CN103305599B - 一种牛csrp3基因单碱基突变的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种牛CSRP3基因单碱基突变的检测方法，包含CSRP3基因的待测秦川肉牛和中国荷斯坦奶牛全基因组DNA序列为模板，设计CSRP3基因特异性引物，在PCR反应程序下进行扩增，扩增后的特异性PCR产物经检测出现目的带时，直接用限制性内切酶HhaI消化，然后再进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果鉴定了秦川肉牛和中国荷斯坦奶牛CSRP3基因第14832位的单碱基突变情况。该检测方法操作简单易行，成本低，时间短，重复性高，检测结果准确，极容易判型，便于推广应用。

Description

一种牛CSRP3基因单碱基突变的检测方法

技术领域

本发明属于分子生物学和生物信息学领域，具体涉及基因单碱基突变的检测。

技术领域

本发明属于分子生物学和生物信息学领域，具体涉及基因单碱基突变的检测。

背景技术

目前，在家畜的遗传育种中，应用分子标记的现代育种技术是加快良种选育和提高种群遗传品质，从而增加家畜生产性能先进的有效的方法。应用分子标记育种首先是在DNA水平上筛查和检测牛经济性状密切相关的遗传标记；其次是建立其基因多态性的快速检测方法；然后实现遗传标记辅助选择和实现早期诊断选择。

    SNP的检测方法有很多种，大多数方法以聚合酶链式反应为主要基础，利用碱基差异造成的DNA片段的各种差异来进行SNP检测和分析，如下所述：（1）单链构象多态性。实验证明300 bp以下的DNA片段中的单碱基突变，单链构象多态性检测方法检出率几乎100%，但300bp以上的片段检出率则不高，甚至还会出现漏检的情况；此外，其操作繁琐，需要特殊仪器；所用试剂包含有硝酸银和甲醛，易对人体健康造成危害；PCR产物电泳之前需进行特殊处理；电泳温度高低和凝胶浓度大小等均可影响其灵敏度的高低；实验重复效果不好。（2）创造酶切位点PCR法。其关键环节在于错配引物的设计，引物只能固定在突变位点的邻近序列设计。创造酶切位点PCR法稳定性高，结果准确，但是由于人为地引入了错配碱基，与正常引物相比，其扩增难度很高，扩增效率大大降低，将会直接影响到酶切的结果。(3)综上所述，以上方法均不是一种检测SNPs的理想的遗传标记方法。限制性片段长度多态性，此检测方法结合PCR产物直接测序法，检测单碱基突变的效率可以达到100%。此方法的关键是使用PCR将编码区域的序列在不同个体当中进行扩增，扩增的产物进行测序，测序结果与原来序列进行比对分析，以准确确定碱基突变的位置。PCR-RFLP具有快速，准确，方法简便，重复性高，成本低廉的优点，大量样本的分析可以用此种方法。

CSRP家族成员在肌肉生长发育过程中均起重要作用。研究表明CSRP3基因（又叫肌肉特异性LIM蛋白（muscle LIM protein，MLP）仅在肌中表达，且其表达与肌分化过程相一致，是一个肌发生的正调节因子(Arber et al., 1994）。另有研究表明，CSRP3基因编码产物MLP可以通过一种物理的方式与肌肉组织基本的螺旋一环一螺旋(bHLH)转录因子发生作用，这种作用具有高度的特异性，即MLP不与非肌源性bHLH蛋白或成肌增强因子2发生作用(Kong et al., 1997 )。MLP可能以共激活因子的形式促进肌源性bHLH蛋白与特定DNA调控元件的结合(Kong et al., 1997 )。由此，我们推测该基因可能对牛肌肉生长发育产生影响，值得深入研究。但是到目前为止，有关牛CSRP3基因的研究尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种牛CSRP3基因单碱基突变的检测方法，该检测方法操作简单易行，成本低，时间短，重复性高，检测结果准确，极容易判型，便于推广应用。

为了实现上述发明目的，本发明是通过以下技术方案来实现，该方法包括以下步骤：

（1）根据牛CSRP3基因在基因组序列中的位置，设计一对基因特异性引物；

所述的一对基因特异性引物如下：

上游引物CSRP3-GSP-F：  5'- CACAGGTCAGGAATCAAAG -3'  19bp；

下游引物CSRP3-GSP-R：  5'- GCAAAGGTCAAACAATAGG -3'  19bp。

（2）以包含牛CSRP3基因的DNA序列为模板进行PCR扩增；

所述PCR反应体系为15 μL，其中包括2×Reaction Mix 7.5 μL，ddH₂O 6.1 μL，上游引物CSRP3-GSP-F 0.3 μL，下游引物CSRP3-GSP-R 0.3 μL，Golden DNA polymerase 0.3 μL，含CSRP3基因序列的DNA模板0.5 μL。

以上各成分混匀后，进行分装，每管总体积15 μL。放入PTC-200 PCR扩增仪进行PCR反应，PCR程序为：95℃预变性5 min，94℃变性30 s，60℃退火40 s，72℃延伸40 s，共计36个循环，72℃充分延伸10 min，最后16℃保存待用。

（3）通过琼脂糖凝胶电泳检测牛CSRP3基因单碱基突变，当在PCR产物中加入限制性内切酶HhaI进行消化后，经琼脂糖凝胶电泳进行片段大小分离与鉴定，电泳结果发现3种不同条带，分别对应着3种不同基因型（野生纯合基因型AA，突变纯合基因型GG，杂合基因型AG）。随后，挑取不同带型送测序验证，利用生物信息学方法，将测序结果与NCBI公布的序列进行比较，发现该CSRP3基因第2外显子区域即第14832位发生了A＞T突变。电泳结果与测序结果相一致。

步骤（3）所述的检测牛CSRP3基因单碱基突变的PCR-RFLP方法，所述的琼脂糖凝胶浓度为3%。

本发明的技术方案还在于采用了一种牛CSRP3基因单碱基突变检测方法的应用，所述的检测方法可用于牛的辅助选择和良种选育。通过将不同基因型与牛的不同性状进行关联分析，从而确定基因与性状的对应关系，用于牛的良种选育。

步骤（5）所述的不同性状包括包括生长和胴体性状。

本发明的检测方法先用PCR扩增，然后用限制性内切酶HhaI直接消化PCR产物，消化后的产物直接跑琼脂糖凝胶电泳。根据电泳结果，挑取不同带型送测序验证，便可鉴定秦川肉牛和中国荷斯坦奶牛CSRP3基因第14832位的单碱基突变情况。该检测方法操作简单易行，成本低，时间短，重复性高，检测结果准确，极容易判型，便于推广应用。

附图说明

图1为牛血液基因组DNA电泳检测图。

图2为牛CSRP3基因第2外显子区域607 bp PCR产物2%琼脂糖凝胶电泳图。

图3为秦川肉牛CSRP3基因第2外显子区域607 bp PCR产物经HhaI酶切消化后的3%琼脂糖凝胶电泳图。

图4为中国荷斯坦奶牛CSRP3基因第2外显子区域607 bp PCR产物经HhaI酶切消化后的3%琼脂糖凝胶电泳图。

图5为牛CSRP3基因第2外显子区域即g. 14832位碱基突变位点野生纯合AA基因型测序结果图。

图6为牛CSRP3基因第2外显子区域即g. 14832位碱基突变位点杂合AG基因型测序结果图。

图7为牛CSRP3基因第2外显子区域即g. 14832位碱基突变位点突变纯合GG基因型测序结果图。

图8为牛CSRP3基因第2外显子区域即g. 14832位碱基突变位点的DNA序列分析。

下面结合附图说明和发明人给出的最佳实施方式对本发明做进一步的详细说明，本发明的实施例部分包括实施例，验证实施例，应用实施例，各实施例是为了更清楚的说明本发明，以使公众对发明内容从整体上得到充分的理解，而并非对本发明保护范围的限定。

具体实施方式

以下实施例中所用的主要试剂来源：

一、常用试剂和溶液的配制

试剂和溶液的配制方法具体如下：

（1） ACD抗凝剂

柠檬酸2.4 g，柠檬酸钠6.6 g，葡萄糖7.35 g，加水定容至50 mL蒸馏水中，采集血样时，在新鲜血液中按一定比例加入ACD。

（2） PBS缓冲液

NaCl 4 g，KCl 0.1 g，Na₂HP0₄ 0.72 g， KH₂P0₄ 0.12 g，加灭菌过的蒸馏水定容至500 mL，用pH试纸调pH至7.4，120℃高压灭菌20 min。

（3）DNA抽提液

分别量取1 mmol/L Tris·Cl 100 mL，5 mmol/L NaCl 40 mL，0.5 mmol/L EDTA 400 mL，10%十二烷基磺酸钠100 mL，定容至1000 mL。pH值用NaOH调为8.0。

（4）蛋白酶K

加5 mL灭菌蒸馏水，稀释成20 mg/mL，放入-20℃保存备用。

（5）70%乙醇

无水乙醇350 mL，加蒸馏水150 mL定容至500 mL。

（6）10×TBE缓冲液

称取Tris 54 g，硼酸27.5 g， EDTA·Na₂ 3.72 g，加热混匀，保存备用。

二、软件工具

（1）引物设计软件

Primer Premier 5.0软件自行设计上下游引物；

（2）序列分析软件

DNA Star 7.10软件进行序列比对和突变位点分析；

（3）统计分析软件

EXCELL 用于数据统计；SPASS 17.0进行各性状指标的统计和分析，以及差异显著性检验。

实施例1：牛血液样本采集和DNA提取以及构建混合DNA池

一、牛血液样本采集

2008年9月至2012年6月，分别在陕西省秦宝牧业发展有限公司和西安草滩奶牛场采集血样，先后共采集秦川肉牛血样404份，中国荷斯坦奶牛血样150份。50 mL全血中加入1.5 mL的ACD抗凝剂，混匀后置于冰盒中带回实验室，存放于-80℃保存。

二、牛血液基因组DNA提取

血液基因组DNA提取过程具体步骤如下：

（1）将血样在半冻融状态下，吸1000 μL血液于2 mL的灭菌离心管中；

（2）再向灭菌管中加入PBS缓冲液1000 μL，使总体积达到2000 μL，轻摇10 min；之后4℃，12000 rpm离心10 min；

（3）弃上清，重复上面的步骤2-3次，直到上清液变清亮；

（4）分别加DNA抽提液800 μL，蛋白酶K 15 μL，混匀后，放入恒温水浴箱中56℃过夜消化蛋白质等，当溶液变得澄清透明时，便可拿出；

（5）加入1000 μL 的Tris饱和酚，放在冰上温和摇动10 min；之后 4℃，12000 rpm离心10 min；用移液器小心吸取上清液到灭菌离心管中；

（6）加入500 μL 的Tris饱和酚和500 μL 的氯仿，放在冰上温和摇动10 min；之后4℃，12000 rpm离心10 min；用移液器小心吸取上清液到另一个灭菌的离心管中；

（7）加入1000 μL 的氯仿，放在冰上温和摇动10 min；之后4℃，12000 rpm离心10 min；用移液器小心吸取上清液到另一个灭菌的离心管中；

（8）加入2倍体积的无水乙醇，上下颠倒数次使DNA析出；之后4℃，12000 rpm离心10 min，弃去乙醇；

（9）加入70%的乙醇1 mL，温和摇动10 min；之后4℃，12000 rpm离心10 min，重复漂洗一次；

（10）室温下让乙醇挥发干净，加入一定量灭菌水溶解DNA，完全溶解后测定浓度和纯度。

三、紫外分光光度计测定DNA浓度和纯度

以80 ng/μL作为标准DNA浓度，若测得的DNA浓度在80 ng/μL左右，说明DNA浓度符合实验要求；浓度过高的需要稀释成标准浓度；浓度过低的需重新提取DNA。

若A₂₆₀ nm /A₂₈₀ nm比值在1.6～2.0之间时，可判定DNA的纯度基本符合要求。若A₂₆₀ nm /A₂₈₀ nm比值小于1.6或者大于2.0时，可判定纯度不符合要求。必须对样品DNA做进一步的纯化，或重新提取DNA。

四、琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA的质量

（1）称取0.5 g 的琼脂糖，转入三角瓶中，再加入1×TBE 20 mL 使其悬浮，微波炉加热60秒，待溶液沸腾呈透明状时拿出。

（2）将液体倒入制胶板中，插上梳子，待琼脂糖完全冷却凝固，拔掉梳子，将凝胶移入电泳槽中。

（3）向电泳槽中加入1×TBE缓冲液，使液面高出胶面5 mm。

（4）取DNA样品5 μL ，加3 μL 上样缓冲液后，混匀上样。

（5）120 V电压电泳30 min。

（6）在凝胶成像系统上观察，如果电泳条带清晰而规则，没有明显拖尾现象，说明提取的DNA效果较好，可以满足实验需要，否则需重新提取相应样品的DNA。

五、构建混合DNA池

本发明的详细DNA池构建方法如下：将提取的基因组DNA，用紫外分光光度计测量每个DNA样品浓度各3次，取平均值，再将样品稀释到终浓度为80 ng/μL，20个DNA样品中各取2 μL快速构建成DNA池。以池中DNA样品为模板进行PCR扩增，并送去测序，快速筛查基因的SNPs。

结果：牛血液基因组DNA的电泳检测结果见图1。

实施例2：牛CSRP3基因第2外显子的PCR扩增

一、引物设计

以NCBI数据库中GenBank公布的牛（登录号：AC_000186.1）序列为参考，利用Premier 5.0软件设计牛CSRP3基因第2外显子的PCR引物，其引物序列如下：

上游引物CSRP3-GSP-F：  5'- CACAGGTCAGGAATCAAAG -3'  19bp；

下游引物CSRP3-GSP-R：  5'- GCAAAGGTCAAACAATAGG -3'  19bp。

该引物对扩增了牛CSRP3基因整个第2外显子区域，片段大小为607 bp。

二、PCR扩增

（1）PCR反应体系

PCR反应体系采用混合加样法，实验中我们通常是先计算出每一种成份所需要的量，然后再算出加样总量，之后等量分装到每一个PCR管，然后加

入模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增。PCR反应体系如表1。

表1  PCR反应体系

成分	体积
		2×Reaction Mix	7.5 μL
ddH2O	6.1 μL
		引物上游	0.3 μL
引物下游	0.3 μL
		Golden DNA polymerase	0.3 μL
个体或混合DNA模板	0.5 μL
		总体积	15 μL

（2）PCR反应程序

95℃预变性5 min，94℃变性30 s，60℃退火40 s，72℃延伸40 s，共36个循环，72℃充分延伸10 min，最后16℃保存待用。PCR反应程序见表2。

表2  PCR反应程序

步骤	温度	时间
			预变性	95℃	5 min
变性	94℃	30 s
			退火	60℃	40 s
延伸	72℃	40 s
			充分延伸	72℃	10 min
保存待用	16℃	For ever

结果：PCR扩增结果见图2。图2为牛CSRP3基因第2外显子区域607 bp PCR产物2%琼脂糖凝胶电泳图。从左至右方向，泳道1表示Marker I（自上而下分别代表600 bp～100 bp）；泳道2～8为607 bp PCR产物。

电泳结果表明：PCR片段的大小为607 bp，与预期理论设计的片段大小完全一致。因此，成功扩增出牛CSRP3基因第2外显子区域DNA片段。

实施例3：生物信息学分析

（1）测序验证

分别以个体和混合DNA池中DNA为模板进行PCR扩增，PCR产物点样于1%的琼脂糖凝胶，120 V电压电泳30 min，核酸燃料染色，然后进行切胶回收，回收后的产物送南京金斯瑞生物科技公司进行正向测序，测序使用的是ABI 3730型全自动序列分析仪。

（2）筛查突变位点

根据个体和混合DNA池模板测序后的峰图结果，以NCBI数据库中GenBank公布的牛AC_000186.1序列为参考，利用DNA Star 7.10软件将测序后序列与公布的参考序列进行DNA序列比对和突变位点分析，结果筛查到在基因组第14832位发生一处单碱基A>G突变，突变的具体位置见图8。（图8为牛CSRP3基因第2外显子区域即g. 14832位碱基突变位点的DNA序列分析。图中的下划线部分分别表示上下游引物F和R；灰色阴影部分为完整的第2外显子区域；方框显示的是g. 14832位 A>G碱基突变位点。）为进一步验证碱基突变位点的变异情况，在404头秦川肉牛群体和150头中国荷斯坦奶牛群体中均进行了下一步的应用验证。

实施例4：牛CSRP3基因g. 14832位的HhaI限制性内切酶消化

利用实施例2中的引物和PCR扩增条件，对实施例1中秦川肉牛的404份和150份中国荷斯坦奶牛基因组DNA进行PCR扩增，共获得554份个体的牛CSRP3基因中包含g. 14832 A>G突变位点的DNA片段，然后利用如下方法进行HhaI限制性内切酶消化，具体方法如下：

（一）PCR产物进行HhaI限制性内切酶消化

（1）HhaI酶切消化体系

酶切前，先随机进行小样本PCR扩增产物的抽检，目的是通过随机抽检的方式，检验PCR产物是否扩增出目的片段。

其次，在PCR产物中加入酶切反应各个组分，进行酶切消化反应，酶切体系如下：

表3  HhaI限制性内切酶消化体系

组分	体积
		HhaI	1 μL
10×M Buffer	2 μL
		PCR产物	≤1 μg
灭菌水	up to 20 μL
		总体积	20 μL

（2）酶切反应

    将（1）中各成分混匀后，瞬时离心，放入37℃隔水式培养箱中反应1小时。1小时后向PCR管中添加10×Loading Buffer（使用时添加反应液量的1/10），即可停止反应，进行电泳。

（3）酶切产物的琼脂糖凝胶电泳

A. 装板

事先将制胶板和梳子清洗干净，晾干备用。

B. 配胶

根据不同长度的PCR扩增片段配制适合浓度的胶。最适合的胶浓度是经过多次的摸索条件得来的，根据实验经验，此实验中607 bp长度的片段适合的胶浓度为3%。

    称取琼脂糖0.9 g，倒入三角锥形瓶中，同时加入1×TBE缓冲液 30 mL;之后，将三角锥形瓶放入微波炉中加热1 min至完全沸腾状态， 随后待温度降至60度左右时加入核酸染料3 μL。

   C.倒胶

倒胶时，注意不能产生气泡，如果产生气泡用白枪头挑破或将气泡挑至制胶板的四周，之后立即插上梳子，要保证梳子齿和液面接触处没有气泡，一旦产生气泡要拔出重插。

D. 静置

静置水平桌面上15 min左右使之充分凝固。

E.准备电泳

琼脂糖凝固后即可拔出梳子，拔梳子时要用力均匀以保持胶孔的整齐。将琼脂糖放入电泳槽中固定好，倒入1×TBE电泳缓冲液需高出胶面5 mm，速度要慢，以免梳子孔中进入气泡，产生的大气泡会使电泳条带弯曲。

F. 点样

用微量加样器把酶切消化产物按顺序加到点样孔中。由于边缘效应带型不整齐，每块板中最边上的两个孔最好不要点样。

G. 电泳    

电压调至120 V，室温电泳30 min。

（二）凝胶成像系统照相分析

利用北京伯乐公司T2A型凝胶成像系统照相分析，并做好记录和带型统计。

牛CSRP3基因的g. 14832位碱基发生A＞G突变时，PCR扩增产物经HhaI酶切消化后产生不同的带型。由于牛为二倍体，所以牛基因组的CSRP3基因的第14832 位发生碱基突变后的琼脂糖凝胶电泳结果为：如图3所示，

从左至右方向，泳道1～7，10～11为野生纯合AA基因型；泳道8～9为杂合AG基因型；泳道12为突变纯合GG基因型；泳道13代表Marker I。图4中，从左至右方向，泳道1～12为野生纯合AA基因型个体的酶切产物；泳道13代表Marker I。

验证实施例：不同带型个体PCR产物的测序验证

利用ABI 3730型测序仪对不同带型个体的PCR产物进行正向测序，测序结果如图4所示。箭头的指示位置表示基因组第14832位碱基；图5表示野生纯合AA基因型测序结果；图6表示杂合AG基因型测序结果；图7表示突变纯合GG基因型测序结果。

应用实施例1：牛CSRP3基因g. 14832位点的基因型频率统计分析

根据实施4中的酶切电泳结果，统计秦川肉牛和中国荷斯坦奶牛共计554个体在g. 14832位点的基因型频率，统计结果如下：

表4 牛CSRP3基因g. 14832位点的基因型频率统计分析

应用实施例2：不同基因型与生长和胴体性状的关联分析

生长指标包括：体高，体斜长，腰角宽；胴体性状指标包括：空腹24 h宰前活重，胴体重，屠宰率；此数据资料在秦川肉牛屠宰前，由本实验室人员进行当天测量并记录。测量工具为测杖、卷尺和钢尺。

关联分析结果见表5，实验采用SPSS 17.0软件对不同基因型与各性状指标进行统计和分析，以及差异显著性检验。

表5 牛CSRP3因不同基因型与生长和胴体性状的关联分析

  注：A，B同一行中肩标字母相同者表示差异不显著（P>0.05），不同字母表示差异极显著（P<0.01）；

      a，b同一行中肩标字母相同者表示差异不显著（P>0.05），不同字母表示差异显著（P<0.05）。 

关联结果表明，在体高和体斜长两个生长性状指标上，3种基因型之间无显著差异（P>0.05）；腰角宽指标上，AG基因型个体与GG基因型个体达到差异显著水平（P＜0.05）。在胴体性状中，空腹24 h宰前活重指标上，不同基因型之间未达到统计学的差异显著水平（P>0.05）；胴体重上，GG基因型个体与AA、AG基因型个体达到了统计学的极显著水平（P＜0.01）；屠宰率指标上，AA型个体与GG型个体达到了统计学的极显著水平（P＜0.01），AG型个体与GG型个体达到了统计学的显著水平（P＜0.05）。在这几项指标中，GG基因型个体的各指标平均数值普遍地高于其它2种基因型，这说明GG基因型在整个秦川牛群体中处于优势地位，是优势基因型，所以在牛的发育早期，我们应尽可能的多选GG基因型个体留作种用，使整个牛群具有良好的生长发育状况和较好的胴体品质，从而加快具有优质经济性状牛种群的建立。

序列表

 

Claims (1)

1.一种牛CSRP3基因单碱基突变的检测方法，其特征在于，以包含CSRP3基因的待测秦川肉牛和中国荷斯坦奶牛全基因组DNA序列为模板，设计CSRP3基因特异性引物，在PCR反应程序下进行扩增，扩增后的特异性PCR产物经检测出现目的带时，直接用限制性内切酶HhaI消化PCR产物，然后再进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果发现3种不同条带，分别对应着3种不同基因型，挑取不同带型送测序验证，利用生物信息学方法，将测序结果与NCBI公布的序列进行比较，发现该CSRP3基因第2外显子区域即第14832位发生了A＞T突变；

    所述的牛CSRP3基因特异性引物为：

上游引物CSRP3-GSP-F：  5'- CACAGGTCAGGAATCAAAG -3'  19bp；

下游引物CSRP3-GSP-R：  5'- GCAAAGGTCAAACAATAGG -3'  19bp；

所述的PCR 反应体系为：

总反应体系为15 μL，其中包括2×Reaction Mix 7.5 μL，ddH₂O 6.1 μL，上游引物CSRP3-GSP-F 0.3 μL，下游引物CSRP3-GSP-R 0.3 μL，Golden DNA polymerase 0.3 μL，含CSRP3基因序列的DNA模板0.5 μL；

所述的PCR反应程序为：

95℃预变性5 min，94℃变性30 s，60℃退火40 s，72℃延伸40 s，共36个循环，72℃充分延伸10 min，最后16℃保存待用。

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