JP2021518165A - 単一分子シーケンシングの方法 - Google Patents

Abstract

本明細書で提供されるのは、発光反応のための成分を含む、ポリメラーゼ酵素、テンプレート核酸、およびポリメラーゼ試薬溶液を利用して単一核酸分子をシーケンシングするための方法およびシステムである。【選択図】図１Ｂ

Description

本発明は、単一分子核酸シーケンシングのための方法に関する。

導入
現在のシーケンス技術は、２つの主なカテゴリである、ショートリードシーケンシングとロングリードシーケンシングに分類できる。各カテゴリでは、ＤＮＡは特定の数のヌクレオチドまたは塩基対（ｂｐ）までの長さの断片に切断される。全ての場合において、ＤＮＡの全ての断片が２次元アレイに広げられ、少なくとも１つのセンサーがＤＮＡの断片と一致する場所に対応するセンサーアレイによって検出される。

ショートリードシーケンシングアプローチは、ライゲーションによるシーケンシング（ＳＢＬ）と合成によるシーケンシング（ＳＢＳ）を含む単純なサイクルベースの技術である。ＳＢＬアプローチには、ＳＯＬＩＤ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）と完全ゲノミクス（ＢＧＩ）が含まれる。ＳＯＬＩＤによると、約７５塩基対（ｂｐ）のリード長に達するが、完全ゲノミクスアプローチによると、２８〜１００塩基対のリードが可能である。これらのアプローチでは、構造の変化とゲノムアセンブリは不可能であり、ホモポリマーエラーの影響を受けやすくなる。それらの実行時間は数日程度である。ＩｌｌｕｍｉｎａとＱｉａｇｅｎのＧｅｎｅＲｅａｄｅｒ技術は、サイクリックリバーシブルターミネーションとＳＢＳアプローチを使用している。それらは３００ｂｐまで達することができる。しかしながら、主な欠点は、ＡＴおよびＧＣリッチ領域の表現の不足、変電のエラー、高い半陽性率にある。一方、４５４パイロシーケンシングおよびＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）などの他のＳＢＳアプローチでは、単一ヌクレオチドの付加／停止を使用する。Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔは７００ｂｐのリード長を達成できるのに対し、４５４パイロシーケンシングは４００ｂｐに達し得る。しかしながら、これらの技術はより高速でポイントオブケアに適しているが、それらには挿入／欠失エラーの優勢、ホモポリマー領域エラーなど、多くの欠点もある。それらは、長距離のゲノム構造またはトランスクリプトーム構造を明らかにするために使用することはできず、ペアエンドシーケンシングを行うこともできない。

ロングリードシーケンシングアプローチには、合成ロングリードシーケンシングとリアルタイムロングリードシーケンシングという２つの主要な種類がある。Ｉｌｌｕｍｉｎａと１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓで使用されている合成統合されたロングリードシーケンシングは、バーコードを活用して大きなフラグメントの計算によるアセンブリを可能にするライブラリーの調製に焦点を当てている。実際、これらの技術は実際のロングリードではなく、ショートリードを実行し、バーコードアプローチを使用してＤＮＡの断片が整理されるため、分析中の複雑さが解消され、実際のロングリード法と同様のデータを取得できる。しかしながら、このアプローチは、一部にはさらに広い範囲を必要とするため、非常に高いコストがかかる。もう１つの種類のロングリードシーケンシングは、リアルタイムロングリードシーケンシングであり、Ｐａｃｉｆｉｃ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓとＯｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓで使用されている。合成ロングリードシーケンシングとは異なり、リアルタイムロングリードシーケンシングは、増幅されたＤＮＡのクローン集団に依存せず、ケミカルサイクリングを必要としない。Ｎａｎｏｐｏｒｅの技術は、エラー率が約３０％と非常に高く、コストに大きく寄与する非常に高いカバレッジも必要である。修飾塩基の使用は、分析をさらに複雑にする独自のシグナルを生成したＮａｎｏｐｏｒｅの技術にとっても特に困難であった。Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓは、最大４０００〜５０００ｂｐｓのリード長に到達できる。しかしながら、ロングリードでは約１５％とシングルパスエラー率が高いため、高いカバレッジが必要であり、１Ｇｂシーケンシングのコストが＄１０００を超える（例えば、Ｇｏｏｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１７：３３３−３５１；２０１６を参照されたい）。さらに、存在する熱バックグラウンドとこれらの方法で利用される励起エネルギーは、重要な反応で使用されるＤＮＡポリメラーゼに損傷を与え、最終的にこの技術のリード長と適用性を制限する。さらに、生成された発光は、ポリメラーゼによって結合されたヌクレオチドとは無関係の一般的なスペクトルであるため、パイロシーケンシングでは、各ヌクレオチドが全ての結合事象から１つずつシグナルを収集するサイクルベースのアプローチが必要である。これは、次のヌクレオチドを投与するために未結合のヌクレオチドを取り除くための洗浄サイクルが続く。

したがって、現在の技術の大多数は、ユニットあたりのヌクレオチドのリード長が短い（約４０〜１００塩基長）ため、最も困難な問題の１つは、配列の小さな断片を１つの大きな意味のある配列に整列させ、高いカバレッジデータを分析し、強力なスーパーコンピュータを使用して複雑なアルゴリズムで生成されたデータの負荷を後処理することである。より新しい世代の単一分子ベースのシーケンシング技術は、この問題に潜在的に対処できる。しかしながら、これらの従来技術の各々は、高いカバレッジ（配列の同じ領域の複数の読み取り）を必要とする高いエラー率を有し、信頼できるデータを得るためにしばしば約３０倍から１００倍である。

したがって、単一分子核酸シーケンシングのための改善された方法が必要である。

本明細書で提供されるのは、核酸テンプレートをシーケンシングする方法であって、
（ｉ）ポリメラーゼ酵素、（ｉｉ）ＡＴＰ再生酵素、（ｉｉｉ）発光酵素（例えば、ホタルルシフェラーゼ）、（ｉｖ）テンプレート核酸、および（ｉｉｉ）成長する核酸鎖のテンプレート指向合成を実行するための成分を有するポリメラーゼ−ＡＴＰ再生酵素−発光試薬溶液を含むシーケンシング混合物を提供することであって、上記試薬溶液が、ＡＴＰ再生酵素基質（例えば、ＡＰＳ、ＡＤＰ−グルコース、ＡＭＰ＋ＰＥＰなど）、発光基質（例えば、ルシフェリン）、および複数の種類のヌクレオチド類似体を含み、ヌクレオチド類似体の各種類がポリメラーゼにより切断可能な標識された脱離基を有し、ヌクレオチド類似体の各種類が異なる標識を有し、標識された脱離基がテンプレート鎖へのそれぞれのヌクレオチド類似体のポリメラーゼ依存性結合の際に切断される、提供することと、

複数のヌクレオチド類似体がテンプレートに逐次的に追加されるように核酸合成を実行することであって、それにより：ａ）ヌクレオチド類似体がポリメラーゼと会合し、ｂ）ヌクレオチド類似体は、そのヌクレオチド類似体上の標識された脱離基がポリメラーゼによって切断されるときに、ポリメラーゼによってテンプレート鎖に組み込まれ、標識された脱離基が、ＡＴＰ再生酵素によってＡＴＰ再生酵素基質（例えば、ＡＴＰスルフリラーゼによってＡＰＳ、ＡＧＰＰａｓｅによってＡＤＰグルコース、ＰＰＤＫによってＡＭＰ＋ＰＥＰなど）と結合され、標識されたＡＴＰを生じ、次いでｃ）標識されたＡＴＰを発光酵素（ホタルルシフェラーゼ）に結合し、発光基質（ルシフェリン）が、発光酵素（ルシフェラーゼ）によって触媒されて、限定された期間（一時的／控えめ）、発光を生成し、それぞれの標識された脱離基を再生し、上記発光が、それぞれの標識された脱離基上の標識に光を生成させる（励起する）、実行することと、

核酸合成が行われている間に標識からの光を検出し、各々の控えめな発光期間中に検出された光を使用して、テンプレート核酸の配列を決定することと、を含む、方法である。

本発明のシーケンシング法（本明細書ではＦＬＡＳＨ（登録商標）シーケンシング法とも呼ばれる）の主な利点は、ポリメラーゼ酵素が、特定の表面に付着することによって、または既存の方法で発生するような、シグナルの生成に使用される外部光励起へと複数回曝露することによって、本発明の反応条件において損傷を受けないことである。本発明の方法では、ポリメラーゼは、修飾されていないか、付着していないか、外部光源に曝露していないか、さもなければその本来の鎖伸長機能の実行から圧力がかけられていない。これは、既存の方法よりもカバレッジがはるかに少ない、本来の環境で発生するのと同じくらい正確で高忠実度で非常に長いリード長に到達できる、より長く機能するポリメラーゼをもたらすという利点がある。

例えば、本発明の特定の実施形態では、単一のポリメラーゼまたは複数のポリメラーゼのいずれかが、単一の液滴内のシーケンシング反応混合物に閉じ込められ、ポリメラーゼ（複数可）は、検出されるｄＮＴＰの組み込みシグナルを生成するために外部光励起を受けない。

特定の実施形態では、シーケンシング混合物は、標識されたピロリン酸塩を２つのリン酸イオンに変換することができるピロホスファターゼ酵素をさらに含む。酵素濃度の比は、ＡＴＰスルフリラーゼ／ルシフェラーゼループ活性がピロホスファターゼ活性よりも桁違いに高くなるように調整される。一実施形態では、ＡＴＰ−スルフリラーゼ／ルシフェラーゼループの相対的な反応速度は、ピロホスファターゼ反応よりも１０３〜１０１２倍速い範囲である。別の実施形態では、ルシフェラーゼおよびピロホスファターゼはナノマトリックス中に共カプセル化されている。一実施形態では、ナノマトリックスは、負に帯電したナノ粒子である。この実施形態では、標識されたＡＴＰ（ＡＴＰ−ＦＬ）は、ルシフェラーゼおよびピロホスファターゼが共カプセル化されている負に帯電したマトリックス中に拡散することができる。特定の実施形態では、ｃ）標識されたＡＴＰを発光酵素に結合させ、発光基質が発光酵素によって触媒されるステップが、ナノマトリックス内で起こる。

本発明の方法は、全ゲノムシーケンシング、ＳＮＰバリアント検出などを含む様々な用途に有用である。既存の方法に対する本発明の方法の１つの利点は、例えばホタルルシフェラーゼおよびルシフェリンを使用して、発光反応においてフルオロフォアで標識されたＡＴＰ（例えば、標識ＡＴＰ）を利用して、フルオロフォア標識を励起する、制御された、一意に定義された、控えめな、かつ／または一過性の制限された発光時間をもたらすことである。驚くべきことに、そのような標識されたＡＴＰは、ホタルルシフェラーゼおよびルシフェリンを使用する発光反応において機能することができることが見出された。既存の方法に対する本発明の方法の別の利点は、フルオロフォア標識を励起するための発光反応によって利用される光強度の減少であり、それにより、ＤＮＡポリメラーゼへの損傷が生じない。例えば、発光光強度は、既存のシーケンシング法と比較して、少なくとも５倍、１０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍から少なくとも１，０００倍まで低減することができる。特定の実施形態では、本明細書で利用される標識（例えば、フルオロフォア）を励起するために利用される光強度の減少は、少なくとも５倍、１０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、２０００倍などであり得る。この利点により、ＤＮＡポリメラーゼの機能がより長くなり、これによってより長いリード長を生成する。

開示された発明は、逐次的にｄＮＴＰを組み込む個々のポリメラーゼ酵素をモニターすることに基づく単一分子シーケンシング技術である。特定の実施形態では、本発明は、ポリメラーゼがテンプレートに相補的なｄＮＴＰを組み込むたびに、組み込みプロセス中に蛍光シグナルが一過性に、一意に、かつ／または控えめに生成されるプロセスを包含し、そのような蛍光は一過性の、一意の、かつ／または控えめな発光反応による励起によって引き起こされる。換言すると、発光反応は、励起スペクトルなどを介して、標識された脱離基（例えば、標識されたピロリン酸）に、その特定のｄＮＴＰに特異的な制限された時間の間、検出可能な光シグナルを放出させる。このプロセスは、次のｄＮＴＰ組み込みのために繰り返される（図１）。

より具体的には、ポリメラーゼがテンプレートＤＮＡに相補的な鎖に修飾デオキシリボヌレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）ヌクレオチド類似体を組み込むたびに、結合したヌクレオチドの種類に特異的な蛍光シグナルが生成される。４種類のｄＮＴＰ、すなわちデオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、およびデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）が存在する。各ヌクレオチドは、ポリメラーゼ酵素によって相補鎖に結合されている間、固有の蛍光シグナル（例えば、赤、黄、緑、または青など）を生成する。以前に結合したヌクレオチド類似体の３’部分へのヌクレオチド類似体の結合が完了すると、脱離基によって生成される蛍光は、適切な蛍光センサーおよび／または検出デバイスによって検出され、次いで、それは、いくつかの実施形態では、そのそれぞれのｄＮＴＰ組み込みに対する発光反応の減衰によって急速に終了する。換言すると、テンプレート鎖に組み込まれた各ｄＮＴＰは、独特であり、それぞれのｄＮＴＰ組み込み事象を示す、控えめな、制限された期間の光パルス（蛍光シグナル）をもたらす。

他の実施形態では、脱離基によって生成される蛍光は、適切な蛍光センサーおよび／または検出デバイスによって増幅され、検出され、次いで、それは、いくつかの実施形態では、そのそれぞれのｄＮＴＰ組み込みに対する発光反応の減衰によって急速に終了する。

上記方法のＡＴＰ再生酵素／ルシフェラーゼループからの検出可能な光シグナルを増幅する方法も本明細書で提供される。

シーケンシングは、ヌクレオチドが相補鎖に付加されるたびに生成される蛍光を検出することによってヌクレオチドの種類を明らかにすることによって達成される。したがって、各々の特定のヌクレオチドが結合するたびに、蛍光センサーで検出できる蛍光シグナルの短いピークが生成される。その結果、ヌクレオチド配列の対応するデータ配列に変換できる後続の連続した色のデータ配列が生成される（図１）。

本明細書に開示される本発明の方法によって提供される利点は、その単純さと革新的な化学反応にあり、検出中のバックグラウンドシグナルを大幅に低減し、それによって感度を向上させる。本発明の方法によれば、試薬および酵素を含む反応条件のより少ない修正は、特異性、効率、および速度を改善する。また、本発明の方法によれば、ポリメラーゼはほぼ理想的な条件で動作し、高感度と特異性を利用することにより、ポストプロセッシングと生成されたデータの分析を大幅に少なくすることにより、ＤＮＡポリメラーゼ分子あたり約数万塩基の非常に長いリード長に達すると企図される。本明細書に開示される本発明の方法の組み合わされた特徴は、競合する技術と比較して試験ごとの時間を大幅に削減することに加えて、高い特異性を達成しながら、それぞれのデバイスと各実行の両方のコストを低減する。したがって、開示された発明の方法およびシステムは、特異性に悪影響を与えることなく、非常に低コストのリアルタイムシーケンシングシステムの実現を可能にする。

参照による組み込み
本明細書では、この明細書で言及されている全ての公開された特許、公開された特許出願、および非特許刊行物は、あたかも個々の公開された特許、公開された特許出願、または非特許刊行物が体的かつ個別に示されているのと同程度に、全ての目的のためにその全体が参照により組み込まれる。

本発明のシーケンシング法の一実施形態の一般的な図を示す：ＤＮＡポリメラーゼは、それぞれのフルオロフォアレベルを有する修飾されたｄＮＴＰをビルディングブロックとして使用する。ポリメラーゼに結合すると、蛍光分子を含むピロリン酸は後の反応のために切断される。 フルオロフォアが付着したそれぞれのヌクレオチド類似体のテンプレート鎖へのポリメラーゼ依存性結合と、フルオロフォアが付着した標識ピロリン酸の切断を示す。次いで標識ピロリン酸はそれぞれの標識されたピロリン酸に結合してアデノシン５’−ホスホ硫酸（ＡＰＳ）とし、標識されたＡＴＰ（ＡＴＰ＋ＦＬ）をもたらすＡＴＰスルフリラーゼと相互作用する。 標識ＡＴＰの形成を示す。 本明細書に記載された発光反応のための試薬、標識されたＡＴＰ（ＡＴＰ＋ＦＬ）、ルシフェリン、およびホタルルシフェラーゼを示す。 発光反応における試薬の相互作用を示す。これにより、付随する発光の結果、標識されたピロリン酸が蛍光を発する。 ヌクレオチド類似体ｄＮＴＰがポリメラーゼと相互作用している間に、標識ＡＴＰから標識ピロリン酸が切断されると蛍光が生成され、それぞれのフルオロフォアの色に対応する蛍光シグナルが生成されることをさらに示す。各種類のヌクレオチド類似体が異なる標識（例えば、異なるＦＬ）を有するように、ヌクレオチド類似体ｄＮＴＰのクラスごとに固有の色の付いたフルオロフォアがある。 ＡＴＰスルフリラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、またはｄＧＴＰ−クマリンの量を実施例２に示すように変化させることにより、ポリメラーゼ−ＡＴＰスルフリラーゼ−ルシフェラーゼ反応（ＦＬＡＳＨ（登録商標）反応とも呼ばれる）の結果としての発光生成を示す。 ＡＴＰスルフリラーゼの変化に伴う本発明のＦＬＡＳＨ（登録商標）シーケンシング反応の結果としての発光生成を示す。 ホタルルシフェラーゼの変化を伴う本発明のＦＬＡＳＨ（登録商標）シーケンシング反応の結果としての発光生成を示す。 ｄＧＴＰ−クマリンの変化を伴う本発明のＦＬＡＳＨ（登録商標）シーケンシング反応の結果としての発光生成を示す。 実施例４に記載されているように、ルシフェラーゼとピロホスファターゼを共カプセル化するための正の正味電荷を持つメソポーラスマトリックスを示す。 蛍光標識されたかつ標識されていないｄＧＴＰで本発明のＦＬＡＳＨ（登録商標）シーケンシング反応を行った結果を示す。 無機ホスファターゼの量を変えてルシフェラーゼ反応にＡＴＰとＡＰＳを添加した結果を示す。 補酵素ＡをＡＴＰスルフリラーゼ／ルシフェラーゼシグナル増幅ループ反応に添加することによる発光シグナルへの影響を示す。 液滴に対応する閉じ込め領域にＦＬＡＳＨ（登録商標）反応試薬を閉じ込める実施形態を示す。複数のポリメラーゼおよび複数のプライマーを有するシーケンス混合物中の単一の標的核酸テンプレートを示す。 液滴に対応する閉じ込め領域にＦＬＡＳＨ（登録商標）反応試薬を閉じ込める実施形態を示す。単一の標的核酸テンプレートのみがシーケンシングされるように、複数の標的核酸テンプレート、複数のポリメラーゼおよび単一のプライマーを有するシーケンス混合物を示す。 液滴に対応する閉じ込め領域にＦＬＡＳＨ（登録商標）反応試薬を閉じ込める実施形態を示す。複数のポリメラーゼを有するシーケンス混合物中の単一の自己プライミング標的核酸テンプレートを示す。 標的テンプレート核酸のその後の結合のために、プライマーが固体表面基板に結合している構成を示す。 プライマーのその後の結合のために、標的テンプレート核酸が固体表面基板に結合している構成を示す。 単一の標的核酸テンプレート上で複数のポリメラーゼを使用して本発明のシーケンシング法を開始する実施形態を示す。 相補鎖の合成を開始するポリメラーゼがその典型的なリード長を横切って、テンプレートから脱落または解離し、反応混合物中の多くの他のポリメラーゼの別のものはすぐにテンプレートに結合し、相補鎖シーケンシング合成を続けるため、標的テンプレートのシーケンシングが実質的に連続する実施形態を示す。 多数の同一のプライマーがそれぞれ別個の場所で基質に結合している実施形態を示しており、これは単一の全体的な反応チャンバーまたは個々の控えめな反応チャンバーのいずれかであり得る。これらのプライマーは、本質的に同じ標的テンプレート核酸に結合する。 多数の異なる（相互に排他的な）プライマーがそれぞれ別個の場所で基質に結合している実施形態を示しており、これは単一の全体的な反応チャンバーまたは個々の控えめな反応チャンバーのいずれかであり得る。これらのプライマーは、異なる相互に排他的な標的テンプレート核酸に結合する。 テンプレート鎖へのｄＮＴＰ組み込みの生化学プロセスの簡略図を示す。

本明細書で提供されるのは、核酸テンプレートをシーケンシングする方法であって、
（ｉ）ポリメラーゼ酵素、（ｉｉ）ＡＴＰ再生酵素、（ｉｉｉ）発光酵素（例えば、ホタルルシフェラーゼ）、（ｉｖ）テンプレート核酸、および（ｉｉｉ）成長する核酸鎖のテンプレート指向合成を実行するための成分を有するポリメラーゼ−ＡＴＰ再生酵素−発光試薬溶液を含むシーケンシング混合物を提供することであって、上記試薬溶液が、ＡＴＰ再生酵素基質（例えば、ＡＰＳ、ＡＤＰ−グルコース、ＡＭＰ＋ＰＥＰなど）、発光基質（例えば、ルシフェリン）、および複数の種類のヌクレオチド類似体を含み、ヌクレオチド類似体の各種類がポリメラーゼにより切断可能な標識された脱離基を有し、ヌクレオチド類似体の各種類が異なる標識を有し、標識された脱離基がテンプレート鎖へのそれぞれのヌクレオチド類似体のポリメラーゼ依存性結合の際に切断される、提供することと、

複数のヌクレオチド類似体がテンプレートに逐次的に追加されるように核酸合成を実行することであって、それにより：ａ）ヌクレオチド類似体がポリメラーゼと会合し、ｂ）ヌクレオチド類似体は、そのヌクレオチド類似体上の標識された脱離基がポリメラーゼによって切断されるときに、ポリメラーゼによってテンプレート鎖に組み込まれ、標識された脱離基が、ＡＴＰ再生酵素によってＡＴＰ再生酵素基質（例えば、ＡＴＰスルフリラーゼによってＡＰＳ、ＡＧＰＰａｓｅによってＡＤＰグルコース、ＰＰＤＫによってＡＭＰ＋ＰＥＰなど）と結合され、標識されたＡＴＰを生じ、次いでｃ）標識されたＡＴＰを発光酵素（ホタルルシフェラーゼ）に結合し、発光基質（ルシフェリン）が、発光酵素（ルシフェラーゼ）によって触媒されて、限定された期間（一時的／控えめ）、発光を生成し、それぞれの標識された脱離基を再生し、上記発光が、それぞれの標識された脱離基上の標識に光を生成させる（励起する）、実行することと、

核酸合成が行われている間に標識からの光を検出し、各々の控えめな発光期間中に検出された光を使用して、テンプレート核酸の配列を決定することと、を含む、方法である。

本発明の方法の特定の実施形態では、上記方法は、
（ｉ）ポリメラーゼ酵素、（ｉｉ）ＡＴＰスルフリラーゼ、（ｉｉｉ）発光酵素（例えば、ホタルルシフェラーゼ）、（ｉｖ）テンプレート核酸、および（ｉｉｉ）成長する核酸鎖のテンプレート指向合成を実行するための成分を有するポリメラーゼ−スルフリラーゼ−発光試薬溶液を含むシーケンシング混合物を提供することであって、上記試薬溶液が、ＡＰＳ、発光基質（例えば、ルシフェリン）、および複数の種類のヌクレオチド類似体を含み、ヌクレオチド類似体の各種類がポリメラーゼにより切断可能な標識された脱離基を有し、ヌクレオチド類似体の各種類が異なる標識を有し、標識された脱離基がテンプレート鎖へのそれぞれのヌクレオチド類似体のポリメラーゼ依存性結合の際に切断される、提供することか、または

（ｉ）ポリメラーゼ酵素、（ｉｉ）ＡＤＰｇｌｃピロホスホリラーゼ（ＡＧＰＰａｓｅ）、（ｉｉｉ）発光酵素（例えば、ホタルルシフェラーゼ）、（ｉｖ）テンプレート核酸、および（ｉｉｉ）成長する核酸鎖のテンプレート指向合成を実行するための成分を有するポリメラーゼ−ＡＧＰＰａｓｅ−発光試薬溶液を含むシーケンシング混合物を提供することであって、上記試薬溶液が、ＡＤＰ−グルコース、発光基質（例えば、ルシフェリン）、および複数の種類のヌクレオチド類似体を含み、ヌクレオチド類似体の各種類がポリメラーゼにより切断可能な標識された脱離基を有し、ヌクレオチド類似体の各種類が異なる標識を有し、標識された脱離基がテンプレート鎖へのそれぞれのヌクレオチド類似体のポリメラーゼ依存性結合の際に切断される、提供することか、または

（ｉ）ポリメラーゼ酵素、（ｉｉ）ピルビン酸オルトリン酸ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）、（ｉｉｉ）発光酵素（例えば、ホタルルシフェラーゼ）、（ｉｖ）テンプレート核酸、および（ｉｉｉ）成長する核酸鎖のテンプレート指向合成を実行するための成分を有するポリメラーゼ−ＰＰＤＫ−発光試薬溶液を含むシーケンシング混合物を提供することであって、上記試薬溶液が、ＡＭＰ、およびホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）、発光基質（例えば、ルシフェリン）、および複数の種類のヌクレオチド類似体を含み、ヌクレオチド類似体の各種類がポリメラーゼにより切断可能な標識された脱離基を有し、ヌクレオチド類似体の各種類が異なる標識を有し、標識された脱離基がテンプレート鎖へのそれぞれのヌクレオチド類似体のポリメラーゼ依存性結合の際に切断される、提供することと、

複数のヌクレオチド類似体がテンプレートに逐次的に追加されるように核酸合成を実行することであって、それにより：ａ）ヌクレオチド類似体がポリメラーゼと会合し、ｂ）ヌクレオチド類似体は、そのヌクレオチド類似体上の標識された脱離基がポリメラーゼによって切断されるときに、ポリメラーゼによってテンプレート鎖に組み込まれ、標識された脱離基が、ＡＴＰスルフリラーゼによってＡＰＳ、ＡＧＧＰａｓｅによってＡＤＰ−グルコース、かつ／またはＰＰＤＫによってＡＭＰのいずれかと結合され、標識されたＡＴＰを生じ、次いでｃ）標識されたＡＴＰを発光酵素（ホタルルシフェラーゼ）に結合し、発光基質（ルシフェリン）が、発光酵素（ルシフェラーゼ）によって触媒されて、限定された期間（一時的／控えめ）、発光を生成し、それぞれの標識された脱離基を再生し、上記発光が、それぞれの標識された脱離基上の標識に光を生成させる（励起する）、実行することと、

核酸合成が行われている間に標識からの光を検出し、各々の控えめな発光期間中に検出された光を使用して、テンプレート核酸の配列を決定することと、を含む。

本明細書で使用されるとき、「ポリメラーゼ−ＡＴＰ再生酵素−ルシフェラーゼ」またはその文法的変形は、本発明の方法で使用して、ポリメラーゼ鎖伸長シーケンシング反応により生成される標識ピロリン酸を利用し、標識されたピロリン酸（ＰＰｉ；図１Ｂ）をＡＴＰに変換できる、当該技術分野で公知の任意の連結された３酵素系を指す。例えば、連結された３酵素ポリメラーゼ−ＡＴＰ再生酵素−ルシフェラーゼ系は、以下からなる群から選択することができる：ポリメラーゼ−ＡＴＰスルフリラーゼ−発光酵素系、ポリメラーゼ−ＡＧＰＰａｓｅ−発光（全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み入れられるＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３９９（２０１０）１６８−１７３に開示されるような）、ポリメラーゼ−ＰＰＤＫ−発光酵素系（全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＺｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００６，７８，４４８２−４４８９に開示されるような）など。

本明細書で使用されるとき、「ＡＴＰ再生酵素基質」という語句は、本明細書で使用されるそれぞれのＡＴＰ再生酵素の天然基質を指す。例えば、本明細書でＡＴＰスルフリラーゼに使用される天然基質はＡＰＳであり、ＡＧＧＰａｓｅにはＡＤＰ−グルコースであり、ＰＰＤＫにはＡＭＰ＋ＰＥＰである、などである。

本明細書で使用されるとき、「ＡＴＰ再生酵素／ルシフェラーゼループ」または「ＡＴＰ再生酵素／ルシフェラーゼシグナル増幅ループ」という用語、その文法的変形（例えば、ＡＴＰスルフリラーゼ／ルシフェラーゼループ、ＡＧＰＰａｓｅ／ルシフェラーゼループ、ＰＰＤＫ／ルシフェラーゼループなど）は、一般に、本明細書の実施例３および図１Ｂ〜１Ｇに記載されているＡＴＰ再生酵素とルシフェラーゼの間の酵素ループを指し、これにより、ルシフェラーゼによって触媒される発光反応に続いて、蛍光標識が付いたままの新しいピロリン酸分子（ＰＰｉ＋ＦＬ）が放出される（図１Ｆ）。この新しく放出されたＰＰｉ−ＦＬは、もう一度ＡＴＰ再生酵素（例えば、ＡＴＰスルフリラーゼ、ＡＧＰＰａｓｅ、ＰＰＤＫなど）の基質になり、これにより、ＡＴＰ再生酵素（ＡＴＰスルフリラーゼ、ＡＧＰＰａｓｅ、ＰＰＤＫなど）とルシフェラーゼ（図１Ｇ上）の間の酵素ループを生成する。図１Ｂ〜１Ｇに示すように、このループにより、ＰＰｉ＋ＦＬはＡＴＰスルフリラーゼによってリサイクルされ、蛍光標識されたＡＴＰ（ＡＴＰ−ＦＬ）に変換され、次いでＰＰｉ−ＦＬを放出するルシフェラーゼによって触媒され得る。これは、標識されたピロリン酸から連続したシグナルを生成し、それによって最新のヌクレオチドのシーケンシングシグナルの増幅メカニズムとして機能する。

特定の実施形態では、シーケンシング混合物が、標識されたピロリン酸塩を２つのリン酸イオンに変換することができるピロホスファターゼ酵素をさらに含み、これは、本発明の方法では、鎖伸長シーケンシング反応において、次のｄＮＴＰ組み込み前に「ＡＴＰ再生酵素／ルシフェラーゼシグナル増幅ループ」を破壊するように機能する。本明細書で使用するための例示的な連結ポリメラーゼ−ＡＴＰ再生酵素−ルシフェラーゼ−ピロホスファターゼ４酵素系には、以下が含まれる。ポリメラーゼ−ＡＴＰスルフリラーゼ−ルシフェラーゼ−ピロホスファターゼ、ポリメラーゼ−ＡＧＰＰａｓｅ−ルシフェラーゼ−ピロホスファターゼ、およびポリメラーゼ−ＰＰＤＫ−ルシフェラーゼ−ピロホスファターゼなど。この実施形態では、酵素濃度の比が、ＡＴＰ再生酵素／ルシフェラーゼループ活性がピロホスファターゼ活性よりも桁違いに高くなるように調整される。連結ポリメラーゼ−ＡＴＰ再生酵素−ルシフェラーゼ−ピロホスファターゼ４酵素系が使用される一実施形態では、ＡＴＰ再生酵素／ルシフェラーゼループの相対的な反応速度は、ピロホスファターゼ反応より１０３〜１０１２、１０３〜１０１１、１０３〜１０１０、１０３〜１０９、１０３〜１０８、１０３〜１０７、および１０３〜１０６などの倍数で速い範囲であるよう選択される。他の実施形態では、ＡＴＰ再生酵素／ルシフェラーゼループの相対的な反応速度がピロホスファターゼ反応よりも、少なくとも１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２などからなる群から選択される倍数速い。

他の実施形態では、本発明のシーケンシング法におけるピロホスファターゼ反応の速度に対して、ＡＴＰ再生酵素／ルシフェラーゼループ反応の速度を制御する。またはＡＴＰ再生酵素／ルシフェラーゼループ反応の全体的な時間の長さ、ピロホスファターゼ酵素に対するＡＴＰ再生酵素の比率を変更および調整できる。したがって、本明細書に提供されるのは、シーケンシング反応におけるＡＴＰ再生酵素／ルシフェラーゼ増幅ループのシグナルの時間の長さを調節する方法であって、本明細書に記載のＦＬＡＳＨ（登録商標）シーケンシング法を実施することと、ＡＴＰ再生酵素／ルシフェラーゼ増幅ループのシグナルの時間の長さを調節するのに有効なピロホスファターゼ対ＡＴＰ再生酵素の比で、ピロホスファターゼをシーケンシング混合物に添加することと、を含む、方法である。

本明細書での使用のために選択されるＡＴＰ再生酵素に応じて、本明細書での使用が企図される例示的なＡＴＰ再生酵素：ピロホスファターゼ酵素比は、ＡＴＰ再生酵素／ルシフェラーゼ増幅ループのシグナルの時間の長さを調節するのに有効であり、１：１、１：２、１：５、１：１０、１：２０、１：３０、１：４０、１：５０、１：６０、１：７０、１：８０、１：９０、１：１００、１：２５０、１：１５０、１：１７５、１：２００、１：２２５、１：２５０、１：２７５、１：３００、１：３５０、１：４００、１：４５０、１：５００、１：５５０、１：６００、１：６５０、１：７００、１：７５０、１：８００、１：８５０、１：９００、１：９５０、１：１０００、１：１５００、１：２０００、１：３０００、１：４０００、１：５０００のＡＴＰ再生酵素：ピロホスファターゼ酵素などからなる群から選択できる。同様に、本明細書での使用のために選択されるＡＴＰ再生酵素に応じて、本明細書での使用が企図される例示的なピロホスファターゼ：ＡＴＰ再生酵素比は、１：１、１：２、１：５、１：１０、１：２０、１：３０、１：４０、１：５０、１：６０、１：７０、１：８０、１：９０、１：１００、１：２５０、１：１５０、１：１７５、１：２００、１：２２５、１：２５０、１：２７５、１：３００、１：３５０、１：４００、１：４５０、１：５００、１：５５０、１：６００、１：６５０、１：７００、１：７５０、１：８００、１：８５０、１：９００、１：９５０、１：１０００、１：１５００、１：２０００、１：３０００、１：４０００、１：５０００のピロホスファターゼ：ＡＴＰ再生酵素などからなる群から選択できる。

本発明のシーケンシング法においてＡＴＰスルフリラーゼおよびＡＰＳが使用される特定の実施形態では、本明細書での使用が企図される例示的なＡＴＰスルフリラーゼ酵素：ピロホスファターゼ酵素比は、１：１、１：２、１：５、１：１０、１：２０、１：３０、１：４０、１：５０、１：６０、１：７０、１：８０、１：９０、１：１００、１：２５０、１：１５０、１：１７５、１：２００、１：２２５、１：２５０、１：２７５、１：３００、１：３５０、１：４００、１：４５０、１：５００、１：５５０、１：６００、１：６５０、１：７００、１：７５０、１：８００、１：８５０、１：９００、１：９５０、１：１０００、１：１５００、１：２０００、１：３０００、１：４０００、１：５０００のＡＴＰスルフリラーゼ酵素：ピロホスファターゼ酵素などからなる群から選択される。

別の実施形態では、シーケンシング混合物が、ｄＮＴＰをＡＭＰに分解することができるアピラーゼ酵素をさらに含み、これは、本発明の方法では、鎖伸長シーケンシング反応において、次のｄＮＴＰ組み込み前に「ＡＴＰ再生酵素／ルシフェラーゼシグナル増幅ループ」を破壊するように機能する。本明細書で使用するための例示的な連結ポリメラーゼ−ＡＴＰ再生酵素−ルシフェラーゼ−ピロホスファターゼ４酵素系には、以下が含まれる。ポリメラーゼ−ＡＴＰスルフリラーゼ−ルシフェラーゼ−アピラーゼ、ポリメラーゼ−ＡＧＰＰａｓｅ−ルシフェラーゼ−アピラーゼ、およびポリメラーゼ−ＰＰＤＫ−ルシフェラーゼ−アピラーゼなど。この実施形態では、酵素濃度の比が、ＡＴＰ再生酵素／ルシフェラーゼループ活性がアピラーゼ活性よりも桁違いに高くなるように調整される。連結ポリメラーゼ−ＡＴＰ再生酵素−ルシフェラーゼ−ピロホスファターゼ４酵素系が使用される一実施形態では、ＡＴＰ再生酵素／ルシフェラーゼループの相対的な反応速度は、アピラーゼ反応より１０３〜１０１２、１０３〜１０１１、１０３〜１０１０、１０３〜１０９、１０３〜１０８、１０３〜１０７、および１０３〜１０６などの倍数で速い範囲であるよう選択される。他の実施形態では、ＡＴＰ再生酵素／ルシフェラーゼループの相対的な反応速度がアピラーゼ反応よりも、少なくとも１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２などからなる群から選択される倍数速い。

他の実施形態では、本発明のシーケンシング法におけるアピラーゼ反応の速度に対して、ＡＴＰ再生酵素／ルシフェラーゼループ反応の速度を制御する。またはＡＴＰ再生酵素／ルシフェラーゼループ反応の全体的な時間の長さ、アピラーゼ酵素に対するＡＴＰ再生酵素の比率を変更および調整できる。本明細書での使用のために選択されるＡＴＰ再生酵素に応じて、本明細書での使用が企図される例示的なＡＴＰ再生酵素：アピラーゼ酵素比は、１：１、１：２、１：５、１：１０、１：２０、１：３０、１：４０、１：５０、１：６０、１：７０、１：８０、１：９０、１：１００、１：２５０、１：１５０、１：１７５、１：２００、１：２２５、１：２５０、１：２７５、１：３００、１：３５０、１：４００、１：４５０、１：５００、１：５５０、１：６００、１：６５０、１：７００、１：７５０、１：８００、１：８５０、１：９００、１：９５０、１：１０００、１：１５００、１：２０００、１：３０００、１：４０００、１：５０００のＡＴＰ再生酵素：アピラーゼ酵素などからなる群から選択できる。同様に、本明細書での使用のために選択されるＡＴＰ再生酵素に応じて、本明細書での使用が企図される例示的なアピラーゼ：ＡＴＰ再生酵素比は、１：１、１：２、１：５、１：１０、１：２０、１：３０、１：４０、１：５０、１：６０、１：７０、１：８０、１：９０、１：１００、１：２５０、１：１５０、１：１７５、１：２００、１：２２５、１：２５０、１：２７５、１：３００、１：３５０、１：４００、１：４５０、１：５００、１：５５０、１：６００、１：６５０、１：７００、１：７５０、１：８００、１：８５０、１：９００、１：９５０、１：１０００、１：１５００、１：２０００、１：３０００、１：４０００、１：５０００のアピラーゼ：ＡＴＰ再生酵素などからなる群から選択できる。

本発明の方法の別の実施形態では、ルシフェラーゼおよびピロホスファターゼは、ナノマトリックス中に共カプセル化される。一実施形態では、ナノマトリックスは、図５に示されるように、負に帯電したナノ粒子である。この実施形態では、標識されたＡＴＰ（ＡＴＰ−ＦＬ）が、ルシフェラーゼおよびピロホスファターゼが共カプセル化されている負に帯電したマトリックス中に拡散することができる。特定の実施形態では、ｃ）標識されたＡＴＰを発光酵素に結合させ、発光基質が発光酵素によって触媒されるステップが、ナノマトリックス内で起こる。

本明細書で使用される場合、「シーケンシング混合物」という語句は、本発明の単一分子シーケンシング反応を実施するために使用される成分を指す。一実施形態では、シーケンシング混合物は、（ｉ）ポリメラーゼ酵素、（ｉｉ）ＡＴＰ再生酵素（例えば、ＡＴＰスルフリラーゼ、ＡＧＰＰａｓｅ、ＰＰＤＫなど）、（ｉｉｉ）発光酵素（例えば、ホタルルシフェラーゼ）、（ｉｖ）テンプレート核酸、および（ｉｉｉ）成長する核酸鎖のテンプレート指向合成を実施するための成分を有するポリメラーゼ−ＡＴＰ再生酵素−発光試薬溶液を含み、上記試薬溶液はＡＰＳ、ＡＤＰ−グルコース、ＡＭＰ＋ＰＥＰなどのいずれかを含み、発光基質（例えば、ルシフェリン）、およびその中の複数の種類の標識ヌクレオチド類似体を含む。本発明によれば、使用されるシーケンシング混合物は、本発明のシーケンシング方法において、以前のシーケンシング方法に比べて以下の利点を提供する：使用されるポリメラーゼは、その理想的な状態で機能する。ポリメラーゼ酵素を改変する必要はない。高いヌクレオチド（例えば、ｄＮＴＰ）濃度を使用すると、最適な効率が得られる。発光反応による非常に低い強度の控えめな限定された期間の励起光のみが必要であり、フルオロフォアの光退色を有利に低減し、ポリメラーゼ酵素の変性を低減する。実質的に蛍光バックグラウンドを提供しないため、塩基呼び出しの特異性と感度が向上する。高度な光学系やナノ構造のチップ設計を必要としないため、コストを低減できる。高い特異性を提供し、高いカバレッジの必要性を低減する。従来技術の方法と比較して必要とされるコンピュータ処理がはるかに少ない長いリード長（例えば、１遺伝子／細胞に対し約５０Ｋｂ）を提供する。

本明細書で使用されるとき、「ポリメラーゼ−ＡＴＰ再生酵素−発光試薬溶液」という語句、ＡＴＰ再生酵素としてＡＴＰスルフリラーゼ、ＡＧＰＰａｓｅ、ＰＰＤＫなどのいずれかを使用するその文法的変形、または「試薬溶液」は、成長する核酸のテンプレート指向合成を行うために必要な成分の混合物を指す。ＡＴＰスルフェリラーゼを使用する一実施形態では、ポリメラーゼ、例えばＤＮＡ ｐｏｌ Ｉ、ＡＴＰスルフリラーゼ、および発光酵素（例えばルシフェラーゼなど）と共に使用するためのポリメラーゼ試薬溶液は、ＡＰＳ（アデノシン５’ホスホ硫酸）、ルシフェリン、および適切な濃度のｄＮＴＰ、例えば、本明細書に記載のフルオロフォア修飾ヌクレオチド類似体を含む。ＡＧＰＰａｓｅを使用する別の実施形態では、ポリメラーゼ、例えばＤＮＡ ｐｏｌ Ｉ、ＡＧＰＰａｓｅ、および発光酵素（例えばルシフェラーゼなど）と共に使用するためのポリメラーゼ試薬溶液は、ＡＤＰ−グルコース、ルシフェリン、および適切な濃度のｄＮＴＰ、例えば、本明細書に記載のフルオロフォア修飾ヌクレオチド類似体を含む。ＰＰＤＫを使用する別の実施形態では、ポリメラーゼ、例えばＤＮＡ ｐｏｌ Ｉ、ＰＰＤＫ、および発光酵素（例えばルシフェラーゼなど）と共に使用するためのポリメラーゼ試薬溶液は、ＡＭＰ＋ＰＥＰ、ルシフェリン、および適切な濃度のｄＮＴＰ、例えば、本明細書に記載のフルオロフォア修飾ヌクレオチド類似体を含む。特定の実施形態では、一部では、本発明の方法で有利に使用される標識脱離基（例えば、蛍光ピロリン酸；ＰＰｉ）から生じる低蛍光バックグラウンドにより、使用されるｄＮＴＰの濃度はこれまで可能であったよりもはるかに高い。標識されたＡＴＰ形成酵素（例えば、ＡＴＰスルフリラーゼ、ＡＧＰＰａｓｅ、ＰＰＤＫなど）とポリメラーゼの速度は、酵素の種類と供給源に応じて大幅に異なるため、本明細書で使用されるＡＴＰ再生酵素（例えば、ＡＴＰスルフリラーゼ、ＡＧＰＰａｓｅ、ＰＰＤＫなど）反応によって達成される標識されたＡＴＰ形成速度は、本明細書に記載されるＡＴＰ再生酵素濃度などの反応条件を調整することによって別々に調整することができる。

本明細書で使用されるとき、「標識ＡＴＰ反応」という語句は、図１Ｂおよび１Ｃに示すように、フルオロフォアで標識されたピロリン酸（ＰＰｉ＋ＦＬ）とＡＴＰ再生基質（例えば、アデノシン５’ホスホ硫酸（ＡＰＳ）、ＡＤＰ−グルコース、ＡＭＰ＋ＰＥＰなどのいずれか）を組み合わせて標識されたＡＴＰ（ＡＴＰ＋ＦＬ）を形成することができる任意の反応を指す。本明細書で使用するための一実施形態では、標識されたピロリン酸は、ＡＴＰスルフリラーゼ酵素などを使用してＡＰＳと組み合わせることができる。本明細書で使用するための別の実施形態では、標識されたピロリン酸は、ＡＧＰＰａｓｅ酵素などを使用してＡＤＰ−グルコースと組み合わせることができる。本明細書で使用するための別の実施形態では、標識されたピロリン酸は、ＰＰＤＫ酵素などを使用してＡＭＰ＋ＰＥＰと組み合わせることができる。

本明細書で使用されるとき、「発光反応」という語句は、発光体の温度からエネルギーをまったく導き出さないまたはそのエネルギーのみを導き出す光の放射（すなわち、白熱光以外の光の放射）を生成できる任意の反応を指す。「発光」には、蛍光、リン光、熱発光、化学発光、電気発光および生物発光が含まれるが、これらに限定されない。「発光性」とは、発光を示す物体を指す。好ましい実施形態では、光は可視スペクトルにある。しかしながら、本発明は可視光に限定されず、任意の周波数の電磁放射を含む。一実施形態では、本明細書で使用される発光反応は、発光基質、ルシフェリンを触媒して標識されたＡＴＰ（ＡＴＰ＋ＦＬ）を補因子として使用して発光、オキシルシフェリン、ＡＭＰを生成し、さらに、標識されたピロリン酸（ＰＰｉ＋ＦＬ）を再生する、発光酵素、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼ）によって引き起こされる（図１Ｄ〜１Ｆを参照されたい）。

例えば、一実施形態では、本明細書で企図される反復シーケンシングサイクルは、ＡＴＰ−スルフリラーゼ酵素によって触媒されるＰＰｉとＡＰＳとの第１の標識ＡＴＰ反応を含み、標識ＡＴＰおよび無機硫酸の生成をもたらす。第２の反応では、発光反応、ルシフェリンとルシフェラーゼがＡＴＰをエネルギー源として消費し、光、ＡＭＰ、オキシルシフェリンを生成し、標識されたピロリン酸（ＰＰｉ＋ＦＬ）を再生する（図１Ｄ〜１Ｆ）。したがって、それぞれのｄＮＴＰ類似体がそれぞれ組み込まれた後、溶液中の標識されたピロリン酸塩（ＰＰｉ＋ＦＬ）の各分子に対して光の量子が生成される。本明細書で企図される一実施形態の反応の過程で、ＡＰＳおよびルシフェリンが消費され、ＡＭＰおよびオキシルシフェリンが生成されるが、ＡＴＰスルフリラーゼおよびルシフェラーゼは一定のままである。本発明は、使用されるルシフェラーゼの種類に関して限定されない。特定の開示された実施形態はホタルルシフェラーゼを利用したが、当該技術分野で知られている任意のルシフェラーゼを開示された方法で使用することができる。

本発明によれば、補酵素Ａは、シーケンシング反応においてＡＴＰ再生酵素／ルシフェラーゼ増幅ループのシグナルの強度を増加させる効果を有するルシフェラーゼの分解／非活性化を防止することにより、ルシフェラーゼ／ルシフェリン対または複合体を安定化することが見出された。したがって、本明細書で提供されるのは、シーケンシング反応におけるＡＴＰ再生酵素／ルシフェラーゼ増幅ループのシグナルの強度を増加させる方法であって、本発明のＦＬＡＳＨ（登録商標）シーケンシング方法を実施することと、ＡＴＰ再生酵素／ルシフェラーゼ増幅ループのシグナルの強度を増加させるのに有効な補酵素Ａ：ルシフェラーゼ比で、補酵素Ａをシーケンシング混合物に添加することと、を含む、方法である。

したがって、いくつかの実施形態では、本明細書で使用される補酵素Ａの量は、補酵素Ａ：ルシフェラーゼの比として本発明のシーケンシング混合物および溶液に添加することができ、シーケンシング反応における、ＡＴＰ再生酵素／ルシフェラーゼ増幅ループのシグナル強度を増加させるのに有効である。いくつかの実施形態では、本明細書での使用が企図される適切な補酵素Ａ：ルシフェラーゼ比は、１：１、１：２、１：５、１：１０、１：２０、１：３０、１：４０、１：５０、１：６０、１：７０、１：８０、１：９０、１：１００、１：２５０、１：１５０、１：１７５、１：２００、１：２２５、１：２５０、１：２７５、１：３００、１：３５０、１：４００、１：４５０、１：５００、１：５５０、１：６００、１：６５０、１：７００、１：７５０、１：８００、１：８５０、１：９００、１：９５０、１：１０００、１：１５００、１：２０００、１：３０００、１：４０００、１：５０００の補酵素Ａ：ルシフェラーゼなどからなる群から選択できる。他の実施形態では、本明細書での使用が企図される、シーケンシング反応におけるＡＴＰ再生酵素／ルシフェラーゼ増幅ループのシグナルの強度を増加させるのに有効な適切なルシフェラーゼ：補酵素Ａ比は、１：１、１：２、１：５、１：１０、１：２０、１：３０、１：４０、１：５０、１：６０、１：７０、１：８０、１：９０、１：１００、１：２５０、１：１５０、１：１７５、１：２００、１：２２５、１：２５０、１：２７５、１：３００、１：３５０、１：４００、１：４５０、１：５００、１：５５０、１：６００、１：６５０、１：７００、１：７５０、１：８００、１：８５０、１：９００、１：９５０、１：１０００、１：１５００、１：２０００、１：３０００、１：４０００、１：５０００のルシフェラーゼ：補酵素Ａなどからなる群から選択できる。

本明細書中で使用されるとき、「ポリメラーゼ酵素」は、核酸合成を行うことを担う周知のタンパク質を指す。本明細書での使用に好ましいポリメラーゼ酵素は、ＤＮＡポリメラーゼである。天然のポリメラーゼ媒介核酸合成では、ポリメラーゼ酵素、テンプレート核酸配列、および合成プロセスの開始点として機能するプライミング配列の間で複合体が形成される。合成中、ポリメラーゼは反応混合物からヌクレオチドモノマーをサンプリングして、テンプレート配列の次の塩基に対するそれらの相補性を決定する。サンプリングされた塩基が次の塩基と相補的である場合、それは成長中の新生鎖に組み込まれる。このプロセスは、テンプレート配列の長さに沿って継続され、そのテンプレートを効果的に複製する。簡略化された概略図で説明されているが、実際の組み込みの生化学プロセスは比較的複雑である。組み込み生化学の図式的表現が図１４に提供されている。この図は、ヌクレオチド組み込みのメカニズムの完全な説明ではない。反応プロセス中に、ポリメラーゼ酵素は一連の構造変化を起こすが、これはメカニズムの重要なステップである可能性がある。

図１４に示すように、合成プロセスは、ステップ２で、プライミングされた核酸テンプレート（Ｄ）がポリメラーゼ（Ｐ）に結合することから始まる。複合体とのヌクレオチド（Ｎ）結合は、ステップ４で発生する。ステップ６は、ポリメラーゼの開いた構造から閉じた構造への異性化を表す。ステップ８は、ヌクレオチドが成長中の鎖に組み込まれる化学ステップである。ステップ１０で、ポリメラーゼの閉じた位置から開いた位置への異性化が起こる。組み込み時に切断されるポリリン酸成分は、ステップ１２で複合体から放出される。図はピロリン酸の放出を示しているが、標識されたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体が使用される場合、放出される成分はピロリン酸塩とは異なる場合があることが理解されよう。多くの場合、本発明のシステムおよび方法は、放出された成分が色素に結合したポリリン酸（例えば、標識ピロリン酸；ＰＰｉ）を含むように、その末端リン酸に標識を有するヌクレオチド類似体を使用する。天然のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の基質を使用すると、ステップ１４でポリメラーゼがテンプレート上を転移する。転移後、ポリメラーゼは別のヌクレオチドを追加し、反応サイクルを回して継続する位置にある。

本明細書での使用に適したポリメラーゼ酵素は、例えば、Ｅ．ｃｏｉｌ Ｐｏｌ Ｉ（クラスＡ）、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐｏｌ ＩＩ（クラスＢ）、Ｅ．ｃｏｉｌ Ｐｏｌ ＩＩＩ（クラスＣ）、Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔｉｃ Ｐｏｌ ＩＩ（クラスＤ）、ヒトＰｏｌベータ（クラスＸ）、およびＥ．ｃｏｉｌ ＵｍｕＣ／ＤｉｎＢおよび真核生物ＲＡＤ３０／色素性乾癬バリアント（クラスＹ）のような、様々な系統発生関係に基づいて６つの主要なグループに分類することができるＤＮＡポリメラーゼが含まれる。命名法の概説については、例えば、ＢＢｕｒｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２００１）“Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ：ｐｒｏｐｏｓａｌ ｆｏｒ ａ ｒｅｖｉｓｅｄ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ”Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７６（４７）：４３４８７−９０を参照されたい。ポリメラーゼの概説については、例えば、それぞれがその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｕｂｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００２）“Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ”Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．７１：１３３−１６３；Ａｌｂａ（２００１）“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆａｍｉｌｙ Ｒｅｖｉｅｗ：Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ”Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２（１）：ｒｅｖｉｅｗｓ ３００２．１−３００２．４；およびＳｔｅｉｔｚ（１９９９）“ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ：ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｃｏｍｍｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ”Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７４：１７３９５−１７３９８を参照されたい。多くのポリメラーゼの基本的な作用機序が決定されている。文字通り何百ものポリメラーゼの配列が公に利用可能であり、これらの多くの結晶構造が決定されているか、または相同なポリメラーゼの解明された結晶構造との類似性に基づいて推測することができる。

核酸シーケンシングに適した多くのそのようなポリメラーゼは容易に入手可能である。例えば、ヒトＤＮＡポリメラーゼベータはＲ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓから入手できる。本明細書での使用に適したＤＮＡポリメラーゼには、Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈおよび多くの他の製造者から入手可能なＤＮＡポリメラーゼＩが含まれる。ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントは、例えば、Ａｍｂｉｏｎ、Ｃｈｉｍｅｒｘ、ｅＥｎｚｙｍｅ ＬＬＣ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈおよび多くの他の製造者から、組換えとプロテアーゼ消化バージョンの両方で入手できる。ＰＨＩ．２９ ＤＮＡポリメラーゼは、例えばＥｐｉｃｅｎｔｒｅから入手できる。ポリＡポリメラーゼ、逆転写酵素、シーケナーゼ、ＳＰ６ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、および様々な熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ、ホットスタート、チタンＴａｑなど）は、これらおよびその他の様々なソースから入手できる。その他の市販のＤＮＡポリメラーゼには、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから入手できるＰｈｕｓｉｏｎｈＭ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ポリメラーゼ、Ｐｒｏｍｅｇａから入手可能なＧｏＴａｑ（登録商標）Ｆｌｅｘｉ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能なＲｅｐＩｉＰＨＩ（商標）ＰＨＩ．２９ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なＰｆｕＵｌｔｒａ（商標）Ｈｏｔｓｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｎｏｖａｇｅｎから入手可能なＫＯＤ ＨｉＦｉ ＤＮＡ ポリメラーゼ、および多くの他のものが含まれる。

利用可能なＤＮＡポリメラーゼ酵素は、エキソヌクレアーゼ活性を低減または排除すること（多くの天然のＤＮＡポリメラーゼには、例えば、シーケンシングアプリケーションに干渉するプルーフリーディングエキソヌクレアーゼ機能がある）、クレノウフラグメントなどのプロテアーゼ消化酵素フラグメントを組換え体にすることにより、生成を簡素化することなど、様々な方法で改変されている。前述のように、ポリメラーゼ−ＤＮＡ−ヌクレオチド複合体における標識ヌクレオチドの特異性、処理能力、および保持時間の改善をもたらすため（例えば、ＨａｎｚｅｌらによるＷＯ２００７／０７６０５７ ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥＳ ＦＯＲ ＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ ＡＮＡＬＯＧＵＥ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮおよびＲａｎｋらによるＷＯ２００８／０５１５３０ ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥ ＥＮＺＹＭＥＳ ＡＮＤ ＲＥＡＧＥＮＴＳ ＦＯＲ ＥＮＨＡＮＣＥＤ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ）、分岐画分と転移を改変するため（例えば、Ｐｒａｎａｖ Ｐａｔｅｌらによる「ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥＳ ＡＮＤ ＲＥＡＣＴＩＯＮ ＣＯＮＤＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＭＯＤＩＦＩＥＤ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ」という名称の２００９年９月４日に出願された米国特許出願第１２／５８４，４８１号）、光安定性を増加させるため（例えば、Ｋｅｉｔｈ Ｂｊｏｒｎｓｏｎらによる、「Ｅｎｚｙｍｅｓ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ Ｐｈｏｔｏｄａｍａｇｅ」という名称の２００９年３月３０日に出願された米国特許出願第１２／３８４，１１０号）、ならびに表面固定化酵素活性を改善するため（例えば、ＨａｎｚｅｌらによるＷＯ２００７／０７５９８７ ＡＣＴＩＶＥ ＳＵＲＦＡＣＥ ＣＯＵＰＬＥＤ ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥＳおよびＨａｎｚｅｌらによるＷＯ２００７／０７６０５７ ＰＲＯＴＥＩＮ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＳＴＲＡＴＥＧＩＥＳ ＴＯ ＯＰＴＩＭＩＺＥ ＡＣＴＩＶＩＴＹ ＯＦ ＳＵＲＦＡＣＥ ＡＴＴＡＣＨＥＤ ＰＲＯＴＥＩＮＳ）に、ポリメラーゼも修飾されている。これらの利用可能なポリメラーゼのいずれも本発明に従って修飾して、分枝画分の形成を減少させ、閉じたポリメラーゼ−ＤＮＡ複合体の安定性を改善し、かつ／または反応速度定数を変更することができる。

分岐画分を減少させるため、閉じた複合体の安定性を増加させるため、または反応速度定数を変更するための変異の好ましい基質であるＤＮＡポリメラーゼには、Ｔａｑポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ欠損Ｔａｑポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｉｌ ＤＮＡポリメラーゼ１、クレノウフラグメント、逆転写酵素、野生型ＰＨＩ−２９ポリメラーゼおよびエキソヌクレアーゼ欠損型などのそのようなポリメラーゼの誘導体を含むＰＨＩ−２９関連ポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＢ６９ポリメラーゼなどが含まれる。

さらに、例えば２００９年３月３０日に出願された米国特許出願第１２／３８４，１１０号に教示されているように、光安定性を高めるため、例えばＷＯ２００７／０７５９８７およびＷＯ２００７／０７６０５７で教示されるように、表面への結合時の酵素の活性を向上させるため、または引用された参考文献で教示され、当該技術分野で一般的であるように、精製または取り扱いタグを含めるためなど、用途固有の理由でポリメラーゼをさらに修飾することができる。同様に、本明細書に記載の修飾ポリメラーゼは、他の戦略と組み合わせて使用して、ポリメラーゼの性能、例えば、２００９年３月３０日に出願され、「Ｔｗｏ ｓｌｏｗ−ｓｔｅｐ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｅｎｚｙｍｅ ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ」という名称の、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第１２／４１４，１９１号に教示されるように、ポリメラーゼ速度定数を制御するための反応条件を改善することができる。

単一分子反応で長いリード長を達成する方法
長いリード長を達成する能力は、既存のシーケンシング法のとらえどころのない目標であった。全ての最新のシーケンシングアプローチは、長いリード長を達成する能力に制限がある。特に、単一分子シーケンシング法の場合、この制限は、テンプレートＤＮＡに対するポリメラーゼの相対的親和性に起因する。シーケンシング反応の間、ポリメラーゼは最終的にテンプレートＤＮＡから落ち、それにより、それぞれのリード長でｄＮＴＰ鎖伸長反応を停止する。例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＳＭＲＴ技術では、細胞ごとに１つのテンプレートと１つのポリメラーゼがある。これらの単一のポリメラーゼシーケンシング反応では、単一のポリメラーゼがテンプレートから解離する（離れる）と、その特定のリード長は、典型的に、約７００塩基対（ｂｐ）と考えられるものに対応する比較的短いリード長で終了する。

本明細書で提供されるのは、本発明に従って、テンプレート核酸をシーケンシングする方法であって、
標的テンプレート核酸、複数の種類のヌクレオチド類似体、および複数のポリメラーゼ酵素を含むシーケンシング混合物を提供することと、
複数のヌクレオチド類似体がテンプレートに逐次的に追加されるように核酸合成を実行することと、
核酸合成が行われている間にそれぞれのヌクレオチド類似体を検出して、テンプレート核酸の配列を決定することと、を含む、方法である。

本明細書中で使用されるとき、「複数のポリメラーゼ酵素」、「複数のポリメラーゼ」という語句またはそれらの文法的変形は、単一のシーケンシング反応混合物において使用されるポリメラーゼ酵素の数を指す。「複数のポリメラーゼ酵素」におけるポリメラーゼの量は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００、１０００００、２０００００、３０００００、４０００００、５０００００、６０００００、７０００００、８０００００、９０００００、および少なくとも１００００００のポリメラーゼ酵素からなる群から選択できる。標的核酸テンプレートを連続的にシーケンシングする他の実施形態では、ポリメラーゼ対テンプレートの比は、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、１５０：１、２００：１、２５０：１、３００：１、３５０：１、４００：１、４５０：１、５００：１、５５０：１、６００：１、６５０：１、７００：１、７５０：１、８００：１、８５０：１、９００：１、９５０：１、１０００：１、１００００：１、２００００：１、３００００：１、４００００：１、５００００：１、６００００：１、７００００：１、８００００：１、９００００：１、１０００００：１、２０００００：１、３０００００：１、４０００００：１、５０００００：１、６０００００：１、７０００００：１、８０００００：１、９０００００：１、および少なくとも１００００００：１からなる群から選択される。複数のポリメラーゼは、同じ種類のポリメラーゼの均質な集まりであり得るか、または２つ以上の異なる種類のポリメラーゼ、例えば３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０から１００以上の異なる複数のポリメラーゼの不均質な集まりであり得る。

一実施形態では、単一のシーケンシング反応混合物は、その中でシーケンシングされる唯一の（単一の）標的テンプレート核酸を有する。他の実施形態では、単一のシーケンシング反応混合物は、その中でシーケンシングされる１つを超える、または複数（ｍｕｌｔｉｐｌｅ）、または複数（ｐｌｕｒａｌｉｔｙ）の標的テンプレート核酸を有する。特定の実施形態では、１つの標的テンプレート核酸は、個々の光閉じ込めで提供される。

本発明のＦＬＡＳＨ（登録商標）シーケンシング法のいくつかの実施形態では、酵素が特定の個別の閉じ込め（例えば、液滴など）で提供されるため、閉じ込め領域にはテンプレート標的核酸が１つだけ存在し、一方で複数（例えば、多く）のポリメラーゼ酵素および連結物を形成する対応する複数の他の酵素が存在する（図９）。この実施形態では、ポリメラーゼ酵素が標的テンプレート核酸から落ちる（解離する）とき（図１１Ｂ）、特定の標的核酸テンプレート領域に限定された他の多数のポリメラーゼの１つが、以前のポリメラーゼが中断または解離したテンプレート上の位置で有利にそして比較的すぐにその鎖伸長を開始する（図１１Ｂ）。換言すると、シーケンシング鎖伸長は、第１のポリメラーゼ酵素がテンプレート核酸から解放されて解離するまで第１のポリメラーゼ酵素で発生し、次いで、シーケンシング鎖伸長反応は、第２のポリメラーゼ（最初のものとは異なる）がテンプレート核酸から解放されて解離するまで第２のポリメラーゼで継続し、次いで、シーケンシング鎖伸長反応は、第３のポリメラーゼ（第２のポリメラーゼとは異なり、特定のシーケンシング反応の第１のポリメラーゼまたは複数のポリメラーゼの別のポリメラーゼであり得る）がテンプレート核酸から解放されて解離するまで第３のポリメラーゼで継続するなどである。当業者は、このアプローチを使用すると、シーケンシング反応が行われている限り、標的核酸テンプレートが連続的にシーケンシングされることを容易に理解するであろう。当業者はまた、本明細書に開示されるシーケンシングの実質的に連続的な方法を使用する場合、そのリード長は、標的核酸の長さおよび／またはそれぞれの鎖伸長反応に使用される反応閉じ込め領域の物理的サイズによってのみ制限されることを容易に理解するであろう。

したがって、本明細書で提供されるのは標的核酸テンプレートを連続的にシーケンシングする方法である。この実施形態では、本明細書で使用される「連続性」、「標的核酸テンプレートを連続的にシーケンシングする」こと、または「標的核酸テンプレートを実質的に連続的にシーケンシングすること」は、単一のポリメラーゼが特定の標的核酸を全体の長いリード長について連続的にシーケンシングできることを意味しないが、標的核酸テンプレートの反応領域にある複数のポリメラーゼ酵素が、それらの間でまとめられて、以前のポリメラーゼが特定の標的核酸テンプレートから解離した次のヌクレオチドでｄＮＴＰ鎖伸長を引き継ぐために利用可能な複数のポリメラーゼ酵素により、特定の標的を連続的にシーケンシングできることを意味する。

本発明の連続的ＦＬＡＳＨ（登録商標）シーケンシング法の特定の実施形態では、特に複数のポリメラーゼが単一の標的テンプレート核酸をシーケンシングするために使用される場合、全体のリード長は、特定の反応閉じ込め領域に提供される標的テンプレート核酸の長さによってのみ制限される。例えば、単一の標的核酸テンプレート上で複数のポリメラーゼを使用することによって達成することができる、本明細書で企図される全体のリード長は、染色体全体の長さ、例えば、５０００万〜約３億塩基対（例えば、３００Ｍｂｐ）などまでである。本明細書で企図される他の特定の実施形態では、本発明のシーケンシング方法により達成されるリード長は、少なくとも２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１０００ｂｐ（すなわち、１ｋｂｐ）、５ｋｂｐ、１０ｋｂｐ、２０ｋｂｐ、３０ｋｂｐ、４０ｋｂｐ、５０ｋｂｐ、１００ｋｂｐ、２００ｋｂｐ、３００ｋｂｐ、４００ｋｂｐ、５００ｋｂｐ、６００ｋｂｐ、７００ｋｂｐ、８００ｋｂｐ、９００ｋｂｐ、１０００ｋｂｐ（１Ｍｂｐ）、５Ｍｂｐ、１０Ｍｂｐ、２０Ｍｂｐ、５０Ｍｂｐ、７５Ｍｂｐ、１００Ｍｂｐ、２００Ｍｂｐ、３００Ｍｂｐ、４００Ｍｂｐ、５００Ｍｂｐ、６００Ｍｂｐ、７００Ｍｂｐ、８００Ｍｂｐ、９００Ｍｐｂ、１０００Ｍｂｐからなる群から選択できる。

複数のポリメラーゼによる標的テンプレート核酸の実質的に連続したシーケンシングのため、反応は、特定のリード長を達成する単一の酵素の能力によって制限されない。これは、本発明の方法において、より高い特異性および低いエラー率を有する酵素の使用を可能にする。本発明のシーケンシングのＦＬＡＳＨ（登録商標）法の特定の実施形態によれば、１つのテンプレートおよび１つを超えるポリメラーゼ（すなわち、複数）を使用して無限に長いリード長を達成できることが本明細書で企図される。本明細書に記載されるように、あるポリメラーゼが標的テンプレート核酸から脱落するとき、別のポリメラーゼは前のポリメラーゼが中断したところから続き、本発明のＦＬＡＳＨ（登録商標）シーケンシング法で行うためにポリメラーゼを選択または最適化できる方法を有利に変更する。この理由から、当業者は、たとえポリメラーゼが比較的短いリード長を有しても、非常に低いエラー率を有するポリメラーゼを選択することができる。これは、本発明のシーケンシング方法で使用するために選択されたポリメラーゼが長いリード長と特異性の両方を必要としないという点で、この特定の実施形態に利点を提供する。

本明細書で使用されるとき、「テンプレート核酸」または「標的テンプレート核酸」という語句は、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡヘアピン、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、重合剤の結合の認識部位を有するＲＮＡ、およびＲＮＡヘアピンを含む任意の適切なポリヌクレオチドを指す。さらに、本発明のシーケンシング方法での使用のためのテンプレート核酸として適切な標的ポリヌクレオチドは、イントロン、調節領域、対立遺伝子、バリアント、または変異などの細胞のゲノムの特定の部分、全ゲノム、またはその一部であり得る。他の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、アンチセンスＲＮＡ、またはＲＮＡｉであり得る。単一のポリメラーゼのみが特定の標的をシーケンシングするための使用が企図される他の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、約１０塩基〜約１００，０００塩基、約１０，０００塩基〜約９０，０００塩基、約２０，０００塩基〜約８０，０００塩基、約３０，０００塩基〜約７０，０００塩基、約４０，０００塩基〜約６０，０００塩基、またはそれ以上、約１０，０００〜５０，０００塩基である典型的な範囲などの任意の長さであってよい。また、本明細書では、この特定の単一のポリメラーゼの実施形態において、約１００塩基〜１０，０００塩基の標的テンプレート核酸長が企図されている。

本発明のテンプレート核酸はまた、ＰＮＡ、修飾オリゴヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−メチル化オリゴヌクレオチドなどの生物学的ＲＮＡまたはＤＮＡに典型的ではないヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド）、修飾リン酸バックボーンなどの非天然核酸を含むことができる。核酸は、例えば、一本鎖または二本鎖であり得る。

本明細書中で使用されるとき、「ヌクレオチド類似体」という語句は、ＤＮＡ合成において使用され得る修飾ヌクレオチド（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＵＴＰなどの修飾ｄＮＴＰ）を指す。本発明で使用するためのヌクレオチド類似体は、ポリメラーゼおよび選択的切断活性の基質となり得る任意の適切なヌクレオチド類似体であり得る。ヌクレオチドを修飾しても、ポリメラーゼおよび他の酵素の基質として依然として使用できることが示されている。ヌクレオチド類似体のバリアントが企図される場合、ポリメラーゼとの、またはエキソヌクレアーゼ活性などの別の酵素活性とのヌクレオチド類似体の適合性は、活性アッセイによって決定することができる。活性アッセイの実施は簡単であり、当該技術分野でよく知られている。

ヌクレオチド類似体は、例えば、成長中の鎖への組み込み時に切断されるポリリン酸鎖の部分に標識を有する、そのポリリン酸鎖中に３つ以上のリン酸を有するヌクレオシドポリリン酸であり得る。ポリリン酸は、純粋なポリリン酸、例えば、−−Ｏ−−ＰＯ３−またはピロリン酸（例えば、ＰＰｉ）であり得るか、またはポリリン酸塩は、置換を含み得る。類似体およびそのような類似体を作製する方法に関するさらなる詳細は、あらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，４０５，２８１号、同第９，４６４，１０７号などに見出すことができる。

代替のラベリング戦略では、ナノスケール領域での半導体の構成とサイズに起因する固有の蛍光能力を有する蛍光または発光ナノ粒子、例えばナノ結晶、すなわち量子ドットなどの無機材料を標識部分として使用できる（例えば、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，８６１，１５５号、同第６，６９９，７２３号、同第７，２３５，３６１号を参照されたい）。そのようなナノ結晶材料は、一般に、例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ Ｃａｌｉｆ．）から市販されている。同様に、そのような化合物は、個々の標識基として、または例えば他の無機ナノ結晶または有機フルオロフォアとの相互作用基または対として存在し得る。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ＥＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａ１）、シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ、セルリアン、ＣｙＰｅｔ）、および黄色蛍光タンパク質誘導体（ＹＦＰ、シトリン、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ）などの蛍光タンパク質を使用できる。同様に、本明細書での使用が企図されるのは、全ての目的でその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｒｕｔｚｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｃｙｔｏｍ．２０１１ Ｊａｎｕａｒｙ；ＣＨＡＰＴＥＲ：Ｕｎｉｔ−６．３１．（ｄｏｉ：１０．１００２／０４７１１４２９５６．ｃｙ０６３１ｓ５５．）に記載されているような、検出のために複数の色分けされたシグナルを生成する多極蛍光色素を使用する蛍光細胞バーコードである。

好ましい実施形態では、ヌクレオチド類似体は、フルオロフォアを末端リン酸に添加することにより修飾され（例えば、全ての目的でその全体が参照により本明細書に組み入れられるＹａｒｂｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５４：１２０６９−１２０７３，１９７９を参照されたい）、ヌクレオチド類似体がテンプレート鎖に組み込まれたときにＰＰｉ標識脱離基（例えば、ＰＰｉ＋ＦＬ）がポリメラーゼによって生成される場合、図１Ｂおよび１Ｃに示すように、その標識ピロリン酸は、ＡＴＰスルフリラーゼによりアデノシン５’ホスホ硫酸と組み合わせて標識ＡＴＰ（ＡＴＰ＋ＦＬ）を形成することができる。４種類のｄＮＴＰ、すなわちデオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、およびデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）が存在する。ｄＡＴＰαＳはＤＮＡポリメラーゼの基質として機能するが、ルシフェラーゼの基質としては機能しないので、ｄＡＴＰの代わりに、ｄＡＴＰの代替としてｄＡＴＰαＳを使用できる可能性がある。本明細書に開示される本発明の方法の好ましい実施形態では、それぞれの各ｄＮＴＰは、ポリメラーゼがテンプレートＤＮＡに相補的な鎖に修飾されたデオキシリボヌレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）ヌクレオチド類似体を組み込むたびに、他のｄＮＴＰに対して異なる固有のフルオロフォアを使用して修飾され、ヌクレオチドのクラスまたは種類に特異的な結合した蛍光シグナル（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＡＴＰαＳ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＣＴＰ、または当該技術分野でよく知られている他の修飾ヌクレオチドのそれぞれに対する固有のシグナル）が生成される。本明細書での使用が企図される他の修飾ヌクレオチドは、Ｊｏｒｄｈｅｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｖｉｒａｌ ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．（２０１３）１２：４４７−４６４；ａｎｄ Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．Ｆｏｕｒ−ｃｏｌｏｒ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｗｉｔｈ ３′−Ｏ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｃｌｅａｖａｂｌｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｄｉｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（２００８）１０５：９１４５−９１５０など（この各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるようなものである。

特定の実施形態では、本明細書で使用するための例示的なヌクレオチド類似体、または標識されたｄＮＴＰには、以下が含まれる：
ＡＴＴＯ６８０、トリエチルアンモニウムで標識されたガンマ−（６−アミノヘキシル）−２’−デオキシアデノシン−５’−三リン酸；
ＡＴＴＯ６８０、トリエチルアンモニウム塩で標識されたガンマ−（６−アミノヘキシル）−２’−デオキシシチジン−５’−三リン酸；
ＡＴＴＯ６８０、トリエチルアンモニウム塩で標識されたガンマ−（６−アミノヘキシル）−２’−デオキシチミジン−５’−三リン酸；
ガンマ−［（６−アミノヘキシル）イミド］−ｄＧＴＰ−ＡＴＴＯ−６４７Ｎ；
ガンマ−［（６−アミノヘキシル）イミド］−ｄＧＴＰ−Ｃｙ５；
ガンマ−（６−アミノヘキシル）−ｄＧＴＰ−Ｃｙ５；
Ａｌｅｘａ７００、トリエチルアンモニウム塩で標識されたガンマ−（６−アミノヘキシル）−２’−デオキシチミジン−５’−三リン酸；
Ａｌｅｘａ６６０、トリエチルアンモニウム塩で標識されたガンマ−（６−アミノヘキシル）−２’−デオキシアデノシン−５’−三リン酸；
ＡＴＴＯ７００、トリエチルアンモニウム塩で標識されたガンマ−（６−アミノヘキシル）−２’−デオキシチミジン−５’−三リン酸など。

さらに他の実施形態では、ｄＡＴＰαＳ、ｄＧＴＰαＳ、ｄＣＴＰαＳ、ｄＴＴＰαＳがｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＴＴＰの代わりに使用され、これはヌクレオチドとポリメラーゼ以外の酵素（例えばルシフェラーゼ）との非特異的相互作用を低減することが本明細書で企図される。

各ヌクレオチドは、ポリメラーゼ酵素によって相補鎖に結合されている間、固有の蛍光シグナル（例えば、赤、黄、緑、または青など）を効果的に生成する。以前に取り付けられたヌクレオチド類似体の３’部分へのヌクレオチド類似体の結合が完了すると、その後の標識ＡＴＰおよび発光反応の結果、標識されたピロリン酸脱離基（例えば、蛍光ピロリン酸；ＰＰｉ＋ＦＬ）は、それぞれの発光反応の控えめで限定された期間中に、適切な蛍光センサーおよび／または検出デバイスによって検出される（図１Ｆ）。

本明細書で提供される本発明の連結３−酵素系およびポリメラーゼ−ＡＴＰスルフリラーゼ−ルシフェラーゼの方法を使用すると、ヌクレオチドの特定の種類を示す特定のシグナルは、ヌクレオチドとポリメラーゼ−ＡＴＰスルフリラーゼ−ルシフェラーゼとの特定の相互作用中にのみ生成される。ポリメラーゼ前後の相互作用状態は類似し、シグナルは、ポリメラーゼとの相互作用中に「変化」する。例えば、本明細書に記載の一実施形態では、
１−最初は外部光励起がないため、バックグラウンド蛍光がないか、非常に低い。
２−本発明の方法のポリメラーゼ−ＡＴＰスルフリラーゼ−ルシフェラーゼ相互作用の間に、特定の種類の蛍光が生成される。
３−それぞれの発光反応が停止した後、標識されたピロリン酸シグナル（ＰＰｉ＋ＦＬ）は初期状態に戻る。

本明細書で使用されるとき、「標識脱離基」という語句は、テンプレート核酸鎖への各ｄＮＴＰの組み込み中の本発明の３酵素ポリメラーゼ−ＡＴＰスルフリラーゼ−ルシフェラーゼ反応による開裂時および／または開裂の際にそれぞれのｄＮＴＰから放出される標識、例えばフルオロフォアなどが付着したポリリン酸鎖を指す。本明細書の特定の実施形態では、ポリリン酸は、ｄＮＴＰ（図１Ａおよび１Ｂ）から切断され、標識ＡＴＰ（ＡＴＰ＋ＦＬ；図１Ｂおよび１Ｃ）に変換され、その後、本明細書に記載されているように、それぞれの控えめな、限定された期間の発光反応（図１Ｆを参照されたい）の終了前の後続の蛍光検出のために、ルシフェラーゼ反応（図１Ｄ−１Ｆ）を介して反応混合物に放出される、蛍光標識ピロリン酸（ＰＰｉ＋ＦＬ）である。

本明細書に記載されているように、この蛍光標識されたピロリン酸（ＰＰｉ＋ＦＬ）は、ＡＴＰスルフリラーゼ／ルシフェラーゼ増幅ループで何度も図１Ｂにループバックし、その後、図１Ｇに示すＰｉ＋ＦｌおよびＰｉに変換（分解）される。蛍光標識されたピロリン酸（ＰＰｉ＋ＦＬ）をループバックして、伸長配列への各ｄＮＴＰ組み込みのそれぞれの蛍光シグナルを増幅できる回数は、少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００、１０００００、２０００００、３０００００、４０００００、５０００００、６０００００、７０００００、８０００００、９０００００、および少なくとも１００００００回からなる群から選択できる。

使用する反応条件も、様々な反応の相対速度に影響を与える可能性がある。したがって、反応条件の制御は、シーケンシング法がテンプレート内の塩基を高速で呼び出すことに成功することを保証するのに役立つ。反応条件には、例えば、緩衝液の種類および濃度、反応のｐＨ、温度、塩の種類および濃度、酵素の反応速度に影響を与える特定の添加剤の存在、ならびに金属補因子を含む様々な補因子の種類、濃度、および相対量が含まれる。ポリメラーゼの２つの遅いステップの挙動を達成または増強するための反応条件の操作は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，１３３，６７２号に詳細に記載されている。

酵素反応はしばしば、一部は反応混合物のｐＨを制御するために使用される緩衝液の存在下で実行される。緩衝液の種類は、場合によっては、ポリメラーゼ反応の速度論に影響を与える可能性があり、２つの遅いステップの反応速度が望まれる場合、それは２つの遅いステップの反応速度をもたらし得る。例えば、場合によっては、緩衝液としてＩＲＩＳを使用すると、２つの遅いステップの反応を得ることができる。適切な緩衝液には、例えば、ＴＡＰＳ（３−｛［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝プロパンスルホン酸）、Ｂｉｃｉｎｅ（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン）、ＩＲＩＳ（トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン）、ＡＣＥＳ（Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸）、Ｔｒｉｃｉｎｅ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン）、ＨＥＰＥＳ ４−２−ヒドロキシエチル−１−ピペラジンエタンスルホン酸）、ＴＥＳ（２−｛［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝エタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸））、およびＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）が含まれる。

反応のｐＨは、ポリメラーゼ反応の反応速度に影響を与える可能性があり、２つの遅いステップの反応速度を示す反応を得るために、ポリメラーゼ反応条件の１つとして使用できる。ｐＨは、２つの遅いステップの反応メカニズムを生成する値に調整できる。ｐＨは一般に約６〜約９である。いくつかの実施形態では、ｐＨは約６．５〜約８．０である。他の実施形態では、ｐＨは約６．５〜７．５である。特定の実施形態では、ｐＨは、約６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、または７．５から選択される。

反応の温度は、反応の相対速度が適切な範囲で発生するように調整できる。反応温度は、使用するポリメラーゼの種類または選択的切断活性に依存する可能性がある。本明細書で使用される温度はまた、２つの塩基間の水素結合、ならびに反応混合物中の水との塩基の相互作用を操作および制御し、それによって反応成分の溶解度を制御することも企図される。

いくつかの実施形態では、マグネシウム、補酵素Ａなどの添加剤を、反応の速度論に影響を与えるであろう反応混合物に添加することができる。場合によっては、添加剤は酵素の活性部位と相互作用し、例えば競合阻害剤として作用できる。場合によっては、添加剤は、反応の速度に影響を与える方法で、活性部位から離れた酵素の部分と相互作用することができる。反応速度に影響を与える可能性のある添加剤には、例えば、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，２５２，９１１号に記載されているように、反応速度を調節するための分析反応における競合的であるがさもなければ非反応性の基質または阻害剤が含まれる。

別の例として、重水素などの同位体を追加して、ポリメラーゼ反応の１つまたは複数のステップの速度に影響を与えることができる。場合によっては、重水素同位体効果により、重水素を使用して、ポリメラーゼ反応の１つまたは複数のステップを遅くすることができる。ポリメラーゼ反応のステップの反応速度を変えることにより、いくつかの例では、本明細書に記載されるように、２つの遅いステップの反応速度を達成することができる。重水素同位体効果は、例えば、組み込み速度を遅くすることにより、例えば、ヌクレオチドの組み込み速度を制御するために使用することができる。重水素以外の同位体、例えば、炭素（例えば１３Ｃ）、窒素、酸素、硫黄、またはリンの同位体も使用できる。

さらに別の例として、ポリメラーゼ反応の反応速度を制御するために使用できる添加剤には、有機溶媒の添加が含まれる。溶剤添加剤は一般に水溶性有機溶剤である。溶媒は全ての濃度で可溶性である必要はないが、一般に、ポリメラーゼ反応の反応速度を制御するために使用される量で可溶性である。理論に拘束されるわけではないが、溶媒は、ポリメラーゼ反応の様々なステップの速度に影響を与える可能性があるポリメラーゼ酵素の三次元構造に影響を与える可能性があると考えられている。例えば、溶媒は、異性化ステップなどの構造変化を含むステップに影響を与える可能性がある。添加された溶媒もまた、転位ステップに影響を及ぼし、場合によっては遅延させる可能性がある。場合によっては、溶媒は水素結合相互作用に影響を与えることによって作用する。

単一分子シーケンシングにおけるポリメラーゼ反応の１つまたは複数のステップの速度を制御するために使用できる水混和性有機溶媒には、例えば、アルコール、アミン、アミド、ニトリル、スルホキシド、エーテル、およびエステル、ならびにこれらの官能基を１つを超えて有する小分子が含まれる。例示的な溶媒には、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、グリセロール、および小アルコールなどのアルコールが含まれる。アルコールは、１、２、３、またはそれ以上のアルコール基を有し得る。例示的な溶媒には、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）およびジオキサン、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、およびアセトニトリルなどの小分子エーテルも含まれる。

水混和性有機溶媒は、ポリメラーゼ反応の反応速度を制御するのに十分な任意の量で存在することができる。溶媒は、一般に、ｗ／ｗまたはｖ／ｖで溶媒の４０％未満の量で添加される。いくつかの実施形態では、溶媒は、約０．１％〜３０％、約１％〜約２０％の間、約２％〜約１５％の間、および約５％〜１２％で添加される。動力学を制御するための有効量は、本明細書に記載されている方法および当該技術分野で知られている方法によって決定することができる。

ポリメラーゼ反応条件を制御する別の態様は、補因子の種類、レベル、および相対量の選択に関する。例えば、ポリメラーゼ反応の過程で、マグネシウムやマンガンなどの二価の金属補因子が酵素−基質複合体と相互作用し、活性部位の定義に構造的な役割を果たす。ポリメラーゼ反応における金属補因子相互作用の議論については、例えば、Ａｒｎｄｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００１）４０：５３６８−５３７５を参照されたい。適切な条件には、米国特許第８，２５７，９５４号に記載されているものが含まれ、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み入れられる。

本発明の方法の特定の実施形態では、ポリメラーゼ反応の速度および忠実度は、ポリメラーゼが基質濃度、光励起の量、化学修飾のレベルなどのパラメータに関して理想に近い条件で作動するように、ｄＮＴＰヌクレオチド類似体の濃度を調整することによって制御される。したがって、本明細書では、ポリメラーゼ酵素は、自然環境で達成されるＤＮＡ合成長と同様に、その最大リード長、例えば約数万塩基対に達することが企図される。これにより、装置の複雑さが低減され、酵素の感度と特異性が高まり、低いエラー率と低いカバレッジをもたらす。これにより、装置のコストとゲノムあたりのコストが低減されるだけでなく、非常にコンパクトなシステムで塩基多型検出、構造変化、ゲノムアセンブリなどのアプリケーションが可能になる。

別の実施形態では、上記のように、標識ＡＴＰ酵素（例えば、ＡＴＰスルフリラーゼ）およびポリメラーゼの速度は、酵素の種類および供給源に応じて大幅に変動する可能性があるため、本明細書で使用されるＡＴＰスルフリラーゼ反応による標識ＡＴＰ生成の速度は、ＡＴＰスルフリラーゼ濃度などの反応条件を調整することによって別々に調整することができる。

本発明は、核酸テンプレートのシーケンシングのためのシステムを含む。システムは、複数の核酸テンプレートを同時にシーケンシングすることを提供する。このシステムは、ここで説明する全ての試薬と方法を組み込むことができ、試料の封じ込め、発光反応からの励起光による試料の照明、それぞれのｄＮＴＰがポリメラーゼによってその同族のテンプレートＤＮＡに組み込まれると、標識ＡＴＰ類似体から切断された標識脱離基（例えば、ＰＰｉ＋ＦＬ）から強度対時間のデータを生成するためにシーケンシング中に試料から放出された光を検出すること、それぞれの標識された脱離基、例えば、フルオロフォアで標識されたピロリン酸から、経時的強度対時間データを使用してテンプレートの配列を決定することに必要な機器を提供する。

本明細書で使用されるとき、「光を検出すること」という語句は、例えば、そのような標識がそれらのそれぞれのシグナルを放出する励起状態にあるとき、フルオロフォア標識から放出される蛍光を検出するための周知の方法を指す。

本明細書で使用されるとき、「ピロホスファターゼ酵素」は、ピロリン酸塩から２つのリン酸イオンへの加水分解を触媒することに関与する周知のタンパク質を指す。本明細書で使用するための例示的なピロホスファターゼ酵素は、ＵＳ５，８４３，６６５に記載されているヒトピロホスファターゼ、Ｙａｎｇ，Ｚ ａｎｄ Ｗｅｎｓｅｌ，Ｔ Ｇ（１９９２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６７：２４６３４−４０，２４６４１−７に記載されているウシピロホスファターゼであり、それらのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれている。

本明細書で使用されるとき、「ＡＴＰ再生酵素／ルシフェラーゼループ」またはその文法的変形（例えば、ＡＴＰスルフリラーゼ／ルシフェラーゼループ、ＡＧＰＰａｓｅ／ルシフェラーゼループ、ＰＰＤＫ／ルシフェラーゼループなど）は、一般に、ＡＴＰ再生酵素とルシフェラーゼの間の酵素ループ（図１Ｂ〜１Ｇ）を指し、これにより、ルシフェラーゼによって触媒される発光反応に続いて、蛍光標識が付いたままの新しいピロリン酸分子（ＰＰｉ＋ＦＬ）が放出される（図１Ｆ）。この新しく放出されたＰＰｉ−ＦＬは、もう一度ＡＴＰ再生酵素（例えば、ＡＴＰスルフリラーゼ、ＡＧＰＰａｓｅ、ＰＰＤＫなど）の基質になり、これにより、ＡＴＰ再生酵素（ＡＴＰスルフリラーゼ、ＡＧＰＰａｓｅ、ＰＰＤＫなど）とルシフェラーゼ（図１Ｇ上）の間の酵素ループを生じる。図１Ｂ〜１Ｇに示すように、このループにより、ＰＰｉ＋ＦＬはＡＴＰスルフリラーゼによってリサイクルされ、蛍光標識されたＡＴＰ（ＡＴＰ−ＦＬ）に変換され、次いでＰＰｉ−ＦＬを放出するルシフェラーゼによって触媒され得る。これは、標識されたピロリン酸から連続したシグナルを生成し、それによって最新のヌクレオチドのシーケンシングシグナルの増幅メカニズムとして機能する。

本明細書で使用されるとき、用語「共カプセル化」、カプセル化、またはその文法的変化形は、ルシフェラーゼおよびピロホスファターゼ（無機）などの２つ以上の酵素の、例えば、本明細書に記載されているメソポーラスナノマトリックスなどのカプセル（例えば、ナノマトリックスまたはナノ粒子）への組み込みを指す。

本明細書で使用されるとき、「ナノマトリックス」という用語は、酵素および反応物を限られた空間内にカプセル化できる密閉構造を形成する生体適合性またはポリマー材料から典型的に構成されるナノスケールのコーティング、構造または容器を指す。ナノマトリックスは全ての分子に対して透過性ではないが、代わりに分子の望ましいサブセットのみがその壁または膜を通過できる。例えば、ナノマトリックスは、特定の酵素を封入するナノマトリックス内でのみ特定の反応が起こり得るように、酵素を反応混合物内の特定の空間に閉じ込める。一実施形態では、封入される酵素は、ルシフェラーゼおよびピロホスファターゼ（例えば、無機物など）である。本明細書で使用するための例示的なナノマトリックスは、例えば、ＵＳ２０１／００６７１９１Ａ１およびＺｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ Ｂ（２０１８），ｗｗｗ／／ｄｌｉ．ｏｒｇ／１０／１０１６／ｊ．ａｐｓｂ．２０１８．０１．００７に記載されているもの、ならびにナノ粒子（例えば、メソポーラスシリカナノ粒子）などを含む。ナノマトリックスおよび／またはナノ粒子は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１６／００６７１９１Ａ１に記載されているように電荷を運ぶことができる。一実施形態では、ナノマトリックスは、負に帯電したナノ粒子である。

一実施形態では、シーケンシングのためのシステムは、一般に、例えば、独特の液滴などの中に複数の単一のポリメラーゼ酵素、単一のテンプレート、または単一のプライマーを有する基質を含む。高度に処理的な酵素ポリメラーゼ反応の場合、それぞれがポリメラーゼ酵素、核酸テンプレート、およびプライマーを含み、遺伝子合成の発生時にそれらのシグナルをそれぞれのヌクレオチドに割り当てることができるように一意に閉じ込められる。本明細書で提供される他の実施形態では、複数のポリメラーゼ酵素が、例えば、一意の閉じ込め、液滴など内で、単一のテンプレートおよび／または単一のプライマーと共に使用される。シーケンシング試薬は、一般に、２種類以上のヌクレオチド類似体、好ましくはｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＡＧＰおよびｄＣＴＰに対応する４つのヌクレオチド類似体を含み、各ヌクレオチド類似体は異なる標識で標識されている。ポリメラーゼは、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体をプライマーから伸長する成長している鎖に連続的に付加する。付加された各ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体は、テンプレート核酸上の対応する塩基に相補的であり、その結果、生成される成長する鎖の部分は、テンプレートに相補的である。

システムは、図１Ｂ〜１Ｆに記載されるように、テンプレート鎖に組み込まれ、さらに標識ＡＴＰ反応（ＡＴＰスルフリラーゼを介して）と発光反応（例えば、ホタルルシフェラーゼ＋ルシフェリン）を経験するので、それぞれのｄＮＴＰからの標識されたピロリン酸脱離基を照射するための発光試薬（例えば、ホタルルシフェラーゼおよびルシフェリン）を含む。発光反応は、切断された標識ピロリン酸（もはや標識ＡＴＰに結合されていない）上の標識を励起する波長範囲でそれぞれの標識脱離基を照らす（図１Ｅおよび１Ｆを参照されたい）。

システムはさらに、テンプレート鎖へのポリメラーゼ酵素媒介付加の間に、それぞれの標識されたＡＴＰ（ＡＴＰ＋ＦＬ；それぞれのｄＮＴＰに対応する）から切断された標識された脱離基からのシグナルを観察するための検出光学系を含む。検出光学系は、複数の単一分子ポリメラーゼシーケンス反応を同時に観察し、最終的に、本発明の連結３酵素（ポリメラーゼ−ＡＴＰスルフリラーゼ−ルシフェラーゼ）系で標識ＡＴＰから切断される標識脱離基（例えば、フルオロフォア標識ピロリン酸；ＰＰｉ）を介して、それぞれのヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体付加を観察する。観察された単一分子ポリメラーゼシーケンス反応のそれぞれについて、検出光学系は、控えめな限定された期間、それぞれの発光（例えば、ルシフェラーゼ／ルシフェリン）反応からの発光シグナルの減衰および終了により、それぞれのシグナルが停止するまで、それぞれのｄＮＴＰに対応するそれぞれの発光反応によって励起されるそれぞれのフルオロフォア標識を示す、標識された脱離基のそれぞれからのシグナルを同時に観察する。

システムはまた、それぞれの脱離基からの観測されたシグナルを使用して、成長する鎖に付加されるヌクレオチド類似体の種類を決定するように構成されたコンピュータを含む。これにより、標識された脱離基からの観察されたシグナルは、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の種類が成長している鎖に組み込まれているかどうかを示すために使用される。コンピュータは、一般に、観測されたシグナルに関する情報を、シグナルデータの形で検出光学系から受け取る。コンピュータは、塩基呼び出しの配列を生成するためにシグナルデータを使用して、シグナルデータを格納、処理、および解釈する。塩基呼び出しは、配列決定を支援するためにコンピュータに与えられた他の情報と組み合わされた、受信したシグナルデータからのテンプレートの配列のコンピュータによる推定を表す。

本発明で使用できる光学的検出システムは、例えば、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，８０２，４２４号、同第７，７１４，３０３号、および同第７，８２０，９８３号に記載されている。

本発明のプロセスを実施する際に使用するためのコンピュータは、Ｉｎｔｅｌ ＰｅｎｔｉｕｍまたはＤｕｏＣｏｒｅプロセッサを実行しているＰＣまたはＭａｃｉｎｔｏｓｈ（登録商標）種類のコンピュータのようなパーソナルコンピュータから、ＵＮＩＸ（登録商標）、ＬＩＮＵＸ、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）、またはその他のシステムを実行しているワークステーション、実験装置、または高速サーバーに至るまでに及ぶことができ、本発明のロジック処理は、ソフトウェアおよび／またはファームウェアロジック命令を実行する汎用ロジックプロセッサ（ＣＰＵなど）、または完全に、実験室または診断システムまたはカメラシステムに組み込まれたソフトウェアまたはファームウェアの要素を含めることもできる特殊用途のロジック処理回路（ＡＳＩＣなど）によって、または、汎用および専用ロジック回路の組み合わせによって実行することができる。シグナルデータのデータ形式は、ＪＰＥＧ、ＧＩＦ、ＢＭＰ、ＴＩＦＦなどのデジタル画像ベースのデータ形式、または「ｆａｓｔｑ」または「ｑｓｅｑ」形式（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を含むその他の配列特有の形式を含む、任意の便利な形式で構成できる。一方、ａｖｉ、ｍｐｅｇ、ｍｏｖ、ｒｍｖ、または他のビデオ形式などのビデオベースの形式を使用することもできる。本発明のソフトウェアプロセスは、一般に、例えば、Ｍａｔｌａｂ、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｃ＃、ＮＥＴ、Ｖｉｓｕａｌ Ｂａｓｉｃ、Ｐｙｔｈｏｎ、ＪＡＶＡ（登録商標）、ＣＧＩなどを含む様々なプログラミング言語でプログラムすることができる。

本発明の方法およびシステムのいくつかの実施形態では、光閉じ込めは、同時の複数の単一分子ポリメラーゼシーケンシング反応を同時に観察する能力を高めるために使用される。一般に、光閉じ込めは基板上に配置され、非常に小さなスペースまたは体積のみに電磁放射を提供したり、そのような放射を誘導したりするために使用される。このような光閉じ込めは、ウェル、凹部、導管などの構造的閉じ込めを含むか、または他のコンポーネントと組み合わせて光学プロセスを含み、検出を提供するか、または非常に小さな体積のみから放出される放射を導き出すことができる。そのような光閉じ込めの例には、例えば、全反射（ＴＩＲ）ベースの光学システムを利用するシステムが含まれ、それにより、光は、基板内の全反射を生じる角度で基板の透明部分を通して導かれる。

特定の実施形態では、好ましい光閉じ込めは、本明細書に記載の個々のシーケンシング反応を含むことができる微小液滴（例えば、油中水型エマルションなど）である。例えば、シーケンシング混合物の反応成分は、各微小液滴に、酵素および関連試薬の１つのポリメラーゼ−ＡＴＰスルフリラーゼ−ルシフェラーゼセットと１つのテンプレート核酸が含まれており、これにより各シグナル検出ユニットが単一の微小液滴に焦点を合わせるように、分割できる。本明細書では、各微小液滴が、個々の単一分子シーケンシング反応を含む単一分子反応セルであることが企図される。微小液滴反応セルはまた、それぞれのシグナル検出ユニットに光を集束させるためのマイクロレンズとして機能する本発明のシーケンシング方法において有利に有用である。

本発明の基板は、一般に剛性であり、しばしば平面であるが、必ずしもそうである必要はない。基板が光閉じ込めのアレイを含む場合、基板は一般に、照明および光閉じ込めからの光の測定を可能にするために光学機器とインターフェースすることができるサイズおよび形状のものである。典型的には、基板はまた、光学的測定のために、例えば試薬および基板および／またはフルオロフォア標識ピロリン酸塩などの標識成分を含む液体媒体と接触して保持されるように構成される。

閉じ込め領域で本発明のシーケンシング混合物の成分を提供するための例示的な実施形態は、図９〜１３に示されるものなど、多数の他の構成の中に含まれる。例えば、一実施形態では、各標的核酸テンプレートは、個々のそれぞれのシグナル検出器の表面に結合される。一実施形態では、核酸テンプレートは、例えば、金表面へのチオール結合などを介して、当該技術分野で周知の多数の方法を使用して、表面または固体基板に直接結合または付着することができる（図１０Ｂ）。他の実施形態では、ＤＮＡテンプレートは、シラン、ＮＨＳエステルなどを介して、それぞれの表面に直接結合または付着させることができる。他の実施形態では、シーケンシングのためのプライマーは、個々のそれぞれのシグナル検出器の表面に結合され得る（図１０Ａ）。本明細書に記載されるように、各アタッチメントは、個々のシグナル検出器の表面上にあり得る。例示的なシグナル検出器が本明細書で記載されており、ＣＣＤ、ＣＭＯＳセンサーのピクセルとすることができ、またはそれらは、光検出器、またはアレイを形成する光電子増倍管などとすることができる。

基板が光閉じ込めのアレイを含む場合、アレイは基板の表面上に単一行または複数行の光閉じ込めを含むことができ、複数のレーンが存在する場合、レーンの数は通常少なくとも２、より一般的には１０を超え、より一般的には１００を超える。光閉じ込めの対象となるアレイは、基板のｘ軸またはｙ軸を水平または斜めに整列させることができる。個々の閉じ込めは、グリッドを形成するように、または円形、楕円形、楕円形、円錐形、長方形、三角形、または多面体パターンを形成するように、行と列など、基板の表面にわたってまたは表面全体に任意の形式で配列できる。隣接する光閉じ込め間の最近隣距離を最小化するために、六角形アレイがしばしば好ましい。

光閉じ込めのアレイは、分析の容易さ、ハイスループット、またはマイクロタイタープレートなどにおける他の利点を提供する構造に組み込むことができる。そのようなセットアップは、本明細書では「アレイのアレイ」とも呼ばれる。例えば、対象のアレイは、マイクロタイタープレートなどの別のアレイに組み込むことができ、プレートの各マイクロウェルは、光閉じ込めの対象のアレイを含む。

本発明によれば、閉じ込めのアレイ（例えば、反応セル、微小液滴など）は、１００を超える、１０００を超える、１０，０００を超える、１００，０００を超える、または１，０００，０００を超える別個の反応のアレイで提供される。単一の基板上のセル（微小液滴など）。さらに、反応セルアレイは、典型的には、基板の表面上に比較的高密度で含まれる。このような高い密度は、典型的には、１ｍｍ２あたり１０個の反応セルよりも高い密度で存在する反応セル、好ましくは基板表面積の１ｍｍ２あたり１００個の反応セルよりも多く、より好ましくは１ｍｍ２あたり５００個のあるいは１０００個の反応セルよりも多く、および多くの場合、ｍｍ ｍｍ２あたり１００，０００を超える反応セルが存在する。多くの場合、アレイ内の反応セルは、一定の間隔で、例えば、所定のアレイ内の一定間隔の反応セルの２、５、１０、２５、５０、または１００またはそれ以上の行および／または列で配置され、特定の好ましいケースでは、標準の行および／または列のフォーマットから逸脱したアレイで反応セルの構成を提供することに利点がある。好ましい態様では、基板は、基板上の個別の単一分子シーケンシング反応領域を規定するための光閉じ込めとして、特定の反応セルの微小液滴として含む。

光閉じ込めのアレイの全体的なサイズは、一般に、数ナノメートルから数ミリメートルの厚さ、および数ミリメートルから５０センチメートルの幅および／または長さの範囲であり得る。アレイは、厚さが約数百ミクロンから数ミリメートルの全体的なサイズを有することができ、所望の光閉じ込めの数に応じて任意の幅または長さを有することができる。

個々の閉じ込め間の間隔は、対象のアレイが使用される特定の用途をサポートするように調整できる。意図された用途が、光閉じ込めからの入射波長の低レベルの回折散乱の有無にかかわらず、アレイの暗視野照明を必要とする場合、個々の閉じ込めは、入射波長に対して互いに近くに配置できる。

アレイ内の個々の閉じ込めは、約１０００ゼプトリットル未満、約９００未満、約２００未満、約８０未満、約１０ゼプトリットル未満の有効観察体積を提供することができる。必要に応じて、１ゼプトリットル未満の有効観察量を提供できる。好ましい態様では、個々の閉じ込めは、生理学的に関連する濃度でまたはその近くに存在する酵素などの個々の分子の分離を可能にする有効な観察体積をもたらす。ほとんどの酵素はミカエリス定数をこれらの範囲内に持っているため、多くの生化学反応の生理学的に適切な濃度はマイクロモルからミリモルの範囲である。したがって、好ましい光閉じ込めのアレイは、約１マイクロモル（μＭ）より高い、またはより好ましくは５０μＭより高い、またはさらには１００μＭより高い濃度で存在する個々の分子を検出するための有効な観察体積を有する。特定の実施形態では、典型的な微小液滴サイズは１０マイクロメートルから２００マイクロメートルの範囲であり、したがって、典型的な微小液滴の体積は約５ピコリットルから２０ナノリットルである。

光閉じ込め内の化学的または生化学的分析の文脈では、目的の反応が少なくとも閉じ込めの光学的に調べられた部分内で起こるように、好ましくは単一分子ポリメラーゼシーケンシング反応の反応のみが個別の閉じ込め（例えば、微小液滴内など）の調べられた部分内で発生するようになることが一般に望ましい。当該技術分野で周知のいくつかの方法を一般に使用して、観察体積内に個々の分子を提供することができる。これらの様々なものが米国特許第７，７６３，４２３号に記載されており、全ての目的でその全体が参照により本明細書に組み入れられ、とりわけ、約１、２、３つまたはいくつかの他の選択された数の分子は、所与の観察体積内に収まると予想されるように、所望の密度で表面に個々の分子を固定化するように設計された修飾表面が記載されている。典型的には、このような方法は、希釈技術を利用して、表面上のそのような基の希釈、または目的の分子と相互作用する中間または最終結合基の希釈、またはこれらの組み合わせのいずれかにより、表面に比較的低密度の結合基を提供する。同様に、本明細書で企図されるのは、これらの希釈技術を使用して、１つ、２つ、３つ、またはその他いくつかの選択された数の単一分子シーケンス反応を提供し、本明細書では光閉じ込めのために企図される微小液滴反応セルで発生するような、表面に固定化されることなく、所定の観察体積内に収まるようにすることである。特定の実施形態では、希釈技術を利用して、本発明のシーケンシング方法で使用するための微小液滴における単一分子シーケンシング反応を提供する。

本発明のシステムおよび方法は、当該技術分野でよく知られているシステムを使用して、本明細書に記載の３酵素ｐｏｌ−ＡＴＰスルフリラーゼ−ルシフェラーゼ（例えば、ポリリン酸標識）を受けた後、ヌクレオチド類似体の標識脱離基（例えば、ポリリン酸塩標識；ＰＰｉ＋ＦＬ）からのシグナルをモニタリングすることにより、配列決定および塩基呼び出しの改善をもたらし得る。一般に、シグナルデータはプロセッサによって受信される。プロセッサが受信した情報は、検出光学系から直接取得することも、検出光学系からのシグナルをプロセッサが受信する前に他のプロセッサで処理することもできる。いくつかの初期キャリブレーション操作を適用できる。これらの初期キャリブレーションステップの一部は、実行の開始時に１回だけ実行される場合と、実行中に継続的に実行される場合がある。これらの初期キャリブレーションステップには、重心決定、アライメント、グリッド、ドリフト補正、初期バックグラウンド減算、ノイズパラメータ調整、フレームレート調整などが含まれる。ビニングなど、これらの初期キャリブレーションステップの一部には、以下でさらに説明するように、プロセッサから検出器／カメラに戻るコミュニケーションを含み得る。

一般に、ある種のスペクトルトレース決定、スペクトルトレース抽出、またはスペクトルフィルターが初期シグナルデータに適用される。これらのフィルターステップの一部または全ては、プロセスの後の時点で、例えば、パルス同定ステップの後に、任意選択で実行されてもよい。スペクトルトレース抽出／スペクトルフィルターは、当該技術分野でよく知られているように、いくつかのノイズ低減および他のフィルターを含むことができる。受け取った初期シグナルデータは一連の隣接するピクセル検出器によってキャプチャされた光レベルまたは光子カウントであるため、本明細書に記載の例示的システムの多くでは、この段階でスペクトルトレースの決定が行われる。例えば、１つの例示的なシステムでは、位置からのピクセル（または強度レベル）が、各フレームで個々の導波路に対して組み込まれる。異なる周波数またはスペクトルの光は、１つを超える位置に当てられ、一般に一部のオーバーラップがあり、場合によってはかなりのオーバーラップがある。本発明の特定の実施形態によれば、スペクトルトレース抽出は、以下に説明するように、各スペクトルトレースに対して最高のシグナル対ノイズ比を提供する様々な種類の分析を使用して実行することができる。

スペクトルトレース決定の代替として、本発明の方法はまた、複数のピクセル位置での強度レベルから導出された単一のシグナルを分析し得る（これは、合計スペクトルシグナルまたはグレースケールスペクトルシグナルまたは強度レベルシグナルと呼ばれ得る）。しかしながら、多くの状況で、スペクトル抽出を使用すると、ＳＮＲ（シグナル対ノイズ比）が向上し、抽出されたスペクトルトレースをいくぶん個別に分析してパルスを検出すると、パルスが検出されることがわかっている。さらなる実施形態では、本発明による方法は、隠れマルコフモデルなどの統計モデルを使用して、複数のキャプチャされたピクセルデータを分析することができる。本明細書で提供される本発明のシーケンシング方法およびシステムでは、初期シグナルデータから複数（例えば、４つ）のスペクトルトレースを決定することが好ましい方法である。

標識された脱離基（例えば、標識されたピロリン酸；ＰＰｉ＋ＦＬ）からのシグナルが、有意なシグナルパルスまたは事象として分類され得るかどうかが決定される。いくつかの例示的なシステムでは、検出に利用できる光子の数が少ないため、および検出の速度のために、有意なパルスが検出されたかどうかを決定する際に様々な統計分析技術を実行することができる。

シグナルが重要なパルスまたはシグナル事象として同定された場合、スペクトルの割り当てを検証するために、さらに任意選択のスペクトルプロファイル比較を実行できる。このスペクトルプロファイル比較は、スペクトルトレースがパルス同定の前または最中に決定される実施形態では任意選択である。色が所定の組み込みシグナル（例えば、フルオロフォアで標識されたｄＮＴＰ）に割り当てられると、その割り当てを使用して、組み込まれたそれぞれの塩基、またはテンプレート配列内のその相補体のいずれかを呼び出す。この決定を行うために、標識された脱離基に対応するチャネル（例えば、標識されたピロリン酸；ＰＰｉ＋ＦＬ）からのシグナルを使用して、ヌクレオチド標識からのパルスが組み込み事象に対応するかどうかを評価する。次いで、呼び出された塩基の集積は、線形配列情報、例えば、テンプレート配列内のヌクレオチドの連続配列を提供する、配列フラグメントをより長いコンティグに組み立てるなどの追加の処理にかけられる。

上記のように、シグナルデータは、処理システム、例えば、適切にプログラムされたコンピュータまたは他のプロセッサに入力される。シグナルデータは、例えば、リアルタイムシグナル処理のために、検出システムから直接入力することができ、またはそれは、シグナルデータ記憶ファイルまたはデータベースから入力することができる。いくつかの場合、例えば、検出システムの性能に関する即時のフィードバックを求めている場合、検出または他の実験パラメータを調整する場合、リアルタイムのシグナル処理が使用される。いくつかの実施形態では、シグナルデータは、検出システムから適切なファイルまたはデータベースに格納され、反応後または非リアルタイム方式で処理される。

本発明に関連して使用されるシグナルデータは、様々な形態であり得る。例えば、データは、所与の検出器またはアレイベースの検出器の検出点で受信された光シグナルの強度値を表す数値データであり得る。シグナルデータは、ＣＣＤ、ＥＭＣＣＤ、ＩＣＣＤ、またはＣＭＯＳセンサーなどの画像検出器からの画像データを含み得る。特定の実施形態では、単一分子から少数の光子を検出するために、光電子増倍管（ＰＭＴ）および／または光子計数器ユニットの使用が、本発明の方法での使用のために企図される。いずれの場合でも、本発明の特定の実施形態に従って使用されるシグナルデータは、一般に、強度レベル情報とスペクトル情報の両方を含む。別個の検出器要素の文脈において、そのようなスペクトル情報は、一般に、強度が検出される検出器部分の場所または位置（例えば、ピクセル）の同定を含む。画像データの文脈では、スペクトル画像データは典型的に、システムがシグナル全体のスペクトル分解能を含む場合に、イメージングシステムと検出器の較正済みスペクトル画像データと相関する画像データから派生したデータになる。スペクトルデータは、検出器から抽出された画像データから得ることができ、代替的に、スペクトルデータの導出は、スペクトルデータが検出器から抽出されるように、検出器上で行うことができる。

上述のシーケンシング法の場合、組み込み事象からのシグナルの結果ではない、検出システムによって検出される特定の量の光シグナルが存在する可能性がある。このようなシグナルはシステムの「ノイズ」を表し、モニター対象の反応の内部、検出システムの内部、および／または上記の全ての外部にある可能性のある多数の発生源に由来する可能性がある。本発明の実施は、従来技術の方法に典型的に存在するこれらの全体的なノイズ源を有利に低減する。本発明に従って有利に低減される反応内部の先行技術のノイズの例には、例えば：検出事象に関連しない蛍光標識の存在、例えば、遊離標識、溶液中に拡散した非組み込み塩基に関連する標識、複合体に関連付けられているが組み込まれていない塩基、個々の観測体積または領域における複数の複合体の存在；観察体積内の基質または酵素複合体への色素またはヌクレオチドの非特異的吸着；汚染されたヌクレオチド類似体、例えば他の蛍光成分で汚染されたもの；弱い蛍光の可能性がある他の反応成分；例えば、反応条件の結果として、スペクトル成分をシフトする染料成分などが含まれる。次のヌクレオチド類似体を組み込む前に、控えめな、限定された期間のポリメラーゼ−ＡＴＰ−スルフリラーゼ−ルシフェラーゼ反応を受ける、それぞれのｄＮＴＰの脱離基上の蛍光標識からの蛍光シグナル検出および情報の制御された使用は、ノイズの発生源を削減または排除することにより、システムのシグナル対ノイズ比を向上させ、塩基呼び出しおよび関連する配列決定の品質を向上させる有利な方法を提供する。

検出システムの内部であるが反応混合物の外部のノイズ源には、例えば、フィルタリング光学系を通って漏れる反射励起放射、基質または任意の光学成分からの散乱励起または蛍光放射、隣接するシグナル源の空間的クロストーク、システムの光学成分の一部または全ての自動蛍光、ＣＣＤなどの検出器からのリードノイズ、ＥＭＣＣＤカメラなどのゲインレジスタノイズなどが含まれ得る。他のシステム由来のノイズの寄与は、バックグラウンド補正エラー、フォーカスドリフトエラー、オートフォーカスエラー、パルス周波数分解能、アライメントエラーなどのデータ処理の問題から発生する可能性がある。さらに他のノイズの寄与は、周囲光の干渉、ほこりなどを含む、システム全体の外部のソースから生じる可能性がある。

これらのノイズ成分は、組み込み事象に関連付けられている可能性のある任意のシグナルパルスの基礎となる背景光子に寄与する。そのため、典型的に、ノイズレベルは、シグナルパルスが統計的に有意であると判断できる限界を形成する。

全体的なシグナルデータへのノイズの寄与の同定は、例えば、いずれのシグナルデータは無関係であると判断される、目的の反応がない場合のシグナルモニタリングを含む、当該技術分野で周知のいくつかの方法によって実行できる。代替として、そして好ましくは、ベースラインシグナルが推定され、システムによって生成されるシグナルデータから差し引かれ、それにより、ノイズ測定が、目的の反応に関する測定と同時に行われる。ベースラインの生成および適用は、以下でより詳細に説明されるいくつかの手段によって実行され得る。

本発明によれば、シグナル処理方法は、全ての非有意なパルスベースのシグナル事象に広く適用されるようなノイズと、妥当な信頼度で関連しているとみなされ得、したがって、とりあえず、組み込み事象として同定できる有意なシグナルパルスとを区別する。本発明の文脈において、シグナル事象は、そのようなシグナル事象がいくつかの異なるパルス基準のいずれかを満たすかどうかに基づいて、それが有意なシグナルパルスを構成するかどうかに関して最初に分類される。有意なパルスとして同定または分類されると、シグナルパルスをさらに評価して、シグナルパルスが組み込み事象を構成するかどうかを判断し、特定の組み込まれた塩基と呼ぶことができる。理解されるように、特定のシグナル事象を重要なパルスとして、そして最終的には組み込み事象として呼び出すための根拠は、本明細書で一般的に述べられるような様々なパラメータに基づいて、特定の量のエラーを被る。したがって、シグナルデータをパルスとして、最終的には組み込み事象または同定された塩基として分類することを含む本発明の態様は、同じまたは同様のエラーを被り、そのような命名法は議論の目的のために使用され、呼び出された塩基が配列の正しい塩基であることがある程度の信頼性を持って期待されることを示すものであり、呼び出された塩基が実際に所与の配列の所与の位置の塩基であるという絶対的な信頼性を示すものとしてではないことが理解されよう。

そのようなシグナルパルス基準の１つは、問題のシグナル事象に関連付けられたシグナルと全てのバックグラウンドノイズのレベルの比（「シグナル対ノイズ比」または「ＳＮＲ」）であり、それによりシグナル事象を重要なシグナルパルスとして分類できる信頼性または統計的有意性の尺度を提供する。有意なパルスシグナルを系統的または他のノイズ成分と区別する場合、シグナルは一般に、シグナルの強度、シグナルの持続時間、一時的なシグナルのパルス形状、パルス間隔、およびパルススペクトル特性など、いくつかの測定基準の１つまたは複数でシグナル閾値レベルを超える必要がある。

簡略化した例として、シグナルデータを処理システムに入力することができる。シグナルデータが、シグナル強度およびシグナル持続時間の１つまたは複数でシグナル閾値を超える場合、それは重要なパルスシグナルとみなされる。同様に、追加の測定基準が閾値として使用される場合、シグナルは、特定のシグナル事象を重要なパルスとして同定する際に、そのような測定基準と比較されてもよい。理解されるように、この比較は、典型的に、前述の測定基準の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つのそのような閾値、多くの場合、重要なパルスを同定する際の前述の閾値の３つまたは４つ全てを含む。

シグナルの閾値は、シグナル強度、シグナルの持続時間、パルスの形状、間隔、パルスのスペクトル特性、またはこれらの組み合わせのいずれであっても、通常、以前の実験データからの予想されるシグナルプロファイルに基づいて決定される。このような閾値は、全体的なシグナルデータのパーセンテージから特定でき、統計的評価により、このような閾値処理が適切であることが示される。特に、いくつかの場合において、閾値のシグナル強度および／またはシグナル持続時間は、全体のシグナルデータの特定の割合またはパーセンテージ以外を全て除外するように設定でき、閾値のリアルタイム設定を可能にする。しかしながら、やはり、パーセンテージまたは絶対シグナル値に関する閾値レベルの同定は、一般的に以前の実験結果と相関している。代替の態様では、シグナル閾値は、所与の評価の状況で決定されてもよい。特に、例えば、パルス強度閾値は、絶対的なシグナル強度に基づいていてもよいが、そのような閾値は、例えば試薬拡散によるシグナルバックグラウンドレベルの変動を考慮に入れず、特にシグナルはバックグラウンドレベルに比べて比較的弱い場合に、使用される閾値に影響を及ぼし得る。したがって、特定の態様では、本発明の方法は、問題となる特定の反応のバックグラウンド蛍光を決定し、これは、自由に拡散する色素または色素標識類似体の微小液滴への寄与が最小または存在しないため、比較的小さく、例えば、パルス強度対バックグラウンドフルオロフォア拡散の比として、または統計的方法、例えば、５シグマなどによって、所望のレベルによって、実際のバックグラウンドより上にシグナル閾値を設定する。最小フルオロフォア拡散バックグラウンドなどの実際の反応バックグラウンドを補正することにより、閾値は、色素濃度、レーザー出力などの変動の影響に対して自動的に較正される。反応バックグラウンドとは、目的の反応に具体的に関連するバックグラウンドシグナルのレベルを意味し、例えば、システムまたは基質成分の自家蛍光、レーザーブリードスルーなどのバックグラウンドへのシステムの寄与とは対照的に、反応条件に応じて変化すると予想される。

組み込み事象のリアルタイム検出に依存する特に好ましい態様では、有意なシグナルパルスの同定は、シグナル強度とシグナル持続時間の両方で閾値を横断するシグナルプロファイルに依存し得る。例えば、シグナルが強度の低い方の閾値を増加する方向に横切るシグナルが検出されると、シグナルの強度が同じまたは異なる強度の閾値を減少する方向に横切るまで、同じセットの検出要素、例えばピクセルからの後続のシグナルデータがモニターされる。適切な強度のピークが検出されると、それが強度の閾値を超えた期間の期間が持続時間の閾値と比較される。ピークが十分な持続時間の十分に強いシグナルを含む場合、それは有意なシグナルパルスと呼ばれる。

強度および持続時間の閾値を使用することに加えて、またはその代わりとして、パルス分類は、パルスを重要であると分類する際にいくつかの他のシグナルパラメータを使用することができる。そのようなシグナルパラメータには、例えば、パルス形状、シグナルのスペクトルプロファイル、例えば、パルススペクトル重心、パルス高さ、パルス拡散比、パルス間隔、総シグナルレベルなどが含まれる。

重要なシグナルパルスの同定の後または前に、シグナルデータは、特定のシグナル種類に相関し得る。本発明に関連して使用される光学的検出スキームとの関連で、これは典型的には、シグナルデータを生じさせるシグナルの特定のスペクトルプロファイルを示す。特に、本発明の方法およびプロセスと共に使用される光学検出システムは、一般に、区別可能なスペクトルプロファイルを有する光シグナルを受信するように構成され、各スペクトル的に区別可能なシグナルプロファイルは、一般に、異なる反応事象と相関し得る。核酸シーケンシングの場合、例えば、各スペクトル的に区別可能なシグナルは、核酸配列の所与の位置に組み込まれるかまたは存在する特定のヌクレオチドと相関するかまたは示し得る。その結果、検出システムは、そのようなシグナルを受け取り、それらのスペクトルに基づいてシグナルを分離する光学系を含む。次いで、異なるシグナルは、異なる検出器、単一のアレイベースの検出器の異なる場所に送られるか、同じイメージング検出器に差分的にイメージングされる（例えば、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，８０５，０８１号を参照されたい）。

異なるシグナルスペクトルに異なる検出器を使用するシステムの場合、所与のシグナルへのシグナル種類の割り当て（議論のしやすさのために以降、「色分類」または「スペクトル分類」と呼ぶ）は、シグナルパルスをデータが由来する検出器と相関させることの問題である。特に、分離された各シグナル成分が個別の検出器によって検出される場合、その検出器によるシグナルの検出は、必要な色として分類されるシグナルを示す。

しかしながら、好ましい態様では、本発明と共に使用される検出システムは、全体のシグナルの異なるスペクトル成分の全てまたは少なくともいくつかが異なるスペクトル成分間の区別を可能にする方法で画像化される画像検出器を利用する。したがって、複数のシグナル成分は同じ全体的な検出器に送られるが、検出器の全体的または部分的に異なる領域に入射する可能性があり、例えば、画像検出器内の様々なピクセルセットで画像化され、同定可能なスペクトル画像（および関連する画像データ）を生成する。本明細書で使用されるとき、スペクトルまたはスペクトル画像は、一般に、反応場所から受け取った光シグナルのスペクトル拡散によって引き起こされる複数の強度を有するピクセル画像またはフレーム（任意選択でデータを１次元に減少させる）を示す。

その最も単純な形態では、検出器内の隣接する検出要素またはピクセルのグループに入射するシグナル事象への色の割り当ては、別個の検出器について述べたのと同様の方法で達成されることが理解されよう。特に、シグナルが画像化され、そこからシグナルデータが導出されるピクセルのグループの位置は、シグナル成分の色を示す。しかしながら、特に好ましい態様では、シグナル成分の空間的分離は完全ではなく、その結果、異なる色のシグナルが、重なり合うピクセルのセットで画像化される。したがって、シグナルの同定は、一般に、シグナルが入射した複数のピクセルの集約された同定情報（またはシグナル成分の全体的な画像）に基づいて行われる。

特定のシグナルが重要なパルスとして同定され、特定のスペクトルが割り当てられると、そのスペクトルが割り当てられたパルスをさらに評価して、そのパルスを組み込み事象と呼ぶことができるかどうかを判断し、その結果、新生鎖に組み込まれた塩基か、またはテンプレート配列内のその相補体を呼び出すことができる。標識された脱離基（例えば、フルオロフォア標識されたピロリン酸；ＰＰｉ＋ＦＬ）からのシグナルは、どの塩基が呼び出されるべきかを同定するために使用される。上述のように、一実施形態では、本発明の３酵素ポリメラーゼ−ＡＴＰスルフリラーゼ−ルシフェラーゼ反応系を使用することにより、組込み事象への高い信頼性と相関させることができる一連の特徴的なシグナルが生成される。

さらに、色が割り当てられたパルスデータから塩基を呼び出すには、典型的には、塩基が呼び出されるときの信頼レベルを再び同定する検定を使用する。典型的に、このような検定では、重要なパルスの同定に使用される同じデータパラメータの数を含む、シグナルが受信されたデータ環境が考慮される。例えば、そのような検定には、バックグラウンドシグナルレベル、隣接するパルスシグナルパラメータ（間隔、強度、持続時間など）、スペクトル画像解像度、およびその他の様々なパラメータの考慮事項が含まれ得る。そのようなデータは、色が割り当てられたシグナルパルスの所定の塩基呼び出しにスコアを割り当てるために使用でき、このようなスコアは、呼び出された塩基が正しくない確率、例えば、１００分の１（９９％正確）、１０００分の１（９９．９％正確）、１０，０００分の１（９９．９９％正確）、１００，０００分の１（９９．９９９％正確）、またはそれ以上と相関する。クロマトグラフィーで得られた配列データのＰＨＲＥＤまたは同様の種類のスコアリングと同様に、そのようなスコアを使用して、シーケンシングデータの精度を示したり、かつ／または不十分な精度の配列情報を除外したりできる。

塩基が十分な精度で呼び出されると、同じシーケンシング実行および同じプライマー伸長反応で呼び出される後続の塩基が、以前に呼び出された各塩基に追加され、テンプレートまたは新生鎖の配列全体で塩基の配列を提供する。反復処理および追加のデータ処理を使用して、任意の空白を埋めたり、誤って呼び出された塩基を修正したりするなど、所与の配列を修正できる。

本発明の特定の実施形態による反応位置の配列での組み込み反応によるシーケンシングの分析は、全ての目的で参照により全体が組み込まれる米国特許第９，４４７，４６４号の図１３にグラフで示されているように行うことができる）。例えば、カメラでキャプチャされたデータは、スペクトルの時系列でもある動画として表される。スペクトルキャリブレーションテンプレートは、スペクトルからトレースを抽出するために使用される。次いで、トレースで同定されたパルスを使用してスペクトルデータに戻り、そのデータから各パルスの時間平均パルススペクトルを生成する。このようなパルススペクトルには、酵素の構造変化に関連する事象のスペクトルが含まれる。次いで、スペクトルキャリブレーションテンプレートを使用して、パルススペクトルを特定の塩基に分類する。次いで、塩基分類とパルスおよびトレースメトリックが保存されるか、他のロジックに渡されてさらに分析される。下流の分析には、酵素の立体配座の変化からの情報を使用して、塩基の呼び出しの組み込み事象の決定を支援することが含まれる。本発明における使用のためのさらなる塩基呼び出しおよびシーケンシング方法は、例えば、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み入れられるＵＳ８，１８２，９９３に記載されたものを含み得る。

ポリメラーゼに対してより最適化された環境でのポリメラーゼの使用を可能にする本発明の単一分子シーケンシング法の利点は、シーケンシング実行ごとに達成される非常に低いエラー率、換言すると、シーケンシング実行ごとに得られる実質的に高レベルの配列精度である。例えば、天然のポリメラーゼは１億塩基ごとに１つのエラーを発生させる。これは、本明細書で提供される本発明のＦＬＡＳＨ（登録商標）シーケンシング法の目標エラー率として本明細書で企図される。また、標的核テンプレートごとに複数のポリメラーゼを使用する本発明によれば、エラー率はリード長とは独立し、したがって、より忠実度の高いポリメラーゼを選択することでエラー率を改善でき、結果として必要なカバレッジが少なくなり、さらに、複数のポリメラーゼを使用することで、非常に長いリード長を達成できる。カバレッジが考慮される前の実行ごとに、本発明の方法で使用されるポリメラーゼによって達成されるエラー率は、１％〜３０％、１％〜２０％、１％〜１０％、１％〜５％、１％〜３％、１％〜２％、０．０００００１％〜１％、０．００００１％〜１％、０．０００１％〜１％、０．００１％〜１％、０．０１％〜１％、０．０００００１％〜０．００００１％、０．０００００１％〜０．０００１％、０．０００００１％〜０．００１％から選択される範囲であると企図される。

この利点により、業界標準で定義された正確な配列を取得するために必要な全体的なカバレッジが減少し、それに応じてヌクレオチド配列を取得する全体的なコストが低減される。本明細書で使用されるとき、カバレッジは、業界標準内の特定の標的核酸配列の正確な配列を得るために必要なシーケンシング実行の数を意味する。

実施例１−発光ベースの単一分子シーケンシング
単一分子シーケンシング反応を行う前に、それぞれのフルオロフォアは、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＣＴＰのそれぞれの対応するｄＮＴＰの末端リン酸に結合する。各ｄＮＴＰ塩基（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）には異なるフルオロフォアがある（図１Ａ）。外部光励起がないため、この時点で蛍光は生成されないことから、化学的に消光できるフルオロフォアを選択する必要はない。単一分子シーケンシング反応中、ＤＮＡポリメラーゼとの相互作用により、ＤＮＡポリメラーゼはｄＮＴＰヌクレオチド類似体を相補的なテンプレート鎖に結合するが、付加されたフルオロフォア標識を含むピロリン酸（ＰＰｉ＋ＦＬ）を切断して放出する（図１Ａおよび１Ｂ）。この場合、外部光励起はなく、標識されたフルオロフォアの動的、静的、またはその他の形態の消光メカニズムは必要ない。

放出されると、標識ピロリン酸（ＰＰｉ＋ＦＬ）はＡＴＰスルフリラーゼと相互作用し、標識ピロリン酸をアデノシン５’−ホスホ硫酸（ＡＰＳ）に結合し、依然としてフルオロフォア標識を含む標識ＡＴＰ（ＡＴＰ＋ＦＬ）を生じる（図１Ｂおよび１Ｃ）。

上記で生成された標識ＡＴＰ（ＡＴＰ＋ＦＬ）は、ルシフェリンを基質として使用するホタルルシフェラーゼへの結合に使用される（図１Ｄおよび１Ｅ）。標識ＡＴＰ（ＡＴＰ＋ＦＬ）が補因子として作用することで、ホタルルシフェラーゼはルシフェリンを触媒する（図１Ｄ〜１Ｆ）。酵素的触媒作用の結果として、ルシフェリンはオキシルシフェリンに変換され、発光も控えめかつ限られた時間だけ生成される（図１Ｆ）。反応の副産物として、アデノシン一リン酸とＰＰｉ＋ＦＬが生成される。標識ピロリン酸塩（ＰＰｉ＋ＦＬ）に結合したフルオロフォアは、発光反応の結果として、限られた期間生成された発光によって励起される。これにより、発光の控えめな限られた期間（寿命）で検出可能な蛍光放射が得られ、この蛍光放射のスペクトルは、特定のフルオロフォアのそれぞれのｄＮＴＰに対応している（図１Ｆ）。したがって、ｄＮＴＰがＤＮＡポリメラーゼと相互作用する結果として、発光酵素と発光基質によって生成された発光反応によって生成された発光時に蛍光が生成され、特定のｄＮＴＰについて選択された蛍光体の色に対応する蛍光シグナルが生成される。このような相互作用の特異性は、発光生成とＰＰｉ＋ＦＬの近接性によってさらに向上する。それぞれの蛍光は、次のｄＮＴＰを付加する前に、一実施形態などの、控えめで限定された期間の後、光が消える前に検出される。

このｄＮＴＰ組み込みプロセスは、所望の核酸リード長が達成されるまで繰り返される。

実施例２−発光の生成に影響するパラメータ
実施例２Ａ−ＡＴＰスルフリラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、および発光基質−ｄＧＴＰ−クマリンのそれぞれの濃度を変化させることによる影響
この反応では、４塩基（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ）の混合物によって形成される２０ｂｐの領域の開始配列を除いて、全てのシトシン塩基で構成される３００ｂｐ一本鎖ＤＮＡテンプレートが生成された。テンプレートＤＮＡに加えて、反応には開始配列に相補的なプライマーオリゴヌクレオチド、ｄＧＴＰ−クマリン、ＡＴＰスルフリラーゼ、アデノシン５’−ホスホ硫酸、ホタルルシフェラーゼ（発光酵素として）、およびルシフェリン（発光基質として）が含まれていた。ＡＴＰスルフリラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、および発光基質、ｄＧＴＰ−クマリンのそれぞれの濃度を変化させることによる影響を、それぞれ図２〜４に示す。図２〜４からわかるように、ｄＧＴＰ−クマリン（これは、末端リン酸がクマリンによって標識されたｄＧＴＰである）から開始すると、ここで使用されているポリメラーゼ−ＡＴＰスルフリラーゼ−ホタルルシフェラーゼの連結された３酵素システム（ＦＬＡＳＨ（登録商標）アプローチとも呼ばれる）は、驚くべきことに、最終ステップで発光を生成することがわかった。この特定の場合では、クマリンの励起スペクトルは３８５ｎｍでピークになり、放射スペクトルは５０２ｎｍでピークになるため、この反応によって生成される発光（５６０ｎｍでピーク）を使用して、結果としてのクマリンからの蛍光放射を観察することはできない。

しかしながら、他の実施形態では、ＤＤＡＯ（［７−ヒドロキシ−９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）］などの５６０ｎｍに近い励起スペクトルを有するフルオロフォア標識が本明細書で企図され、それぞれのｄＮＴＰに対応する検出可能な蛍光放射を生成するであろう。例えば、本発明の方法で本明細書で使用するために、以下の標識ｄＮＴＰが合成され、Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｊｅｎａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手された：
ＡＴＴＯ６８０、トリエチルアンモニウムで標識されたガンマ−（６−アミノヘキシル）−２’−デオキシアデノシン−５’−三リン酸、
ＡＴＴＯ６８０、トリエチルアンモニウム塩で標識されたガンマ−（６−アミノヘキシル）−２’−デオキシシチジン−５’−三リン酸、
ＡＴＴＯ６８０、トリエチルアンモニウム塩で標識されたガンマ−（６−アミノヘキシル）−２’−デオキシチミジン−５’−三リン酸、
ガンマ−［（６−アミノヘキシル）イミド］−ｄＧＴＰ−ＡＴＴＯ−６４７Ｎ、
ガンマ−［（６−アミノヘキシル）イミド］−ｄＧＴＰ−Ｃｙ５、
ガンマ−（６−アミノヘキシル）−ｄＧＴＰ−Ｃｙ５、
Ａｌｅｘａ７００、トリエチルアンモニウム塩で標識されたガンマ−（６−アミノヘキシル）−２’−デオキシチミジン−５’−三リン酸、
Ａｌｅｘａ６６０、トリエチルアンモニウム塩で標識されたガンマ−（６−アミノヘキシル）−２’−デオキシアデノシン−５’−三リン酸、および
ＡＴＴＯ７００、トリエチルアンモニウム塩で標識されたガンマ−（６−アミノヘキシル）−２’−デオキシチミジン−５’−三リン酸。

実施例２Ｂ−ＡＴＰスルフリラーゼとＡＰＳをルシフェラーゼ反応に添加することによる影響
この実験では、シーケンス混合物の以下の試薬を使用した：
１０×ＴＡＥ緩衝液１７．５μＬ
ルシフェラーゼ（１ＭのＴｒｉｓ中５ｍｇ／ｍｌ）（１：５０）１７．５μＬ−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−２５０ｎｇ Ｓｉｇｍａ
Ｃｙｃ−Ｌｕｃ（１０ｍｇ／ｍＬ）（１×ＴＡＥ中１：１０）３５μＬ−−−−−−−−−−−−５μｇ ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ
ＡＴＰ（１００ｍＭ）（１：５ｋ）３５μＬ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−１．２μＭ Ｓｉｇｍａ
ＣｏＡ（１０ｍＭ）（１：２０）３５μＬ−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−２ｍＭ Ｓｉｇｍａ
ＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）＝（ｒｘｎあたり２．５μＬ）−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−１ｍＭ ＮＥＢ
ＰＰａｓｅ １×（＝希釈なし）（２００Ｕ／ｍＬ）＝０．５μＬ−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−０．１Ｕ Ｓｉｇｍａ
ＡＳｕｌｆ（３００Ｕ／ｍＬ）＝０．５μＬ−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−０．１５Ｕ ＮＥＢ
ＡＰＳ（１０ｍＭ）＝１μＬ−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−３７７μＭ Ｓｉｇｍａ

ＡＴＰスルフリラーゼ／ルシフェラーゼシグナル増幅ループが蛍光シグナルレベルに及ぼす影響を研究するために、ＡＴＰスルフリラーゼ−ルシフェラーゼの組み合わせのみを観察することができる。反応は、７５０ｎｇのルシフェラーゼ、５μｇのＣｙｃ−Ｌｕｃルシフェリン、１．２μＭのＡＴＰ、２ｍＭの補酵素Ａ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１５単位のＡＴＰスルフリラーゼ、３７７μＭのＡＰＳを含む１×ＴＡＥ緩衝液で実施した。ピロホスファターゼの変動は、０．１、０．００５、および０．００２単位量に対応する。ルシフェラーゼ、ＡＴＰ、補酵素Ａ、ピロホスファターゼ、およびＡＰＳはＳｉｇｍａから入手した。ＡＴＰスルフリラーゼおよびＭｇＣｌ２はＮＥＢから入手した。

最初に、ピロホスファターゼとＭｇＣｌ２を３８４ウェルマイクロプレートの関連するウェルに分注した。次いで、緩衝液、ルシフェラーゼ、および補酵素Ａのマスターミックスを調製し、混合して、等量で関連するウェルに分注した。次いで、Ｃｙｃ−Ｌｕｃルシフェリンを各ウェルに添加し、最後にＡＴＰを各ウェルに添加した。次いで、ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｐｔｉｍａプレートリーダーから測定値を取得する前に、プレートを１５秒間振盪した。

この実施例では、ルシフェリンを基質として使用するルシフェラーゼ反応のみに対応する標準的な反応が、図７の実線のプロットとして示される。図７において、実線のプロットは、通常のルシフェラーゼ反応から予想される発光シグナルの上昇と減衰を示す。３０００秒の時点で、ＡＴＰ−スルフリラーゼとＡＰＳが標準的な反応に追加され、図７に見られるように、ＡＴＰスルフリラーゼ／ルシフェラーゼシグナル増幅ループが開始され、シグナルが増幅された（図７の３０００秒の時点での開始する実線のプロットを参照されたい）。これらの結果は、本発明のシーケンシング方法によって生成される発光シグナル（したがって、その後の蛍光シグナル）が、ＡＴＰスルフリラーゼ／ルシフェラーゼシグナル増幅ループを開始する、ＡＴＰ再生酵素（この実施例ではＡＴＰスルフリラーゼ）およびその同族のＡＴＰ再生酵素基質（この実施例ではＡＰＳ）の添加によって増幅できることを示す。

標準的な反応と同様に３つの反応が行われ、無機ピロリン酸の様々な相対希釈が、１倍のＭｇＣｌ２と共に、０．０２倍（１：５０希釈）、０．０５倍（１：２０希釈）、および１倍（希釈なし）の１倍のピロホスファターゼの量で添加された。図７に示すように、無機ピロホスファターゼを添加するとループシグナルが減少する（０．０２倍Ｐｐａｓｅのドットプロットと０．０５倍Ｐｐａｓｅの破線プロット）。より高い濃度の無機ピロホスファターゼでは、ループは完全に減少する（１倍Ｐｐａｓｅの破線プロット）。これは、ＡＴＰスルフリラーゼ／ルシフェラーゼシグナル増幅ループによって増幅される発光シグナルのレベルが、ＡＴＰスルフリラーゼの濃度に対するピロホスファターゼの濃度比を調整することによって有利に制御され得ることを示している。

実施例２Ｃ−補酵素ＡをＡＴＰスルフリラーゼ／ルシフェラーゼシグナル増幅ループ反応に添加することによる発光シグナルへの影響
補酵素ＡをＡＴＰスルフリラーゼ／ルシフェラーゼシグナル増幅ループに添加することによる発光シグナルレベルへの影響を、実施例２Ｂと同様に標準的なルシフェラーゼ反応を行うことにより研究した。反応は、７５０ｎｇのルシフェラーゼ、５μｇのＣｙｃ−Ｌｕｃルシフェリン、１．２μＭのＡＴＰ、２ｍＭの補酵素Ａ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１５単位のＡＴＰスルフリラーゼ、２００μＭのＡＰＳを含む１×ＴＡＥ緩衝液で実施した。ルシフェラーゼ、ＡＴＰ、補酵素Ａ、およびＡＰＳはＳｉｇｍａから入手した。ＡＴＰスルフリラーゼおよびＭｇＣｌ２はＮＥＢから入手した。最初に、ＡＴＰスルフリラーゼ、ＡＰＳ、補酵素Ａ、およびＭｇＣｌ２を３８４ウェルマイクロプレートの関連するウェルに分注した。次いで、緩衝液、ルシフェラーゼ、およびＣｙｃ−Ｌｕｃルシフェリンのマスターミックスを調製し、混合して、等量で関連するウェルに分注した。次いで、ＡＴＰを各ウェルに添加した。次いで、ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｐｔｉｍａプレートリーダーから測定値を取得する前に、プレートを１５秒間振盪した。

ルシフェラーゼ、ルシフェリン、ＡＴＰを含む標準的なルシフェラーゼ反応の発光の結果を図８の濃い実線のプロットに示す。図８において、濃い実線のプロットは、通常のルシフェラーゼ反応から予想される発光シグナルの上昇と減衰を示す。破線のプロットは、ＡＴＰスルフリラーゼおよびＡＰＳとのルシフェラーゼ反応を示す。図８の細い線のプロットは、ルシフェラーゼ−ＡＴＰスルフリラーゼがＡＰＳおよび補酵素Ａと一緒に連結した場合を示している。このＡＰＳと補酵素の共投与の例では、蛍光シグナルレベルがはるかに高く、シグナルの耐久性が高くなっている。これらの結果は、補酵素Ａがシグナルにプラスの影響を与えることを示している。これは、ルシフェラーゼへの損傷を防ぎ、ルシフェラーゼ／ルシフェリン対を安定化してループ効率を改善することによって発生すると考えられる。

実施例３−酵素ループを破壊するための酵素比の調整
ルシフェラーゼによって触媒される発光反応に続いて、新しいピロリン酸分子が放出されるが、蛍光標識は付着したままである（ＰＰｉ＋ＦＬ）（図１Ｆ）。この新しく放出されたＰＰｉ−ＦＬは再びＡＴＰスルフリラーゼの基質になり、これによりＡＴＰスルフリラーゼとルシフェラーゼの間に酵素ループが形成される（図１Ｇ上）。このループと共に、ＰＰｉ＋ＦＬはＡＴＰスルフリラーゼによってリサイクルされ、蛍光標識されたＡＴＰ（ＡＴＰ−ＦＬ）に変換され、次いでＰＰｉ−ＦＬを放出するルシフェラーゼによって触媒され得る。これは、標識されたピロリン酸から連続したシグナルを生成し、それによって最新のヌクレオチドのシーケンシングシグナルの増幅メカニズムとして機能する。しかしながら、このループ中に、ポリメラーゼがテンプレートへの別のヌクレオチドの組み込みを受ける場合、継続するＰＰｉ−ＦＬループによって読み取りエラーが発生する可能性がある。

この反応ループを破壊するために、ピロホスファターゼ酵素が反応に導入される（図１Ｇ下）。ピロホスファターゼは、ピロリン酸の２つのリン酸イオンへの加水分解を触媒して、ループを破壊する。しかしながら、ピロホスファターゼはまた、ポリメラーゼによるヌクレオチド組み込みの直後に放出された最初のピロリン酸を使用することもあり得る。これにより、組み込みの結果として生成されたシグナルが失われる可能性がある。

シグナル損失を減らし、ループの増幅効果から利益を得るために、ピロホスファターゼ活性を制御するための複数のアプローチがある。

まず、ＡＴＰスルフリラーゼ活性がピロホスファターゼ活性よりも桁違いに高くなるように酵素濃度の比が調整される。これにより、ポリメラーゼ反応によって生成されるピロホスファターゼとピロホスファターゼの最初の相互作用が非常に起こりにくくなり、ループが何度も実行されて増幅効果が得られるようになる。しかしながら、最終的にはピロリン酸との相互作用が発生し、ループが停止するか、読み取りエラーが発生する可能性がある。ピロホスファターゼとＡＴＰスルフリラーゼの比率がそれに応じて調整されている場合、ループを停止する前に増幅効果を許可している間、このエラーは非常にまれである。ポリメラーゼの組み込みはピロホスファターゼとＡＴＰスルフリラーゼの両方の活性よりも桁違いに遅いため、ループは新しいヌクレオチドの組み込みの前に何度も続く。

ポリメラーゼ、ＡＴＰ−スルフリラーゼ／ルシフェラーゼループ、およびピロリン酸の加水分解の反応速度は、それぞれ独立して調整できる。ここでの目標は、ピロリン酸がピロホスファターゼによって加水分解される前に、ＡＴＰ−スルフリラーゼ／ルシフェラーゼループが発生する回数を最大にすることと、ポリメラーゼが別の組み込み事象に入る前にループが終了することを確実にすることと、である。別の考慮事項は、ピロリン酸の相互作用が、ピロホスファターゼと比較してＡＴＰスルフリラーゼと可能性が高くなるべきで、さもなければピロリン酸がポリメラーゼによって放出された直後に加水分解される場合に、読み取りエラーが発生する。

ポリメラーゼの反応速度は、反応中の他の酵素と比べて劇的に遅く、典型的には毎秒約１０００ヌクレオチド（またはより遅い）であるため（Ｆｉｊａｌｋｏｗｓｋａ，ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．３６，１１０５−１１２１（２０１２）；およびＬａｐｅｎｔａ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．ＰＬＯＳ ＯＮＥ １１，ｅ０１５２９１５（２０１６））、およびヌクレオチドの組み込み事象は、ピロリン酸の生成のために必要とされるため、本明細書では、ＡＴＰ−スルフリラーゼ／ルシフェラーゼループの相対反応速度をピロリン酸よりも約１０２〜１０９倍速くし、ヌクレオチドあたり１０−１〜１０−４％のエラー率を統計的に保証するように調整することが企図されている。他の実施形態では、またピロリン酸より約１０３〜１０９倍速くＡＴＰ−スルフリラーゼ／ルシフェラーゼループの相対的な反応速度を調整することも本明細書において企図される。他の実施形態では、またピロリン酸より約１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、および１０９倍速くＡＴＰ−スルフリラーゼ／ルシフェラーゼループの相対的な反応速度を調整することも本明細書において企図される。従来技術のシーケンシング技術の典型的なエラー率が１実行あたり１５％を超えることを考慮すると（Ｇｏｏｄｗｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１７，３３３−３５１（２０１６））、本発明の方法は、従来のアプローチを大幅に改善する。この構成は、最も遅い反応であるピロリン酸加水分解がポリメラーゼよりもはるかに高速になり、別のヌクレオチド組み込み事象が発生する前に、ＡＴＰスルフリラーゼ／ルシフェラーゼループを何度も通過した後、ピロリン酸加水分解が発生するように調整することもできる。

実施例４−酵素ループを回避するためのルシフェラーゼとピロホスファターゼの共カプセル化
ＡＴＰスルフリラーゼとルシフェラーゼの間の酵素反応ループを回避する別の方法として（図１Ｇ上）、理想的に負に帯電したナノ／マイクロマトリックス（図５）へのルシフェラーゼとピロホスファターゼの共カプセル化が使用される。このマトリックスは、ルシフェラーゼおよびピロホスファターゼのカプセル化が高いナノ粒子の形にすることができる。ＡＴＰ分子は本質的に正味電荷を表さないが、ＰＰｉ−ＦＬは正味負電荷を表す。ポリメラーゼによる組み込み反応に続いてＰＰｉ−ＦＬが放出された後、マトリックスの電荷がＰＰｉ−ＦＬを反発するため、ＰＰｉ−ＦＬは、負に帯電したマトリックス内にカプセル化されているピロリン酸よりもＡＴＰスルフリラーゼと相互作用する可能性が高くなる。ＡＴＰスルフリラーゼは標識ＡＴＰ（ＡＴＰ−ＦＬ）を放出する。ＡＴＰ−ＦＬは負の電荷を表さないため、ルシフェラーゼとピロホスファターゼがカプセル化されている負に帯電したマトリックス中に拡散することができる。次いで、ＡＴＰ−ＦＬはルシフェラーゼと相互作用する。ＰＰｉ−ＦＬが放出されると、最初にマトリックス内でＰＰｉ−ＦＬをリン酸イオンに変換するピロホスファターゼに遭遇し、システム内の任意の他の反応中へとリサイクルされる蛍光標識を排除する。

特定の実施形態では、ルシフェラーゼ酵素およびプリオホスファターゼ酵素は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，９７５，２７８号に記載されている架橋など、当該技術分野で周知の方法を使用して互いに連結または係留することができる。

実施例５−標識された基質と共に機能する標識された酵素的連結物が、発光と蛍光の両方を生じる。
従来技術のパイロシーケンシング法とは対照的に、本発明のＦＬＡＳＨ（登録商標）シーケンシング法は、リアルタイム単一分子シーケンシングを達成するために、パイロシーケンシングで使用される同様の３つの酵素連結物と組み合わされたガンマリン酸標識ヌクレオチドを使用する。本発明のＦＬＡＳＨ（登録商標）法では、反応に関与する各酵素は、標識された基質の変換を触媒する。最初の反応では、ポリメラーゼがガンマリン酸標識ｄＮＴＰを付加し、その結果、標識ピロリン酸が切断される（図１Ａおよび１Ｂを参照されたい）。次に、標識されたＡＴＰスルフリラーゼは、標識されたピロリン酸とＡＰＳを使用して、標識されたＡＴＰを生成し（図１Ｃ）、生成されたＡＴＰは、ガンマリン酸の元の標識を依然として保持している。次いで、その標識されたＡＴＰは、標識されたピロリン酸を放出して発光を生成するルシフェラーゼによってさらに使用される（図１Ｄ〜１Ｆ）。発光生成の前のステップのいずれかの失敗は読み出しを妨げる可能性があるが、発光生成はこれらの前のステップが正常に完了したことの確認である。

この実験では、シーケンス混合物の以下の試薬を使用した：
１０×ＴＡＥ ２．５μＬ
ルシフェラーゼ（１ＭのＴｒｉｓ中５ｍｇ／ｍｌ）０．２５μＬ−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−１．２５μｇ Ｓｉｇｍａ
Ｃｙｃ−Ｌｕｃ（１０ｍｇ／ｍＬ）（ｄＭＳＯ中１：１０）２．５μＬ−−−−−−−−−−−−２．５μｇ ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ
シーケナーゼ緩衝液（１０×）２．５μＬ Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ
シーケナーゼ（１３Ｕ／μＬ）＝０．２５μＬ−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−（３．２５単位）Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ
テンプレート５００ｎＭ＝０．５μＬ−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−１０ｎＭ ＩＤＴ
プライマー１００μＭ＝０．５μＬ−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−２μＭ ＩＤＴ
ｄＧＴＰ、Ｃｙ５、Ａｔｔｏ６４７ １ｍＭ＝５μＬ−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−２００μＭ Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ
ＭｇＳＯ４（１００ｍＭ）＝（ｒｘｎあたり１．２５μＬ）−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−１ｍＭ ＮＥＢ
ＡＳｕｌｆ（３００Ｕ／ｍＬ）＝０．２５μＬ−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−０．０７５Ｕ ＮＥＢ
ＡＰＳ（１０ｍＭ）＝０．５μＬ−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−２００μＭ Ｓｉｇｍａ

この実施例では、本明細書に記載されている本発明のＦＬＡＳＨ（登録商標）シーケンシング反応が行われた。反応は、１×ＴＡＥ緩衝液と、１．２５μｇのルシフェラーゼ、２．５μｇのＣｙｃ−Ｌｕｃルシフェリン、３２５ユニットのシーケナーゼ、１０ｎＭのシトシンホモポリマー、２μＭのプライマー、２００μＭのｄＧＴＰ、２００μＭのｄＧＴＰ−Ｃｙ５、２００μＭのｄＧＴＰ−ＡＴＴＯ−６４７、１ｍＭのＭｇＳＯ４、０．０７５ユニットのＡＴＰスルフリラーゼ、２００μＭのＡＰＳを含む１０×シーケナーゼ緩衝液とで実施した。ルシフェラーゼおよびＡＰＳはＳｉｇｍａから入手した。ＡＴＰスルフリラーゼおよびＭｇＳＯ４はＮＥＢから入手した。シーケナーゼおよびシーケナーゼ緩衝液は、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒから入手した。シトシンホモポリマーおよびプライマーはＩＤＴから入手した。ｄＧＴＰ−ＡＴＴＯ６４７はＪｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した。

最初に２つの個別のマスターミックスが調製された。第１のマスターミックスには、水、シーケナーゼ反応緩衝液、シーケナーゼ、シトシンホモポリマー、プライマー、ＡＰＳ、およびＡＴＰスルフリラーゼが含まれていた。第２のマスターミックスには、水、１×ＴＡＥ緩衝液、ＭｇＳＯ４、ルシフェラーゼ、およびＣｙｃ−Ｌｕｃルシフェリンが含まれていた。マスターミックスの各々を混合し、各マスターミックスのアリコートを取り出して混合し、その時点でｄＮＴＰを添加してＦＬＡＳＨ（登録商標）反応を調製した。この反応を３８４ウェルマイクロプレートのウェルに入れ、次いで光出力を集束するレンズと光を検出するＰＭＴ光検出器を備えたカスタマイズされた光学セットアップに入れた。各フィルターを手動で交換して、各ＦＬＡＳＨ（登録商標）反応ミックスのスペクトルを取得した。

この実施例では、本明細書に記載される本発明のＦＬＡＳＨ（登録商標）シーケンシング反応が行われ、シーケンシング混合物は、ポリメラーゼ−ＡＴＰスルフリラーゼ−ルシフェラーゼ連結物を含み、標的テンプレート核酸は、シトシンホモポリマー＊（配列番号１）であった。この場合、外部励起源がないため、スペクトルは外部増幅なしの発光スペクトルとなる。結果は、全ての反応が完了した場合にのみ発光を生成できる、発光の生成を示している。したがって、結果は、シーケンシング法の全ての反応が完了したことを示している。図６に示すスペクトルからわかるように、標識されないｄＧＴＰを溶液に添加すると、発光が生成され、記載された酵素連結物の正常な操作が実証された（図６；濃い実線プロット）。標識されないｄＧＴＰの代わりにガンマリン酸標識ｄＧＴＰを使用した場合も同様に、全ての反応が完了したことを示す発光シグナルが観察された。しかしながら、これらの２つのガンマ−リン酸標識ｄＧＴＰの場合、驚くべきことに、ｄＧＴＰ−ＡＴＴＯ６４７の蛍光放射ピークに対応する６７０ｎｍ付近（図６；明るい実線プロット）とｄＧＴＰ−Ｃｙ５の蛍光放射ピークに対応する６８０ｎｍ付近（図６；破線プロット）に余分な蛍光放射ピークも観察された。この特定の場合では、蛍光ラベルはＣｙ５である。これは、基質が標識された場合、この酵素的連結物が依然として発光をもたらす標識された基質と共に機能することを確認する。さらに、ルシフェラーゼ反応から生成された発光を使用して、そのルシフェラーゼ発光反応によって生成された標識ピロリン酸を励起することが示された（図１Ｅ−１Ｆ）。したがって、図１Ｄ〜１Ｆに示すルシフェラーゼ反応によって生成された発光によって引き起こされる、ルシフェラーゼによって放出されたピロリン酸の蛍光標識の励起に対応する、プロセスの別の重要な事象が示された。これらの結果は、標識されたＡＴＰおよびルシフェラーゼを使用したルシフェリンの触媒により、それぞれの標識されたｄＮＴＰに特異的な蛍光の放射をもたらすことを示している。
＊テンプレートＤＮＡ（配列番号１）（５’−ＣＣＣ ＣＣＣ ＣＣＣ ＣＣＣ ＣＣＣ ＣＣＣ ＣＣＣ ＣＣＣ ＣＣＣ ＣＣＣ ＣＣＣ ＣＣＣ ＣＣＣ ＣＣＣ ＣＣＣ ＣＣＣ ＣＣＣ ＣＣＣ ＣＣＣ ＣＣＣ ＣＣＣ ＣＣＣ ＣＣＣ ＣＣＣ ＣＣＣ ＣＣＣ ＣＣＣ ＣＣＣ ＣＣＣ ＣＣＣ ＡＡＡ ＴＣＴ ＴＡＴ ＣＡＴ ＣＧＧ ＴＣＧ ＧＴＧ−３’）
プライマー（配列番号２）（５’−ＣＡＣ ＣＧＡ ＣＣＧ ＡＴＧ ＡＴＡ ＡＧＡ ＴＴＴ Ｇ −３’）

本実施形態は、本明細書の例示的な実施形態を参照して特に示され説明されたが、以下の特許請求の範囲によって定義される本実施形態の趣旨および範囲から逸脱することなく、形態および詳細の様々な変更が行われ得ることが当業者によって理解される。当業者は、日常的な実験にすぎないものを用いて、本明細書において記載される具体的な手順の多くの均等物を認識するか、またはそれを確かめることができるであろう。そのような均等物は、本発明の範囲内にあるとみなされ、以下の特許請求の範囲に含まれる。本出願を通して引用される全ての非特許文献刊行物、特許、および特許出願の内容は、全ての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。それらの特許、出願および他の文書の適切な構成要素、プロセス、および方法は、本発明およびその実施形態のために選択され得る。

Claims (33)

1. 核酸テンプレートをシーケンシングする方法であって、
   （ｉ）ポリメラーゼ酵素、（ｉｉ）ＡＴＰ再生酵素、（ｉｉｉ）発光酵素、（ｉｖ）テンプレート核酸、および（ｉｉｉ）成長する核酸鎖のテンプレート指向合成を実行するための成分を有するポリメラーゼ−ＡＴＰ再生酵素−発光試薬溶液を含むシーケンシング混合物を提供することであって、前記試薬溶液が、ＡＴＰ再生酵素基質、発光基質、および複数の種類のヌクレオチド類似体を含み、ヌクレオチド類似体の各種類が前記ポリメラーゼにより切断可能な標識された脱離基を有し、ヌクレオチド類似体の各種類が異なる標識を有し、前記標識された脱離基がテンプレート鎖へのそれぞれのヌクレオチド類似体のポリメラーゼ依存性結合の際に切断される、提供することと、
   複数のヌクレオチド類似体が前記テンプレートに逐次的に追加されるように核酸合成を実行することであって、それにより：ａ）ヌクレオチド類似体が前記ポリメラーゼと会合し、ｂ）前記ヌクレオチド類似体は、そのヌクレオチド類似体上の前記標識された脱離基が前記ポリメラーゼによって切断されるときに、前記ポリメラーゼによって前記テンプレート鎖に組み込まれ、前記標識された脱離基が、前記ＡＴＰ再生酵素によってＡＴＰ再生酵素基質と結合され、標識されたＡＴＰを生じ、次いでｃ）前記標識されたＡＴＰを発光酵素に結合し、発光基質が、前記発光酵素によって触媒されて、限定された期間、発光を生成し、それぞれの前記標識された脱離基を再生し、前記発光が、それぞれの前記標識された脱離基上の前記標識に光を生成させる、実行することと、
   核酸合成が行われている間に前記標識からの光を検出し、各々の控えめな発光期間中に検出された光を使用して、前記テンプレート核酸の配列を決定することと、を含む、方法。
2. 前記ヌクレオチド類似体が、末端リン酸に結合したフルオロフォアによって修飾されている、請求項１に記載の方法。
3. 前記脱離基が標識されたピロリン酸塩である、請求項１〜２に記載の方法。
4. 前記ピロリン酸塩がフルオロフォアで標識されている、請求項１〜３に記載の方法。
5. ヌクレオチドの各塩基が、他の塩基と比較して固有のフルオロフォアで標識されている、請求項１〜４に記載の方法。
6. 前記発光酵素がルシフェラーゼである、請求項１〜５に記載の方法。
7. 前記ルシフェラーゼがホタルルシフェラーゼである、請求項１〜６に記載の方法。
8. 前記発光基質がルシフェリンである、請求項１〜７に記載の方法。
9. 前記ポリメラーゼ酵素がＤＮＡポリメラーゼである、請求項１〜８に記載の方法。
10. 前記ＡＴＰ再生酵素が、ＡＴＰスルフリラーゼ、ＡＧＰＰａｓｅ、およびＰＰＤＫから選択される、請求項１〜９に記載の方法。
11. 前記ＡＴＰ再生酵素基質が、ＡＰＳ、ＡＤＰ−グルコース、およびＡＭＰ＋ＰＥＰから選択される、請求項１〜１０に記載の方法。
12. 前記標識された脱離基が、ＡＴＰスルフリラーゼによってＡＰＳと結合されるか、ＡＧＰＰａｓｅによってＡＤＰ−グルコースと結合されるか、またはＰＰＤＫによってＡＭＰ＋ＰＥＰと結合される、請求項１〜１１に記載の方法。
13. ヌクレオチド類似体の種類がｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰαＳ、ｄＣＴＰαＳ、ｄＴＴＰαＳ、およびｄＡＴＰαＳを含む、請求項１〜１２に記載の方法。
14. 前記シーケンシング混合物が、前記標識されたピロリン酸塩を２つのリン酸イオンに変換することができるピロホスファターゼ酵素をさらに含む、請求項１〜１３に記載の方法。
15. 酵素濃度の比が、ＡＴＰスルフリラーゼ／ルシフェラーゼループ活性が前記ピロホスファターゼ活性よりも桁違いに高くなるように調整される、請求項１４に記載の方法。
16. ＡＴＰ−スルフリラーゼ／ルシフェラーゼループの相対的な反応速度が前記ピロホスファターゼ反応よりも、少なくとも１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２倍からなる群から選択される倍数速い、請求項１５に記載の方法。
17. 前記ルシフェラーゼおよびピロホスファターゼがナノマトリックス中に共カプセル化されている、請求項７〜１６に記載の方法。
18. 前記ナノマトリックスが、負に帯電したナノ粒子である、請求項１７に記載の方法。
19. 標識されたＡＴＰ（ＡＴＰ−ＦＬ）が、ルシフェラーゼおよびピロホスファターゼが共カプセル化されている前記負に帯電したナノマトリックス中に拡散することができる、請求項１８に記載の方法。
20. ｃ）前記標識されたＡＴＰを発光酵素に結合させ、発光基質が前記発光酵素によって触媒されるステップが、前記ナノマトリックス内で起こる、請求項１７〜１９に記載の方法。
21. 複数のポリメラーゼ酵素が使用される、請求項１〜２０に記載の方法。
22. 複数のポリメラーゼ酵素が少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００、１０００００、２０００００、３０００００、４０００００、５０００００、６０００００、７０００００、８０００００、９０００００、および少なくとも１００００００のポリメラーゼ酵素からなる群から選択される量で使用される、請求項１〜２１に記載の方法。
23. 複数のポリメラーゼ酵素が、少なくとも２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、１５０：１、２００：１、２５０：１、３００：１、３５０：１、４００：１、４５０：１、５００：１、５５０：１、６００：１、６５０：１、７００：１、７５０：１、８００：１、８５０：１、９００：１、９５０：１、１０００：１、１００００：１、２００００：１、３００００：１、４００００：１、５００００：１、６００００：１、７００００：１、８００００：１、９００００：１、１０００００：１、２０００００：１、３０００００：１、４０００００：１、５０００００：１、６０００００：１、７０００００：１、８０００００：１、９０００００：１、および少なくとも１００００００：１からなる群から選択されるポリメラーゼ対テンプレートの比で使用される、請求項１〜２２に記載の方法。
24. テンプレート核酸をシーケンシングする方法であって、
    標的テンプレート核酸、複数の種類のヌクレオチド類似体、および複数のポリメラーゼ酵素を含むシーケンシング混合物を提供することと、
    複数のヌクレオチド類似体が前記テンプレートに逐次的に追加されるように核酸合成を実行することと、
    核酸合成が行われている間にそれぞれのヌクレオチド類似体を検出して、前記テンプレート核酸の配列を決定することと、を含む、方法。
25. 複数のポリメラーゼ酵素が少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００、１０００００、２０００００、３０００００、４０００００、５０００００、６０００００、７０００００、８０００００、９０００００、および少なくとも１００００００のポリメラーゼ酵素からなる群から選択される量で使用される、請求項２４に記載の方法。
26. 複数のポリメラーゼ酵素が、少なくとも２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、１５０：１、２００：１、２５０：１、３００：１、３５０：１、４００：１、４５０：１、５００：１、５５０：１、６００：１、６５０：１、７００：１、７５０：１、８００：１、８５０：１、９００：１、９５０：１、１０００：１、１００００：１、２００００：１、３００００：１、４００００：１、５００００：１、６００００：１、７００００：１、８００００：１、９００００：１、１０００００：１、２０００００：１、３０００００：１、４０００００：１、５０００００：１、６０００００：１、７０００００：１、８０００００：１、９０００００：１、および少なくとも１００００００：１からなる群から選択されるポリメラーゼ対テンプレートの比で使用される、請求項２４〜２５に記載の方法。
27. シーケンシング反応におけるＡＴＰ再生酵素／ルシフェラーゼ増幅ループのシグナルの強度を増加させる方法であって、請求項１に記載の方法を実施することと、ＡＴＰ再生酵素／ルシフェラーゼ増幅ループのシグナルの強度を増加させるのに有効な補酵素Ａ：ルシフェラーゼ比で、補酵素Ａを前記シーケンシング混合物に添加することと、を含む、方法。
28. 前記補酵素Ａ：ルシフェラーゼ比が、１：１、１：２、１：５、１：１０、１：２０、１：３０、１：４０、１：５０、１：６０、１：７０、１：８０、１：９０、１：１００、１：２５０、１：１５０、１：１７５、１：２００、１：２２５、１：２５０、１：２７５、１：３００、１：３５０、１：４００、１：４５０、１：５００、１：５５０、１：６００、１：６５０、１：７００、１：７５０、１：８００、１：８５０、１：９００、１：９５０、１：１０００、１：１５００、１：２０００、１：３０００、１：４０００、１：５０００の補酵素Ａ：ルシフェラーゼからなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
29. 前記ルシフェラーゼ：補酵素Ａ比が、１：１、１：２、１：５、１：１０、１：２０、１：３０、１：４０、１：５０、１：６０、１：７０、１：８０、１：９０、１：１００、１：２５０、１：１５０、１：１７５、１：２００、１：２２５、１：２５０、１：２７５、１：３００、１：３５０、１：４００、１：４５０、１：５００、１：５５０、１：６００、１：６５０、１：７００、１：７５０、１：８００、１：８５０、１：９００、１：９５０、１：１０００、１：１５００、１：２０００、１：３０００、１：４０００、１：５０００のルシフェラーゼ：補酵素Ａからなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
30. シーケンシング反応におけるＡＴＰ再生酵素／ルシフェラーゼ増幅ループのシグナルの時間の長さを調節する方法であって、請求項１に記載の方法を実施することと、ＡＴＰ再生酵素／ルシフェラーゼ増幅ループのシグナルの時間の長さを調節するのに有効なピロホスファターゼ対ＡＴＰ再生酵素の比で、ピロホスファターゼを前記シーケンシング混合物に添加することと、を含む、方法。
31. ＡＴＰ再生酵素／ルシフェラーゼ増幅ループのシグナルの時間の長さを調節するのに有効な前記ＡＴＰ再生酵素対ピロホスファターゼ酵素比が、１：１、１：２、１：５、１：１０、１：２０、１：３０、１：４０、１：５０、１：６０、１：７０、１：８０、１：９０、１：１００、１：２５０、１：１５０、１：１７５、１：２００、１：２２５、１：２５０、１：２７５、１：３００、１：３５０、１：４００、１：４５０、１：５００、１：５５０、１：６００、１：６５０、１：７００、１：７５０、１：８００、１：８５０、１：９００、１：９５０、１：１０００、１：１５００、１：２０００、１：３０００、１：４０００、１：５０００のＡＴＰ再生酵素：ピロホスファターゼ酵素からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
32. ＡＴＰ再生酵素／ルシフェラーゼ増幅ループのシグナルの時間の長さを調節するのに有効な前記ピロホスファターゼ：ＡＴＰ再生酵素比が、１：１、１：２、１：５、１：１０、１：２０、１：３０、１：４０、１：５０、１：６０、１：７０、１：８０、１：９０、１：１００、１：２５０、１：１５０、１：１７５、１：２００、１：２２５、１：２５０、１：２７５、１：３００、１：３５０、１：４００、１：４５０、１：５００、１：５５０、１：６００、１：６５０、１：７００、１：７５０、１：８００、１：８５０、１：９００、１：９５０、１：１０００、１：１５００、１：２０００、１：３０００、１：４０００、１：５０００のピロホスファターゼ：ＡＴＰ再生酵素からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
33. 前記ＡＴＰ再生酵素がＡＴＰスルフリラーゼである、請求項３０〜３２に記載の方法。
    
    

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