JP2001512694A - Ｄｎａのｈｌａクラスｉタイプを決定するための方法およびキット - Google Patents

Ｄｎａのｈｌａクラスｉタイプを決定するための方法およびキット

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、対象のＨＬＡクラスＩタイプを決定するための方法および装置に関する。本発明では、群特異的配列を用いて、対象が有するＨＬＡ群および／対立遺伝子を正確に同定するためのプロトコールで使用できるプライマー分子を設計する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、患者のHLAクラスＩタイプを決定する方法に関し、この方法では、 患者が保持するＨＬＡグループおよび／または対立遺伝子を正確に同定する増幅
プロトコールに使用できるプライマー分子を設計するために、グループ特異的配
列が用いられる。
【０００２】
【発明の背景】
組織適合性遺伝子座抗原（Histocompatibility Locus Antigen：ＨＬＡ）クラ
スＩ遺伝子は、主要移植抗原HLA-A、HLA-BおよびHLA-Cをコードする三つの古典 的遺伝子と、他の７種類のクラスＩ遺伝子（そのうちでHLA-E、HLA-FおよびHLA-
Gはおそらく機能的遺伝子であり、HLA-H、HLA-I、HLA-KおよびHLA-Lは偽遺伝子 である）からなっている。このクラスＩ遺伝子は同様の構造を共有しており、こ
れには、就中、5’-＞3’、5’非翻訳フランキング領域；略73塩基対（bp）の長
さを有する第一のエキソン（「エキソン１」）；略130 bpの長さを有する第一の
イントロン（「イントロン１」）；略250 bpの長さを有する第二のエキソン（「
エキソン２」）；略272 bpの長さを有する第二のイントロン（「イントロン２」
）；略276 bpの長さを有する第三のエキソン（「エキソン３」）；略588 bpの長
さを有する第三のイントロン（「イントロン３」）；および第四のエキソン（「
エキソン４」）が含まれる。
【０００３】 ＨＬＡクラスＩ遺伝子は、個体間において高度に多型性である。1996年現在に
おいて、少なくとも73のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子、126のＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子、 および35のＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子が同定されている。この多様性は、ドナーとホ
ストの間の組織移植を考えるときに特に関連する。移植組織の免疫拒絶ならびに
移植片／ホスト病の両方を回避するために、ドナーおよびホストの組織適合性抗
原は可能な限り同じであるべきである。従って、ドナーおよびホストのHLAタイ プを正確に同定することが重要である。組織移植に内在する緊急性を考慮すると
、このタイピングは可能な限り効率的に行うことが望ましい。
【０００４】 患者サンプル中におけるHLA-A、HLA-BおよびHLA-Cの対立遺伝子を決定する方 法は、これら遺伝子が移植組織適合性および自己免疫疾患において機能的に重要
であるため、多くの研究がなされている。開発された第一の試験は、免疫学的方
法を使用して、種々のHLA遺伝子座により発現されたエピトープを同定した。こ れらの試験（例えば、Terasaki and McClelland, Nature, 204: 998, (1964)に 記載された補体依存性細胞障害試験）は、広範な血清学的特異性を同定したが、
一群の対立遺伝子メンバー間を識別せず、ときには全く誤って同定した。不運に
も、最も正確なこのような低解像度試験は、全ての機能的に重要な移植抗原を検
出および識別することはできない（Anasetti et al. Hum. Immunol., 29:70 (19
90)）。
【０００５】 各群の対立遺伝子間を識別する核酸レベルでの高解像度試験が、最近の研究の
焦点なってきている。現在の高解像度のタイピング法には、下記のものが含まれ
る。
【０００６】 Hoffinan-La Roche, Inc.社に米国特許第5,451,512号に記載の配列特異的オリ
ゴヌクレオチドプローブ（「SSOP」）技術は、逆ドットブロットフォーマットを
使用している。ここでは、HLA-Aプローブを膜上に固定し、標識された標的（患 者サンプル）ＤＮＡを膜に結合したプローブにハイブリダイズさせる（Saiki et
al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. 86:6230-6234に記載の通り）。ドットブ ロット上の前記プローブに対するハイブリダイゼーションのパターンが、個体の
HLAタイプに関する情報を与える。しかし、ハイブリダイゼーションは本来的に 、プローブと患者サンプルとの間の軽微な配列の相違を排除するほど十分に特異
的ではないので、患者サンプルは、把握されない対立遺伝子変異を含む可能性が
ある。
【０００７】 核酸に基づくもう一つの試験は、インペリアルキャンサーリサーチファウンデ
ーション(Imperial Cancer Research Fund)発行の「HLA Class I SSP ARMS-PCR
Typing Kit」参照マニュアル（1995年6月編）に記載の、増幅耐性突然変異シス テム（ARMS）である。この試験は、増幅プライマーの3’末端と標的ＤＮＡ配列 との間の相補性（適合性）の必要に基づいている。このような相補性が存在しな
いと、プライマーは適正に機能せず、フラグメントが増幅されない。患者由来の
標的ＤＮＡに作用する種々のプライマー対について、フラグメントが首尾良く増
幅されるか否かを決定することによって、配列情報が推定される。この技術の正
確度は、試験されるプライマー対の数によって制限され、また対立遺伝子変異が
存在する確率によって制限される。
【０００８】 上記の欠点を克服するために、直接的ＤＮＡシーケンシングによってタイピン
グを行うことが提案されている（Santamaria et al., "HLA Class I Sequence-B
ased Typing" Hum. Immunol. 37, 39-50 (1993); WO 9219771; US Pat. 5, 424,
184）。しかし、患者のクラスＩHLA遺伝子座の直接的シーケンシングは、概念 的には最も正確であるが、このようなシーケンシングは、臨床的実施には不適切
な時間フレームを必要とする。直接的シーケンシング法の成功は、効率的なプロ
トコールおよび関連プライマー配列の設計に依存すると思われる。
【０００９】 本発明に先立って、直接的シーケンシングプロトコールには多くの欠点が示さ
れた。例えば上記 Santamaria et al.の方法は、エキソン配列の多様性を考慮し
て、保存されたプライマーハイブリダイゼーション部位の非常に制限された選択
しか与えない cDNA（エキソン）配列に焦点を当てているので、十分な情報を提 供しない。加えて、Santamariaのシーケンシングプライマーはエキソン内でハイ
ブリダイズするので、対立遺伝子の識別に決定的であり得るプライマーから上流
のＤＮＡ配列に関して情報を提供しない。更に、開示されている部位は、HLAタ イプの同定において現在考慮することが必要とされている、数十以上の対立遺伝
子が最近になって発見される前に決定されたものである。
【００１０】 イントロン配列は、エキソンの全長に亘るＤＮＡ配列を提供し得るから、HLA-
A、HLA-BおよびHLA-C遺伝子に関する増幅プライマーおよびシーケンシングプラ イマーのための好ましいハイブリダイゼーション部位を提供するかもしれない。
HLAクラスＩ遺伝子についてのイントロン配列は、少なくとも1985年の初期に開 示されている（Weiss et al., Immunobiol 170:367-380, (1985)）。その実質的
な多様性およびシーケンシングの困難さのために、その後に幾つかの配列が発表
されているだけである。
【００１１】 多くの研究者は、HLAクラスＩイントロンに基づくオリゴヌクレオチドを、HLA
クラスＩタイピングの制限された側面のために限定的に使用してきた。
【００１２】 Blasczyk et al.（Tissue Antigens 1996: 47:102-110）は、エキソンに基づ く増幅プライマーを使用して群特異性を決定した。増幅の後、イントロン２に位
置する万能シーケンシングプライマーが、増幅されたフラグメントの配列を決定
するために使用された。この論文は、イントロン１もしくは３または 5’非翻訳
領域に由来する如何なるイントロン配列も開示していない。
【００１３】 Cereb et al.（Tissue Antigens 1995: 45:1-11）は、全てのクラスＩ遺伝子 のための遺伝子座特異的な増幅プライマー組に有用なイントロン配列の同定を企
画した。これらのプライマー組は、同じ遺伝子座の全ての対立遺伝子を増幅する
ように設計された。群特異的な増幅プライマーは探索または報告されなかった。
【００１４】 Johnston-Dow et al.（Poster Presentation: 1995 ASHI Meeting, Dallas, T
X）は、HLA-Aの直接的シーケンシングのためのシステムを提示した。ここでは、
縮重したエキソンに基づくプライマーを用いて、HLA-AＤＮＡ配列のエキソン１ 〜５を増幅した。前掲のCereb et al.におけると同様に、HLA-A遺伝子座の全て の対立遺伝子を増幅するために、縮重したプライマーのプールが設計された。群
特異性は探索または報告されなかった。更に、エキソン２および３に隣接したイ
ントロン領域にハイブリダイズする縮重したプライマー混合物を用いて、増幅さ
れたフラグメントのシーケンシングが得られた。. 古典的HLAクラスＩ遺伝子座のタイピングへの合理的なアプローチは、イント ロンに基づくオリゴヌクレオチドを用いて、患者サンプルにおける各遺伝子座の
夫々の対立遺伝子を高解像度でタイピングするための、単純化された一連のステ
ップを提供するであろう。更に、この方法は、曖昧さを伴わずに、新規な対立遺
伝子を同定することができるであろう。
【００１５】 イントロンに基づくHLAクラスＩタイピングの別の方法は、本発明の譲受人に 譲渡され、先に出願された米国特許出願番号 08/継続中（代理人事件番号VGEN.P
-037-US）の主題である。
【００１６】
【発明の概要】
本発明は、患者サンプル中におけるHLAクラスＩ遺伝子（HLA-A, HLA-BおよびH
LA-C遺伝子座を含む）の、核酸に基づく高解像度のタイピングのための材料およ
び方法に関する。それは部分的には、多くの患者サンプルの分析から導かれた、
5’フランキング領域、イントロン１、イントロン２およびイントロン３の配列 を含む群特異的配列モチーフの発見に基づいている。このような配列モチーフは
、患者のHLA群またはタイプの同定に使用できる増幅プライマーを設計するため に用いることができる。本発明はまた、部分的には、患者の精密な対立遺伝子タ
イプを確認するために使用できる、多くの対立遺伝子特異的配列の決定に基づい
ている。
【００１７】 本発明は、HLA-A, HLA-BまたはHLA-C遺伝子座の非翻訳領域における群特異的 配列モチーフと選択的にハイブリダイズできる、実質的に精製された核酸を提供
する。このような核酸（キットに含めてもよい）は、単独でまたはエキソンに基
づくプライマーと組み合わせて、患者サンプルに含まれるHLA-A, HLA-B, または
HLA-C対立遺伝子の群特異性を決定するために、また存在する特異的対立遺伝子 を同定するために使用することができる。
【００１８】 特定の実施例において、本発明は、対象のHLAクラスＩタイプを確認する方法 であって、前記対象の群タイプを同定する第一の増幅反応、およびシーケンシン
グのための対立遺伝子特異的な核酸を生じる第二の増幅反応を行うこととを具備
する方法を提供する。
【００１９】 ＜定義＞ 「対立遺伝子」とは、問題の遺伝子の択一的形態の一つを意味する。
【００２０】 「増幅」とは、反応混合物中において、一以上の特異的遺伝子または遺伝子フ
ラグメントの他の遺伝子に対する相対的量を増大させるためのプロセスを意味す
る。当業者に周知の増幅方法は、米国特許第4,683,194号、同第4,683,195号およ
び同第4,683,202号に記載のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）であり、これらの 特許は本明細書の一部をなす参照として本願に組み込まれる。このＰＣＲ反応は
、プライマー対、即ち、二本鎖ＤＮＡ（コーディング鎖は「センス鎖」と称し、
その相補鎖は「アンチセンス鎖」と称する）の各相補鎖の一方の使用を含むもの
であり、これらは遺伝子の問題の領域の近傍に位置する部位でハイブリダイズす
るであろう。次いで、夫々のサイクルにおいて鎖延長ポリメリゼーション（連鎖
終止ヌクレオチドなし）が実施され、問題の領域の多くのコピーが多数回行われ
る。次いで、増幅されたオリゴヌクレオチドを反応混合物から分離し、シーケン
シング反応のための出発サンプルとして使用する。Gelfand et al.は熱安定性酵
素、即ち、微生物Thermus aquaticus由来の「Taqポリメラーゼ」を報告したが、
これは増幅プロセスに有用である（本明細書の一部をなす参照として本願に組み
込まれる米国特許第5,352,600号および同第5,079,352号を参照されたい）。
【００２１】 ここで用いる「群」の語は、一つの遺伝子座の対立遺伝子のサブセットを意味
し、その全てが、それらを他の群から識別する配列の特徴を共有するものである
。例えば、血清学的群反応性（リンパ球細胞障害性試験）は、HLA対立遺伝子の ための慣用的な基礎である。対立遺伝子の最初の２文字は、血清学的群を意味す
る。例えば、A*0201、A*0202、A*0217の名称で呼ばれるものは、全てA2群のメン
バーである。更に、典型的には、この命名法は血清学的スプリット群を意味する
（例えばA23およびA24は、A9の血清学的スプリットである）。
【００２２】 「群特異的配列モチーフ」は、一つまたは少数の群にのみ存在する核酸の、1 〜25ヌクレオチド（「nt」）の一般的には短い配列を意味する。HLA遺伝子座の 一つの領域において、モチーフが幾つかの群に共通している場合、耐遺伝子座の
他の領域における群特異的配列モチーフは、群を識別する特徴として役立つこと
ができる。該モチーフは、当該領域のためのコンセンサス配列をもった一以上の
ヌクレオチドを共有し得る。
【００２３】 「ハプロタイプ」とは、一つの染色体上に存在する対立遺伝子を意味する。
【００２４】 「ヘテロ接合」とは、少なくとも二つの異なる対立遺伝子の存在を意味する。
【００２５】 「ホモ接合」とは、単一種の対立遺伝子の存在を意味する。
【００２６】 「遺伝子座」とは、HLA-A, HLA-BまたはHLA-Cのような遺伝子を意味する。
【００２７】 「遺伝子座特異的」とは、或る遺伝子座にのみ関連した事象を意味する。; 「患者サンプル」とは、HLAタイピングを必要としている患者から採取した、 増幅反応を実施するための十分な量および質の核酸（好ましくはＤＮＡ）を含む
サンプルを意味する。適切な供給源の非制限的な例は、末梢血リンパ球、組織（
それから誘導された細胞培養物を含む）、粘膜切屑、および骨髄である。
【００２８】 「プライマーとは、鎖延長反応を開始するために役立ち得る、一般に5〜50ヌ クレオチドの長さのポリヌクレオチドである。
【００２９】 「シーケンシング」または「ＤＮＡシーケンシング」とは、遺伝子の少なくと
も一部におけるヌクレオチドの順序を決定することを意味する。シーケンシング
の周知の方法は、Sanger et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 74(12): 5463
-5467 (1977)（最近、EP-BI- 655506、およびシーケナーゼ 2.0 製品文献 (Amer
sham Life Sciences, Cleveland) incorporated herein by reference）におい て詳述された）によって最初に記載された「連鎖終止」法である。基本的に、こ
のプロセスではシーケンシングすべきＤＮＡが単離され、一本鎖にして四つの容
器の中に置かれる。各容器において、ＤＮＡ鎖を複製するために必要な成分には
、鋳型依存性のＤＮＡポリメラーゼ、シーケンシングすべきＤＮＡの既知領域に
対して相補的な短いプライマー分子、並びにプライマーとシーケンシングすべき
ＤＮＡとの間のハイブリダイゼーションおよびハイブリダイズしたプライマーの
鎖延長を誘導するバッファー中の個別のヌクレオチド三燐酸が含まれる。加えて
、各容器は少量の、一つのタイプの任意に検出可能に標識されたジデオキシヌク
レオチド三燐酸、例えばジデオキシアデノシン三燐酸（「ddA」）ジデオキシグ アノシン三燐酸（「ddG」）、ジデオキシシトシン三燐酸（「ddC」）、またはジ
デオキシチミジン三燐酸（「ddT」）を含む。各容器内において、単離されたＤ ＮＡの各片はプライマーとハイブリダイズする。次いで、このプライマーは一回
に一塩基づつ伸長されて、前記単離されたＤＮＡ片に対して相補的な新たな核酸
ポリマーを形成する。ジデオキシヌクレオチドが伸長するポリマー中に組み込ま
れると、これはポリマー鎖を終端させ、更なる伸長を妨げる。従って、各容器内
において、特定の長さの一組の伸長したポリマーが形成され、これは容器内のジ
デオキシ核酸に対応するヌクレオチドの位置の指標となる。次いで、配列を決定
するために、これらポリマーの組をゲル電気泳動を用いて評価する。
【００３０】 「特異的ハイブリダイゼーション」とは、核酸の鎖が、その相補的核酸に対し
てハイブリダイズすることを意味する。
【００３１】 「標的配列」とは、プライマーの特異的ハイブリダイゼーションのための好ま
しい部位を意味する。
【００３２】 「非翻訳領域」とは、ＲＮＡに転写されず、その結果タンパク質に翻訳されな
いHLA遺伝子座の一部を言う。非翻訳領域の例は、5’-および3’-フランキング 領域およびイントロン配列である。例えば、5'-フランキング領域は転写も翻訳 もされず、またイントロン配列は転写はされるが翻訳されない。
【００３３】
【好ましい実施の形態】
本発明は、患者サンプルのHLAクラスＩタイプを効率的かつ正確に決定するた めに使用できる組成物および方法に関する。
【００３４】 本発明は、一部は、HLAクラスＩ遺伝子座の群特異的配列モチーフの決定に基 づいている。これらのモチーフは、核酸増幅反応における群特異的プライマーと
して使用し得るオリゴヌクレオチドの設計に用いることができる。本発明はまた
、一部は、HLAクラスＩ遺伝子座の対立遺伝子の広範な変異領域の配列決定に基 づいている。このような配列は、或る対立遺伝子をもう一つの対立遺伝子から識
別するために使用することができる。HLA-Aの5’フランキング領域およびHLA-A のイントロン１，２および３の配列が本明細書に提供され、また図３〜図６に記
載されている。
【００３５】 一般に、本発明の方法は下記の通りである。HLAクラスＩ群のメンバー間でのH
LA遺伝子座のヌクレオチド配列（これらは非翻訳領域またはエキソン領域に存在
する）は、群特異的モチーフ配列を同定するために使用できる。群の同定は、図
７〜図９に示すように、血清学的関係によって、または系統発生情報を用いて確
立すればよい。群特異的モチーフ配列に基づいて、オリゴヌクレオチドプライマ
ーを設計し、合成し、HLA遺伝子座の一部を増幅するために使用することができ る。この方法で使用されるオリゴヌクレオチドを、ここでは「群特異的プライマ
ー」と称し、特に、場合応じて「群特異的非翻訳領域プライマー」または「群特
異的エキソン領域プライマー」と称する。
【００３６】 本発明の好ましい非制限的実施例において、これらのプライマーは、HLAクラ スＩ遺伝子座の非翻訳領域に対応する（「群特異的非翻訳領域プライマー」）。
このようなプライマーは対にして使用され、この対の各メンバーは、少なくとも
一つのエキソンの何れかの側にある非翻訳領域にハイブリダイズする。例えば、
プライマー対は、5’非翻訳領域と第一、第二、または第三のイントロン；第一 イントロンと第二または第三のイントロン；或いは第二のイントロンと第三のイ
ントロンにおける群特異的モチーフにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド対
であり得る。
【００３７】 本発明によれば、群特異的プライマーを幾つかの異なった方法で使用すること
ができる。第一シリーズの非限定的態様では、この群特異的プライマーは、何れ
の対立遺伝子群が患者サンプル中に存在するかを同定する診断的態様において使
用することができる。第二シリーズの非限定的態様では、この群特異的プライマ
ーは、十分な量の特定の対立遺伝子フラグメントを増幅し、次いで該フラグメン
トを、万能シーケンシングプライマーを用いた直接的なヌクレオチドシーケンシ
ングに付するために使用することができる。
【００３８】 第一シリーズの態様に従えば、本発明は、対象のHLAクラスＩ群タイプを決定 する方法であって； (i) 群特異的非翻訳領域プライマー対および対象由来の標 的ＤＮＡサンプルを、前記プライマーに基づく前記標的ＤＮＡの増幅が起きる条
件下で組み合わせるステップと； (ii) 前記増幅によって核酸生成物が生じたか
どうかを決定するステップとを具備し；核酸生成物を生じさせる前記プライマー
対の能力が、特定のHLA群タイプと関連している方法を提供する。この群特異的 プライマーは、群特異的エキソン領域プライマーまたは群特異的非翻訳領域プラ
イマーであり得る。関連の態様において、本発明は、対象のHLAクラスＩ群タイ プを決定する方法であって： (i) 対象の群タイプに対応した複数の群特異的な エキソン領域プライマー対および対象由来の標的ＤＮＡサンプルを、前記標的Ｄ
ＮＡのプライマーに基づく増幅が生じる条件下で組み合わせるステップと； (ii
) 前記増幅による核酸生成物のサイズを決定するステップと； (iii) 前記生成 物のサイズを、特定のHLA群タイプに関連した予測されるフラグメントのサイズ と相関させるステップとを具備する方法を提供する。この複数のプライマーは、
HLAカクテルと称する（図１および図２参照）これら第一の方法は、有用な診断 的情報を与えるために使用することができる。例えば、群タイプの決定は、含ま
れる特定の対立遺伝子を同定することなく、組織適合性を比較する第一のレベル
として役立ち得る。例えば、潜在的なドナーおよび宿主が組織移植について評価
され、それらの群タイプが適合しないときは、更なる比較が必要になる可能性が
ある。或いは、それらのタイプが適合しないときは、例えば、直接のシーケンシ
ングにより更なる分析を行う望ましい。
【００３９】 第二シリーズの実施例に従えば、本発明は、対象のHLAクラスＩ対立遺伝子タ イプを決定する方法であって： (i) 群特異的プライマー対と患者由来の標的Ｄ ＮＡサンプルとを、プライマーに基づく標的ＤＮＡの増幅が生じ得るような条件
下で組み合わせるステップと； (ii) 前記増幅の核酸生成物を回収するステップ
と； (iii) 該生成物の核酸配列を決定するステップとを具備する方法を提供す る。使用される群特異的プライマー対は、上記の第一の方法を用いて決定したよ
うにして、対象の群タイプに基づいて決定することができる。本発明の好ましい
態様においては、HLA遺伝子座の領域に広がる対立遺伝子特異的配列を含んだ群 特異的非翻訳領域プライマーを利用することができる。対象がヘテロ接合であれ
ば、同定される各群について、別の増幅反応が行われる（例えば、群A2および群
A3のためのフラグメントを増幅する別の反応）。シーケンシングは、HLA群また は対立遺伝子タイプに関係なく動作する万能シーケンシングプライマーを用いて
行うことができる。
【００４０】 本発明のより詳細な説明は下記の通りである。HLAクラスＩ遺伝子座の殆どの 対立遺伝子（HLA-A、HLA-BおよびHLA-Cを含む）は、エキソン２およびエキソン ３に基づいて識別することができる。一つの非制限的な態様において、本発明の
方法はこの事実を利用し、HLA-Aの例を使用して、図２に一般的に記載されたス トラテジーを用いる。ゲノムＤＮＡサンプルを、周知の技術に従って、患者サン
プルから調製する。次いで、このゲノムＤＮＡのアリコートを、群特異的エキソ
ン領域プライマー対と別々に反応させる（図２）。この場合、ＤＮＡフラグメン
トの首尾よい増幅は特定の群タイプに関連している。或いは、図２Ａに示すよう
に、サンプルの一部は群特異的エキソン領域プライマー対で処理してもよい。当
該カクテル中の各プライマー対は、群特異的なイントロン配列モチーフに特異的
にハイブリダイズするから、選択された対立遺伝子群のみを増幅するであろう。
それら間において、適切なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）条件の下に、当該カ
クテルは、各群特異的増幅生成物が異なった長さを有するように、全ての公知の
HLA-A群を増幅するかもしれない。反応生成物がアガロースゲル上で分離される とき、患者サンプル中に存在する群は長さによって同定することができる。
【００４１】 任意にではあるが、群特異性が決定されたら、正確な対立遺伝子を同定するた
めに、対立遺伝子の直接の配列を決定してもよい。図３に示すように、患者サン
プルＤＮＡの更なる部分を、ＰＣＲ条件の下に、先に決定した群に特異的なプラ
イマー対で処理してもよい。好ましくは、このようなプライマーは群特異的な非
翻訳領域プライマーであり、これは当該遺伝子座の大きな距離に広がっている。
二つの群が検出されたら、二つの別々の反応が行われる。第二の増幅が完了した
時点で、この反応生成物を、イントロンに基づく「万能プライマー」を用いてシ
ーケンシングする。該プライマーは、遺伝子座の全対立遺伝子の間で保存されて
いるイントロン配列にハイブリダイズする。理論的には、増幅された群にのみ特
異的なシーケンシングプライマーを使用することが可能であるが、万能プライマ
ーの使用により当該方法およびキットの調製を単純化できることが分かっている
。種々の万能シーケンシングプライマーがここに具体的に提供される（以下を参
照のこと）が、これらは夫々、エキソン２の5’末端、エキソン２の3’末端、エ
キソン３の5’末端、およびエキソン３の3’末端に隣接したイントロン配列にハ
イブリダイズする。
【００４２】 本発明の方法の実質的な利点は、最初の群特異的増幅が、患者サンプルの95％
において、ＰＣＲに基づくハプロタイプの分離を可能にすることである。ハプロ
タイプの分離は、他のプロトコールでは達成できないヘテロ接合の cis/trans 結合の分割を可能にするので、これは本発明の主な効果である。本発明では、ハ
プロタイプの分離は、血清学的科に対応する群特異的増幅を用いて、表２（下記
参照）に記載したシーケンシングプライマー混合物（「PMs」）と共に血清学的 ヘテロ接合サンプルにおいて達成できる。シーケンシングに使用するPMsの選択 は、先に行ったPCR-SSP低分解能タイピングの増幅パターンに依存する。プライ マーは１サイクルプロトコールで機能するように設計される。該プロトコールに
は、実験室のタイピング能力を維持するパーキンエルマーシステム9600上のＰＣ
Ｒプロトコールが含まれるが、これに限定されない。全てのＰＣＲ生成物は、完
全なサブタイピングのための十分な配列情報を有している。このアプローチは、
例え増幅ストラテジーが遺伝子座特異的であったとしても、一対の遺伝子プライ
マーの後に直接的シーケンシングまたはSSOハイブリダイゼーションを使用する タイピングシステムよりも優れている。配列に基づくタイピング（SBT）の実質 的な利点は、配列モチーフのcis/trans 結合の定義である。最初のＰＣＲ増幅後
のSTBは配列モチーフのcis/trans結合を定義できず、従って、オリゴタイピング
を模倣する。新たに同定された対立遺伝子の迅速に増大する数は、新たな対立遺
伝子が、通常は同じ遺伝子座の異なった対立遺伝子間で起きる遺伝子変換事象か
ら主に発生したことを確認する。新たに同定された対立遺伝子は、新たな配列モ
チーフによっては特徴付けされず、既存の配列の組合せによって同定される。こ
の所見から、各遺伝子座における対立遺伝子の量は理論的に、公知の配列モチー
フの可能な全ての組合せを表すと結論し得る。勿論、それらの幾つかは陰性選別
の犠牲になる。しかし、未だ膨大な量の対立遺伝子が同定されないままであると
思われる。全ての可能な配列モチーフをカバーしない、制限された数のオリゴヌ
クレオチドを用いたPCR-SSPサブタイピングストラテジーはこのような制限を受 ける。分析された多型領域のcis/trans結合が定義されなければ、幾つかの新た な対立遺伝子は、公知の対立遺伝子のヘテロ接合の組合せとしてミスタイピング
される可能性がある。これは、SBTストラテジーに関する結果を有する。元のＰ ＣＲ増幅後のSBTの曖昧なタイピング結果は、現在知られているHLA配列データバ
ンクに関して曖昧なだけである。しかし、新たな対立遺伝の検出に関しては、こ
の結果は時間が経つにつれて曖昧になる可能性がある。この所見は、ここ５年の
間に、ＰＣＲに基づくDRBIタイピングにおいて既になされており、また恐らくは
ＰＣＲに基づくクラスＩタイピングにおいても起こる可能性がある。上記の点を
考慮すると、今回のSBTアプローチのアイディアは、HLA-A, HLA-BおよびHLA-Cサ
ブタイプを同定するだけでなく、可能な限り多くの多型部位をカバーし、また多
型配列モチーフのcis/trans 結合を定義する。この方法で得られたタイピング結
果は、増大するHLA配列データバンクとは独立に、曖昧なまま残るであろう。
【００４３】 一般に、群特異的プライマーは、それらの意図した標的へのハイブリダイゼー
ションを促進するように望ましく設計される。異なる群間、および実際には群特
異的モチーフ間の相同性が存在することを考慮すべきである。従って、本発明の
好ましい態様において、プライマーは、それが相対的にストリンジェントな条件
下で、その群標的にハイブリダイズするように設計することができる。例えば、
一以上の不適合残基を、当該分子の3’ドメインの中に加工してもよい。更に、 該プライマーは、天然に存在する如何なる配列またはコンセンサス配列とも異な
り、むしろ意図した標的群以外の標的ＤＮＡに対するハイブリダイゼーションを
更に減少させるように働く、挿入された不適合を有するように設計することがで
きる。一定の環境下では、一以上の不適合を5’末端に導入して内部のヘアピン ループを不安低化してもよい。このような変化は一般的にはプライマーの効率を
向上しない 次の核酸配列は、HLA-Aのための群特異的非翻訳領域プライマーの中に含まれ 得るものであり、これらは表１に示したような群に特異的である。表１の中の配
列は、次の配列識別名を有する： 11-210は配列番号35であり、残りの配列 Il-2
30m〜I3-282は、それぞれ配列番号 181-202である。
【表１】
【００４４】
【表２】
【００４５】 本発明は、先に述べた配列またはその機能的等価物を有する領域を含む核酸分
子を提供する。
【００４６】 ここで定義した核酸配列の「機能的等価物」とは、核酸分子中に含まれたとき
に、ここに開示された配列の特異性を保持し、および／またはストリンジェント
なハイブリダイゼーション条件（例えば、65℃で１×ＳＳＣ）下で、開示された
配列の相補体にハイブリダイズする核酸配列を言う。
【００４７】 特定の非制限的例において、上記配列を含むオリゴヌクレオチドまたはその特
異性を保持する機能的等価物は、表２に示す長さの群特異的フラグメントを発生
させるために、下記の組合せでＰＣＲ増幅反応に使用することができる。
【表３】
【００４８】 以下の核酸配列は、表３（センスプライマー）および表４（アンチセンスプラ
イマー）に示した群に特異的な、HLA-Aのための群特異的エキソン領域プライマ ーの中に含まれ得る。表４中の配列、即ち、プライマー番号85, 118, 120, 123,
127, 129, 134, 137, 140, 160, 167, 175, 193および202は、それぞれ配列番 号203〜216を有する。表５中の配列、即ち、プライマー番号 98, 115, 116, 117
, 126, 133, 135, 136, 138, 142, 144, 145, 152, 153, 154, 155, 161, 165,
168,および180は、それぞれ配列番号217〜236を有し、またプライマー番号119は
配列番号245を有する。本発明は、先に述べた配列またはその機能的等価物を有 する領域を含んだ核酸分子を提供する。それらは、非限定的な例において、表５
に記載した対として使用することができる。
【表４】
【００４９】
【表５】
【００５０】
【表６】
【００５１】 一般に、先に述べた群特異的プライマーは、塩基の追加、削除または置換によ
って修飾して、実質的に同じ特異性を有する機能的に等価なプライマーを製造し
てもよい。即ち、群特異的多型性が除去されないように修飾してもよい。このよ
うな修飾は、幾つかのパラメータによって抑制される。第一に、3’末端での正 確なマッチングは、プライマー伸長にとって特に重要である。好ましくは、少な
くとも5 ntは標的ＤＮＡに対して相補的である。正確に保存された領域が短く、
例えば10 nt未満のときは、プライマー配列を変えることが推奨される。このプ ライマーは、好ましくは50％未満のＧまたはＣである。また、プライマーは、偽
遺伝子または非古典的HLAクラスＩ遺伝子座との特異的ハイブリダイゼーション を回避するように設計すべきである。後述の例では、均一な増幅条件を保証する
ために、全てのプライマーの融点は約62℃である。
【００５２】 シーケンシングの目的のために、以下の核酸配列は指示した位置で、指示した
遺伝子座の全ての対立遺伝子とハイブリダイズする配列（従って、万能シーケン
シングプライマーと称する）である。表６の中のプライマー類には、配列番号23
7〜244が連続的に付与される。
【表７】
【００５３】 上記で述べた三つの群のプライマーは、それぞれ、エキソン２および３を横切
ってシーケンシングするための5' および 3' プライマーを含む。
【００５４】 適切な万能シーケンシングプライマーの選択は、下記を含む種々のルールによ
って制限される。シーケンシングプライマーのハイブリダイゼーション部位は、
群特異的増幅プライマーによって増幅されたフラグメント内に存在しなければな
らない。全てのプライマーは、情報を含む配列を提供するように、また有用な配
列の遙か下流で開始しないように望ましく選択される。好ましいプライマーは、
エキソン／イントロン境界の近傍の保存された部位にハイブリダイズする。
【００５５】 第二および第三のエキソンの直接的シーケンシングは、第一、第二および第三
のイントロンの保存された領域に位置する上記表６のプライマーを用いて、指示
したように5’末端または3’末端から行うことができる。
【００５６】 HLAクラスＩ遺伝子のための直接的シーケンシングの重要な問題は、特異的な ＰＣＲ生成物の発生であり、これは幾つかの偽遺伝子を含む異なったHLAクラス Ｉ遺伝子座の間の広範な配列相同性に起因して、かなり複雑である。十分なＰＣ
Ｒ生成物が発生したならば、何れかのシーケンシング化学を適用することが可能
であろう。
【００５７】 通常の場合、群特異的増幅シーケンシングの前に起きるから、一度に一つの対
立遺伝子のみがシーケンシングされ、曖昧なホモ接合のシーケンシング結果を生
じる。これらの場合、対立遺伝子はソフトウエアがなくとも比較的同定し易い。
【００５８】 しかし、約5％の事例では、同じ群から二つの対立遺伝子現れるが、シーケン シングの結果はヘテロ接合を示す。実際に蛍光検出装置で見ると、サンプルは一
方の側に孤立的に二つの塩基を有し、夫々が半値ピーク高さを有する正常な塩基
配列のように見える。この結果は、書くHLA遺伝子の全ての対立遺伝子間で共有 された類似性の程度から生じ；配列のヘテロ接合性は、塩基置換から生じる。試
験配列に何れの対立遺伝子が存在するかを決定する面倒な仕事は、コンピュータ
分析を使用して単純化することができる。本件の譲受人であるVisible Genetics
社によって開発されたGeneLibrarianと称するソフトウエアプログラムは、当該 試験配列を、対立遺伝子の全ての可能なホモ接合とヘテロ接合の組合せを含むデ
ータベースと迅速に比較する。このプログラムは、試験配列に最も密接に適合す
るこれらの保存された配列を同定する。対で、オペレータは、何れの対立遺伝子
対が試験サンプル中に存在するかを決定することができる。対立遺伝子対が存在
しないことは、正確な適合性を示し、ソフトウエアは、オペレータが試験配列を
検討して、塩基呼び出しにおけるエラーまたは他のアーティファクトが分析を妨
害しているかどうかを決定する。
【００５９】 シーケンシング反応の順序は、オペレータが選択すればよい。各遺伝子座のエ
キソンは、センス鎖またはアンチセンス鎖上でシーケンシングすることができる
。好ましい方法は、各エキソンに由来する一つの鎖から配列を得るものである。
その結果が曖昧さを含むものであれば、当該アンプリコンは、同じエキソンのた
めの他のプライマーを用いて再度シーケンシングされる。両方のシーケンシング
プライマーの入手可能性は、確かな結果を保証するためのリダンダンシーを提供
する。
【００６０】 幾つかの場合、二以上のオリゴヌクレオチド種の等モル混合物を用いるのが有
利であろう。該オリゴヌクレオチド混合物は、それらの間で、同じ部位にある遺
伝子座の全ての対立遺伝子についてのシーケンシング反応を効果的にプライミン
グするように選択すればよい。
【００６１】 別の技術では、色素ターミネータを使用する代わりに、色素で標識されたプラ
イマーを使用することができる。この場合、選択されたシーケンシングプライマ
ーは、当該技術において周知のホスホロアミダイトまたはNHS/色素エステル技術
を用いて、5’末端に検出可能なラベルで標識される。このとき選択されるラベ ルは、使用する検出器に依存する。OpenGene System（Visible Genetics Inc.,
トロント, ON）と共に使用するラベルは、フルオロフォア(fluorophore) Cy5.5 （アマーシャムライフサイエンス社, クリーブランド, OH）である。フルオレセ
イン-イソチオシアネートを、ALF自動シーケンサー（ファルマシア社, Piscataw
ay NJ）と共に使用してもよい。当業者に周知のこの方法では、シーケンシング 反応混合物は、反応混合物当たり一つのddNTPのみを含むように若干変更される 。反応生成物の検出のために、このサンプルを等容量のローディングバッファ（
5%フィコール＋着色色素）と混合してもよい。MicroGene Blaster自動DNAシーケ
ンサー（Visible Genetics Inc., トロント）にロードされたMicroCel電気泳動 カセットの各レーン当たり、1.5μＬのこれらサンプルをロードすることができ る。このサンプルを電気泳動させて読みとればよい。
【００６２】 結果はGeneObjectsソフトウエアを用いて表示され、分析される。塩基の配列 が決定されて、該配列に対応するHLA対立遺伝子が同定される。このプロセスが 各遺伝子座（HLA-A, HLA-B, HLA-C）について行われ、その結果が患者ファイル に記録される。
【００６３】 異なる自動ＤＮＡシーケンシング装置と共に異なるバリエーションのシーケン
シング化学を使用できることは、当業者に周知である。単一色素の装置、例えば
OpenGene System（Visible Genetics Inc., トロント）、ALF Express（ファル マシア, Uppsala, スエーデン）またはLi-Cor 4000L（Lincoln City, ネブラス カ）は、一般に色素で標識されたプライマーを使用する。これらの装置では、レ
ーン当たり一つの連鎖終止シーケンシング反応混合物がランされる。
【００６４】 多重色素シーケンサー、例えば、Prism 377（アプライドバイオシステムズ社,
フォスターシティー, カリホルニア州）は、単一レーンにおける複数の色素を 検出する。この技術は色素ターミネータ化学を便利に使用するが、この場合、連
鎖終止ヌクレオチド自身がフルオロフォアで標識される（デュポン・ド・ヌモー
・アンド・カンパニーに付与された米国特許第5,332,666号を参照のこと）。こ の場合、一つのレーンに四つの異なった標識を有する反応生成物をランさせれば
よい。
【００６５】 本発明に従って、他のシーケンシング化学と共に、単一の色素または多重色素
の化学の何れかを用いてもよい。古典的HLAクラスＩ遺伝子座から詳細な配列情 報を得るために必要な反応の数を減少させるための追加の方法が、本願と共通人
の所有になる米国特許出願08/577,858号（単一トラックシーケンシング）並びに
08/640,672号および08/684,498号（単一管シーケンシング）に開示されている。
【００６６】 固体のHLA-Bタイプを決定するために、直接的に類似する方法を使用してもよ い。HLA-A遺伝子のときと同様に、HLA-B遺伝子の第二および第三エキソンは多型
であり、従って、シーケンシングに基づくタイピングストラテジーを提供する。
プライマーのリストが、それらの配列、長さおよび局在位置と共に、下記の表７
に与えられている。表７のプライマーには、連続的な配列番号398〜435が付され
ている。
【表８】
【００６７】
【表９】
【００６８】 HLA-Bタイピングのための適切なプライマー混合物を、下記の表８に列記する 。
【表１０】
【００６９】
【表１１】
【００７０】
【表１２】
【００７１】 HLA-Bタイピングに適したシーケンシングプライマーを、表９に列記する。
【表１３】
【００７２】 表９中のプライマーには、順に配列番号436-442が付与されている。
【００７３】 実施例８以下に記載のプロトコールは、前記記載の材料を使用してHLA-Bのタ イピングをするために使用し得る。
【００７４】 上記記載の核酸は、発明の方法を実践する際に使用するキット中に含まれる。
開示されたグループ特異性プライマー及びプライマー対に加え、このようなキッ
トには更に、緩衝液，試薬，Ｔａｑポリメラーゼを含む（しかしこれには限定さ
れないが）増幅酵素等の酵素を含んでいてもよい。具体的であるが非限定である
態様では、該キットは、グループ特異的エキソン領域プライマーを(例えば、複 数のプライマーからなる「カクテル」として)及びグループ特異的未翻訳領域プ ライマーを含んでいてもよく、このようなプライマーは、個々の試験管に入れら
れている。
【００７５】 具体的かつ非限定の発明の態様では、下記方法が使用されて、対立遺伝子のタ
イプわけ、ここでは、HLA-B例に挙げているがしかし、プライマーの選択によっ ては、HLA-Aに対しても同様に応用可能である。下記試薬が使用され得る。2.5 m
MデアザdNTP混合物（2.5mM dATP, 2.5 mM dCTP, 2.5mM dTTP, 2.5 mM dGTP, 1.2
5 mM 7-DEAZA dGTP）; 166mM硫酸アンモニウム（シグマ・バイオサイエンス）；
100% DEMO； PCRプライマー（例えば、表８から選択されたペア）；ゲノムＤＮ
Ａコントロール（６０ng/μｌ）；シークシンス緩衝液（260 mM Tris-HCl,pH8.3
, 39mM MgCl2）; 300:1デアザ・ターミネータ，これにはデアザＡターミネータ （750μM dATP、750μM dCTP、560μM dGTP，750μM dTTP、190μM ７デアザ
dGTP，2.5μM ddATP）, デアザC ターミネータ（750μM dATP、750μM dCTP、560μM dGTP，750μM dTTP, 190μM
７デアザdGTP，2.5μM ddCTP）、デアザGターミネータ（750μM dATP、750μ
M dCTP、560μM dGTP，750μM dTTP、190μM 7デアザdGTP，2.5μM ddGTP） 、デアザＴターミネータ（750μM dATP、750μM dCTP, 560μM dGTP，750μM d
TTP、190μM ７デアザdGTP，2.5μM ddTTP）、配列プライマ5x2 seq. 3x2 seq
. 5x3 seq. 3x3 seq. (例えば表9参照)、サーモシークエンナーゼ32Uμｌ（例え
ば、サーモシーケナーゼ・サイクル・シーケンシング・コア・キット）アマーシ
ャム・ライフサイエンス、製品番号ＵＳ79610）；酵素希釈緩衝液（10mM、Tris-
HCl, pH 8, 1 mM 2-ME, 0.5% (v/v), トウイーン‐20，0.5% (v/v)NP-40; 例え ばアマーシャム・ライフサイエンスより）；ピンク・ローデイング染料（アマー シャム）； 10X PCR緩衝液II（10 mM Tris-HCl, pH8.3, 500m M KCl）; Taq D
NAポリメラーゼ（例えば、パーキン・エルマーまたはロッシェ）25 mM MgCl2;分
子グレード水、及び鉱物油（サーモ・サイクラーを加熱蓋無しで使用する場合、
蒸発を防ぐため）。本方法に使用される装置には、サイモサイクラー（例：ＰＥ
9600 またはＭＪＰＴＣ）、この場合、ランピング時間は1℃／秒に調整され、 試験管及びトレイはサーモサイクラーのメーカーより提供され、この場合、ポリ
スチレンよりもポリプロプレン製の試験管及びトレイの使用が好ましい。
【００７６】 まず、前記パラグラフに言及されている具体的態様に準拠して、下記ＨＬＡロ
ーカス増幅プロトコールを使用してもよい。試薬(酵素を除く)は、室温で解凍し
、攪拌し、手短に微遠心（マイフロフユージ）し、使用するまで氷上に静置すれ
ばよい。酵素は、必要時に冷凍庫より取り出せばよい。次に氷上に下記のマスタ
ー混合物を下記順序（量は25μｌ反応物用）で混合することによって調整すれば
よい：分子グレード水7.75μｌ；10Ｘ ＰＣＲ緩衝液II（無MgCl2）2.5μｌ; 2.
5mMデアザdNTP混合物2.0μｌ; 25mM MgCl2 1.5μｌ; 100%DMSO 2.5μｌ; 166 mM
硫酸アンモニウム2.5μｌ；PCRプライマー1.0μｌ;及び５U／μｌ Tac ポリメ
ラーゼ0.25（ピペットを静かに上下して攪拌する）。該マスター混合物（容量20
μｌ）は、次に標識を付けた0.2ｍｌの薄壁増幅用試験管に入れられ、５μｌの6
0ng/μｌのゲノムDNAを加え、各反応につきDNAの最終濃度が300ngになるように 添加する。その結果得られた反応混合物を、サーモサイクラー中の下記サイクル
に供し、増幅させればよい。
【００７７】 (1) 94℃、5分、１サイクルで変性 (2) 94℃、30秒で変性 (3) 63℃、30秒でのアニ−リング、35サイクル (4) 72℃、60秒で伸張 (5) 72℃、5分で伸張、1サイクル (6) 4℃で浸漬、1サイクル
【００７８】 得られた増幅産物を分析するために、エチジウム・ブロマイドを含む１％アガ
ロース・ゲルを調整し、PCR産物４μｌをゲルに充填すればよい。次にサンプル をサイズ標識と共にゲル電気泳動にかけ、断片のサイズを求める産物のサイズを
比較すればよい（例えば表８を参照）。 得られた増幅産物を次に下記のようにシーケンシングすればよい。4つの.2 ml
の薄壁試験管を氷上に載置し、それぞれA、C，G、及びTと標識する。デアザA 、
C、 G、及び Tテーミネーターを各々3μｌを適宜標識された試験管中にいれる 。次に、サーモシーケナーゼ酵素を別の試験管で、氷上、１μｌのサーモシーケ
ナーゼに９μｌの酵素希釈緩衝液を混合することによって1／10に希釈する。別 の .5ｍｌ試験管に、氷上で、下記を混合してマスターシーケンシング混合物を
作成する：シーケンシング緩衝液2.5μｌ；シーケンシング・プライマー2.5μｌ
；100%DMSO3.5μｌ；増幅産物4.5μｌ、分子レベル水6.0μｌ；1／10希釈のサー
モシーケナーゼ3.0μｌ(全容量22μｌ)。前記マスターシーケンシング混合物を ５μｌをデアザターミネーターをいれた4本の試験管のそれぞれに添加する。必 要ならば、該反応混合物を8μｌの鉱物油でカバーして、下記サイクルシーケン シングに供してもよい。
【００７９】 (1) 94℃、2分、１サイクルで変性 (2) 94℃、30秒で変性 (3) 55℃、30秒でのアニ−リング、35サイクル (4) 70℃、60秒で伸張 (5) 72℃、2分で伸張、1サイクル (6) 4℃で浸漬
【００８０】 次に、反応産物をシーケンシング・ゲル上にかけ、標準技法を使用して増幅産
物の配列を確認すればよい。
【００８１】 高解像度のタイプわけの方法は、下記の実施例に詳述する。 実施例は、本発明の方法を実証するために述べられるが、それによって発明の範
囲が如何様にも限定されるものではない。
【００８２】 6．実施例 HLA-Aグループタイプの決定 ゲノムDNAは、標準の塩析手法（ピュア遺伝子DNA単離キット、Gentra System Inc., ミネアポリス）等の標準方法に準拠して、また洗剤及びプロテナーゼK 処理（分子生物の現行プロトコール、Eds. Ausubel, F.M. ら（John Wiley &
Sons;1995）によって患者のサンプルから調整された。
【００８３】 プライマーは全てGene Assembler plus（ファルマシア、ウプサラ、スウエー デン）上で合成され、高速蛋白液クロマトグラフィーで精製された。配列、長さ
、溶融温度（Tm）、プライマーのグループ特異性配置が表3に（センス・プライ マー）、４（アンチセンス・プライマー）、５(プライマー対)に掲載されている
。内部陽性コントロールプライマーは、５’プライマ−hGHI ５’GCC TTC CCA
ACC ATT CCC TTA 3'(配列番号336)、21 mer, Tm=64℃、核酸位置5560‐5580；３
’プライマーhGHI 5' TCC ATG TCC TTC CTG AAG CA 3'(配列番号349)20 mer, T
m=60℃、核酸位置6614-6633。これらのコントロールプライマーは、ヒト成長ホ ルモン遺伝子の1074bp断片を増幅する。
【００８４】 グループ特異性認識は、下記のように遂行された。ゲノムDNAを分取し、前記 表5に記載の24のグループ特異的エキソン領域プライマー対のパネルと別々に反 応させた(Blasczyk et al., 1995, Tissue Ant. 46:86-95)。プライマー対の増 幅カクテルを、5%のグリセロール、0.1μｌクレゾール赤ナトリウム塩(クレゾー
ル赤ストック溶液：10mg/ml)を補給した標準10xパーキンエルマー緩衝液(1x緩衝
液：50 mM KCl; 1.5 mM MgCl2; 10mM Tris-HCl, pH8.3; 0.001% (w/v)ゼラチン)
を使用して容積10μｌに調整した。グリセロール及びクレゾール赤を使用したの
は、アガロース・ゲル・ローデイング緩衝液を使用する必要性を排除するためで
ある。更に、グリセロールはPCR収量を増加させる。
【００８５】 SSP管一本当りのPCR混合物は下記の通りである： ゲノムDNA 100ng = 1.00μｌ Taqポリメラーゼ 0.4U = 0.08μｌ dNTPs, 10 mM = 0.80μｌ 緩衝液、10X = 1.00μｌ グリセロール = 0.50μｌ クレゾール赤１０mg/ml = 0.10μｌ dH2O = 1.52μｌ プラーマー対＋コントロールプライマー対 = 5.00μｌ 計 10.00μｌ
【００８６】 PCR溶液は、30反応に提供できるような容量で調整された。各10μｌPCR容量に
使用されるプライマーの量は、各HLA-Aプライマーにつき3 pmol、各内部コント ロール・プライマーにつき0.8 pmolである。
【００８７】 反応混合物を十分に混合し、サーモサイクラー9600（Perkin-Elmer, Inc）中 で加熱し、下記プロトコールに供した。最初の変性後、第一回目の10回の二つの
温度サイクルを行った後、20回の3つの温度サイクルを行った。
【００８８】 1) 95℃、5分初期変性 2) 第一回１０サイクル i) 95℃、３０秒変性 ii) 65℃、50秒アニーリング及び伸張 3) 最終２０サイクル i) 95℃、30秒変性 ii) 62℃、50秒アニーリング iii) 72℃、30秒伸張
【００８９】 次に、反応試験管を氷上で冷却した。視覚化のため、８μｌの増幅産物をエチ
ジウム・ブロマイド（0.2μg／ml）で予め染色した２％アガロース・ゲルにかけ
た。結果を既知のサイズ・マーカーをもつコントロール・レーンと比較した。反
応産物は、二本のバンド（異なるグループ由来の対立遺伝子）または一本のバン
ド（同じグループ由来の対立遺伝子）として視覚化された。バンドのサイズが決
定され、グループ特異性が表5の長さ指定に準拠して付与された。
【００９０】 図10及び11は、典型的なゲルの結果を示す。これは、図7及び8で示したように
解明され、テストされたゲノムDNAサンプル中にはどのグループの特異性が存在 するのかを決定する。図10及び11中、"位置"と標記されたカラムは表5のプライ マー混合物番号を称す。
【表１４】
【００９１】
【表１５】
【００９２】 7． 実施例：プライマー・カクテルを使用したグループ特異性の決定 患者のサンプルのグループ特異性低解像タイプわけが下記のように行われた。 まず、ストックPCR増幅反応混合物が30反応分、調整された。
【００９３】 μｌ dNTPs 10 mM 24 グリセロール100% 15 10X PCR緩衝液* 30 クレゾール赤（10 mg／ml） 3.0 H2O 45 最終 117
【００９４】 * 1X PCR緩衝液は、10MM TRis-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2及び0
.001%（w／ｖ）ゼラチンからなる。
【００９５】 該ストック混合物は、大量に調整してもよい。また、4℃で少なくとも１ヶ月 貯蔵してもよいし、あるいは、分取し（117.0μｌ）て−30℃で少なくても6ヶ月
貯蔵してもよい。解凍及び冷凍を繰り返すのは避けるべきである。
【００９６】 表５に掲載のＨＬＡ‐Ａグループ特異的増幅プライマーを全て含む混合物（い
わゆる"カクテル"）を別に調整してもよい。各プライマー対の一つの5’末端に 蛍光標識を付す。最終のカクテルの濃度は、5μｌ当り各ＨＬＡ‐Ａプライマー が3ｐmolになるようにデザインされる。選択的に、内部コントロール・プライマ
ーを（中でも増幅の成功を決定するために）5μｌ当り0.8pmolを添加してもよい
。適切な内部コントロール・プライマーは、ヒト成長ホルモン遺伝子（上記参照
）1074ｂｐの断片を増幅する。
【００９７】 低解像度の増幅反応を行うために、反応混合物は、下記のように調整され得る
。
【００９８】 容積 ストック混合物 5μｌ カクテル 5μｌ 患者サンプルＤＮＡ100-250 ng 1μｌ Taq ポリメラーゼ酵素0.4Ｕ 0.08μｌ
【００９９】 ＰＣＲサイクル・パラメターは、パーキン・エルマー・システム9600用に調整
される。最初の変性反応後、10回の2つの温度サイクルを行い、続いて20回の3つ
の温度サイクルを続ける。1)95℃、5分初期変性、2) 第一回１０サイクル、i)
95℃、３０秒変性、ii) 65℃、50秒アニーリング及び伸張、3) 最終２０サイ クル、i) 95℃、30秒変性、ii) 62℃、50秒アニーリング、iii) 72℃、30秒伸張
。 次に反応試験管を氷上で冷却する。視覚化のために、2μｌの増幅産物を、単 一核酸長さの解像を行なうマイクロジーン・ブラスター等のポリアクリルアミド
・ゲルにかけた。結果を既知のサイズ・マーカーをもつコントロール・レーンと 比較した。反応産物は、二本のバンド（異なるグループ由来の対立遺伝子）また
は一本のバンド（同じグループ由来の対立遺伝子）として視覚化された。バンド
のサイズが決定され、グループ特異性が表5の長さ指定に準拠して付与された。
【０１００】 8. シーケンシングによる対立遺伝子タイプの決定 グループ・タイプ特異性を決定した後、該患者サンプルを新しく分取してグル
ープ特異性増幅を、問題のグループに特異的な単一のプライマー対を使用して行
い、シーケンシングのテンプレートを生成した。好ましい非限定態様では、増幅
プライマーは、グループ特異的未翻訳領域プライマーを掲載している上記表２か
ら選択され得る。この二回目の増幅は二つの目的で行われた。第一に、増幅を成
功させることによって低解像テストのグループ決定を確認した。二番目に、増幅
によって、正確な対立遺伝子確認のために使用される配列情報を生成する。もし
２つのグループが確認されれば、それぞれ異なるプライマー対を使用した2つの 別々の反応が行われる。
【０１０１】 8.1 PCR プロトコール 同一ＰＣＲプロトコールが,テンプレート生成のために使用される全てのプラ イマー混合物に対して使用され得る。該ＰＣＲ増幅は、全量50μｌが、10以上の
シーケンシング反応用の十分なＰＣＲ産物を生成するために用意される。これは
シーケンシングの過程でもし何か失敗があっても、シーケンシングを新しいテン
プレートを作成せずに繰り返すことができるようにするためである。ＰＣＲの高
い厳密性と下記に詳述したプロトコールによって、”ホットスタートアプローチ
”の使用を不要にする。下記ＰＣＲ反応混合物が使用できる。
【０１０２】 反応当りの容量 5×PCRバッファー* 10.0μL DMSO 1.0μL 2.5mMの各dNTP 5.0μL ddＨ２Ｏ 27.8μL 合計 43.8μL センスプライマー**（10pmol/μL） 1.0μL アンチセンスプライマー**（10pmol/μL） 1.0μL Taqポリメラーゼ（5U/μL） 0.2μL ゲノムDNA（100ng/μL） 4.0μL 最終合計 50.0μL
【０１０３】 *５ＸのＰＣＲ緩衝液の組成：75ｍＭ（ＮＨ４）2ＳＯ４;17.5ｍＭ ＭｇＣｌ ２ 及び300ｍＭTris-HCl, pH 9.0 ** グループ特異性増幅プライマーのペアは前記表２に開示されたものから選 択される。
【０１０４】 ＰＣＲサイクルのパラメターは、パーキン・エルマー・システム9600サーマル
サイクル用に調整される。最初の変性反応後、10回の2つの温度サイクルで一回 目のラウンドを行い続いて20回の3つの温度サイクルを続ける。
【０１０５】 1) 95℃、5分初期変性、 2) 第一回１０サイクル i) 95℃、３０秒変性、 ii) 65℃、50秒アニーリング及び伸張、 3) 最終２０サイクル、 i) 95℃、30秒変性、 ii) 62℃、50秒アニーリング、 iii) 72℃、30秒伸張
【０１０６】 次に10μｌのＰＣＲ産物をエチジウム・ブロマイド（0.2μｌ／ｍｌ）で予め 染色した２％アガロース・ゲルにかける。所期のサイズの明瞭なバンドが見える
はずである。
【０１０７】 8.2 シーケンシング反応プロトコール シーケンシング反応はReady Reaction DyeDeoxy Terminator Cycle シーケン シング・キットFS (Perkin Elmer Applied Biosystem Division, Foster City,
CA)を使用してAmpriTaqTM DNAポリメラーゼＦＳ染色ターミネータ・サイクル・ シーケンシング化学反応によって、メーカーのプロトコールに準拠して実施され
得る。このキットには、異なる蛍光標識（染色ターミネータ）のついた4つのddN
TPが含まれている。ＰＣＲ断片は、事前の精製工程を何も経ずに直接シーケンシ
ング用に使用される。
【０１０８】 ピペット操作工程を簡単にするため、５’バイオチン標識されたシーケンシン
グプライマーddH2O及びキット試薬からなるマスター混合物を調整する。このマ スター混合物は、使用直前に調整すべきであり使用時までは室温に保管してもよ
い。シーケンシング・マスター混合物は、一回の反応用に、シーケンシング・プ
ライマー1pmon/μｌ溶液に3.0μｌ、6.0μｌddH2O、及び予め混合されたシーケ ンシング試薬8.0μｌ；３６＋１反応物用に、これらの量はそれぞれ、111.0μｌ
、222.0μｌ、及び296.0μｌに増加される。シーケンシング・プライマーは、上
記表6に記載のＨＬＡ‐Ａ用のシーケンシング・プライマーから選択され得る。
【０１０９】 マスター混合物は、200μｌＰＣＲ試験管中の各シーケンシング反応につき17 μｌ容量分取され、未精製のＰＣＲ産物3μｌを添加する。次に、反応混合物は 、パーキン・エルマー・サーマル・サイクル9600での25サイクルに供される。各
サイクルは、10秒95℃、5秒50℃、4分60℃からなる。
【０１１０】 8.3 伸張産物の精製 シーケンシング反応後、伸張産物は、未組み込みDye terminators から分離されるのが望ましい。さもなければ、未組み込みDye terminatorsが、 電気泳動で分離された配列断片の蛍光をもとにした検出過程を阻害することにな
る。
【０１１１】 各シーケンシング反応用に、50μｇ（5μｌ）ストレプトアビデインで被覆さ れたダイナビーズM-280 （Dynal Inc. Oslo, Norway）が、5μｌの ２Ｘ結合洗浄緩衝液（"B&W", 2XのB&W洗浄緩衝液；２M NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH7.5, 1 mM EDTA)で洗浄される. 該ビーズは次に20μｌのＢ&Ｗ中 に再懸濁される。
【０１１２】 各20μｌのシーケンシング反応には、20μｌの再懸濁されたビーズが添加され
、混合物は室温（20‐25℃）で15分間インキュベートされる。該ビーズは次に固
定され、上澄みが除去され、次にビーズが70%エタノールでピペットの上下に５ 回動かすことにより一度洗浄される。そしてエタノールをできる限り除去するの
が望ましい。というのは、エタノールは電気泳動ゲルの可動性を阻害し得るから
である。
【０１１３】 各シーケンシング反応について、４μｌのローデイング緩衝液（５：１ホルム
アミド２５mM EDTA, pH8.0、50 mg/ml デキストラン・ブルー）を添加してもよ い。
【０１１４】 8.4 電気泳動及びデータ収集 前記方法によって調整されたサンプルは、すぐに使用してもよいし、電気泳動
分離を開始する前に少なくとも２４時間４℃に貯蔵してもよい。電気泳動分離の
前に、各反応物は９０℃２分インキュベートし、各サンプルから３μｌを予備シ
ーケンシング・ゲルに充填する。自動ABI 377シークエンサー（Applied Biosyst
ems, Foster City, CA）用に、0.2 mm厚の５％ポリアクリルアミド（アクリルア
ミド、ビスアクリルアミド＝２９：１）‐７Ｍ尿素ゲルを使用し得る[ゲル組成 ：21.0g尿素、8.4ｍｌ30%アクリルアミド（ストック溶液：二回蒸留した水中に ５８ｇアクリルアミド、２ｇビスアクリルアミド）、6.0ｍｌTBE緩衝液（10x T
BE緩衝液；108.0g tris塩、55.0gホウサン、7.4gNa2 EDTA）、15μｌTEMED, 3
50μｌ10%アンモニウム・パー・サルフェート（10mlのddH2O中に1.0g アンモニ
ウム・パー・サルフェート）、20.0mlのddH2O]。電気泳動は、一定の48ワット8 時間で稼動させ得る。データ収集は、ABI377で電気泳動を開始した直後に開始す
る。データ分析は、そのあとABI分析ソフトウエア(バージョン2.2.1)を使用して
行う。
【０１１５】 8.5 データ解析及びHLAタイピング データ収集の後、クロマトグラムを印刷し、配列をEMBLデータバンクにあるHL
Aデータ及びArnett and Parhamによって集められた配列とを人手によって比較す
る。グループ特異的増幅及びヘテロザイゴート位置が欠損しているため、人手に
よる分析が通常非常に早い。または、配列をデータ分析エデイター（Sequence N
avigator TM, Applied Biosystem）によっチエックし、いずれの配列整列プログ
ラムによって整列される。
【０１１６】 様々な出版物をここでは引用した。その内容は参照によってその全容をここに
収容している。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、HLAクラスＩシーケンシングの基本方針の原理を示す説明図である。 群特異的プライマーがＰＣＲ増幅のために使用され、増幅された群とは無関係に
、第二イントロンに位置する万能プライマーがシーケンシングに使用される。5'
FR= 5'フランキング領域；5' UTR= 5'非翻訳領域（エキソン１におけるATG開始 コドンから -1 〜 -23）
【図２】 HLA-A群特異的プライマーのカクテルを用いて、患者サンプル中に含まれる標 的ＤＮＡを増幅する本発明の方法を模式的に示す説明図である。次いで、増幅生
成物をアガロースゲルで電気泳動的に分離し、群Ａ２および群Ａ３に対応するフ
ラグメントの移動度による同定を可能にする。次いで、群Ａ２およびＡ３に特異
的なプライマーを用い、標的ＤＮＡの複製サンプルを別の反応で増幅してＡ２お
よびＡ３フラグメントを生成し、次いで万能シーケンシングプライマーを用いて
これを配列決定する。図２Ｃおよび図２Ｄは、プライマー対のパネルを用いた別
の反応において、ゲノムＤＮＡのアリコートの反応により群タイプ特異性を決定
する基本指針を示す説明図である。
【図３】 HLA-A群特異的プライマーのカクテルを用いて、患者サンプル中に含まれる標 的ＤＮＡを増幅する本発明の方法を模式的に示す説明図である。
【図４】 種々の対立遺伝子におけるHLA-A5’フランキング領域の核酸配列を示す図であ
り、コンセンサス配列（配列番号:2）および下記の隊列遺伝子の配列を含む： A*0101(配列番号:2); A*0301(配列番号:3); A*1101(配列番号:4); A*1102(配列 番号:5); A*3001(配列番号:6); A*3002(配列番号:7); A*3004(配列番号:8); A*0
201-11(配列番号:9); A*0215(配列番号:10); A*0217(配列番号:1l); A*6801(配 列番号:12); A*6802(配列番号:13); A*6901(配列番号:14); A*2301(配列番号:15
); A*2402(配列番号:16); A*2403(配列番号:17); A*2404(配列番号:18); A*2405
(配列番号:19); A*2407(配列番号:20); A*2501(配列番号:21); A*2601(配列番号
:22); A*3402(配列番号:23); A*4301(配列番号:24); A*6601(配列番号:25); A*6
602(配列番号:26); A*6603(配列番号:27); A*2901(配列番号:28); A*2902(配列 番号:29); A*31012(配列番号:30); A*3201(配列番号:31); A*3301(配列番号:32)
; A*3303(配列番号:33); A*7401(配列番号:34); A*7402(配列番号:36); A*7403(
配列番号:37); 及びA*8001(配列番号:38).
【図５】 種々の対立遺伝子におけるHLA-A5’フランキング領域の核酸配列を示す図であ
る。
【図６】 種々の対立遺伝子におけるHLA-A5’フランキング領域の核酸配列を示す図であ
る。
【図７】 種々の対立遺伝子におけるHLA-A5’フランキング領域の核酸配列を示す図であ
る。
【図８】 種々の対立遺伝子におけるHLA-A5’フランキング領域の核酸配列を示す図であ
る。
【図９】 種々の対立遺伝子におけるHLA-Aイントロン１の核酸配列を示す図であり、コ ンセンサス配列（配列番号:39）、並びに下記の対立遺伝子の配列を含む： A*0101(配列番号:40); A*0301(配列番号:41); A*1101(配列番号:42); A*1102(配
列番号:43); A*3001(配列番号:44); A*3002(SEQlDN0:45); A*3004(配列番号:46)
; A*0201(配列番号:47); A*0202(配列番号:44); A*0203(配列番号:49); A*0204(
配列番号:50); a*0205(配列番号:5l); A*0206(配列番号:52); A*0207(配列番号:
53); A*0207(配列番号:54); A*0208(配列番号:55); A*0209(配列番号:56); A*02
10(配列番号:57); A*0211(配列番号:58); A*0215(配列番号:59); A*0217(配列番
号:60); A*6801(配列番号:61); A*6802(配列番号:62); A*6901(配列番号:63); A
*2301(配列番号:64); A*2402(配列番号:65); A*2403(配列番号:66); A*2404(配 列番号:67); A*2405(配列番号:68); a*2407(配列番号:69); A*2501(配列番号:70
); A*2601(配列番号:71); A*3402(配列番号:72); A*6601(配列番号:73); A*6602
(配列番号:74)A*6603(配列番号:75); A*4301(配列番号:76); A*2901(配列番号:7
7); A*2902(配列番号:78); A*3101(配列番号:79); A*3201(配列番号:80); A*330
1(配列番号:81); A*3303(配列番号:82); A*7401(配列番号:83); A*7402(配列番 号:84); A*7403(配列番号:85); 及びA*8001(配列番号:86).
【図１０】 種々の対立遺伝子におけるHLA-Aイントロン２の核酸配列を示す図であり、コ ンセンサス配列（配列番号:87）、並びに下記の対立遺伝子の配列を含む： A*0101(配列番号:88); A*0201(配列番号:89); A*0202(配列番号:90); A*0203(配列番号:91); A*0204(配列番号:92); A*0205(配
列番号:93); A*0206(配列番号:94); A*0207(配列番号:95); A*0208(配列番号:96
); A*0209(配列番号:97); A*0210(配列番号:98); A*0211(配列番号:99); A*0215
(配列番号:100); A*0217(配列番号:101); A*6801(配列番号:102); A*6802(配列 番号:103); A*6901(配列番号:104); A*2501(配列番号:105); A*2601(配列番号:1
06); A*4301(配列番号:107); A*6601(配列番号:108); A*6602(配列番号:109); A
*6603(配列番号:110); A*3402(配列番号:111); A*2901(配列番号:112); A*2902(
配列番号:113); A*3101(配列番号:114); A*3201(配列番号:115); A*3301(配列番
号:116); A*3303(配列番号:117); A*7401(配列番号:118); A*7402(配列番号:119
); A*7403(SEQH)N0:120); A*2301(配列番号:121); A*2402(配列番号:122); A*24
03(配列番号:123); A*2404(配列番号:124); A*2405(配列番号:125); A*2407(配 列番号:126); A*0301(配列番号:127); A*1101(配列番号:128); A*1102(配列番号
:129); A*3001(配列番号:130); A*3002(配列番号:131); A*3004(配列番号:132);
及びA*8001(配列番号:133).
【図１１】 種々の対立遺伝子におけるHLA-Aイントロン２の核酸配列を示す図である。
【図１２】 種々の対立遺伝子におけるHLA-Aイントロン３の核酸配列を示す図であり、コ ンセンサス配列（配列番号:134）並びに下記の対立遺伝子の配列が含まれている
： A*0101(配列番号:135); A*0301(配列番号:136); A*1101(配列番号:137); A*1102
(配列番号:138); A*3001(配列番号:139); A*3002(配列番号:140); A*3004(配列 番号:141); A*0201(配列番号:142); A*0202(配列番号:143); A*0203(配列番号:1
44); A*0204(配列番号:145); A*0205(配列番号:146); A*0206(配列番号:147); A
*0207(配列番号:148); A*0208(配列番号:149); A*0209(配列番号:150); A*0210(
配列番号:151); A*0211(配列番号:152); A*0215(配列番号:153); A*0217(配列番
号:154); A*6801(配列番号:155); A*6802(配列番号:156); A*6901(配列番号:157
); A*2301(配列番号:158); A*2402(配列番号:159); A*2403(配列番号:160); A*2
404(配列番号:161); A*2405(配列番号:162); A*2407(配列番号:163); A*2501(配
列番号:164); A*2601(配列番号:165); A*3402(配列番号:166); A*4301(配列番号
:167); A*6601(配列番号:168); A*6602(配列番号:169); A*6603(配列番号:170);
A*2901(配列番号:171); A*2902(配列番号:172); A*3101(配列番号:173); A*320
1(配列番号:174); A*3301(配列番号:175); A*3303(配列番号:176); A*7401(配列
番号:177); A*7402(配列番号:178); A*7403(配列番号:179); 及びA*8001(配列番
号:180).
【図１３】 種々の対立遺伝子におけるHLA-Aイントロン３の核酸配列を示す図である。
【図１４】 種々の対立遺伝子におけるHLA-Aイントロン３の核酸配列を示す図である。
【図１５】 種々の対立遺伝子におけるHLA-Aイントロン３の核酸配列を示す図である。
【図１６】 種々の対立遺伝子におけるHLA-Aイントロン３の核酸配列を示す図である。
【図１７】 HLA-A遺伝子の5’フランキング領域および5’非翻訳領域の系統発生ツリーを 示す図である。
【図１８】 HLA-A遺伝子のイントロン１〜３の系統発生ツリーを示す図である。
【図１９】 HLA-B遺伝子のイントロン１〜３の系統発生ツリーを示す図である。
【図２０】 群特異的なエキソン領域プライマーを用いてHLA-A群タイプを決定した増幅の 結果を示す電気泳動図であり、ここでは群特異性が6601および3201であると決定
された（表７参照）。
【図２１】 群特異的エキソン領域プライマーを用いてHLA-A群タイプを決定する増幅の結 果を示す電気泳動写真であり、ここでは群特異性が020xおよび680xであることが
決定された（表８参照）。
【図２２】 HLA-Bの第一イントロンの核酸配列を示す図であり、コンセンサス配列（配列 番号:246）並びに下記の対立遺伝子の配列が含まれている： B*0702(配列番号:247), B*0801(配列番号:248), B*1302(配列番号:249), B*1401
(配列番号:250), B*1402(配列番号:251), B*1501(配列番号:252), B*1502(配列 番号:253), B*1505(配列番号:254), B*1508(配列番号:255), B*1510(配列番号:2
56), B*1512(配列番号:251), B*1513(配列番号:258), B*1517(配列番号:259), B
*1525(配列番号:260), B*1532(配列番号:261), B*1801(配列番号:262), B*1805(
配列番号:263), B*27052(配列番号:264), B*27053(配列番号:265), B*2707(配列
番号:266), B*3501(配列番号:267), B*3502(配列番号:268), B*3503(配列番号:2
69), B*3701(配列番号:270), B*3801(配列番号:271), B*3901(配列番号:272), B
*3903(配列番号:273), B*3906(配列番号:274), B*4001(配列番号:275), B*4002(
配列番号:276), B*4101(配列番号:277), B*4102(配列番号:278), B*4201(配列番
号:279), B*4402(配列番号:280), B*4403(配列番号:281), B*4501(配列番号:282
), B*4601(配列番号:283), B*4701(配列番号:284), B*4801(配列番号:285), B*4
901(配列番号:286), B*5001(配列番号:287), B*5101(配列番号:288), B*5108(配
列番号:289), B*5201(配列番号:290), B*5301(配列番号:291), B*5401(配列番号
:292), B*5501(配列番号:293), B*5601(配列番号:294), B*5701(配列番号:295),
B*5801(配列番号:296), B*5901(配列番号:297), B*6701(配列番号:298), B*730
1(配列番号:299).
【図２３】 HLA-Bの第二イントロンの核酸配列を示す図であり、コンセンサス配列（配列 番号:301）並びに下記の対立遺伝子の配列が含まれている： B*0702(配列番号:301), B*0801(配列番号:302), B*1302(配列番号:303), B*1401
(配列番号:304), B*1402(配列番号:305), B*1501(62)(配列番号:306), B*1505(6
2)(配列番号:307), B*1508(62)(配列番号:308), B*15l0(71)(配列番号:309), B*
1513(77)(配列番号:310), B*1517(63)(配列番号:311), B*1525(62)(配列番号:31
2), B*1532(62)(配列番号:313), B*1801(配列番号:314), B*2702(配列番号:315)
, B*2704(配列番号:316), B*27052(配列番号:317), B*27053(配列番号:318), B*
2707(配列番号:319), B*3501(配列番号:320), B*3502(配列番号:321), B*3503( 配列番号:322), B*3507(配列番号:323), B*3508(配列番号:324), B*3701(配列番
号:325), B*3801(配列番号:326), B*3901(配列番号:327), B*3903(配列番号:328
), B*3906(配列番号:329), B*4001(配列番号:330), B*4002(配列番号:331), B*4
101(配列番号:332), B*4102(配列番号:333), B*4201(配列番号:334), B*4402(配
列番号:335), B*4403(配列番号:337), B*4501(配列番号:338), B*4601(配列番号
:339), B*4701(配列番号:340), B*4801(配列番号:341), B*4901(配列番号:342),
B*5001(配列番号:343), B*5101(配列番号:344), B*5108(配列番号:345), B*520
1(配列番号:346), B*5301(配列番号:347), B*5401(配列番号:348), B*5501(配列
番号:350), B*5601(配列番号:351), B*5701(配列番号:352), B*5801(配列番号:3
53), B*5901(配列番号:354), B*6701(配列番号:355), B*7301(配列番号:356).
【図２４】 HLA-Bの第二イントロンの核酸配列を示す図である。
【図２５】 HLA-Bの第三イントロンの核酸配列を示す図であり、コンセンサス配列（配列 番号:357）並びに下記の対立遺伝子の配列が含まれている： B*0702(配列番号:358), B*0801(配列番号:359), B*1302(配列番号:360), B*1401
(配列番号:361), B*1402(配列番号:362), B*1501(配列番号:363), B*1502(配列 番号:364), B*1510(配列番号:365), B*1513(配列番号:366), B*1517(配列番号:3
67), B*1525(配列番号:368), B*1801(配列番号:369), B*27052(配列番号:370),
B*27053(配列番号:371), B*3501(配列番号:372), B*3502(配列番号:373), B*350
3(配列番号:374), B*3701(配列番号:375), B*3801(配列番号:376), B*3903(配列
番号:377), B*3906(配列番号:378), B*4001(配列番号:379), B*4002(配列番号:3
80), B*4101(配列番号:381), B*4102(配列番号:382), B*4201(配列番号:383), B
*4402(配列番号:384), B*4403(配列番号:385), B*4501(配列番号:386), B*4601(
配列番号:387), B*4701(配列番号:388), B*4901(配列番号:389), B*5001(配列番
号:390), B*5101(配列番号:391), B*5108(配列番号:392), B*5201(配列番号:393
), B*5301(配列番号:394), B*5401(配列番号:395), B*5501(配列番号:396), B*5
601(配列番号:397).
【図２６】 HLA-Bの第三イントロンの核酸配列を示す図である。
【図２７】 HLA-Bの第三イントロンの核酸配列を示す図である。
【図２８】 HLA-Bの第三イントロンの核酸配列を示す図である。
【図２９】 HLA-Bの第三イントロンの核酸配列を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ロイシュナー、ジェイムス カナダ国、エム５エム・４エム３、オンタ リオ、ノース・ヨーク、シルバン・バリ ー・ウエイ 84 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 CA20 HA11 HA20 4B063 QA01 QA13 QA18 QQ02 QQ42 QR07 QR62 QS02 QS25 QX01

Claims (14)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 対象のHLA-Bクラス１群タイプを決定する方法であって： (i) 群特異的非翻訳領域プライマー対および対象由来の標的ＤＮＡサンプルを
    、前記プライマーに基づく前記標的ＤＮＡの増幅が起きる条件下で組み合わせる
    ステップと； (ii) 前記増幅によって核酸生成物が生じたかどうかを決定するステップとを 具備し、 核酸生成物を生じさせる前記プライマー対の能力が、特定のHLA群タイプと関 連している方法。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載の方法であって：更に、 (iii) ステップ(ii)の核酸生成物の核酸配列を決定するステップを具備する方
    法。
  3. 【請求項３】 請求項１に記載の方法であって、前記プライマー対が、下記
    からなる群から選択される１以上のオリゴヌクレオチドプライマーを含む方法：
    E1-B121ml17, El-B129, E1-B130, E1-B136, E1-B182, I1-B145, I1-B154m, I1-
    B167, I1-B168, I1-B169, I1-B170, I1-B171, I1-B172, I1-B173, I1-B174, I1-
    B175, I1-B326, I1-B331, I1-B346, I3-B126, I3-B147, I3-B164, I3-B165, I3-
    B166, I3-B187, I3-B212, I3-B305, I3-B319, I3-B320, I3-B321, I3-B323, I3-
    B332, I3-B335, I3-B337, I3-B342, I3-B347, I3-B348, 及び B-B349。
  4. 【請求項４】 請求項１に記載の方法であって、前記プライマー対が、下記
    の対からなる群から選択される方法： I1-B174 及び I3-B305; I1-B167 及び I3
    -B323; I1-B175 及び I3-B319; I1-B145及びI3-B321; E1-B121m17及びI3-B147;
    I1-B154m及びI3-B164; E1-B182 及び I3-B349; I1-B168 及び I3-B212; I1-B326
    及び I3-B165; I1-B167 及び I3-B320; I1-B172 及び I3-B342; I1-B172 及び
    I3-B323; I1-B174 及び I3-B323; I1-B170 及び I3-B126; I1-B326 及び I3-B34
    8; I1-B331 及び I3-B332; I1-B326 及び I3-B337; I1-B326及びI3-B187; I1-B1
    69及びI3-B166; I1-B171 及びI3-B347; I1-B173及びI3-B335; I1-B168 及び I3-
    B212; I1-B346 及び I3-B126; I3-B326 及び I3-B126; I1-B167 及び I3-B126;
    I1-B168 及び I3-B126 E1-B129 及び I3-B126; E1-B130 及び I3-B126; E1B-182
    及び I3-B126; 及び E1B-136 及び I3-B126。
  5. 【請求項５】 群タイプが知られている対象のHLA-BクラスＩタイプを決定 する方法であって： (i) 対象の群タイプに対応した群特異的非翻訳領域プライマー対および対象由
    来の標的ＤＮＡサンプルを、前記標的ＤＮＡのプライマーに基づく増幅が生じて
    第二の核酸生成物が製造される条件下で組み合わせるステップと； (ii) ステップ(i)で採取された第二の核酸生成物の核酸配列を決定するステッ
    プとを具備する方法。
  6. 【請求項６】 請求項５に記載の方法であって、(1)で用いられる前記群特 異的非翻訳領域プライマー対が、下記からなる群から選択される一以上のオリゴ
    ヌクレオチドプライマーを含む方法： E1-B121m17, E1-B129, E1-B130, E1-B136
    , E1-B182, I1-B145, I1-B154m, I1-B167, I1-B168, I1-B169, I1-B170, I1-B17
    1, I1-B172, I1-B173, I1-B174, I1-B175, I1-B326, I1-B331, I1-B346, I3-B12
    6, I3-B147, I3-B164, I3-B165, I3-B166, I3-B187, I3-B212, I3-B305, I3-B31
    9, I3-B320, I3-B321, I3-B323, I3-B332, I3-B335, I3-B337, I3-B342, I3-B34
    7, I3-B348, 及び I3-B349。
  7. 【請求項７】 請求項５に記載の方法であって、(1)で用いられる前記群特 異的非翻訳領域プライマー対が、下記からなるオリゴヌクレオチドプライマーの
    群から選択される方法： I1-B174 及び I3-B305; I1-B167 及び I3-B323; I1-B1
    75 及び I3-B319; I1-B145 及び I3-B321; E1-B121m17 及び I3-B147; I1-Bl54m
    及び I3-B164; E1-B182 及び I3-B349; I1-B168 及び I3-B212; I1-B326 及び
    I3-B165; I1-B167 及び I3-B320; I1-B172 及び I3-B342; I1-B172 及び I3-B32
    3; I1-B174 及び I3-B323; I1-B170 及び I3-B126; I1-B326 及び I3-B348; I1-
    B331 及び I3-B332; I1-B326 及び I3-B337; I1-B326 及び I3-B187; I1-B169 及び I3-B166; I1-B171 及び I3-B347; I1-B173 及び I3-B335; I1-B168 及び I
    3-B212; I1-B346 及び I3-B126; I3-B326 及び I3-B126; I1-B167 及び I3-B126
    ; I1-B168 及び I3-B126 E1-B129 及び I3-B126; E1-B130 及び I3-B126; E1B-1
    82 及び I3-B126; 及び E1B-136 及び I3-B126。
  8. 【請求項８】 下記からなる群から選択される一以上のオリゴヌクレオチド
    プライマーを含んだ複数のオリゴヌクレオチドプライマー対を含有する組成物：
    E1-B121m17, E1-B129, E1-B130, E1-B136, E1-B182, I1-B145, I1-B154m, I1-B
    167, I1-B168, I1-B169, I1-B170, I1-B171, I1-B172, I1-B173, I1-B174, I1-B
    175, I1-B326, I1-B331, I1-B346, I3-B126, I3-B147, I3-B164, I3-B165, I3-B
    166, I3-B187, I3-B212, I3-B305, I3-B319, I3-B320, I3-B321, I3-B323, I3-B
    332, I3-B335, I3-B337, I3-B342, I3-B347, I3-B348, 及び I3-B349。
  9. 【請求項９】 下記からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドプライマ
    ーを含有する組成物： E1-B121m17, E1-B129, EI-B130, E1-B136, EI-B182, I1-
    B145, I1-B154m, I1-B167, I1-B168, I1-B169, I1-B170, I1-B171, I1-B172, I1
    -B173, I1-B174, I1-B175, I1-B326, I1-B331, I1-B346, I3-B126, I3-B147, I3
    -B164, I3-B165, I3-B166, I3-B187, I3-B212, I3-B305, I3-B319, I3-B320, I3
    -B321, I3-B323, I3-B332, I3-B335, I3-B337, I3-B342, I3-B347, I3-B348, 及
    び I3-B349。
  10. 【請求項１０】 下記からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド対を含
    有する組成物： I1-B174 及び I3-B305; I1-B167 及び I3-B323; I1-B175 及び
    I3-B319; I1-B145 及び I3-B321; E1-B121m17 及び I3-B147; I1-B154m 及び I3
    -B164; E1-B182 及び I3-B349; I1-B168 及び I3-B212; I1-B326 及び I3-B165;
    I1-B167 及び I3-B320; I1-B172 及び I3-B342; I1-B172 及び I3-B323; I1-B
    174 及び I3-B323; I1-B170 及び I3-B126; I1-B326 及び I3-B348; I1-B331 及
    び I3-B332; I1-B326 及び I3-B337; I1-B326 及び I3-B187; I1-B169 及び I3-
    B166; I1-B171 及び I3-B347; I1-B173 及び I3-B335; I1-B168 及び I3-B212;
    I1-B346 及び I3-B126; I3-B326 及び I3-B126; I1-B167 及び I3-B126; I1-B16
    8 及び I3-B126 EI-B129 及び I3-B126; E1-B130 及び I3-B126; E1-B182 及び
    I3-B126; 及び E1-B136及び I3-B126。
  11. 【請求項１１】 (a) 下記から生る群から選択される一以上のプライマーを
    含む複数のオリゴヌクレオチド群特異的非翻訳領域プライマー対と； E1-B121m1
    7, E1-B129, E1-B130, E1-B136, EI-B182, I1-B145 I1-B154m, I1-B167, I1-B16
    8, I1-B169, I1-B170, I1-B171, I1-B172, I1-B173, I1-B174, I1-B175, I1-B32
    6, I1-B331, I1-B346, I3-B126, I3-B147, I3-B164, I3-B165, I3-B166, I3-B18
    7, I3-B212, I3-B305, I3-B319, I3-B320, I3-B321, I3-B323, I3-B332, I3-B33
    5, I3-B337, I3-B342, I3-B347, I3-B348, 及び I3-B349； (b) ヌクレオチド鎖延長のための酵素とを具備するキット。
  12. 【請求項１２】 (a) 下記から生る群から選択されるオリゴヌクレオチド群
    特異的非翻訳領域プライマーと； E1-B121m17, E1-B129, E1-B130, E1-B136, E1
    -B182, I1-B145, I1-B154m, I1-B167, I1-B168, I1-B169, I1-B170, I1-B171, I
    1-B172, I1-B173, I1-B174, I1-B175, I1-B326, I1-B331, I1-B346, I3-B126, I
    3-B147, I3-B164, I3-B165, I3-B166, I3-B187, I3-B212, I3-B305, I3-B319, I
    3-B320, I3-B321, I3-B323, I3-B332, I3-B335, I3-B337, I3-B342, I3-B347, I
    3-B348, 及び I3-B349 ； (b) ヌクレオチド鎖延長のための酵素とを具備するキット。
  13. 【請求項１３】 (a) 下記から生る群から選択されるオリゴヌクレオチドプ
    ライマー対と； I1-B174 及び I3-B305; I1-B167 及び I3-B323; I1-B175 及び
    I3-B319; I1-B145 及び I3-B321; E1-B121m17 及び I3-B147; I1-B154m 及び I3
    -B164; E1-B182 及び I3-B349; I1-B168 及び I3-B212; I1-B326 及び I3-B165;
    I1-B167 及び I3-B320; I1-B172 及び I3-B342; I1-B172 及び I3-B323; I1-B1
    74 及び I3-B323; I1-B170 及び I3-B126; I1-B326 及び I3-B348; I1-B331 及 び I3-B332; I1-B326 及び I3-B337; I1-B326 及び I3-B187; I1-B169 及び I3-
    B166; I1-B171 及び I3-B347; I1-B173 及び I3-B335; I1-B168 及び I3-B212;
    I1-B346 及び I3-B126; I3-B326 及び I3-B126; I1-B167 及び I3-B126; I1-B16
    8 及び I3-B126 E1-B129 及び I3-B126; E1-B130 及び I3-B126; E1-B182 及び
    I3-B126; 及び E1-B136 及び I3-B126； (b) ヌクレオチド鎖延長のための酵素とを具備するキット。
  14. 【請求項１４】 請求項１３に記載のキットであって：更に、 (d) 下記からなる群から選択されるシーケンシングプライマーを具備するキッ
    ト： GGA TCT CGG ACC CGG AGA CTC G (配列番号436); ACC CGG TTT CAT TTT CA
    G TTG (配列番号437); TTT ACC CGG TTT CAT TTT CAG TT (配列番号438); TCC C
    CA CTG CCC CTG GTA (配列番号439); GGK CCA GGG TCT CAC A (配列番号440); A
    TC TCG GAC CCG GAG ACT (配列番号441); 及び TCC CAC TCC ATG AGG TAT TTC (
    配列番号:442)。
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