CN111477272A - 一种利用SNPs辅助选择高产仔数獭兔的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用SNPs辅助选择高产仔数獭兔的方法，其利用FSHβ基因内的特定SNP突变对高产仔数獭兔母兔进行选择，包括以下步骤：S1、组建目标獭兔母兔群体；S2、采集目标獭兔母兔群体中所有母兔的DNA；S3、对目标SNP位点进行基因型分型；S4、根据育种目标挑选特定基因型的母兔；S41、选择高产仔数和产活仔数的母兔时，挑选FSH30位点基因型为AA的母兔，同时淘汰基因型为GG的母兔；S42、选择初生窝重较高的母兔时，挑选FSH2位点基因型为GG的母兔，淘汰FSH2位点基因型为TT的母兔；同时挑选FSH31位点基因型为GG的母兔，淘汰FSH31位点基因型为AA的母兔；S5、结合育种值综合排序，配种产生后代。

Description

一种利用SNPs辅助选择高产仔数獭兔的方法

技术领域

本发明涉及遗传育种领域，尤其涉及一种利用SNPs辅助选择高产仔数獭兔的方法。

背景技术

獭兔，学名力克斯兔(Rex rabbit)，是世界著名的皮用兔品种。我国是世界獭兔养殖大国，据2013年调查统计，我国獭兔的饲养量已超过毛兔，成为仅次于肉兔的家兔养殖类型。饲养地区涉及到全国26个省市自治区，品种分布面积广，发展速度快。全年饲养量达1亿多只，出栏量7000万只。獭兔因其被毛具有“短、平、密、细、美、牢”的特点，其毛皮制品色彩斑斓，无需人工染色而受到消费者的喜爱，因此发展獭兔养殖具有广阔的市场前景。

目前我国制约獭兔生产的主要因素为品种退化，表现为颜色变异、繁殖性能低下、抗病力差等方面。在一些地区，一只成年獭兔一年可提供的商品皮张数仅为12-14张，远不能满足市场需求，也远没有达到獭兔繁殖力潜力的上限，因此具有很大的提高空间。另外，世界一些獭兔养殖的发达国家如法国国立农科院(INRA)经10多年的选育，育成獭兔新品种-Orylag獭兔，该獭兔品种已经进行商标注册并受到保护。法国限制该品种向他国出口，极大的制约了我国獭兔种质的提升和改良。

我国家兔育种经历了系谱+表型选择阶段(2000年以前，其代表品种为哈尔滨大白兔、塞北兔、吉戎兔等品种)；系谱+表型+育种值选择阶段(2010年以前，其代表品种为皖系长毛兔、川白獭兔、康大肉兔配套系等)；系谱+表型+育种值选择+基因型选择阶段(2010年以后，其代表品种为天府黑兔)三个主要发展阶段(秦应和，2019)。根据经典育种理论，育种过程实质上是人为的决定哪些家畜个体作为亲本繁殖后代。通过一代又一代的选种和选配，定向的改变群体的基因频率，使得有利于生产性能提高的基因频率增高，不利于生产性能提高的基因频率降低(张沅，2003)。

传统系谱+表型选择方法主要考虑个体生产性能，同时参考同胞、父母的表现，选育过程较直观，易于在基层推广，对于遗传力较高的性状(如生长发育，被毛质量)具有较好的效果。但这种方法并没有有效的剖分出遗传因素对于性状的影响，过度依赖于个人经验和主观判断，往往难以选择出真正具有较好遗传潜力的种兔，另外，对于遗传力较低的性状(如繁殖，抗病力)效果很差，在现代育种中采用较少。系谱+表型+育种值选择增加了对育种值的选择，对真正能遗传给后代的部分进行剖分，通常采用BLUP法，极大程度的利用个体父母、后代、同胞和亲属的信息，计算个体育种值，并根据育种值排序进行选择。目前，采用这种方法已培育出大量优秀的家兔品种，是目前采用的主流方法。虽然BLUP方法能够充分利用各种信息进行育种值的最佳估计，但在某些情况下仍不能取得理想效果，如低遗传力性状和阈性状，由于对这类性状育种值的准确估计需要大量各类亲属的信息，很难对个体进行准确的遗传评定(张沅，2003)，因而对于繁殖性状的评估具有一定的局限性。

2010年以后，随着分子生物学手段的丰富和成熟和越来越多主效基因的发掘，在育种过程中除考虑个体育种值以外，还考虑了被选择个体中是否存在特定的基因型，即标记辅助选择(MAS)。MAS的原理是预先知道所评定性状有某些主效基因的存在，并且能直接测定它们的基因型，或知道它们与某些标记的连锁关系，将基因型信息或标记信息用到个体遗传评定中，就会提高评定的精确性(张沅，2003)。在常规BLUP基础上加上标记的信息，即同时利用表型、系谱和标记的信息进行个体育种值估计。可用公式表示为：

个体育种值＝QTL育种值+多基因育种值

MAS不仅可以在动物生命早期开始，突破一些限性表达性状选择的限制，也可以缩短世代间隔，提高选择强度，从而提高选择的准确性。

现有技术培育品种

1、哈尔滨大白兔

哈尔滨大白兔是中国农业科学院哈尔滨兽医科学研究所用10年时间育成的肉用品种，采用的培育方法为系谱+表型培育法。该品种的培育时间为1976-1986年，并通过了国家级品种审定。成年兔体长57.95cm，胸围39.04cm，体重6252g，显著大于其亲本上海大耳白兔和哈尔滨本地白兔(张军飞，1989)。哈尔滨大白兔可用于对体型较小品种进行遗传改良(庞有志，1997)。

2、四川白獭兔

四川白獭兔是2015年通过国家遗传资源委员会审定的我国首个獭兔新品种，培育时间为1995-2005年(秦应和，2019；关云秀等，2020)，2016年被农业农村部列为全国主导品种，采用的培育方法为系谱+表型+育种值培育法。川白獭兔具有体型大、被毛质量好、适应性强的特点。2017年，在四川省的江油、仪陇、江安、大邑、罗江等县市进行的品种性能的监测表明，川白獭兔在大规模饲养的情况下保留了品种本身的优良性状，遗传性能稳定(关云秀等，2020)。

3、川府黑兔

天府黑兔的培育时间是从1990-2001年，目前已通过了省级品种审定，是一个较为优秀的肉用品种(赖松家等，2002)。个体选择过程主要采用BLUP法制订综合选择指数，依据指数选留。2011年以后，又在此基础上加入生长发育性状和抗病性状等方面的基因型信息辅助选育，采用的方法为系谱+表型+育种值+基因型的培育法。

综上所述，传统的家兔育种主要采用的是表型选择的常规育种方法，这种方法存在选择准确性差、选择效率低下、耗费的人力物力大、选种周期长的缺点；在家兔育种领域，特别是在繁殖性状方面采用分子标记辅助育种的案例目前尚未见报道，需要进行深入的探索。

发明内容

本发明目的是针对上述问题，提供一种准确性高、选种周期短的利用SNPs辅助选择高产仔数獭兔的方法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案是：

一种利用SNPs辅助选择高产仔数獭兔的方法，其利用FSHβ基因内的特定SNP突变对高产仔数獭兔母兔进行选择，包括以下步骤：

S1、组建目标獭兔母兔群体；

S2、采集目标獭兔母兔群体中所有母兔耳组织并提取DNA；

S3、确定DNA中的目标SNP位点并采用Snapshot微测序方法对目标SNP位点进行基因型分型；

S4、根据育种目标挑选特定基因型的母兔；

S41、若需选择高产仔数和产活仔数的母兔，挑选FSH30(FSHβ:2908G>A)位点基因型为AA的母兔，同时淘汰基因型为GG的母兔；

S42、若需选择初生窝重较高的母兔，挑选FSH2位点基因型为GG的母兔，淘汰FSH2(FSHβ:284G>T)位点基因型为TT的母兔；同时挑选FSH31(FSHβ:2963G>A)位点基因型为GG的母兔，淘汰FSH31位点基因型为AA的母兔；

S5、结合育种值综合排序，配种产生后代。

进一步的，所述步骤S1中组建参考群体时亲本F0代为任意需要进行选种的獭兔群体。

进一步的，所述步骤S3中确定DNA中的目标SNP位点包括以下步骤：

S31、在DNA中进行FSHβ基因引物设计并在目标群体内随机选择若干只海狸色獭兔和若干只白色獭兔进行全长扩增；

S32、采用软件DNAMAN进行基因信息比对，获得全部SNPs；

S33、根据全部SNPs所在的位置和杂合程度进行选择，确定目标SNP位点。

进一步的，所述步骤S33中在全部SNPs中选择目标SNP位点包括以下步骤：

S331、选择的目标SNP位点位于目标基因的外显子内；

S332、选择的目标SNP位点在小群体中分型的标记杂合度≥50％；标记杂合度的计算公式为：

其中，p_i为目标位点的等位基因频率。

与现有技术相比，本发明具有的优点和积极效果是：

本发明的通过对控制哺乳动物卵泡发育和排卵的主效基因卵泡刺激素(FSHβ)进行序列分析和SNP标记的鉴定和筛选，在獭兔群体中分别对筛选获得的对獭兔繁殖性状(初产仔数、产活仔数、初产窝重、21日龄活仔数等)具有显著效应的SNPs进行验证，同时采用循证医学中的经典方法整合分析法(Meta-Analysis)对不同群体相同SNP标记的效应进行综合分析和判断，最终开发出能够提高獭兔繁殖性能的分子标记，有效的弥补和解决了传统育种方法对于低遗传力性状选择准确性差、周期长、成本高的缺陷和问题。本发明中的方法简单易行、成本低廉、技术成熟、分型准确率达90％以上，可作为獭兔繁殖性状选种的有效标记，与传统的系谱+表型+育种值的方法配合使用，可有力的提高獭兔种母兔选育的效率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的框架流程图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

如图1所示，本实施例公开了一种利用SNPs辅助选择高产仔数獭兔的方法，其步骤如下：

(1)、参考群体的组建

用于SNPs筛选和开发的参考群体以两个獭兔品系(白色獭兔和海狸色獭兔)共170个个体组成。

参考群体的亲本F0代的选配采用表型选配的方式，即白色獭兔与白色獭兔交配，海狸色獭兔与海狸色獭兔交配，产生F1代，规模约为500只子代獭兔。

(2)、表型性状测定

F1代达5月龄性成熟时挑选日龄、体重相近，体况较好的170只母獭兔进行配种，采用的交配方式为随机交配，尽量避免全同胞交配和回交。在仔兔出生当天、21日龄和断奶时分别记录初产仔数、产活仔数、初生窝重、21日龄活仔数、泌乳力、断奶窝重和断奶活仔数。

(3)、目标基因的选择

研究表明，雌性哺乳动物卵泡发生的普遍机制是通过中枢神经系统和卵巢之间的一条内分泌腺和卵巢内的几条旁分泌腺进行调节。其中，研究最深入的是下丘脑-垂体-卵巢轴的作用。原始卵泡需经历被启动募集、生长分化、发育成有腔卵泡、发育成排卵卵泡等几个主要阶段。促卵泡素FSH在有腔卵泡的生长发育、增殖和募集过程中起到主导作用(田允波等，2006)。用抑制素降低小鼠的FSH浓度，卵泡募集受阻，卵泡生长静止，新卵泡波的出现推迟(Elizabeth等，2000)，而人为提高FSH浓度可使更多的卵泡参与周期募集(Driancourt，2001)。有腔卵泡形成优势化的排卵卵泡过程也是FSH，LH及它们的受体和E2共同作用的结果，优势卵泡能够继续接受FSH的作用表达更多的LHR，使优势卵泡的生长加快(田允波等，2006)。试验表明，在卵泡优势化阶段，若维持血浆中FSH较高水平，排卵卵泡数会增加(Shi等，2000)。Scarammuzi等(2011)提出两种增加哺乳动物排卵率的模型，其中提高FSH的浓度可在同等条件下使更多的卵泡排出，从而增加排卵数。这说明，促卵泡素(FSH)对哺乳动物的排卵有重要的刺激和调节作用。

哺乳动物的卵泡刺激素一般由α和β两个亚基组成，其蛋白质分子量约为30kDa，其中β亚基是激素生物活性和免疫活性的决定因素。一般认为，α亚基负责信号转导作用，β亚基是功能亚基，与受体结合。编码FSHβ亚基的基因由3个外显子和2个内含子组成，编码110个氨基酸残基，第一外显子为5’UTR，第二外显子前端具有编码7个氨基酸的信号肽序列，第三外显子编码36-111个氨基酸残基，并具有大小约为1.1kb的3’UTR(石福岳，2013)。目前，已有大量研究表明FSHβ基因与猪的高产仔数有显著的相关性(赵要风等，1996，1999)，并进一步证实了FSHβ基因本身就是控制猪产仔数的主效基因。虽然物种的亲缘关系较远，但家猪和家兔均为常年发情的多胎哺乳动物，在繁殖生理学上具有一定的相似性，有理由认为，FSHβ基因是影响兔的排卵数和产仔数的一个主效基因，因此将其选为目标基因。

(4)、目标SNPs的确定与筛选

①采集参考群体170只母兔的耳组织样本，75％乙醇保存，随后采用试剂盒法提取DNA，-20℃保存。

②在参考群体内随机选择10只海狸色獭兔和10只白色獭兔并根据NCBI官网上发布的家兔基因组信息进行FSHβ基因引物设计并进行全长扩增。

③采用DNAMAN进行个体间的基因信息比对，获得全部SNPs。

④根据SNPs所在的位置和杂合程度进行选择，确定目标SNPs。具体筛选标准如下：

i)所选择的目标SNPs需位于目标基因即FSHβ基因的外显子内；

ii)所选择的目标SNPs在小群体中分型的杂合度≥50％。其中标记杂合度的计算公式为：

pi为目标位点的等位基因频率。

(5)、目标SNPs的分型

对选定的目标SNPs在参考群体170个个体中进行Snapshot微测序分型，获得所有个体的基因型。

注：Snapshot技术是由美国ABI公司开发的一种基于荧光标记单碱基延伸的分型技术，也称微测序，主要针对中等通量的SNP分型项目。

(6)、标记与繁殖性状的关联性分析

关联分析采用一般线性模型进行，设计两个固定效应：品种(白色或海狸色)和基因型(高产型，低产型，杂合型)，分别对獭兔的初产仔数、产活仔数、初生窝重、泌乳力、21日龄活仔数、断奶窝重、断奶活仔数和不同基因型之间进行关联分析，检测筛选出的目标SNPs的效应。

(7)、目标SNPs效应的验证

①在参考群体之外另外选择3个独立的獭兔群体，群体大小在100～200只繁殖母兔，采用与参考群体相同的饲养管理方法并进行繁殖性状性能测定和记录，同时对目标基因型进行测定，采用与参考群体分析相同的模型进行与目标SNPs的关联分析，从而验证所选标记的效应。

②采用Meta分析的方法，在STATA软件中设置各参数，进行4个群体标记效应的综合分析，得到标记对獭兔繁殖性状的综合评价结果。

标记扩增的条件与方法

①獭兔组织DNA的提取

DNA提取一般采集獭兔耳组织样本，妥善保存后采用普通的动物组织DNA提取试剂盒进行抽提。

②引物

本检测方法的目标SNPs为FSHβ基因1号外显子(FSH2)284G>T，3号外显子(FSH30,FSH31)2908G>A，2963C>T三个点突变。

针对目标位点分型的Snapshot引物序列为：

FSHβ1-2F：AATTACAGATTTTTCAGGGCATG

FSHβ1-2R：AATGATTAGAGCTTACTACTGAGTGTC

FSHβ-30-31-F：TGCTGTCACCATTCTGTCCTG

FSHβ-30-31-R：GAAAGACAGCCTCGTCAGCC

FSHβ2Y(F)：ttttTTAAACAAATGTGTGCAAAACAAA

FSHβ2Y(F)：ttttttttttttttttttttttttttttttttTAGGCCCAGAGGTAGGAAATGATA

FSHβ31Y(R)：ttttttttttttttttGTTTCTGGCCCTGCTCTTGA

③预扩增反应体系与条件

Snapshot预扩增反应体系为：2.5×Buffer缓冲液IV，4.0μL；上游引物(5Mm/L)，0.1μL；下游引物(5Mm/L)，0.1μL；Taq酶(5U/μL)，0.1μL；模板DNA(约50-100ng)：1.0μL；灭菌双蒸水：4.7μL。终末体积为10μL。

Snapshot预扩增反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，最后72℃终末延伸10min。

④预扩增产物消化

将上述预扩增产物取4.0μL用于消化，消化反应体系为：PCR产物，4.0μL；SAP酶(1U/μL)，1.33μL；EoxI酶(20U/μL)，0.27μL。

产物消化反应条件为：37℃1.0h，75℃15min。

⑤延伸反应

Snapshot延伸反应体系为：消化后预扩增产物，1.0μL，引物混合物，1.0μL，ABI混合液，0.5μL，10×BufferI，0.4μL，双蒸水，2.1μL。终末体积为6.0μL。

Snapshot延伸反应条件为：96℃10s，50℃5s，60℃30s，27个循环。

⑥上机检测

取延伸反应产物6.0μL加入0.5μLCIP，37℃孵育1h，75℃15min。

将产物与分子量内标和甲酰胺混合液充分混合，95℃变性，在ABI3730测序仪上检测。

上述反应过程涉及到高通量测序仪ABI3730以及较高的分子试验反应条件，实际操作时与生物公司联系，提供相关引物后进行位点的检测，可同时检测上述三个标记。

分子标记对于獭兔繁殖性状的效应

根据在本参考群体中170只獭兔的试验数据，标记FSH2的GG型为高产仔数基因型，比TT型平均高1.2只初产仔数和1.2只产活仔数；标记FSH30的AA型为高产仔数基因型，比GG型平均高出1.3只初产仔数和1.4只产活仔数；标记FSH31的GG型为高产仔数基因型，比AA型平均高出1.2只初产仔数和1.3只产活仔数。上述标记的高产基因型和低产基因型之间的差异均为显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)。具体试验数据如表1所示：

表1 FSHβ基因3个SNPs与繁殖性状的关联性分析最小二乘均值结果

将上述结果在3个独立的獭兔群体中分别进行验证，并采用Meta分析进行4个群体相同标记效应的客观评价，最终得出FSH30的AA(高产基因型)基因型的母兔比GG(低产基因型)基因型的母兔每胎可多产0.5只仔獭兔(P＝0.05)；FSH30的AA基因型的母兔比GG基因型的母兔每胎可多产0.5只仔活獭兔仔兔(P＝0.04)；而FSH2的GG(高产基因型)的母兔比TT(低产基因型)的母兔平均窝产仔数高32克(P＝0.03)。如表2、表3、表4所示，通过Meta分析结果可知，FSH2和FSH31对獭兔的初产仔数和产活仔数无显著效应，但却提高了初生窝重；而FSH30对初产仔数、产活仔数都有显著的影响。

表2初产仔数的Meta分析结果

表3产活仔数的Meta分析结果

表4初生窝重的Meta分析结果

表5列出了申请人所在的实验兔场2014-2016年母兔繁殖性能的记录(平均值±标准差)：

表5实验兔场2014-2016年母兔繁殖性能记录

由表5可知，2016年比2014和2015年的初产仔数平均高0.2只，产活仔数2016年比2015年高0.2只，2014年比2015年高0.1只，初产窝重2016年比2015年高6.3克，2014年比2015年高28克，差异均不显著。比较可知传统选育方法对初产仔数的提高不明显，初生窝重甚至随着产仔数的提高有下降的趋势，而采用分子标记辅助选择高产基因型，选择效率要高于传统选择方法。

经济效益测算

以一个中等规模的兔场为例，养殖500只能繁基础母兔。假设每只母兔每年配种3次，平均每胎产6只仔兔，按每只商品兔的市场价格为100元计算，出栏率为85％，配种受胎率为80％，则该兔场每年的毛利润为500只基础母兔×0.8×6只仔兔/胎×3胎×0.85×100元＝612000元。若采用标记辅助选择筛选高产基因型的母兔，则每胎产活仔数比原来提高0.5只仔獭兔，利润为500只基础母兔×0.8×6.5只仔兔/胎×3胎×0.85×100元＝663000元，比未采用标记辅助选择每年提高净利润51000元。同时还要考虑高产基因可稳定遗传到下一代，保证了高产仔数的稳定性和兔场收益的稳定性，具有一定的实用和推广价值。

本发明的应用范围

①本发明中的方法可用于獭兔养殖过程中高产母兔的辅助选择。

②本发明开发出的3个分子标记对高产獭兔的选择需结合育种值进行。

③本发明开发的3个分子标记中，FSH30(FSHβ：2908G>A)与初产仔数和产活仔数有关，FSH2(FSHβ：284G>T)和FSH31(FSHβ：2908G>T)与初产窝重有关。

本发明的通过对控制哺乳动物卵泡发育和排卵的主效基因卵泡刺激素(FSHβ)进行序列分析和SNP标记的鉴定和筛选，在獭兔群体中分别对筛选获得的对獭兔繁殖性状(初产仔数、产活仔数、初产窝重、21日龄活仔数等)具有显著效应的SNPs进行验证，同时采用循证医学中的经典方法整合分析法(Meta-Analysis)对不同群体相同SNP标记的效应进行综合分析和判断，最终开发出能够提高獭兔繁殖性能的分子标记，有效的弥补和解决了传统育种方法准确性差、周期长、成本高的缺陷和问题。本发明中的方法简单易行、成本低廉、技术成熟、准确率达90％以上，可作为獭兔繁殖性状选种的有效标记，与传统的系谱+表型+育种值的方法配合使用，可有力的提高獭兔种母兔选育的效率。

Claims (4)

1.一种利用SNPs辅助选择高产仔数獭兔的方法，其特征在于：其利用FSHβ基因内的特定SNP突变对高产仔数獭兔母兔进行选择，包括以下步骤：

S1、组建目标獭兔母兔群体；

S2、采集目标獭兔母兔群体中所有母兔耳组织并提取DNA；

S3、确定DNA中的目标SNP位点并采用Snapshot微测序方法对目标SNP位点进行基因型分型；

S4、根据育种目标挑选特定基因型的母兔；

S41、选择高产仔数和产活仔数的母兔时，挑选FSH30位点基因型为AA的母兔，同时淘汰基因型为GG的母兔；

S42、选择初生窝重较高的母兔时，挑选FSH2位点基因型为GG的母兔，淘汰FSH2位点基因型为TT的母兔；同时挑选FSH31位点基因型为GG的母兔，淘汰FSH31位点基因型为AA的母兔；

S5、结合育种值综合排序，配种产生后代。

2.如权利要求1所述的利用SNPs辅助选择高产仔数獭兔的方法，其特征在于：所述步骤S1中组建参考群体时亲本F0代为任意需要进行选种的獭兔群体。

3.如权利要求2所述的利用SNPs辅助选择高产仔数獭兔的方法，其特征在于：所述步骤S3中确定DNA中的目标SNP位点包括以下步骤：

S31、在DNA中进行FSHβ基因引物设计并在目标群体内随机选择若干只海狸色獭兔和若干只白色獭兔进行全长扩增；

S32、采用软件DNAMAN进行基因信息比对，获得全部SNPs；

S33、根据全部SNPs所在的位置和杂合程度进行选择，确定目标SNP位点。

4.如权利要求3所述的利用SNPs辅助选择高产仔数獭兔的方法，其特征在于：所述步骤S33中在全部SNPs中选择目标SNP位点包括以下步骤：

S331、选择的目标SNP位点位于目标基因的外显子内；

S332、选择的目标SNP位点在小群体中分型的标记杂合度≥50％；标记杂合度的计算公式为：

其中，p_i为目标位点的等位基因频率。

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