CN1854308A - 碱基序列检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供价格便宜、重复性好、并且简便的碱基序列检测方法，尤其是能在1个反应槽中检测多个变异位点。在含有核酸样品的反应槽中，添加与碱基AGTC相对应的4种ddNTP或其衍生物中的至少一种进行互补链的合成，使靶位点延伸一个碱基，以由所得的焦磷酸生成的ATP作为反应底物进行化学发光反应，利用上述化学发光判断是否有互补链合成，确定上述靶位点的碱基序列。

Description

碱基序列检测方法

技术领域

本发明涉及碱基序列检测方法，更详细地说，涉及SNPs(single nucleotidepolymorphisms)、甲基化胞嘧啶等对单碱基的变异和变化的检测方法、以及利用此方法的基因的诊断方法。

背景技术

人类基因组的解析已经结束，基因组信息在各个领域得到应用的时代已经来临。人的个体性和对药品的敏感性在基因水平上的阐明正不断推进，其结果将被应用于诊断和治疗之中。这其中尤其是基因组序列中的单核苷酸多态(SNPs)被认为起着重要的作用。SNPs的数据库的构建正在进行，并开始应用于各种诊断。

对于SNPs的解析提出了以下多种方法：DNA序列确定方法，在变异部分插入与该变异对应的荧光标记核酸后、用凝胶电泳进行检测的方法，根据变异部分的有无使用具有活性作用的荧光探针的方法，或如DNA芯片等那样区分探针是否和靶点稳定杂交的方法，以及利用阶段性互补链合成来确定序列的方法等。这些方法中很多是为制作SNPs数据库而开发的技术，装置往往庞大且造价高。因此希望使用简便、运行成本低廉的SNPs的检测方法。

DNA碱基序列的检测方法大致可以分为利用荧光的方法和利用化学发光的方法等两种方法。在使用荧光的方法中，由于光源是必需的，因而通常装置庞大。另一方面，在使用化学发光的方法中，以往主要是采用荧光素酶反应对ATP进行检测和对细菌进行检测(检测ATP)，但最近使用的是焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)，该技术利用化学发光来确定DNA碱基序列。

在焦磷酸测序技术中，将DNA互补链合成时生成的焦磷酸变成ATP，进行以该ATP为底物的荧光素·荧光素酶反应，通过检测产生的光来确定序列。即，按照顺序向反应槽中注入核酸底物，进行DNA互补链的合成反应。如果观察到光，说明互补链合成反应已经进行，则从注入的核酸底物可以确定被插入位点的碱基。反应后，剩余的底物迅速进行酶分解，使得在注入下一个核酸底物时在反应槽中几乎不存在。由于发光量与互补链合成的量成比例，同时插入2个底物时能观察到2倍的发光。

但是，人基因组DNA是来源于母亲和父亲的2个等位基因进行配对，DNA样品有杂合样品和纯合样品，其中杂合样品具有针对特定位点的序列的2种不同的等位基因，而纯合样品具有相同的等位基因。焦磷酸测序技术的情况下，杂合样品中得到的信号强度是纯合样品的一半，对于不同样品，这种一半的信号强度有时会持续一会。但是，这种情况在正确了解以SNPs为首的序列信息方面存在困难。

另外，在DNA互补链合成时，通常使用4种碱基dATP、dCTP、dGTP、dTTP进行互补链的合成，但由于发光底物dATP与ATP的结构相似，也可作为荧光素酶反应的反应底物。即，为进行互补链的合成而加入dATP时，会引发荧光素酶反应，即使不引起DNA互补链的合成，也能观察到发光。与此相反，国际专利申请98/13523号(特表2001-501092号公报)公开了使用不会成为发光底物的dATP类似物dATPαS和ddATP类似物进行互补链合成的方法，但由于dATPαS价格高而存在运行成本高的问题。

而且，在使用ATP的荧光素酶反应中，发光的同时会生成焦磷酸作为反应产物，但焦磷酸再次转换成ATP作为发光反应的底物。即，发光能一直持续。与此相反，国际专利申请98/28440号(特表2001-506864号公报)公开了为了在每次加入核酸底物时发光(信号)，使分解酶三磷酸腺苷双磷酸酶共存于反应液中，从而迅速分解加入的dNTP和ATP。但是，由于三磷酸腺苷双磷酸酶的用量大时，会妨碍反应的进行，而用量小时，会发生由残存的dNTP引起的反应，因而存在使用困难、价格高的问题。

此外，Science 1987，238，336-341报道了向反应槽中一起加入4种荧光标记终止剂，通过单核苷酸互补链的延伸检测DNA变异的方法。但是，在此反应中，互补链延伸后，由于要分离插入的荧光标记终止剂产生的荧光和剩余终止剂产生的荧光后进行检测，所以必须利用凝胶电泳分离生成物再进行检测。另外，Nucleic Acids Research，2000，Vol.28，Nol.12报道了4种终止剂同时加入反应槽中，进行单核苷酸延伸反应，再使用质量分析仪分析生成物的方法，但是，由于需要价格昂贵的装置，因而缺乏广泛应用性。

发明内容

本发明的课题在于解决以往技术中的问题，提供廉价而且重复性好、简便的碱基序列检测方法，尤其是能在一个反应槽中检测多个单核苷酸变异的碱基序列检测方法。

为克服上述课题，本发明提供以化学发光检测方法为基础的、廉价、重复性好、简便的碱基序列检测方法。在以往的焦磷酸测序技术中，为了不影响后面的反应，用三磷酸腺苷双磷酸酶分解加入的核酸底物，为降低背景发光，又必须使用dATPαS等高价样品。在本发明的方法中，互补链合成反应以单个碱基终止，通过使用不能进行1个碱基以上的互补链延伸的拟核酸碱基(ddNTP)，解决了这些问题。

即，使用无3’末端延伸能力的4种ddNTP作为互补链合成试剂，阶段性进行互补链合成反应，再利用化学发光确定靶位点的碱基序列。在本发明的方法中，由于插入的核酸碱基无延伸能力，所以不必加入三磷酸腺苷双磷酸酶等分解酶。以往认为ddATP与dATP产生同样背景发光，因而一直回避使用ddATP。但是，发明人已证实，ddATP与dATP不同，其作为荧光素酶反应的底物的活性低，因此不必使用价格高的dATPαS。而且，本发明中通过向试剂中加入微量PPase，降低背景化学发光，也能高灵敏度地进行碱基序列的检测。另外，通过使用多个引物，能在1个反应槽中检测多个变异位点。

如果利用本发明，能利用化学发光简便装置检测特定位点的碱基序列和变异的有无。本发明中使用的核酸底物(ddNTP)没有3’末端延伸能力，在插入到DNA链后，不能进行后面的互补链的合成，因而不必使用三磷酸腺苷双磷酸酶等高价分解酶分解所加入的核酸底物。另外，由于ddNTP不会成为荧光素酶反应的底物，因而也不必使用dATPαS等高价试剂。在本发明的方法中使用的试剂(ddNTP和Ppase等)都是廉价的，又由于能在1个反应槽中同时检测多个变异位点，所以与以往的检查方法比较，成本和时间都得以降低。

附图说明

图1是表示对利用本发明的方法和焦磷酸测序技术法的阶段反应的比较。

图2是表示本发明方法(实施例1)中的反应式。

图3是比较利用本发明得到的发光类型和焦磷酸测序技术中得到的发光类型。

图4是比较以dATP、dATPαS、ddATP以及ddATPαS作为底物时的荧光素酶反应引起的发光强度的曲线图。

图5是表示在本发明的方法中使用酶PPDK、并以AMP作为底物合成ATP的反应式。

图6是表示3个SNPs的组合和观察到的发光类型。

图7是表示在3个SNPs的检测中的发光类型的曲线图。

图8是表示按顺序注入3种引物检测多个SNPs的例子中的发光类型的曲线图。

图9是表示实施例2中除去三磷酸腺苷双磷酸酶进行检测的情况下(添加PPase 40mU/mL)得到的发光类型。

其中，

101：引物

102：来自父亲的等位基因的一侧DNA链

103：来自母亲的等位基因的一侧DNA链

1021：多态位点的碱基(A)

1031：多态位点的碱基(B)

301：添加ddCTP引起的发光强度的增加

302：添加ddTTP引起的发光强度的增加

303：添加dCTP引起的发光强度的增加

304：添加dTTP引起的发光强度的增加

305-308：向反应槽中加入三磷酸腺苷双磷酸酶时的发光强度的变化

401：ATP引起的发光

402：dATP引起的发光

403：dATPαS引起的发光

404：ddATP引起的发光

405：ddATPαS引起的发光

701：加入ddATP时的发光强度(其他的3倍的强度)

702：加入ddCTP时的发光强度

703：加入ddGTP时的发光强度

704：加入ddCTP时的发光强度

801：用引物-2测定时加入ddATP时的发光

802：用引物-2测定时加入ddGTP时的发光

803，804：用引物-3测定时加入ddATP和ddGTP时的发光

具体实施方式

本发明的方法是碱基序列检测方法，该方法包括以下工序：向有核酸样品的反应槽中加入ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP等4种ddNTP或其衍生物中任一种进行互补链合成，使靶位点延伸一个碱基的工序；使所得的焦磷酸生成ATP，并以此为反应底物进行化学发光反应的工序；以及利用所述化学发光判断互补链合成的有无，确定所述靶位点的碱基序列的工序。

4种ddNTP或其衍生物按顺序每次一种加入反应槽中，通过只有注入与检测对象位点互补的核酸碱基才产生的发光，能够确定靶位点的碱基种类。ddNTP和其衍生物本身就是互补链合成的底物，但是由于其没有3’末端延伸能力，因而所述互补链的合成只限于1个碱基的延伸，所得化学发光通常是一个碱基所对应的发光强度。另外，作为ddNTP的衍生物，例如，可以举出ddATPαS等ddNTPαS。

以ATP作为反应底物的化学发光反应，可以采用荧光素·荧光素酶体系的酶发光反应。焦磷酸转变成ATP可以利用以往的APS和ATP硫酸化酶反应体系，然而，如果使用不会成为荧光素反应的底物的AMP和丙酮酸磷酸二激酶反应体系，能避免背景发光的问题。

通过预先使分解焦磷酸和/或ATP的酶共存于反应槽中，可以使荧光素酶反应中生成的焦磷酸和ATP马上分解，因而，收集一定时间内(1分钟)的发光，可以得到明显的峰。作为分解焦磷酸和/或ATP的酶，可以使用焦磷酸酶和三磷酸腺苷双磷酸酶，但优选廉价且活性高的焦磷酸酶。

本发明的方法能用于检测包含单碱基取代(SNPs)、癌变所伴随的碱基变异和甲基化(甲基化胞嘧啶等)、人为的碱基取代等在内的所有单碱基的变异和变化。可检测的位点不只限于1个，只要满足后述的一定条件，就能在1个反应槽中简便地检测2个或2个以上的靶位点。

检测多个靶位点的情况下，准备与各位点对应的引物，使用其中2或3种引物，同时进行利用上述4种ddNTP及其衍生物的互补链合成和化学发光反应，由所得结果确定与上述2或3种引物对应的靶位点的碱基序列。或者，利用1种引物，进行利用上述4种ddNTP或其衍生物的互补链合成和化学发光反应，确定对应靶位点的碱基序列后，再分解或除去添加到反应槽中的ddNTP及其衍生物，也可以按顺序利用接下来的引物确定靶位点。另外，也可以反复进行同时向反应槽中添加2种或2种以上引物同时检测2个或2个以上靶位点的工序。作为分解除去ddNTP的方法，可以举出上述酶解、和将核酸样品固定在固相上后用反应液冲洗的方法。

本发明也提供用于上述碱基序列检测方法的试剂盒。该试剂盒中含有：1)对应于碱基AGTC的4种ddNTP或其衍生物

2)DNA聚合酶

3)荧光素和荧光素酶

4)AMP和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)以及丙酮酸磷酸二激酶、和/或APS和ATP硫酸化酶。

根据需要，试剂盒中还可进一步添加分解焦磷酸和/或ATP的酶。

下面利用实施例更详细地说明本发明，但本发明并不限定于这些实施例。

实施例1

图1是比较利用本发明的方法的阶段反应与焦磷酸测序技术的阶段反应。个体的基因，是来源于父亲和来源于母亲的2个等位基因配对而成。本实施例中，以杂合样品为例进行说明，该杂合样品在某多态位点具有各一条A/G差异的2个等位基因。

图1的102和103分别表示多态A(1021)和多态G(1031)2个等位基因的一侧DNA链。使用通用的引物101，利用本发明的方法检测单核苷酸多态的情形以A表示，利用以往的焦磷酸测序技术进行检测的情形用B表示。发生互补链合成反应的情况下的发光强度与互补链合成时插入的碱基数成比例。下面为了方便，将单碱基所对应的发光强度作为“强度单位1(或1个单位)”进行说明。在本发明的方法中，由于使用ddNTP作为底物，因而延伸的碱基数常常为1，所得的发光强度为强度单位1。另一方面，在焦磷酸测序技术中，由于使用dNTP作为底物，因而合成的碱基的长度会因检测对象多态位点的相邻碱基的种类和状态而有所不同，会得到发光强度为1个单位、2个单位或3个或3个以上单位等各种值。

检测的方案如下所述。首先扩增作为检测对象的DNA，使之变成单链后加入到反应槽中。使设计的引物与该单链DNA杂交，所述引物与作为检测对象的核酸碱基之前的一个碱基呈3’末端对应关系。即，设定为由引物引发的互补链合成，使得核酸底物插入到检测对象位点。在本实施例中应该被插入到检测对象位点的碱基种类是T或C。通过加样器(dispenser)按顺序将4种核酸底物即拟核酸碱基(终止剂)或核酸碱基注入到反应槽中。注入的核酸底物的种类和顺序，在本发明的方法的情况下是ddATP→ddCTP→ddGTP→ddTTP，在焦磷酸测序技术的情况下是dATPαS→dCTP→dGTP→dTTP。注入的核酸碱基种类与检测对象位点的碱基互补的情况下，互补链合成反应继续，注入的核酸碱基结合到引物的3’末端。在本实施例中，焦磷酸测序技术中，因为需要而预先在反应液中加入了三磷酸腺苷双磷酸酶，因而注入的核酸底物在1分钟内分解，但如后所述，该三磷酸腺苷双磷酸酶产生的分解作用在本发明的方法中不一定需要。

最初注入的ddATP或dATPαS由于与检测对象多态位点的碱基不互补，因而互补链合成反应不发生。接下来如果注入ddCTP或dCTP，只在多态位点是G的等位基因的DNA链103处发生互补链合成反应，在本发明的方法和焦磷酸测序技术中都观测到强度单位1的发光。同样，接下来的ddGTP或dGTP由于与检测对象多态位点的碱基不互补，不引起互补链合成反应，观察不到发光。接下来的ddTTP或dTTP的注入，在多态位点是A的等位基因的DNA链102处发生互补链合成反应，从而在本发明的方法中观察到强度单位为1的发光。另一方面，在焦磷酸测序技术中，DNA链102的多态位点和其邻位各插入了1个dTTP，同时另一个等位基因在DNA链103也插入了1个dTTP，合计观察到3个碱基对应的发光(强度单位为3)。图2表示本发明方法中的一系列的反应式。另外，图3示意性表示在本发明的方法(A)和焦磷酸测序技术(B)中观察到的发光(信号强度)。

在本发明的方法中，由于只在变异位点插入与其数目相对应的核酸碱基，因而，对于纯合基因型的被检验者的DNA样品，在一处观察到2个单位的发光；对于杂合型DNA样品，则在二处观察到1个单位的发光。另一方面，在焦磷酸测序技术中，由于互补链合成持续发生，发光强度的表现方式变得复杂。

表1表示的是在本实施例中使用的反应液组成。在反应液中含有DNA聚合酶、ATP生成反应中使用的ATP硫酸化酶、APS、发光反应中使用的荧光素酶、荧光素。而且，在焦磷酸测序技术中由于有必要分解注入的核酸底物，所以反应液中添加有分解酶三磷酸腺苷双磷酸酶。如后所述，由于试剂中常常含有杂质焦磷酸等，所以在本发明的方法中，在加入有拟核酸碱基的试剂中预先了加入微量的焦磷酸酶(PPase)。

表1

             反应液组成

试剂	浓度
		三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)(pH7.8)	60mM
EDTA	2mM
		MgAc	20mM
DTT	0.2mM
		ATP硫酸化酶	0.2U/mL
荧光素酶	50.0GLU/mL
		测序酶(Sequenase)2.0*	65U/mL
三磷酸腺苷双磷酸酶	1U/mL
		荧光素	0.4mM
APS	5μM
		BSA	0.1％

^*Amersham Bioscience公司生产的循环测序用耐热性DNA聚合酶。

若加入与模板DNA互补的核酸底物，则进行互补链的合成，能观察到发光，但互补链的合成进行时，会产生副产物焦磷酸。焦磷酸在APS和ATP硫酸化酶的存在下，生成ATP，但APS本身也能成为荧光素酶反应的底物引起发光反应。在焦磷酸测序技术中为了进行任意阶段的互补链延伸反应，有必要预先加入足够的APS，致使背景发光变大。但是，本发明的方法中，由于不需要存在与焦磷酸测序技术同样大量的APS，所以实质上观察不到APS引起的背景发光。

ATP在荧光素酶的存在下，与荧光素反应发光，释放出焦磷酸。由于焦磷酸再次与APS反应生成ATP，发光反应持续到荧光素消耗殆尽或APS用尽。但是，加入了三磷酸腺苷双磷酸酶的情况下，由于三磷酸腺苷双磷酸酶也分解ATP，所以发光在1分钟左右的较短时间停止。图4表示这样在三磷酸腺苷双磷酸酶存在下观察到的发光(信号强度)。在本实施例中，由于PPase的量少，因而如果发生互补链合成，信号强度急剧升高，随着焦磷酸的缓慢分解，信号强度慢慢减弱(401)。接下来，注入下一个拟核酸碱基，此碱基被插入而引起互补链的合成时，由于信号强度再次急剧增加，因而能容易地检测出。

如上所述，反应中使用的各种试剂中往往含有杂质焦磷酸(PPi)。焦磷酸在混合反应试剂时被转变成ATP，引起发光反应，成为背景发光的原因。因而，在本实施例中，使微量的Ppase共存于加入有拟核酸碱基的试剂中，从而分解了作为杂质的焦磷酸。PPase的加入量如果多，则由于在ATP→PPi→ATP循环反应中焦磷酸减少，发光反应会在短时间内停止。互补链合成时生成的焦磷酸转变成ATP的过程也受到影响，发光(信号强度)也变小，但不妨碍测定。

另外，也可以使用三磷酸腺苷双磷酸酶代替上述PPase。由于三磷酸腺苷双磷酸酶分解ATP、dNTP、ddNTP等，因而如前所述，在分解ATP并在短时间内收集发光的同时分解加入的拟核酸碱基(ddNTP)。但是，由于PPase的价格是三磷酸腺苷双磷酸酶的一半左右，而且必需的使用量是三磷酸腺苷双磷酸酶的1/10左右，所以使用PPase能使成本降低。

本实施例中，拟核酸碱基使用终止剂ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP。图4表示分别以dATP、dATPαS、ddATP以及ddATPαS作为底物时的荧光素酶反应引起的发光强度(401：ATP、402：dATP、403：dATPαS、404：ddATP、405：ddATPαS)。dATP作为荧光素酶反应的反应底物比dATPαS的活性高300倍左右，而ddATP只显示了与dATPαS大致相同的低活性。由于ddATP的价格约是dATPαS的一半，而且反应必需的量是dATPαS的1/10左右，所以使用ddATP的本发明的方法与以往的方法比较，使检测成本降低。

在本发明的方法中，由于只在核酸碱基插入到引物的3’末端时，能观察到1个单位的发光，所以所得数据(发光类型)简单而且明了。通过只有注入与检测对象位点互补的核酸碱基种类时产生的发光，能够简单地判别靶SNPs。如上，如果利用本发明的方法，使用廉价的试剂ddATP和PPase能简便地检测单核苷酸多态(SNPs)。

实施例2

在实施例1中，在焦磷酸转变成ATP的反应中使用了ATP硫酸化酶，由焦磷酸和APS生成ATP。如上所述，APS作为荧光素酶发光底物的活性低，但是如果大量共存于反应槽中，由此引起的发光将不能忽视，往往使检测灵敏度下降。所以，在本实施例中，使用不会成为荧光素酶反应的底物的AMP作为焦磷酸的反应底物，并使用丙酮酸磷酸二激酶(Pyruvate Phosphate Dikinase：PPDK)进行反应，针对该体系进行说明。图5表示本实施例的反应概况。本实施例的方法除ATP生成反应以外，几乎与实施例1相同，但是，由于设定了所使用的酶PPDK的适用条件，因而所用试剂和反应条件有所不同。表2表示本实施例中使用的反应液的组成。

表2

            反应液组成

试剂	浓度
		三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)(pH7.8)	60mM
EDTA	2mM
		MgAc	20mM
DTT	0.2mM

接下页

表2，接上页

PPDK	10.0U/mL
		荧光素酶	200.0GLU/mL
测序酶(Sequenase)2.0*	65U/mL
		三磷酸腺苷双磷酸酶	1U/mL
荧光素	0.4mM
		PEP3Na	0.04mM
AMP	0.2mM
		BSA	0.1％

^*Amersham Bioscience公司生产的循环测序用耐热性DNA聚合酶。

在使用PPDK的反应体系中由于背景发光小，增加荧光素酶的量，能使发光量增加数倍。所以即使微量的样品也能灵敏地测定。

检测的方案如下所述。按顺序向反应槽中加入4种ddNTP，进行互补链合成反应。只有注入与检测对象位点的碱基互补的拟核酸碱基时，才进行互补链的合成，生成焦磷酸(PPi)。Ppi和AMP在PPDK的存在下反应生成ATP。ATP成为荧光素酶反应的底物，在发出荧光的同时，生成AMP和PPi。与实施例1相同，生成的PPi与AMP反应再次生成ATP。即使在本实施例中，由于利用PPase或三磷酸腺苷双磷酸酶分解PPi，因而发光强度缓慢降低。检测对象样品的基因型有纯合和杂合的两种情形。纯合的情况下，互补链合成所伴随的发光强度的急剧增加只观察到1次，但杂合的情况下，则观察到2次。通过观察这种发光强度的变化，能检测到作为靶的检测对象位点的变异。

图9是表2的试剂中除去三磷酸腺苷双磷酸酶的情况下的实施例。多态是A/G杂合的情形。已知道，只有注入与多态对应的碱基的情况下，发光强度才急剧增加。使4种ddNTP或其衍生物按顺序反应的情况下，纯合时能观察到1次发光强度的急剧增加，杂合时能观察到2次。在本实施例中由于不加入三磷酸腺苷双磷酸酶，而加入40mU/mL PPase，因而延伸时生成的PPi被PPase分解，发光强度缓慢减弱。其减少量比加入三磷酸腺苷双磷酸酶的情况下要缓慢。在本发明中，由于使用ddNTP和其衍生物，延伸碱基数总保持每次1个碱基，判断简便，如本实施例那样，不加入试剂三磷酸腺苷双磷酸酶也能判断碱基的不同。

实施例3

本发明的方法能在1个反应容器中检测多个单核苷酸多态(SNPs)。首先，作为第一个例子，对检测对象SNPs是3个的情形进行说明。

SNPs几乎都是由一般型(野生型)和其一个碱基被其他3种碱基中某一个特定取代而成的类型(变杂合)构成。即，可以说SNPs位点的变异通常有2种。因此，同时检测3个多态的情况下，应确定的碱基的个数一共为6个(2个×3种)。而且，由于自然界中可能存在的碱基有A、C、G、T 4种，对于3个SNPs，如果不同时测定组合完全相同的SNPs，则6个可采用的碱基的自由度一共为27。因此，完全确定3个SNPs的条件如下所示。

首先，为了使3个SNPs不成为完全相同的组合，有必要选择检测对象SNPs。另外，在3个SNPs的可采用碱基，即6个碱基中，有必要使4种碱基ACGT中的任一个都至少存在1个。例如，有必要如(A/G、A/G、T/C)那样，在3种SNPs中含有2个相同的「A/G」组合；如(A/G、A/C、G/C)那样，在3种SNPs中不完全含有4种碱基ACGT(此种情况下不含有「T」)。

关于检测对象SNPs的组合的这些限定条件，由于单纯通过与其对应的引物的组合就可设定，所以不失一般性。下面，以3种检测对象SNPs(SNP-1、SNP-2、SNP-3)分别是(A/C、A/G、C/T)的情形为例，对本发明中多个SNPs的检测方法进行具体说明。

首先，向检测对象DNA中加入3种引物，配制反应液。然后如在实施例1和2中说明的那样，按顺序加入4种ddNTP，观察发光强度。加入的碱基不被插入的情况下发光强度为零，1个检测对象位点被插入时发光强度为1。另外，加入的碱基与基因型为纯合的1个SNPs对应的情况下，或与基因型为杂合的2个SNPs对应的情况下，发光强度都为2。而且，加入ddATP以外的拟核酸碱基时，在对应的SNPs等位基因为纯合时，得到的发光强度为2，杂合时发光强度为1，但纯合时，如果具有碱基A的等位基因，则为零。这样，通过比较对应于加入的碱基的发光强度，能确定全部多态位点。

图6表示3种检测对象SNPs在各种组合时所观察到的发光情况。发光强度合计都是6个单位。这18种组合的发光类型完全不同，由所得的发光类型能唯一确定多态位点。图7是实际的测定例。这里使用了具有(A/C)、(A/G)、(C/T)3个SNPs的样品。在测定例中加入T、G和C时，发光强度为1个单位(702、703、704)，加入A时的发光强度为3个单位(701)，由此确定样品的基因型是(AA、AG、CT)。这相当于图6的案例13。

从图6可知，只要满足上述条件，利用本发明的方法对于任何SNPs都能唯一确定至3个。另外，对于检测对象SNPs存在于1条DNA链上的情形和存在于不同DNA链上的情形，也同样处理。

在本发明的方法中，ddNTP的注入是每次一种核酸碱基，加入的ddNTP即使有残留，也没有妨碍测定。因此没有必要加入试剂中预先含有的PPase以外的分解酶。为了观察到呈尖峰状的发光信号，在本实施例的反应液中加入了三磷酸腺苷双磷酸酶，但不加进行测定当然也可以。

实施例4

下面对多个SNPs的检测例子进行说明。检测多个SNPs的情形下，按顺序在反应槽中加入多个引物，再向其中按顺序加入4种拟核酸碱基进行测定(图8)。因此为了不使引物之间发生部分杂交而阻碍互补链合成反应，将反应温度升至接近40℃(优选32℃～40℃)，并且加入的引物量尽量少。优选各引物的量与检测对象DNA样品等摩尔。

反应槽中不加入引物的情况下，在加入ddNTP时，不产生发光(图8最上面的图)。在多个SNPs位点的检测中，为了不影响使用下一个引物的检测，必须除去注入的ddNTP。ddNTP的除去方法有，如上述利用PPase和三磷酸腺苷双磷酸酶等分解酶的分解法和用反应液冲洗的方法。

在使用第一个引物(primer-1)进行第一次测定中，只有加入ddATP时，才能观察到发光(信号)(801)。这表示对应于加入的引物的位点是基因型(AA)的纯合。在加入新的引物进行第二次测定时，由于当残留有以前使用的ddNTP时不好，因而向反应槽中加入三磷酸腺苷双磷酸酶进行分解。在进行利用接下来的引物的测定中，ddNTP只要是在加入相同碱基的循环结束前，被分解即可，因而加入的三磷酸腺苷双磷酸酶的量可以比焦磷酸测序技术少。

在使用第二个引物(primer-2)进行测定时，虽然能观察到ddATP的若干发光(信号)，但由其强度认为，是在第一次的测定中插入未反应的位点引起的(802)。在此测定中，添加ddGTP时观察到强发光(信号)。由此显示对应于第二个引物的位点是基因型(GC)的纯合。

在使用第三个引物(primer-3)进行测定中，注入ddATP和ddGTP时，得到几乎相同强度的发光(信号)(803)。由此显示对应于第三个引物的位点是基因型(AG)的杂合。

因此对于多个SNPs，通过按顺序加入不同的引物进行测定能分别确定SNPs的基因型。在本实施例中，按顺序每次加入1个引物，也可以3个一起加入。在此情况下，添加3～4个引物可以确定大于等于10处的SNPs。

产业上的可利用性

本发明的检测方法能有效地适用于特定位点的碱基序列的检测、尤其是对含有单核苷酸(SNPs)和甲基化的基因的变异的检测。

Claims (13)

1.一种碱基序列检测方法，其特征在于，具有在含有核酸样品的反应槽中添加与碱基AGTC相对应的4种ddNTP或其衍生物中的至少一种进行互补链的合成，使靶位点延伸一个碱基的工序；以由所得的焦磷酸生成的ATP作为反应底物进行化学发光反应的工序；和利用上述化学发光判断是否有互补链合成，确定上述靶位点的碱基序列的工序。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，按顺序每次向反应槽中加入一种上述4种ddNTP或其衍生物进行互补链的合成。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，使用丙酮酸磷酸二激酶和AMP由上述互补链合成中得到的焦磷酸生成ATP。

4.如权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述化学发光反应是荧光素酶引起的酶发光反应。

5.如权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，使分解焦磷酸和/或ATP的酶共存于上述反应槽中。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，利用所述的酶分解所述化学发光反应中生成的焦磷酸和/或ATP，在一定时间内收集发光。

7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述酶是焦磷酸酶和/或三磷酸腺苷双磷酸酶。

8.一种碱基序列的检测方法，其是使用权利要求1～7任一项所述的方法检测2个或2个以上靶位点的方法，其特征在于，准备与各种所述靶位点对应的引物，针对其中的2种或3种引物，同时进行利用上述4种ddNTP或其衍生物的互补链合成和化学发光反应，由其结果确定与上述2种或3种引物对应的靶位点的碱基序列。

9.一种碱基序列的检测方法，其是使用权利要求1～7任一项所述的方法检测2个或2个以上靶位点的方法，其特征在于，准备与各种所述靶位点对应的引物，针对一种引物，进行利用上述4种ddNTP或其衍生物的互补链合成和化学发光反应，确定对应的靶位点的碱基序列后，分解或除去反应槽中添加的ddNTP或其衍生物，然后按顺序利用接下来的引物确定靶位点。

10.一种碱基序列的检测方法，其是使用权利要求1～7任一项所述的方法检测2个或2个以上靶位点的方法，其特征在于，准备与各种所述靶位点对应的引物，同时向反应槽中添加2种或2种以上引物，进行利用上述4种ddNTP或其衍生物的互补链合成和化学发光反应，确定对应的靶位点的碱基序列后，分解或除去反应槽中添加的ddNTP或其衍生物，然后按顺序利用下一个或二个或二个以上引物确定靶位点。

11.如权利要求1～10任一项所述的方法，其特征在于，所述靶位点是单碱基发生了变异或变化的位点。

12.碱基序列检测用试剂盒，其包括下列1)～4)：

1)对应于碱基AGTC的4种ddNTP或其衍生物

2)DNA聚合酶

3)荧光素和荧光素酶

4)AMP和磷酸烯醇丙酮酸以及丙酮酸磷酸二激酶、和/或APS和ATP硫酸化酶。

13.如权利要求12所述的试剂盒，其进一步含有分解焦磷酸和/或ATP的酶。

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