CN110952148A - 一种中小长度rna高通量测序建库方法及其应用 - Google Patents

一种中小长度rna高通量测序建库方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种中小长度RNA高通量测序建库方法及其应用。相比于现有报道，本发明提供的技术方案能够同时分析mRNA和lncRNA，以及snoRNA，也可以分析含有富含GC的重复扩增的RNA模板；此外，建库起始样本量少，所需时间短，偏差更少，适用于检测全细胞、外泌体乃至最新的技术包括HITS‑CLIP/CLIP‑seq、RIP‑seq、ribosome profiling核糖体图谱分析等，减少测序偏差，还可以获得snoRNA和其他结构的非编码RNA的全长序列。

Description

一种中小长度RNA高通量测序建库方法及其应用
本申请要求了2018年12月28日提交中国专利局的，申请号为201811620297.6，发明名称为“一种中小长度RNA高通量测序建库方法及其应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明涉及高通量测序及文库构建领域，更具体地，涉及一种高灵敏度外泌体融合基因检测方法及其应用。
背景技术
所有的RNA-seq技术，都需要先进行cDNA合成步骤：利用反转录酶(RT)将RNA转录为DNA，然后进行高通量DNA测序。现有的RNA-seq技术可以大致分为两种：
第一种适用于检测mRNA、lncRNA，用oligo(dT)引物进行反转录，富集poly(A)+RNA；第二种是去除高丰度的rRNA之后，使用随机引物进行反转录。通过反转录得到cDNA产物，然后转化为合适长度的双链DNA，链接到平台特异的测序接头。最广泛使用的技术是使用RNA片段、random hexamer引物，在合成第二链的时候添加dUTP；在加接头之后，含尿嘧啶的第二链会在PCR的过程中通过高保真度的DNA聚合酶被去除，或者被酶促降解，以达到链特异性。
第二种RNA-seq的方法，适用于miRNA和其他小非编码RNA，需要将含有引物结合位点的RNA-seq接头连接到靶RNA的3’或5’末端，然后进行反转录、PCR扩增，构建RNA-seq文库。
逆转录酶(RT)在生物技术中别用于合成RNA的cDNA拷贝用于多种应用，包括RT-PCR和qRT-PCR、cDNA文库的构建、微阵列的探针的制备、以及常规的和下一代RNA测序。
TGIRT，即热稳定内含子II型反转录酶(thermostable group II intron reversetranscriptases,TGIRT)。与传统的逆转录病毒的反转录酶相比，TGIRT酶有着更高的持续合成能力和保真度；TGIRT还有着显著的模板转换活性，无需RNA连接酶就可以在cDNA合成的过程中直接加上RNA-seq的接头。
但是，现有的RNA-seq技术重复性很高，但是仍会因为RNA样本制备、反转录、添加接头的方法不同而出现一定的偏差；此外，因为有很多结构蛋白，比如tRNA、snoRNA，对传统的RNA-seq耐热。
具体来说，现有技术有着以下的局限性：1)不能在同一个RNA-seq反应中同时进行mRNA、lncRNA、小ncRNA测序；2)适用于cDNA合成的逆转录病毒RT酶的相对保真度较低、持续合成能力较低，难以分析RNA序列多态性、高级结构或富集GC的RNA；3)用RNA连接酶或random hexamer引物加接头，会产生偏差。
有鉴于此，有必要提供一种针对中小长度RNA高通量测序的建库方法，偏差更小，保真度更高，能同时检测mRNA、lncRNA和snoRNA，还可以获得其他结构的非编码RNA的全长序列的方法。
发明内容
本发明提供了一种中小长度RNA高通量测序建库方法及其应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
第一方面，本发明提供了一种中小长度RNA高通量测序建库方法，包括如下步骤：
1)获取样品中的mRNA；将所得mRNA产物、退火后结合的R2 RNA/R2RDNA双链、逆转录酶加入缓冲液中室温孵育，添加dNTPs后，在55-65℃下反应5-15分钟或55-60分钟；然后加入NaOH，95-100℃孵育3-5min，冷却至室温，用HCl中和；纯化，获得含cDNA第一链的产物；
2)将R1R DNA进行腺苷酸化反应并纯化，获得纯化后的R1R DNA产物；
3)将1)所得含cDNA第一链的产物和2)所得R1R DNA产物加入连接体系中，连接反应后进行纯化；
4)将3)获得的纯化产物进行PCR扩增，获得中小长度RNA高通量测序文库。
优选地，所述步骤3)中，所述连接体系为：
Figure BDA0002343114030000021
优选地，所述R2 RNA序列为
5’rArGrA rUrCrG rGrArA rGrArG rCrArC rArCrG rUrCrU rGrArA rCrUrCrCrArG rUrCrA rC/3SpC3。
优选地，所述R2R DNA序列为5’GTG ACT GGA GTT CAG ACG TGT GCT CTT CCG ATCTN。
优选地，所述R1R DNA序列为5’/5Phos/GAT CGT CGG ACT GTA GAA CTC TGA ACGTGT AG/3NH2。
优选地，所述P5 FP引物、P7 RF引物序列为表1所示。
第二方面，本发明提供了一种中小长度RNA高通量测序建库试剂盒，包括表1所述的引物。
第三方面，本发明提供了一种中小长度RNA高通量测序建库方法或中小长度RNA高通量测序建库试剂盒在构建转录组测序文库中的应用。
本发明具有以下有益效果：
1.本发明在文库构建步骤，使用的反转录酶为TGIRT。TGIRT酶有着以下效果：
1)比逆转录病毒逆转录酶有着更高的热稳定性，持续性和保真度，允许从高度结构化或严格修饰的RNA进行全长的端到端cDNA合成。
2)端对端模板切换活性，能够在逆转录过程中连接RNA-seq或PCR接头，并且不再需要单独的RNA 3'-衔接子连接步骤，大大促进了链特异性RNA-seq文库的构建，其偏差小于使用random hexamer引物或使用RNA连接酶进行连接的方法。
3)可从退火引物有效合成cDNA。
4)直接在DNA链的3'末端启动DNA合成，同时连接DNA-seq接头而不进行末端修复，拖尾或连接，以更简单的工作流程捕获精确的DNA末端。能够分析核小体定位，转录因子结合位点，DNA甲基化位点和起源组织。
2.配合TGIRT酶，对整个RNA-seq的建库流程进行了优化，修改了引物，使其扩增效果更好。这样能够给更好的进行全面的链特异性转录组分析，有着更加均一的5'至3'基因覆盖范围，能够给识别更多的剪接点；能够同时分析mRNA和lncRNA，以及snoRNA，也可以分析含有富含GC的重复扩增的RNA模板；适用于全细胞，外泌体，血浆和其他细胞外RNA样本；处理时间＜5h，所需RNA更少，可作RIP-seq、HITS-CLIP、irCLIP核糖体图谱分析等。
综上，本发明提供了的技术方案，相比于现有报道，本发明建库起始样本量少，所需时间短，偏差更少，适用于检测全细胞、外泌体乃至最新的技术包括HITS-CLIP/CLIP-seq、RIP-seq、ribosome profiling核糖体图谱分析等，减少测序偏差，还可以获得tRNA和其他结构的非编码RNA的全长序列。
附图说明
图1为本发明实施例提供的文库构建流程示意图；
图2为本发明实施例提供的基因表达箱线分布图；
图3本发明实施例提供的中小长度RNA高通量测序中检测到的各类型RNA占比图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或制造厂商所建议条件实施。
在本发明一具体实施例中，结合图1所示的文库构建流程示意图，本发明提供了一种中小长度RNA高通量测序建库方法及其应用。
本发明提供的用于中小长度RNA高通量测序建库方法，采用了本发明提供的用于中小长度RNA高通量测序建库试剂盒，所述方法包括但不限于如下步骤的一个或多个步骤：
采用mRNA试剂盒提取样品中的mRNA：
1.模板/引物退火
1.1按照下表配置反应体系：
Figure BDA0002343114030000041
1.2热循环仪中82℃孵育2min，按0.1℃/s的降温至25℃
2.TGIRT反应合成cDNA
2.1.按照下表配置反应体系：
Figure BDA0002343114030000042
2.2.室温预孵育30min，然后添加1μL of 25mM dNTPs，60℃孵育反应5-15min(短RNA)或60min(长RNA或有大量修饰的RNA)
2.3.添加1μL 5M NaOH，95℃孵育3min，冷却至室温，用1μL 5M HCl中和
2.4.用RNA Clean&Concentrator-5试剂盒(Zymo Research,Cat No:R1015)纯化反转产物
3.R1R DNA oligo腺苷酸化
3.1.按照下表配置反应体系：
Figure BDA0002343114030000043
3.2.65℃孵育1h，85℃孵育5min，使酶失活
3.3.用RNA Clean&Concentrator-5试剂盒(Zymo Research,Cat No:R1015)纯化腺苷化的R1R DNA，用10μL双蒸水洗脱，使R1R DNA终浓度为10μM
4.R1R接头连接
4.1.按照下表配置反应体系：
Figure BDA0002343114030000051
4.2.65℃孵育1h，90℃孵育3min，使酶失活
4.3用RNA Clean&Concentrator-5试剂盒(Zymo Research,Cat No:R1015)纯化已连接的cDNA，用23μL H2O洗脱
5.PCR扩增
5.1.按照下表配置反应体系：
Figure BDA0002343114030000052
5.2配置完成后，震荡混匀，短暂离心收集样本。
5.3按照以下程序反应：
Figure BDA0002343114030000053
Figure BDA0002343114030000061
5.4用1.4X DNA纯化磁珠进行文库纯化，准备测序。
6.Qsep100全自动核酸蛋白分析系统检测文库主峰大小。
7.上述步骤所用引物序列如表1所示：
Figure BDA0002343114030000062
本发明提供的技术方案用到的index序列如下表所示：
Figure BDA0002343114030000063
Figure BDA0002343114030000071
具体实验结果
1基因组比对
测序获得的序列数据经过质量控制以后，采用HISAT2软件[1]与物种人的基因组进行比对，基因组比对率是衡量数据质量的一个标准，常规方法(Norm)基因组比对率(Mapping Rate)不足40％，本方法(TGIRTG2)基因组比对率>70％，显著优于常规方法。
表1基因组比对数据统计
Figure BDA0002343114030000072
All Reads：参与基因组比对的总序列数，即质量控制以后的测序序列
UnMapped：与基因组未比对上的序列数
Mapped：即总参与比对序列中能够比对到基因组上的测序序列数
Mapping Rate：基因组比对率，即测序序列比对到基因组占总测序过滤后序列的比值
Unique Mapped：总参与比对序列中能够在基因组上只有唯一比对位置的序列数
Unique Mapped Rate：唯一位置比对率，即唯一位置比对序列占从测序过滤后序列的比值
Norm用与本方法起始量一样(1ng)的常规建库方法，流程包括：mRNA捕获，mRNA打断，第一链cDNA合成，第二链cDNA合成，末端修复，接头连接，PCR富集。
2表达量计算
基因表达(Gene Expression)是进行转录组测序研究的基础。
根据基因组比对结果文件，利用htseq-count[2]计算基因的表达量，FPKM(Fragments Per Kilo base Million Reads)用来进行标准化，所有基因的表达量FPKM结果分布图如图2所示，其中纵轴代表FPKM的log10对数转换值，矩形盒两端边的位置分别对应数据的上下四分位数(Q1和Q3)，矩形盒内部的一条线段为中位数，结果显示FPKM分布的中位数位于0.1-1之间，下四分位数(所有基因表达量从小到大排序后第25％的数字)位于0.1以上(对应图中对数转换的坐标值-1)，FPKM大于0.01一般认为基因有表达，表明该方法可以检测到大部分基因(75％)，如图3所示，该方法可以检测到mRNA、lncRNA、snoRNA以及中小长度的其它RNA。
生信分析参考文献
[1]Kim D,Langmead B,Salzberg S L.HISAT:a fast spliced aligner with lowmemory requirements[J].Nature methods,2015,12(4):357.
[2]Anders S,Pyl P T,Huber W.HTSeq—a Python framework to work with high-throughput sequencing data[J].Bioinformatics,2015,31(2):166-169.
综上所述，本发明提供的技术方案能够同时分析mRNA和lncRNA，以及snoRNA等。
应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明实施例原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明实施例的保护范围。
序列表
<110> 广州表观生物科技有限公司
<120> 一种中小长度RNA高通量测序建库方法及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 34
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agaucggaag agcacacguc ugaacuccag ucac 34
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctn 35
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gatcgtcgga ctgtagaact ctgaacgtgt ag 32
<210> 4
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caagcagaag acggcatacg agat 24
<210> 6
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atct 34

Claims (10)

1.一种中小长度RNA高通量测序建库方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)获取样品中的mRNA；将所得mRNA产物、退火后结合的R2 RNA/R2RDNA双链、逆转录酶加入缓冲液中室温孵育，添加dNTPs后，在55-65℃下反应5-15分钟或55-60分钟；然后加入NaOH，95-100℃孵育3-5min，冷却至室温，用HCl中和；纯化，获得含cDNA第一链的产物；
2)将R1R DNA进行腺苷酸化反应并纯化，获得纯化后的R1R DNA产物；
3)将1)所得含cDNA第一链的产物和2)所得R1R DNA产物加入连接体系中，连接反应后进行纯化；
4)获得的纯化产物进行PCR扩增，获得中小长度RNA高通量测序文库。
2.如权利要求1所述的中小长度RNA高通量测序建库方法，其特征在于，所述步骤3)中，所述连接体系为：
Figure FDA0002343114020000011
3.如权利要求1所述的中小长度RNA高通量测序建库方法，其特征在于，所述步骤1)中，添加dNTPs后，在60℃下反应5-15分钟或60分钟。
4.如权利要求1所述的中小长度RNA高通量测序建库方法，其特征在于，所述R2 RNA序列为5’rArGrA rUrCrG rGrArA rGrArG rCrArC rArCrG rUrCrU rGrArA rCrUrC rCrArGrUrCrA rC/3SpC3。
5.如权利要求1所述的中小长度RNA高通量测序建库方法，其特征在于，所述R2R DNA序列为5’GTG ACT GGA GTT CAG ACG TGT GCT CTT CCG ATC TN。
6.如权利要求1所述的中小长度RNA高通量测序建库方法，其特征在于，所述R1R DNA序列为5’/5Phos/GAT CGT CGG ACT GTA GAA CTC TGA ACG TGT AG/3SpC3。
7.如权利要求1所述的中小长度RNA高通量测序建库方法，其特征在于，所述P5 FP引物、P7 RF引物序列为表1所示。
8.一种中小长度RNA高通量测序建库试剂盒，其特征在于，包括表1所示的引物。
9.如权利要求8所述的中小长度RNA高通量测序建库试剂盒，其特征在于，所述中小长度RNA高通量测序建库试剂盒还包括如权利要求2所述的连接体系。
10.一种如权利要求1所述的中小长度RNA高通量测序建库方法或如权利要求9所述的中小长度RNA高通量测序建库试剂盒在中小长度RNA高通量测序中的应用。
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