KR101864704B1

KR101864704B1 - 북방전복 유래의 GnRH 유전자 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101864704B1
Application number: KR1020160109871A
Authority: KR
Inventors: 이정식; 손영창; 김재원
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2016-08-29
Filing date: 2016-08-29
Publication date: 2018-06-05
Also published as: KR20180024184A

Abstract

본 발명은 북방전복 유래의 GnRH 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에서는 북방전복의 성선자극호르몬방출호르몬(GnRH, gonadotropin releasing hormone) 유전자를 특이적으로 검출할 수 있는 특이 프라이머 세트를 이용하여 전복의 성숙 발달 정도의 판별이 가능한 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명으로부터 확보된 전복의 성숙지표를 이용하여 종묘생산에 적합하며 최고의 성숙도에 달한 건강한 어미를 선별하고 이들로부터 완전히 성숙된 알을 확보함으로써 건강한 전복 치패의 대량 생산이 가능할 것으로 판단되어, 관련 산업에 매우 유용할 것으로 기대된다.

Description

북방전복 유래의 GnRH 유전자 및 이의 용도{GnRH gene from Haliotis discus hannai and uses thereof}

본 발명은 북방전복 유래의 GnRH 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.

척추동물에서는 성숙 관련 내분비 기구가 잘 연구되어 있고, 번식조절 관련 호르몬과 수용체 신호전달 체제는 비교적 상세히 밝혀져 있다. 생식관련 기능은 뇌의 시상하부(hypothalamus)-뇌하수체(pituitary)-생식선(gonad)(HPG) 축을 따라 이루어지며, 성숙촉진, 배란유도, 출산에 이르기까지 다양한 내분비성 호르몬들이 농수축산, 임상 목적으로서도 적절하게 활용되고 있다. 성숙 과정에 관여하는 호르몬과 신경 펩타이드류는 대표적으로 멜라토닌(melatonin), 키스펩틴(kisspeptin), 뉴로키닌 B(neurokinin B), 고나도트로핀 저해 호르몬(gonadotropin-inhibitory hormone, GnIH), 고나도트로핀 방출 호르몬(gonadotropin-releasing hormone, GnRH), 황체형성 호르몬(leteinizing hormone, LH), 난포자극 호르몬(follicle-stimulating hormone, FSH), 그리고 성장인자 인히빈(Inhibin) 등이 있다. 현재까지 전복류의 번식생리학적 성숙 및 신경내분비현상에 관련한 분자생물학적 연구는 열대전복(Haliotis asinina)의 성숙과 관련성이 높을 것으로 생각되는 신경펩타이드 4종(APGWamide, myomodulin, FMRFamide, shistomomin)의 발현변화에 대한 보고에 국한되어 있다.

한편, 전복의 성 성숙 발달지표의 개발은 "건강한 전복 치패 생산"을 위한 성적으로 건강한 어미 전복의 확보에 이용할 수 있다. 2014년 기준으로 우리나라 전복생산량은 비공식적으로 약 7,000억원 규모인데, 전복의 양식과정에서 치패의 사망으로 인한 손실액은 약 900-1,000억원에 이른다. 이러한 막대한 치패의 사망원인 가운데 하나는 전복의 치패가 건강하지 못하기 때문이다. 건강한 전복 치패를 생산하기 위해서는 우선 성숙한 어미로부터 완전히 성숙된 알을 확보해야 한다. 자연에서 전복의 주산란기는 초가을 (9월-10월)인데, 현재 전복 양식현장에서는 인위적인 방법으로 초봄 (3-4월)에 산란을 시킨다. 따라서 산란용 어미 전복은 초가을에 비해 초봄에 성숙도가 낮으며, 미성숙단계의 어미로부터 산란된 미성숙 상태의 알에서 건강하지 못한 치패가 생산되고 있는 실정이다.

한국등록특허 제0806208호에서는 '홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 분류체계 결정 방법과 이와 관련된 폴리뉴클레오티드 프로브, ＤＮＡ 칩 및 키트'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1211068호에서는 '대한민국 남해 어류의 종 판별 방법과 이에 따른 어류의 종 판별용 폴리뉴클레오티드 프로브, ＤＮＡ 칩 및 키트'가 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이, 북방전복 유래의 GnRH 유전자 및 이의 용도에 대해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 전복의 성숙발달 지표자를 개발하고자 시도한 결과, 우선 북방전복의 성숙관련 유전자들 중 성선자극호르몬방출호르몬(GnRH, gonadotropin releasing hormone) 유전자를 새롭게 분리하였고, 상기 유전자를 검출할 수 있는 특이 프라이머 세트를 제작하여 신경절 조직들 (뇌신경절, 측족신경절 및 아가미신경절)과 생식소(난소 및 정소), 아가미, 혈구세포, 외투막, 패각근 및 내장조직들을 생식소 발달 단계(Stage I, 회복기 및 초기성장기; Stage II, 후기성장기; Stage III, 성숙기; Stage IV, 방란기/방정기; Stage V, 퇴행기; Stage VI, 부정형기)별로 샘플링하여 얻은 총 RNA을 대상으로 PCR을 수행한 결과, 암컷 북방전복의 경우, 성숙기 및 방란기(Stage III와 IV)에서 측족신경절과 아가미신경절에서 GnRH 전사체의 발현이 높게 나타났으며, 수컷 북방전복의 경우, 방정기(Stage IV)의 아가미신경절에서 GnRH 전사체의 발현이 현저하게 증가되는 것을 확인하였다. 이를 통해, 본원 발명에서 개발한 GnRH 특이 프라이머를 이용하여 전북의 성숙 발달 정도의 판별이 가능한 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 북방전복(Haliotis discus hannai) 유래의 GnRH(gonadotropin releasing hormone) 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 GnRH 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 북방전복(Haliotis discus hannai) 유래의 GnRH(gonadotropin releasing hormone) 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 물질을 포함하는 북방전복의 성숙 발달 정도를 판별하기 위한 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 북방전복(Haliotis discus hannai)으로부터 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 GnRH(gonadotropin releasing hormone) 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 북방전복의 성숙 발달 정도를 판별하는 방법을 제공한다.

본 발명에서는 북방전복의 성선자극호르몬방출호르몬(GnRH, gonadotropin releasing hormone) 유전자를 특이적으로 검출할 수 있는 특이 프라이머 세트를 이용하여 전복의 성숙 발달 정도의 판별이 가능한 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명으로부터 확보된 전복의 성숙지표를 이용하여 종묘생산에 적합하며 최고의 성숙도에 달한 건강한 어미를 선별하고 이들로부터 완전히 성숙된 알을 확보함으로써 건강한 전복 치패의 대량 생산이 가능할 것으로 판단되어, 관련 산업에 매우 유용할 것으로 기대된다.

도 1은 북방전복의 신경절 (A) 및 생식소 (B)의 적출 및 신경절(CG, 뇌신경절; PPG, 측족신경절; BG, 아가미신경절)의 H-E 염색 (C)을 나타내는 것이다.
도 2는 Hdh - GnRH (prepro-Hdh - GnRH) cDNA의 염기서열과 예측된 아미노산 서열을 나타낸다. 잠정적인 시그널 펩티드(signal peptide) 서열은 실선 밑줄로 표시하였고, 성숙 GnRH 펩티드 영역은 진한 글자체로 네모 박스로 구분된다. RKR 3개의 염기성 아미노산 절단 부위는 이탤릭체로 나타내었고, GAP 서열은 파선형의 밑줄로 표시하였다. *는 종결코돈을 나타낸다. 3'-말단의 polyadenylation 부위는 굵은 실선 밑줄로 표시하였다.
도 3은 북방전복 난소의 성숙 단계별 H-E 염색을 나타내는 것이다. A, 회복기/초기성장기; B, 후기성장기, C, 성숙기; D, 방란기/방정기, E, 퇴행기; F, 부정형기
도 4는 북방전복 정소의 성숙 단계별 H-E 염색을 나타내는 것이다. A, 회복기/초기성장기; B, 후기성장기, C, 성숙기; D, 방란기/방정기, E, 퇴행기; F, 부정형기
도 5는 성숙 전복 난소 (A)와 정소 (B) 발달 단계 (Stage III와 IV)에서의 다양한 전복조직의 GnRH 유전자 발현 변화를 실시간중합효소반응법 (RT-PCR)으로 나타내는 것이다. cDNA 추출 조직의 보정을 목적으로 RPL5 유전자를 참고 유전자로 이용하였다. 각각의 수치는 평균±표준오차로 표시하였고 막대 위의 상이한 문자는 유의수준 0.05에서 통계적으로 차이가 있음을 의미한다. CG, 뇌신경절; PPG, 측족신경절, O, 난소; T, 정소; G, 아가미; I, 내장조직; H, 혈구세포; AM, 폐각근; M, 외투막.
도 6은 생식소 성숙 단계별 암컷 (A) 및 수컷 (B) 전복 신경절에서의 Hdh-GnRH 전사체의 발현 변화를 qRT-PCR로 나타낸 것이다. (CG, 뇌신경절; PPG, 측족신경절; BG, 아가미신경절). Stage I, 회복기 및 초기성장기; Stage II, 후기성장기; Stage III, 성숙기; Stage IV: 방란기/방정기; Stage V, 퇴행기; Stage VI, 부정형기

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 북방전복(Haliotis discus hannai) 유래의 GnRH(gonadotropin releasing hormone) 단백질을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 단백질의 단편, 유도체 및 유사체 (analogues)를 포함한다. 본원에 사용된, 용어 "단편", "유도체" 및 "유사체"는 본 발명의 단백질과 실질적으로 같은 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 폴리펩티드를 말한다. 본 발명의 단편, 유도체 및 유사체는 (i) 하나 이상의 보존적(conservative) 또는 비보존적 아미노산 잔기(바람직하게는 보존적 아미노산 잔기)가 치환된 폴리펩티드(상기 치환된 아미노산 잔기는 유전암호에 의해 암호화될 수도, 되지 않을 수도 있다) 또는 (ii) 하나 이상의 아미노산 잔기에서 치환기(들)를 가지는 폴리펩티드, 또는 (iii) 또 다른 화합물(폴리펩티드의 반감기를 연장할 수 있는 화합물, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜)과 결합된 성숙 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드, 또는 (iv) 부가적인 아미노산 서열(예를 들면, 선도 서열, 분비 서열, 상기 폴리펩티드를 정제하는데 사용된 서열, 프로테이노젠(proteinogen) 서열 또는 융합 단백질)과 결합된 상기 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드일 수 있다. 본원에 정의된 상기 단편, 유도체 및 유사체는 당업자에 잘 알려져 있다.

서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 오직 성숙 폴리펩티드만을 암호화하는 코딩 서열; 성숙 폴리펩티드 및 다양한 부가적인 코딩 서열을 암호화하는 서열; 성숙 폴리펩티드(및 임의의 부가적인 코딩 서열) 및 넌코딩 서열을 암호화하는 서열을 포함한다.

용어 "폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드"는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 부가적인 코딩 및/또는 넌코딩 서열을 더 포함하는 폴리뉴클레오티드를 말한다.

또한, 본 발명은 본원에 기재된 것과 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 단편, 유사체, 및 유도체를 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 상기 폴리뉴클레오티드의 변이체에 관한 것이다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 자연적으로 발생하는 대립유전자 변이체 또는 비자연적으로 발생하는 변이체일 수 있다. 상기 뉴클레오티드 변이체는 치환 변이체, 결실 변이체, 및 삽입 변이체를 포함한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 대립유전자 변이체는 폴리뉴클레오티드의 대안(alternative)이며, 이는 하나 이상의 치환, 결실 또는 삽입된 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 변이체에 의해 암호화된 폴리펩티드에서 실질적인 기능 변화를 초래하지는 않는다.

본 발명의 GnRH 단백질은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 북방전복에서 성선자극호르몬방출호르몬(GnRH, gonadotropin releasing hormone)으로서의 활성을 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 GnRH 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 바람직하게는, 본 발명의 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 기재된 서열번호 1의 염기서열과 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%의 동일성을 가지는 서열과 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 특히, 스트린전트 조건하에 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명에서, "스트린전트 조건"은 (1) 0.2 × SSC, 0.1% SDS, 60℃와 같은 더 낮은 이온강도 및 더 높은 온도하에서의 혼성화 및 세척; 또는 (2) 50%(v/v) 포름아미드, 0.1% 소혈청/0.1% Ficoll 및 42℃ 등과 같은 변성제의 존재하에 혼성화; 또는 (3) 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 가지는 단지 2개의 서열 사이에서 발생하는 혼성화를 말한다. 게다가, 혼성화가 가능한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드의 생물학적 기능 및 활성은 서열번호 2 표시되는 성숙 폴리펩티드의 생물학적 기능 및 활성과 동일하다.

본 발명의 북방전복(Haliotis discus hannai) 유래의 GnRH(gonadotropin releasing hormone) 단백질 코딩 유전자는 본 발명을 통해 처음으로 분리되었고, 북방전복의 성숙 발달 정도의 판별에 대한 연관성은 전혀 알려지지 않았다.

본 발명자는 다음과 같은 입증을 통하여 GnRH 단백질 코딩 유전자가 북방전복의 성숙 발달 정도를 판별하기 위한 마커로 이용될 수 있음을 규명하였다.

구체적으로, 북방전복의 성숙관련 유전자들 중 성선자극호르몬방출호르몬(GnRH, gonadotropin releasing hormone) 유전자를 새롭게 분리하였고, 상기 유전자를 검출할 수 있는 특이 프라이머 세트를 제작하여 신경절 조직들 (뇌신경절, 측족신경절 및 아가미신경절)과 생식소(난소 및 정소), 아가미, 혈구세포, 외투막, 패각근 및 내장조직들을 생식소 발달 단계(Stage I, 회복기 및 초기성장기; Stage II, 후기성장기; Stage III, 성숙기; Stage IV, 방란기/방정기; Stage V, 퇴행기; Stage VI, 부정형기)별로 샘플링하여 얻은 총 RNA을 대상으로 PCR을 수행한 결과, 암컷 북방전복의 경우, 성숙기 및 방란기(Stage III와 IV)에서 측족신경절과 아가미신경절에서 GnRH 전사체의 발현이 높게 나타났으며, 수컷 북방전복의 경우, 방정기 (Stage IV)의 아가미신경절에서 GnRH 전사체의 발현이 현저하게 증가되는 것을 확인하였다.

따라서, 북방전복(Haliotis discus hannai) 유래의 GnRH(gonadotropin releasing hormone) 단백질 코딩 유전자를 본 발명자들이 고안한 프라이머를 사용하여 역전사 중합효소반응을 실시함으로써 북방전복의 성숙 발달 정도를 판별할 수 있었다.

본 발명에서, 용어 "북방전복(Haliotis discus hannai) 유래의 GnRH(gonadotropin releasing hormone) 단백질 코딩 유전자의 발현 수준을 측정하는 물질"란 상기와 같이 북방전복의 성숙 발달 정도를 판별하기 위한 마커인 GnRH 단백질 코딩 유전자의 발현 수준을 확인함으로써 마커의 검출에 사용될 수 있는 분자를 의미하며, 바람직하게는 마커에 특이적인 프라이머를 말한다.

GnRH 단백질 코딩 유전자의 발현 수준은 GnRH 단백질 코딩 유전자의 mRNA의 발현 수준을 확인함으로써 알 수 있다. 본 발명에서 "mRNA 발현 수준 측정"이란 북방전복의 성숙 발달 정도를 판별하기 위하여 생물학적 시료에서 GnRH 단백질 코딩 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, mRNA의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명에서는 GnRH 단백질 코딩 폴리뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 북방전복의 성숙 발달 정도를 판별할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 북방전복의 성숙 발달 정도 판별용 조성물은 GnRH 단백질 코딩 유전자에 대하여 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 구체적으로는, GnRH 단백질 코딩 유전자는 서열번호 8 및 9로 표시되는 프라이머이다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 북방전복으로부터 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 GnRH 단백질 코딩 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 북방전복의 성숙 발달 정도를 판별하는 방법을 제공한다.

본 발명의 GnRH 단백질 코딩 유전자의 발현 수준은 GnRH 단백질 코딩 유전자의 mRNA의 발현 수준을 확인함으로써 알 수 있다.

생물학적 시료에서 mRNA를 분리하는 과정은 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있으며 mRNA 수준은 다양한 방법으로 측정할 수 있다.

mRNA 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅, DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 검출 방법들을 통하여, 북방전복 시료에서의 GnRH 단백질 코딩 유전자의 mRNA 발현을 조사하여 북방전복의 성숙 발달 정도를 판별할 수 있다.

mRNA 발현수준 측정은 바람직하게는, 북방전복의 성숙 발달 정도 판별용 마커로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하는 역전사효소 중합효소반응법 또는 DNA 칩을 이용하는 것이다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법은 상기 GnRH 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하여 북방전복의 암컷 및 수컷의 아가미신경절에서 가장 높은 경우 산란기로 판별하는 것일 수 있고, 바람직하게는 북방전복의 암컷의 측족신경절과 아가미신경절에서 가장 높은 경우 성숙기 및 방란기로 판별하고, 북방전복의 수컷의 아가미신경절에서 가장 높은 경우 방정기로 판별하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 본 발명을 실시 예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

생식소 및 신경절 해부 및 적출

성숙 단계의 암/수 전복의 생식소 조직을 적출하고, 신경절 조직에 해당되는 1쌍의 뇌신경절 (CG) 및 측족신경절 (PPG)을 적출한 후, RNA 추출 전까지 -80℃에서 보관하였고, 적출한 조직의 파라핀 섹션을 제작한 후 H/E 염색을 실시하여 조직의 적합성 여부를 판단하였다.

mRNA 추출 및 cDNA 합성

신경절 조직, 즉 CG 및 PPG를 대상으로 RNeasy Mini Kit (Qiagen, USA)를 이용하여 총 RNA를 추출하였다. 성숙 관련 호르몬을 암호화하는 유전자의 클로닝을 위해 SMART RACE(rapid amplification of cDNA ends) cDNA 증폭 키트 (Clontech, USA)를 사용하여 추출된 총 RNA로부터 첫번째 가닥 cDNA를 합성하였다.

성숙관련 호르몬 분자 클로닝

전복이 속하는 복족류의 성숙관련 유전자들 중 성선자극호르몬방출호르몬(GnRH, gonadotropin releasing hormone) 유전자의 총 서열의 길이를 밝히고자, 북방전복 (Haliotis discus hannai)과 동종인 H. laevigata (GenBank accession No. KP719129)의 이미 알려져 있는 GnRH mRNA 부분 서열을 기반으로 정방향 (F) 및 역방향 (R) 프라이머를 제작하였고, CG 및 PPG 첫번째 가닥 cDNA을 주형으로 LA Taq DNA 중합효소 (Takara Bio, Japan)로 PCR 반응을 실시하여 북방전복의 GnRH 유전자의 부분 염기 서열을 확인하였다. 이 서열을 기반으로 유전자 특이적 F/R 프라이머를 제작하고 Universal Primer A Mix (UPM; Clontech)와 함께 CG 및 PPG의 첫번째 가닥 cDNA를 주형으로 5'-/3'-RACE PCR를 실시하였다. 그 결과 총 868 뉴클레오티드 (nt) (poly(A)-tail은 포함되지 않음)의 GnRH를 암호화하고 있는 cDNA를 밝혀내었다. 총 길이 GnRH cDNA에는 75 nt의 5'-비번역 영역 (UTR), 306nt의 코딩 서열 (101개의 아미노산에 해당)와 487nt의 3'-UTR이 포함되어 있음을 확인하였다.

연체동물 DB 활용 및 검색

북방전복의 GnRH와 유사한 서열을 가지는 생물군을 확인하기 위해, NCBI 데이터베이스를 대상으로 BLAST 검색을 실시하고, CLUSTALW 프로그램을 이용하여 북방전복의 GnRH를 암호화하고 있는 cDNA의 ORF(open reading frame)과 BLAST 검색을 통해 유사성이 높은 생물군의 GnRH-ORF와 비교분석을 통해 계통수를 조사하고자 하였다. 또한 NeuroPred, SignalIP 프로그램을 이용하여 GnRH neuropeptide의 번역 후의 프로세싱(post-translational processing)에 대한 예측도 병행하였다.

성숙 단계별 전복 시료 확보

성숙 단계별 전복 확보를 위해 강원도 양양군 기사문리 지역에서 매달 채집된 전복을 대상으로 생식소에 대한 H-E 염색을 실시하여 생식소 발달 단계별로 6개의 단계로 분류하였다. Stage I, 회복기 및 초기성장기 (1월~3월); Stage II, 후기성장기 (3월~5월); Stage III, 성숙기 (6월~8월); Stage IV, 방란기/방정기 (9월~10월); Stage V, 퇴행기 (10월~11월); Stage VI, 부정형기 (11월~2월)(Najmudeen 2007, Molluscan Res 27(3): 140-146).

성숙기 (Stage III과 Stage IV)에 속하는 전복에 대해서 조직별 GnRH mRNA의 발현을 확인하기 위해 신경절 조직들 (뇌신경절, 측족신경절)과 생식소, 아가미, 혈구세포, 외투막, 패각근, 내장 조직을 적출한 후 RNA 추출 전까지 -80℃에서 보관하였다. 또한 GnRH mRNA의 주요한 발현 조직인 신경절 조직들 (뇌신경절(CG), 측족신경절(PPG), 아가미신경절(BG))에서의 생식소 발달 단계별 발현 양상을 확인하기 위해 각 단계별 신경절 조직들을 적출하였다.

GnRH 올리고 프라이머 제작 및 프라이머 특이성 확인

Primer Express v3.0 Software (Applied Biosystems)를 이용하여 동정된 북방전복의 GnRH cDNA을 대상으로 북방전복 특이적인 GnRH 올리고 프라이머(Hdh-GnRH-F3와 R3, 표 1)를 제작하였다. 프라이머 선정 기준은 다음과 같다: 프라이머 길이, 18~25bp; 녹는점 (Tm) 63℃; 정방향 및 역방향 프라이머 간의 Tm 차이는 1℃ ; 증폭 길이는 75~250 bp; GC 함량은 40~60%.

참고 유전자(Reference gene) 선정

각 조직에서 추출된 cDNA 레벨의 보정을 위하여 참고 유전자로 전복의 RPL5 유전자를 선정하여 프라이머(Hdh-RPL5-F와 Hdh-RPL5-R, 표 1)를 제작하였다.

실시간중합효소반응 (real-time PCR ) 분석

성숙 관련 GnRH 유전자의 mRNA 발현 양상을 조직별, 성숙단계별로 확인하기 위해 실시간중합효소반응법 (quantitative real time PCR, qRT-PCR)을 실시하였다. RNeasy Kit (QIAGEN, Valencia, CA, USA)를 이용하여 뇌신경절, 측족신경절, 아가미신경절, 생식소, 아가미, 혈구세포, 외투막, 폐각근, 내장조직으로부터 총 RNA를 추출하였다. 게놈 DNA를 제거하기 위해 5X gDNA Eraser Buffer를 42℃에서 2분간 처리하였다. 첫번째 가닥 cDNA 합성은 PrimeScript RT reagent Kit (TaKaRa Bio, Shiga, Japan)를 사용하여 37℃에서 15분간 실시하였다. 실시간중합효소반응은 7500 Real-Time PCR Instrument System (AppliedBiosystem, Boston, USA)을 이용하여 수행하였으며, 반응액 20℃에는 합성된 cDNA (10ng, each), 2x SYBR Premix Ex Taq, 50x Reference Dye II (TaKaRa Bio. Japan) 및 10uM GnRH 올리고 프라이머 세트가 포함되어 있다. PCR은 two-step PCR법을 사용하였고, 50℃에서 2분, 95℃에서 10분 이후, 95℃ 15초, 60℃ 1분간 40회 증폭하였다.

실시예 1. 전복(학명: Haliotis discus hannai ) GnRH ( gonadotropin -releasing hormone) cDNA 분리

1-1. 생식소 /신경절 해부 및 적출

북방전복의 신경계는 신경세포가 모인 다수의 신경절을 이루며, 뇌신경절, 측족신경절, 내장신경절 등으로 구성되어 있다. 적출한 뇌신경절과 측족신경절 및 아가미 신경절의 조직 절편을 만들어 hematoxyline-eosin으로 염색하여 광학현미경으로 관찰하였다(도 1A와 도 1C).

1-2. Hdh - GnRH cDNA 클로닝

5'과 3'-RACE PCR 방법으로 성숙한 북방전복의 측족신경절에서 prepro-Hdh - GnRH cDNA를 동정하였다. 북방전복의 prepro- Hdh - GnRH cDNA를 Hdh - GnRH로 명명하며, Hdh - GnRH는 전장 길이 868 뉴클레이티드 (nt)의 염기로 이루어져 있고, NCBI의 ORF finder tool를 이용하여 번역부위 (CDS, coding DNA sequence)를 예측한 결과, 75 nt의 5' 비번역 영역 (untranslated region, UTR)과 306 nt의 번역 영역 (101개의 아미노산들에 해당됨 : 서열번호 2), 그리고 487 nt로 이루어진 3' 비번역 영역(poly A 말단부위는 제외)을 포함하고 있었다(도 2). SinalP 4.1 server와 NeuroPred 프로그램을 이용하여 Hdh - GnRH 유전 정보에서 예상되는 아미노산 서열을 분석한 결과, 알려진 GnRH 전구체와 유사하게 북방전복의 GnRH 단백질 전구체에는 한 개의 시그널 신호 영역(signal peptide)과 한 개의 GnRH 펩티드 (12개의 아미노산으로 구성)와 한군데의 프로세싱 영역, 한 개의 GnRH-associated peptide (GAP) 영역을 포함되어 있을 것으로 추정되었다.

실시예 2. 실시간중합효소반응법(real-time PCR )을 이용한 전복 GnRH (gonadotropin-releasing hormone) mRNA 발현 조사를 위한 GnRH 특이적 프라이 머 제작

2-1. 성숙 단계별 전복 시료 확보

생식소에 대한 H-E 염색을 실시하여 생식소 발달 단계에 따라 연속적인 6단계 (Stage I~VI)로 분류하였다. 성숙기군 (Stage III과 Stage IV)에 속하는 전복에 대해서 조직별 GnRH mRNA의 발현을 확인하기 위해 신경절 조직들 (뇌신경절, 측족신경절)과 생식소, 아가미, 혈구세포, 외투막, 패각근, 내장 조직을 적출한 후 RNA 추출 전까지 -80℃에서 보관하였다. 또한 GnRH mRNA의 주요한 발현 조직인 신경절 조직들에서의 생식소 발달 단계별 발현 양상을 확인하기 위해 각 단계별 신경절 조직들 (뇌신경절, 측족신경절, 아가미신경절)을 적출하였다.

전복 생식소 발달 단계를 연속적인 6단계로 분류하였으며, 난소 및 정소의 조직 절편을 제작한 후 H-E 염색을 실시한 후 광학현미경으로 관찰하였다. 생식소 발달 단계는 Najmudeen (Najmudeen 2007, Molluscan Res 27(3): 140-146)의 방법을 기준으로 생식세포 형성과정, 생식상피 조직상의 형태 변화, 생식소 내강에 존재하는 미분화 간충직 조직 그리고 생식소 결합조직과 생식상피에 존재하는 황색 과립세포의 출현 빈도 등에 따라 회복기/초기성장기, 후기성장기, 성숙기, 방란기/방정기, 퇴행기, 부정형기로 구분하였다(도 3 및 도 4).

2-2. 북방전복 GnRH 전사체의 조직별 발현 양상

실시간중합효소반응법 (qRT-PCR)으로 성숙기 (Stage III와 IV)의 암컷 및 수컷 전복에서의 대표 조직들 (뇌신경절, 생식소, 아가미, 내장조직, 혈구세포, 폐각근, 외투막)에서의 Hdh - GnRH 전사체의 발현 양상을 조사한 결과, 신경절 조직에서의 발현율이 높았고(도 5), 특히 측족신경절에서 높게 발현되었다(도 6).

2-3. 번식 단계별 북방전복 GnRH 전사체의 발현 양상

qRT-PCR법으로 전복 생식소 발달 단계별 GnRH 전사체의 신경절에서의 발현 변화를 조사하였다. 암컷 전복에서는 특히, 성숙기 및 방란기(Stage III와 IV)에서 측족신경절과 아가미신경절에서 GnRH 전사체의 발현이 높게 나타났으며, 암수 전복의 뇌신경절에서는 발현 변화가 뚜렷하지 않았다(도 6). 흥미롭게도, 방정기 (Stage IV)의 수컷 전복 아가미신경절에서의 GnRH 전사체의 발현이 현저하게 증가되었다. 이러한 결과로부터 전복의 GnRH 전사체는 생식소의 발달 단계 중 특히, 성숙 단계의 신경절 조직에서의 발현이 크게 증가됨이 확인되었고, 향후 전복의 성숙 발달 지표로서의 전복의 GnRH의 활용이 가능할 것으로 판단된다.

PCR 과 실시간중합효소반응법( qRT - PCR )에 이용한 올리고 프라이머

Primer	Sequence(5'- 3')(서열번호)	Application
Hdh-GnRH-F1	GCTGCTGCTCACGGTACATG(3)	Partial PCR
Hdh-GnRH-R1	CTGCATTCTGGCAGCGATGG(4)	Partial PCR
Hdh-GnRH-F2	GGAATCATCTCGTGTGGCCCATCGCTGC(5)	RACE PCR
Hdh-GnRH-R2	CTGGCAGCGATGGGCCACACGAGATG(6)
UPM(F/R)	CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT(7)
Hdh-GnRH-F3	CATACGCACCAAACCACAGAA(8)	Quantitative Real-time PCR (qPCR)
Hdh-GnRH-R3	CGTGCCAGCCGTTGCT(9)
Hdh-RPL5-F	TCACCAACAAGGACATCATTTGTC(10)
Hdh-RPL5-R	CAGGAGGAGTCCAGTGCAGTATG(11)
Note. F, forward; R, reverse; UPM, universal primer A mix

본 발명을 통해, 전복의 성숙 발달 단계별로 GnRH 유전자의 발현양상을 조사함으로써, 전복의 성숙 발달 지표로 활용할 수 있다. 전복의 성 성숙 발달지표의 개발은 "건강한 전복 치패 생산" 위한 성숙 상태가 완전하여 양질의 배우자 생산에 적합한 건강한 어미 전복의 확보에 이용할 수 있다.

<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> GnRH gene from Haliotis discus hannai and uses thereof <130> PN16104 <160> 11 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 306 <212> DNA <213> Haliotis discus hannai <400> 1 atgtcagtac tatcaagaca aggggtgact gtgtcggtgc tgctgctgct gctcacagta 60 cacgctgttg gaggccagaa ctaccacttc agcaacggct ggcacgcagg caggaaacgt 120 ggcggggaca gcaccagctg cgtcttcagg aaagacatcc tcatgcttgt caacaaactg 180 atcatggagg aatcatctcg tgtggcccat cgctgccaga acggagtgcc gcacatggac 240 ttcacagagc ctgacacagt tgaagctgat tctgccaacc agctgacaga caagcgatgg 300 aagtga 306 <210> 2 <211> 101 <212> PRT <213> Haliotis discus hannai <400> 2 Met Ser Val Leu Ser Arg Gln Gly Val Thr Val Ser Val Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Thr Val His Ala Val Gly Gly Gln Asn Tyr His Phe Ser Asn 20 25 30 Gly Trp His Ala Gly Arg Lys Arg Gly Gly Asp Ser Thr Ser Cys Val 35 40 45 Phe Arg Lys Asp Ile Leu Met Leu Val Asn Lys Leu Ile Met Glu Glu 50 55 60 Ser Ser Arg Val Ala His Arg Cys Gln Asn Gly Val Pro His Met Asp 65 70 75 80 Phe Thr Glu Pro Asp Thr Val Glu Ala Asp Ser Ala Asn Gln Leu Thr 85 90 95 Asp Lys Arg Trp Lys 100 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gctgctgctc acggtacatg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ctgcattctg gcagcgatgg 20 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ggaatcatct cgtgtggccc atcgctgc 28 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ctggcagcga tgggccacac gagatg 26 <210> 7 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ctaatacgac tcactatagg gcaagcagtg gtatcaacgc agagt 45 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 catacgcacc aaaccacaga a 21 <210> 9 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 cgtgccagcc gttgct 16 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 tcaccaacaa ggacatcatt tgtc 24 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 caggaggagt ccagtgcagt atg 23

Claims

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북방전복(Haliotis discus hannai)으로부터 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 GnRH(gonadotropin releasing hormone) 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하여 측족신경절 및 아가미신경절에서 발현 수준이 뇌신경절보다 높은 경우 북방전복 암컷의 성숙기 및 방란기로 판별하고, 아가미신경절에서 발현 수준이 측족신경절 및 뇌신경절보다 높은 경우 북방전복 수컷의 방정기로 판별하는 단계를 포함하는 북방전복의 성숙 발달 정도를 판별하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 방법은 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 북방전복의 성숙 발달 정도를 판별하는 방법.
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