CN106248758B - 一种dna探针与电极表面相互作用的分析方法 - Google Patents

一种dna探针与电极表面相互作用的分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于卟啉和核酸复合纳米结构的电致化学发光用于DNA探针与电极表面相互作用的分析方法。本发明通过序列设计，利用DNA碱基互补配对的特性，自组装形成特定的纳米结构，并在纳米结构的基础上，将锌卟啉通过G‑四链体的方式与DNA探针进行等摩尔的组装，利用锌卟啉能够发生电致化学发光的特性作为信号源，实现对不同DNA探针的信号强度的检测，并通过分析信号强度对DNA探针的设计进行进一步优化。本发明通过ECL的检测方式，能够直观地表征DNA探针界面与信号强度的关系，更加贴近实际检测体系，能够应用于DNA探针的设计和验证。

Description

一种DNA探针与电极表面相互作用的分析方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种DNA探针与电极表面相互作用的分析方法。
背景技术
在电化学DNA传感器的设计中，DNA探针的设计是关键。DNA在电极表面的固定方式直接决定DNA在电极表面的组装密度和探针DNA的空间姿态，也直接影响DNA传感器的灵敏度和使用寿命。具体的DNA探针对于信号强度的影响仍然不明确，通常通过最终的检测结果来验证探针设计是否可行，然而并不能确定信号强度不佳是否是由于DNA界面导致的(Mascini,et al.,DNA electrochemical biosensors.Fresenius'journal ofanalytical chemistry,2001.369(1):15-22.)。
在DNA探针设计中，一维的DNA探针，末端基团固定不牢靠，易脱落，一维探针在电极表面有一定倾角，在一锥形区域内摆动，不利于高密度的组装。二维探针较一维探针固定更加牢靠，姿态更加优良。三维立体DNA探针，有更好的稳定性和特异性，探针姿态良好，自由度大，易于目标分子的特异性结合(Pei,H.,et al.,A DNA Nanostructure-basedBiomolecular Probe Carrier Platform for Electrochemical Biosensing.AdvancedMaterials,2010.22(42):4754-4758.)。
电致化学发光分析兼有电化学分析和光学分析的特点，具有普通光学分析法难以比拟的分析性能。比如，电致化学发光无需激发光源，不存在类似于荧光分析法的发散光背景干扰的问题。此外，电致化学发光物质和共反应剂之间的特异性可以减少电致化学发光反应的副反应，以及无明显高浓度自猝灭的发生。
G-四链体结构是一种卟啉嵌入到一段富含GT的折叠单链DNA序列形成的超纳米结构，可以折叠包裹卟啉分子形成稳定的纳米结构，克服了卟啉分子水溶性不佳的问题(ZhaoC,Wu L,Ren J,et al.A label-free fluorescent turn-on enzymatic amplificationassay for DNA detection using ligand-responsive G-quadruplex formation[J].Chemical Communications,2011,47(19):5461-5463.)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种DNA探针与电极表面相互作用的分析方法，利用DNA纳米结构的空间组合，对DNA传感器中DNA探针与电极表面的相互作用进行分析，验证设计探针的可行性，有利于进一步优化构建核酸传感器。
实现本发明目的的技术解决方案为：
一种DNA探针与电极表面相互作用的分析方法，利用DNA探针与卟啉的相互作用结合信号分子，利用卟啉的光电特性，以电致化学发光作为检测手段，具体步骤如下：
步骤1，将待测DNA探针溶液滴加到电极表面，过夜后，去离子水去除未结合的DNA，然后将电极置于含有锌卟啉(ZnPPIX)的缓冲溶液中进行G-四链体的自组装，去离子水去除未反应的卟啉分子，氮气吹干；
步骤2，以步骤1所得的电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂电极为对电极，以0.1M四丁基高氯酸铵的(TBAP)的二氯甲烷溶液为电解液，采用循环伏安法检测ECL信号，调节电位为-2.5～-0.2V，扫描速度为100mV S-1，检测ECL的信号强度。
步骤1中，所述的缓冲溶液中，甲醇与HEPES缓冲液的体积比为1：4～9，HEPES缓冲液的pH为7.4，ZnPPIX的浓度为1～2mM。
优选地，步骤1中，所述的待测DNA探针为每条单链的四面体序列有三分之一的序列和其他三条链互补配对的四条DNA单链经变性、退火自组装成的底端为四面体结构，顶端延伸出G-四链体序列的三维DNA探针。
本发明构建了一种利用新的纳米结构分析DNA探针与电极表面相互作用的方法，通过ECL的检测方式，能够直观地表征DNA探针界面与信号强度的关系，更加贴近实际检测体系，此外，通过三维的探针设计可以达到比一维以及二维DNA传感器更大的检测信号。
附图说明
图1为实施例2中四面体组装过程中相应的电泳图。
图2为实施例2中表面修饰不同DNA探针的电极表面的形貌AFM图。
图3为实施例2中表面修饰不同DNA探针的电极的电化学阻抗谱图。
图4为实施例3中锌卟啉与DNA构建的纳米结构的SPR图。
图5为实施例3中G-四链体的紫外吸收图。
图6为实施例3中卟啉DNA纳米结构的圆二色光谱图。
图7为实施例4中表面修饰不同DNA探针的电极的ECL检测结果图。
具体实施方式
为进一步详细说明本发明的发明内容，在具体实施例中，通过构建三种不同的DNA探针，即一维、二维和三维DNA探针，采用本发明方法对三种不同探针与电极表面相互作用进行分析，一维、二维和三维探针的构建如下：
(1)根据所需要的空间结构，设计末端基团修饰，顶端含有G-四链体序列的DNA序列。
(2)一维探针为末端直接标记巯基的DNA单链(g-1)。
(3)二维探针前体为末端修饰氨基的DNA单链(g-2)，氨基与二硫化碳在硼酸缓冲液中震荡发生加成反应，最终形成末端含有双巯基的二维探针。
(4)三维探针是由四条DNA单链(Tetra-A，Tetra-B，Tetra-C，Tetra-D)，每条单链的四面体序列有三分之一的序列和其他三条链互补配对，在含有Mg2+的缓冲液中通过在PCR仪的温度控制，变性，退火形成四面体结构，四面体的底面三个顶点处均修饰有巯基。
各探针的序列如下表所示：
实施例1
1、DNA纳米结构的自组装，其步骤如下：
一维DNA探针即末端修饰巯基的DNA单链g-1，将2μL DNA单链g-1(100μM)溶于5μL的三氯乙基磷酸酯(TCEP)(30mM)，42μL的TM缓冲液(20mMTris，50mMMgCl2，pH8.0)，1μL 6-巯基-1己醇(MCH)(1mM)的混合溶液中。
二维DNA探针的构建：2μL末端氨基修饰的DNA单链g-2(100μM)，2μL的CS2(100μM)，40μL硼酸缓冲液(pH＝9)混合，震荡1h。然后在溶液中加入5μL的TCEP(30mM)作为巯基保护剂和1μLMCH(1mM)作为封闭剂，得到双巯基末端的DNA二维探针。
三维探针的构建：将Tetra-A、Tetra-B、Tetra-C、Tetra-D单链DNA各2μL(100μM)，和5μL的TCEP(30mM)，37μL的TM缓冲液混合(20MmM Tris，50mM MgCl2，pH8.0)，将混合溶液置于PCR仪内95℃变性2min，然后4℃退火30秒。然后加入1μL MCH(1mM)作为封闭剂，DNA单链自组装形成底端为四面体结构，顶端延伸出G-四链体序列的三维DNA探针。
2、金电极上的G-四链体结构形成
金电极的抛光预处理：金电极浸泡于H4BNa溶液中促使金电极的表面的巯基还原，用Al2O3打磨金电极去处经表面吸附的杂质，在去离子水和乙醇中超声，去除表面打磨后吸附的杂质，去离子水洗净电极表面，氮气吹干电极。
将三种探针3μL分别滴加到直径3mm的抛光预处理后的金电极表面过夜。用去离子水冲洗，高纯N2吹干。将ZnPPIX溶解于10mL甲醇和40mL HEPES(20mM HEPES，150mM NaCl，pH7.0)缓冲液的混合溶液中，ZnPPIX的浓度为2mM，将修饰有探针的电极浸泡在ZnPPIX溶液中30min，用0.01M的PBS溶液漂洗，高纯N2吹干。
实施例2
1、电泳检测
1％的琼脂糖凝胶以TBE缓冲液配置，加入10μL EB/100mL溶液混匀，微波炉加热5min，待温度降至50℃左右倒入模板冷却成型。所有样品均参考三维探针构建体系，根据组装过程分别依次加入Tetra-A，Tetra-B，Tetra-C，Tetra-D，Tetra-A+Tetra-B，Tetra-B+Tetra-C，Tetra-A+Tetra-B+Tetra-C，Tetra-A+Tetra-B+Tetra-C+Tetra-D，每条单链均为2μL，与5μL 30mM的TCEP混合，用TM缓冲液补齐为50μL的反应体系，将混合溶液置于PCR仪内95℃变性2min，然后4℃退火30秒。各样品通过溴酚蓝染色后，各取5μL滴加。电压设为80mV，时间为90min。泳道1为1000～10000bpDNA ledder，泳道2为Tetra-A，泳道3为Tetra-B，泳道4为Tetra-C，泳道5为Tetra-D，泳道6为Tetra-A+Tetra-B，泳道7为Tetra-B+Tetra-C，泳道8为Tetra-B+Tetra-C+Tetra-D，泳道9为Tetra-A+Tetra-B+Tetra-C，泳道10为Tetra-A+Tetra-B+Tetra-C+Tetra-D，电泳结果如图1所示。从图1中可以看出，Tetra-A，B，C，D四条单链分子量最小，Tetra-A+Tetra-B，Tetra-B+Tetra-C发生碱基配对组装分子量变大，Tetra-B+Tetra-C+Tetra-D和Tetra-A+Tetra-B+Tetra-C发生进一步组装，分子量继续变大，Tetra-A+Tetra-B+Tetra-C+Tetra-D进一步自组装，分子量最大，并且形成四面体相对复杂的空间结构而无法跑出胶孔，说明了DNA链之间的相互碱基配对组装，实现了四面体的组装过程。
2、AFM表面形貌观察
将实施例1制得的一维，二维和三维DNA探针3μL滴加到可拆卸金电极表面，将可拆卸电极头部置于原子力显微镜下观察，结果如图2所示，通过图2的AFM表征可以看出，A为一维DNA探针，B为二维DNA探针，C为三维DNA探针。通过AFM可以看出电极表面DNA探针密度由大到小为三维，二维，一维。一维探针呈现小的角锥状零星的分布在电极表面，二维探针呈现更高的圆锥，分布密度明显就更大，但是比较散乱，三维探针呈现拉长的三角锥状，连续密集的分布在金面表面。
3、电阻检测
将实施例1制得的修饰有三维，二维，一维探针的3mm金电极和裸的金电极在含0.1M KCl支持电解质的5mM铁氰化钾缓冲体系中检测电化学阻抗，结果如图3所示，A为裸电极，B为一维DNA探针修饰，C为二维DNA探针修饰，D为三维DNA探针修饰。通过图3可以看出，裸电极的阻抗在200Ω左右，一维DNA探针在3500Ω左右，二维DNA探针在4500Ω左右，三维DNA探针在5000Ω左右，阻抗由大到小为D，C，B，A。由于DNA的导电效果不佳，其在电极表面的组装会影响电极界面的电子传递效率，所以电极表面DNA含量由大到小依次为D，C，B，A。
综合以上表征，显示了电极表面的三维探针的密度最高，其次为二维，一维探针密度最低。
实施例3
1、SPR监测DNA和卟啉的自组装
用TM缓冲液清洗SPR金片表面，加入100μL三维DNA探针，反应半小时，用去离子水冲洗后，用HEPES缓冲液冲洗，加入100μL含有2mM ZnPPIX的HEPES缓冲液，反应半小时，用HEPES缓冲液冲洗，图4为相应步骤对应的SPR图，A点为加入DNA，B点为TM缓冲液冲洗，C点为HEPES缓冲液冲洗，D点为加入溶有2μM锌卟啉的HEPES溶液，E点为HEPES缓冲液冲洗。从图4可以看到随着DNA探针和卟啉的分次加入，基线不断抬升，并且经由缓冲液冲洗，其基线依然稳定，证明了DNA和卟啉的分布组装并非为非特异性吸附，而是由于自组装发生的，证明了DNA和卟啉的分步组装过程。
在含有2μM卟啉的HEPES缓冲溶液中加入等浓度的Tetra-A单链自组装形成G-四链体，超滤除去未反应的卟啉分子，将G-四链体溶液滴于微量紫外检测器，检测器紫外吸收。从图5紫外吸收图可以看到在波长260nm出有DNA的吸收峰，385nm出现有ZnPPIX的吸收峰，说明未被超滤出去的卟啉分子与单链DNA发生自组装形成G-四链体。
由图6圆二色光谱可知，圆二色谱图中Soret带出现CD谱。因此，我们对G-四链体组装后的DNA与ZnPPIX分别做了圆二色光谱表证。结果如图6所示，单独的ZnPPIX因其构象的自由性没有CD吸收峰；当ZnPPIX与DNA混合后，因ZnPPIX以特定的结构组装在G-四链体链的中心，显示特定构象，因此，在410nm处显示出ZnPPIX的Soret带特征吸收峰，表明ZnPPIX与DNA发生了相互反应产生了G-四链体的结构。
实施例4
不同探针结构的ECL检测
以实施例1中表面修饰有不同DNA探针的电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂电极为对电极，调节电位为-0.2-2.5V，扫描速度为100mV S-1，光电倍增管偏置电压为1000V；放大级数为3，在4mL以0.01M TBAP作为电介质的二氯甲烷溶液中，以电致化学发光检测系统检测ECL信号，结果如图7所示。由图7可以看到，a为一维DNA体系，b为二维DNA体系，c为三维DNA体系，ECL信号强度c＞b＞a。通过ECL信号差异成功的区分了不同DNA探针牟定方式，并且信号强度与其阻抗，AFM结果相一致。
综上所述，本发明对比传统的电极表面界面探究方法如阻抗、AFM等，基于G-四链体标记产生的ECL在信号强度上表现出了显著的差异，直观地反应了三种不同探针在电极表面的状态，综合了密度、空间姿态和探针结构对于目标信号的影响，能够系统地对DNA在电极界面组装的影响作出了分析评估。

Claims (1)

1.一种DNA探针与电极表面相互作用的分析方法，其特征在于，具体步骤如下：
步骤1，将待测DNA探针溶液滴加到电极表面，过夜后，去离子水去除未结合的DNA，然后将电极置于含有锌卟啉的缓冲溶液中进行G-四链体的自组装，去离子水去除未反应的锌卟啉分子，氮气吹干，所述的缓冲溶液中，甲醇与HEPES缓冲液的体积比为1：4～9，HEPES缓冲液的pH为7.4，锌卟啉的浓度为1～2mM，所述的待测DNA探针为每条单链的四面体序列有三分之一的序列和其他三条链互补配对的四条DNA单链经变性、退火自组装成的底端为四面体结构，顶端延伸出G-四链体序列的三维DNA探针，四条DNA单链分别为Tetra-A即GGGTTGGGCGGGATGGGTTACCTCAGTGCTTATTCAACCCTATTATTTTTTTTACATTCCTAAGTCTGAAACATTACAGCTTGCTACACGAGAAGAGCCGCCATAGTA，Tetra-B即SH-(CH2)6-TATCACCAGGCAGTTGACAGTGTAGCAAGCTGTAATAGATGCGAGGGTCCAATAC，Tetra-C即SH-(CH2)6-TCAACTGCCTGGTGATAAAACGACACTACGTGGGAATCTACTATGGCGGCTCTTC，Tetra-D即SH-(CH2)6-TTCAGACTTAGGAATGTGCTTCCCACGTAGTGTCGTTTGTATTGGACCCTCGCAT；
步骤2，以步骤1所得的电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂电极为对电极，以0.1M四丁基高氯酸铵的二氯甲烷溶液为电解液，采用循环伏安法检测ECL信号，调节电位为-2.5～-0.2V，扫描速度为100mV S-1，检测ECL的信号强度。
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