JP4866099B2 - 試料中の鶏由来成分の検出方法 - Google Patents

Description

本発明は鶏由来成分の検出方法に関する。より詳細には、食品、飼料などに含まれるおそれのある鶏由来成分をＰＣＲ法で検出する方法及びその際に使用されるプライマーに関する。

食物アレルギーは、食品中に含まれるアレルギー誘発物質の摂取が引き起こす有害な免疫反応であり、皮膚炎、喘息、消化管障害、アナフィラキシーショック等を引き起こす。近年は、このような食物アレルギー患者が増加の傾向を示している。そこで、食物アレルギーの方の適切な食品選択を助けることを目的に、食物アレルギーの原因食品（食品衛生法では特定原材料と呼ばれている）を僅かでも含む加工食品にあっては、平成１４年４月以降、その旨を表示することが食品衛生法により義務付けられた。その中で、表示が義務づけられている原材料は患者数の多いものや重篤な症状を起こす５品目（卵、牛乳、小麦、そば及び落花生）で、それ以外に推奨項目としてアレルギー症状を惹起した実績のある20品目が定められている。鶏肉は推奨20品目の中に含まれている食品である。
鶏肉アレルギーの患者は、鶏だけでなく他の食用鳥類の摂取も避けることがほとんどである。しかし実際には、七面鳥のような他の食用鳥類を食してもアレルギー症状を惹起しない患者もいることが知られている。このような現状を踏まえて考えると、食品検体から鶏由来成分を検出しようとする場合、微量な混入を検出できることに加えて、鶏と他の食用鳥類とが詳細に区別でき、混入物が鶏であることを特定し得るというのは極めて有意義であると考えられる。

食品、飼料などに含まれる鶏由来成分を検出する測定系としては、特異的抗体を用いた抗原抗体反応を利用した方法がある。抗体を用いた系は、蛋白質そのものを検出する系であることや簡易測定法に適用できることなどの利点があるが、反面、抗原の中には熱変性に弱いものがあったり、非常に近縁な動物種同士を区別するのが困難であるという欠点がある。
その点、遺伝子配列を用いたPCR法は、操作に熟練を要する、核酸成分が溶出しにくい検体から検出するのは困難である、といった欠点はあるものの、近縁な動物同士でもわずかな配列の違いを利用して区別することが可能である。

これまでPCR法を用いた鶏由来成分検出方法としては、ミトコンドリアチトクロームb遺伝子を利用した方法（特許文献１）、ATP合成酵素サブユニット8遺伝子を利用した方法（特許文献２）、12SリボゾームRNA遺伝子を利用した方法(非特許文献１)などがある。
特開2003-230383公報 特開2003-164287公報 J. Agric. Food. Chem. 2003,51,1524-1529

上記のように、PCR法を用いた鶏由来成分検出方法が知られているが、それらの方法で、鶏と他の食用鳥類、例えばウズラとの識別が可能であるかは明記されておらず、また各種の地鶏でも検出が可能かなどの検討も行っていない。
そこで、発明者らは、豚、牛、羊などの哺乳動物由来のDNAは増幅されないのみならず、ウズラ、鴨、七面鳥といった他の食用鳥類由来のDNAも増幅されないPCR用プライマーを検討し、鶏ミトコンドリア16SリボゾームRNA遺伝子領域から鶏遺伝子特異的に増幅するDNA配列を選択し、プライマーとすることにより、上記の問題を解消し得ることが分かった。

ところで、食肉加工品においては、その製造過程において、加熱、凍結、高圧処理などが行われおり、また自己消化により、DNAの塩基配列の一部が変性、欠失、置換などを受けていることが多い。PCR産物である増幅DNA断片の増幅サイズは使用するプライマー対によって決まるが、増幅サイズが大きいと、上記塩基配列の変性などによりPCR反応の進行が停止してしまい、十分に増幅できないことがある。前述した従来のPCR法による鶏由来成分の検出方法での増幅サイズは227〜285bpであるが、本発明者らが種々検討した結果、この増幅サイズは大きすぎ、より高精度で測定（検出）するには、増幅サイズを上記サイズより小さくする方が好ましいことが判明した。増幅サイズについて、更に検討したところ、増幅サイズを３０〜２００ｂｐになるようにプライマー対を設定するのが好ましいことが明らかとなった。
本発明は上記の知見に基づいてなされたもので、PCR法を用いた試料中の鶏由来成分の検出方法であって、鶏由来成分を特定的に検出することができる方法、並びにそれに使用されるプライマー及びプライマー対を提供するものである。

上記の課題を解決するためになされた本発明の鶏由来成分の検出方法は、PCR法を用いて試料中の鶏由来成分を検出する方法において、プライマーが鶏のミトコンドリア16SrRNA遺伝子配列に由来する鶏特異的塩基配列からなるプライマー対を使用することからなる。特に、増幅サイズが３０〜２００ｂｐとなるプライマー対を設定するのが好ましい。更に、プライマー対としては、配列番号１〜４に示される塩基配列からなるプライマーの一種と、配列番号５〜８に示される塩基配列からなるプライマーの一種との組み合わせが好適である。
より好ましい検出方法としては、PCR法を用いて試料中の鶏由来成分を検出する方法であって、試料中のDNAを抽出する工程、上記の好適なプライマー対を使用して試料中のDNAを鋳型としてPCR法でDNA断片を増幅させる工程、増幅されたDNA断片を検出する工程を含むことからなる検出方法である。
更に、本発明のプライマーは、上記の方法に使用されるプライマーであって、配列番号１〜８に示される塩基配列からなる鶏由来成分検出用プライマーであり、特に配列番号１〜４に示される塩基配列からなるプライマーの一種と、配列番号５〜８に示される塩基配列からなるプライマーの一種とで構成される鶏由来成分検出用プライマー対が好ましい。

本発明の方法によれば、鶏に由来するDNAのみを特異的に増幅することができるプライマーが使用されているので、鶏由来成分と他の食用鳥類由来の成分とを識別することができ、試料中の鶏由来成分を確実且つ正確に検出することができる。特に増幅サイズが３０〜２００ｂｐとなるプライマー対を使用することにより、加工食品のように加熱、加圧などの処理されたような試料であっても、鶏由来成分を検出できるという効果を奏する。

本発明は前記の構成よりなり、本発明の鶏由来成分の検出方法は、PCR法を用いて試料中の鶏由来成分を検出する方法において、プライマーが鶏のミトコンドリア16SrRNA遺伝子配列に由来する鶏特異的塩基配列からなるプライマー対を使用することからなる。
PCR法を用いて、試料中の鶏由来成分を検出する方法は、前記特許文献１及び２並びに非特許文献１に記載されるように公知である。
本発明においては、上記のPCR法により鶏由来成分を検出する方法において、プライマー対として、鶏のミトコンドリア16SrRNA遺伝子配列に由来する鶏特異的塩基配列からなるプライマー対を使用することに特徴がある。

より具体的には、ミトコンドリアDNAは、一個の細胞におおよそ平均で1000個以上も存在し、組織から大量に採取することができ、分析しやすいという特長があることから、本発明者らは、既存のデータベースより、鶏、ウズラ、鴨及び七面鳥のミトコンドリア塩基配列を検索し、16SリボゾームRNA遺伝子領域において鶏特異的塩基配列で且つウズラ、鴨、七面鳥、牛、豚及び羊には存在しない塩基配列が存在し、当該鶏特異的な塩基配列からなるDNAをPCR用プライマーとすることにより、鶏由来DNA（食用ブロイラー、薩摩地鶏、名古屋コーチン及び烏骨鶏由来DNAを含む）のみが増幅し、ウズラ、鴨、七面鳥、牛、豚及び羊由来DNAは増幅しないことが明らかとなった。そして、そのプライマー対を使用することにより、試料中の鶏由来成分を特異的に検出し得ることが判明した。

また、前述のように、試料が加工食品や飼料のように、その製造工程において、加熱、凍結、加圧などの処理が行われている場合、試料中のDNAは変性している可能性が高い。このような試料においては、PCR産物の増幅サイズが大きいと、DNAの変性した個所で伸長が停止ししてしまい、それ以上伸長しない頻度が高まる結果、DNAの増幅が不足し、目的とするDNAを検出できない場合がある。
本発明においては、このような問題を回避するためには、PCR産物の増幅サイズを３０〜２００ｂｐ程度、より好ましくは４０〜１２０ｂｐ程度、更に好ましくは５０〜１１０ｂｐ程度に調整することが望ましいことが判明した。
PCR産物の増幅サイズは使用するプライマー対の選択により決まるので、増幅サイズが上記の範囲になるようなプライマー対を選択するのが好ましい。

このような知見に基づき、本発明で使用するプライマーの好ましい例として、センスプライマーとしては配列番号１〜４に示される塩基配列からなるプライマーが、アンチセンスプライマーとして配列番号５〜８に示される塩基配列からなるプライマーが挙げられる。従って、好ましいプライマー対としては、配列番号１〜４に示される塩基配列からなるプライマーの一種と、配列番号５〜８に示される塩基配列からなるプライマーの一種との組み合わせが例示できる。

上記のプライマーは、当該配列からなるDNAを常法に準じて、例えばDNA自動合成機を用いて調製することができ、調製されたDNAは必要に応じてHPLCなどの慣用の手段で精製することにより、目的とするプライマーが得られる。

以下、本発明の検出方法を具体的に説明する。
試料としては、食品（例えば生肉、食肉含有加工食品等）、飼料（例えば肉骨粉含有食品）などが挙げられ、特に本発明の方法は、加熱、加圧などの処理がされた加工食品に好適に使用される。

本発明の方法においては、まず試料の脂肪分をできるだけ除去した後、試料をDNA抽出に好適な状態、例えばミンチ状、スラリー状などに調製し、DNAの抽出を行う。当該DNAの抽出は、常法に準じて、Marmur法、塩化ベンジル法、CTAB法などにより行うことができ、また市販の組織細胞ミトコンドリアDNA抽出キットを使用することもできる。

抽出されたDNAサンプルは、常法に準じて、プライマー対として前記のプライマーを用い、サンプル中のDNAを鋳型としてPCRにてDNAを増幅させる。
プライマーの使用量は、特に制限されないが、一般的に約0.4μＭで使用することが好ましい。
また、PCR法に使用されるTaq DNAポリメラーゼとしては慣用のポリメラーゼを使用することができ、例えばGene
Taq、TaKaRa Taq、ExTaq HSなどが例示できる。
PCR条件としては、目的DNAを増幅し得る条件であれば特に限定されないが、例えば98℃で3分熱処理した後、98℃で30秒、69℃（場合によっては71℃）で30秒、72℃で30秒を38サイクル繰り返し、次いで72℃で7分間反応させる方法が挙げられる。

かくして得られたPCR産物は、慣用の方法でDNAの検出が行われる。係る検出方法としては、PCR産物をアガロースなどを使用した慣用のゲル電気泳動に付し、泳動後のDNA断片をエチジウムブロマイド染色、蛍光試薬などで検出する方法が例示される。試料中に鶏由来成分が含まれている場合には、増幅されたDNA断片がゲル上で検出されるので、鶏由来成分の含有を判別することができる。
検出限界は、用いるプライマー対の種類及び組み合わせ、試料の量、PCR条件、検出方法などの種々の条件によって適宜設定することができるが、本発明の方法によれば５ｐｇ程度まで検出することができる。

本発明のプライマーは、配列番号１〜８に示される塩基配列からなる鶏由来成分検出用プライマーであり、また本発明のプライマー対は、配列番号１〜４に示される塩基配列からなるプライマーの一種と、配列番号５〜８に示される塩基配列からなるプライマーの一種との組み合わせからなる鶏由来成分検出用プライマー対である。

本発明の方法は上記の説明に限定されるものではなく、適宜変更して実施することができ、例えば配列番号１〜８に示される塩基配列からなるプライマーは、鶏由来成分を検出し得る限り、当該塩基配列に１又は２以上の塩基が付加したり、１又は２以上の塩基が置換・欠失したものでもよい。

以下、実施例に基づいて、本発明をより詳細に説明するが、本発明は係る例に限定されるものではない。なお、サンプルの調製などは以下のとおりである。
試料の処理・DNA抽出
各試料は、脂肪分を極力除去した後に、ミルサーにかけてミンチ状にした。その後、場合により後記実施例に示される各処理（加熱処理、冷蔵処理など）を実施し、処理した試料をそれぞれ100mgずつ採取し、まず、ホモジナイザーで破砕し、PCR反応のための鋳型DNAの抽出はWizard Genomic DNA purification kit
(Promega)を用いて行った。

PCR条件及び検出条件
PCR反応はEx Taq HS kit (Takara)を用いて行った。具体的な反応方法としては、反応液として、キット添付バッファーにdNTP溶液(dATP, dCTP, dGTP及びdTTP各0.2mM)、センスプライマー(0.4μM)、アンチセンスプライマー（0.4μM）、Ex Taq HS（0.75U）に適当量の鋳型DNAを加えたものを使用し、PCRの反応条件は、本検出が有効に行えるように設定した条件を用いた、詳細には、98℃で3分熱処理した後、98℃で30秒、69℃（場合によっては71℃）で30秒、72℃で30秒を38サイクル繰り返し、次いで72℃で7分間反応させた。
DNAの検出方法としては、泳動ゲルとしてアガロースゲル（タカラバイオ）１％のミニゲルを使用し、泳動条件１００V３０分で泳動した。泳動時には、同時にマーカーとして50bpラダー（Invitrogen製）を泳動し、PCR産物の大きさを確認した。

プライマー及びプライマー対
使用したプライマーは配列番号１〜４（センスプライマー、Ｓ）及び配列番号５〜８（アンチセンスプライマー、ＡＳ）に示される塩基配列からなるプライマーであり、プライマーの組み合わせは、以下の５通りを各実験において選択して用いた。
Ｓ２（配列番号１）−Ａ５（配列番号６）（増幅サイズ293bp）
Ｓ３（配列番号２）−Ａ２（配列番号５）（増幅サイズ51bp）
Ｓ５（配列番号３）−Ａ６ｂ（配列番号８）（増幅サイズ100bp）
Ｓ５（配列番号３）−Ａ５ｃ（配列番号７）（増幅サイズ110bp）
Ｓ６（配列番号４）−Ａ６ｂ（配列番号８）（増幅サイズ199bp）

実施例１（各品種との交差性の確認）
使用鋳型DNAとして、鶏、ウズラ、鴨、七面鳥、羊、牛、豚をそれぞれ50ng含む試料を前記の方法で準備した。使用プライマーは表１の組み合わせで前記記載の反応条件でPCRを行った。その結果を表１に示す。

表１に示されるように、用いた５つのプライマーの組み合わせではすべて鶏特異的な増幅が見られた、また、S3-A2の組み合わせでは、ウズラ、七面鳥及び羊を鋳型にした場合において、特異的増幅（51bp）と違う位置に非特異的増幅が見られたが、結論としては、鶏肉をウズラ、鴨、七面鳥、牛、豚、羊と区別することができ、本発明のプライマーの有用性が確認された。

実施例２（検出限界の確認）
使用鋳型DNAとして、鶏DNAを50ng, 5ng, 500pg, 50pg, 5pg, 500fg含む試料を前記の方法及び段階希釈で準備した。使用プライマーは表２の組み合わせで前記記載の反応条件でPCRを行った。その結果を表２に示す。

表２に示されるように、プライマーと鋳型の相性によって10〜100倍の感度の開きがあった。また、だいたい5〜50pgが最低検出限界であることが判明した。

実施例３（100℃で8時間処理した試料の測定）
使用鋳型DNAとして、鶏肉を100℃で8時間加熱処理した後、DNA抽出し、DNAを、それぞれを50ng, 5ng, 500pg, 50pg, 5pg含む試料を前記の方法及び段階希釈で準備した。使用プライマーは表３の組み合わせで前記記載の反応条件でPCRを行った。その結果を表３に示す。

表３に示されるように、熱処理によって増幅効率が著しく低下したプライマーの組み合わせと余り変化しないプライマーの組み合わせに分かれた。増幅サイズは、S2-A5で299bp、S3-A2で51bp、S5-A6bで100bp、S6-A6bで199bpであり、この結果と増幅サイズの結果を組み合わせると、加熱処理を十分に行ったサンプルを用いた場合、増幅サイズが少ないほど検出感度が良い傾向が見られ、加熱処理による最低検出限界の低下が増幅サイズと相関していた。この結果より、加熱などの処理のされた加工食品のPCR測定には、増幅サイズが３０〜２００ｂｐ程度、より好ましくは４０〜１２０ｂｐ程度、更に好ましくは５０〜１１０ｂｐ程度であることが確認できた。

実施例４（加熱処理及び冷蔵処理）
使用鋳型DNAとして、鶏肉を100℃で30分、60分、2時間、4時間処理又は冷蔵庫内で1日間及び4日間保存した後、DNAを抽出し、DNAを、それぞれを50pg及び5pg含む試料を前記の方法及び段階希釈で準備した。使用プライマーは表４の組み合わせで前記記載の反応条件でPCRを行った。その結果を表４に示す。

表４に示されるように、100℃で各時間処理、冷蔵庫で1〜4日保存後でも十分に増幅が可能であった。

Claims (6)

1. ＰＣＲ法を用いて試料中の鶏由来成分を検出する方法において、プライマーとして、配列番号１〜４に示される塩基配列からなるプライマーの一種と、配列番号５〜８に示される塩基配列からなるプライマーの一種とで構成されるプライマー対を使用することを特徴とする鶏由来成分の検出方法。
2. 増幅サイズが３０〜２００ｂｐとなるプライマー対を使用する請求項１記載の検出方法。
3. ＰＣＲ法を用いて試料中の鶏由来成分を検出する方法であって、試料中のＤＮＡを抽出する工程、請求項１記載のプライマー対を使用して試料中のＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法でＤＮＡ断片を増幅させる工程、増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程を含むことからなる鶏由来成分の検出方法。
4. 増幅サイズが３０〜２００ｂｐとなるプライマー対を使用する請求項３記載の検出方法。
5. 配列番号１〜８の何れかに示される塩基配列からなる鶏由来成分検出用プライマー。
6. 配列番号１〜４に示される塩基配列からなるプライマーの一種と、配列番号５〜８に示される塩基配列からなるプライマーの一種とで構成される鶏由来成分検出用プライマー対。