CN102329862A - 三条可用于溶藻弧菌识别检测的寡核苷酸序列及其制备方法与应用 - Google Patents
三条可用于溶藻弧菌识别检测的寡核苷酸序列及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
三条可用于溶藻弧菌识别检测的寡核苷酸序列及其制备方法与应用，涉及溶藻弧菌的识别检测。寡核苷酸序列包括SEQ ID No.1～3。合成用于筛选的ssDNA寡核苷酸文库(5′-TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TC----N35----GCA CAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG-3′)；将寡核苷酸文库与溶藻弧菌混合后进行SELEX筛选；SELEX筛选完成后对适配子富集文库进行克隆测序；对测序结果中出现的高拷贝ssDNA进行不同长度的截取，得到一系列新的序列，再构建这些新序列的互补序列；对获得的新序列及其互补序列进行亲和特异性的验证，获得相应适配子。
Description
技术领域
本发明涉及溶藻弧菌的识别检测，尤其是涉及三条可用于溶藻弧菌识别检测的寡核苷酸序列及其制备方法与应用。
背景技术
在养殖业中，每年约有10％的水产养殖动物死于感染性病害，其中弧菌感染导致的疾病占了相当大的比重。虽然化学药品和抗生素可控制其感染，但是药物防治常会产生不良后果，如在水产动物体内积累、残留，容易产生耐药菌株和易污染环境等问题，因此建立病原弧菌的快速检测技术，以提早防治病害的发生和流行仍是目前的主要手段。
目前，弧菌的检测方法主要是根据伯杰氏细菌鉴定手册，通过对微生物的生理生化特征检测进行鉴定，由于需要测试的项目较多，因此该方法工作量较大、操作较繁琐。16SRNA的分子生物学方法虽有较高的准确性，但需要提取病原菌的16SRNA，手续较繁琐，且对检测设备有一定要求，难以实现现场的快速检测需要；免疫学方法制备的抗血清虽能实现快速检测，但由于制备的抗血清为多克隆抗体，实际应用中可能会出现假阳性或假阴性，即使采用单克隆抗体，由于制备技术要求较高、周期较长，因此其应用受到限制。
指数富集配体进化技术(Systemic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)，简称SELEX技术，是近年来新发展起来的一种系统筛选技术。它利用寡核苷酸分子可在空间形成多种多样的三维结构，通过构建的随机寡核苷酸库，从中筛选出与目标靶分子有特异识别作用的高亲和力的寡核苷酸分子——适配子，其分子识别能力可达到甚至超过了单克隆抗体的水平，而制备技术则比单克隆抗体简单、快速。运用该技术目前已筛选出肿瘤细胞、炭疽杆菌等的适配子，可用于肿瘤细胞和炭疽杆菌的检测、识别。
溶藻弧菌是一种广泛分布于世界各地海水及河口处的一种病原微生物，其数量居海水类弧菌之首，存在于多种海洋动物中，是鱼、虾、贝等海水养殖动物的条件致病菌，并可引起人食物中毒、耳部发炎等疾病，对公共卫生安全构成十分严重的威胁。因此，运用SELEX技术筛选溶藻弧菌适配子，并将其应用于溶藻弧菌的识别鉴定，能大大提高溶藻弧菌检测的灵敏度和特异性，成为本发明的重点。
本申请人在中国专利201110090419.7中已公开了4条适配子序列，分别如下：
8号适配子：5′-TCAGTCGCTT CGCCGTCTCC TTCAGAGTCG TGGAGAGGGTGAACGGAGGG GGGAAACAGC ACAAGAGGGA GACCCCAGAG GG-3′
10号适配子：5′-TCAGTCGCTT CGCCGTCTCC TTCAGGTGGC GAGTTGCGAAGGACTGTGTC GAGTGTTGGC ACAAGAGGGA GACCCCAGAG GG-3′
37号适配子：5′-TCAGTCGCTT CGCCGTCTCC TTCAGCGGGA TGAGGGAGTAGGAGGGCCAC AGTGGACTGC ACAAGAGGGA GACCCCAGAG GG-3′
46号适配子：5′-TCAGTCGCTT CGCCGTCTCC TTCCAGTCGC TTCGCCGCCTCCTTCCCTCT GGGGTCTC-3′。
发明内容
本发明的目的在于提供三条可用于溶藻弧菌识别检测的寡核苷酸序列及其制备方法。该寡核苷酸序列不仅具有检测快速、操作简单、稳定性高于抗体等特点，而且制备方法容易、制备周期较短。
本发明的另一目的在于提供三条可用于溶藻弧菌识别检测的寡核苷酸序列的应用。
所述三条可用于溶藻弧菌识别检测的寡核苷酸序列，包括SEQ ID No.1(该序列又可记为“46互补”)、SEQ ID No.2(该序列又可记为“46+”)和SEQ ID No.3(该序列又可记为“46+互补”)三条寡核苷酸序列，且采用其中一条就能完成溶藻弧菌的识别检测。
所述SEQ ID No.1为：5′-GAGACCCCAG AGGGAAGGAG GCGGCGAAGCGACTGGAAGG AGACGGCGAA GCGACTGA-3′；
所述SEQ ID No.2为：5′-TCAGTCGCTT CGCCGTCTCC TTCCAGTCGC TTCGCCGCCTCCTTCCCTCT GGGGTCTCCC TCTTGTGC-3′；
所述SEQ ID No.3为：5′-GCACAAGAGG GAGACCCCAG AGGGAAGGAGGCGGCGAAGC GACTGGAAGG AGACGGCGAA GCGACTGA-3′。
所述三条可用于溶藻弧菌识别检测的寡核苷酸序列的制备方法，包括以下步骤：
1)合成用于筛选的ssDNA寡核苷酸文库(5′-TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TC----N35----GCA CAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG-3′)，其中N35为35个随机寡核苷酸；
2)将寡核苷酸文库与溶藻弧菌混合后进行SELEX筛选；
3)SELEX筛选完成后对适配子富集文库进行克隆测序；
4)对测序结果中出现的高拷贝ssDNA进行不同长度的截取，得到一系列新的序列，再构建这些新序列的互补序列；
5)对步骤4)获得的新序列及其互补序列进行亲和特异性的验证，获得相应适配子。
在步骤2)中，所述SELEX筛选的具体步骤如下：
2.1溶藻弧菌菌液制备
用生理盐水将培养24h的溶藻弧菌菌落从斜面上洗涤下来，6000rpm离心5min，弃上清液，用生理盐水重悬并稀释菌液到下列浓度范围：1×108～9×108个/ml，然后取菌液分装20管，每管1ml的菌液，-20℃低温保存备用；
2.2与弧菌结合
取合成好的浓度为100μM的ssDNA寡核苷酸文库4μL，用2×结合缓冲液稀释至100μl，95℃变性5min，冰浴10min后加入100μl自然室温恢复的菌液，摇床结合30min，再6000rpm离心5min，弃上清，然后用1×结合缓冲液洗沉淀3次，弃上清，则沉淀部分为弧菌沉淀和与其相结合的ssDNA；
在步骤2.2中，所述2×结合缓冲液为20×结合缓冲液用双蒸水稀释10倍后的溶液，所述1×结合缓冲液为20×结合缓冲液用双蒸水稀释20倍后的溶液；所述20×结合缓冲液配方为1M NaCl、50mM KCl、500mM Tris-HCl、10mM MgCl2、pH 7.4。
2.3分离结合的ssDNA
在步骤2.2所得的沉淀部分中加入1×结合缓冲液100μL，96℃加热5min，使与弧菌结合的ssDNA变性，从而与弧菌分离，然后15000rpm离心10min，取上清液，再次加热并离心，合并上清液，则可分离得到与弧菌结合的ssDNA；
2.4不对称PCR扩增ssDNA
总体积为25μl的不对称PCR的扩增体系为：
10×PCR缓冲液：2μl(可购于Fermentas公司)；
P1(10μM)：1μl(可购于上海生物工程公司)；
P2(0.2μM)：1μl(可购于上海生物工程公司)；
dNTP(各2.5mM)：0.4μl(可购于Takara公司)；
MgCl2(25mM)：1.2μl(可购于Fermentas公司)；
ssDNA模板(0.2μg/μl)：2μl；
Taq DNA聚合酶(5u/μl)：0.2μl(可购于Fermentas公司)；
ddH2O：17.2μl；
PCR反应参数：94℃预变性4min，然后进行40个循环(94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸20s)，最后72℃延伸7min；
2.5亲和力的测定
2.5.1扩增：用带有地高辛标记的引物P1不对称PCR扩增筛选出来的ssDNA文库，扩增条件和参数与步骤2.4的不对称PCR扩增体系和参数相同；
2.5.2测定亲和力：
TMB显色系统：以四甲基联苯胺(TMB)为底物，辣根过氧化物酶标记兔抗地高辛抗体IgG的显色系统来测定吸附到弧菌表面的适配子量；
所述测定亲和力的具体步骤如下：
2.5.2.1将TMB用无水乙醇配成1mg/mL 4℃遮光保存，用前按照下列比例配制：TMB∶底物缓冲液∶30％过氧化氢＝100∶900∶1，即配即用；
2.5.2.2与菌结合：取步骤2.5.1扩增所得的PCR产物，以已知浓度梯度的初始ssDNA文库为标准品，用Bandscan软件作为图像分析软件，采用溴化乙锭琼脂糖凝胶电泳法(又叫EB荧光分光广度法)定量测定PCR产物中的DNA含量，获得相应DNA的摩尔浓度值，然后再取该PCR产物100μL，用2×结合缓冲液100μL稀释后，95℃变性5min后，于4℃迅速冷却后加入到室温恢复的100μL菌液(约1.6×108个菌)中，充分混合，在室温下结合30min，然后6000rpm离心，分离细菌沉淀与上清液，细菌沉淀中包含有与菌结合的带地高辛标记的ssDNA，上清液中是未结合的ssDNA。同时做一不加ssDNA(用结合缓冲液代替)的空白；
2.5.2.3洗涤：将上述细菌沉淀用1×结合缓冲液100μL洗涤3次，6000rpm离心，弃上清，取菌沉淀；
2.5.2.4与酶标兔抗地高辛抗体结合：在菌沉淀中加入100μL双蒸水重悬后再加入100μL 1∶900TBS稀释过的过量的酶标兔抗地高辛抗体(IgG-HRP)，充分混合后，反应10min，使之与菌沉淀中的地高辛标记的ssDNA结合；
2.5.2.5洗涤：6000rpm离心，去上清，再用1×结合缓冲液100μL洗涤3次，得菌沉淀；
2.5.2.6TMB显色：加入200μL双蒸水重悬菌沉淀，再加入200μL TMB显色液，避光显色10min后，以2mol/L H2SO4 100μL终止反应，测定450nm处的吸光值OD450，该值即反映与菌结合的ssDNA的亲和力，即OD结合，空白同样进行上述步骤2.5.2.3，2.5.2.4，2.5.2.5和2.5.2.6，得到空白相应的吸光度OD空白；
2.5.2.7计算相应文库的亲和力：
2.6重复筛选
以每一轮不对称PCR的产物作为下一轮的筛选文库，重复上述SELEX筛选步骤2.1～2.5，直到亲和力不再明显上升为止，最终筛选得到适配子的富集文库。
在步骤3)中，所述克隆测序的具体方法如下：
将步骤2)筛选出的适配子富集文库进行不对称PCR扩增(扩增条件同步骤2.4)，扩增产物送测序公司进行克隆，并随机挑取5个以上克隆进行测序(也由测序公司完成)，可以得到一系列寡核苷酸序列或ssDNA，这些ssDNA均有如下相似结构：5′-TCA GTC GCT TCGCCG TCT CCT TC-NNNN……NNN-3′(其中N为ATCG中四种核苷酸中的任何一种)。
在步骤4)中，所述“对测序结果中出现的高拷贝ssDNA进行不同长度的截取，得到一系列新的序列，再构建这些新序列的互补序列”的具体方法如下：
4.1多拷贝的ssDNA的选择：对步骤3)获得的一系列ssDNA进行比较分析，可以发现有些ssDNA是完全相同的，或者说有些ssDNA在测序结果中有2个以上的拷贝；若没有发现这种多拷贝ssDNA，则重复步骤3)，继续克隆测序，直到获得至少一个多拷贝的ssDNA，然后选择拷贝数最多且至少有2个以上拷贝数的ssDNA进行后续操作。
4.2多拷贝ssDNA的截取及其互补序列的构建：对步骤4.1获得的多拷贝ssDNA，按5′向3′的方向分别截取长度为58～80个核苷酸，则可以得到一系列新的寡核苷酸片段，再根据碱基互补配对原理则可以构建出这些序列的互补序列。
在步骤5)中，所述亲和特异性的验证的具体方法如下：
对步骤4)获得的新序列及其互补序列进行亲和特异性的验证，最终获得3条对溶藻弧菌有较好亲和特异性的寡核苷酸序列(适配子)；具体过程如下：
5.1合成需要进行验证的ssDNA序列(由上海生工生物工程技术有限公司合成)，并在5’端标记地高辛；
5.2微生物的准备
选取水产养殖环境常见的病原微生物——哈维式弧菌(Vibrio harveyi)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)作为对照菌，与溶藻弧菌(V.alginolyticus)一起，在无菌条件下分别接种到胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)中，30℃下100rpm摇床培养约8～10h。然后取菌液离心，弃上清培养液，再用生理盐水稀释到1×108～9×108个/mL，-20℃低温保存备用；
5.3亲和力的测定
5.3.1与菌结合：取合成出的ssDNA序列10pmol用2×结合缓冲液稀释到100μl，95℃变性5min，冰浴10min后，分别与上述4种菌液各100μl混合(菌数量约为3×108个)，在28℃、100rpm摇床结合40min，然后6000rpm离心5min，分离细菌沉淀与上清液，同时做一不加ssDNA(用2×结合缓冲液代替)的空白；
5.3.2洗涤：将上述细菌沉淀用1×结合缓冲液500μl洗涤1次，6000rpm离心5min，弃上清，取菌沉淀；
5.3.3与辣根过氧化物酶标记兔抗地高辛抗体结合：在空白及实验组菌沉淀中加入100μl1∶1000TBS稀释的过量的辣根过氧化物酶标记兔抗地高辛抗体(购于北京博奥森生物技术公司)，充分混合后，反应10min；
5.3.4洗涤：10000rpm离心5min，再用1×结合缓冲液500μl洗涤3次，弃上清，取菌沉淀；
5.3.5显色：加入400μl双蒸水重悬菌沉淀，再加入200μl TMB显色液，避光显色10min后，以2mol/L H2SO4 200μl终止反应，测定450nm处的吸光值OD450，该值即反映结合的酶标抗地高辛的OD值，即为OD结合，空白同样进行上述步骤5.3.2、5.3.3、5.3.4和5.3.5，得到空白相应的吸光度OD空白，相应适配子的亲和力＝OD结合-OD空白；
5.3.6数据处理分析
用EXCEL软件中的统计函数进行数据处理，统计指标采用T检验进行统计分析，统计概率p＜0.05为显著差异，p＜0.01为极显著的差异，统计分析后获得相应序列对上述四种菌的识别效果，从而确定该序列对溶藻弧菌是否具有亲和特异性，能否用于溶藻弧菌的识别检测。
实验结果：
通过SELEX筛选和亲和特异性验证，46互补、46+、46+互补适配子对溶藻弧菌均有极显著的亲和力(p＜0.01)，且这3个适配子对溶藻弧菌的亲和力均极显著高于对其它3株菌(哈维氏弧菌、嗜水气单胞菌和迟缓型爱德华氏菌)的亲和力(p＜0.01)，说明这3个适配子对溶藻弧菌都有显著的特异性识别能力，可应用于溶藻弧菌的识别检测。
本发明所述三条可用于溶藻弧菌识别检测的寡核苷酸序列具有识别检测溶藻弧菌的功能，且采用所述三条可用于溶藻弧菌识别检测的寡核苷酸序列中的任意一条就能够单独应用于溶藻弧菌的检测。
所述的三条寡核苷酸序列的5′端均标记有地高辛。
所述三条可用于溶藻弧菌识别检测的寡核苷酸序列可用于各类样品中溶藻弧菌的识别检测，具体检测方法如下：
1)待测菌液制备：取样品，蒸馏水溶解后接种到胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)培养基中，30℃下100rpm摇床培养约8～10h。然后取菌液离心，弃上清培养液，再用生理盐水稀释到1×108～9×108个/mL，-20℃低温保存备用。
2)亲和特异性检测：然后用5′端标记有地高辛的上述三条寡核苷酸序列中的任一一条按制备步骤5.3的亲和力测定方法对待测菌液进行检测；同时用溶藻弧菌代替待测菌液，同样按5.3的亲和力测定方法进行检测，得到阳性对照；用无菌蒸馏水代替待测菌液，同样按5.3的亲和力测定方法进行检测，得到阴性对照。结果显示阳性对照组颜色为黄色，阴性对照组不显色。如果待测样品检测结果呈现黄色，说明样品中有溶藻弧菌，为阳性，如果待测样品检测结果不显色，则说明样品中没有溶藻弧菌。
本发明具有检测快速，操作简单，适配子的稳定性高于抗体的特点，而且合成制备容易，制备周期较短。
附图说明
图1为SELEX筛选流程图。
图2为亲和力的测定流程图。
图3为本发明实施例1中SEQ ID No.1适配子对4种不同菌种的识别效果图。
图4为本发明SEQ ID No.2适配子对4种不同菌种的识别效果图。
图5为本发明SEQ ID No.3适配子对4种不同菌种的识别效果图。
图6为本发明实施例1中3条序列(3个适配子)及其他3条适配子(37，10，8)与溶藻弧菌的亲和力比较图。
在图3～图6中，纵坐标均为亲和力(Affinity)，图3～图5的横坐标为微生物(Microorganism)，V.alginolytics、V.harveyi、A.hydrophila、E.tarda分别表示溶藻弧菌、哈维式弧菌、嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌，图6的横坐标为适配子(Aptamers)。图3～图5柱形上的**分别代表与其它组比较达到极显著水平(p＜0.01)，图6柱形上的**分别代表与空白对照组比较达到极显著水平(p＜0.01)。
具体实施方式
实施例1
本实施例的三条可用于溶藻弧菌识别检测的寡核苷酸序列的制备步骤主要包括：
1、合成用于筛选的ssDNA寡核苷酸文库(5′-TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TC----N35----GCA CAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG-3′)：由上海生工生物工程技术有限公司化学合成。
2、SELEX筛选：相应的筛选流程如图1所示，具体步骤如下：
2.1溶藻弧菌菌液制备
用生理盐水将培养24h的溶藻弧菌菌落从斜面上洗涤下来，6000rpm离心5min，弃上清液，用生理盐水重悬并稀释菌液到下列浓度范围：1×108个/mL至9×108个/ml，然后取菌液分装20管，每管1ml的菌液，-20℃低温保存备用；
2.2与弧菌结合
取合成好的浓度为100μM的ssDNA寡核苷酸文库4μL，用2×结合缓冲液稀释至100μl，95℃变性5min，冰浴10min后加入100μl自然室温恢复的菌液，摇床结合30min，再6000rpm离心5min，弃上清，然后用1×结合缓冲液洗沉淀3次，弃上清，则沉淀部分为弧菌沉淀和与其相结合的ssDNA；
在步骤2.2中，所述2×结合缓冲液为20×结合缓冲液用双蒸水稀释10倍后的溶液，所述1×结合缓冲液为20×结合缓冲液用双蒸水稀释20倍后的溶液；所述20×结合缓冲液配方为1M NaCl、50mM KCl、500mM Tris-HCl、10mM MgCl2、pH 7.4。
2.3分离结合的ssDNA
在步骤2.2所得的沉淀部分中加入1×结合缓冲液100μL，96℃加热5min，使与弧菌结合的ssDNA变性，从而与弧菌分离，然后15000rpm离心10min，取上清液，再次加热并离心，合并上清液，则可分离得到与弧菌结合的ssDNA；
2.4不对称PCR扩增ssDNA
总体积为25μl的不对称PCR的扩增体系为：
10×PCR缓冲液：2μl(可购于Fermentas公司)；
P1(10μM)：1μl(可购于上海生物工程公司)；
P2(0.2μM)：1μl(可购于上海生物工程公司)；
dNTP(各2.5mM)：0.4μl(可购于Takara公司)；
MgCl2(25mM)：1.2μl(可购于Fermentas公司)；
ssDNA模板(0.2μg/μl)：2μl；
Taq DNA聚合酶(5u/μl)：0.2μl(可购于Fermentas公司)；
ddH2O：17.2μl；
PCR反应参数：94℃预变性4min，然后进行40个循环(94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸20s)，最后72℃延伸7min；
2.5亲和力的测定(测定过程如图2所示)。
2.5.1扩增：用带有地高辛标记的引物P1不对称PCR扩增筛选出来的ssDNA文库，扩增条件和参数与步骤2.4的不对称PCR扩增体系和参数相同；
2.5.2测亲和力：
TMB显色系统：以四甲基联苯胺(TMB)为底物，辣根过氧化物酶标记兔抗地高辛抗体IgG的显色系统来测定吸附到弧菌表面的适配子量；
所述亲和力的测定的具体步骤如下：
2.5.2.1将TMB用无水乙醇配成1mg/mL 4℃遮光保存，用前按照下列比例配制：TMB∶底物缓冲液∶30％过氧化氢＝100∶900∶1，即配即用；
2.5.2.2与菌结合：取筛选、扩增所得的ssDNA库的PCR产物，以已知浓度梯度的初始ssDNA文库为标准品，用Bandscan软件作为图像分析软件，采用溴化乙锭琼脂糖凝胶电泳法(又叫EB荧光分光广度法)定量测定PCR产物中的DNA含量，获得相应DNA的摩尔浓度值，然后再取该PCR产物100μL，用2×结合缓冲液100μL稀释后，95℃变性5min后，于4℃迅速冷却后加入到室温恢复的100μL菌液(约1.6×108个菌)中，充分混合，在室温下结合30min，然后6000rpm离心，分离细菌沉淀与上清液，细菌沉淀中包含有与菌结合的带地高辛标记的ssDNA，上清液中是未结合的ssDNA。同时做一不加ssDNA(用结合缓冲液代替)的空白；
2.5.2.3洗涤：将上述细菌沉淀用1×结合缓冲液100μL洗涤3次，6000rpm离心，弃上清，取菌沉淀；
2.5.2.4与酶标兔抗地高辛抗体结合：在菌沉淀中加入100μL双蒸水重悬后再加入100μL 1∶900TBS稀释过的过量的酶标兔抗地高辛抗体(IgG-HRP)，充分混合后，反应10min，使之与菌沉淀中的地高辛标记的ssDNA结合；
2.5.2.5洗涤：6000rpm离心，去上清，再用1×结合缓冲液100μL洗涤3次，得菌沉淀；
2.5.2.6TMB显色：加入200μL双蒸水重悬菌沉淀，再加入200μL TMB显色液，避光显色10min后，以2mol/L H2SO4 100μL终止反应，测定450nm处的吸光值OD450，该值即反映与菌结合的ssDNA的亲和力，即OD结合，空白同样进行上述2.5.2.3、2.5.2.4、2.5.2.5、2.5.2.5步骤，得到空白相应的吸光度OD空白；
2.5.2.7计算相应文库的亲和力：
2.6重复筛选
以每一轮不对称PCR的产物作为下一轮的筛选文库，重复上述SELEX筛选步骤2.1～2.5，直到亲和力不再明显上升为止，最终筛选得到适配子的富集文库。
3、克隆测序：筛选得到的适配子富集文库经不对称PCR扩增后(扩增条件同前步骤2.4)，扩增产物送测序公司进行克隆，并随机挑取82克隆进行测序(由上海美吉生物医院科技有限公司完成克隆和测序工作)，得到51条有效的ssDNA(编号为1～51号)，其中有一条ssDNA(其序列为5′-TCAGTCGCTT CGCCGTCTCC TTCCAGTCGC TTCGCCGCCT CCTTCCCTCTGGGGTCTCCC TCTTGTGCTC TCCCTCGACT CA-3′)在24个克隆中均有出现，即该ssDNA在测序结果中出现了24次，该ssDNA的拷贝数是24，是51条ssDNA中出现频率最高的，因此选择该ssDNA进行后续操作。
4、对步骤3克隆测序结果中出现的该高拷贝ssDNA(其序列为5′-TCAGTCGCTTCGCCGTCTCC TTCCAGTCGC TTCGCCGCCT CCTTCCCTCT GGGGTCTCCCTCTTGTGCTC TCCCTCGACT CA-3′)，按5′向3′的方向分别截取长度为58到80个核苷酸，得到一系列新的序列，再根据碱基互补配对原理则可以构建出这些序列的互补序列。这些序列中包含有编号为46互补的序列(即SEQ ID No.1)、46+的序列(即SEQ ID No.2)、46+互补的序列(即SEQ ID No.3)。
5、对步骤4获得的新序列及其互补序列进行亲和特异性的验证：分别对编号为46互补、46+、46+互补以及8、10、37号序列进行亲和特异性的验证试验，最终证明该3条序列(46互补、46+、46+互补)是对溶藻弧菌有较好亲和特异性的寡核苷酸序列(适配子)；具体过程如下：
5.1合成需要进行验证的ssDNA序列(由上海生工生物工程技术有限公司合成)，并在5’端标记地高辛；
5.2微生物的准备
选取水产养殖环境常见的病原微生物——哈维式弧菌(Vibrio harveyi)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)作为对照菌，与溶藻弧菌(V.alginolyticus)一起，在无菌条件下分别接种到胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)中，30℃下100rpm摇床培养约8～10h。然后取菌液离心，弃上清培养液，再用生理盐水稀释到1×108～9×108个/mL，-20℃低温保存备用；
5.3亲和力的测定
5.3.1与菌结合：取合成出的ssDNA序列10pmol用2×结合缓冲液稀释到100μl，95℃变性5min，冰浴10min后，分别与上述4种菌液各100μl混合(菌数量约为3×108个)，在28℃、100rpm摇床结合40min，然后6000rpm离心5min，分离细菌沉淀与上清液，同时做一不加ssDNA(用2×结合缓冲液代替)的空白；
5.3.2洗涤：将上述细菌沉淀用1×结合缓冲液500μl洗涤1次，6000rpm离心5min，弃上清，取菌沉淀；
5.4.3与辣根过氧化物酶标记兔抗地高辛抗体结合：在空白及实验组菌沉淀中加入100μl1∶1000TBS稀释的过量的辣根过氧化物酶标记兔抗地高辛抗体(购于北京博奥森生物技术公司)，充分混合后，反应10min；
5.4.4洗涤：10000rpm离心5min，再用1×结合缓冲液500μl洗涤3次，弃上清，取菌沉淀；
5.4.5显色：加入400μl双蒸水重悬菌沉淀，再加入200μl TMB显色液，避光显色10min后，以2M H2SO4 200μl终止反应，测定450nm处的吸光值OD450，该值即反映结合的酶标抗地高辛的OD值，即为OD结合，空白同样进行上述步骤5.3.2～5.3.5，得到空白相应的吸光度OD空白，相应适配子的亲和力＝OD结合-OD空白；
6.数据处理分析
用EXCEL软件中的统计函数进行数据处理，统计指标采用T检验进行统计分析，统计概率p＜0.05为显著差异，p＜0.01为极显著的差异，统计分析后获得相应序列对上述四种菌的识别效果，从而确定该序列对溶藻弧菌是否具有亲和特异性，能否用于溶藻弧菌的识别检测。
实验结果如下：
通过SELEX筛选和亲和特异性验证，46互补、46+、46+互补适配子对溶藻弧菌均有极显著的亲和力(p＜0.01)，且这3个适配子对溶藻弧菌的亲和力均极显著高于对其它3株菌(哈维氏弧菌、嗜水气单胞菌和迟缓型爱德华氏菌)的亲和力(p＜0.01)，说明这3个适配子对溶藻弧菌都有显著的特异性识别能力，可应用于溶藻弧菌的识别检测(如图3～5)，且这3个序列识别效果要明显好于37，10和8号适配子(如图6所示，这3个适配子序列可参见本申请人的在先中国专利申请，申请号为201110090419.7)。
实施例2
寡核苷酸序列具有识别检测溶藻弧菌的用途：具体使用步骤如下：1)取病鱼的伤口组织粘液，蒸馏水溶解后接种到胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)培养基中，30℃下100rpm摇床培养约8-10h。然后取菌液离心，弃上清培养液，再用生理盐水稀释到1×108～9×108个/mL，-20℃低温保存备用。然后用5′端标记有地高辛的适配子46互补(SEQ ID No.1)按制备步骤5.3的亲和力测定方法进行检测，同时做一阳性对照(用溶藻弧菌作阳性对照)和阴性对照(用无菌蒸馏水作阴性对照)，结果显示阳性对照组和实验组颜色变黄，而阴性对照组颜色未变，说明样品中有溶藻弧菌，病鱼感染了溶藻弧菌。
2)取感染了弧菌病的养殖水体，按上述方法进行微生物的培养和样品的制备，然后用5′端标记有地高辛的适配子46+(SEQ ID No.2)按制备步骤5.3的亲和力测定方法进行检测，同时做一阳性对照(用溶藻弧菌作阳性对照)和阴性对照(用无菌蒸馏水作阴性对照)，结果显示阳性对照组和实验组颜色变黄，而阴性对照组颜色未变，说明染病水样中含有溶藻弧菌。
3)取市售活鱼的血清，按上述方法进行微生物的培养和样品的制备，然后用5′端标记有地高辛的适配子46+互补(SEQ ID No.3)按制备步骤5.3的亲和力测定方法进行检测，同时做一阳性对照(用溶藻弧菌作阳性对照)和阴性对照(用无菌蒸馏水作阴性对照)，结果显示阳性对照组颜色变黄，而实验组和阴性对照组颜色未变，说明正常自来水中不含溶藻弧菌。
Claims (9)
1.三条可用于溶藻弧菌识别检测的寡核苷酸序列，包括SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3三条寡核苷酸序列，且采用其中一条就能完成溶藻弧菌的识别检测；
所述SEQ ID No.1为：5′-GAGACCCCAG AGGGAAGGAG GCGGCGAAGCGACTGGAAGG AGACGGCGAA GCGACTGA-3′；
所述SEQ ID No.2为：5′-TCAGTCGCTT CGCCGTCTCC TTCCAGTCGC TTCGCCGCCTCCTTCCCTCT GGGGTCTCCC TCTTGTGC-3′；
所述SEQ ID No.3为：5′-GCACAAGAGG GAGACCCCAG AGGGAAGGAGGCGGCGAAGC GACTGGAAGG AGACGGCGAA GCGACTGA-3′。
2.三条可用于溶藻弧菌识别检测的寡核苷酸序列的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)合成用于筛选的ssDNA寡核苷酸文库：5′-TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TC----N35----GCA CAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG-3′，其中N35为35个随机寡核苷酸；
2)将寡核苷酸文库与溶藻弧菌混合后进行SELEX筛选；
3)SELEX筛选完成后对适配子富集文库进行克隆测序；
4)对测序结果中出现的高拷贝ssDNA进行不同长度的截取，得到一系列新的序列，再构建这些新序列的互补序列；
5)对步骤4)获得的新序列及其互补序列进行亲和特异性的验证，获得相应适配子。
3.如权利要求2所述的三条可用于溶藻弧菌识别检测的寡核苷酸序列的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述SELEX筛选的具体步骤如下：
2.1溶藻弧菌菌液制备
用生理盐水将培养24h的溶藻弧菌菌落从斜面上洗涤下来，6000rpm离心5min，弃上清液，用生理盐水重悬并稀释菌液到下列浓度范围：1×108～9×108个/ml，然后取菌液分装20管，每管1ml的菌液，-20℃低温保存备用；
2.2与弧菌结合
取合成好的浓度为100μM的ssDNA寡核苷酸文库4μL，用2×结合缓冲液稀释至100μl，95℃变性5min，冰浴10min后加入100μl自然室温恢复的菌液，摇床结合30min，再6000rpm离心5min，弃上清，然后用1×结合缓冲液洗沉淀3次，弃上清，则沉淀部分为弧菌沉淀和与其相结合的ssDNA；
2.3分离结合的ssDNA
在步骤2.2所得的沉淀部分中加入1×结合缓冲液100μL，96℃加热5min，使与弧菌结合的ssDNA变性，从而与弧菌分离，然后15000rpm离心10min，取上清液，再次加热并离心，合并上清液，则可分离得到与弧菌结合的ssDNA；
2.4不对称PCR扩增ssDNA
总体积为25μl的不对称PCR的扩增体系为：
10×PCR缓冲液：2μl(可购于Fermentas公司)；
P1(10μM)：1μl(可购于上海生物工程公司)；
P2(0.2μM)：1μl(可购于上海生物工程公司)；
dNTP(各2.5mM)：0.4μl(可购于Takara公司)；
MgCl2(25mM)：1.2μl(可购于Fermentas公司)；
ssDNA模板(0.2μg/μl)：2μl；
Taq DNA聚合酶(5u/μl)：0.2μl(可购于Fermentas公司)；
ddH2O：17.2μl；
PCR反应参数：94℃预变性4min，然后进行40个循环(94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸20s)，最后72℃延伸7min；
2.5亲和力的测定
2.5.1扩增：用带有地高辛标记的引物P1不对称PCR扩增筛选出来的ssDNA文库，扩增条件和参数与步骤2.4的不对称PCR扩增体系和参数相同；
2.5.2测定亲和力：
TMB显色系统：以四甲基联苯胺为底物，辣根过氧化物酶标记兔抗地高辛抗体IgG的显色系统来测定吸附到弧菌表面的适配子量；
所述测定亲和力的具体步骤如下：
2.5.2.1将TMB用无水乙醇配成1mg/mL 4℃遮光保存，用前按照下列比例配制：TMB∶底物缓冲液∶30％过氧化氢＝100∶900∶1，即配即用；
2.5.2.2与菌结合：取步骤2.5.1扩增所得的PCR产物，以已知浓度梯度的初始ssDNA文库为标准品，用Bandscan软件作为图像分析软件，采用溴化乙锭琼脂糖凝胶电泳法定量测定PCR产物中的DNA含量，获得相应DNA的摩尔浓度值，然后再取该PCR产物100μL，用2×结合缓冲液100μL稀释后，95℃变性5min后，于4℃迅速冷却后加入到室温恢复的100μL菌液中，充分混合，在室温下结合30min，然后6000rpm离心，分离细菌沉淀与上清液，细菌沉淀中包含有与菌结合的带地高辛标记的ssDNA，上清液中是未结合的ssDNA。同时做一不加ssDNA的空白；
2.5.2.3洗涤：将上述细菌沉淀用1×结合缓冲液100μL洗涤3次，6000rpm离心，弃上清，取菌沉淀；
2.5.2.4与酶标兔抗地高辛抗体结合：在菌沉淀中加入100μL双蒸水重悬后再加入100μL 1∶900TBS稀释过的过量的酶标兔抗地高辛抗体，充分混合后，反应10min，使之与菌沉淀中的地高辛标记的ssDNA结合；
2.5.2.5洗涤：6000rpm离心，去上清，再用1×结合缓冲液100μL洗涤3次，得菌沉淀；
2.5.2.6TMB显色：加入200μL双蒸水重悬菌沉淀，再加入200μL TMB显色液，避光显色10min后，以2mol/L H2SO4 100μL终止反应，测定450nm处的吸光值OD450，该值即反映与菌结合的ssDNA的亲和力，即OD结合，空白同样进行上述步骤2.5.2.3，2.5.2.4，2.5.2.5和2.5.2.6，得到空白相应的吸光度OD空白；
2.5.2.7计算相应文库的亲和力：
2.6重复筛选
以每一轮不对称PCR的产物作为下一轮的筛选文库，重复上述SELEX筛选步骤2.1～2.5，直到亲和力不再明显上升为止，最终筛选得到适配子的富集文库。
4.如权利要求3所述的三条可用于溶藻弧菌识别检测的寡核苷酸序列的制备方法，其特征在于在步骤2)的2.2部分中，所述2×结合缓冲液为20×结合缓冲液用双蒸水稀释10倍后的溶液，所述1×结合缓冲液为20×结合缓冲液用双蒸水稀释20倍后的溶液；所述20×结合缓冲液配方为1M NaCl、50mM KCl、500mM Tris-HCl、10mM MgCl2、pH 7.4。
5.如权利要求2所述的三条可用于溶藻弧菌识别检测的寡核苷酸序列的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述克隆测序的具体方法如下：
将步骤2)筛选出的适配子富集文库进行不对称PCR扩增，扩增条件同步骤2.4，扩增产物送测序公司进行克隆，并随机挑取5个以上克隆进行测序，可以得到一系列寡核苷酸序列或ssDNA，这些ssDNA均有如下相似结构：5′-TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCTTC-NNNN……NNN-3′，其中N为ATCG中四种核苷酸中的任何一种。
6.如权利要求2所述的三条可用于溶藻弧菌识别检测的寡核苷酸序列的制备方法，其特征在于在步骤4)中，所述“对测序结果中出现的高拷贝ssDNA进行不同长度的截取，得到一系列新的序列，再构建这些新序列的互补序列”的具体方法如下：
4.1多拷贝的ssDNA的选择：对步骤3)获得的一系列ssDNA进行比较分析，可以发现有些ssDNA是完全相同的，或者说有些ssDNA在测序结果中有2个以上的拷贝；若没有发现这种多拷贝ssDNA，则重复步骤3)，继续克隆测序，直到获得至少一个多拷贝的ssDNA，然后选择拷贝数最多且至少有2个以上拷贝数的ssDNA进行后续操作；
4.2多拷贝ssDNA的截取及其互补序列的构建：对步骤4.1获得的多拷贝ssDNA，按5′向3′的方向分别截取长度为58～80个核苷酸，则可以得到一系列新的寡核苷酸片段，再根据碱基互补配对原理则可以构建出这些序列的互补序列。
7.如权利要求2所述的三条可用于溶藻弧菌识别检测的寡核苷酸序列的制备方法，其特征在于在步骤5)中，所述亲和特异性的验证的具体方法如下：
对步骤4)获得的新序列及其互补序列进行亲和特异性的验证，最终获得3条对溶藻弧菌有较好亲和特异性的寡核苷酸序列(适配子)；具体过程如下：
5.1合成需要进行验证的ssDNA序列(由上海生工生物工程技术有限公司合成)，并在5’端标记地高辛；
5.2微生物的准备
选取水产养殖环境常见的病原微生物——哈维式弧菌(Vibrio harveyi)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)作为对照菌，与溶藻弧菌(V.alginolyticus)一起，在无菌条件下分别接种到胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，30℃下100rpm摇床培养约8～10h；然后取菌液离心，弃上清培养液，再用生理盐水稀释到1×108～9×108个/mL，-20℃低温保存备用；
5.3亲和力的测定
5.3.1与菌结合：取合成出的ssDNA序列10pmol用2×结合缓冲液稀释到100μl，95℃变性5min，冰浴10min后，分别与上述4种菌液各100μl混合，在28℃、100rpm摇床结合40min，然后6000rpm离心5min，分离细菌沉淀与上清液，同时做一不加ssDNA的空白，即用2×结合缓冲液代替；
5.3.2洗涤：将上述细菌沉淀用1×结合缓冲液500μl洗涤1次，6000rpm离心5min，弃上清，取菌沉淀；
5.3.3与辣根过氧化物酶标记兔抗地高辛抗体结合：在空白及实验组菌沉淀中加入100μl1∶1000TBS稀释的过量的辣根过氧化物酶标记兔抗地高辛抗体，充分混合后，反应10min；
5.3.4洗涤：10000rpm离心5min，再用1×结合缓冲液500μl洗涤3次，弃上清，取菌沉淀；
5.3.5显色：加入400μl双蒸水重悬菌沉淀，再加入200μl TMB显色液，避光显色10min后，以2mol/L H2SO4 200μl终止反应，测定450nm处的吸光值OD450，该值即反映结合的酶标抗地高辛的OD值，即为OD结合，空白同样进行上述步骤5.3.2、5.3.3、5.3.4和5.3.5，得到空白相应的吸光度OD空白，相应适配子的亲和力＝OD结合-OD空白；
5.3.6数据处理分析
用EXCEL软件中的统计函数进行数据处理，统计指标采用T检验进行统计分析，统计概率p＜0.05为显著差异，p＜0.01为极显著的差异，统计分析后获得相应序列对上述四种菌的识别效果，从而确定该序列对溶藻弧菌是否具有亲和特异性，能否用于溶藻弧菌的识别检测。
8.如权利要求1所述的三条可用于溶藻弧菌识别检测的寡核苷酸序列在各类样品中溶藻弧菌的识别检测中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述识别检测的具体方法如下：
1)待测菌液制备：取样品，蒸馏水溶解后接种到胰蛋白胨大豆肉汤培养基培养基中，30℃下100rpm摇床培养约8～10h；然后取菌液离心，弃上清培养液，再用生理盐水稀释到1×108～9×108个/mL，-20℃低温保存备用；
2)亲和特异性检测：然后用5′端标记有地高辛的上述三条寡核苷酸序列中的任一一条按制备步骤5.3的亲和力测定方法对待测菌液进行检测；同时用溶藻弧菌代替待测菌液，同样按5.3的亲和力测定方法进行检测，得到阳性对照；用无菌蒸馏水代替待测菌液，同样按5.3的亲和力测定方法进行检测，得到阴性对照；结果显示阳性对照组颜色为黄色，阴性对照组不显色；若待测样品检测结果呈现黄色，则说明样品中有溶藻弧菌，为阳性；若待测样品检测结果不显色，则说明样品中没有溶藻弧菌。
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20130605 |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |