CN106801085A - 基于铂纳米颗粒催化h2o2分解产生气压变化即时检测端粒酶活性的方法 - Google Patents

基于铂纳米颗粒催化h2o2分解产生气压变化即时检测端粒酶活性的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106801085A
CN106801085A CN201710034420.5A CN201710034420A CN106801085A CN 106801085 A CN106801085 A CN 106801085A CN 201710034420 A CN201710034420 A CN 201710034420A CN 106801085 A CN106801085 A CN 106801085A
Authority
CN
China
Prior art keywords
telomerase
air pressure
nanoparticle
magnetic bead
primer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201710034420.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106801085B (zh
Inventor
金燕
王彦君
李保新
杨璐竹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shaanxi Normal University
Original Assignee
Shaanxi Normal University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shaanxi Normal University filed Critical Shaanxi Normal University
Priority to CN201710034420.5A priority Critical patent/CN106801085B/zh
Publication of CN106801085A publication Critical patent/CN106801085A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106801085B publication Critical patent/CN106801085B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/91—Transferases (2.)
    • G01N2333/912—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • G01N2333/91205—Phosphotransferases in general
    • G01N2333/91245—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • G01N2333/9125—Nucleotidyltransferases (2.7.7) with a definite EC number (2.7.7.-)
    • G01N2333/9128—RNA-directed DNA polymerases, e.g. RT (2.7.7.49)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种基于铂纳米颗粒催化H2O2分解产生气压变化即时检测端粒酶活性的方法，当存在活性端粒酶时，磁珠表面修饰的端粒酶引物会与端粒酶结合，使得端粒酶引物沿着其3’末端被延长，并形成一条带有TTAGGG重复序列的DNA单链，这条长的DNA单链能够与许多cDNA杂交，通过将cDNA修饰到铂纳米颗粒表面，就使得铂纳米颗粒固定到了磁珠的表面，然后利用铂纳米颗粒催化过氧化氢分解产生氧气，体系气压发生变化，再采用便携式气压计检测体系的气压值，即可实现对端粒酶活性的即时检测。本发明检测方法简单、快速、灵敏，可以检测不同种类肿瘤细胞中端粒酶活性的表达水平，在以端粒酶为靶点的癌症的治疗诊断方面具有重要的意义。

Description

基于铂纳米颗粒催化H2O2分解产生气压变化即时检测端粒酶 活性的方法
技术领域
本发明属于肿瘤活性检测技术领域，具体涉及一种基于气压变化简单、灵敏的即时检测癌细胞中端粒酶活性的方法。
背景技术
端粒是一种位于真核细胞染色体末端的特殊结构，由端粒DNA和端粒相关蛋白构成，其端粒DNA由非编码的重复序列组成，不同物种的重复序列不同，如人的端粒DNA由5′-TTAGGG-3′重复序列组成，长度为4～15kb不等。端粒的主要功能是保护染色体末端、防止染色体融合、重组和降解。在正常细胞中，随着细胞的不断增殖，端粒会逐渐的缩短，当端粒缩短到一定程度时，染色体不稳定，细胞就会衰老、死亡。端粒酶是由RNA模板、端粒相关蛋白组成的一种核糖核蛋白酶，具有逆转录酶的活性，可以以自身RNA为模板，通过逆转录合成端粒重复序列并连接到染色体末端，用来补偿细胞分裂时端粒长度的缩短，从而让肿瘤细胞获得无限增殖的能力。有研究表明85％～95％的肿瘤细胞中都可以检测到端粒酶活性呈阳性表达，而在正常细胞中检测不到端粒酶的活性。因此，端粒酶被认为是一种判断肿瘤细胞的标示物，灵敏即时地检测端粒酶活性对于肿瘤的诊断、治疗以及预后评估都有很重要的意义(Shay,J.W.,Wright,W.E.Telomerase:A target for cancer therapeutics[J].Cancer Cell 2002,2:257-265.)。
目前为止，在端粒酶活性检测的方法中最经典的方法是基于聚合酶链式反应(PCR)扩增技术的端粒重复序列扩增法(TRAP)(Piatyszek,M.；Kim,N.；Weinrich,S.；Hiyama,K.；Hiyama,E.Wright,W.；Shay,J.Detection of telomerase activity in humancells and tumors by a telomeric repeat amplification protocol(TRAP)[J].Methods Cell Sci.1995,17:1-15.)。该方法是基于聚合酶链式反应(PCR)扩增技术，当细胞提取物中存在活性端粒酶时，端粒酶引物被延长产生端粒重复序列。通过PCR扩增技术使延长产物指数倍增加，然后通过凝胶电泳对PCR结果进行表征，从而实现了对细胞提取物中的端粒酶活性高效、灵敏的检测。但是该方法仍然存在一些缺点，例如操作过程繁琐复杂，耗时，容易产生假阳性信号，导致实验结果不可靠。为了克服这些缺点，许多研究工作者试图发展无需PCR辅助，同时能够灵敏检测端粒酶活性的技术。
发明内容
为了克服现有技术中端粒酶活性检测成本较高、操作复杂、实用性不强等缺陷，本发明提供了一种基于铂纳米颗粒的催化作用，无需通过聚合酶链式反应就能够即时灵敏检测端粒酶活性的方法。
解决上述技术问题所采用的技术方案由下述步骤组成：
1、将氨基化的磁珠与醛基化的端粒酶引物反应，制备磁珠/端粒酶引物复合物。
2、将铂纳米颗粒与巯基化的cDNA探针反应，制备铂/cDNA复合物。
3、将待测细胞进行裂解提取端粒酶，以提取的端粒酶RNA为模板，对磁珠/端粒酶引物复合物进行扩增。
4、将步骤3的扩增产物和磁珠/端粒酶引物复合物分别与铂/cDNA复合物进行杂交。
5、在常温、密闭条件下，将步骤4的两个杂交产物分别与双氧水进行反应，反应完后，分别检测两个反应体系的气压，若步骤3的扩增产物对应体系的气压大于磁珠/端粒酶引物复合物对应体系的气压，说明待测细胞有活性端粒酶，否则，待测细胞无活性端粒酶。
上述的端粒酶引物的序列为5’-AAT CCG TCG AGC AGA GTT-3’；所述巯基化的cDNA探针的序列为5’-SH-TTTTTTCCCTAACCCTAA-3’。
本发明基于铂纳米颗粒对过氧化氢的催化作用，构建了一种即时检测端粒酶活性的方法。当存在活性端粒酶时，磁珠表面修饰的端粒酶引物会与端粒酶结合，使得端粒酶引物沿着其3’末端被延长，形成一条带有TTAGGG重复序列的DNA单链，这条长的DNA单链能够与许多cDNA杂交。本发明将cDNA的5’端修饰到铂纳米颗粒表面，这样，就使得铂纳米颗粒固定到了磁珠的表面，通过磁性分离之后，多余的铂纳米颗粒被去除。在加入过氧化氢时，利用铂纳米颗粒的催化作用，过氧化氢分解产生氧气，体系气压发生变化，再采用便携式气压计检测体系的气压值，活性端粒酶的存在会使气压变化值较大，基于此即可实现对端粒酶活性的即时检测。本发明检测方法简单、快速、灵敏，可以检测不同种类肿瘤细胞中端粒酶活性的表达水平，在以端粒酶为靶点的癌症的治疗诊断方面具有重要的意义。
附图说明
图1是加入活性海拉细胞(HeLa)端粒酶扩增产物、失活海拉细胞提取物以及正常细胞(HL-7702)细胞提取物时体系对应的气压值。
图2是加入不同数目海拉细胞(HeLa)端粒酶的扩增产物时体系的气压值。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
实施例1
以检测海拉(HeLa)细胞中的端粒酶为例，具体检测方法如下：
1、取0.48μL浓度为50μg/μL氨基化的磁珠(NH2-MB，由陕西北美基因股份有限公司)，用磷酸盐缓冲溶液清洗两次，然后将清洗干净的氨基化的磁珠加入到120μL磷酸盐缓冲溶液中，并加入1.2μL浓度为10μmol/L醛基化的端粒酶引物(由生工生物工程(上海)股份有限公司提供，其中端粒酶引物序列为：5’-AAT CCG TCG AGC AGA GTT-3’)，于30℃下震荡2小时，然后通过磁性分离的方法用磷酸盐缓冲溶液洗涤除去没有连接到磁珠表面的端粒酶引物，得到磁珠/端粒酶引物复合物；将磁珠/端粒酶引物复合物用磷酸盐缓冲溶液定容至120μL，置于冰箱中4℃保存备用。
2、将1.63mL 19.3mmol/L的氯铂酸水溶液与14.1mL柠檬酸钠水溶液(含柠檬酸钠11.1mg)混合后，逐滴加入1.75mL硼氢化钠水溶液(含7.3mg硼氢化钠)，滴加完后室温搅拌30分钟，得到铂纳米颗粒溶液；取100μL所得铂纳米颗粒溶液，用去离子水离心洗涤3次，得到铂纳米颗粒，将所得铂纳米颗粒均匀分散于100μL磷酸盐缓冲溶液中，然后加入8μL巯基化的cDNA探针(由生工生物工程(上海)股份有限公司提供，其序列为：5’-SH-TTTTTTCCCTAACCCTAA-3’)，其中铂纳米颗粒和巯基化的cDNA探针的浓度分别为0.8μmol/L和8μmol/L，于30℃下震荡孵育4小时，用磷酸盐缓冲溶液离心洗涤3次，得到铂/cDNA复合物，将铂/cDNA复合物用定容磷酸盐缓冲溶液至100μL，置于冰箱中4℃保存备用。
3、按照常规方法将培养好的HeLa细胞进行裂解提取端粒酶；取步骤1所得的磁珠/端粒酶引物复合物溶液20μL，用端粒酶重复序列扩增缓冲溶液洗涤2次，然后用端粒酶重复序列扩增缓冲溶液定容至20μL，再向其中加入0.4μL 10μmol/L dNTPs水溶液和500个海拉细胞所对应的端粒酶提取液，于30℃下震荡孵育4小时，然后通过磁性分离的方法用磷酸盐缓冲溶液洗涤3次，得到端粒酶引物的扩增产物。
4、将端粒酶引物的扩增产物、用磷酸盐缓冲溶液定容至12μL，再向其中加入8μL步骤2所得铂/cDNA复合物溶液，于35℃下震荡孵育1.5小时，然后通过磁性分离的方法用磷酸盐缓冲溶液洗涤3次，得到杂交产物。同时按照该步骤分别将失活海拉细胞提取物和正常细胞(HL-7702)细胞提取物与铂/cDNA复合物进行杂交，分别得到相应的杂交产物。
5、分别将步骤4得到的三种杂交产物加入100μL质量分数为30％的双氧水中，在常温、密闭条件下反应1小时后，用便携性气压计检测体系的压力。
本实施例的端粒重复序列扩增缓冲溶液中包含有20mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液，pH＝8.3，1.5mmol/L MgCl2，1mmol/L EGTA，63mmol/L KCl，0.05％吐温-20，0.2mmol/L dNTPs，0.1mg/mL BSA(Wang J.S.，Wu L.,Ren J.S.,and Qu X.G.[J].Visualizing Human Telomerase Activity with Primer-Modified AuNanoparticles.Small.2012,8(2):259-264)；所用的磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.1mmol/L、pH＝7.4，含0.1mmol/L KCl、10mmol/L MgCl2。
由图1的对比结果可以看出，加入失活海拉细胞提取物和正常细胞(HL-7702)细胞提取物，体系的压力值几乎没有变化，而加入HeLa细胞裂解提取的端粒酶时，体系的压力值明显增大。说明存在活性端粒酶时，会引起铂纳米颗粒与磁珠结合，使体系气压值增大。因此，通过检测体系的气压值，即可实现对端粒酶活性的即时检测。
发明人按照实施例1的方法观察加入不同个数海拉细胞(Hela)的端粒酶提取液对应体系的气压值，结果如图2所示。从图2的结果可以看出，随着海拉(HeLa)细胞数目的逐渐增加，体系的气压值逐渐增大，并且在加入相当于1个海拉(HeLa)细胞的端粒酶提取液时，体系的气压有明显的变化，说明本发明方法可以高灵敏的实现端粒酶活性的即时检测。

Claims (3)

1.一种基于铂纳米颗粒催化H2O2分解产生气压变化即时检测端粒酶活性的方法，其特征在于它由下述步骤组成：
(1)将氨基化的磁珠与醛基化的端粒酶引物反应，制备磁珠/端粒酶引物复合物；
(2)将铂纳米颗粒与巯基化的cDNA探针反应，制备铂/cDNA复合物；
(3)将待测细胞进行裂解提取端粒酶，以提取的端粒酶RNA为模板，对磁珠/端粒酶引物复合物进行扩增；
(4)将步骤(3)的扩增产物和磁珠/端粒酶引物复合物分别与铂/cDNA复合物进行杂交；
(5)在常温、密闭条件下，将步骤(4)的两个杂交产物分别与双氧水进行反应，反应完后，分别检测两个反应体系的气压，若步骤(3)的扩增产物对应体系的气压大于磁珠/端粒酶引物复合物对应体系的气压，说明待测细胞有活性端粒酶，否则，待测细胞无活性端粒酶。
2.根据权利要求1所述的基于铂纳米颗粒催化H2O2分解产生气压变化即时检测端粒酶活性的方法，其特征在于：所述的端粒酶引物的序列为5’-AAT CCG TCG AGC AGA GTT-3’。
3.根据权利要求2所述的基于铂纳米颗粒催化H2O2分解产生气压变化即时检测端粒酶活性的方法，其特征在于：所述巯基化的cDNA探针的序列为5’-SH-TTTTTTCCCTAACCCTAA-3’。
CN201710034420.5A 2017-01-17 2017-01-17 基于铂纳米颗粒催化h2o2分解产生气压变化即时检测端粒酶活性的方法 Active CN106801085B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710034420.5A CN106801085B (zh) 2017-01-17 2017-01-17 基于铂纳米颗粒催化h2o2分解产生气压变化即时检测端粒酶活性的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710034420.5A CN106801085B (zh) 2017-01-17 2017-01-17 基于铂纳米颗粒催化h2o2分解产生气压变化即时检测端粒酶活性的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106801085A true CN106801085A (zh) 2017-06-06
CN106801085B CN106801085B (zh) 2020-04-24

Family

ID=58984502

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710034420.5A Active CN106801085B (zh) 2017-01-17 2017-01-17 基于铂纳米颗粒催化h2o2分解产生气压变化即时检测端粒酶活性的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106801085B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109212123A (zh) * 2018-09-10 2019-01-15 陕西师范大学 一种基于气压变化即时检测汞离子的方法
CN109738417A (zh) * 2019-01-25 2019-05-10 中南大学 一种利用多孔金纳米球检测肿瘤细胞的方法
CN110243905A (zh) * 2019-06-12 2019-09-17 南京市第二医院 一种用于检测端粒酶活性的电化学传感器及其检测方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103333958A (zh) * 2013-06-07 2013-10-02 浙江今复康生物科技有限公司 免洗涤锚定延伸端粒亲和扩增检测端粒酶的方法及试剂盒
CN103529023A (zh) * 2013-10-11 2014-01-22 东南大学 一种端粒酶活性检测方法
CN103539072A (zh) * 2013-09-24 2014-01-29 苏州创科微电子材料有限公司 一种纳米材料高效催化双氧水制氧的方法
CN104975103A (zh) * 2015-07-27 2015-10-14 华中科技大学 一种检测端粒酶活性的方法
CN106148517A (zh) * 2016-06-30 2016-11-23 陕西师范大学 一种基于链替代反应的比色法检测端粒酶活性的方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103333958A (zh) * 2013-06-07 2013-10-02 浙江今复康生物科技有限公司 免洗涤锚定延伸端粒亲和扩增检测端粒酶的方法及试剂盒
CN103539072A (zh) * 2013-09-24 2014-01-29 苏州创科微电子材料有限公司 一种纳米材料高效催化双氧水制氧的方法
CN103529023A (zh) * 2013-10-11 2014-01-22 东南大学 一种端粒酶活性检测方法
CN104975103A (zh) * 2015-07-27 2015-10-14 华中科技大学 一种检测端粒酶活性的方法
CN106148517A (zh) * 2016-06-30 2016-11-23 陕西师范大学 一种基于链替代反应的比色法检测端粒酶活性的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
XIAOLIN XU等: "A simple,fast,label-free colorimetric method for detection of telomerase activity in urine by using hemin-graphene conjugates", 《BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS》 *
ZHIJUN ZHANG等: "A Pt-nanoparticle electrocatalytic assay used for PCR-free sensitive telomerase detection", 《CHEMICAL COMMUNICATIONS》 *
陈勇等: "人类端粒DNA的分子识别及其作用机制探讨", 《中国科学：化学》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109212123A (zh) * 2018-09-10 2019-01-15 陕西师范大学 一种基于气压变化即时检测汞离子的方法
CN109738417A (zh) * 2019-01-25 2019-05-10 中南大学 一种利用多孔金纳米球检测肿瘤细胞的方法
CN110243905A (zh) * 2019-06-12 2019-09-17 南京市第二医院 一种用于检测端粒酶活性的电化学传感器及其检测方法
CN110243905B (zh) * 2019-06-12 2021-08-17 南京市第二医院 一种用于检测端粒酶活性的电化学传感器及其检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN106801085B (zh) 2020-04-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Khan et al. Isothermal SARS-CoV-2 diagnostics: tools for enabling distributed pandemic testing as a means of supporting safe reopenings
CN109055499A (zh) 基于CRISPR-Cas的等温核酸检测方法及试剂盒
CN106801085A (zh) 基于铂纳米颗粒催化h2o2分解产生气压变化即时检测端粒酶活性的方法
CN111440851B (zh) 一种检测miRNA的电化学生物传感器及其制备方法与应用
CN104502437B (zh) 一种多重信号放大的免标记电化学传感器及对核酸的检测
CN107586827B (zh) 一种基于核酸外切酶iii的汞离子检测探针组、试剂盒及汞离子检测方法
CN116590387B (zh) 一种基于CRISPR系统的ssDNA检测方法及应用
Miao et al. Nuclease assisted target recycling and spherical nucleic acids gold nanoparticles recruitment for ultrasensitive detection of microRNA
CN106811524B (zh) 一种端粒酶活性比色检测法
CN112534063A (zh) 用于核酸测序的方法、系统和组合物
Zhang et al. Sensitive and selective amplified visual detection of cytokines based on exonuclease III-aided target recycling
CN108088826A (zh) 一种检测尿嘧啶-dna糖基化酶（udg）的荧光生物传感器
CN110408679B (zh) 一种基于酶辅助循环信号放大的电化学急性白血病基因Pax-5a检测方法
CN107151694A (zh) 环介导的级联放大策略用于高灵敏检测dna甲基转移酶活性
Wang et al. Cyclic enzymatic repairing-mediated dual-signal amplification for real-time monitoring of thymine DNA glycosylase
CN112226484B (zh) β-葡萄糖转移酶的荧光生物传感器及检测方法与应用
CN109444102A (zh) 一种检测赭曲霉毒素a的荧光生物传感器及其制备方法和应用
Zhang et al. Label-free and high-throughput bioluminescence detection of uracil-DNA glycosylase in cancer cells through tricyclic cascade signal amplification
CN105154563B (zh) 一种基于三重放大技术均相非标检测端粒酶活性的方法
CN108359716A (zh) 一种基于引物生成型滚环扩增技术的端粒酶活性检测方法
Yang et al. CRISPR/Cas13a trans-cleavage-triggered catalytic hairpin assembly assay for specific and ultrasensitive SARS-CoV-2 RNA detection
Xu et al. Palindromic probe-mediated strand displacement amplification for highly sensitive and selective microRNA imaging
Ma et al. CRISPR-empowered electrochemical biosensor for target amplification-free and sensitive detection of miRNA
WO2023202303A1 (zh) 一种微rna检测方法及试剂盒
CN109055609B (zh) 基于t4 dna聚合酶的西瓜花叶病毒检测传感器及其组装方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant