少なくとも1種のグリコール酸類、二価陽イオンのキレート剤、並びに界面活性剤を含む第1-1試薬と、
タンパク質分解酵素を含む第1-2試薬と、
アルブミン、上記第1-1試薬に含まれる二価陽イオンのキレート剤により捕捉される二価の金属塩、及び緩衝剤を含む第2試薬と、
を含む、項7又は8に記載の核酸抽出液製造用のキット。
本発明の核酸抽出液の製造方法は、被検試料に、コール酸類、グリコール酸類、及び二価陽イオンのキレート剤を接触させて核酸を抽出処理する第1工程、及び第1工程で得られた抽出液にアルブミンを添加する第2工程を含むことを特徴とする。以下、本発明の核酸抽出液の製造方法について詳述する。
更に、本発明は、上記核酸抽出液の製造方法に使用される核酸抽出液の製造用キットをも提供する。
EDTA処理した全血からDNA抽出液を調製し、得られたDNA抽出液に含まれるβグロビン遺伝子の検出を行った。
<試薬の調製>
第1-1試薬として、10mMのデオキシコール酸ナトリウム、0.35Mのグリコール酸、100mMのEDTA・2Na、0.5g/LのTween 20、及び0.5g/LのTriton X−100を含む水溶液を調製した。
第1-2試薬として、0.1mAUのプロテイナーゼK(ロッシュ社製)を含む水溶液を調製した。
第2試薬として、1.0g/Lの牛血清アルブミン(BSA)、25mMのMgCl2、0.5mMのTASP緩衝剤を含む水溶液(pH9.5)を調製した。
第1-1試薬10μlと第1-2試薬10μlを混合し、20μlの混合液(第1試薬)を得た。次いで、EDTAで処理した全血1μlを0.2mlのマイクロチューブに入れ、更に上記で得られた第1試薬20μlを添加して撹拌した後に、72℃で6分間インキュベートし、続いて94℃で3分間インキュベートした。
次いで、上記処理を行ったマイクロチューブに、第2試薬10μlを添加し、撹拌することにより、核酸抽出液を調製した。
また、比較のために、第1-1試薬と第1-2試薬の代わりに同量の滅菌水、第2試薬の代わりに同量の滅菌水、又は第1-1試薬、第1-2試薬及び第2試薬の代わりに同量の滅菌水を使用して、上記と同様に処理して核酸抽出液を調製した。
上記で調製した核酸抽出液を室温まで冷却し、PCRによりβグロビン遺伝子を増幅させた。PCR反応は、フォワードプライマーGH20(5'-GAAGAGCCAAGGACAGGTAC-3';配列番号1)、リバースプライマーGH21(5'-GGAAAATAGACCAATAGGCAG-3';配列番号2)をプライマーセットとして用いた。PCR反応液は、×10 Reaction Buffer(Ex Taq Buffer(+Mg2+)、タカラバイオ社製)を5μL、2.5mMのdNTPsを5μL、10pmol/μLのプライマー各1μL、5U/μLのEx Taq(タカラバイオ社製)を0.5μL、上記で調製した核酸試料を5μLに、滅菌水を加えて、全量50μLとして調製した。反応は、94℃で60秒での変性の後、94℃で30秒の変性、55℃で30秒のアニーリング、72℃で60秒の伸長を1サイクルとし、35サイクル行った後、72℃で240秒の最終伸長反応で、反応を終了させた。次に、PCR反応で得られた各増幅産物を常法に基づき電気泳動に供し、核酸断片を可視化した。
得られた結果を図1に示す。上記第1試薬(第1-1試薬と第1-2試薬の混合液)と上記第2試薬を使用した条件では、βグロビン遺伝子を明確に検出できた。これに対して、上記第1試薬及び第2試薬の一方又は双方を滅菌水に置き換えた場合には、βグロビン遺伝子を検出することはできなかった。具体的には、上記第1試薬のみを使用した場合には、夾雑物が多く、極めて薄いバンドしか検出されなかった。また、上記第2試薬のみを使用した場合には、即ち、滅菌水での熱処理により核酸を抽出して第2試薬を添加しても、極めて薄いバンドしか検出されなかった。
この結果から、デオキシコール酸、グリコール酸、及びEDTAを用いて、核酸抽出を行うだけでは、核酸抽出液に含まれる夾雑物によってPCRによるDNA増幅反応が阻害されるが、更に核酸の抽出処理後にアルブミンを添加することにより、DNA増幅反応の阻害を抑制できることが確認された。即ち、本実験結果から、被検試料に、デオキシコール酸、グリコール酸、及び二価陽イオンのキレート剤を接触させて核酸を抽出した後に、更にアルブミンを添加することにより、全血のような夾雑物の多い被検試料であっても、核酸増幅反応にそのまま適用可能な核酸抽出液を調製できることが明らかとなった。
Claims (7)
- 被検試料が全血であり、下記工程を含む核酸抽出液の製造方法:
リトコール酸、デオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、コール酸、グリココール酸、タウロコール酸及びそれらの塩よりなる群から選択される少なくとも1種のコール酸類、グリコール酸及びその塩よりなる群から選択される少なくとも1種のグリコール酸類、二価陽イオンのキレート剤、並びにタンパク質分解酵素を、被検試料に接触させて核酸を抽出処理する第1工程、並びに
第1工程で得られた抽出液にアルブミンを添加する第2工程。 - 更に、第1工程において、被検試料に界面活性剤を接触させる、請求項1に記載の核酸抽出液の製造方法。
- 更に、第2工程において、第1工程で使用した二価陽イオンのキレート剤により捕捉される二価の金属塩を添加する、請求項1に記載の核酸抽出液の製造方法。
- 更に、第2工程において、緩衝剤を添加する、請求項1に記載の核酸抽出液の製造方法。
- 全血から核酸抽出液を製造するためのキットであって、リトコール酸、デオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、コール酸、グリココール酸、タウロコール酸及びそれらの塩よりなる群から選択される少なくとも1種のコール酸類、グリコール酸及びその塩よりなる群から選択される少なくとも1種のグリコール酸類、二価陽イオンのキレート剤、タンパク質分解酵素、並びにアルブミンを含む、核酸抽出液製造用のキット。
- リトコール酸、デオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、コール酸、グリココール酸、タウロコール酸及びそれらの塩よりなる群から選択される少なくとも1種のコール酸類、グリコール酸及びその塩よりなる群から選択される少なくとも1種のグリコール酸類、二価陽イオンのキレート剤、並びにタンパク質分解酵素を含む第1試薬と、
アルブミンを含む第2試薬と、
を含む、請求項5に記載の核酸抽出液製造用のキット。 - リトコール酸、デオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、コール酸、グリココール酸、タウロコール酸及びそれらの塩よりなる群から選択される少なくとも1種のコール酸類、グリコール酸及びその塩よりなる群から選択される少なくとも1種のグリコール酸類、二価陽イオンのキレート剤、並びに界面活性剤を含む第1−1試薬と、
タンパク質分解酵素を含む第1−2試薬と、
アルブミン、上記第1−1試薬に含まれる二価陽イオンのキレート剤により捕捉される二価の金属塩、及び緩衝剤を含む第2試薬と、
を含む、請求項5に記載の核酸抽出液製造用のキット。
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