JPH0678800A

JPH0678800A - Ｈｌａ−ｄｐ型決定法

Info

Publication number: JPH0678800A
Application number: JP5151817A
Authority: JP
Inventors: Ann B Begovich; ビー．ベゴビッチアン; Teodorica L Bugawan; エル．ブガワンテオドリカ; Henry A Erlich; エー．アーリッヒヘンリー
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1992-06-23
Filing date: 1993-06-23
Publication date: 1994-03-22
Anticipated expiration: 2018-06-16
Also published as: AU675431B2; CA2098947A1; NZ247935A; JP3417601B2; EP0575845A2; EP0575845A3; AU4142293A

Abstract

(57)【要約】【目的】本発明は個体から得られた核酸含有試料から
個体のHLA-DP遺伝子型を決定する方法、該方法で使われ
るオリゴヌクレオチドプライマーそれ自体、前記オリゴ
ヌクレオチドプライマーを含んで成るキット、およびHL
A-DP型決定法において有用なオリゴヌクレオチドプロー
ブを提供する。【効果】本発明のHLA-DP型決定法は、移植片拒絶およ
び対宿主性移植片病の防止、自己免疫疾患に対するかか
りやすさの決定、法医学的試料の個体起源に関する証拠
の提出、並びに実父確定試験において有用であろう。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、米国特許第 4,683,195
号および同第 4,683,202号に開示されたような遺伝子増
幅方法論並びに米国特許第 4,683,194号に開示されたよ
うなドットブロットおよび対立遺伝子特異的オリゴヌク
レオチドプローブ技術を使って個体のHLA-DP遺伝子型を
決定する方法およびそのための組成物に関する。本発明
の方法およびプローブは、具体的には、多形性クラスII
HLA-DP 遺伝子の検出に関する。本発明は分子生物学、
診断医学および法医学の分野に関する。

【０００２】

【従来の技術】後述する本発明の理解を助けるために、
国際特許出願公開第 WO 89/11547号の序論部分を参考に
する。そこには上記分野における序論が与えられてお
り、その中で使われる用語の定義は本明細書で使用する
用語の定義と同じである。

【０００３】WO 89/11547 は、個体から得られた核酸含
有試料から個体のHLA-DP遺伝子型を決定する方法を開示
しており、該方法は、(a)HLA-DP 遺伝子の多形性領域を
含む前記核酸の標的領域を増幅せしめ；(b) 前記増幅さ
れた核酸中に相補的配列が含まれる場合にのみ配列特異
的オリゴヌクレオチド(SSO) プローブの各々が前記増幅
された核酸と安定なハイブリッド二本鎖を形成するのを
可能にする条件下で、前記増幅された核酸をHLA-DP遺伝
子の可変セグメントに特異的な SSOプローブのパネルと
ハイブリダイズせしめ；そして(c) 前記増幅された核酸
と前記 SSOプローブとの間で形成されたハイブリッドを
検出することを含んで成る。

【０００４】WO 89/11547 は個体のHLA-DP遺伝子型を決
定するのに有用なキットも記載しており、それらのキッ
トは、(a) 前記標的領域中の対立遺伝子変異体配列のた
めのSSO プローブのパネル；および(b) キット成分を利
用することにより遺伝子型を決定するための使用説明書
を含んで成る。

【０００５】本発明は、個体から得られた核酸含有試料
から個体のHLA-DP遺伝子型を決定するための改善された
方法および試薬を提供する。本発明は、HLA-DPB1対立遺
伝子の可変第二エクソン中の更なる配列多形性の発見と
特徴づけに起因する。結果として、更なるDPB1 (DPベー
タ) 対立遺伝子変異体、すなわち後述する対立遺伝子DP
B21, DPB22, DPB23, DPB24, DPB25, DPB26, DPB27, DPB
28, DPB29 およびDPB30 が発見された。

【０００６】それらのDP遺伝子の新規配列に基づいて、
変異体遺伝子型の検出のためのSSOプローブの配列が提
供される。異なるDP対立遺伝子間の変異は分散される。
従って、１つのプローブだけがまれに特定のDPB1対立遺
伝子を一様に同定することができる。対立遺伝子の同定
は、むしろ、各プローブがDPB1遺伝子の種々のセグメン
トに特異的なであるプローブのパネルの結合パターンか
ら推測される。

【０００７】より詳しくは、本発明は、HLA-DP遺伝子型
を決定しようとする個体から得られた核酸含有試料から
個体のHLA DP遺伝子型を決定する方法に関し、該方法
は、次のプライマー：

【表１０】

【０００８】から成る群から選ばれたプライマーを使っ
て、ポリメラーゼ連鎖反応を実施するのに適当な条件下
で前記試料中の核酸の標的領域を増幅せしめ、ここで前
記標的領域はHLA DP遺伝子の多形性領域（可変セグメン
ト）を含み；両者が正確に相補的である場合にのみ配列
特異的オリゴヌクレオチド(SSO) プローブが前記増幅さ
れた核酸と結合して安定なハイブリッド二本鎖を形成す
るような条件下で、前記増幅された核酸を SSOプローブ
のパネルと混合し、ここで各プローブはHLA DP遺伝子の
可変セグメントの変異体配列に相補的であり；そして前
記増幅された核酸と前記SSO プローブとの間で形成され
たハイブリッドを検出することを含んで成る。

【０００９】前記プローブは、好ましくは次の群：

【表１１】

【表１２】から成る群から選ばれる。

【００１０】より好ましくは、それらは次の核酸配列を
有する新規プローブ：

【表１３】の群から選ばれる。

【００１１】本発明に従った好ましい方法では、プロー
ブのパネルはハイブリダイズ領域を有するプローブ：

【表１４】を含んで成る。

【００１２】最も好ましくは、前記プローブのパネルが
ハイブリダイズ領域を有するプローブ：配列番号92（5'
CCTGATGAGGTGTACTG）を更に含んで成る。本発明は、特
に診断用具として使用する時、例えば個体のHLA DP遺伝
子型を決定するために、例えば個体のHLA DP遺伝子型が
DPB21, DPB22, DPB23, DPB24, DPB25, DPB26, DPB27, D
PB28, DPB29 およびDPB30 から成る群から選ばれた対立
遺伝子を含んで成る場合に、新規プライマー：

【表１５】および上述の新規プローブそれ自体にも関する。

【００１３】本発明は増幅された核酸にも適合でき、そ
してＰＣＲ技術が非常に少量の核酸を増幅することがで
きるため、極少量の核酸を含む試料を本発明の方法によ
り特定のHLA-DP変異体の存在について型決定することが
できる。例えば、Higuchi ら, 1988, Nature 332: 543
-546により記載されたDQアルファを使った研究により証
明されるように、一本の毛髪でさえ、本発明の目的に十
分な量のＤＮＡを含有する。

【００１４】一般に、試料中の核酸はＤＮＡであり、最
も普通にはゲノムＤＮＡであろう。しかしながら、本発
明は他の核酸、例えば伝令ＤＮＡまたはクローン化ＤＮ
Ａを使って実施することもでき、試料中の核酸は一本鎖
であっても二本鎖であってもよく、そして本発明の目的
に適当であろう。当業者は、どんな性質の核酸であって
も、単に本発明の方法の適切な段階に適当な処置をとる
ことによって、核酸を本発明の方法により型決定するこ
とができると理解する。ＰＣＲを使って試料中の核酸を
増幅せしめる時、本発明の新規プローブを使って型決定
する時の試料は通常二本鎖ＤＮＡを含有するだろう。

【００１５】上述したように、本発明のHLA-DP型決定法
およびプローブは、ＰＣＲで増幅された標的ＤＮＡと共
同して使用される。しかしながら、本発明を実施する者
は、標的配列がSSO プローブとの核酸ハイブリダイゼー
ションにより検出できるように十分な増幅を提供する任
意の既知の方法によって試料中のHLA-DP標的配列の増幅
を行ってもよいことに気づくべきである。ＰＣＲ法は当
業界で周知であり（米国特許第 4,683,195号および同第
4,683,202号を参照のこと）、そして様々な販売業者、
例えばPerkin Elmer (Norwalk, CT)がＰＣＲ試薬を販売
しＰＣＲプロトコールを発表しているけれども、ＰＣＲ
法をよく知らない人々に対する本発明の明確化と十分な
理解のために、幾つかの一般的なＰＣＲ情報を下記に提
供する。

【００１６】試料中の標的核酸配列をＰＣＲにより増幅
せしめるためには、該配列が増幅系の成分に近づきやす
くなければならない。一般に、この近づきやすさは試料
から核酸を単離することによって保証される。生物学的
試料から核酸を抽出する様々な技術が当業界で公知であ
る。例えば、Maniatisら、Molecular Cloning: A Labor
atory Manual, (New York, Cold Spring Harbor Labora
tory, 1982) に記載された技術を参照のこと。あるい
は、試料がかなり容易に崩壊され得る場合には、ＰＣＲ
法による増幅前に核酸を精製する必要はなく、即ち試料
が細胞、特に末梢血リンパ球または羊膜細胞から成る場
合は、単に高張緩衝液中に細胞を懸濁することによって
細胞内成分の溶解および分散を達成することができる。

【００１７】ＰＣＲ法を開始するために試料中の核酸を
まず変性せしめる（試料の核酸が二本鎖であると仮定す
る）ため、そしてある試料では単純に加熱することが細
胞の破壊をもたらすため、時には試料からの核酸の単離
を鎖分離と一緒に行うことができる。鎖分離は物理的、
化学的または酵素的手段を含む任意の適当な変性方法に
よって行うことができる。典型的な熱変性は、約 1〜10
分間の時間約80℃〜105 ℃の温度を伴う。

【００１８】鎖分離は、ヘリカーゼ活性を示すことがで
きる酵素であるヘリカーゼによって誘導することもでき
る。例えば、酵素RecAはATP の存在下でヘリカーゼ活性
を有する。ヘリカーゼによる鎖分離に適当な反応条件は
当業界で公知である（Kuhn Hoffman-Berling, 1978, CS
H-Quantitative Biology 43:63 、および Radding,198
2, Ann. Rev. Genetics 16:405-436を参照のこと）。

【００１９】上述したように、鎖分離は試料核酸の単離
と一緒にまたは別々の段階として行うことができる。Ｐ
ＣＲ法のこの態様では、反応は熱安定性ポリメラーゼに
より触媒され、高温で実施される。反応温度は、前記酵
素が熱安定性であり、且つ核酸が一本鎖と二本鎖の平衡
状態にあり、その結果十分なプライマーが鋳型鎖にアニ
ールして妥当な重合速度を可能にするような温度であ
る。しかしながら、ＰＣＲ法の好ましい態様では、鎖分
離は、二本鎖の変性を引き起こすがポリメラーゼの不可
逆的変性を引き起こさない効果的な時間の間、反応液を
十分に高い温度に加熱することにより達成される（欧州
特許出願公開第 258,017号を参照のこと；これは参考と
して本明細書中に組み込まれる）。

【００２０】一度鎖が分離されれば、ＰＣＲの次の段階
は、分離された鎖を標的配列に隣接するプライマーとハ
イブリダイズせしめることを含む。次いで該プライマー
を伸長して標的鎖の相補的コピーを形成させ、そして変
性、ハイブリダイゼーションおよび伸長のサイクルを、
所望の量の増幅核酸を得るのに必要な回数だけ繰り返
す。

【００２１】上述したように、本発明はHLA-DP DNAの増
幅および型決定のためのＰＣＲ新規プライマーも提供す
る。それらのプライマーは、HLA-DP遺伝子座の変異領域
中の標的配列に隣接する保存領域内の配列に相補的であ
る。本発明の目的上、好ましいHLA-DP遺伝子座の変異領
域はDPA1およびDPB1遺伝子の第二エクソンである。好結
果のＰＣＲ増幅のために、本発明のプライマーは、各プ
ライマーが二本鎖配列に沿ってハイブリダイズする位置
が、一方のプライマーから合成される伸長生成物がその
鋳型（相補鎖）から分離された時に他方のプライマーの
伸長のための鋳型として働くような位置であるように、
デザインされる。

【００２２】更に、選択的アニーリング条件下でHLA-DP
領域に優先的に結合するであろうプライマーが提供され
る。好ましいプライマーは次のものである：

【表１６】

【００２３】ＰＣＲにおけるプライマーの鋳型依存性伸
長は、適当な塩、金属カチオンおよびpH緩衝系から成る
反応媒質中で適当量の４種のデオキシリボヌクレオチド
三リン酸（dATP, dGTP, dCTP, およびdTTPまたはdUTP）
の存在下で重合剤により触媒される。適当な重合剤は、
鋳型依存性ＤＮＡ合成を触媒することが知られている酵
素である。例えば、鋳型がＲＮＡならば、ＲＮＡを相補
的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列に変換する適当な重合剤は逆
転写酵素（ＲＴ）、例えばトリ骨髄芽球症ウイルスＲＴ
である。

【００２４】増幅の標的がＤＮＡである場合、適当なポ
リメラーゼとしては、例えばＥ．コリＤＮＡポリメラー
ゼＩまたはそれのクレノウ断片、Ｔ₄ＤＮＡポリメラー
ゼ、およびサーマス・アクアチクス（Thermus aquatic
us）から単離されPerkin Elmer (Norwalk, CT)から市販
されている熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであるTaq ポリ
メラーゼが挙げられる。最後の酵素は核酸の増幅と配列
決定に広く使われている。ＤＮＡポリメラーゼを使用す
る時の反応条件は当業界で既知であり、例えば、論文Me
thods in Enzymology およびManiatisら, Molecular Cl
oning: A Laboratory Manual（前掲）中に記載されてい
る。

【００２５】ＰＣＲ法は、各段階の後で新たな試薬を添
加する段階形式において、または全試薬を同時に添加す
る形式において、または一定数の段階の後で新たなもし
くは異なる試薬を添加する部分的段階形式において、実
施することができる。例えば、鎖分離が熱により誘導さ
れそしてポリメラーゼが熱感受性であるならば、各ラウ
ンドの鎖分離の後にポリメラーゼを添加しなければなら
ないだろう。しかしながら、変性にヘリカーゼを使用す
る場合または伸長に熱安定性ポリメラーゼを使用する場
合には、全試薬を最初に添加することができ、あるいは
また、試薬のモル比が反応にとって重要である場合に
は、それらの試薬が合成反応により消耗された時に定期
的に試薬を補充することができる。

【００２６】ＰＣＲ法による可能な莫大な増幅のため、
別の試料、正の対照の鋳型または前の増幅から得られた
少量のＤＮＡが、鋳型ＤＮＡの添加なしでさえも、ＰＣ
Ｒ生成物をもたらすのに十分な鋳型を提供する。可能な
ら、ＰＣＲ生成物の分析および試料調製とは別の領域中
に全反応混合物が容易される。ＲＮＡ／ＤＮＡ調製、反
応液の混合および試料分析への精巧なまたは使い捨ての
容器、溶液またはピペット（好ましくは容量ピペットま
たは差し込み型ピペットチップ）の使用は、相互汚染を
最小にするだろう。Higuchi およびKwok, 1989, Nature
339: 237-238、並びにKwokおよびOrrego, Innis ら
編, 1990, PCR Protocols: A Guide to Methods and Ap
plications, Academic Press, Inc., San Diego, CA
（これらは参考として本明細書中に組み込まれる）も参
照のこと。

【００２７】核酸増幅の相互汚染の影響を最小にする１
つの特定方法は、国際特許出願公開第 WO 92/01814号に
記載されており、これは参考として本明細書中に組み込
まれる。この方法は、普通でないヌクレオチド塩基、例
えばdUTPを増幅生成物中に導入することを含む。酵素的
および／または物理化学的処理への増幅生成物の暴露
が、該生成物を次の増幅のための鋳型として働くことの
できないＤＮＡにする。例えば、ウラシル−ＤＮＡグリ
コシラーゼは、ウラシル塩基を含むＰＣＲ生成物からウ
ラシル残基を除去するだろう。増幅前のＰＣＲ反応混合
物の酵素処理は、前の反応からの任意の汚染ウラシル含
有ＰＣＲ生成物の分解を引き起こし、そして増幅反応を
「安定化」する作用をする。

【００２８】プライマーと鋳型の両方を添加した後で反
応混合物に熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを添加すること
が好ましいが、必須ではない。プライマー伸長に不可欠
である少なくとも１つの成分を分離することにより、重
合の開始を調節することができ、且つ非特異的なプライ
マーハイブリダイゼーションと伸長を最小にすることが
できる。重合の開始は、MgCl₂の添加を遅らせることに
よっても調節することができる。

【００２９】「ホットスタート」と称するＰＣＲの変形
が国際特許出願公開第 WO 91/12342号に記載されている
（これは参考として本明細書中に組み込まれる）。ホッ
トスタートＰＣＲでは、最初の高温変性段階までポリメ
ラーゼの添加が遅延され、それによって全反応成分を室
温で添加した場合に起こり得る非特異的プライマーハイ
ブリダイゼーションからの伸長生成物の形成を最小にす
る。

【００３０】当業者は、ＰＣＲ法が通常は熱安定性酵素
を使って自動化された方法として実施されることを知っ
ているだろう。この方法では、反応混合物が変性領域、
プライマーアニーリング領域および反応領域を通って循
環される。熱安定性酵素の使用に合わせて特別に改造さ
れた機械は、欧州特許出願公開第 236,069号（これは参
考として本明細書中に組み込まれる）により詳細に開示
されており、そしてPerkin Elmer (Norwalk, CT)から市
販されている。

【００３１】上述したように、本発明の方法においてＰ
ＣＲ法が重要である１つの理由は、HLA-DP DNA型決定前
にＰＣＲ法を使って試料核酸を増幅できることである。
しかしながら、本発明の目的上のＰＣＲのもう１つの重
要な使用目的は、HLA-DP領域中に存在する以前に発見さ
れていない対立遺伝子変異体のヌクレオチド配列を決定
し、その結果それらの変異体のためのプローブを作製し
本発明で使用することができるようにするためである。

【００３２】ＰＣＲのこの使用目的においては、DPA1と
DPB1遺伝子の多形性領域を増幅せしめ、それらの多形性
標的領域、例えばDPA1およびDPB1遺伝子の第二エクソン
のヌクレオチド配列を決定する。下記に説明するよう
に、血清学的型決定、混合リンパ球型決定、または感作
リンパ球型決定により型決定しようとする特定の変異体
を含む細胞を、従来技術の方法により確立されたDP型を
有する特定の変異体のヌクレオチド配列と関連づけるこ
とも有用である。

【００３３】DP変異体対立遺伝子の標的領域のヌクレオ
チド配列の分析は、ＰＣＲ生成物の直接分析によって容
易に実施することができる。好ましい配列決定プロトコ
ールは、Innis ら、1988, Proc. Natl. Acad. Sci. 8
5:9436-9440および米国特許第5,075,216号（これらは参
考により本明細書中に組み込まれる）に記載されてい
る。ＰＣＲ増幅生成物の直接分析方法はSaiki ら, 198
8, Science 239: 489-491によっても記載されてい
る。あるいは、増幅された標的配列を、Scharfら, 198
6, Science 233:1076-1078 により記載されたように
して配列分析前にクローニングしてもよい。

【００３４】WO 89/11547 において論じられたように、
多数の異なるハプロタイプを表すDPw 型の細胞のパネル
がＰＣＲとDPB1遺伝子の第二エクソンのヌクレオチド配
列決定により分析されている。自己免疫疾患にかかって
いる様々な個体から得られた試料を使ったこの努力およ
び同様な努力の結果として、この遺伝子座における多数
の異なる対立遺伝子変異体が発見された。

【００３５】一般に、この結果は特定のDPB1配列が標準
的PLT 限定DPw1〜DPw6特異性と関係があることを証明し
た。まれな例外が標準的で且つ再現性を有するPLT DPw
型決定方法を得ることの難しさを反映し、この難しさが
本発明の方法の利点を強調する。この点で、それは最初
にDPw1として型決定された細胞系Cox がDPw3と再度型決
定され、DPB3対立遺伝子（現在DPB1^*0301、新命名法は
どこかに記載される）を含むことに関係がある。

【００３６】よって、本発明は、自己免疫疾患への個体
のかかりやすさを決定する方法であって、本発明の方法
に従って個体のHLA DP遺伝子型を決定し、そして前記個
体の遺伝子型が自己免疫疾患に関連する遺伝子型である
かどうかを決定することを含んで成る方法にも関する。
前記自己免疫疾患は、例えば少数関節性幼若性慢性関節
リウマチおよびインスリン依存性糖尿病（IDDM）の場合
には、DPB2.1対立遺伝子に関連づけられ、または例えば
セリアック病（CD）の場合にはDPB13, DPB1, DPB3 およ
びDPB4.2から成る群から選ばれた対立遺伝子に関係づけ
られる。

【００３７】血清学的に限定されたDP型とDP変異体ヌク
レオチド配列との間の他の興味ある重要な関係並びにDP
A1（以前はDPアルファ）遺伝子座およびDPB1（以前はDP
ベータ）遺伝子座に関するHLA-DNA 型決定の実施方法の
説明については、WO 89/11547 を参照のこと。

【００３８】DPA1およびDPB1遺伝子のＤＮＡ配列は、本
発明の配列特異的オリゴヌクレオチドプローブのデザイ
ンにおける有用な出発点として働く。それらのプローブ
は、緊縮ハイブリダイゼーション条件下で、プローブが
DPA1およびDPB1対立遺伝子の可変セグメント中の正確に
相補的な配列にのみ特異的にハイブリダイズするように
デザインされる。

【００３９】それらの SSOプローブは可変領域中の変異
体配列に渡り且つ配列特異的ハイブリダイゼーションを
考慮に入れた任意の長さのものであることができるが、
好ましくはプローブのハイブリダイズ領域が短く、長さ
が10〜30塩基、より好ましくは約17〜19塩基である。固
定化のために、プローブがポリＴの長鎖を含んでもよ
く、照射により固体支持体に固定化せしめることがで
き、固定化の技術は国際特許出願公開第 WO 89/11548号
および欧州特許出願公開第 237,362号中により詳細に記
載されている。それらの出願の開示は参考として本明細
書中に組み込まれる。

【００４０】本発明の SSOプローブは、DP対立遺伝子の
特定の変異体セグメントと特異的にハイブリダイズし且
つ前記特定のセグメントについて既知である他の変異体
配列と不安定化ミスマッチを有するようにデザインされ
る。好ましくは、該プローブはDPB1およびDPA1遺伝子の
可変第二エクソン中の変異体ＤＮＡセグメントに特異的
であり、更により好ましくは、該プローブは第二エクソ
ンの8-11, 36, 55-57,65-69, 76および84-87 位近くの
残基をコードするＤＮＡセグメントに特異的である。DP
A1およびDPB1対立遺伝子の第二エクソンに特異的にハイ
ブリダイズするようにデザインされたオリゴヌクレオチ
ドプローブについては、下記と実施例においてより詳細
に記載する。

【００４１】本発明のプローブは、ＰＣＲプライマーの
説明のところで上述した技術を使って合成しそして標識
することができる。例えば、プローブを³²P-ATP とキナ
ーゼと共にインキュベートすることにより、プローブを
５′末端のところで³²Ｐにより標識することができる。
SSO プローブのための適当な非放射性標識は西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ(HRP) である。

【００４２】この標識を含むプローブの調製および検出
方法は下記の実施例と欧州特許出願公開第 237,362号
（これは参考により本明細書中に組み込まれる）に記載
されている。そのような標識プローブの使用に関する追
加の情報については、米国特許第 4,789,630号；Saiki
ら, 1988, N. Eng. J. Med. 319:537-541 ；およびBu
gawan ら, 1988, Bio/Technology 6:943-947 を参照の
こと（これらは参考により本明細書中に組み込まれ
る）。有用な色素原としては赤色ロイコ色素とテトラメ
チルベンジジン(TMB) が挙げられる。

【００４３】本発明のプローブを使って、どのSSO プロ
ーブが試料中に存在するHLA-DP配列に結合するかを調べ
ることにより試料中に存在する対立遺伝子配列を同定す
ることができる。SSO プローブと試料中の核酸配列との
間で形成されたハイブリッドを検出する本発明の目的に
適当なアッセイ方法は、当業界で既知である。例えば、
実施例に記載するようなドットブロット方式を使って検
出を行うことができる。

【００４４】ドットブロット方式では、未標識の増幅さ
れた試料を膜に結合せしめ、その膜を適当なハイブリダ
イゼーション条件下で標識プローブと共にインキュベー
トし、ハイブリダイズしなかったプローブを洗浄により
除去し、結合したプローブの存在についてフィルターを
モニタリングする。少数のプローブを使って多数の試料
を分析する時、好ましい方法は、完全に一致したハイブ
リッドのみが存在できるようにする高緊縮ハイブリダイ
ゼーションおよび洗浄条件を必要とする。

【００４５】別法は「逆」ドットブロット方式であり、
この場合増幅された配列が標識を含む。この方式では、
未標識のSSO プローブを膜に結合せしめ、そして適当な
緊縮ハイブリダイゼーション条件下で標識された試料に
暴露する。次いで適当に緊縮な条件下での洗浄によりハ
イブリダイズしなかったプローブを除去し、そして結合
した配列の存在についてフィルターをモニタリングす
る。

【００４６】「逆」ドットブロット方式の別の変形で
は、SSO プローブが標識され、試料核酸は未標識であ
る。ハイブリダイゼーションと洗浄の後、標識プローブ
またはプローブの標識断片を膜から遊離せしめ、試料中
の配列が標識オリゴヌクレオチドにハイブリダイズした
かどうかを検出する。標識の遊離は、二本鎖ハイブリッ
ド中の制限部位を認識する制限酵素での消化により達成
することができる。オリゴマー制限として知られるこの
方法は、米国特許第 4,683,194号および対応するEP特許
公開第164,054 号（これらの各々は参考により本明細書
中に組み込まれる）に一層詳しく記載されている。

【００４７】本発明のどのDP SSOプローブが試料中のDP
配列にハイブリダイズするかを決定するどんな方法にせ
よ、DP-DNA型決定方法の主要な特徴は、SSO プローブの
パネルの結合パターンを分析することによる試料中に存
在するHLA-DP対立遺伝子の同定を含む。本発明の個々の
プローブは確かに有用な情報を提供するために使用でき
るけれども、DPB1対立遺伝子中の変異は事実上分散さ
れ、そのため特定のDP変異体を独自に同定することがで
きるいずれか１つのプローブはごくまれである。むし
ろ、実施例に示すように、対立遺伝子の同定はDPA1とDP
B1遺伝子の異なるセグメントに特異的であるSSO プロー
ブのパネルの結合パターンから推測される。

【００４８】HLA-DP対立遺伝子のＤＮＡ型決定は、多数
の異なる目的に、例えば、WO 89/11547 と下記に詳細に
記載される通り、或る種のHLA-DP対立遺伝子に関係づけ
られる自己免疫疾患への個体のかかりやすさを調べるた
めに有用である。医学技術が発達するにつれて、グレー
ヴス病、S.L.E.およびシェーグレン症候群を包含するま
すます多数の病気状態または病気傾向状態が種々のDP対
立遺伝子に関連があると知られるようになるだろう。

【００４９】本発明はそのような対立遺伝子を他の対立
遺伝子から識別する方法を提供し、かくして自己免疫疾
患の危険性が高い個体を同定する手段を提供する。好ま
しい態様では、まずＰＣＲ法を使ってHLA-DP遺伝子座の
標的領域を増幅せしめることにより、かかりやすさを決
定しようとする個体をHLA-DP型について分析する。次い
で、増幅された標的領域にSSO プローブをハイブリダイ
ズせしめ、そして増幅されたＤＮＡ中に存在する特定の
DP対立遺伝子をSSO プローブの結合パターンから決定す
る。最後に、増幅されたＤＮＡ中に存在する対立遺伝子
が自己免疫疾患に関係する対立遺伝子であるかどうかを
決定する。

【００５０】しかしながら、本発明の方法は、有意な恩
恵を提供できるという点で医学の分野に限定されない。
ＤＮＡ型決定方法は、今や、個体を犯罪現場に残された
証拠と結び付けることにより犯罪者または犠牲者の正体
を確立する時のように犯罪を解明するためか、または生
物学的材料を使って個体の実母または実父を確定する時
のように非犯罪的性質の他の問題を解明するためかいず
れにせよ、個体の同定の重要な領域で重要な役割を果た
している。よって、本発明はゲノム核酸を含む試料の起
源に関する法医学的証拠を提供する方法にも関し、該方
法は、前記試料のHLA DP遺伝子型と容疑者のHLA DP遺伝
子型を決定し、前記容疑者のHLA DP遺伝子型と前記試料
のHLA DP遺伝子型を比較し、そして前記試料が前記容疑
者から誘導され得たかどうかを決定することを含んで成
る。

【００５１】本発明を使用する目的が何であれ、種々の
DP対立遺伝子間の相違が本方法の成功の鍵である。DP対
立遺伝子（並びにSXA およびSXB 偽対立遺伝子）の各々
からのアミノ酸配列を配列表に与える。DPB1対立遺伝子
のヌクレオチド配列が提供される。各対立遺伝子につい
ての核酸配列およびアミノ酸配列の配列番号を下記に示
す。DPB1対立遺伝子の各々に対して２つの同義の名称が
与えられ；二番目はＷＨＯ命名委員会により与えられた
公式名称である。

【００５２】

【表１７】

【００５３】

【表１８】

【００５４】上記に与えた配列情報は、容易な視覚的閲
覧を可能にする形で下記のアミノ酸およびヌクレオチド
配列整列表中に繰り返す。

【００５５】DP対立遺伝子間の最も有意な相違は、それ
らの対立遺伝子によりコードされる種々のアミノ酸配列
を整列しそして調査すると全く容易に検出することがで
きる。そのような整列を下記に示す。

【００５６】ここでダッシュ（−）はDPB4.1対立遺伝子
（種々のDPB1対立遺伝子およびDPB1偽遺伝子については
SXB と指示する）との一致またはDPA1対立遺伝子（種々
のDPA1対立遺伝子、DPA2、およびDPアルファ偽遺伝子に
ついてはSXA と命名する）との一致を示す。この描写に
おいて、番号付けられた位置は成熟ペプチドサブユニッ
トに対するもので、対立遺伝子の名称を左側に、そして
代表的細胞源を右側に示す。

【００５７】

【表１９】

【００５８】しかしながら、実用的で且つ経済的な方式
でDP対立遺伝子を検出および識別するためには、該対立
遺伝子のヌクレオチド配列を知る必要がある。様々なDP
A1およびDPB1対立遺伝子のヌクレオチド配列の一部を下
記に示す。それらの配列は上記の如く同定される。本発
明の例示的プライマーは８〜90コドンの配列を決定する
ことができるＤＮＡの製造を可能にする。本発明の種々
のプローブとのハイブリダイゼーションに好ましい標的
配列である対立遺伝子配列の位置を〔−Ａ−〕，〔−Ｂ
−〕，〔−Ｃ−〕，〔−Ｄ−〕，〔−Ｅ−〕および〔−
Ｆ−〕と指示する。

【００５９】

【表２０】

【００６０】

【表２１】

【００６１】

【表２２】

【００６２】

【表２３】

【００６３】上記に与えたＤＮＡ配列は本発明の重要な
局面である。配列の一方の鎖のみが示されているけれど
も、当業者は上述の情報から該配列の他方の鎖を推定す
ることができると知る。この情報は本発明のプローブの
作製を可能にする。多数の本発明の例示的プローブを下
記の実施例に示す。しかしながら、DPB1対立遺伝子のハ
イブリダイゼーション分析用の適当なプローブは或る種
の多形性配列を含んで成る（またはそれに相補的であ
る）だろう。

【００６４】本発明の６セットの例示的プローブを下記
に描写する。各セットはHLA-DPB1遺伝子の第二エクソン
の特定領域における多形性間を識別するためにデザイン
される。該領域の名称は上述した通りである。プローブ
がハイブリダイズするセグメント中の対立遺伝子変異体
内でコードされる多形性残基をプローブ配列の左側に１
文字アミノ酸記号で示す（ダッシュはその位置に非多形
性原型残基が存在することを意味する）。

【００６５】それらのプローブは多形性アミノ酸残基を
コードする領域に及び、約18ヌクレオチドの長さを有す
るものとして示される。多形性アミノ酸残基をコード
し、従って指定のセグメントをコードする対立遺伝子を
検出するためにプローブ内部に含まれていなければなら
ないプローブ中のそれらの配列は、配列中の斜線記号
（／）の間にある。プローブがハイブリダイズするであ
ろうDP対立遺伝子をプローブの右側に示す。

【００６６】

【表２４】

【００６７】

【表２５】

【００６８】本発明のプローブはハイブリダイゼーショ
ンで使用する一本鎖であるため、プローブを例えばコー
ド鎖とハイブリダイズするようにデザインする理由が、
単に非コード鎖上に存在する相補的配列にハイブリダイ
ズするであろう同等に有用なプローブをデザインできな
かったことを意味するのではないことは重要である。

【００６９】上記に提供した配列情報も本発明の別の重
要な局面に関する。本発明の好ましいプライマーは多数
の異なるDP対立遺伝子を増幅するためにデザインされ
る。多くの場合、下記の実施例で証明されるように、そ
のようなプライマーは非常に有用である。しかしなが
ら、当業者は上記に与えられたＤＮＡ配列情報を使って
対立遺伝子特異的増幅を可能にするであろうプライマー
をデザインすることもできることを認識する。そのよう
な対立遺伝子特異的プライマーは、単一の対立遺伝子ま
たは既知の対立遺伝子の或るサブセットのみを増幅せし
めるだろう。例えば、本発明の"DEAV"プローブは、"DEA
V"陽性DPB1対立遺伝子の対立遺伝子特異的増幅に備える
プライマーペアの１プライマーとして用いることができ
る。

【００７０】本発明はまた、個体のHLA DP遺伝子型を決
定するのに有用なキットにも関し、該キットはSSO プロ
ーブのパネルと、おそらく本発明の適当なプライマーを
含んで成る。前記キットは、好ましくは、本法を実施す
るのに不可欠な成分を含んで成る多容器単位から成る。
例えば、該キットは、本発明の好ましい態様ではプライ
マーが必要であるため、ＰＣＲ用のプライマーを含有す
ることができる。それらのプライマーは少なくともDPB1
遺伝子を増幅し、そして適宜、例えば法医学的分析にお
いては、更にDPA1遺伝子も増幅するプライマーを含める
ことができる。

【００７１】該キットは少なくともDPB1遺伝子のための
SSOプローブも含まなければならず、そして適宜、更に
DPA1遺伝子のための SSOプローブも含まれる。場合によ
って、 SSOプローブがハイブリダイゼーション分析に有
用である適当な支持体膜に固定化されてもよい。該キッ
ト内の容器中に含めることができる他の任意の成分とし
ては、例えば、プライマー伸長生成物の合成を触媒する
物質、基質ヌクレオシド三リン酸、標識するのに使う手
段（例えば、標識がビオチンであるならば、アビジン−
酵素接合体と酵素基質と色素原）、およびＰＣＲまたは
ハイブリダイゼーション反応用の適当な緩衝液が挙げら
れる。上記成分に加えて、該キットは本法を実施するた
めの装置を含むこともできる。

【００７２】単に例示目的であって本発明の範囲を限定
するつもりで提供するのではない本発明の多数の実施例
を下記に与える。特許請求の範囲内の本発明の多数の実
施態様は、上記説明と下記実施例を読むことにより当業
者に明白であろう。下記実施例において、特記しない限
り幾つかの技術は標準的である。そのような技術は感作
リンパ球型決定（ＰＬＴ）を含み、これは本質的にはSh
awら, 1980, J. Exp.Med. 152:565-580 により記載さ
れた通りに実施した。

【００７３】一般に、リンパ球感作のために、応答細胞
と刺激細胞を解凍し、洗浄し、グルタミンと抗生物質が
補足されたRPMI-1640 培地（完全培地）中に再懸濁し
た。応答用細胞を２：１の比で放射線照射された刺激細
胞と混合し、そして細胞混合物を37℃で10日間インキュ
ベートした。感作され照射された応答細胞を照射された
刺激細胞と一緒に完全培地中で同時培養した。48時間
後、³Ｈ−チミジンを培養物に添加した。18時間後に細
胞を収得し、β崩壊をカウントすることによりトリチウ
ムの取り込みを評価した。

【００７４】ＤＮＡ配列分析は、Maniatisら, Molecula
r Cloning: A Laboratory Manual (New York, Cold Spr
ing Harbor Laboratory, 1982)により記載された通りに
実施した。一般に、分析しようとする配列をM13 クロー
ニングベクター中にクローニングし、マキサム−ギルバ
ート法かまたはジデオキシチェーンターミネーション法
のいずれかにより分析した。合成オリゴヌクレオチド、
両プライマーおよびプローブは市販の装置を使って合成
した。合成技術は当業界で周知である。当業者は、必要
であれば別の業者から代わりの試薬または装置を選択す
る立場にある。特記しない限り、下記に与える百分率は
それぞれwt/wt, vol/volおよびwt/volに基づく。

【００７５】実施例１：HLA-DP対立遺伝子のＤＮＡ配列の分析 DPA1遺伝子とDPB1遺伝子の種々の対立遺伝子の可変第二
エクソンのＤＮＡ配列を決定した。使用するＤＮＡ試料
は、できる限り広範囲の PLT限定DP対立遺伝子のスペク
トルを表すように選択した。標準的な６つのDPw 型につ
いて同型接合の細胞から、異常な型決定反応を示す細胞
から、およびDPブランク反応を示す細胞から、ＤＮＡを
抽出した。ＤＮＡ抽出は、Maniatisら, Molecular Clon
ing: A Laboratory Manualに記載されたような標準技術
によるものであった。

【００７６】DPA1遺伝子とDPB1遺伝子の可変第二エクソ
ンを、下記実施例２に記載の如くＰＣＲ法により増幅せ
しめた。増幅されたＤＮＡ配列を M13由来のベクター中
にクローニングし、チェーンターミネーション法により
ＤＮＡ配列を決定した。使用した細胞系、それらのDR血
清型、それらのPLT 限定DPw 型、およびそれらの細胞系
が含有することが判明したＤＮＡ限定対立遺伝子を表の
形で下記に列挙する（ブランクはデータが決定されなか
ったことを意味する）。

【００７７】

【表２６】

【００７８】上記からわかるように、HLA-DP亜型のＤＮ
Ａ分析は、特異的配列が既知のPLT限定DPw 型と関係が
あることを示し、このことは、感作Ｔ細胞により認識さ
れる多形性エピトープがDPB1鎖上にあることを指摘す
る。幾つかのDP型、例えばDPw2およびDPw4については、
配列分析が亜型変異体を明らかにした。DPw2の変異体は
DPB2.1およびDPB2.2と命名された。PLT についてDPw4
"new"（例えば LB1）またはDPw4^*（例えば APD）と型
決定された細胞は、珍しいDPB4.2亜型を含む。DPB4.2亜
型は配列によるとDPB4.1対立遺伝子よりもDPB2.1に近く
関連づけられる。個体CD11はDPw2と PLT型決定される
が、密接に関連したDPB2.1とDPB4.2対立遺伝子を含む。

【００７９】上の結果はユニークDPB1配列がDPw1, DPw
3, DPw5およびDPw6特異性と一致し、それらの対立遺伝
子がこの関係を反映するようにデザインされたことも示
す。しかしながら、少ない例外は、細胞系DKY はDPw5と
型決定されたがDPB2.1対立遺伝子を含むこと、および個
体CD2 はDPw2と PLT型決定されるがDPB4.2とDPB10 対立
遺伝子を含むことである。

【００８０】実施例２：DPA1遺伝子およびDPB1遺伝子の
ＰＣＲ増幅のためのプライマー実施例１に記載の細胞のうちの幾つかのDPA1遺伝子およ
びDPB1遺伝子をＰＣＲにより増幅せしめた。使用したプ
ライマー（合成）を、該プライマーが結合しそしてプラ
イマー伸長のための鋳型として働くであろう遺伝子の領
域と一緒に下記に示す。表に示されるように、左側のプ
ライマーGH98とDB01は上側の鎖から由来し、ＤＮＡポリ
メラーゼが右方向に伸長するように指令する。右側のプ
ライマーGH99とDB03は下側の鎖から由来し、左方向に合
成を指令する。小文字は、標的ゲノムＤＮＡ（反対鎖に
示される）に相補的でないプライマー中の塩基を示す。

【００８１】プライマー中のそれらの変化は、増幅され
たＤＮＡの末端に制限部位（BamHIまたはPstI）を組み
入れ、増幅されたＤＮＡのクローニングを容易にする。
DPA1の第二エクソンの増幅に用いるオリゴヌクレオチド
プライマーGH98とGH99は243bpセグメントを増幅する。
ＰＣＲ生成物の最初の2 bpは、該エクソンに隣接する介
在配列からのものである。オリゴヌクレオチドプライマ
ーDB01とDB03はDPB1の第二エクソンの294 bpセグメント
を増幅する。生成物の左側13 bp と右側17 bpは介在配
列からのものである。プライマーが結合するゲノム配列
を、配列表中に次の配列番号のもとに列挙する。

【００８２】GH98が結合する領域──配列番号146 GH99が結合する領域──配列番号147 DB01が結合する領域──配列番号148 DB03が結合する領域──配列番号149

【００８３】プライマーハイブリダイゼーション領域の
間の領域の配列は、増幅される対立遺伝子に依存する。
対立遺伝子配列は上記の配列番号のもとに配列表中に提
供される。

【００８４】

【表２７】

【００８５】プライマーのハイブリダイゼーションと伸
長されたプライマー含有生成物の合成は、本質的には欧
州特許出願公開第 258,017号中およびＰＣＲを実施する
のに使った熱循環器の製造業者Perkin Elmer (Norwalk,
CT)により提供されたプロトコール中に記載された通り
であった。増幅は28サイクルであったが、更に多数、即
ち35サイクルが良い結果をもたらすことができる。

【００８６】DPB1対立遺伝子の第二エクソンを増幅する
ための別の２つのプライマー（UG19およびUG21と命名）
は、上述したプライマーよりも効率的で且つ特異的であ
ることが判明した。UG19およびUG20を使った増幅では、
50mM KCl、10mM Tris-HCl (pH 8.4)、1.5mM MgCl₂、10
0 μg/mlのゼラチン、各175 μM のdATP, dCTP, dGTPお
よびdTTp、各0.5 μM の増幅プライマー並びに5.0 単位
のTaq ＤＮＡポリメラーゼを含む 200μl の反応液中で
0.1 〜1 μg のゲノムＤＮＡを増幅せしめた。増幅は、
ＤＮＡ熱循環器（Perkin Elmer〔Norwalk, CT 〕）中で
二段階温度サイクル（変性：95℃で30秒；アニーリング
と伸長：65℃で30秒）を使って30サイクル実施した。

【００８７】問題のDPA1プライマーとDPB1プライマーの
配列を下記と配列表中に与える。

【表２８】

【００８８】実施例３：DPB1対立遺伝子のハイブリダイ
ゼーション分析用の SSOプライマー残りの実施例にわたり言及される本発明の代表的プロー
ブを表の形で下記に記載する。この表には、プローブの
名称、配列番号、プローブ配列（５′から３′方向）、
並びにプローブがハイブリダイズする対立遺伝子の領域
および該領域によりコードされる多形性アミノ酸配列が
提供される。プローブは未標識のものとしてまたは³²Ｐ
もしくは「Ｘ」標識を有するものとしてのいずれかで示
され、ここでＸは下記実施例に記載されるようなＨＲＰ
またはビオチンを表す。

【００８９】プローブ配列がＸに続くプローブ名称によ
り表示される時、該プローブの配列は、³²Ｐ標識がＨＲ
Ｐ標識により置き換えられていること以外は、Ｘの後ろ
に指示されたプローブの配列と同じである。以後の実施
例において論じられるように、該プローブは未標識プロ
ーブを膜に固定化せしめそして標識ＰＣＲ生成物にハイ
ブリダイズさせる逆ドットブロット方式において使用す
ることもできる。未標識のものとして下記に示されるプ
ローブは逆ドットブロット方式における使用のためにデ
ザインされた。プローブ 154と155 は各々、配列中
「Ｎ」と表示されるイノシン塩基を含む。

【００９０】

【表２９】

【００９１】

【表３０】

【００９２】

【表３１】

【００９３】

【表３２】

【００９４】上の表に関して、DB28はDB32と交差ハイブ
リダイズするため、DB28とDB32の代わりにそれぞれDB58
とDB59を使うとより優れた結果を得ることができること
に注目すべきである。加えて、プローブDB63はDB93より
も好ましい。HLA-DP型決定アッセイにおいて使用される
特異的プローブパネルを下記の実施例において記載す
る。"ALL" プローブであるDB123 は、領域Ｂのすぐ３′
側の非可変配列に特異的であり、全てのDPB1対立遺伝子
配列にハイブリダイズする。それはハイブリダイゼーシ
ョン反応におけるDPB1 DNAの量についての対照として有
用である。

【００９５】当業者は、使用する標識の種類および使用
するハイブリダイゼーション方式に依存して、ハイブリ
ダイセーションおよび洗浄条件が異なるであろうことを
知っている。好ましい態様ではプローブが非同位体的に
（例えばＨＲＰまたはビオチンを使って）標識されるだ
ろうが、幾つかのプローブには同位体（例えば³²Ｐ）標
識が使われた。ドットブロット方式で使用する³²Ｐ標識
プローブまたはＨＲＰ標識プローブについてのハイブリ
ダイゼーションおよび洗浄条件を下記に記載する。

【００９６】そのような条件は経験的に決定された（Bu
gawan ら, 1988, J. Immunol. 141(12):4024-4030を参
照のこと；これは参考として本明細書中に組み込まれ
る）。表中、条件は５×デンハーツ溶液、0.5 % SDS 、
および指定量（即ち 0.1×，３×，５×）のSSPEから成
るハイブリダイゼーション溶液を仮定して言及した。５
×デンハーツ溶液は、500 mlあたり0.5 g のフィコー
ル、0.5 g のポリビニルピロリドン、0.5 g のBSA (Pen
tax FractionＶ) を含有する。

【００９７】洗浄溶液は0.1 ×SSPEと0.1% SDSを含有す
る（ＨＲＰ標識プローブには、SDSの代わりに0.1% Trit
on X-100 を使用した）。洗浄段階は、水浴またはエア
インキュベーターのいずれかの中で指摘の温度（摂氏
度）において10分間実施する。下記に記載のように、塩
化テトラメチルアンモニウムまたは同様な塩は、より均
一なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件、即ち多数
のプローブを１パネルにおいて使用して試料中のDP対立
遺伝子の型を決定する時の好ましい条件を考慮に入れる
ために使われる。

【００９８】

【表３３】

【００９９】塩化テトラメチルアンモニウム(TMACL) が
ハイブリダイゼーション溶液中に存在する時、プローブ
の区別はプローブの長さに基づくのであってプローブの
Ｇ，Ｃ，ＡまたはＴ組成には関係ない。よって、ハイブ
リダイゼーション溶液中にTMACL を使うことにより、同
じ長さの多数の異なるプローブを単一温度でハイブリダ
イズせしめ洗浄することができる。

【０１００】この目的に適当なハイブリダイゼーション
溶液は、3M TMACL ; 0.5% SDS ; 10mM Tris-HCl, pH=7.
5 および0.1mM EDTAを含有する。ハイブリダイゼーショ
ンは19マーのプローブDB27, DB28, DB29, DB35, DB34,
DB37, DB38およびDB62については55℃にて、17マーのプ
ローブDB30, DB31, DB33およびDB59については50℃に
て、そしてDB40およびDB41については60℃にて、30〜60
分間実施する。洗浄溶液は3M TMACL ; 50mM Tris-HCl,
pH=8および2mM EDTAを含有する。洗浄は37℃で20分間、
次いで高緊縮温度（ハイブリダイゼーション温度）で10
分間実施する。

【０１０１】実施例４：DPA1対立遺伝子のハイブリダイ
ゼーション分析用のSSO プローブ DPA1対立遺伝子のハイブリダイゼーション分析用の適当
なSSO プローブの例を下記に示す。２セットのプローブ
が例示され、各セットはHLA-DPA1遺伝子の第二エクソン
の特異的断片中の多形性間を識別するようにデザインさ
れる。ASO1とASO2は、それぞれメチオニン（Ｍ）（アミ
ノ酸31）とグルタミン（Ｑ）（アミノ酸50）を含む多形
セグメントを含有する領域でDPA1対立遺伝子に結合す
る。ASO3とASO4は、それぞれグルタミン（アミノ酸31）
とアルギニン（Ｒ）（アミノ酸50）を含む多形性セグメ
ントを含有する領域でDPA2対立遺伝子に結合する。

【０１０２】ASO2とASO4は、グルタミンを含む50位のと
ころでアルギニンを含むものから多形性セグメントを識
別する。それらのプローブは、それらの多形性アミノ酸
残基をコードする領域に及ぶ。それらのプローブを使っ
たハイブリダイゼーションは、通常５×SSPE、５×デン
ハーツ溶液および0.5% SDSを含む溶液中で42℃にて少な
くとも１時間実施する。それらのプローブを使う際の洗
浄条件（温度は摂氏度）も示す。プローブ配列は５′か
ら３′方向で示される。

【０１０３】

【表３４】

【０１０４】実施例５：SSO プローブとのハイブリダイ
ゼーションによる増幅されたDPB1配列の分析 24のHTC （同型接合型決定用細胞）からのＰＣＲ増幅さ
れたDPB1配列を、³²Ｐ−標識SSO プローブのパネル（ｎ
＝９）を用いたドットブロット方式において分析し、プ
ローブの結合パターンからDPB1型を推測した。細胞から
のＤＮＡの抽出は実施例１に記載された通りであった。
細胞性ゲノムの標的領域、即ちDPB1遺伝子の第二エクソ
ンを、実施例２に記載の如くプライマーDB01とDB03を使
ってＰＣＲ技術により増幅せしめた。ただし、ＤＮＡが
上記表に挙げた細胞からのＤＮＡであった。この実験の
時点では、現在既知のわずか１サブセットの対立遺伝子
しか知られていなかった。本発明の方法を使って追加の
対立遺伝子が発見された。

【０１０５】増幅されたＤＮＡをフィルター上にドット
ブロットした；各SSO プローブとのハイブリダイゼーシ
ョンによる分析のために試料のパネルを含む別個のフィ
ルターを調製した。試料をドットブロットするために
は、0.4N NaOH と25mM EDTA を含む溶液 195μl で試料
を希釈することにより各増幅試料５μl を変性せしめ、
そしてまず９枚の複製Genatran 45 (Plasco, Woburn, M
assachusetts) ナイロンフィルターを水で湿らせ、それ
らをドットブロット調製用のBio-dot (Bio-Rad,Richmon
d, CA) 装置中に入れ、試料をスポットし、そして各ウ
エルを0.4 mlの20×SSPE (3.6M NaCl, 200mM NaH₂PO₄お
よび20mM EDTA)ですすいだ。フィルターを取り出し、２
×SSPE中ですすぎ、そして真空オーブン中で80℃にて30
分間焼いた。

【０１０６】フィルター上の試料を本発明のSSO プロー
ブとハイブリダイズせしめた。ハイブリダイゼーション
は、２〜５mlのハイブリダイゼーション溶液中0.25〜0.
5 ピコモルのプローブを使って行った。ハイブリダイゼ
ーションおよび洗浄条件は実施例３に表の形で記載した
通りであった。このDPB1型決定の結果を下記に示し、フ
ィルター上の試料がハイブリダイズしたプローブおよび
該プローブにより検出されたコードアミノ酸配列も示
す。

【０１０７】

【表３５】

【０１０８】SSOプローブを用いたハイブリダイゼーシ
ョン分析に基づく細胞のDPB1型の決定については上で論
じた。試料のDPB1型を決定するために、試料ＤＮＡへの
プローブの結合を調べた。プローブの結合パターンから
存在する対立遺伝子を推測した。例えば、試料１は SSO
プローブ DB11, DB17 およびDB20とハイブリッドを形成
した。DB11, DB17およびDB20によりコードされるアミノ
酸はそれぞれVYQL, DED およびLEEKである。

【０１０９】DPB1対立遺伝子アミノ酸配列のセグメント
Ａ，ＣおよびＤの調査は、配列VYQLがDPB3, DPB6, DPB1
1 およびDPB13 中に存在し；配列DED がDPB17, DPB14,
DPB12, DPB9, DPB6 およびDPB3中に存在し；配列LEEK(L
-K) がDPB14 およびDPB3中に存在することを示す。プロ
ーブとハイブリダイズする３つの配列を含む唯一の対立
遺伝子（実験の時点では）はDPB3である。よって、 SSO
型決定に基づく試料１のDP型はDPB3である。

【０１１０】他の試料のDPB1型を同種の分析により推測
し、決定された型を上表に叙述した。この表において、
星印（^*）は配列分析によってもDPB1遺伝子型が決定さ
れた細胞を示す。細胞系 COXのDPB1型（以前w1→w3）お
よびBM21のDPB1型（以前w1→ブランク）は、指摘の型に
最近変更された。記号 +/-は、プローブを使って弱いシ
グナルが得られたことを表す。幾つかの場合（BM21とTO
K ）、この弱いシグナルは、領域Ａ中にアミノ酸残基VH
QLをコードする追加の多形性配列（これがDB11プローブ
と交差ハイブリダイズする）が存在することを反映す
る。

【０１１１】該配列は、より便利には領域ＡプローブDB
22を使って型決定することができる。別の細胞系BM92に
ついては、DB10プローブにより認識される配列に対する
DB11プローブのバックグラウンド交差ハイブリダイゼー
ションが明らかに存在する。同様な様式で、DB18プロー
ブに相補的な配列に対してDB19プローブを用いると交差
ハイブリダイゼーションシグナルが生じ得る。

【０１１２】この実施例で使用したSSO プローブのパネ
ルは、５つの多形性領域のうちの３領域のみのところで
変異を検出し、それら３領域の全ての対立遺伝子変異体
を検出するわけではない。この実施例の手順を使った型
決定方法は、単純で且つHTCに対して紛らわしくない
が、種々のプローブのハイブリダイゼーションパターン
が対立遺伝子のユニークペアより多いものとして解釈で
きる場合には、与えられた多形性のパッチワークパター
ンが曖昧な型決定を引き起こし得る。

【０１１３】この曖昧さは、異なるDPB1対立遺伝子を構
成するDPB1配列変異体の多数の異なる組合せから生じ
る。しかしながら、本発明により提供される追加の SSO
プローブ（この追加のプローブは残りの多形性領域に及
ぶ）と、多分上述の対立遺伝子特異的増幅とを使用する
ことによって、異型接合個体について明確な型決定を得
ることができる。

【０１１４】実施例６：ＰＣＲ増幅された標的領域のＤ
ＮＡ配列分析によるセリアック病患者のHLA-DP型決定セリアック病（CD）を有する４人の患者の細胞を PLT型
決定し、そして実施例１に記載の通りにDPB1（第二エク
ソン）遺伝子の第二エクソンのＤＮＡ配列を決定した。
CD診断は臨床症候学に基づいた。

【０１１５】CD細胞のDPB1のＤＮＡ配列決定により得ら
れた分析結果は上記に記載してある。それらの結果か
ら、CD細胞を非CD細胞と比較すると、DPB4.2対立遺伝子
の頻度に明らかな増加があることが観察される。加え
て、DPB10 対立遺伝子配列は２人の無関係のCD患者に存
在するが、非CD細胞系では30のうちのわずか１つに観察
されるのみである。

【０１１６】実施例７： SSOプローブハイブリダイゼー
ション分析によるセリアック病患者のHLA-DP型決定 CDを有する19人の患者の細胞と43人の非CD対照の細胞を
SSOプローブハイブリダイゼーション分析によりHLA-DP
型について分析した。CDの診断は臨床症候学に基づい
た。CD患者並びに対照の個体は全てイタリア出身であっ
た。ＤＮＡ抽出は実施例１に記載の通りであった。試料
のＰＣＲ増幅は実施例２に記載の通りであった。増幅さ
れた配列の分析は実施例４に記載の通りであった。

【０１１７】分析結果は、非CD対照に比べてCD患者にお
いてDPB4.2対立遺伝子に有意な増加が認められることを
示した。この対立遺伝子はCD患者19人中12人に存在した
が、対照患者では43人中３人にのみ存在した。DPB4.2と
DPB3対立遺伝子は、CD患者19人中17人に存在し、対照患
者では43人中15人に存在した。遺伝子型DPB4.1/4.2はCD
患者19人中10人に存在し、対照患者では43人中わずか１
人にのみ存在した。

【０１１８】実施例８：法医学的試料のHLA-DP型決定容疑者のゲノム核酸を含む試料を得る。ゲノムの標的領
域、即ちDPA1およびDPB1遺伝子の第二エクソンを含む領
域を実施例２に記載の通りＰＣＲ技術により増幅せしめ
る。ただし、前記実施例中の細胞の核酸を容疑者からの
核酸に置き換え、そして増幅された試料は³²Ｐ標識を含
む。同フィルター上にドットブロットされておりそして
ポリｄＴ末尾によりフィルターにより固定化されている
本発明のプローブと増幅された試料とをハイブリダイズ
せしめる。

【０１１９】固定化された配列特異的プローブの調製技
術は国際特許出願公開第WO 89/11548 号に記載されてい
る。フィルターのハイブリダイゼーションおよび洗浄条
件は、完全に一致したハイブリッドだけを二本鎖状態の
まま残すことを可能にする。フィルターを調べてどのプ
ローブが標識試料とハイブリッドを形成するかを決定す
る。

【０１２０】容疑者から得られたものと比較しようとす
る試料を、同じ手順、即ちＰＣＲ増幅および固定化 SSO
プローブとのハイブリダイゼーションにより、DP型につ
いて調べる。容疑者からの試料の SSOプローブの結合パ
ターンと比較試料の結合パターンを調査してハイブリダ
イゼーションパターンが同一か異なるかを決定する。

【０１２１】実施例９：西洋ワサビペルオキシダーゼで
標識されたSSO プローブを使ったHLA-DP型決定第二エクソン変異体用のSSO プローブを使って39人の個
体からの細胞のパネルをDPB1対立遺伝子について型決定
した。該プローブを西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)
で標識し、ハイブリッドをドットブロット方式で検出し
た。

【０１２２】分析する細胞は14人のIDDM患者、５人のDR
3 対照非IDDM患者、およびPLT によりDPブランクとして
型決定された19人のHTC からのものであった。IDDM患者
は臨床症候学により同定された。実施例１に記載の通
り、細胞からＤＮＡを抽出した。50mM Tris-HCl, pH 8.
3 ；2.5mM MgCl₂； 100μg/mlのゼラチン；各0.75mMの
４種のデオキシヌクレオシド三リン酸；プライマーDB01
およびDB03；並びにTaqポリメラーゼを含有する反応混
合物 200μl 中で、ＰＣＲ技術を使って、標的領域、即
ちDPB1遺伝子の第二エクソンを増幅せしめた。

【０１２３】増幅温度循環プロフィールは次のようであ
った：94℃への30秒間の加熱に次いでその温度での30秒
間のインキュベーション；55℃への１分間の冷却に次い
でその温度での30秒間のインキュベーション；72℃への
30秒間の加熱に次いでその温度での45秒間のインキュベ
ーション。この循環を42サイクル繰り返した。増幅後、
反応混合物をサンプリングし、そして30％Nusieve,１％
アガロースを含むゲル上でのゲル電気泳動によりモニタ
リングしてＤＮＡ量が全て同等であるかどうかを調べ
た。

【０１２４】Genatranナイロン膜上に150 μl/ドットの
変性した増幅ＤＮＡをドットすることによりドットブロ
ット試料を含むフィルターを調製し、そして試料を含む
フィルターを５分間ＵＶ処理した。ＵＶ処理は試料を膜
に固定するためである。0.4NNaOH と25mM EDTA を含む
総容量 150μl においてＰＣＲ反応混合物５μl を処理
することにより、増幅ＤＮＡを変性せしめた。 HRP標識
された SSOプローブを使ったハイブリダイゼーション用
に８枚の複製フィルターを調製した。

【０１２５】ハイブリダイゼーション前に、試料を含む
フィルターを、プローブ不含有の予備ハイブリダイゼー
ション溶液（１×SSPE、５×デンハーツ溶液、１％ Tri
tonX-100 ）中で15分間インキュベートした。この予備
ハイブリダイゼーション溶液にはSDS の代わりにTriton
X-100を使った。ハイブリダイゼーションは、１ピコモ
ル／mlのプローブを更に含む同溶液中で実施した。

【０１２６】HRP 標識プローブのうちの１つを含む2.5
mlのハイブリダイゼーション溶液と共に各フィルターを
40分間インキュベートした。使用したプローブはDB27,
DB28, DB29, DB30, DB31, DB32, DB33およびDB35であっ
た。プローブとハイブリダイゼーション条件は実施例３
において表の形で列挙されている。ハイブリダイゼーシ
ョン後、実施例３に記載の通り、適当な緊縮条件下で、
即ち 0.1×SSPE、0.1%Triton X-100 中で42℃にて10分
間フィルターを洗浄した。

【０１２７】HRP標識された SSOプローブは、本質的に
は米国特許第 4,962,029号および同第 4,914,210号並び
に対応する国際特許出願公開第 WO 89/02932号および同
第WO89/02931 号において開示された方法によって調製
した。また、LevensonおよびChang, "Nonisotopically
Labelled Probes and Primers", PCR Protocols 99-11
2 頁, Academic Press, 1990, M. Innis編も参照のこ
と。

【０１２８】それらの方法は本質的に、一方の末端にホ
スホルアミダイト成分を有しそして他方の末端に保護さ
れたまたは未保護のスルフヒドリル成分を有する親水性
ポリマー鎖（例えばポリオキシエチレン）を含んで成る
直鎖状連結分子を使って核酸プローブを誘導体化するこ
とを含む。前記ホスホルアミダイト成分は当業界で周知
の反応（例えばBeaucageら, 1988, Tetrahedron Lett.
22:1859-1862）により核酸プローブに結合し、一方スル
フヒドリル基は、タンパク質、例えばHRP とジスルフィ
ド結合または他の共有結合を自由に形成することができ
る。

【０１２９】米国特許第4,962,029 号および国際特許出
願公開第 WO 89/02932号では、HRPはＮ−マレイミド−
６−アミノカプロイル基を介して連結分子に接合され
る。該標識は、ジメチルホルムアミド中１当量のジシク
ロヘキシルカルボジイミドの存在下でＮ−マレイミド−
６−アミノカプロン酸を４−ヒドロキシ−３−ニトロベ
ンゼンスルホン酸ナトリウムでエステル化することによ
り調製する。

【０１３０】精製後、生成物を１：８の HRP対エステル
比において HRP含有リン酸緩衝液に添加する。オリゴヌ
クレオチドプローブをＤＮＡ合成装置中で合成し、そし
てホスホルアミダイト合成条件を使って構造(C₆H₅)₃CS-
(CH₂CH₂O)₄-P(CH₂CH₂CN)〔N(i-Pr)₂〕を有する連結分子
を取りつける。トリチル基を除去し、 HRP誘導体とプロ
ーブ誘導体とを一緒に混合し、そして反応せしめて標識
プローブを形成させる。同様な方法により、ビオチン標
識されたプローブまたはプライマーを調製することもで
きる。

【０１３１】ハイブリダイズしたプローブを含む試料
を、Sheldon ら, 1986, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 8
3:9085-9089に記載されたような、TMB/H₂O₂を使用する
発色反応を使って検出する。この検出系は国際特許出願
公開第 WO 89/11548号に記載されている。増幅されたＤ
ＮＡ試料のHLA-DP遺伝子型はフィルターから容易に明ら
かであった。

【０１３２】実施例10： HRP標識された SSOプローブを
使ったHLA-DPB1型決定Ａ．ＰＣＲ増幅 DPB1型決定は14種以上の SSOプローブ（配列特異的オリ
ゴヌクレオチド）を使うことができ、そのためＤＮＡが
限定していない場合、0.5 〜2 μg のＤＮＡに対して20
0 μl の反応容量において増幅を行う。より少量のＤＮ
Ａ、即ち100 ngを増幅せしめることができるが、そのよ
うな試料では一層多数のサイクル、即ち45サイクルの増
幅を実施すべきである。

【０１３３】ＰＣＲ反応は次の成分を１〜２秒間渦動攪
拌することにより出発する。ＤＮＡ 0.5 〜2 mg 10×Taq 緩衝液 20μl 100mM dNTPs 1.5 μl DPB1プライマー〔10mM UG19 またはDB01〕 10μl DPB2プライマー〔10mM UG21 またはDB03〕 10μl Taq ポリメラーゼ 5 U/ml 1.2 μl

【０１３４】ガラス蒸留済H₂O を加えて 200μl の最終
容量にする。10×Taq 塩は 500mM KCl; 100mM Tris, pH
8.3 ; 15mM MgCl₂および1 mg/ml ゼラチンである。負
の対照（即ちＤＮＡなし）を各ＰＣＲ反応に含めるべき
である。典型的には、Perkin Elmer (Norwalk, CT)ＤＮ
Ａ熱循環器中での30〜35サイクルの増幅で十分である。
各サイクルは、96℃で30秒間の変性、および65℃で30秒
間のアニーリングと伸長を行うように設計される。プラ
イマーペアDB01/DB03 を使う場合、アニーリングは55℃
で30秒間であり、そして伸長は72℃で30秒間である。分
析用ゲルを使ってＰＣＲを確認し、ドットブロットに使
用するＤＮＡの量を定量することができる。

【０１３５】Ｂ．ドットブロット典型的には、増幅されたＤＮＡ５μl は、単一のドット
ブロットに十分な量より多い約 200 ng を含む。しかし
ながら、14ドット以上が要求されることがあり、即ちド
ットブロットを調製するのに約70μl の増幅反応液が使
われることを覚えておいてほしい。各５μl の増幅反応
液については、ＤＮＡに50μl の0.4N NaOH と25mM EDT
A を添加する。ＤＮＡの変性を完結するのに５分間で十
分である。Genatran膜をまず２×SSPEで湿らせ、次いで
55μl の変性ＤＮＡをドットブロット装置に装入する。
膜を２×SSPEですすぎ、ＵＶ光への５分間の暴露、即ち
Stratageneにより販売されているStratalinker 1800 ^TM
ＵＶ光箱中での55 mJ/cm²暴露により、ＤＮＡを膜に固
定する。

【０１３６】Ｃ．ハイブリダイゼーション膜を再び２×SSPEで湿らせ、そして8 ×12 cm の膜（ド
ットブロット装置のサイズ）あたり約5 mlのハイブリダ
イゼーション溶液を添加する。ハイブリダイゼーション
溶液１mlあたり約 1〜1.5 ピコモルの HRPプローブを添
加し、プローブを少なくとも１時間ハイブリダイズせし
める。ハイブリダイゼーション溶液はSSPE（前述）、５
×デンハーツおよび１％ Triton X-100 である。次いで
膜を 0.1×SSPEおよび 0.2％ Triton X-100 で10分間洗
浄する。その他の点で、ハイブリダイゼーションおよび
洗浄条件は実施例３に記載した通りであった。使用した
プローブはDB27, DB29, DB30, DB31, DB33, DB34, DB3
5, DB37, DB38, DB40, DB41, DB58, DB59, DB62およびD
B63である。

【０１３７】Ｄ．検出次のプローブの検出段階は、適度の振盪と膜を完全に被
覆するのに丁度足る溶液を使って、Bugawan ら, 1988,
Bio/Technology 6:943-947 （これは参考として本明細
書中に組み込まれる）に記載されたように室温で実施す
る。膜を緩衝液Ｂと共に５分間インキュベートし、緩衝
液Ｃで５分間洗浄し、そして遮光下で緩衝液ＣとTMB
（緩衝液Ｃ 48 mlと2 mg/ml のTMB 2.5 ml）と共に10分
間インキュベートすることにより検出を行う。

【０１３８】緩衝液Ｂは 100 mM NaCl，１Ｍ尿素，５％
Triton X-100および１％硫酸デキストランである。緩衝
液Ｃは 100 mM クエン酸ナトリウム，pH 5.0である。TM
B は３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジンであ
る。50.5 ml の緩衝液Ｃ／TMB に23μl の3% H₂O₂を添
加する。生じた溶液を使って遮光条件下で膜上に色を発
色させる（発色は 1〜15分間生じる）。少量の緩衝液Ｃ
を含むH₂O 中でフィルターを洗浄することにより発色を
停止させる。緩衝液Ｃ洗浄を30分間２回繰り返す。膜の
写真を取り、そして遮光下で膜を緩衝液Ｃ中に保存す
る。

【０１３９】ここに記載の方法並びに SSOプローブおよ
びプライマー並びにそれらを含むキットは、正確で、比
較的単純で且つ経済的な個体のHLA-DP遺伝子型決定に有
用である。正確なDP型決定は幾つかの医学用途に重要で
あるとわかるだろう。例えば、提供者と受容者の正確な
HLA-DP型の一致は、同種移植片拒絶の防止や対宿主性移
植片病の防止に役立つかもしれない。或る種のHLA-DP遺
伝子型は或る種の自己免疫疾患（例えばセリアック病、
少数関節性JRA およびIDDMを含む）に関連するように思
われるので、完全な臨床的症候が現れる前の前記病気の
早期診断において有用かもしれない。

【０１４０】正確なHLA-DP型決定は法医学において有用
である。例えば、それはゲノム核酸を含む試料、例えば
血液、毛髪または精液が容疑者に由来するかどうかにつ
いての証拠を提供する。また個体の実父または実母を確
定する際にも有用である。後者は歴史的試料を分析する
際に特に重要である。

【０１４１】実施例11：15プローブDPB1型決定アッセ
イ；ドットブロットおよび逆ドットブロット方式ドットブロットおよび逆ドットブロットハイブリダイゼ
ーションプロトコールは既に上記に記載してある。ここ
では、各ハイブリダイゼーションプロトコールを使った
DPB1型決定アッセイを記載する。それらのアッセイは15
個のプローブ、即ち領域Ａ用４個、領域Ｃ用４個、領域
Ｄ用５個そして領域Ｆ用２個を使用する。両プロトコー
ルは、Bugawan ら, 1990, Immunogenetics 32:231-241
（これは参考として本明細書中に組み込まれる）に記載
されたようなDPB1遺伝子座における型決定に好結果に利
用されている。

【０１４２】Ａ．ドットブロットプライマーUG19とUG21を用いて、それらのプライマーに
ついて実施例２に記載した増幅プロトコールを使って増
幅を行う。ドットブロット方式では、増幅されたＤＮＡ
を膜上に固定化する。約100 ngの増幅されたＤＮＡを0.
4N NaOH および25mM EDTA の溶液45μl 中で室温にて10
分間変性せしめる。

【０１４３】膜（Genetrans-45〔Plasco, Woburn, Mass
achusetts 〕またはBiodyne 〔Pall, Glen Cove, New Y
ork 〕）を２×食塩−リン酸ナトリウム−EDTA（SSPE）
または10mM Tris, 0.1mM EDTA 中で予め湿らせる。次い
で、ドットブロット装置（Biodot, BioRad, Richmond,
California）を使って50μl の変性ＤＮＡ試料を膜に適
用する。Stratalinker（Stratagene, La Jolla, Califo
rnia）を使って50 mJ/cm²においてＤＮＡを膜に紫外線
（ＵＶ）架橋せしめる。予め湿らせるのに使ったのと同
じ溶液中で膜を手短にすすぐことにより、未結合のＤＮ
Ａを除去する。

【０１４４】ハイブリダイゼーションは本質的には上記
実施例に記載された通りに実施する。プローブおよびハ
イブリダイゼーション条件は下記に示される。２組のプ
ローブとハイブリダイゼーションおよび洗浄条件とが示
される。第一組はSSPE（指摘の濃度で）および 0.5％ド
デシル硫酸ナトリウム(SDS) のハイブリダイゼーション
溶液を使用する。ハイブリダイゼーション溶液１mlあた
り１ピコモルのHRP 標識プローブを用いて振盪水浴中で
（注釈が付けられた場合を除く）指摘の温度（摂氏度）
で30〜60分間ハイブリダイゼーションを行う（96枚の試
料フィルター当たり８mlのハイブリダイゼーション溶液
を使う）。次いでフィルターを 0.1×SSPE＋0.1% SDS中
で指摘の温度で10分間洗浄することにより、未結合のプ
ローブを除去する。

【０１４５】第二組のプローブおよびハイブリダイゼー
ション条件は、TAMCl を使ったハイブリダイゼーション
（実施例３に記載）のためのものである。上記と同様に
して3M TAMCl, 0.5% SDS, 10mM Tris (pH 7.2)および0.
1mM EDTA中で指摘の温度においてハイブリダイゼーショ
ンを行う。3M TAMCl, 50mM Tris (pH 7.2)および2mMEDT
A中で37℃にて10分間、次いで指摘の緊縮温度にて10分
間フィルターを洗浄することにより、未結合のプローブ
を除去する。

【０１４６】下表において、丸括弧内のプローブは、TA
MCl 用のハイブリダイゼーション条件下で作業するため
にデザインされたプローブである。第二のプローブが示
されていない場合、指摘のプローブはSSPEとTAMCl の両
方のハイブリダイゼーション条件に使われる。全てのDP
B1プローブの配列は上記実施例と配列表中に提供されて
いる。領域Ｂのすぐ３′の非可変配列に特異的であり且
つ全てのDPB1対立遺伝子配列にハイブリダイズする１つ
のプローブ（DB123 、配列番号 136、5'CGCTTCGACAGCGA
CGT 3'）も含まれる。この「All 」プローブは、ハイブ
リダイゼーション反応における増幅されたDPB1 DNAの量
の対照として使われる。

【０１４７】

【表３６】 ^*これらのプローブには振盪水浴の代わりにエアインキ
ュベーターを使う。

【０１４８】固定化ＤＮＡへの HRP標識プローブのハイ
ブリダイゼーションは、過酸化水素の存在下で HRPによ
り青色沈澱物に変換される無色の可溶性基質テトラメチ
ルベンジジン（TMB, Fluka, Ron Kon, Koma, New York
）を使うことによって検出する。検出は適度な振盪下
で室温にて次のようにして行われる。洗浄後、膜を１×
ダルベッコのリン酸塩緩衝化塩溶液中で30分間インキュ
ベートし、次いで緩衝液Ｃ（100mM クエン酸ナトリウ
ム, pH 5）＋0.1 mg/ml TMB に移す。

【０１４９】0.0015％の最終濃度への過酸化水素の直接
添加によりTMB が沈澱し、１〜５分で青色沈澱として現
れる。膜を0.01×緩衝液Ｃに移すことにより反応を停止
させる。永久的記録のため、膜を写真撮影することがで
きる。遮光下で緩衝液Ｃ中に個別に保存すれば、沈澱物
は２か月に渡り安定である。あるいは、高感度の市販の
ECL遺伝子検出系キット（Amersham, Arlington Height
s, Illinois ）を使って、 HRP標識プローブのハイブリ
ダイゼーションを検出することができる。

【０１５０】Ｂ．逆ドットブロット逆ドットブロット方式では、プローブを膜に固定化しそ
してビオチニル化された増幅ＤＮＡにハイブリダイズせ
しめる。使用するプロトコールは本質的にはSaiki ら,
1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6215-6219に記
載された通りである。

【０１５１】増幅は上記のドットブロットと同様に行わ
れるが、ただし各プライマーはオリゴヌクレオチドの
５′末端に結合された単一のビオチン分子を含む。下記
に示す15のプローブに、ターミナルデオキシリボヌクレ
オチジルトランスフェラーゼかまたは化学合成のいずれ
かを使ってポリＴ末尾を提供し、そして該プローブをフ
ィルターに結合せしめる。それらの長さのため、末尾が
優先的に膜に結合し、オリゴヌクレオチドプローブを自
由にハイブリダイズできる状態にしておく。膜を１×SS
PE, 0.5% SDS中で50℃にて少なくとも30分間洗浄するこ
とにより、未結合のプローブを除去する。

【０１５２】使用した15のプローブを、それらがハイブ
リダイズする遺伝子の領域に従ってグループ分けして下
記に列挙する。検出される特異的アミノ酸エピトープ
は、上述のドットブロット方式で使用した15のプローブ
により検出されたのと同じエピトープである。各プロー
ブのハイブリダイゼーション領域の配列は上記実施例と
配列表中に与えられる。上述した「All 」プローブもこ
こに含まれる。

【０１５３】

【表３７】

【０１５４】ハイブリダイゼーションのために、ビオチ
ニル化された増幅ＤＮＡを95℃にて５分間変性させ、次
いで氷上で冷却する。50μl の変性ＤＮＡを、70μl の
20 mg/mlストレプトアビジン−HRP 接合体（Amplitype
^TM, Hoffmann-La Roche Inc., Nutley, New Jersey）と
一緒に2.5 mlの予熱された（50℃）ハイブリダイゼーシ
ョン溶液（１×SSPE, 0.5% SDS）中のフィルターに添加
する。振盪水浴中で50℃にて30分間ハイブリダイゼーシ
ョンを行う。振盪水浴中42℃において0.25×SSPE, 0.1%
SDS中で10分間フィルターを洗浄することにより、未結
合のプローブを除去する。ドットブロットアッセイと同
様にハイブリダイゼーションを検出する。

【０１５５】実施例12：25プローブDPB1型決定アッセイ本質的には実施例11に記載の通りであるが、アミノ酸33
〜36（領域Ｂ）の５つの異なるエピトープ用の５個の追
加のプローブ、76位（領域Ｅ）の３つの可変アミノ酸用
の３個の追加のプローブ、およびアミノ酸84〜87（領域
Ｆ）のGGPMおよびVGPMエピトープを区別するための２個
の追加のプローブを含むように改変されたドットブロッ
トDPB1型決定アッセイもデザインした。下記に示すプロ
ーブのセットは実施例11に記載のものと異なる。

【０１５６】しかしながら、探査される可変領域と検出
される配列は、上述したように領域Ｂ用の５個のプロー
ブ、領域Ｅ用の３個のプローブおよび領域Ｆ用の２個の
プローブを追加すると同じである。実施例11と同様、対
照として前記プローブのセット中に「All 」プローブDB
123 が含まれる。それらの配列は上記実施例と配列表中
に提供される。

【０１５７】ハイブリダイゼーションは本質的には前の
実施例11に記載した通りに実施する。プローブハイブリ
ダイゼーションおよび洗浄条件を下表に示す。指摘の濃
度のSSPEと0.5 ％のドデシル硫酸ナトリウム(SDS) のハ
イブリダイゼーション溶液を使用する。注釈を加えた場
合を除いて、振盪水浴中でハイブリダイゼーション溶液
１mlあたり２ピコモルの HRP標識プローブを使って（96
−試料フィルターあたり8 mlのハイブリダイゼーション
溶液を使う）指摘の温度（摂氏）において20〜60分間ハ
イブリダイゼーションを行う。次いで下記に指摘の条件
を使って0.1 ×SSPE＋0.1% SDS中でフィルターを洗浄す
ることにより、未結合のプローブを除去する。

【０１５８】

【表３８】

【０１５９】20個のみの対立遺伝子が存在することが知
られていた時点で25プローブアッセイを使って幾つかの
異なる集団中の対立遺伝子の多形性を特徴付けた。多数
の試料が、以前には観察されなかった10個の対立遺伝子
の存在を暗示するユニークなハイブリダイゼーションパ
ターンを示した。それらの推定上の新規対立遺伝子をm1
3 ベクター中にクローニングし、そして増幅プライマー
UG21とAB111 を使って、本質的には上記実施例に記載の
通りに配列決定した。プライマーAB111 は、クローニン
グを容易にするために５′末端にBamHI 部位が付加され
ていること以外はプライマーUG19と同じである。UG19と
UG21のヌクレオチド配列は上記実施例２と配列表中に提
供される。AB111 の配列は下記と配列表中に示される。

【０１６０】ＰＣＲベースのアッセイを使って形質転換
体をDPB1第二エクソンの存在についてスクリーニングし
た。50mM KCl, 10mM Tris pH 8.3, 各200 μM のdNTP,
4mMMgCl₂, 2.5単位のTaq ポリメラーゼ（Perkin Elmer,
Norwalk, CT ）並びにm13クローニング部位に隣接する
各20ピコモルのプライマーRS348 およびRS349 （配列は
下記に示す）を含有する100 μl のＰＣＲ反応混合物中
にピペットチップを使ってファージＤＮＡを移した。

【０１６１】35サイクルの増幅（95℃で１分間の変性、
60℃で30秒間のアニーリング、72℃で30秒間の伸長）の
後、3% Nusieve／1% Agaroseゲル上に５μl のＰＣＲ生
成物を適用し、そして³⁵Ｓ−dATPとシークエナーゼ 2.0
（United States Biochemicals）を用いてジデオキシチ
ェーンターミネーション法により正しいサイズ（約400
塩基対）のＰＣＲ生成物を生産するクローンを配列決定
した。

【０１６２】

【表３９】

【０１６３】10個の新規対立遺伝子、前記10個の新規対
立遺伝子の各々が見つかる集団、および前記集団内の対
立遺伝子頻度を下記の表に示す。各対立遺伝子に対して
２つの名称が与えられる。第一はＷＨＯ命名委員会によ
り与えられた公式名称であり、括弧内に示される第二の
名称は同義名称である。それらの10個の対立遺伝子のヌ
クレオチド配列は上記対立遺伝子配列表と配列表中に示
される。それらのヌクレオチド配列は、 Genbankヌクレ
オチドデータベースに提出され、登録番号M84617〜M846
26を与えられている。

【０１６４】

【表４０】

【０１６５】前記対立遺伝子の大部分は、調査した集団
中比較的少頻度（＜５％）であると思われる。全部では
ないが２例、DPB1^*3201とDPB1^*3301の場合、各対立遺
伝子は最小２人の無関係の個体中に見つかった。一般
に、それらの10個の新規対立遺伝子は、前の実施例に記
載した20個のDPB1対立遺伝子中に同定されたのと同じ多
形性パッチワークパターンを示す。DPB1^*3201は、アミ
ノ酸57を特定するコドン中に単一ヌクレオチド置換（Ａ
→Ｔ）を有し、この置換がこの位置にバリン残基を生ぜ
しめ、そして第三領域（領域Ｃ）の多様性に新規配列モ
チーフ(DEV) を与えるという点でユニークである。プロ
ーブ AB112（配列番号92）は、この新規配列モチーフを
検出するためにデザインされる。 AB112（配列番号92）
の配列を下記に示す：

【０１６６】 AB112 配列番号92 5' XCCTGATGAGGTGTACTG 3' ここでＸはHRP を示す。このプローブを使って様々な集
団中のほぼ2,000 個体を型決定した。これまでのところ
該プローブはDEV モチーフが見つかった最初の試料との
みハイブリダイズし、このことはそれがまれな変異体で
あることを示唆する。

【０１６７】２つの対立遺伝子DPB1^*3101とDPB1^*3401
は、72位に単一アミノ酸変化（Ｖ→Ｌ）を引き起こすヌ
クレオチド241 位に単一塩基置換（Ｇ→Ｌ）を有する。
これはＡからＦまでと命名した６つの領域以外の多形性
領域の最初の例である。

【０１６８】このDPB1型決定アッセイは、25個の配列特
異的オリゴヌクレオチドプローブ、即ち領域Ａ用の４個
（LFQG, VYQL, VYQG, VHQL）、領域Ｂ用の５個（EEFAR
F, EELVRF, QEYARF, EEYARFおよびEEFVRF）、領域Ｃ用
の４個（AAE, DEE, EAE, DED）、領域Ｄ用の５個（I-K,
I-E, L-K, L-E, L-R ）、領域Ｅ用の３個（M, V, I ）
そして領域Ｆ用の３個（GGPM, VGPM, DEAV）から成る。
10個の新規対立遺伝子の発見前に知られていたもとの20
個のDPB1対立遺伝子を使うと、190 の異型接合遺伝子型
（20個の対立遺伝子を使うと210 の可能な遺伝子型が存
在し、そのうちの190 が異型接合である）の６つをほと
んど識別することができた。

【０１６９】本明細書に報告される10個の新規対立遺伝
子の追加は、DPB1対立遺伝子の数を30に増やし、そして
可能な遺伝子型の数を465 に増やす。それらの新規対立
遺伝子の追加は、幾つかの異型接合組合せが識別不可能
なプローブハイブリダイゼーションパターンを有し得る
ようなアッセイに更なる曖昧さを加えることになる。し
かしながら、DEV モチーフ用のプローブ（AB112 ─配列
番号92）を加えた25プローブ型決定アッセイの使用によ
り、９組の遺伝子型（18の遺伝子型）がほとんど識別可
能である。

【０１７０】より多数の集団の研究により、新規対立遺
伝子が発見されることが予想される。本発明の方法は新
規対立遺伝子を検出するための手段を提供し、上述の対
立遺伝子に限定されるものではない。本明細書に記載の
方法により適当なプローブパネルを選択することによっ
て迅速且つ正確なDPB1型決定が達成される。

【０１７１】

【配列表】配列番号：１配列の長さ：８１配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｐｅｐｔｉｄｅ配列： Asp His Val Ser Thr Tyr Ala Ala Phe Val Gln Thr His Arg Pro 1 5 10 15 Thr Gly Glu Phe Met Phe Glu Phe Asp Glu Asp Glu Met Phe Tyr 20 25 30 Val Asp Leu Asp Lys Lys Glu Thr Val Trp His Leu Glu Glu Phe 35 40 45 Gly Gln Ala Phe Ser Phe Glu Ala Gln Gly Gly Leu Ala Asn Ile 50 55 60 Ala Ile Leu Asn Asn Asn Leu Asn Thr Leu Ile Gln Arg Ser Asn 65 70 75 His Thr Gln Ala Thr Asn 80

【０１７２】配列番号：２配列の長さ：８１配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｐｅｐｔｉｄｅ配列： Asp His Val Ser Thr Tyr Ala Ala Phe Val Gln Thr His Arg Pro 1 5 10 15 Thr Gly Glu Phe Met Phe Glu Phe Asp Glu Asp Glu Gln Phe Tyr 20 25 30 Val Asp Leu Asp Lys Lys Glu Thr Val Trp His Leu Glu Glu Phe 35 40 45 Gly Arg Ala Phe Ser Phe Glu Ala Gln Gly Gly Leu Ala Asn Ile 50 55 60 Ala Ile Leu Asn Asn Asn Leu Asn Thr Leu Ile Gln Arg Ser Asn 65 70 75 His Thr Gln Ala Ala Asn 80

【０１７３】配列番号：３配列の長さ：８０配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｐｅｐｔｉｄｅ配列： Asp His Val Ser Thr Tyr Ala Glu Phe Val Gln Thr His Arg Pro 1 5 10 15 Ser Gly Glu Tyr Met Phe Glu Phe Asp Glu Glu Glu Gln Phe Tyr 20 25 30 Val Asn Leu Asp Glu Lys Glu Met Val Trp Pro Leu Pro Glu Phe 35 40 45 Ile His Thr Phe Asp Phe Gly Ala Gln Arg Gly Ile Ala Gly Ile 50 55 60 Val Met Ala Arg Lys His Leu Asn Thr Arg Ile Asn Gly Lys Gln 65 70 75 Thr Trp Ala Thr Asp 80

【０１７４】配列番号：４配列の長さ：８７配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｐｅｐｔｉｄｅ配列： Asn Ser Val Tyr Gln Glu Arg Gln Glu Cys Tyr Ala Phe Asn Gly 1 5 10 15 Thr Gln Arg Val Val Asp Gly Leu Ile Tyr Asn Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Val His Phe Asp Ala Asp Val Gly Glu Leu Arg Ala Met Thr Glu 35 40 45 Leu Gly Arg Pro Ile Gly Glu Tyr Phe Asn Ser Gln Lys Asp Phe 50 55 60 Met Glu Arg Lys Arg Ala Glu Val Asp Lys Val Cys Arg His Lys 65 70 75 Tyr Glu Leu Met Glu Pro Leu Ile Arg Gln Arg Arg 80 85

【０１７５】配列番号：５配列の長さ：２４９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列： GTGTACCAGG GACGGCAGGA ATGCTACGCG TTTAATGGGA CACAGCGCTT 50 CCTGGAGAGA TACATCTACA ACCGGGAGGA GTACGCGCGC TTCGACAGCG 100 ACGTGGGGGA GTTCCGGGCG GTGACGGAGC TGGGGCGGCC TGCTGCGGAG 150 TACTGGAACA GCCAGAAGGA CATCCTGGAG GAGAAGCGGG CAGTGCCGGA 200 CAGGGTATGC AGACACAACT ACGAGCTGGA CGAGGCCGTG ACCCTGCAG 249

【０１７６】配列番号：６配列の長さ：８３配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｐｅｐｔｉｄｅ配列： Val Tyr Gln Gly Arg Gln Glu Cys Tyr Ala Phe Asn Gly Thr Gln 1 5 10 15 Arg Phe Leu Glu Arg Tyr Ile Tyr Asn Arg Glu Glu Tyr Ala Arg 20 25 30 Phe Asp Ser Asp Val Gly Glu Phe Arg Ala Val Thr Glu Leu Gly 35 40 45 Arg Pro Ala Ala Glu Tyr Trp Asn Ser Gln Lys Asp Ile Leu Glu 50 55 60 Glu Lys Arg Ala Val Pro Asp Arg Val Cys Arg His Asn Tyr Glu 65 70 75 Leu Asp Glu Ala Val Thr Leu Gln 80

【０１７７】配列番号：７配列の長さ：２５７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列： AGAATTACCT TTTCCAGGGA CGGCAGGAAT GCTACGCGTT TAATGGGACA 50 CAGCGCTTCC TGGAGAGATA CATCTACAAC CGGGAGGAGT TCGTGCGCTT 100 CGACAGCGAC GTGGGGGAGT TCCGGGCGGT GACGGAGCTG GGGCGGCCTG 150 ATGAGGAGTA CTGGAACAGC CAGAAGGACA TCCTGGAGGA GGAGCGGGCA 200 GTGCCGGACA GGATGTGCAG ACACAACTAC GAGCTGGGCG GGCCCATGAC 250 CCTGCAG 257

【０１７８】配列番号：８配列の長さ：８７配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｐｅｐｔｉｄｅ配列： Asn Tyr Leu Phe Gln Gly Arg Gln Glu Cys Tyr Ala Phe Asn Gly 1 5 10 15 Thr Gln Arg Phe Leu Glu Arg Tyr Ile Tyr Asn Arg Glu Glu Phe 20 25 30 Val Arg Phe Asp Ser Asp Val Gly Glu Phe Arg Ala Val Thr Glu 35 40 45 Leu Gly Arg Pro Asp Glu Glu Tyr Trp Asn Ser Gln Lys Asp Ile 50 55 60 Leu Glu Glu Glu Arg Ala Val Pro Asp Arg Met Cys Arg His Asn 65 70 75 Tyr Glu Leu Gly Gly Pro Met Thr Leu Gln Arg Arg 80 85

【０１７９】配列番号：９配列の長さ：２４９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列： CTTTTCCAGG GACGGCAGGA ATGCTACGCG TTTAATGGGA CACAGCGCTT 50 CCTGGAGAGA TACATCTACA ACCGGGAGGA GCTCGTGCGC TTCGACAGCG 100 ACGTGGGGGA GTTCCGGGCG GTGACGGAGC TGGGGCGGCC TGAGGCGGAG 150 TACTGGAACA GCCAGAAGGA CATCCTGGAG GAGGAGCGGG CAGTGCCGGA 200 CAGGATGTGC AGACACAACT ACGAGCTGGG CGGGCCCATG ACCCTGCAG 249

【０１８０】配列番号：１０配列の長さ：８５配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｐｅｐｔｉｄｅ配列： Asn Tyr Leu Phe Gln Gly Arg Gln Glu Cys Tyr Ala Phe Asn Gly 1 5 10 15 Thr Gln Arg Phe Leu Glu Arg Tyr Ile Tyr Asn Arg Glu Glu Phe 20 25 30 Ala Arg Phe Asp Ser Asp Val Gly Glu Phe Arg Ala Val Thr Glu 35 40 45 Leu Gly Arg Pro Ala Ala Glu Tyr Trp Asn Ser Gln Lys Asp Leu 50 55 60 Leu Glu Glu Lys Arg Ala Leu Pro Asp Arg Met Cys Arg His Asn 65 70 75 Tyr Glu Leu Asp Glu Ala Val Thr Leu Gln 80 85

【０１８１】配列番号：１１配列の長さ：２４９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列： GTGTACCAGT TACGGCAGGA ATGCTACGCG TTTAATGGGA CACAGCGCTT 50 CCTGGAGAGA TACATCTACA ACCGGGAGGA GTTCGTGCGC TTCGACAGCG 100 ACGTGGGGGA GTTCCGGGCG GTGACGGAGC TGGGGCGGCC TGATGAGGAC 150 TACTGGAACA GCCAGAAGGA CCTCCTGGAG GAGAAGCGGG CAGTGCCGGA 200 CAGGGTATGC AGACACAACT ACGAGCTGGA CGAGGCCGTG ACCCTGCAG 249

【０１８２】配列番号：１２配列の長さ：８３配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｐｅｐｔｉｄｅ配列： Val Tyr Gln Leu Arg Gln Glu Cys Tyr Ala Phe Asn Gly Thr Gln 1 5 10 15 Arg Phe Leu Glu Arg Tyr Ile Tyr Asn Arg Glu Glu Phe Val Arg 20 25 30 Phe Asp Ser Asp Val Gly Glu Phe Arg Ala Val Thr Glu Leu Gly 35 40 45 Arg Pro Asp Glu Asp Tyr Trp Asn Ser Gln Lys Asp Leu Leu Glu 50 55 60 Glu Lys Arg Ala Val Pro Asp Arg Val Cys Arg His Asn Tyr Glu 65 70 75 Leu Asp Glu Ala Val Thr Leu Gln 80

【０１８３】配列番号：１３配列の長さ：２６４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列： AGAATTACCT TTTCCAGGGA CGGCAGGAAT GCTACGCGTT TAATGGGACA 50 CAGCGCTTCC TGGAGAGATA CATCTACAAC CGGGAGGAGT TCGCGCGCTT 100 CGACAGCGAC GTGGGGGAGT TCCGGGCGGT GACGGAGCTG GGGCGGCCTG 150 CTGCGGAGTA CTGGAACAGC CAGAAGGACA TCCTGGAGGA GAAGCGGGCA 200 GTGCCGGACA GGATGTGCAG ACACAACTAC GAGCTGGGCG GGCCCATGAC 250 CCTGCAGCGC CGAG 264

【０１８４】配列番号：１４配列の長さ：８７配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｐｅｐｔｉｄｅ配列： Asn Tyr Leu Phe Gln Gly Arg Gln Glu Cys Tyr Ala Phe Asn Gly 1 5 10 15 Thr Gln Arg Phe Leu Glu Arg Tyr Ile Tyr Asn Arg Glu Glu Phe 20 25 30 Ala Arg Phe Asp Ser Asp Val Gly Glu Phe Arg Ala Val Thr Glu 35 40 45 Leu Gly Arg Pro Ala Ala Glu Tyr Trp Asn Ser Gln Lys Asp Ile 50 55 60 Leu Glu Glu Lys Arg Ala Val Pro Asp Arg Met Cys Arg His Asn 65 70 75 Tyr Glu Leu Gly Gly Pro Met Thr Leu Gln Arg Arg 80 85

【０１８５】配列番号：１５配列の長さ：２５６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列： CTTTTCCAGG GACGGCAGGA ATGCTACGCG TTTAATGGGA CACAGCGCTT 50 CCTGGAGAGA TACATCTACA ACCGGGAGGA GTTCGTGCGC TTCGACAGCG 100 ACGTGGGGGA GTTCCGGGCG GTGACGGAGC TGGGGCGGCC TGATGAGGAG 150 TACTGGAACA GCCAGAAGGA CATCCTGGAG GAGAAGCGGG CAGTGCCGGA 200 CAGGATGTGC AGACACAACT ACGAGCTGGG CGGGCCCATG ACCCTGCAGC 250 GCCGAG 256

【０１８６】配列番号：１６配列の長さ：８３配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｐｅｐｔｉｄｅ配列： Leu Phe Gln Gly Arg Gln Glu Cys Tyr Ala Phe Asn Gly Thr Gln 1 5 10 15 Arg Phe Leu Glu Arg Tyr Ile Tyr Asn Arg Glu Glu Phe Val Arg 20 25 30 Phe Asp Ser Asp Val Gly Glu Phe Arg Ala Val Thr Glu Leu Gly 35 40 45 Arg Pro Asp Glu Glu Tyr Trp Asn Ser Gln Lys Asp Ile Leu Glu 50 55 60 Glu Lys Arg Ala Val Pro Asp Arg Met Cys Arg His Asn Tyr Glu 65 70 75 Leu Gly Gly Pro Met Thr Leu Gln 80

【０１８７】配列番号：１７配列の長さ：２４９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列： CTTTTCCAGG GACGGCAGGA ATGCTACGCG TTTAATGGGA CACAGCGCTT 50 CCTGGAGAGA TACATCTACA ACCGGGAGGA GCTCGTGCGC TTCGACAGCG 100 ACGTGGGGGA GTTCCGGGCG GTGACGGAGC TGGGGCGGCC TGAGGCGGAG 150 TACTGGAACA GCCAGAAGGA CATCCTGGAG GAGAAGCGGG CAGTGCCGGA 200 CAGGATGTGC AGACACAACT ACGAGCTGGA CGAGGCCGTG ACCCTGCAG 249

【０１８８】配列番号：１８配列の長さ：８３配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｐｅｐｔｉｄｅ配列： Leu Phe Gln Gly Arg Gln Glu Cys Tyr Ala Phe Asn Gly Thr Gln 1 5 10 15 Arg Phe Leu Glu Arg Tyr Ile Tyr Asn Arg Glu Glu Leu Val Arg 20 25 30 Phe Asp Ser Asp Val Gly Glu Phe Arg Ala Val Thr Glu Leu Gly 35 40 45 Arg Pro Glu Ala Glu Tyr Trp Asn Ser Gln Lys Asp Ile Leu Glu 50 55 60 Glu Lys Arg Ala Val Pro Asp Arg Met Cys Arg His Asn Tyr Glu 65 70 75 Leu Asp Glu Ala Val Thr Leu Gln 80

【０１８９】配列番号：１９配列の長さ：２４９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列： GTGTACCAGT TACGGCAGGA ATGCTACGCG TTTAATGGGA CACAGCGCTT 50 CCTGGAGAGA TACATCTACA ACCGGGAGGA GTTCGTGCGC TTCGACAGCG 100 ACGTGGGGGA GTTCCGGGCG GTGACGGAGC TGGGGCGGCC TGATGAGGAC 150 TACTGGAACA GCCAGAAGGA CCTCCTGGAG GAGGAGCGGG CAGTGCCGGA 200 CAGGATGTGC AGACACAACT ACGAGCTGGA CGAGGCCGTG ACCCTGCAG 249

【０１９０】配列番号：２０配列の長さ：８３配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｐｅｐｔｉｄｅ配列： Val Tyr Gln Leu Arg Gln Glu Cys Tyr Ala Phe Asn Gly Thr Gln 1 5 10 15 Arg Phe Leu Glu Arg Tyr Ile Tyr Asn Arg Glu Glu Phe Val Arg 20 25 30 Phe Asp Ser Asp Val Gly Glu Phe Arg Ala Val Thr Glu Leu Gly 35 40 45 Arg Pro Asp Glu Asp Tyr Trp Asn Ser Gln Lys Asp Leu Leu Glu 50 55 60 Glu Glu Arg Ala Val Pro Asp Arg Met Cys Arg His Asn Tyr Glu 65 70 75 Leu Asp Glu Ala Val Thr Leu Gln 80

【０１９１】配列番号：２１配列の長さ：２４９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列： CTTTTCCAGG GACGGCAGGA ATGCTACGCG TTTAATGGGA CACAGCGCTT 50 CCTGGAGAGA TACATCTACA ACCGGGAGGA GTTCGTGCGC TTCGACAGCG 100 ACGTGGGGGA GTTCCGGGCG GTGACGGAGC TGGGGCGGCC TGATGAGGAG 150 TACTGGAACA GCCAGAAGGA CATCCTGGAG GAGGAGCGGG CAGTGCCGGA 200 CAGGGTATGC AGACACAACT ACGAGCTGGA CGAGGCCGTG ACCCTGCAG 249

【０１９２】配列番号：２２配列の長さ：８３配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｐｅｐｔｉｄｅ配列： Leu Phe Gln Gly Arg Gln Glu Cys Tyr Ala Phe Asn Gly Thr Gln 1 5 10 15 Arg Phe Leu Glu Arg Tyr Ile Tyr Asn Arg Glu Glu Phe Val Arg 20 25 30 Phe Asp Ser Asp Val Gly Glu Phe Arg Ala Val Thr Glu Leu Gly 35 40 45 Arg Pro Asp Glu Glu Tyr Trp Asn Ser Gln Lys Asp Ile Leu Glu 50 55 60 Glu Glu Arg Ala Val Pro Asp Arg Val Cys Arg His Asn Tyr Glu 65 70 75 Leu Asp Glu Ala Val Thr Leu Gln 80

【０１９３】配列番号：２３配列の長さ：２４９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列： GTGCACCAGT TACGGCAGGA ATGCTACGCG TTTAATGGGA CACAGCGCTT 50 CCTGGAGAGA TACATCTACA ACCGGGAGGA GTTCGTGCGC TTCGACAGCG 100 ACGTGGGGGA GTTCCGGGCG GTGACGGAGC TGGGGCGGCC TGATGAGGAC 150 TACTGGAACA GCCAGAAGGA CATCCTGGAG GAGGAGCGGG CAGTGCCGGA 200 CAGGGTATGC AGACACAACT ACGAGCTGGA CGAGGCCGTG ACCCTGCAG 249

【０１９４】配列番号：２４配列の長さ：８３配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｐｅｐｔｉｄｅ配列： Val His Gln Leu Arg Gln Glu Cys Tyr Ala Phe Asn Gly Thr Gln 1 5 10 15 Arg Phe Leu Glu Arg Tyr Ile Tyr Asn Arg Glu Glu Phe Val Arg 20 25 30 Phe Asp Ser Asp Val Gly Glu Phe Arg Ala Val Thr Glu Leu Gly 35 40 45 Arg Pro Asp Glu Asp Tyr Trp Asn Ser Gln Lys Asp Ile Leu Glu 50 55 60 Glu Glu Arg Ala Val Pro Asp Arg Val Cys Arg His Asn Tyr Glu 65 70 75 Leu Asp Glu Ala Val Thr Leu Gln 80

【０１９５】配列番号：２５配列の長さ：２４９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列： GTGCACCAGT TACGGCAGGA ATGCTACGCG TTTAATGGGA CACAGCGCTT 50 CCTGGAGAGA TACATCTACA ACCGGGAGGA GTTCGTGCGC TTCGACAGCG 100 ACGTGGGGGA GTTCCGGGCG GTGACGGAGC TGGGGCGGCC TGATGAGGAG 150 TACTGGAACA GCCAGAAGGA CATCCTGGAG GAGGAGCGGG CAGTGCCGGA 200 CAGGGTATGC AGACACAACT ACGAGCTGGA CGAGGCCGTG ACCCTGCAG 249

【０１９６】配列番号：２６配列の長さ：８３配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｐｅｐｔｉｄｅ配列： Val His Gln Leu Arg Gln Glu Cys Tyr Ala Phe Asn Gly Thr Gln 1 5 10 15 Arg Phe Leu Glu Arg Tyr Ile Tyr Asn Arg Glu Glu Phe Val Arg 20 25 30 Phe Asp Ser Asp Val Gly Glu Phe Arg Ala Val Thr Glu Leu Gly 35 40 45 Arg Pro Asp Glu Glu Tyr Trp Asn Ser Gln Lys Asp Ile Leu Glu 50 55 60 Glu Glu Arg Ala Val Pro Asp Arg Val Cys Arg His Asn Tyr Glu 65 70 75 Leu Asp Glu Ala Val Thr Leu Gln 80

【０１９７】配列番号：２７配列の長さ：２４９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列： GTGTACCAGT TACGGCAGGA ATGCTACGCG TTTAATGGGA CACAGCGCTT 50 CCTGGAGAGA TACATCTACA ACCGGCAGGA GTACGCGCGC TTCGACAGCG 100 ACGTGGGAGA GTTCCGGGCG GTGACGGAGC TGGGGCGGCC TGCTGCGGAG 150 TACTGGAACA GCCAGAAGGA CCTCCTGGAG GAGAGGCGGG CAGTGCCGGA 200 CAGGATGTGC AGACACAACT ACGAGCTGGA CGAGGCCGTG ACCCTGCAG 249

【０１９８】配列番号：２８配列の長さ：８３配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｐｅｐｔｉｄｅ配列： Val Tyr Gln Leu Arg Gln Glu Cys Tyr Ala Phe Asn Gly Thr Gln 1 5 10 15 Arg Phe Leu Glu Arg Tyr Ile Tyr Asn Arg Gln Glu Tyr Ala Arg 20 25 30 Phe Asp Ser Asp Val Gly Glu Phe Arg Ala Val Thr Glu Leu Gly 35 40 45 Arg Pro Ala Ala Glu Tyr Trp Asn Ser Gln Lys Asp Leu Leu Glu 50 55 60 Glu Arg Arg Ala Val Pro Asp Arg Met Cys Arg His Asn Tyr Glu 65 70 75 Leu Asp Glu Ala Val Thr Leu Gln 80

【０１９９】配列番号：２９配列の長さ：２４９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列： GTGTACCAGT TACGGCAGGA ATGCTACGCG TTTAATGGGA CACAGCGCTT 50 CCTGGAGAGA TACATCTACA ACCGGGAGGA GTACGCGCGC TTCGACAGCG 100 ACGTGGGAGA GTTCCGGGCG GTGACGGAGC TGGGGCGGCC TGCTGCGGAG 150 TACTGGAACA GCCAGAAGGA CATCCTGGAG GAGGAGCGGG CAGTGCCGGA 200 CAGGATATGC AGACACAACT ACGAGCTGGA CGAGGCCGTG ACCCTGCAG 249

【０２００】配列番号：３０配列の長さ：８３配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｐｅｐｔｉｄｅ配列： Val Tyr Gln Leu Arg Gln Glu Cys Tyr Ala Phe Asn Gly Thr Gln 1 5 10 15 Arg Phe Leu Glu Arg Tyr Ile Tyr Asn Arg Glu Glu Tyr Ala Arg 20 25 30 Phe Asp Ser Asp Val Gly Glu Phe Arg Ala Val Thr Glu Leu Gly 35 40 45 Arg Pro Ala Ala Glu Tyr Trp Asn Ser Gln Lys Asp Ile Leu Glu 50 55 60 Glu Glu Arg Ala Val Pro Asp Arg Ile Cys Arg His Asn Tyr Glu 65 70 75 Leu Asp Glu Ala Val Thr Leu Gln 80

【０２０１】配列番号：３１配列の長さ：２４９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列： GTGCACCAGT TACGGCAGGA ATGCTACGCG TTTAATGGGA CACAGCGCTT 50 CCTGGAGAGA TACATCTACA ACCGGGAGGA GTTCGTGCGC TTCGACAGCG 100 ACGTGGGGGA GTTCCGGGCG GTGACGGAGC TGGGGCGGCC TGATGAGGAC 150 TACTGGAACA GCCAGAAGGA CCTCCTGGAG GAGAAGCGGG CAGTGCCGGA 200 CAGGGTATGC AGACACAACT ACGAGCTGGA CGAGGCCGTG ACCCTGCAG 249

【０２０２】配列番号：３２配列の長さ：８３配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｐｅｐｔｉｄｅ配列： Val His Gln Leu Arg Gln Glu Cys Tyr Ala Phe Asn Gly Thr Gln 1 5 10 15 Arg Phe Leu Glu Arg Tyr Ile Tyr Asn Arg Glu Glu Phe Val Arg 20 25 30 Phe Asp Ser Asp Val Gly Glu Phe Arg Ala Val Thr Glu Leu Gly 35 40 45 Arg Pro Asp Glu Asp Tyr Trp Asn Ser Gln Lys Asp Leu Leu Glu 50 55 60 Glu Lys Arg Ala Val Pro Asp Arg Val Cys Arg His Asn Tyr Glu 65 70 75 Leu Asp Glu Ala Val Thr Leu Gln 80

【０２０３】配列番号：３３配列の長さ：２４９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列： GTGTACCAGG GACGGCAGGA ATGCTACGCG TTTAATGGGA CACAGCGCTT 50 CCTGGAGAGA TACATCTACA ACCGGCAGGA GTACGCGCGC TTCGACAGCG 100 ACGTGGGAGA GTTCCGGGCG GTGACGGAGC TGGGGCGGCC TGCTGCGGAG 150 TACTGGAACA GCCAGAAGGA CCTCCTGGAG GAGAGGCGGG CAGTGCCGGA 200 CAGGATGTGC AGACACAACT ACGAGCTGGT CGGGCCCATG ACCCTGCAG 249

【０２０４】配列番号：３４配列の長さ：８３配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｐｅｐｔｉｄｅ配列： Val Tyr Gln Gly Arg Gln Glu Cys Tyr Ala Phe Asn Gly Thr Gln 1 5 10 15 Arg Phe Leu Glu Arg Tyr Ile Tyr Asn Arg Gln Glu Tyr Ala Arg 20 25 30 Phe Asp Ser Asp Val Gly Glu Phe Arg Ala Val Thr Glu Leu Gly 35 40 45 Arg Pro Ala Ala Glu Tyr Trp Asn Ser Gln Lys Asp Leu Leu Glu 50 55 60 Glu Arg Arg Ala Val Pro Asp Arg Met Cys Arg His Asn Tyr Glu 65 70 75 Leu Val Gly Pro Met Thr Leu Gln 80

【０２０５】配列番号：３５配列の長さ：２４９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列： CTTTTCCAGG GACGGCAGGA ATGCTACGCG TTTAATGGGA CACAGCGCTT 50 CCTGGAGAGA TACATCTACA ACCGGGAGGA GTTCGTGCGC TTCGACAGCG 100 ACGTGGGGGA GTTCCGGGCG GTGACGGAGC TGGGGCGGCC TGATGAGGAG 150 TACTGGAACA GCCAGAAGGA CATCCTGGAG GAGGAGCGGG CAGTGCCGGA 200 CAGGATGTGC AGACACAACT ACGAGCTGGA CGAGGCCGTG ACCCTGCAG 249

【０２０６】配列番号：３６配列の長さ：８３配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｐｅｐｔｉｄｅ配列： Leu Phe Gln Gly Arg Gln Glu Cys Tyr Ala Phe Asn Gly Thr Gln 1 5 10 15 Arg Phe Leu Glu Arg Tyr Ile Tyr Asn Arg Glu Glu Phe Val Arg 20 25 30 Phe Asp Ser Asp Val Gly Glu Phe Arg Ala Val Thr Glu Leu Gly 35 40 45 Arg Pro Asp Glu Glu Tyr Trp Asn Ser Gln Lys Asp Ile Leu Glu 50 55 60 Glu Glu Arg Ala Val Pro Asp Arg Met Cys Arg His Asn Tyr Glu 65 70 75 Leu Asp Glu Ala Val Thr Leu Gln 80

【０２０７】配列番号：３７配列の長さ：２４９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列： GTGCACCAGT TACGGCAGGA ATGCTACGCG TTTAATGGGA CACAGCGCTT 50 CCTGGAGAGA TACATCTACA ACCGGGAGGA GTTCGTGCGC TTCGACAGCG 100 ACGTGGGGGA GTTCCGGGCG GTGACGGAGC TGGGGCGGCC TGATGAGGAC 150 TACTGGAACA GCCAGAAGGA CATCCTGGAG GAGGAGCGGG CAGTGCCGGA 200 CAGGATGTGC AGACACAACT ACGAGCTGGA CGAGGCCGTG ACCCTGCAG 249

【０２０８】配列番号：３８配列の長さ：８３配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｐｅｐｔｉｄｅ配列： Val His Gln Leu Arg Gln Glu Cys Tyr Ala Phe Asn Gly Thr Gln 1 5 10 15 Arg Phe Leu Glu Arg Tyr Ile Tyr Asn Arg Glu Glu Phe Val Arg 20 25 30 Phe Asp Ser Asp Val Gly Glu Phe Arg Ala Val Thr Glu Leu Gly 35 40 45 Arg Pro Asp Glu Asp Tyr Trp Asn Ser Gln Lys Asp Ile Leu Glu 50 55 60 Glu Glu Arg Ala Val Pro Asp Arg Met Cys Arg His Asn Tyr Glu 65 70 75 Leu Asp Glu Ala Val Thr Leu Gln 80

【０２０９】配列番号：３９配列の長さ：２４９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列： GTGTACCAGG GACGGCAGGA ATGCTACGCG TTTAATGGGA CACAGCGCTT 50 CCTGGAGAGA TACATCTACA ACCGGGAGGA GTTCGTGCGC TTCGACAGCG 100 ACGTGGGGGA GTTCCGGGCG GTGACGGAGC TGGGGCGGCC TGATGAGGAG 150 TACTGGAACA GCCAGAAGGA CATCCTGGAG GAGAAGCGGG CAGTGCCGGA 200 CAGGATGTGC AGACACAACT ACGAGCTGGT CGGGCCCATG ACCCTGCAG 249

【０２１０】配列番号：４０配列の長さ：８３配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｐｅｐｔｉｄｅ配列： Val Tyr Gln Gly Arg Gln Glu Cys Tyr Ala Phe Asn Gly Thr Gln 1 5 10 15 Arg Phe Leu Glu Arg Tyr Ile Tyr Asn Arg Glu Glu Phe Val Arg 20 25 30 Phe Asp Ser Asp Val Gly Glu Phe Arg Ala Val Thr Glu Leu Gly 35 40 45 Arg Pro Asp Glu Glu Tyr Trp Asn Ser Gln Lys Asp Ile Leu Glu 50 55 60 Glu Lys Arg Ala Val Pro Asp Arg Met Cys Arg His Asn Tyr Glu 65 70 75 Leu Val Gly Pro Met Thr Leu Gln 80

【０２１１】配列番号：４１配列の長さ：２４９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列： CTTTTCCAGG GACGGCAGGA ATGCTACGCG TTTAATGGGA CACAGCGCTT 50 CCTGGAGAGA TACATCTACA ACCGGGAGGA GTTCGTGCGC TTCGACAGCG 100 ACGTGGGGGA GTTCCGGGCG GTGACGGAGC TGGGGCGGCC TGAGGCGGAG 150 TACTGGAACA GCCAGAAGGA CATCCTGGAG GAGGAGCGGG CAGTGCCGGA 200 CAGGATATGC AGACACAACT ACGAGCTGGA CGAGGCCGTG ACCCTGCAG 249

【０２１２】配列番号：４２配列の長さ：８３配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｐｅｐｔｉｄｅ配列： Leu Phe Gln Gly Arg Gln Glu Cys Tyr Ala Phe Asn Gly Thr Gln 1 5 10 15 Arg Phe Leu Glu Arg Tyr Ile Tyr Asn Arg Glu Glu Phe Val Arg 20 25 30 Phe Asp Ser Asp Val Gly Glu Phe Arg Ala Val Thr Glu Leu Gly 35 40 45 Arg Pro Glu Ala Glu Tyr Trp Asn Ser Gln Lys Asp Ile Leu Glu 50 55 60 Glu Glu Arg Ala Val Pro Asp Arg Ile Cys Arg His Asn Tyr Glu 65 70 75 Leu Asp Glu Ala Val Thr Leu Gln 80

【０２１３】配列番号：４３配列の長さ：８３配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｐｅｐｔｉｄｅ配列： Val His Gln Leu Arg Gln Glu Cys Tyr Ala Phe Asn Gly Thr Gln 1 5 10 15 Arg Phe Leu Glu Arg Tyr Ile Tyr Asn Arg Glu Glu Phe Val Arg 20 25 30 Phe Asp Ser Asp Val Gly Glu Phe Arg Ala Val Thr Glu Leu Gly 35 40 45 Arg Pro Asp Glu Asp Tyr Trp Asn Ser Gln Lys Asp Leu Leu Glu 50 55 60 Glu Lys Arg Ala Val Pro Asp Arg Met Cys Arg His Asn Tyr Glu 65 70 75 Leu Asp Glu Ala Val Thr Leu Gln 80

【０２１４】配列番号：４４配列の長さ：２５７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列： AGAATTACCT TTTCCAGGGA CGGCAGGAAT GCTACGCGTT TAATGGGACA 50 CAGCGCTTCC TGGAGAGATA CATCTACAAC CGGGAGGAGT TCGCGCGCTT 100 CGACAGCGAC GTGGGGGAGT TCCGGGCGGT GACGGAGCTG GGGCGGCCTG 150 ATGAGGAGTA CTGGAACAGC CAGAAGGACC TCCTGGAGGA GAAGCGGGCA 200 GTGCCGGACA GGATGTGCAG ACACAACTAC GAGCTGGTCG GGCCCATGAC 250 CCTGCAG 257

【０２１５】配列番号：４５配列の長さ：８５配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｐｅｐｔｉｄｅ配列： Asn Tyr Leu Phe Gln Gly Arg Gln Glu Cys Tyr Ala Phe Asn Gly 1 5 10 15 Thr Gln Arg Phe Leu Glu Arg Tyr Ile Tyr Asn Arg Glu Glu Phe 20 25 30 Ala Arg Phe Asp Ser Asp Val Gly Glu Phe Arg Ala Val Thr Glu 35 40 45 Leu Gly Arg Pro Asp Glu Glu Tyr Trp Asn Ser Gln Lys Asp Leu 50 55 60 Leu Glu Glu Lys Arg Ala Val Pro Asp Arg Met Cys Arg His Asn 65 70 75 Tyr Glu Leu Val Gly Pro Met Thr Leu Gln 80 85

【０２１６】配列番号：４６配列の長さ：２５７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列： AGAATTACCT TTTCCAGGGA CGGCAGGAAT GCTACGCGTT TAATGGGACA 50 CAGCGCTTCC TGGAGAGATA CATCTACAAC CGGGAGGAGT TCGCGCGCTT 100 CGACAGCGAC GTGGGGGAGT TCCGGGCGGT GACGGAGCTG GGGCGGCCTG 150 CTGCGGAGTA CTGGAACAGC CAGAAGGACC TCCTGGAGGA GAAGCGGGCA 200 TTGCCGGACA GGATGTGCAG ACACAACTAC GAGCTGGACG AGGCCGTGAC 250 CCTGCAG 257

【０２１７】配列番号：４７配列の長さ：８５配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｐｅｐｔｉｄｅ配列： Asn Tyr Leu Phe Gln Gly Arg Gln Glu Cys Tyr Ala Phe Asn Gly 1 5 10 15 Thr Gln Arg Phe Leu Glu Arg Tyr Ile Tyr Asn Arg Glu Glu Phe 20 25 30 Ala Arg Phe Asp Ser Asp Val Gly Glu Phe Arg Ala Val Thr Glu 35 40 45 Leu Gly Arg Pro Ala Ala Glu Tyr Trp Asn Ser Gln Lys Asp Leu 50 55 60 Leu Glu Glu Lys Arg Ala Leu Pro Asp Arg Met Cys Arg His Asn 65 70 75 Tyr Glu Leu Asp Glu Ala Val Thr Leu Gln 80 85

【０２１８】配列番号：４８配列の長さ：２５７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列： AGAATTACCT GTACCAGTTA CGGCAGGAAT GCTACGCGTT TAATGGGACA 50 CAGCGCTTCC TGGAGAGATA CATCTACAAC CGGGAGGAGT ACGCGCGCTT 100 CGACAGCGAC GTGGGGGAGT TCCGGGCGGT GACGGAGCTG GGGCGGCCTG 150 CTGCGGAGTA CTGGAACAGC CAGAAGGACA TCCTGGAGGA GAAGCGGGCA 200 GTGCCGGACA GGATGTGCAG ACACAACTAC GAGCTGGACG AGGCCGTGAC 250 CCTGCAG 257

【０２１９】配列番号：４９配列の長さ：８５配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｐｅｐｔｉｄｅ配列： Asn Tyr Val Tyr Gln Leu Arg Gln Glu Cys Tyr Ala Phe Asn Gly 1 5 10 15 Thr Gln Arg Phe Leu Glu Arg Tyr Ile Tyr Asn Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Ala Arg Phe Asp Ser Asp Val Gly Glu Phe Arg Ala Val Thr Glu 35 40 45 Leu Gly Arg Pro Ala Ala Glu Tyr Trp Asn Ser Gln Lys Asp Ile 50 55 60 Leu Glu Glu Lys Arg Ala Val Pro Asp Arg Met Cys Arg His Asn 65 70 75 Tyr Glu Leu Asp Glu Ala Val Thr Leu Gln 80 85

【０２２０】配列番号：５０配列の長さ：２５７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列： AGAATTACCT TTTCCAGGGA CGGCAGGAAT GCTACGCGTT TAATGGGACA 50 CAGCGCTTCC TGGAGAGATA CATCTACAAC CGGGAGGAGT TCGTGCGCTT 100 CGACAGCGAC GTGGGGGAGT TCCGGGCGGT GACGGAGCTG GGGCGGCCTG 150 ATGAGGTGTA CTGGAACAGC CAGAAGGACA TCCTGGAGGA GGAGCGGGCA 200 GTGCCGGACA GGATGTGCAG ACACAACTAC GAGCTGGGCG GGCCCATGAC 250 CCTGCAG 257

【０２２１】配列番号：５１配列の長さ：８５配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｐｅｐｔｉｄｅ配列： Asn Tyr Leu Phe Gln Gly Arg Gln Glu Cys Tyr Ala Phe Asn Gly 1 5 10 15 Thr Gln Arg Phe Leu Glu Arg Tyr Ile Tyr Asn Arg Glu Glu Phe 20 25 30 Val Arg Phe Asp Ser Asp Val Gly Glu Phe Arg Ala Val Thr Glu 35 40 45 Leu Gly Arg Pro Asp Glu Val Tyr Trp Asn Ser Gln Lys Asp Ile 50 55 60 Leu Glu Glu Glu Arg Ala Val Pro Asp Arg Met Cys Arg His Asn 65 70 75 Tyr Glu Leu Gly Gly Pro Met Thr Leu Gln 80 85

【０２２２】配列番号：５２配列の長さ：２５７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列： AGAATTACCT TTTCCAGGGA CGGCAGGAAT GCTACGCGTT TAATGGGACA 50 CAGCGCTTCC TGGAGAGATA CATCTACAAC CGGGAGGAGT TCGCGCGCTT 100 CGACAGCGAC GTGGGGGAGT TCCGGGCGGT GACGGAGCTG GGGCGGCCTG 150 CTGCGGAGTA CTGGAACAGC CAGAAGGACA TCCTGGAGGA GGAGCGGGCA 200 GTGCCGGACA GGATGTGCAG ACACAACTAC GAGCTGGGCG GGCCCATGAC 250 CCTGCAG 257

【０２２３】配列番号：５３配列の長さ：８５配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｐｅｐｔｉｄｅ配列： Asn Tyr Leu Phe Gln Gly Arg Gln Glu Cys Tyr Ala Phe Asn Gly 1 5 10 15 Thr Gln Arg Phe Leu Glu Arg Tyr Ile Tyr Asn Arg Glu Glu Phe 20 25 30 Ala Arg Phe Asp Ser Asp Val Gly Glu Phe Arg Ala Val Thr Glu 35 40 45 Leu Gly Arg Pro Ala Ala Glu Tyr Trp Asn Ser Gln Lys Asp Ile 50 55 60 Leu Glu Glu Glu Arg Ala Val Pro Asp Arg Met Cys Arg His Asn 65 70 75 Tyr Glu Leu Gly Gly Pro Met Thr Leu Gln 80 85

【０２２４】配列番号：５４配列の長さ：２５７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列： AGAATTACCT TTTCCAGGGA CGGCAGGAAT GCTACGCGTT TAATGGGACA 50 CAGCGCTTCC TGGAGAGATA CATCTACAAC CGGGAGGAGC TCGTGCGCTT 100 CGACAGCGAC GTGGGGGAGT TCCGGGCGGT GACGGAGCTG GGGCGGCCTG 150 CTGCGGAGTA CTGGAACAGC CAGAAGGACC TCCTGGAGGA GAAGCGGGCA 200 TTGCCGGACA GGATGTGCAG ACACAACTAC GAGCTGGTCG GGCCCATGAC 250 CCTGCAG 257

【０２２５】配列番号：５５配列の長さ：８５配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｐｅｐｔｉｄｅ配列： Asn Tyr Leu Phe Gln Gly Arg Gln Glu Cys Tyr Ala Phe Asn Gly 1 5 10 15 Thr Gln Arg Phe Leu Glu Arg Tyr Ile Tyr Asn Arg Glu Glu Leu 20 25 30 Val Arg Phe Asp Ser Asp Val Gly Glu Phe Arg Ala Val Thr Glu 35 40 45 Leu Gly Arg Pro Ala Ala Glu Tyr Trp Asn Ser Gln Lys Asp Leu 50 55 60 Leu Glu Glu Lys Arg Ala Leu Pro Asp Arg Met Cys Arg His Asn 65 70 75 Tyr Glu Leu Val Gly Pro Met Thr Leu Gln 80 85

【０２２６】配列番号：５６配列の長さ：２５７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列： AGAATTACGT GTACCAGTTA CGGCAGGAAT GCTACGCGTT TAATGGGACA 50 CAGCGCTTCC TGGAGAGATA CATCTACAAC CGGGAGGAGT TCGTGCGCTT 100 CGACAGCGAC GTGGGGGAGT TCCGGGCGGT GACGGAGCTG GGGCGGCCTG 150 ATGAGGACTA CTGGAACAGC CAGAAGGACC TCCTGGAGGA GGAGCGGGCA 200 GTGCCGGACA GGGTATGCAG ACACAACTAC GAGCTGGACG AGGCCGTGAC 250 CCTGCAG 257

【０２２７】配列番号：５７配列の長さ：８５配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｐｅｐｔｉｄｅ配列： Asn Tyr Val Tyr Gln Leu Arg Gln Glu Cys Tyr Ala Phe Asn Gly 1 5 10 15 Thr Gln Arg Phe Leu Glu Arg Tyr Ile Tyr Asn Arg Glu Glu Phe 20 25 30 Val Arg Phe Asp Ser Asp Val Gly Glu Phe Arg Ala Val Thr Glu 35 40 45 Leu Gly Arg Pro Asp Glu Asp Tyr Trp Asn Ser Gln Lys Asp Leu 50 55 60 Leu Glu Glu Glu Arg Ala Val Pro Asp Arg Val Cys Arg His Asn 65 70 75 Tyr Glu Leu Asp Glu Ala Val Thr Leu Gln 80 85

【０２２８】配列番号：５８配列の長さ：２５７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列： AGAATTACGT GCACCAGTTA CGGCAGGAAT GCTACGCGTT TAATGGGACA 50 CAGCGCTTCC TGGAGAGATA CATCTACAAC CGGGAGGAGT TCGTGCGCTT 100 CGACAGCGAC GTGGGGGAGT TCCGGGCGGT GACGGAGCTG GGGCGGCCTG 150 AGGCGGAGTA CTGGAACAGC CAGAAGGACA TCCTGGAGGA GGAGCGGGCA 200 GTGCCGGACA GGATGTGCAG ACACAACTAC GAGCTGGACG AGGCCGTGAC 250 CCTGCAG 257

【０２２９】配列番号：５９配列の長さ：８５配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｐｅｐｔｉｄｅ配列： Asn Tyr Val His Gln Leu Arg Gln Glu Cys Tyr Ala Phe Asn Gly 1 5 10 15 Thr Gln Arg Phe Leu Glu Arg Tyr Ile Tyr Asn Arg Glu Glu Phe 20 25 30 Val Arg Phe Asp Ser Asp Val Gly Glu Phe Arg Ala Val Thr Glu 35 40 45 Leu Gly Arg Pro Glu Ala Glu Tyr Trp Asn Ser Gln Lys Asp Ile 50 55 60 Leu Glu Glu Glu Arg Ala Val Pro Asp Arg Met Cys Arg His Asn 65 70 75 Tyr Glu Leu Asp Glu Ala Val Thr Leu Gln 80 85

【０２３０】配列番号：６０配列の長さ：２５７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列： AGAATTACGT GCACCAGTTA CGGCAGGAAT GCTACGCGTT TAATGGGACA 50 CAGCGCTTCC TGGAGAGATA CATCTACAAC CGGGAGGAGT TCGTGCGCTT 100 CGACAGCGAC GTGGGGGAGT TCCGGGCGGT GACGGAGCTG GGGCGGCCTG 150 ATGAGGACTA CTGGAACAGC CAGAAGGACA TCCTGGAGGA GAAGCGGGCA 200 GTGCCGGACA GGGTATGCAG ACACAACTAC GAGCTGGACG AGGCCGTGAC 250 CCTGCAG 257

【０２３１】配列番号：６１配列の長さ：８５配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｐｅｐｔｉｄｅ配列： Asn Tyr Val His Gln Leu Arg Gln Glu Cys Tyr Ala Phe Asn Gly 1 5 10 15 Thr Gln Arg Phe Leu Glu Arg Tyr Ile Tyr Asn Arg Glu Glu Phe 20 25 30 Val Arg Phe Asp Ser Asp Val Gly Glu Phe Arg Ala Val Thr Glu 35 40 45 Leu Gly Arg Pro Asp Glu Asp Tyr Trp Asn Ser Gln Lys Asp Ile 50 55 60 Leu Glu Glu Lys Arg Ala Val Pro Asp Arg Val Cys Arg His Asn 65 70 75 Tyr Glu Leu Asp Glu Ala Val Thr Leu Gln 80 85

【０２３２】配列番号：６２配列の長さ：２５７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列： AGAATTACGT GTCCCAGTTA CGGCAGGAAT GCTACGCGTT TAATGGGACA 50 CAGCGCTTCC TGGAGAGATA CATCTACAAC CGGGAGGAGC TCGTGCGCTT 100 CGACAGCGAC GTGGGGGAGT TCCGGGCGGT GACGGAGCTG GGGCGGCCTG 150 AGGCGGAGTA CTGGAACAGC CAGAAGGACA TCCTGGAGGA GGAGCGGGCA 200 GTGCCGGACA GGATGTGCAG ACACAACTAC GAGCTGGACG AGGCCGTGAC 250 CCTGCAG 257

【０２３３】配列番号：６３配列の長さ：８５配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｐｅｐｔｉｄｅ配列： Asn Tyr Val His Gln Leu Arg Gln Glu Cys Tyr Ala Phe Asn Gly 1 5 10 15 Thr Gln Arg Phe Leu Glu Arg Tyr Ile Tyr Asn Arg Glu Glu Leu 20 25 30 Val Arg Phe Asp Ser Asp Val Gly Glu Phe Arg Ala Val Thr Glu 35 40 45 Leu Gly Arg Pro Glu Ala Glu Tyr Trp Asn Ser Gln Lys Asp Ile 50 55 60 Leu Glu Glu Glu Arg Ala Val Pro Asp Arg Met Cys Arg His Asn 65 70 75 Tyr Glu Leu Asp Glu Ala Val Thr Leu Gln 80 85

【０２３４】配列番号：６４配列の長さ：１８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： TACCTTTTCC AGGGACGG 18

【０２３５】配列番号：６５配列の長さ：１８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： TACGTGTACC AGTTACGG 18

【０２３６】配列番号：６６配列の長さ：１８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： TACGTGTACC AGGGACGG 18

【０２３７】配列番号：６７配列の長さ：１８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： TACGTGCACC AGTTACGG 18

【０２３８】配列番号：６８配列の長さ：１８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： CGGGAGGAGT TCGCGCGC 18

【０２３９】配列番号：６９配列の長さ：１８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： CGGGAGGAGT TCGTGCGC 18

【０２４０】配列番号：７０配列の長さ：１８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： CGGGAGGAGC TCGTGCGC 18

【０２４１】配列番号：７１配列の長さ：１８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： CGGCAGGAGT ACGCGCGC 18

【０２４２】配列番号：７２配列の長さ：１８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： CGGGAGGAGT ACGCGCGC 18

【０２４３】配列番号：７３配列の長さ：１８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： CGGGAGGAAT TCGTGCGC 18

【０２４４】配列番号：７４配列の長さ：１８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： CCTGCTGCGG AGTACTGG 18

【０２４５】配列番号：７５配列の長さ：１８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： CCTGATGAGG AGTACTGG 18

【０２４６】配列番号：７６配列の長さ：１８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： CCTGAGGCGG AGTACTGG 18

【０２４７】配列番号：７７配列の長さ：１８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： CCTGATGAGG ACTACTGG 18

【０２４８】配列番号：７８配列の長さ：１８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： GACATCCTGG AGGAGAAG 18

【０２４９】配列番号：７９配列の長さ：１８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： GACATCCTGG AGGAGGAG 18

【０２５０】配列番号：８０配列の長さ：１８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： GACCTCCTGG AGGAGAAG 18

【０２５１】配列番号：８１配列の長さ：１８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： GACCTCCTGG AGGAGGAG 18

【０２５２】配列番号：８２配列の長さ：１８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： GACCTCCTGG AGGAGAGG 18

【０２５３】配列番号：８３配列の長さ：１８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： GACAGGATGT GCAGACAC 18

【０２５４】配列番号：８４配列の長さ：１８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： GACAGGGTAT GCAGACAC 18

【０２５５】配列番号：８５配列の長さ：１８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： CTGGGCGGGC CCATGACC 18

【０２５６】配列番号：８６配列の長さ：１８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： CTGGACGAGG CCGTGACC 18

【０２５７】配列番号：８７配列の長さ：１８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： CTGGTCGGGC CCATGACC 18

【０２５８】配列番号：８８配列の長さ：１９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： TGTCTGCACA TCCTGTCCG 19

【０２５９】配列番号：８９配列の長さ：１９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： TGTCTGCATA CCCTGTCCG 19

【０２６０】配列番号：９０配列の長さ：１９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： CGGACAGGAT ATGCAGACA 19

【０２６１】配列番号：９１配列の長さ：２８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： GGGATCCGAG AGTGGCGCCT CCGCTCAT 28

【０２６２】配列番号：９２配列の長さ：１７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： CCTGATGAGG TGTACTG 17

【０２６３】配列番号：９３配列の長さ：１７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： AGATGAGATG TTCTATG 17

【０２６４】配列番号：９４配列の長さ：１７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： GTTTGGCCAA GCCTTTT 17

【０２６５】配列番号：９５配列の長さ：１７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： AGATGAGCAG TTCTATG 17

【０２６６】配列番号：９６配列の長さ：１７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： GTTTGGCCGA GCCTTTT 17

【０２６７】配列番号：９７配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： CAGGGATCCG CAGAGAATTA C 21

【０２６８】配列番号：９８配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： GTCCTGCAGT CACTCACCTC GGCG 24

【０２６９】配列番号：９９配列の長さ：１９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： GAATTACCTT TTCCAGGGA 19

【０２７０】配列番号：１００配列の長さ：１９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： ATTACGTGTA CCAGTTACG 19

【０２７１】配列番号：１０１配列の長さ：１９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： CGTCCCTGGT ACACGTAAT 19

【０２７２】配列番号：１０２配列の長さ：１７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： CCTGCTGCGG AGTACTG 17

【０２７３】配列番号：１０３配列の長さ：１７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： CAGTACTCCT CATCAGG 17

【０２７４】配列番号：１０４配列の長さ：１７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： CAGTACTCCG CCTCAGG 17

【０２７５】配列番号：１０５配列の長さ：１７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： CCTGATGAGG ACTACTG 17

【０２７６】配列番号：１０６配列の長さ：１９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： GACATCCTGG AGGAGAAGC 19

【０２７７】配列番号：１０７配列の長さ：１９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： GCTCCTCCTC CAGGATGTC 19

【０２７８】配列番号：１０８配列の長さ：１９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： GACCTCCTGG AGGAGAAGC 19

【０２７９】配列番号：１０９配列の長さ：１９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： GCTCCTCCTC CAGGAGGTC 19

【０２８０】配列番号：１１０配列の長さ：１９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： ATTACGTGCA CCAGTTACG 19

【０２８１】配列番号：１１１配列の長さ：１９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： CGTAACTGGT ACACGTAAT 19

【０２８２】配列番号：１１２配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： CTGCAGGGTC ATGGGCCCCC G 21

【０２８３】配列番号：１１３配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： CTGCAGGGTC ACGGCCTCGT C 21

【０２８４】配列番号：１１４配列の長さ：１７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： ATTACGTGTA CCAGTTA 17

【０２８５】配列番号：１１５配列の長さ：１７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： CCTGAGGCGG AGTACTG 17

【０２８６】配列番号：１１６配列の長さ：１８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： GACCTCCTGG AGGAGGAG 18

【０２８７】配列番号：１１７配列の長さ：１８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： GACCTCCTGG AGGAGAGG 18

【０２８８】配列番号：１１８配列の長さ：１８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： CTGGTCGGGC CCATGACC 18

【０２８９】配列番号：１１９配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： GAATTACCTT TTCCAGGGAC 20

【０２９０】配列番号：１２０配列の長さ：１７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： TTACGTGTAC CTGGGAC 17

【０２９１】配列番号：１２１配列の長さ：１８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： ACATCCTGGA GGAGAAGC 18

【０２９２】配列番号：１２２配列の長さ：１８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： ACATCCTGGA GGAGGAGC 18

【０２９３】配列番号：１２３配列の長さ：１８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： ACCTCCTGGA GGAGAAGC 18

【０２９４】配列番号：１２４配列の長さ：１７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： CCTGATGAGG AGTACTG 17

【０２９５】配列番号：１２５配列の長さ：１５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： CTGGGCGGGC CCATG 15

【０２９６】配列番号：１２６配列の長さ：１５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： CTGGACGAGG CCGTG 15

【０２９７】配列番号：１２７配列の長さ：１９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： GACCTCCTGG AGGAGGAGC 19

【０２９８】配列番号：１２８配列の長さ：１９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： GACCTCCTGG AGGAGAGGC 19

【０２９９】配列番号：１２９配列の長さ：１９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： AGCTGGGCGG GCCCATGAC 19

【０３００】配列番号：１３０配列の長さ：１９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： AGCTGGACGA GGCCGTGAC 19

【０３０１】配列番号：１３１配列の長さ：１９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： CCAGTACTCC TCATCAGGC 19

【０３０２】配列番号：１３２配列の長さ：１８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： ATTACGTGCA CCAGTTAC 18

【０３０３】配列番号：１３３配列の長さ：１７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： ATTACGTGCA CCAGTTA 17

【０３０４】配列番号：１３４配列の長さ：１６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： CAGTACTCCT CATCAG 16

【０３０５】配列番号：１３５配列の長さ：１６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： CAGATGAGGA CTACTG 16

【０３０６】配列番号：１３６配列の長さ：１７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： CGCTTCGACA GCGACGT 17

【０３０７】配列番号：１３７配列の長さ：２２配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： CCGTCCCTGG AAAAGGTAAT TC 22

【０３０８】配列番号：１３８配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： GACCTCCTGN GAGGAGAGGC 20

【０３０９】配列番号：１３９配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： GACCTCCTGG AGNGAGGAGC 20

【０３１０】配列番号：１４０配列の長さ：２７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： CGCGGATCCT GTGTCAACTT ATGCCGC 27

【０３１１】配列番号：１４１配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： CTGGCTGCAG TGTGGTTGGA ACGC 24

【０３１２】配列番号：１４２配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： ACACAGGAAA CAGCTATGAC CATG 24

【０３１３】配列番号：１４３配列の長さ：２２配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： CCAGGGTTTT CCCAGTCACG AC 22

【０３１４】配列番号：１４４配列の長さ：２８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： GCTGCAGGAG AGTGGCGCCT CCGCTCAT 28

【０３１５】配列番号：１４５配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： CGGATCCGGC CCAAAGCCCT CACTC 25

【０３１６】配列番号：１４６配列の長さ：２７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： GCGGCATAAG TTGACACATG GTCCGCT 27

【０３１７】配列番号：１４７配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： GCGTTCCAAC CACACTCAGG CCAC 24

【０３１８】配列番号：１４８配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： GTAATTCTCT GCGGGGAGGG G 21

【０３１９】配列番号：１４９配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： CGCCGAGGTG AGTGAGGGCT TTGG 24

【０３２０】配列番号：１５０配列の長さ：１８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： GACAGGATAT GCAGACAC 18

【０３２１】配列番号：１５１配列の長さ：１６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： AGGAGTTCGC GCGCTT 16

【０３２２】配列番号：１５２配列の長さ：１６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： AGGAGTTCGT GCGCTT 16

【０３２３】配列番号：１５３配列の長さ：１７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： AGGAGCTCGT GCGCTTC 17

【０３２４】配列番号：１５４配列の長さ：１７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： CCGGCAGGAG TACGCGC 17

【０３２５】配列番号：１５５配列の長さ：１６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： GAGGAGTACG CGCGCT 16

【０３２６】配列番号：１５６配列の長さ：１７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： CGAGCTGGGC GGGCCCA 17

【０３２７】配列番号：１５７配列の長さ：１７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列： CGAGCTGGTC GGGCCCA 17

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者テオドリカエル．ブガワンアメリカ合衆国，カリフォルニア 94579, サンリーンドロ，ファリスストリート 15524 (72)発明者ヘンリーエー．アーリッヒアメリカ合衆国，カリフォルニア 94602, オークランド，ローダアベニュ 3936

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】 HLA-DP遺伝子型を決定しようとする個体
から得られた核酸含有試料から個体のHLA DP遺伝子型を
決定する方法であって、 (a) 次のプライマー：【表１】から成る群から選ばれたプライマーを使って、ポリメラ
ーゼ連鎖反応を実施するのに適当な条件下で前記試料中
の核酸の標的領域を増幅せしめ、ここで前記標的領域は
HLA DP遺伝子の多形性領域（可変セグメント）を含み； (b) 両者が正確に相補的である場合にのみ配列特異的オ
リゴヌクレオチド(SSO) プローブが前記増幅された核酸
と結合して安定なハイブリッド二本鎖を形成するような
条件下で、前記増幅された核酸を SSOプローブのパネル
と混合し、ここで各プローブはHLA DP遺伝子の可変セグ
メントの変異体配列に相補的であり；そして (c) 前記増幅された核酸と前記SSO プローブとの間で形
成されたハイブリッドを検出する；ことを含んで成る方
法。
【請求項２】前記パネルのプローブが、【表２】【表３】から成る群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】前記パネルのプローブが、【表４】から成る群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】前記個体のHLA DP遺伝子型が、DPB21, D
PB22, DPB23, DPB24, DPB25, DPB26, DPB27, DPB28, DP
B29 およびDPB30 から成る群から選ばれた対立遺伝子を
含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項５】自己免疫疾患への個体のかかりやすさを
決定する方法であって、請求項１に記載の方法に従って
個体のHLA DP遺伝子型を決定し、そして前記個体の遺伝
子型が自己免疫疾患に関連する遺伝子型であるかどうか
を決定することを含んで成る方法。
【請求項６】前記自己免疫疾患が少数関節性幼若性慢
性関節リウマチであり、そして自己免疫疾患に関連する
遺伝子型がDPB2.1対立遺伝子を含んで成る、請求項５に
記載の方法。
【請求項７】前記自己免疫疾患がIDDMである、請求項
６に記載の方法。
【請求項８】前記自己免疫疾患がCDであり、そして自
己免疫疾患に関連する遺伝子型がDPB13, DPB1, DPB3 お
よびDPB4.2から成る群から選ばれた対立遺伝子を含んで
成る、請求項６に記載の方法。
【請求項９】ゲノム核酸を含有する試料の起源に関す
る法医学的証拠を提供する方法であって、請求項１に記
載の方法に従って前記試料のHLA DP遺伝子型および容疑
者のHLA DP遺伝子型を決定し、前記容疑者と前記試料の
HLA DP遺伝子型を比較し、そして前記試料が前記容疑者
から派生し得たのかどうかを推測することを含んで成る
方法。
【請求項１０】前記プローブのパネルが、ハイブリダ
イズ領域を有するプローブ：【表５】を含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】前記プローブのパネルが、ハイブリダ
イズ領域を有するプローブ：配列番号92（5' CCTGATGAG
GTGTACTG）を更に含んで成る、請求項１０に記載の方
法。
【請求項１２】使用するプローブが UG19 配列番号 144 (GCTGCAGGAGAGTGGCGCCTCCGCTCAT)
および UG21 配列番号 145 (CGGATCCGGCCCAAAGCCCTCACTC) である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】次の群：【表６】から選ばれたオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項１４】次のプライマー：【表７】から成る群から選ばれたプライマー。
【請求項１５】診断用具としての請求項１３に記載の
オリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項１６】診断用具としての請求項１４に記載の
プライマー。
【請求項１７】 SSO プローブのパネルであって、前記
プローブのパネルが次の群：【表８】から選ばれる、SSO プローブのパネル。
【請求項１８】個体のHLA DP遺伝子型を決定するため
に使われる請求項１３に記載のオリゴヌクレオチドプロ
ーブ、請求項１４に記載のプライマーまたは請求項１７
に記載のSSO プローブのパネル。
【請求項１９】個体のHLA DP遺伝子型を決定するため
に使われ、ここで前記個体のHLA DP遺伝子型がDPB21, D
PB22, DPB23, DPB24, DPB25, DPB26, DPB27,DPB28, DPB
29およびDPB30 から成る群から選ばれた対立遺伝子を含
んで成る、請求項１３に記載のオリゴヌクレオチドプロ
ーブ、請求項１４に記載のプライマーまたは請求項１７
に記載のSSO プローブのパネル。
【請求項２０】個体のHLA DP遺伝子型を決定するのに
有用なキットであって、 (a) SSO プローブのパネルであって、次の群：【表９】から成る群から選ばれるSSO プローブのパネル；並びに (b) キット成分を利用することにより遺伝子型を決定す
るための使用説明書を含んで成るキット。
【請求項２１】前記個体のHLA DP遺伝子型がDPB21, D
PB22, DPB23, DPB24, DPB25, DPB26, DPB27,DPB28, DPB
29およびDPB30 から成る群から選ばれた対立遺伝子を含
んで成る、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】 HLA DP遺伝子の標的領域の増幅に有用
なオリゴヌクレオチドプライマーを含む容器を更に含ん
で成り、前記標的領域が前記可変セグメントを含有す
る、請求項２０に記載のキット。