CN107002129A - 基因检测平台 - Google Patents
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Abstract
本文公开了用于采用纯多核苷酸聚合酶进行多核苷酸扩增的方法、组合物、设备、系统和试剂盒。在一些情况下,本文公开了用于多核苷酸测序的方法、组合物、设备、系统和试剂盒。
Description
交叉引用
本申请要求于2014年9月2日提交的第62/044,872号美国临时申请的权益,该临时申请通过引用并入本文。
对经由EFS-WEB提交的序列表的引用
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发明背景
基因扩增和基因测序近年来已引起广泛的关注。已经开发出各种基因扩增方法来促进这类扩增。通常,多核苷酸(如DNA)的扩增需要待扩增的多核苷酸链(靶多核苷酸)、含有与靶标互补的序列的短多核苷酸片段(即,引物)、核苷酸,以及使核苷酸以与靶多核苷酸互补的方式聚合(即共价连接)的酶。在化学反应期间,新延伸的多核苷酸链每并入一个核苷即释放一个焦磷酸分子。
一种扩增反应为采用热稳定DNA聚合酶的多核苷酸链反应(PCR)。这类聚合酶的一个实例为最初从细菌水生栖热菌(Thermus aquaticus)中分离的Taq聚合酶。PCR依赖于热循环,该热循环由用于DNA解链和DNA酶促复制的反应的重复加热和冷却循环组成。以下过程需要热循环:(a)变性:双链多核苷酸分离成单链多核苷酸,该单链多核苷酸充当将会形成互补链的核苷酸的缔合的模板,其通常在94-98℃下发生;(b)退火:降低温度以允许引物与分离的多核苷酸链(即,ssDNA)发生氢键键合,其通常在50-65℃下发生;以及(c)延伸:允许酶促聚合的最佳条件,由此形成相对于模板多核苷酸的互补链,其通常在70-80℃下发生(取决于所用的具体聚合酶)。
目前,由于扩增试剂中存在污染物(如来自宿主基因组物质和质粒的多核苷酸污染物),因此基因检测的灵敏度有限。
发明内容
本文提供了用于制备多核苷酸样品以供其表达、扩增、测序或其任意组合的方法、组合物、试剂、装置、系统、试剂盒、程序、商业方法、报告和计算机软件。
在一些方面,本发明公开了一种多核苷酸测序方法,其包括:(a)通过以下步骤复制至少一种靶多核苷酸:(i)使与所述至少一种靶多核苷酸的至少一部分互补的互补多核苷酸与所述至少一种靶多核苷酸杂交;(ii)使一种核苷多磷酸与所述至少一种靶多核苷酸杂交,其中该核苷选自腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶;(iii)将所述一种核苷多磷酸与所述互补多核苷酸连接以延伸所述互补多核苷酸;(iv)释放至少一个焦磷酸;(b)将所述至少一个焦磷酸转化成ATP;(c)检测所述ATP;以及(d)通过使用糖磷酸化酶用过量的所述一种核苷多磷酸将至少一种糖磷酸化,而将所述过量的所述一种核苷多磷酸转化成核苷酸二磷酸或核苷酸单磷酸。
在一些方面,本发明公开了一种多核苷酸测序方法,其包括:(a)通过以下步骤复制至少一种靶多核苷酸:(i)使与所述至少一种靶多核苷酸的至少一部分互补的互补多核苷酸与所述至少一种靶多核苷酸杂交;(ii)使一种核苷多磷酸与所述至少一种靶多核苷酸杂交,其中该核苷选自腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶;(iii)将所述一种核苷多磷酸与所述互补多核苷酸连接以延伸所述互补多核苷酸;(iv)释放至少一个焦磷酸;(b)将所述至少一个焦磷酸转化成ATP;(c)检测所述ATP;以及(d)在不使用核苷降解酶的情况下将过量的所述一种核苷多磷酸灭活。
在一些方面,本发明公开了一种多核苷酸测序方法,其包括:(a)通过以下步骤复制至少一种靶多核苷酸:(i)使与所述至少一种靶多核苷酸的至少一部分互补的互补多核苷酸与所述至少一种靶多核苷酸杂交;(ii)使一种核苷多磷酸与所述至少一种靶多核苷酸杂交,其中该核苷选自腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶;(iii)将所述一种核苷多磷酸与所述互补多核苷酸连接以延伸所述互补多核苷酸;(iv)释放至少一个焦磷酸;(b)将所述至少一个焦磷酸转化成ATP;(c)检测所述ATP;以及(d)使用热稳定的酶将过量的所述一种核苷多磷酸灭活。
在一些方面,本发明公开了一种多核苷酸测序方法,其包括:(a)通过以下步骤复制至少一种靶多核苷酸:(i)使与所述至少一种靶多核苷酸的至少一部分互补的互补多核苷酸与所述至少一种靶多核苷酸杂交;(ii)使一种核苷多磷酸与所述至少一种靶多核苷酸杂交,其中该核苷选自腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶;其中所述一种核苷多磷酸不包含核苷多磷酸硫醇;(iii)将所述一种核苷多磷酸与所述互补多核苷酸连接以延伸所述互补多核苷酸;以及(iv)释放至少一个焦磷酸;(b)将所述至少一个焦磷酸转化成ATP;以及(c)检测所述ATP。
在一些情况下,本发明公开了一种用于测量在多核苷酸复制过程中释放的焦磷酸的方法,其包括:(a)在反应混合物中进行多核苷酸复制,其中该复制导致至少一个焦磷酸的释放;(b)将所述焦磷酸转化成ATP;(c)向所述反应混合物中添加至少一种糖;以及(d)使用不识别dATP的萤光素酶检测所述ATP。
在一些情况下,本发明还公开了一种用于测量在多核苷酸复制过程中释放的焦磷酸的方法,其包括:(a)在至少一种糖的存在下进行多核苷酸复制,其中该复制导致至少一个焦磷酸的释放;(b)将所述焦磷酸转化成ATP;以及(c)使用不识别dATP的萤光素酶检测所述ATP。
在一些情况下,本发明进一步公开了一种用于监测糖磷酸化的速率的方法,其包括:(a)将糖磷酸化酶构建体与核苷多磷酸和至少一种糖反应,其中该糖磷酸化酶构建体包含白蛋白结合部分;以及(b)测量至少一种反应产物的量。
在一些方面,本发明公开了与一种或多种本文公开的酶或蛋白质有关的构建体设计。在一些情况下,本发明公开了一种包含白蛋白结合部分的多核苷酸扩增酶构建体,其中该多核苷酸扩增酶在至少一种核苷多磷酸的存在下扩增靶多核苷酸。
在一些情况下,本发明公开了一种包含对至少两种核苷多磷酸具有结合亲和力的至少一个部分的糖磷酸化酶构建体;其中所述对至少两种核苷多磷酸的结合亲和力在至少1微摩尔到至多250微摩尔(μM)的范围内;其中所述核苷选自腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶;并且其中所述糖磷酸化酶构建体将至少一种糖磷酸化,以产生至少一种磷酸化的糖。
在一些情况下,本发明公开了一种包含与白蛋白结合的至少一个部分的糖磷酸化酶构建体,其中该糖磷酸化酶构建体将至少一种糖磷酸化,以产生至少一种磷酸化的糖;其中该糖磷酸化酶构建体对白蛋白的解离常数为1.5纳摩尔或更低。
在一些方面,本发明公开了包含糖磷酸化酶和至少一个白蛋白结合位点的糖磷酸化酶构建体。在一些方面,本发明还公开了包含生物发光酶和至少一个白蛋白结合位点的生物发光酶构建体。
在一些方面,本发明公开了促进生物发光反应且不将dATP作为底物识别的生物发光酶。在一些方面,本发明公开了促进在高于50摄氏度的温度下的糖磷酸化反应的糖磷酸化酶。在一些方面,本发明公开了促进在高于50摄氏度的温度下的生物发光反应的生物发光酶。
在一些方面,本发明公开了一种用于酶纯化的白蛋白亲和分离方法,其包括:(a)形成包含与白蛋白结合部分结合的靶酶的蛋白质构建体;(b)使所述蛋白质构建体与白蛋白接触以形成白蛋白分子复合物;(c)分离所述蛋白质构建体;以及(d)将所述蛋白质构建体从所述白蛋白分子复合物中取回,其中所述蛋白质构建体保留所述靶酶的活性。
在一些方面,本发明公开了与一种或多种本文所述的方法一起使用的试剂盒。在一些情况下,本发明公开了一种用于多核苷酸测序的试剂盒,其包含:(a)多核苷酸扩增试剂;(b)糖磷酸化酶;以及(c)生物发光酶;其中该试剂盒不包含核苷酸降解酶。
在一些情况下,本发明公开了一种用于多核苷酸测序的试剂盒,其包含:(a)多核苷酸扩增试剂;(b)不识别dATP的生物发光酶;其中该试剂盒不包含识别dATP的生物发光酶。
在一些情况下,本发明公开了一种用于多核苷酸测序的试剂盒,其包含:(a)多核苷酸扩增试剂;以及(b)在50摄氏度以上稳定的生物发光酶;其中该试剂盒不包含最多在50摄氏度时稳定的生物发光酶。
在一些情况下,本发明公开了一种用于多核苷酸测序的试剂盒,其包含:(a)多核苷酸扩增试剂;(b)将至少一种核苷多磷酸灭活的热稳定酶;以及(c)生物发光酶。
在一些情况下,本发明公开了一种用于测量在多核苷酸复制过程中释放的焦磷酸的方法,其包括:(a)在反应混合物中进行多核苷酸复制,其中该复制导致至少一个焦磷酸的释放;(b)将所述焦磷酸转化成ATP;(c)向所述反应混合物中添加至少一种糖;以及(d)使用对dATP的识别受损的热稳定萤光素酶检测所述ATP。可在多核苷酸复制后添加至少一种糖。所述糖可被磷酸化。所述糖的磷酸化可消除(quench)过量的核苷酸。所述糖的磷酸化可包括使用糖磷酸化酶。所述热稳定萤光素酶可为热稳定的萤火虫萤光素酶。所述热稳定萤光素酶可在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基T214、I232、F295、E354、I423、D436、L530和L550相对应的一个或多个位置处包含修饰。该修饰可包括T214A、I232A、F295L、E354K、I423L、D436G、L530R和L550V。所述修饰可包括T214A、I232A、F295L、I423L和L550V。所述热稳定萤光素酶的识别受损可以是对dATP的亲和力的降低。所述热稳定萤光素酶可以不识别dATP而识别ATP。所述热稳定萤光素酶可进一步包含选自白蛋白结合蛋白或Z结构域的结合蛋白。所述转化可在ATP硫酸化酶的存在下进行。该ATP硫酸化酶可以是热稳定的。所述多核苷酸复制可进一步包括以下步骤:(a)使与至少一种靶多核苷酸的至少一部分互补的互补多核苷酸与所述至少一种靶多核苷酸杂交;(b)使一种核苷多磷酸与所述至少一种靶多核苷酸杂交,其中该核苷选自腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶;以及(c)将所述一种核苷多磷酸与所述互补多核苷酸连接以延伸所述互补多核苷酸。所述多核苷酸复制可在高于50摄氏度的温度下进行。所述多核苷酸复制可在至少50摄氏度、至少55摄氏度、至少60摄氏度、至少65摄氏度或至少70摄氏度的温度下进行。所述多核苷酸复制可在聚合酶的存在下进行。该聚合酶可为Taq聚合酶。该Taq聚合酶可为天然Taq聚合酶、重组Taq聚合酶或经修饰的Taq聚合酶。所述方法可以不包括单链结合蛋白(SSB)的使用。所述糖磷酸化酶可为己糖激酶。该己糖激酶可为进一步包含选自白蛋白结合蛋白或Z结构域的结合蛋白的经修饰的己糖激酶。该己糖激酶可在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)或大肠杆菌(E.coli)中表达。该己糖激酶可为热稳定的己糖激酶。所述白蛋白结合蛋白可包含ABP(121aa)、BB(214aa)、ABD(46aa)、ADB1结合位点、ADB2结合位点或ADB3结合位点。ABD对白蛋白的亲和力可为1.5纳摩尔或更低。该白蛋白可为血清白蛋白。该白蛋白可为人血清白蛋白。所述己糖激酶、萤光素酶或ATP硫酸化酶可以被化学修饰。所述化学修饰的己糖激酶、萤光素酶或ATP硫酸化酶可包括对所述己糖激酶、萤光素酶或硫酸化酶的碱性侧链的化学中和或化学酸化。所述化学修饰的己糖激酶、萤光素酶或ATP硫酸化酶可包含乙酰化或柠康酰化(citraconylation)。
在一些情况下,本发明公开了一种促进生物发光反应并且对作为底物的dATP的识别受损的热稳定萤光素酶。该热稳定萤光素酶可在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基T214、I232、F295、E354、I423、D436、L530和L550相对应的一个或多个位置处包含修饰。该修饰可包括T214A、I232A、F295L、E354K、I423L、D436G、L530R和L550V。该修饰可包括T214A、I232A、F295L、I423L和L550V。所述热稳定萤光素酶可进一步化学修饰。所述化学修饰的萤光素酶可包括对所述萤光素酶的碱性侧链的化学中和或化学酸化。所述化学修饰的萤光素酶可包含乙酰化或柠康酰化。所述热稳定萤光素酶可在本文所述的方法中使用。
在一些情况下,本发明公开了一种包含生物发光酶和选自白蛋白结合蛋白或Z结构域的结合部分的生物发光酶构建体。该生物发光酶可为萤光素酶。该萤光素酶可在与SEQID NO:2的氨基酸残基T214、I232、F295、E354、I423、D436、L530和L550相对应的一个或多个位置处包含修饰。该修饰可包括T214A、I232A、F295L、E354K、I423L、D436G、L530R和L550V。该修饰可包括T214A、I232A、F295L、I423L和L550V。所述白蛋白结合蛋白可包含BB、ABD、ABP、ABD1、ABD2或ABD3。所述酶构建体可包含His(6)部分。所述结合部分序列可连接在所述生物发光酶序列的5’并进一步连接至His(6)序列的3’,或者可连接在HIS(6)序列的5’并进一步连接至所述生物发光酶序列的3’。所述HIS(6)序列可连接在所述生物发光酶序列的5’并进一步连接至所述结合部分序列的3’,或者可连接在所述结合部分序列的5’并进一步连接至所述生物发光酶序列的3’。所述生物发光酶序列可连接在所述结合部分序列的5’并进一步连接至His(6)序列的3’,或者可连接在HIS(6)序列的5’并进一步连接至所述结合部分序列的3’。
在一些情况下,本发明公开了一种包含选自白蛋白结合蛋白或Z结构域的结合部分的糖磷酸化酶构建体,其中所述糖磷酸化酶将至少一种糖磷酸化以产生至少一种磷酸化的糖。所述糖磷酸化酶可为己糖激酶。所述白蛋白结合蛋白可包含ABP(121aa)、BB(214aa)、ABD(46aa)、ADB1结合位点、ADB2结合位点或ADB3结合位点。ABD对白蛋白的亲和力可为1.5纳摩尔或更低。所述白蛋白可为人血清白蛋白或牛血清白蛋白。所述酶构建体可进一步包含HIS(6)部分。所述酶构建体可包括图5、19或20C中所示的构建体。所述酶构建体可在酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母或大肠杆菌中表达。
在一些情况下,本发明公开了一种包含选自白蛋白结合蛋白或Z结构域的结合部分的糖磷酸化酶,其中该酶对选自dTTP、dCTP、dGTP、dUTP和dATP的至少两种核苷酸具有相似的结合亲和力。该酶可将至少一种糖磷酸化以产生至少一种磷酸化的糖。相似的结合亲和力可在至少1微摩尔到至多250微摩尔的范围内。该酶可以以相似的效率使所述核苷酸与至少一种糖反应。该酶可以以相似的速率使所述核苷酸与至少一种糖反应。该糖可为己糖。该己糖可选自葡萄糖、阿洛糖、阿卓糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖和塔罗糖。该酶可为己糖激酶。己糖激酶可构成本文所述的构建体。己糖激酶可进一步化学修饰。所述化学修饰的己糖激酶可包括对所述萤光素酶的碱性侧链的化学中和或化学酸化。所述化学修饰的己糖激酶可包含乙酰化或柠康酰化。所述化学修饰的己糖激酶可为热稳定的己糖激酶。所述糖磷酸化酶可在本文所述的方法中使用。
附图简述
本发明的新颖特征在所附权利要求中具体阐述。通过参考以下对利用本发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述和附图,将会获得对本发明的特征和优点的更好的理解,附图中:
图1示出了本文公开的方法、系统和设备的概览。
图2显示了本文公开的纯化方法。柱上的名称指出该柱对其具有亲和力的目标实体(即,纯化标签)。
图3描绘了本文公开的经修饰的Taq聚合酶的构建体。
图4示出了本文公开的测序方法。
图5描绘了本文公开的经修饰的己糖激酶的构建体。
图6示出了链球菌蛋白G中的各个白蛋白结合位点。
图7示出了本文公开的经修饰的萤光素酶的构建体。
图8示出了本文公开的计算机系统的图示。
图9A-图9C示出了用于生成经修饰的己糖激酶的易错(error prone)PCR方法。
图10A-图10B示出了用于生成经修饰的萤光素酶的易错PCR方法。
图11A-图11F显示了在从大肠杆菌或酵母细胞中纯化后,Taq聚合酶-ABS构建体的凝胶电泳。
图12示出了萤光素酶的示例性PCR诱变。
图13A-图13D描绘了本文所述的示例性萤光素酶构建体。
图14显示了具有不同突变的经修饰萤光素酶上的说明性SDS-PAGE。
图15显示了本文所述的经修饰的萤光素酶以及Promega萤光素酶在各个温度下对ATP的萤光素酶活性。Promega萤光素酶用作对照。
图16A-图16C显示了示例性的经修饰萤光素酶在不同温度下的dATP活性,该活性以相对于其ATP活性的百分比示出。Promega萤光素酶用作对照。
图17示出了Promega萤光素酶与本文所述示例性的经修饰萤光素酶之间萤光素酶活性的比较,该活性以相对于其在27℃下的原始活性的百分比示出。
图18示出了己糖激酶的示例性PCR诱变。
图19示出了本文所述的示例性己糖激酶构建体。
图20A-图20C示出了包含Z-basic标签的示例性萤光素酶和己糖激酶构建体设计。
图21A-图21B示出了在27℃(A)和50℃(B)下,腺苷三磷酸双磷酸酶(apyrase)和己糖激酶对dATP的活性。
图22A-图22B显示了在27℃(A)和50℃(B)下,腺苷三磷酸双磷酸酶和己糖激酶对dNTP的活性。
具体实施方式
本文提供了用于制备多核苷酸样品以供其表达、扩增、测序或其任意组合的方法、组合物、试剂、装置、系统、试剂盒、程序、商业方法、报告和计算机软件。该方法、组合物和试剂可用于许多应用,包括例如用于制备多核苷酸样品以供其表达、扩增、测序或其任意组合。此外,其装置、系统、试剂盒、程序、商业方法、报告和计算机软件可用于实施主题方法,并可使用所提供的组合物和试剂。本领域技术人员在阅读下文更全面描述的该方法、组合物、试剂、装置、系统、试剂盒、程序、商业方法、报告和计算机软件的细节后,将会明白本发明的这些及其他目的、优点和特征。
在描述本方法、组合物、试剂、装置、系统、试剂盒、程序、商业方法、报告或计算机软件之前,应当理解,本发明不限于所描述的具体方法、组合物、试剂、装置、系统、试剂盒、程序、商业方法、报告或计算机软件,其本身当然可以变化。还应理解,本文所用的术语仅出于描述具体实施方案的目的,并非意在限制,因为本发明的范围将仅由所附权利要求来限制。
在提供数值的情况下,应当理解,除非上下文另有明确规定,否则每个值都精确到单位的十分之一(即,+/-0.1个单位)。在所述范围内的任何所述值或中间值与在所述范围内的任何其他所述值或中间值之间的每个较小范围均被包含在本发明内。
除非另有定义,否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文所述类似或等同的任何方法和材料均可在本发明的实践或测试中使用,但现在描述一些有潜力并优选的方法和材料。本文提及的所有出版物均通过引用并入本文,以公开并描述为其而引用该出版物的方法和/或材料。应当理解,在存在矛盾的情况下,本公开内容取代所并入的出版物的任何公开内容。
本领域技术人员在阅读本公开内容后将会明白,本文描述和说明的每一个单独实施方案均具有分立的组分和特征,该组分和特征可以容易地与其他几个实施方案中任一个的特征分开或组合,而不脱离本发明的范围或精神。任何记载的方法均可按照所记载的事件的顺序或在逻辑上可行的任何其他顺序来进行。
必须注意,除非上下文另有明确规定,如本文和所附权利要求中所用的,单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数个指示物。因此,例如,提及“一个细胞”包括多个这样的细胞,提及“该多核苷酸”包括提及一个或多个多核苷酸及其等同物;并且提及“该肽”包括提及一个或多个肽,以及本领域技术人员已知的其等同物,例如多肽,等等。
本文所讨论的出版物仅针对其在本申请的申请日之前的公开内容而提供。本文中的任何内容均不应被解释为承认本发明由于在先发明而无权先于这类出版物。此外,所提供的出版物的日期可能与实际出版日期不同,这可能需要单独确认。
一般说明
本文公开了用于核酸测序的方法、组合物、设备、系统和试剂盒,其基于在多核苷酸链合成过程中对核苷酸掺入生长的多核苷酸链中时所释放的焦磷酸的检测。
如图1所示,本说明书有助于对来自受试者的含有靶多核苷酸(例如,DNA)的靶样品进行扩增和/或测序。该样品可包括含有靶多核苷酸的任何样品。该样品可以是身体样品,如任何体液、身体部位或组织。例如,该样品可包括血液、毛发、皮肤、羊水、细胞(例如,颊细胞)。该受试者可为人或动物。该动物可为哺乳动物。该动物可为宠物、野生动物、农场动物或实验室动物。在一些实例中,将样品插入多核苷酸扩增仪中。该样品随后可在多核苷酸测序仪中经历多核苷酸测序。可以传输来自多核苷酸测序仪的数据。可进一步分析来自多核苷酸测序仪的数据。可将原始数据或经分析的数据递送、传输或报告至请求方。请求方可为受试者、实验室、政府实体、医院、执法机构、医生、健康相关机构或任何请求方。可收费对样品进行扩增和/或测序。可收费递送、传输或报告原始数据或经分析的数据。
在一些实例中,101示出了用于DNA测序装置102的样品输入。101进一步含有促进测序反应的试剂和组分。102执行本文公开的测序方法103(例如,Lumen测序)。在一些情况下,102进一步包含能够对反应期间光的产生进行测量的发光计。103有时如图4所示。103完成后,结果可被传输至计算机104。在一些情况下,104如图8所示。105可以可操作地耦合至计算机网络(例如,因特网、互联网、外联网、电信网络或数据网络)。104可含有电子存储系统。在一些情况下,该电子存储系统包括非暂时性存储模块,如计算机、处理器等的有形存储器的任一种或全部,或其相关模块,如各种半导体存储器、磁带驱动器、磁盘驱动器等;或外部存储设备,诸如例如硬盘、外部硬盘驱动器、CD、DVD、闪存驱动器等。104可对数据进行分析,并将数据传输至用户105。数据传输可以经由计算机网络(例如,因特网、互联网、外联网、电信网络或数据网络)进行。数据传输可以经由电子存储系统(例如,非暂时性存储模块或外部存储设备)进行。数据可被可视性地传输,诸如例如,显示在作为104的一部分的屏幕或外部连接的屏幕上,或通过声音传输。用户105可为操作者或终端用户。在一些情况下,终端用户为实验室技术人员、医生、患者、研究人员或客户。
测序方法从多核苷酸(例如,DNA)复制反应获益。该方法可采用待复制和扩增的靶多核苷酸、与靶多核苷酸缔合的多核苷酸引物、有待以与靶多核苷酸互补的方式掺入生长链中的核苷酸(以受控的方式逐个引入),以及促进多磷酸核苷(例如,核苷酸)与新形成的与靶多核苷酸互补的多核苷酸共价键合的酶。在多磷酸核苷与同靶多核苷酸互补的生长链之间形成共价键期间,释放出焦磷酸。通过控制被引入多核苷酸聚合反应的核苷酸的具体类型,并监测焦磷酸的释放,可以确定靶多核苷酸的序列。仅在引入的多磷酸核苷(例如,核苷酸)与链延伸位置互补并且发生核苷的共价键合时释放焦磷酸(PPi)。PPi的释放量与所掺入的碱基的数目相等。例如,当引入与靶多核苷酸上的一个核苷酸(其在核苷酸将要掺入延伸的多核苷酸链的位置处)互补的多磷酸核苷(例如,核苷酸),并且该核苷酸经由共价键掺入生长链中(在聚合酶的帮助下)时,释放一个焦磷酸分子。当引入与靶多核苷酸上的链生长位置处的两个或更多个连续核苷酸碱基互补的多磷酸核苷(例如,核苷酸)时,分别释放两个或更多个焦磷酸分子。当引入与待掺入靶多核苷酸上的链延伸位置处的核苷酸碱基不互补的多磷酸核苷(例如,核苷酸)时,不释放焦磷酸分子。靶蛋白可为多核苷酸复制酶、多核苷酸扩增酶、糖磷酸化酶、发光酶、生物发光酶或发光蛋白。在一些实例中,靶蛋白可为萤光素酶、DNA聚合酶或己糖激酶。
在一些情况下,逐个掺入核苷多磷酸分子的种类。可以控制核苷多磷酸分子的种类的引入。此外,可以逐个控制核苷酸多磷酸分子的种类类型的引入。核苷酸多磷酸可包含一个、两个、三个、四个、五个或更多个磷酸。
可引入引物以启动复制反应。靶多核苷酸可以是双链的,并且该方法可包括双链多核苷酸的分离。在一些实例中,靶多核苷酸是单链的。
此外,核苷酸可包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP或dUTP。有时,核苷酸不包括dATP类似物,而包括dATP。该方法偶尔不使用单链结合蛋白(SSB)。有时,该方法不包括核苷酸降解酶、标记的核苷、标记的多核苷酸或多核苷酸片段化步骤中的至少一种。
多核苷酸测序可以以与本领域已知的常规测序方法相比至少0.5倍、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍或更快的速率进行。测序可以以与本领域已知的常规测序方法相比至多0.5倍、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍或更慢的速率进行。
该方法可在升高的温度下进行。该升高的温度可高于50摄氏度。该升高的温度可为至少50摄氏度到至多55摄氏度。
该方法可进一步包括焦磷酸向ATP的转化。可通过在腺苷5'磷酰硫酸的存在下将焦磷酸转化成ATP的ATP硫酸化酶来促进这种转化。可检测这类ATP。例如,可在萤光素和氧的存在下采用萤光素酶光学地检测ATP。在一些情况下,该萤光素酶为不识别dATP的突变萤光素酶。
在引入多磷酸核苷(例如,核苷酸)和可能杂交并向复制的多核苷酸链中掺入碱基一段时间后,过量的核苷酸可被降解。在一些实例中,过量的多磷酸核苷(例如,核苷酸)被核苷酸降解酶(例如,腺苷三磷酸双磷酸酶)降解。还可采用磷酸化酶如糖磷酸化酶(例如,己糖激酶)将过量的多磷酸核苷(例如,核苷酸)转化成磷酸化的糖。在一些情况下,该糖磷酸化酶为经修饰的糖磷酸化酶,其在糖磷酸化反应中以相似的方式使用至少两种、三种或至少四种核苷酸(例如,ATP、TTP、CTP、GTP、UTP、dATP、dTTP、dCTP、dGTP或dUTP)。在一些实例中,糖磷酸化酶对各种核苷酸(例如,ATP、TTP、CTP、GTP、UTP、dATP、dTTP、dCTP、dGTP或dUTP)的亲和力相似。在与糖磷酸化酶结合的各种核苷酸中,相似的亲和力可以变化至多0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25个百分比(%)。在一些实例中,糖磷酸化酶对各种核苷酸(例如,ATP、TTP、CTP、GTP、UTP、dATP、dTTP、dCTP、dGTP或dUTP)的结合常数相似。在与糖磷酸化酶结合的各种核苷酸中,相似的结合常数可以变化至多0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25个百分比(%)。在一些实施方案中,该方法不使用2'-脱氧腺苷-5'-O-(1-硫代三磷酸)(也被称为α巯基dATP,dATPαS)。
可通过经修饰的聚合酶促进多核苷酸合成。有时,经修饰的聚合酶为经修饰的Taq聚合酶。该修饰可为化学修饰。该修饰可为并入能够结合白蛋白和Taq聚合酶的蛋白质的酶构建体。这样的白蛋白可为牛血清白蛋白或人血清白蛋白。测序方法可为本领域采用的任何测序方法。另外,测序方法可以包括独特的酶构建体或如本文所解释的经修饰的酶。
在一些方面,通过促进伴有焦磷酸释放的多核苷酸延伸反应的任何聚合酶来促进多核苷酸合成。测序方法可包括促进焦磷酸向ATP转化的任何酶(如ATP硫酸化酶)、促进ATP检测的任何酶(如萤光素酶),以及通过以类似方式利用dNTP而将糖磷酸化,由此降解在多核苷酸聚合阶段期间投入反应中的剩余dNTP的磷酸化酶。有时,该磷酸化酶是以类似的方式识别至少两种、三种、四种或五种核苷酸的己糖激酶突变体。
在一些方面,通过促进释放焦磷酸的多核苷酸延伸反应的任何聚合酶来促进多核苷酸合成。测序方法可包括促进焦磷酸向ATP转化的任何酶(如ATP硫酸化酶)、使用过量dNTP将糖转化为磷酸化的糖或降解在多核苷酸聚合阶段期间投入反应的过量dNTP的任何酶,以及能够识别ATP但对dATP的识别减弱或不识别dATP的萤光素酶突变体。
有时,一种或多种上述酶被化学修饰。例如,一种或多种上述酶是嗜热的。在一种或多种上述酶中,可将至少一个带正电荷的氨基酸中和或酸化。在一种或多种上述酶中,可将大部分或全部带正电荷的氨基酸中和或酸化。可对萤光素酶、己糖激酶和ATP硫酸化酶中的至少一种进行化学修饰。还可对腺苷三磷酸双磷酸酶进行化学修饰。
可对一种或多种上述酶进行修饰,以并入HIS(例如,HIS(6))构建体、白蛋白结合结构域(ABS)、生物素标签、Z结构域(或Z结构域部分),或其任意组合。可对一种或多种上述酶进行修饰,以并入白蛋白结合结构域(即,ABS)。可对一种或多种上述酶进行修饰,以同时并入HIS(6)部分和白蛋白结合结构域。可对一种或多种上述酶进行修饰,以并入Z结构域(见下文)。可对一种或多种上述酶进行修饰,以同时并入Z结构域和白蛋白结合域。可对一种或多种上述酶进行修饰,以并入ABP-Z。萤光素酶、己糖激酶和ATP硫酸化酶中的至少一种因此得到修饰。因此还可对腺苷三磷酸双磷酸酶进行修饰。
ABP-Z为修饰的ABP,其进一步含有来自SpA的Z结构域作为第二结合位点。
Z结构域(或Z结构域部分)有时被称为Z结构域野生型、Zacid2或Zbasic2(参见图20A)。Z结构域(或Z结构域部分)可具有序列VDNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQPK(SEQ ID NO:7)(Z结合域野生型)、序列VDNKFNKEEEEAEEEIEELPNLNEEQEEAFIESLEDDPSQSANLLAEAKKLNDAQPK(SEQID NO:8)(有时可被称为Zacid2),或序列VDNKFNKERRRARREIRHLPNLNEEQRRAFIRSLRDDPSQSANLLAEAKKLNDAQPK(SEQ ID NO:9)(有时可被称为Zbasic2)。Z结构域(或Z结构域部分)可具有序列VDNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQPK(SEQ ID NO:7)(Z结合域野生型)。Z结构域(或Z结构域部分)可具有序列VDNKFNKEEEEAEEEIEELPNLNEEQEEAFIESLEDDPSQSANLLAEAKKLNDAQPK(SEQ ID NO:8)(有时可被称为Zacid2)。Z结构域(或Z结构域部分)可具有序列VDNKFNKERRRARREIRHLPNLNEEQRRAFIRSLRDDPSQSANLLAEAKKLNDAQPK(SEQ ID NO:9)(有时可被称为Zbasic2)。
在一些情况下,测序方法采用将糖磷酸化从而形成糖磷酸盐的酶。该糖可以是单糖、二糖、寡糖或多糖。在一些情况下,该糖为单糖。该单糖可为己糖或戊糖。在一些实例中,该单糖为己糖。有时,该己糖为葡萄糖。该酶可为己糖激酶。在一些情况下,测序方法进一步采用聚合酶,如Taq聚合酶,以及在ATP转化期间使用焦磷酸的酶。该ATP转化酶可为ATP硫酸化酶或丙酮酸正磷酸二激酶。在一些情况下,测序方法进一步采用酶将ATP转化成光。所用的酶可为萤光素酶。
上述测序方法可采用经修饰的己糖激酶。在一些情况下,包含经修饰的己糖激酶的测序方法在本文中被称为“Lumen测序”。然后可分析测序方法的结果并将其递交至终端用户。
用于产生靶蛋白构建体的一般程序。
在一些方面,使用载体转化来产生上述任一种蛋白质构建体。有时,通过共价连接编码构成蛋白质构建体的蛋白质区段的单个多核苷酸(例如,DNA)序列来产生上述蛋白质构建体。可使用蛋白质合成仪来产生上述任一种蛋白质构建体。可使用本段中所提及的方法的任意组合来制备上述任一种蛋白质构建体。
在一些情况下,通过生物工程化的宿主来产生上述任一种蛋白质构建体。可通过用携带靶蛋白的所需多核苷酸序列的适当载体对宿主进行转化来实现这样的生物工程化。载体转化可导致通过利用宿主的蛋白质表达机制而使靶多核苷酸被表达为靶蛋白。可对载体构建体进行工程化,使得当该载体携带的序列被表达为蛋白质时,该蛋白质将对应于靶蛋白(例如,共价连接的ABS构建体)。该共价连接可以是直接或间接的(例如,通过间隔区)。有时靶蛋白与HIS(例如,His(6))共价连接。该共价连接可以是直接或间接的(例如,通过间隔区)。有时靶蛋白与ABS和HIS(例如,His(6))二者共价连接。该共价连接可以是任何顺序的直接或间接连接(例如,通过间隔区)。参见例如图3、5、7、13、19和20,其中靶蛋白可以直接或间接地连接至例如ABS,如ABP、ABP-Z或Z结构域(或Z结构域部分)。ABP-Z蛋白可为进一步含有第二结合位点的白蛋白结合蛋白。第二结合位点可识别来自SpA的Z结构域。靶蛋白可为多核苷酸复制酶、多核苷酸扩增酶、糖磷酸化酶、发光酶、生物发光酶或发光蛋白。靶蛋白可为萤光素酶、Taq聚合酶或己糖激酶。
示例性的载体包括但不限于pACYC177、pASK75、pBAD载体系列、pBADM载体系列、pET载体系列、pETM载体系列、pGEX载体系列、pHAT、pHAT2、pMal-c2、pMal-p2、pQE载体系列、pRSET A、pRSET B、pRSET C、pTrcHis2系列、pZA31-Luc、pZE21-MCS-1、pDESTTM14载体、pDESTTM15载体、pDESTTM17载体、pDESTTM24载体、pYES-DEST52载体、pBAD-DEST49目的载体、pAO815毕赤酵母载体、pFLD1巴斯德毕赤酵母载体、pGAPZA、B和C巴斯德毕赤酵母载体、pPIC3.5K毕赤酵母载体、pPIC6A、B和C毕赤酵母载体、pPIC9K毕赤酵母载体、pTEF1/Zeo、pYES2酵母载体、pYES2/CT酵母载体、pYES2/NT A、B和C酵母载体,以及pYES3/CT酵母载体。在一些情况下,该载体为来自大肠杆菌的载体pET21。有时,该载体是来自巴斯德毕赤酵母的pPIC9。在一些实例中,上述任一种蛋白质构建体经合成产生。
用于纯化靶蛋白构建体的一般程序。
在一些情况下,本文所述的方法包括靶蛋白纯化方法。在一些情况下,该纯化方法如图2所示。靶蛋白纯化方法包括天然的、未修饰的或修饰的靶蛋白。靶蛋白可为多核苷酸复制酶、多核苷酸扩增酶、糖磷酸化酶、发光酶、生物发光酶或发光蛋白。靶蛋白可为萤光素酶、Taq聚合酶或己糖激酶。该纯化方法进一步使用HIS(例如,His(6))标签、ABS标签或二者。纯化可使用HIS(例如,His(6))标签或ABS标签来进行,或者可通过使用HIS(例如,His(6))标签对靶蛋白的一种或多种纯化以及随后使用ABS标签的一种或多种纯化来串联进行。在一些情况下,纯化通过使用ABS标签对靶蛋白的一种或多种纯化以及随后使用HIS(例如,His(6))标签的一种或多种纯化来串联进行。在一些情况下,ABS标签的纯化涉及使用白蛋白亲和柱或HIS(例如,His(6))柱。ABS标签的纯化可涉及使用白蛋白亲和柱和HIS(例如,His(6))柱。如图2所例示的,白蛋白亲和柱可在HIS(例如,His(6))柱之前或之后。ABS标签可含有ABP和ABP-Z。有时,ABS标签含有ABP。在一些情况下,ABS标签的纯化涉及使用白蛋白亲和柱,或白蛋白亲和柱和采用ABP-Z(例如,ABS上识别白蛋白和Z结构域的位点)的Z亲和柱。如图2所例示的,白蛋白亲和柱可在Z亲和柱之前或之后。如本文所用的,图2将白蛋白亲和柱、HIS(6)亲和柱和Z亲和柱称为白蛋白柱、HIS(6)柱和Z柱。
在一些情况下,以分批模式(例如,在靶蛋白裂解物溶液中使用带镍树脂或带钴树脂)或经由柱子(通过重力过滤或通过色谱系统)进行采用HIS(例如,His(6))标签的纯化。示例性的镍和钴珠包括但不限于Ni-NTA琼脂糖(Qiagen)、Ni-NTA琼脂糖磁珠(Qiagen)、His60镍Superflow树脂(Clontech Laboratories)、完整的His-Tag纯化树脂(Roche)、His-Tag Isolation and Pulldown钴珠(Life Technologies)、TALONTM钴珠(Life Technologies)或HisPur钴树脂(Thermo Scientific)。示例性的含镍和含钴柱包括但不限于内部填充的镍柱或钴柱、HiTrapTMNi-NTA柱(Qiagen)、Ni-NTA Superflow柱(Qiagen)、Ni-NTA旋转柱(Qiagen)、His60 Ni Superflow柱(ClontechLaboratories)或HisPur钴旋转柱(Thermo Scientific)。
通常,靶蛋白裂解物在含有低浓度咪唑的结合缓冲液中与带镍珠或带钴珠结合。咪唑与His(6)标签竞争结合带镍珠或带钴珠。在一些情况下,结合缓冲液中所用的咪唑的浓度为至多0.01、5、10、15、20、25、30毫摩尔(mM)或更低。结合缓冲液中所用的咪唑的浓度可为至少0.01、5、10、15、20、25、30毫摩尔(mM)或更高。在最初结合步骤后,随后洗涤含有靶蛋白的珠子以除去任何未结合的靶蛋白。在洗涤步骤完成后,采用洗脱缓冲液洗脱靶蛋白,该洗脱缓冲液含有的咪唑浓度高于结合缓冲液中所用的浓度。洗脱缓冲液中所用的咪唑的浓度可为至少200、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000毫摩尔(mM)或更高。
在一些情况下,洗脱的靶蛋白进一步经历脱盐步骤,以除去缓冲液中存在的咪唑浓度。可在加载至含有白蛋白的介质之前对洗脱的靶蛋白进行透析以除去咪唑。该白蛋白可为哺乳动物(例如,牛或人)白蛋白。该白蛋白可为血清白蛋白(例如,牛血清白蛋白或人血清白蛋白)。含有白蛋白的介质可为含有结合或未结合的白蛋白的颗粒。该颗粒可为磁性颗粒。在一些情况下,该颗粒可含有标签。该标签可为光学标签(例如,荧光标签或磷光标签)。含有白蛋白的介质可为含有结合或未结合的白蛋白的固体支持体。在一些情况下,未结合的白蛋白扩散至介质中。结合的白蛋白可为共价结合的白蛋白。含有白蛋白的介质可为由具有结合的白蛋白的颗粒组成的色谱柱。该白蛋白可为哺乳动物白蛋白(例如,牛或人白蛋白)。该白蛋白可为血清白蛋白(例如,牛血清白蛋白或人血清白蛋白)。含有白蛋白的介质可为包含白蛋白的溶液。含有白蛋白的介质可为包含白蛋白的过滤器。在一些情况下,该过滤器可为透析过滤器。
在一些情况下,白蛋白对白蛋白结合结构域的结合亲和力(与解离常数的倒数(1/Kd)有关)为至少0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3或更多纳摩尔(nM)。在一些情况下,白蛋白对白蛋白结合结构域的结合亲和力为至多0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3或更少纳摩尔(nM)。白蛋白结合结构域对白蛋白的结合亲和力偶尔为约1纳摩尔(nM)。
在一些情况下,通过改变至少与ABS-白蛋白对紧邻的环境,来释放与白蛋白结合的ABS肽部分。该环境改变可为环境的温度、疏水性、离子强度、电导率或pH值改变。可通过盐的改变或添加来发生离子强度的变化。可通过碱的添加实现pH变化。可通过酸的添加实现pH变化。可通过疏水性物质的添加实现疏水性的变化。该疏水性物质可为醇,如乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇、庚醇、辛醇、壬醇或其任何组合。该醇可包含直链或支链的脂肪族部分。该醇可包含至少一个芳香族部分。有时,还可利用竞争物ABS蛋白,使其与ABS肽部分竞争与白蛋白的相互作用,而释放与白蛋白结合的ABS肽部分。
可通过用溶液洗涤、浸泡或洗脱ABS与白蛋白的复合物来发生ABS肽部分与白蛋白的分离。该溶液可为缓冲溶液。
可使用固定有白蛋白的柱子在液相色谱系统(例如,HPLC或FPLC)上进行ABS纯化步骤。该柱子可固定有牛血清白蛋白或人血清白蛋白。该柱子可固定有人血清白蛋白。可使用具有中性pH的加样缓冲液将靶蛋白加载至固定有白蛋白的柱子上。该加样缓冲液可具有碱性pH(例如,约pH 7.5、pH 8.0或pH 8.5)。随后可用具有酸性pH的洗涤缓冲液对柱子进行洗涤。可使用含有酸如乙酸、pH至多为1.0、1.5、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或更低的洗脱缓冲液洗脱靶蛋白。有时,该洗脱缓冲液的pH为至少1.0、1.5、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或更高。在一些情况下,洗脱缓冲液中所用的酸的浓度为至少200、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000毫摩尔(mM)或更高。可将洗脱的靶蛋白透析到具有中性pH的缓冲液中。可将洗脱的靶蛋白透析到具有碱性pH(例如,约pH 7.5、pH 8.0或pH 8.5)的缓冲液中。
在一些情况下,ABS蛋白进一步包含Z结构域识别位点(例如,ABP-Z)。可使用固定有蛋白A衍生的配体的柱子在液相色谱系统(例如,HPLC或FPLC)上进行ABP-Z纯化步骤。Rhe蛋白A衍生的配体可以是耐碱性的。可使用具有中性pH的加样缓冲液将靶蛋白加载至固定有耐碱性蛋白A衍生的配体的柱子上。该加样缓冲液可具有碱性pH(例如,约pH 7.5、pH 8.0或pH 8.5)。随后可用加样缓冲液洗涤柱子。可使用含有酸如乙酸、pH至多为1.0、1.5、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或更低的洗脱缓冲液洗脱靶蛋白。该洗脱缓冲液的pH可为至少1.0、1.5、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或更高。洗脱缓冲液中所用的酸的浓度可为至少200、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000毫摩尔(mM)或更高。可将洗脱的靶蛋白透析到具有中性pH的缓冲液中。可将洗脱的靶蛋白透析到具有碱性pH(例如,约pH7.5、pH 8.0或pH 8.5)的缓冲液中。
采用生物素标签(例如,生物结合结构域标签)的纯化可涉及在通过基于抗生物素蛋白或链霉亲和素的方法纯化聚合酶蛋白之前,生物素分子与生物素标签通过酶促生物素化在体内或体外偶联。酶促生物素化可采用生物素连接酶(BirA)将生物素分子与生物素标签缀合。该生物素标签(例如,生物素结合结构域标签)可为包含选自MASSLRQILDSQKIEWRSNAGGAS(SEQ ID NO:10)或GLNDIFEAQKIEWHE(SEQ ID NO:12)的氨基酸序列的多肽标签。生物素标签MASSLRQILDSQKIEWRSNAGGAS(SEQ ID NO:10)具有ATGGCTAGTAGCCTGCGCCAGATCCTGGACAGCCAGAAAATCGAATGGCGCAGCAACGCTGGTGGTGCTAGT(SEQID NO:11)的DNA序列。该生物素标签(例如,生物素结合结构域标签)可为包含氨基酸序列MASSLRQILDSQKIEWRSNAGGAS(SEQ ID NO:10)的多肽标签。生物素标签(例如,生物素结合结构域标签)可为包含氨基酸序列GLNDIFEAQKIEWHE(SEQ ID NO:12)的多肽标签。该生物素标签可为由氨基酸序列MASSLRQILDSQKIEWRSNAGGAS(SEQ ID NO:10)组成的多肽标签。该生物素标签可为由氨基酸序列GLNDIFEAQKIEWHE(SEQ ID NO:10)组成的多肽标签。生物素化可在体内或体外实现。有时,生物素化可在体内实现。有时,本文所述的Taq聚合酶的体内生物素化包括生物素标签MASSLRQILDSQKIEWRSNAGGAS(SEQ ID NO:10)。
有时,生物素化可在体外实现。在生物素化过程中,生物素首先在ATP的存在下形成生物素酰基-5’-AMP,生物素酰基-5’-AMP与生物素标签内的赖氨酸残基的ε-氨基相互作用以形成酰胺键,并且BirA酶可促进该过程。采用抗生物素蛋白或链霉亲和素树脂对聚合酶蛋白质的纯化可通过分批模式实现,或可使用固定有抗生物素蛋白或链霉亲和素配体的柱子在液相色谱系统(例如,HPLC或FPLC)上进行。可通过改变至少与抗生物素蛋白/链霉亲和素-生物素对紧邻的环境来实现聚合酶蛋白质的洗脱。如上所述,该环境改变可为环境的温度、疏水性、离子强度、电导率或pH值改变。在一些情况下,采用与生物素竞争结合抗生物素蛋白或链霉亲和素的生物素类似物如脱硫生物素来实现从抗生物素蛋白/链霉亲和素树脂上的洗脱。有时,采用含有变性剂如尿素或盐酸胍的洗脱缓冲液,高离子强度缓冲液如1MNaCl或1M(NH4)2SO4,或pH范围为约2至约3的洗脱缓冲液来实现从抗生物素蛋白/链霉亲和素树脂上的洗脱。
采用Z结构域蛋白(或Z结构域部分)(例如,Z结构域野生型、Zacid2或Zbasic2)的纯化可包括以分批模式或通过柱色谱法将包含Z结构域的Taq聚合酶溶液与IgG固定的树脂接触。有时,可采用阳离子交换色谱法对包含本文所述Z结构域的经修饰的Taq聚合酶(例如,Z结构域-HIS-Taq)进行纯化。该Z结构域为葡萄球菌蛋白A(SpA)的IgG结合结构域B的工程化类似物(图20A)。
靶蛋白构建体的具体实例在下文详述。
己糖激酶
在一些方面,本发明包括己糖激酶的修饰形式。己糖激酶是一种将六碳糖(即,己糖)磷酸化并生成磷酸己糖的酶。野生型己糖激酶利用ATP或dATP将己糖转化为磷酸己糖。然而,其对其他dNTP(例如,dTTP、dCTP、dGTP或dUTP)的亲和力较低。本文公开的经修饰的己糖激酶在其对各种dNTP的亲和力方面可不同于野生型。经修饰的己糖激酶可以对至少两种、三种、四种或五种天然存在的核苷(即,dATP、dTTP、dCTP、dGTP和dUTP)具有相似的亲和力。经修饰的己糖激酶可在己糖磷酸化期间使用一种或多种dNTP。经修饰的己糖激酶可在己糖磷酸化期间使用选自ATP、dATP、dTTP、dCTP、dGTP和dUTP的一种或多种NTP或dNTP。在一些情况下,经修饰的己糖激酶在己糖磷酸化期间使用ATP、dATP、dTTP、dCTP、dGTP和dUTP。经修饰的己糖激酶对ATP和dNTP的使用可用于在本文公开的测序反应期间除去过量的ATP和dNTP。经修饰的己糖激酶可在本文公开的测序反应期间替代核苷酸降解酶(例如,腺苷三磷酸双磷酸酶)以用于去除过量的ATP和dNTP。这种新型测序方法被称为“Lumen测序”。
可使用酶效率值评价经修饰的己糖激酶利用各种dNTP的速率。如本文所用的,酶效率值是指酶的特异性常数,并且可通过酶的催化常数Kcat与米氏常数Km的比值来描述。在一些情况下,可利用效率来比较酶在对不同底物的作用中的活性。在一些情况下,将经修饰的己糖激酶利用各种dNTP(不包括dATP)的效率值与利用ATP/dATP的效率值进行比较。在一些情况下,该比较以比值表示。在一些情况下,各种dNTP(不包括dATP)中的至少一种的效率值与ATP/dATP的效率值的比值为至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5或更高。有时,各种dNTP(不包括dATP)中的至少一种的效率值与ATP/dATP的效率值的比值为至多0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5或更低。有时,各种dNTP(不包括dATP)中的至少一种的效率值与ATP/dATP的效率值的比值约为1。各种dNTP(不包括dATP)可包括dTTP、dCTP、dGTP。有时,各种dNTP也可包括dUTP。有时,各种dNTP可包括非天然的或罕见的dNTP。
经修饰的己糖激酶的底物可为葡糖糖,生成葡萄糖-6-磷酸作为产物。有时,经修饰的己糖激酶的底物包括阿洛糖、阿卓糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖、塔罗糖、阿洛酮糖、果糖、山梨糖或塔格糖。在一些情况下,经修饰的己糖激酶将一种或多种选自阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖、塔罗糖、阿洛酮糖、果糖、山梨糖和塔格糖的己糖底物磷酸化。在一些情况下,经修饰的己糖激酶仅将一种选自阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖、塔罗糖、阿洛酮糖、果糖、山梨糖和塔格糖的己糖底物磷酸化。
己糖具有两种构型:D-己糖和L-己糖。在一些情况下,本文公开的经修饰的己糖激酶将D-己糖底物磷酸化。在一些情况下,D-己糖底物包括D-阿洛糖、D-阿卓糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-古洛糖、D-艾杜糖、D-半乳糖、D-塔罗糖、D-阿洛酮糖、D-果糖、D-山梨糖或D-塔格糖。在一些情况下,经修饰的己糖激酶将一种或多种选自D-阿洛糖、D-阿卓糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-古洛糖、D-艾杜糖、D-半乳糖、D-塔罗糖、D-阿洛酮糖、D-果糖、D-山梨糖或D-塔格糖的D-己糖底物磷酸化。在一些情况下,经修饰的己糖激酶仅将一种选自D-阿洛糖、D-阿卓糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-古洛糖、D-艾杜糖、D-半乳糖、D-塔罗糖、D-阿洛酮糖、D-果糖、D-山梨糖或D-塔格糖的D-己糖底物磷酸化。在一些情况下,本文公开的经修饰的己糖激酶将D-葡糖糖磷酸化。在一些情况下,本文公开的经修饰的己糖激酶将L-己糖底物磷酸化。
通常,己糖激酶具有被称为己糖激酶A、B、C和D的四种同工型。通常,己糖激酶A、B和C对浓度低于1mM的葡糖糖具有高亲和力,并被其产物葡萄糖-6-磷酸抑制。经修饰的己糖激酶可为衍生自己糖激酶A、己糖激酶B、己糖激酶C或己糖激酶D的经修饰的己糖激酶。经修饰的己糖激酶可为衍生自己糖激酶B的经修饰的己糖激酶。
己糖激酶从任何合适的真核来源或原核来源获得。在一些情况下,己糖激酶从细菌或酵母来源获得。如本文其他地方所公开的,细菌来源为任何合适的细菌,如革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。革兰氏阴性菌可以是厌氧的、棒状的或两者皆具。在一些情况下,革兰氏阴性菌为大肠杆菌。该细菌可为嗜热菌。该嗜热菌可为超嗜热菌。超嗜热菌可包括附着热变形菌(Thermoproteus tenax)、亲硝卤水栖热菌(Thermus caldophilus)、嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus tokodaii)或敏捷气热菌(Aeropyrum pernix)。己糖激酶可从任何合适的酵母如面包酵母(baker’s yeast)、啤酒酵母(brewer’s yeast)或酒酵母(wine yeast)获得。啤酒酵母可包括酿酒酵母、巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)(以前称为卡尔酵母(S.carlsbergensis))、布鲁塞尔酒香酵母(Brettanomyces bruxellensis)、异酒香酵母(Brettanomyces anomalus)、班图酒香酵母(Brettanomyces custersianus)、纳氏酒香酵母(Brettanomyces naardenensis)、南斯酒香酵母(Brettanomyces nanus)、布鲁塞尔德克酵母(Dekkera bruxellensis)或异型德克酵母(Dekkera anomala)。在一些情况下,经修饰的己糖激酶从酿酒酵母获得。在一些情况下,经修饰的己糖激酶B从酿酒酵母获得。在一些情况下,经修饰的己糖激酶B从来自酿酒酵母S288c(NP_013551.1)的己糖激酶获得。
在一些情况下,与配体如葡糖糖或葡萄糖-6-磷酸相互作用所涉及的残基可包括Asp205、Lys169、Asn204、Glu256和Thr168。有时,与ATP相互作用所涉及的残基可包括Lys111。在一些情况下,可对残基如Asp205、Lys169、Asn204、Glu256、Thr168和/或Lys111进行修饰以增加ATP向ADP的水解。在其他情况下,本文所述的经修饰的己糖激酶可在氨基酸位置如Asp205、Lys169、Asn204、Glu256、Thr168和/或Lys111处包括一个或多个修饰。在氨基酸位置如Asp205、Lys169、Asn204、Glu256、Thr168和/或Lys111处具有一个或多个修饰的经修饰的己糖激酶可进一步被化学修饰。该化学修饰的己糖激酶可为热稳定的己糖激酶。在氨基酸位置如Asp205、Lys169、Asn204、Glu256、Thr168和/或Lys111处具有一个或多个修饰的热稳定的己糖激酶还可具有增加的ATP水解活性。
经修饰的己糖激酶可进一步包含多组氨酸标签(例如,6xHis标签)(磷酸核糖基-5-氨基-1-磷酸核糖基-4-咪唑甲酰胺异构酶(his6)序列)。有时,经修饰的己糖激酶进一步包含白蛋白结合位点。在一些情况下,经修饰的己糖激酶进一步包含多组氨酸标签(例如,6xHis标签)(磷酸核糖基-5-氨基-1-磷酸核糖基-4-咪唑甲酰胺异构酶(his6)序列)和白蛋白结合位点。HIS(例如,His(6))标签是由六个共价连接的组氨酸残基组成的纯化标签。白蛋白结合位点(ABS)是能够识别并且/或者结合白蛋白的蛋白质区域。可将ABS并入免疫球蛋白结合蛋白中。有时,ABS被并入蛋白G如链球菌蛋白G中。ABS可并入白蛋白结合蛋白(ABP)。ABS有时是ABP,如来自链球菌蛋白G的ABP。在一些情况下,使用ABP作为纯化标签。可使用HIS(6)部分作为纯化标签。己糖激酶融合蛋白有时被称为His(6)-ABS-己糖激酶。在一些情况下,His(6)标签、ABS和己糖激酶彼此直接相连。或者,His(6)标签、ABS和己糖激酶通过间隔区相连。示例性的His(6)-ABS-己糖激酶构建体如图5所示。该His(6)-ABS-己糖激酶构建体可为如301、302、303、304、305或306所示的构建体。该His(6)-ABS-己糖激酶构建体可为如301所示的构建体。在一些情况下,将His(6)-ABS-己糖激酶构建体进一步修饰以除去6xHis标签部分,如307所示。可在纯化过程期间或之后切去6xHis标签部分。间隔区A可含有允许从ABS-己糖激酶部分上除去6xHis标签的酶切位点。可将His(6)-ABS-己糖激酶构建体进一步修饰以除去6xHis标签部分和ABS部分,如308所示。间隔区B也可含有酶切位点。在一些情况下,间隔区A中的酶切位点与间隔区B中的酶切位点相同。在一些情况下,间隔区A中的酶切位点与间隔区B中的酶切位点不同。
6xHis标签(即,HIS(6))、ABS,或ABS和HIS(6)二者与经修饰的己糖激酶蛋白质之间的距离由间隔区A和间隔区B限定。间隔区A和间隔区B都代表分子连接,如共价连接。间隔区A可为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个共价连接的氨基酸。间隔区B可为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个共价连接的氨基酸。在一些情况下,间隔区A中共价连接的氨基酸的数目与间隔区B中共价连接的氨基酸的数目不同。在一些情况下,间隔区A中共价连接的氨基酸的数目与间隔区B中共价连接的氨基酸的数目相同。间隔区分子可为嵌合肽、有机分子、糖、肽、多核苷酸或核酸单体。该有机分子可为脂肪族分子、共轭分子或芳香族分子。该共轭有机分子可包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个共轭键。该糖可为单糖、二糖、寡糖或多糖。在一些实例中,间隔区A与间隔区B相同。在一些情况下,间隔区A与间隔区B不同。
在一些情况下,ABS进一步包含第二结合位点。第二结合位点可在ABP内。第二结合位点可通过直接共价连接或非直接方式(例如,间隔区)与ABP连接。第二结合位点可在与ABP结合位点不同的位点处,并且不干扰ABP与白蛋白的相互作用。第二结合位点可包含识别膜蛋白的结构域的结合位点。该膜蛋白可为来自细菌的I型膜蛋白。该膜蛋白可为葡萄球菌蛋白A(SpA)。第二结合位点可识别SpA的一个或多个结构域。在一些情况下,第二结合位点识别SpA的结构域B。在一些情况下,第二结合位点识别结构域B的类似物——Z结构域。在一些情况下,第二结合位点为Z结构域结合位点。在一些情况下,ABP进一步包含本文中被称为ABP-Z的Z结构域结合位点。可采用用于制备靶蛋白构建体的一般程序来产生ABS构建体。在一些情况下,ABS构建体在图6中描述。
经修饰的己糖激酶构建体可包含来自SpA的Z结构域(或Z结构域部分),以及HIS、ABS和/或生物素标签(例如,生物素结合结构域标签)。Z结构域(或Z结构域部分)、HIS、ABS和/或生物素标签可以是任何顺序的,并且可在己糖激酶序列的5'末端、己糖激酶序列的3'末端或己糖激酶序列的两端遗传引入。Z结构域(或Z结构域部分)、HIS、ABS和/或生物素标签可在每个单独组件之间包含一个或多个间隔区。例如,可在Z结构域(或Z结构域部分)与HIS之间引入间隔区,或者可在Z结构域(或Z结构域部分)与HIS之间引入第一间隔区并且可在HIS与ABS之间引入第二间隔区,等等。有时,Z结构域(或Z结构域部分)、HIS、ABS和/或生物素标签可在每个单独组件之间没有间隔区的情况下共价连接。有时,己糖激酶、Z结构域(或Z结构域部分)、HIS、ABS和/或生物素标签在经修饰的己糖激酶构建体内可以是任何顺序的。有时,Z结构域(或Z结构域部分)可在经修饰的己糖激酶构建体中替代ABS。该己糖激酶、Z结构域(或Z结构域部分)、HIS和BIO可在每个单独组件之间包含一个或多个间隔区,并且该己糖激酶、Z结构域、HIS和BIO可以是任何顺序的。该己糖激酶、Z结构域(或Z结构域部分)、HIS和BIO可以不在每个单独组件之间包含一个或多个间隔区,并且该己糖激酶、Z结构域(或Z结构域部分)、HIS和BIO可以是任何顺序的。经修饰的己糖激酶构建体可为如图19和20B所示的构建体。
如上文所述,Z结构域可具有如SEQ ID NO:7(Z结合域野生型)、SEQ ID NO:8(有时可被称为Zacid2)或SEQ ID NO:9(有时可被称为Zbasic2)中所示的序列。
在一些情况下,采用用于制备靶蛋白构建体的一般程序产生己糖激酶构建体。有时,通过使用如上文提及的生物工程化宿主产生己糖激酶构建体。如本文其他地方所述,经修饰的己糖激酶蛋白的纯化可采用用于纯化上述靶蛋白构建体的一般程序,其中靶蛋白为经修饰的己糖激酶蛋白质。在一些情况下,纯化方案为图2所示的方案。
如本文所公开的,在一些情况下,ABS从蛋白G获得。蛋白G是一种在革兰氏阳性菌的表面上充当细菌受体的免疫球蛋白结合蛋白。示例性的革兰氏阳性菌包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、鸟肠球菌(Enterococcus avium)、耐久肠球菌(Enterococcus durans)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、鹑鸡肠球菌(Enterococcus gallinarum)、小肠肠球菌(Enterococcus hirae)、孤立肠球菌(Enterococcus solitarius)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus oereus)、双歧双歧杆菌(Bifidobacteriu bifidum)、大芬戈尔德菌(Finegoldia magna)、乳杆菌属的种(Lactobacillus sp.)、单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、诺卡氏菌属的种(Nocardia sp.)、马红球菌(Rhodococcusequi)、放线菌属的种(Actinomyces sp.)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、破伤风梭菌(Clostridum tetani)、动弯杆菌属的种(Mobiluncus sp)或消化球菌属的种(Peptostreptococcus sp.)。在一些情况下,蛋白G在C组和G组链球菌中表达。蛋白G中的各个白蛋白结合位点在图6中例示。在一些情况下,ABS从G148菌株链球菌蛋白G(SpG)获得(Olsson等人,Eur.J.Biochem.168:319-324(1987))。ABS可包包括ABP、BB、ABD或整个蛋白G。ABS可包括ABD1、ABD2、ABD3或其任意组合。
含有ABS的蛋白G蛋白质的任何部分均可连接至经修饰的己糖激酶。在一些情况下,该ABS为ABP。在一些情况下,该ABS为蛋白G的ABD1、ABD2和ABD3区中的至少一个。BB区可连接至己糖激酶。ABP区可连接至己糖激酶。ABD区可连接至己糖激酶。整个链球菌蛋白G可连接至己糖激酶。在一些情况下,His(6)部分进一步连接至具有ABS的经修饰的己糖激酶构建体。His(6)部分可连接至己糖激酶(这样的构建体缺少白蛋白结合位点)。
可通过任何合适的诱变方法生成经修饰的己糖激酶。可通过定点诱变方法生成经修饰的己糖激酶。定点诱变是一种允许在感兴趣的基因内进行特定改变或修饰的方法。定点诱变可采用盒式诱变法、PCR定点诱变、全质粒诱变、Kunkel法或体内定点诱变法。盒式诱变法允许使用限制酶和连接方法将合成的DNA片段插入质粒中。其不涉及聚合。PCR定点诱变与盒式诱变类似,但其中可获得更大的片段,该片段通过凝胶电泳与模板片段分离,然后连接至感兴趣的基因中。全质粒诱变如法允许使用一个或多个引物插入突变,然后扩增整个质粒。由于质粒是线性形式并且其不需要像在PCR中一样指数式扩增,因此该方法与PCR定点诱变不同。Kunkel法是一种基于引物的定点诱变方法。它与先前的方法不同,因为其采用dUTP酶(该酶阻止细菌在DNA复制期间掺入尿嘧啶)缺陷的大肠杆菌菌株以将产物与模板菌株相区分,从而允许更容易地选择含有所需突变的质粒。体内定点诱变法进一步被划分为Delitto perfetto法、错位“pop-in pop-out”法、采用PCR和一个可再循环标记物的直接基因缺失及定点诱变、采用PCR和一个使用长同源区的可再循环标记物的直接基因缺失及定点诱变,以及采用合成寡核苷酸的体内定点诱变。它们与定点诱变方法类似,但在体内条件下进行。
在一些情况下,通过随机诱变方法生成经修饰的己糖激酶。随机诱变是一种生成具有不同功能性质的蛋白质突变体文库的方法。例如,首先将随机突变引入基因中,以生成含有数千个不同形式的该基因的文库。然后,表达该基因的每种形式或变体,并且随后针对功能评价每个表达的蛋白质的性质。可采用易错PCR法、滚环易错PCR法、增变菌株法、临时增变菌株法、插入诱变法、甲磺酸乙酯法、亚硝酸法或DNA改组实现随机诱变。易错PCR法是一种其中聚合酶在野生型序列的扩增期间具有高错误率(在一些情况下,可达2%)的PCR方法。在一些情况下,点突变或单核苷酸突变是易错PCR中最常见的突变类型。滚环易错PCR是易错PCR的一种变化形式。在该方法中,首先将野生型序列克隆至质粒中,随后在易错PCR条件下扩增整个质粒。增变菌株法利用增变菌株如XL1-Red(Strategene),该XL1-Red是三种主要DNA修复途径(mutS、mutD和mutT)有缺陷的大肠杆菌菌株,因此导致其在复制中发生错误。临时增变菌株法与增变菌株类似,不同之处在于大肠杆菌的一种DNA修复途径(mutD5)而不是三种DNA修复途径有缺陷。插入诱变法采用基于转座子的系统来随机地将15个碱基的序列插入整个感兴趣的序列中。甲磺酸乙酯(EMS)法利用化学品EMS将胍残基烷基化,从而导致它们在DNA复制过程中被错误地拷贝。亚硝酸是第二化学诱变剂,其通过将腺嘌呤和胞嘧啶残基脱氨基化而引入突变,从而导致颠换点突变。DNA改组法通过用DNAsel随机消化感兴趣的序列或序列文库,并然后利用自引发PCR将片段随机重新连接而实现。在一些情况下,采用易错PCR法实现用于生成经修饰的己糖激酶的随机诱变。
在一些情况下,经修饰的己糖激酶与野生型己糖激酶具有约60%至约99.9%的序列同源性。经修饰的己糖激酶可与野生型己糖激酶具有61%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同源性。
经修饰的己糖激酶可在本文公开的测序反应过程中替代腺苷三磷酸双磷酸酶。腺苷三磷酸双磷酸酶是一种将ATP水解成AMP和无机磷酸盐的钙激活的核苷酸降解酶。腺苷三磷酸双磷酸酶可进一步作用于ADP及其他核苷三磷酸和二磷酸,以生成NMP和无机磷酸盐。使用经修饰的己糖激酶可减少或消除在测序反应期间对dATPαS的使用。使用经修饰的己糖激酶可改善该方法在对长读序进行测序中的能力。包括己糖激酶或经修饰的己糖激酶的测序方法在本文中被称为“Lumen测序”。
在一些情况下,如本文所述的己糖激酶也被称为糖磷酸化酶。该己糖激酶可为己糖激酶构建体。该己糖激酶构建体可为热稳定的己糖激酶构建体。该热稳定的己糖激酶构建体可在高于50℃的温度下起作用。该己糖激酶可为己糖激酶B。
萤光素酶
在一些方面,本发明包括萤光素酶的修饰形式,其识别ATP并展现出与ATP相比受损的dATP识别或无dATP识别。萤光素酶是能够生成冷光或没有红外或紫外频率的光的一类氧化酶。通常,这种化学产生的光的颜色为黄色、绿色或浅红色,波长为约510至670纳米。萤光素酶存在于许多生物体,如萤火虫、甲虫、海肾、腰鞭毛虫、水母、细菌和海洋桡足类细长长腹水蚤(Metridia longa)中。萤火虫萤光素酶可以从超过2000种萤火虫获得。示例性的萤火虫物种包括来自Cyphonocerinae、萤亚科(Lampyrinae)、熠萤亚科(Luciolinae)、Ototetrinae或Photurinae亚科的种。示例性的萤火虫包括但不限于北美萤火虫(Photinuspyralis)、源氏萤火虫(Luciola cruciata)、Luciola italic、平家萤火虫(Luciolalateralis)、Luciola mingrelica、Photuris pennsylvanica、牙买加叩头虫(Pyrophorusplagiophthalamus)、Phrixothrix hirtus、海洋腔肠(Renilla reniformis)、Gaussiaprinceps、夜光海萤(Cypridina noctiluca)、希氏弯喉海萤(Cypridina hilgendorfii)、Metridia longa或Oplophorus gracilorostris。在一些情况下,萤火虫萤光素酶从北美萤火虫(Photinus pyralis)(AAA29795)获得。在一些情况下,萤光素酶从嗜热菌获得。在一些情况下,萤光素酶从嗜热蓝细菌聚球藻(Thermosynechococcus elongates)获得。
萤火虫萤光素酶为62kDa分子量的酶。该酶需要ATP、分子氧和杂环化合物萤光素以在如下所示的两步过程中生成光。
(1)萤光素+ATP→萤光素化腺苷酸+PPi
(2)萤光素化腺苷酸+O2→氧化萤光素+AMP+光
萤光素进一步以两种形式存在:D-萤光素及其对映体形式L-萤光素。在一些情况下,生物发光反应的底物需要D-萤光素。
通常,除ATP外,萤火虫萤光素酶还将dATP作为底物识别。在测序方法如焦磷酸测序方法中,其通过使用充当聚合酶底物而非萤光素酶底物的dATPαS来规避这个问题。本文公开了一种可以不识别dATP的经修饰的萤光素酶。这样的经修饰的萤光素酶可通过随机突变获得。在一些情况下,该经修饰的萤光素酶接受ATP作为底物,使得在多核苷酸测序期间对dATPαS的需求变得不再必要。
有时,相比于ATP识别,本文所述的经修饰的萤光素酶具有受损的dATP识别。受损的dATP识别可以是对dATP的亲和力的降低。受损的识别可表示为萤光素酶在dATP存在下的活性相对于萤光素酶在ATP存在下的活性的百分比。在一些情况下,该百分比为约0.5%、1%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%、1.5%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%或更高。有时,约2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%或更高的百分比表明相对于dATP缺少对ATP的特异性,或表明其不能区分dATP与ATP。有时,约5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%或更高的百分比表明相对于dATP缺少对ATP的特异性,或表明其不能区分dATP与ATP。在其他情况下,约0.5%、1%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%、1.5%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%或更低的百分比表明对ATP的特异性。约0.5%、1%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%、1.5%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、2%、3%、4%、5%或更低的百分比可以表明对ATP的特异性。有时,热稳定的萤光素酶不识别dATP但识别ATP。
上述经修饰的萤光素酶可包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。经修饰的萤光素酶可进一步在SEQ ID NO:2内的位置处,或在N-末端、C-末端或二者的位置处包含修饰和/或缺失。经修饰的萤光素酶可在N-末端处包含修饰,例如,在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基1-40、1-30、1-20、1-15、1-10或1-5内的氨基酸残基相对应的位置处包含修饰。经修饰的萤光素酶可进一步在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基S201、T202、G203、Q283、S284、S293、T214、I232、F295、E354、I423、D436、L530或L550相对应的一个或多个位置处包含修饰。经修饰的萤光素酶可进一步在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基T214、I232、F295、E354、I423、D436、L530或L550相对应的一个或多个位置处包含修饰。经修饰的萤光素酶可进一步在与SEQ IDNO:2的氨基酸残基T214、I232、F295、I423或L550相对应的一个或多个位置处包含修饰。经修饰的萤光素酶可进一步在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基T214、I232、F295或I423相对应的一个或多个位置处包含修饰。经修饰的萤光素酶可进一步在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基I423、D436或L530相对应的一个或多个位置处包含修饰。
在一些情况下,修饰是对天然氨基酸或非天然氨基酸的突变。修饰还可以是对保守氨基酸的突变,例如,Phe、Tyr和Try是包含芳香族侧链的残基并且其彼此的置换可被认为是保守置换。
本文所述的经修饰的萤光素酶可在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基S201、T202、G203、Q283、S284、S293、T214、I232、F295、E354、I423、D436、L530或L550相对应的一个或多个位置处包含对另一个天然氨基酸或非天然氨基酸的修饰。该修饰可进一步包括T214A、I232A、F295L、E354K、I423L、D436G、L530R或L550V。在一些情况下,经修饰的萤光素酶在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基T214A、I232A、F295L、E354K、I423L、D436G、L530R或L550V相对应的一个或多个位置处包含修饰。经修饰的萤光素酶还可在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基T214A、I232A、F295L、I423L或L550V相对应的一个或多个位置处包含修饰。经修饰的萤光素酶还可在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基T214A、I232A、F295L或I423L相对应的一个或多个位置处包含修饰。经修饰的萤光素酶可进一步在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基I423L、D436G或L530R相对应的一个或多个位置处包含修饰。
经修饰的萤光素酶可在SEQ ID NO:2的I423L、D436G和L530R处包含修饰。经修饰的萤光素酶可在SEQ ID NO:2的T214A、I232A、F295L和I423L处包含修饰。经修饰的萤光素酶可在SEQ ID NO:2的T214A、I232A、F295L、I423L和L550V处包含修饰。经修饰的萤光素酶在SEQ ID NO:2的T214A、I232A、F295L、E354K、I423L、D436G、L530R和L550V处包含修饰。
在SEQ ID NO:2内的位置处,或在N-末端、C-末端或二者的位置处包含修饰和/或缺失的经修饰萤光素酶可具有受损的dATP识别。在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基S201、T202、G203、Q283、S284、S293、T214、I232、F295、E354、I423、D436、L530或L550相对应的一个或多个位置处包含修饰的经修饰萤光素酶可具有受损的dATP识别。
在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基T214、I232、F295、E354、I423、D436、L530或L550相对应的一个或多个位置处包含修饰的经修饰萤光素酶可具有受损的dATP识别。在与SEQ IDNO:2的氨基酸残基T214、I232、F295、I423或L550相对应的一个或多个位置处包含修饰的经修饰萤光素酶可具有受损的dATP识别。在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基T214、I232、F295或I423相对应的一个或多个位置处包含修饰的经修饰萤光素酶可具有受损的dATP识别。在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基I423、D436或L530相对应的一个或多个位置处包含修饰的经修饰萤光素酶可具有受损的dATP识别。有时,该修饰可包括T214A、I232A、F295L、E354K、I423L、D436G、L530R或L550V。
在一些情况下,在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基T214A、I232A、F295L、E354K、I423L、D436G、L530R或L550V相对应的一个或多个位置处包含修饰的经修饰萤光素酶可具有受损的dATP识别。在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基T214A、I232A、F295L、I423L或L550V相对应的一个或多个位置处包含修饰的经修饰萤光素酶可具有受损的dATP识别。在与SEQ IDNO:2的氨基酸残基T214A、I232A、F295L或I423L相对应的一个或多个位置处包含修饰的经修饰萤光素酶可具有受损的dATP识别。在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基I423L、D436G或L530R相对应的一个或多个位置处包含修饰的经修饰萤光素酶可具有受损的dATP识别。
在其他情况下,在SEQ ID NO:2的I423L、D436G和L530R处包含修饰的经修饰萤光素酶可具有受损的dATP识别。在SEQ ID NO:2的T214A、I232A、F295L和I423L处包含修饰的经修饰萤光素酶可具有受损的dATP识别。在SEQ ID NO:2的T214A、I232A、F295L、I423L和L550V处包含修饰的经修饰萤光素酶可具有受损的dATP识别。在SEQ ID NO:2的T214A、I232A、F295L、E354K、I423L、D436G、L530R和L550V处包含修饰的经修饰萤光素酶可具有受损的dATP识别。
在一些情况下,经修饰的萤光素酶进一步包含多组氨酸标签(6xHis标签)。有时,经修饰的萤光素酶进一步包含白蛋白结合位点(ABS)。在一些情况下,经修饰的萤光素酶进一步包含多组氨酸标签(6xHis标签)和白蛋白结合位点。在一些情况下,使用ABP作为纯化标签。有时,使用HIS(6)(即,6XHis标签)作为纯化标签。ABS可为白蛋白结合蛋白(ABP)。参见图6。可将ABS并入免疫球蛋白结合蛋白中。有时,将ABS并入蛋白G如链球菌蛋白G中。在一些情况下,ABS并入白蛋白结合蛋白(ABP)。有时,ABS是ABP,如来自链球菌蛋白G的ABP。在一些情况下,萤光素酶融合蛋白被称为His(6)-ABS-萤光素酶。His(6)标签、ABS和萤光素酶可以彼此直接相连。在一些情况下,His(6)标签、ABS和萤光素酶通过间隔区相连。示例性的His(6)-ABS-萤光素酶构建体如图7所示。该His(6)-ABS-萤光素酶构建体可为如401、402、403、404、405或406所示的构建体。该His(6)-ABS-萤光素酶构建体可为如401所示的构建体。可将His(6)-ABS-萤光素酶构建体进一步修饰以除去6xHis标签部分,如407所示。可在纯化过程期间或之后切去6xHis标签部分。间隔区C可含有允许从ABS-萤光素酶部分上除去6xHis标签的酶切位点。可将His(6)-ABS-萤光素酶构建体进一步修饰以除去6xHis标签部分和ABS部分,如408所示。间隔区D也可含有酶切位点。在一些情况下,间隔区C中的酶切位点与间隔区D中的酶切位点相同。有时,间隔区C中的酶切位点与间隔区D中的酶切位点不同。
ABS、HIS(6)或二者与经修饰的萤光素酶蛋白质之间的距离由间隔区C和间隔区D限定。间隔区C和间隔区D都代表分子连接,如共价连接。间隔区C可为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个共价连接的氨基酸。间隔区D可为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个共价连接的氨基酸。间隔区C中共价连接的氨基酸的数目可以与间隔区D中共价连接的氨基酸的数目不同。在一些情况下,间隔区C中共价连接的氨基酸的数目与间隔区D中共价连接的氨基酸的数目相同。间隔区分子可为嵌合肽、有机分子、糖、肽、多核苷酸或核酸单体。该有机分子可为脂肪族分子、共轭分子或芳香族分子。该共轭有机分子可包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个共轭键。该糖可为单糖、二糖、寡糖或多糖。在一些实例中,间隔区C与间隔区D相同。在一些情况下,间隔区C与间隔区D不同。
在一些情况下,ABS进一步包含第二结合位点。第二结合位点可在ABP内。第二结合位点可通过直接共价连接或非直接方式(例如,间隔区)与ABP连接。第二结合位点可在与ABP结合位点不同的位点,并且不干扰ABP与白蛋白的相互作用。第二结合位点可为识别膜蛋白的结构域的结合位点。该膜蛋白可为来自细菌的I型膜蛋白。该膜蛋白可为葡萄球菌蛋白A(SpA)。第二结合位点可识别SpA的一个或多个结构域。在一些情况下,第二结合位点识别SpA的结构域B。在一些情况下,第二结合位点识别结构域B的类似物——Z结构域。在一些情况下,第二结合位点为Z结构域结合位点。在一些情况下,ABP进一步包含本文中被称为ABP-Z的Z结构域结合位点。在一些情况下,采用用于制备靶蛋白构建体的一般程序产生ABS构建体。在一些情况下,ABS构建体在图6中描述。
经修饰的萤光素酶构建体可包含来自SpA的Z结构域(或Z结构域部分),以及HIS、ABS和/或生物素标签(例如,生物素结合结构域标签)。Z结构域(或Z结构域部分)、HIS、ABS和/或生物素标签可以是任何顺序的,并且可在萤光素酶序列的5'末端、萤光素酶序列的3'末端或萤光素酶序列的两端遗传引入。Z结构域(或Z结构域部分)、HIS、ABS和/或生物素标签可在每个单独组件之间包含一个或多个间隔区。例如,可在Z结构域(或Z结构域部分)与HIS之间引入间隔区,或者可在Z结构域(或Z结构域部分)与HIS之间引入第一间隔区而可在HIS与ABS之间引入第二间隔区,等等。有时,Z结构域(或Z结构域部分)、HIS、ABS和/或生物素标签可在每个单独组件之间没有间隔区的情况下共价连接。有时,己糖激酶、Z结构域(或Z结构域部分)、HIS、ABS和/或生物素标签在经修饰的萤光素酶构建体内可以是任何顺序的。有时,Z结构域(或Z结构域部分)可在经修饰的萤光素酶构建体中替代ABS。萤光素酶、Z结构域(或Z结构域部分)、HIS和BIO可在每个单独组件之间包含一个或多个间隔区,并且萤光素酶、Z结构域、HIS和BIO可以是任何顺序的。萤光素酶、Z结构域(或Z结构域部分)、HIS和BIO可以不在每个单独组件之间包含一个或多个间隔区,并且萤光素酶、Z结构域(或Z结构域部分)、HIS和BIO可以是任何顺序的。示例性经修饰的萤光素酶构建体包括如图13和20B所示的那些。
如上文所述,Z结构域可具有如SEQ ID NO:7(Z结合域野生型)、SEQ ID NO:8(有时可被称为Zacid2)或SEQ ID NO:9(有时可被称为Zbasic2)所示的序列。生物素标签可具有如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12所示的序列。
在一些情况下,采用用于制备靶蛋白构建体的一般程序产生萤光素酶构建体。有时,通过使用如上提及的生物工程化的宿主产生萤光素酶构建体。如本文其他地方所述,经修饰的萤光素酶蛋白质的纯化可采用用于纯化上述靶蛋白构建体的一般程序,其中靶蛋白为经修饰的萤光素酶蛋白质。在一些情况下,纯化方案为图2所示的方案。
在一些情况下,经修饰的萤光素酶在原核表达系统、真核表达系统或基于无细胞的表达系统中表达。经修饰的萤光素酶可在原核表达系统如大肠杆菌中表达。经修饰的萤光素酶可进一步在真核表达系统如酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母中表达。
有时,在原核表达系统如大肠杆菌中产生的经修饰的萤光素酶可对细胞内蛋白酶稳定。与在不同表达系统中产生的经修饰的萤光素酶相比,在原核表达系统如大肠杆菌中产生的经修饰的萤光素酶可对细胞内蛋白酶稳定。
有时,与不同表达系统相比,在原核表达系统如大肠杆菌中,经修饰的萤光素酶的产率增加。产率可为约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、15倍、20倍或更多倍。有时,在30℃至37℃的表达温度下,产率增加。在30℃至37℃的表达温度下,产率可为约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、15倍、20倍或更多倍。
如上所述,经修饰的萤光素酶是在SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置T214、I232、F295、E354、I423、D436、L530和L550处包含突变的任意组合,并任选具有化学修饰的萤光素酶。有时,经修饰的萤光素酶是在氨基酸残基位置T214A、I232A、F295L、E354K、I423L、D436G、L530R和L550V处包含突变的任意组合,并任选具有化学修饰的萤光素酶。有时,经修饰的萤光素酶是在氨基酸残基位置T214A、I232A、F295L、I423L和L550V处包含突变的任意组合,并任选具有化学修饰的萤光素酶。包含一个或多个上述突变的经修饰的萤光素酶可具有与不同表达系统相比增加的表达产率,并且/或者对细胞内蛋白酶的稳定性增加。
如本文所公开的,在一些情况下,ABS从蛋白G获得。蛋白G是在革兰氏阳性菌的表面上充当细菌受体的免疫球蛋白结合蛋白。在一些情况下,蛋白G在C组和G组链球菌中表达。在一些情况下,ABP从G148菌株链球菌蛋白G(SpG)获得。
含有ABS的蛋白G蛋白质的任何部分均可连接至经修饰的萤光素酶。该ABS可为ABP。ABS可为蛋白G的ABD1、ABD2和ABD3区中的至少一个。BB区可连接至萤光素酶。ABP区可连接至萤光素酶。ABD区可连接至萤光素酶。整个链球菌蛋白G可连接至萤光素酶。在一些情况下,HIS(例如,His(6))部分进一步连接至具有ABS的经修饰的萤光素酶构建体。HIS(例如,His(6))部分可连接至萤光素酶(这样的构建体缺少白蛋白结合位点)。
可通过任何合适的诱变方法生成经修饰的萤光素酶。可通过定点诱变方法生成经修饰的萤光素酶。如上文所公开的,定点诱变是一种允许在感兴趣的基因内进行特定改变或修饰的方法。定点诱变可采用盒式诱变法、PCR定点诱变、全质粒诱变、Kunkel法或体内定点诱变法。可通过随机诱变法生成经修饰的萤光素酶。随机诱变是一种生成具有不同功能性质的蛋白质突变体文库的方法。可采用易错PCR法、滚环易错PCR法、增变菌株法、临时增变菌株法、插入诱变法、甲磺酸乙酯法、亚硝酸法或DNA改组实现随机诱变。采用易错PCR法的随机诱变可用来生成经修饰的萤光素酶。
在一些情况下,如本文所述的萤光素酶也被称为生物发光酶。该萤光素酶可为萤火虫萤光素酶。有时,该萤光素酶不识别dATP。偶尔,该萤光素酶不识别dATP但识别ATP。该萤光素酶可为热稳定的萤光素酶。萤光素酶构建体可为热稳定的萤光素酶构建体。热稳定的萤光素酶构建体可在高于50℃的温度下起作用。
热稳定的酶
在一些方面,本发明包括本文公开的酶的热稳定性提高的化学修饰形式。在一些情况下,当在环境温度下发生扩增时,试剂中包括单链DNA结合蛋白(SSB)。该蛋白质能够与DNA的单链区结合,由此防止二级结构形成。在升高的温度下,DNA将不会形成二级结构,因此使得SSB需求不必要。本文公开的化学修饰允许一种或多种酶在升高的温度下起作用。
该温度可为约25℃或更高。该温度可为约30℃、约37℃、约40℃或更高。该温度可为约45℃或更高。有时,该温度可在约25℃至约100℃、约30℃至约95℃、约37℃至约90℃、约40℃至约85℃,或约45℃至约80℃之间。该温度可在约50℃至约80℃之间。在一些情况下,该温度在约50.05℃至约80℃之间。有时,该温度在约50℃至约55℃之间。该温度可至少高于50.05℃。该温度可至少为50.06℃、50.5℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃或高于79℃。该温度可至多为50.5℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃或更低。在一些情况下,该温度为约50.5℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃或约55℃。
在一些情况下,对一种或多种酶进行化学修饰以产生热稳定性。化学修饰的热稳定酶可包括己糖激酶、萤光素酶或ATP硫酸化酶中的一种或多种。化学修饰的热稳定酶可包括经修饰的己糖激酶、经修饰的萤光素酶或ATP硫酸化酶中的一种或多种。化学修饰的热稳定酶可包括ABS修饰的己糖激酶、ABS修饰的萤光素酶或ATP硫酸化酶中的一种或多种。化学修饰的热稳定酶可包括His(6)修饰的己糖激酶、His(6)修饰的萤光素酶或ATP硫酸化酶中的一种或多种。化学修饰的热稳定酶可包括His(6)和ABS修饰的己糖激酶、Z结构域修饰的己糖激酶、His(6)和ABS修饰的萤光素酶、Z结构域萤光素酶或ATP硫酸化酶中的一种或多种。化学修饰的热稳定酶可包括己糖激酶和萤光素酶。化学修饰的热稳定酶可包括己糖激酶和ATP硫酸化酶。化学修饰的热稳定酶可包括萤光素酶和ATP硫酸化酶。在一些情况下,仅己糖激酶被化学修饰。有时仅萤光素酶被修饰。在一些情况下,仅ATP硫酸化酶被化学修饰。
有时,可将在SEQ ID NO:2内的位置处,或在N-末端、C-末端或二者的位置处包含修饰和/或缺失的经修饰萤光素酶进一步化学修饰以增加萤光素酶在例如约50℃至约80℃、约55℃至约70℃或约60℃至约65℃之间的温度下的稳定性。可将在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基S201、T202、G203、Q283、S284、S293、T214、I232、F295、E354、I423、D436、L530或L550相对应的一个或多个位置处包含修饰的经修饰萤光素酶进一步化学修饰以增加萤光素酶在例如约50℃至约80℃、约55℃至约70℃或约60℃至约65℃之间的温度下的稳定性。
可将在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基T214、I232、F295、E354、I423、D436、L530或L550相对应的一个或多个位置处包含修饰的经修饰萤光素酶进一步化学修饰以增加萤光素酶在例如约50℃至约80℃、约55℃至约70℃或约60℃至约65℃之间的温度下的稳定性。可将在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基T214、I232、F295、I423或L550相对应的一个或多个位置处包含修饰的经修饰萤光素酶进一步化学修饰以增加萤光素酶在例如约50℃至约80℃、约55℃至约70℃或约60℃至约65℃之间的温度下的稳定性。可将在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基T214、I232、F295或I423相对应的一个或多个位置处包含修饰的经修饰萤光素酶进一步化学修饰以增加萤光素酶在例如约50℃至约80℃℃、约55℃至约70℃或约60℃至约65℃之间的温度下的稳定性。可将在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基I423、D436或L530相对应的一个或多个位置处包含修饰的经修饰萤光素酶进一步化学修饰以增加萤光素酶在例如约50℃至约80℃、约55℃至约70℃或约60℃至约65℃之间的温度下的稳定性。有时,该修饰可包括T214A、I232A、F295L、E354K、I423L、D436G、L530R或L550V。
在一些情况下,可将在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基T214A、I232A、F295L、E354K、I423L、D436G、L530R或L550V相对应的一个或多个位置处包含修饰的经修饰萤光素酶进一步化学修饰以增加萤光素酶在例如约50℃至约80℃、约55℃至约70℃或约60℃至约65℃之间的温度下的稳定性。可将在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基T214A、I232A、F295L、I423L或L550V相对应的一个或多个位置处包含修饰的经修饰萤光素酶进一步化学修饰以增加萤光素酶在例如约50℃至约80℃、约55℃至约70℃或约60℃至约65℃之间的温度下的稳定性。可将在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基T214A、I232A、F295L或I423L相对应的一个或多个位置处包含修饰的经修饰萤光素酶进一步化学修饰以增加萤光素酶在例如约50℃至约80℃、约55℃至约70℃或约60℃至约65℃之间的温度下的稳定性。可将在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基I423L、D436G或L530R相对应的一个或多个位置处包含修饰的经修饰萤光素酶进一步化学修饰以增加萤光素酶在例如约50℃至约80℃、约55℃至约70℃或约60℃至约65℃之间的温度下的稳定性。
在其他情况下,可将在SEQ ID NO:2的I423L、D436G和L530R处包含修饰的经修饰萤光素酶进一步化学修饰以增加萤光素酶在例如约50℃至约80℃、约55℃至约70℃或约60℃至约65℃之间的温度下的稳定性。可将在SEQ ID NO:2的T214A、I232A、F295L和I423L处包含修饰的经修饰萤光素酶进一步化学修饰以增加萤光素酶在例如约50℃至约80℃、约55℃至约70℃或约60℃至约65℃之间的温度下的稳定性。可将在SEQ ID NO:2的T214A、I232A、F295L、I423L和L550V处包含修饰的经修饰萤光素酶进一步化学修饰以增加萤光素酶在例如约50℃至约80℃、约55℃至约70℃或约60℃至约65℃之间的温度下的稳定性。可将在SEQ ID NO:2的T214A、I232A、F295L、E354K、I423L、D436G、L530R和L550V处包含修饰的经修饰萤光素酶进一步化学修饰以增加萤光素酶在例如约50℃至约80℃、约55℃至约70℃或约60℃至约65℃之间的温度下的稳定性。
在SEQ ID NO:2内的位置处,或在N-末端、C-末端或二者的位置处包含修饰和/或缺失的化学修饰萤光素酶可具有受损的dATP识别。在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基S201、T202、G203、Q283、S284、S293、T214、I232、F295、E354、I423、D436、L530或L550相对应的一个或多个位置处包含修饰的化学修饰萤光素酶可具有受损的dATP识别。
在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基T214、I232、F295、E354、I423、D436、L530或L550相对应的一个或多个位置处包含修饰的化学修饰萤光素酶可具有受损的dATP识别。在与SEQID NO:2的氨基酸残基T214、I232、F295、I423或L550相对应的一个或多个位置处包含修饰的化学修饰萤光素酶可具有受损的dATP识别。在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基T214、I232、F295或I423相对应的一个或多个位置处包含修饰的化学修饰萤光素酶可具有受损的dATP识别。在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基I423、D436或L530相对应的一个或多个位置处包含修饰的化学修饰萤光素酶可具有受损的dATP识别。有时,该修饰可包括T214A、I232A、F295L、E354K、I423L、D436G、L530R或L550V。
在一些情况下,在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基T214A、I232A、F295L、E354K、I423L、D436G、L530R或L550V相对应的一个或多个位置处包含修饰的化学修饰萤光素酶可具有受损的dATP识别。在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基T214A、I232A、F295L、I423L或L550V相对应的一个或多个位置处包含修饰的化学修饰萤光素酶可具有受损的dATP识别。在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基T214A、I232A、F295L或I423L相对应的一个或多个位置处包含修饰的化学修饰萤光素酶可具有受损的dATP识别。在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基I423L、D436G或L530R相对应的一个或多个位置处包含修饰的化学修饰萤光素酶可具有受损的dATP识别。
在其他情况下,在SEQ ID NO:2的I423L、D436G和L530R处包含修饰的化学修饰萤光素酶可具有受损的dATP识别。在SEQ ID NO:2的T214A、I232A、F295L和I423L处包含修饰的化学修饰萤光素酶可具有受损的dATP识别。在SEQ ID NO:2的T214A、I232A、F295L、I423L和L550V处包含修饰的化学修饰萤光素酶可具有受损的dATP识别。在SEQ ID NO:2的T214A、I232A、F295L、E354K、I423L、D436G、L530R和L550V处包含修饰的化学修饰萤光素酶可具有受损的dATP识别。
在一些情况下,在SEQ ID NO:2内的位置处,或在N-末端、C-末端或二者的位置处包含修饰和/或缺失的化学修饰萤光素酶在升高的温度下可具有受损的dATP识别。在与SEQID NO:2的氨基酸残基S201、T202、G203、Q283、S284、S293、T214、I232、F295、E354、I423、D436、L530或L550相对应的一个或多个位置处包含修饰的化学修饰萤光素酶在升高的温度下可具有受损的dATP识别。
在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基T214、I232、F295、E354、I423、D436、L530或L550相对应的一个或多个位置处包含修饰的化学修饰萤光素酶在升高的温度下可具有受损的dATP识别。在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基T214、I232、F295、I423或L550相对应的一个或多个位置处包含修饰的化学修饰萤光素酶在升高的温度下可具有受损的dATP识别。在与SEQID NO:2的氨基酸残基T214、I232、F295或I423相对应的一个或多个位置处包含修饰的化学修饰萤光素酶在升高的温度下可具有受损的dATP识别。在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基I423、D436或L530相对应的一个或多个位置处包含修饰的化学修饰萤光素酶在升高的温度下可具有受损的dATP识别。有时,该修饰可包括T214A、I232A、F295L、E354K、I423L、D436G、L530R或L550V。
在一些情况下,在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基T214A、I232A、F295L、E354K、I423L、D436G、L530R或L550V相对应的一个或多个位置处包含修饰的化学修饰萤光素酶在升高的温度下可具有受损的dATP识别。在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基T214A、I232A、F295L、I423L或L550V相对应的一个或多个位置处包含修饰的化学修饰萤光素酶在升高的温度下可具有受损的dATP识别。在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基T214A、I232A、F295L或I423L相对应的一个或多个位置处包含修饰的化学修饰萤光素酶在升高的温度下可具有受损的dATP识别。在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基I423L、D436G或L530R相对应的一个或多个位置处包含修饰的化学修饰萤光素酶在升高的温度下可具有受损的dATP识别。
在其他情况下,在SEQ ID NO:2的I423L、D436G和L530R处包含修饰的化学修饰萤光素酶在升高的温度下可具有受损的dATP识别。在SEQ ID NO:2的T214A、I232A、F295L和I423L处包含修饰的化学修饰萤光素酶在升高的温度下可具有受损的dATP识别。在SEQ IDNO:2的T214A、I232A、F295L、I423L和L550V处包含修饰的化学修饰萤光素酶在升高的温度下可具有受损的dATP识别。在SEQ ID NO:2的T214A、I232A、F295L、E354K、I423L、D436G、L530R和L550V处包含修饰的化学修饰萤光素酶在升高的温度下可具有受损的dATP识别。
所述升高的温度可在约50℃至约80℃之间。所述升高的温度可在约50.05℃至约80℃之间。有时,所述升高的温度在约50℃至约55℃之间。所述升高的温度可至少高于50.05℃。所述升高的温度可至少为50.06℃、50.5℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃或高于79℃。所述升高的温度可至多为50.5℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃或更低。在一些情况下,所述升高的温度为约50.5℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃或约55℃。
在一些情况下,在SEQ ID NO:2内的位置处,或在N-末端、C-末端或二者的位置处包含修饰和/或缺失的化学修饰萤光素酶随着温度升高可具有受损的dATP识别。在与SEQID NO:2的氨基酸残基S201、T202、G203、Q283、S284、S293、T214、I232、F295、E354、I423、D436、L530或L550相对应的一个或多个位置处包含修饰的化学修饰萤光素酶随着温度升高可具有受损的dATP识别。
在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基T214、I232、F295、E354、I423、D436、L530或L550相对应的一个或多个位置处包含修饰的化学修饰萤光素酶随着温度升高可具有受损的dATP识别。在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基T214、I232、F295、I423或L550相对应的一个或多个位置处包含修饰的化学修饰萤光素酶随着温度升高可具有受损的dATP识别。在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基T214、I232、F295或I423相对应的一个或多个位置处包含修饰的化学修饰萤光素酶随着温度升高可具有受损的dATP识别。在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基I423、D436或L530相对应的一个或多个位置处包含修饰的化学修饰萤光素酶随着温度升高可具有受损的dATP识别。有时,该修饰可包括T214A、I232A、F295L、E354K、I423L、D436G、L530R或L550V。
在一些情况下,在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基T214A、I232A、F295L、E354K、I423L、D436G、L530R或L550V相对应的一个或多个位置处包含修饰的化学修饰萤光素酶随着温度升高可具有受损的dATP识别。在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基T214A、I232A、F295L、I423L或L550V相对应的一个或多个位置处包含修饰的化学修饰萤光素酶随着温度升高可具有受损的dATP识别。在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基T214A、I232A、F295L或I423L相对应的一个或多个位置处包含修饰的化学修饰萤光素酶随着温度升高可具有受损的dATP识别。在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基I423L、D436G或L530R相对应的一个或多个位置处包含修饰的化学修饰萤光素酶随着温度升高可具有受损的dATP识别。
在其他情况下,在SEQ ID NO:2的I423L、D436G和L530R处包含修饰的化学修饰萤光素酶随着温度升高可具有受损的dATP识别。在SEQ ID NO:2的T214A、I232A、F295L和I423L处包含修饰的化学修饰萤光素酶随着温度升高可具有受损的dATP识别。在SEQ IDNO:2的T214A、I232A、F295L、I423L和L550V处包含修饰的化学修饰萤光素酶随着温度升高可具有受损的dATP识别。在SEQ ID NO:2的T214A、I232A、F295L、E354K、I423L、D436G、L530R和L550V处包含修饰的化学修饰萤光素酶随着温度升高可具有受损的dATP识别。
ATP硫酸化酶可从任何合适的原核来源或真核来源获得。在一些情况下,ATP硫酸化酶从酿酒酵母、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、大鼠肝脏和植物获得。可从原核生物(参见例如,Leyh等人,1992.J.Biol.Chem.267:10405-10410;Schwedock和Long,1989.Mol.Plant Microbe Interaction 2:181-194;Laue和Nelson,1994.J.Bacteriol.176:3723-3729)、真核生物(参见例如,Cherest等人,1987.Mol.Gen.Genet.210:307-313;Mountain和Korch,1991.Yeast 7:873-880;Foster等人,1994.J.Biol.Chem.269:19777-19786)、植物(参见例如,Leustek等人,1994.PlantPhysiol.105:897-90216)以及动物(参见例如,Li等人,1995.J.Biol.Chem.270:29453-29459)中克隆ATP硫酸化酶基因。根据具体来源,该酶为同源寡聚体或异源二聚体(参见,例如,Leyh和Suo,1992.J.Biol.Chem.267:542)。ATP硫酸化酶可从嗜热菌获得。ATP硫酸化酶可从古生球菌属(Archaeoglobus)或火球菌属(Pyrococcus)的种获得。ATP硫酸化酶可从嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus steareothermophilus)获得。
本文公开的发明可在升高的温度下使用一种或多种化学修饰的热稳定酶。本文公开的发明可采用化学修饰的热稳定己糖激酶、萤光素酶和ATP硫酸化酶。本文公开的发明可采用化学修饰的热稳定己糖激酶和萤光素酶,以及没有化学修饰的热稳定ATP硫酸化酶。可使用备选的ATP转化酶替代ATP硫酸化酶。其他ATP转化酶可包括丙酮酸正磷酸二激酶。本文公开的发明可采用化学修饰的热稳定己糖激酶和萤光素酶,以及未修饰的丙酮酸正磷酸二激酶。可将丙酮酸正磷酸二激酶化学修饰成热稳定的。本文公开的发明可采用化学修饰的热稳定己糖激酶和萤光素酶,以及热稳定的丙酮酸正磷酸二激酶。该丙酮酸正磷酸二激酶可来自嗜热细菌。本文公开的发明可采用化学修饰的热稳定己糖激酶和萤光素酶,以及嗜热丙酮酸正磷酸二激酶。
本文公开的发明可采用化学修饰的热稳定己糖激酶和ATP硫酸化酶,以及未被化学修饰的萤光素酶。该萤光素酶可从嗜热细菌获得。本文公开的发明可采用化学修饰的热稳定己糖激酶和ATP硫酸化酶,以及嗜热萤光素酶。该嗜热萤光素酶可为识别ATP但不识别dATP的经修饰的萤光素酶。本文公开的发明可采用化学修饰的热稳定己糖激酶和ATP硫酸化酶,以及识别ATP但不识别dATP的嗜热的经修饰萤光素酶。
化学修饰的己糖激酶可为组成His(6)-ABS-己糖激酶蛋白质构建体的经修饰的己糖激酶。在一些情况下,蛋白质的ABS部分和己糖激酶部分都被化学修饰。有时,仅蛋白质的ABS部分被化学修饰。在一些情况下,仅蛋白质的己糖激酶部分被化学修饰。化学修饰的热稳定His(6)-ABS-己糖激酶蛋白质的各种形式可在本发明的上述排列(permutation)中使用。
或者,己糖激酶可用腺苷三磷酸双磷酸酶替代。本文公开的发明可采用化学修饰的热稳定萤光素酶和ATP硫酸化酶,以及未被化学修饰的腺苷三磷酸双磷酸酶或化学修饰的腺苷三磷酸双磷酸酶。未被化学修饰的腺苷三磷酸双磷酸酶可以是没有本文公开的附加化学修饰的嗜热或热稳定的腺苷三磷酸双磷酸酶。本文公开的发明可采用化学修饰的热稳定萤光素酶或化学修饰的热稳定ATP硫酸化酶之一,以及未修饰的腺苷三磷酸双磷酸酶或化学修饰的腺苷三磷酸双磷酸酶之一。本文公开的发明可采用化学修饰的热稳定萤光素酶、未修饰的丙酮酸正磷酸二激酶或化学修饰的丙酮酸正磷酸二激酶,以及化学修饰的腺苷三磷酸双磷酸酶或未被化学修饰的腺苷三磷酸双磷酸酶。
或者,许多热稳定的DNA聚合酶是可用的,其也可以用于本发明以及与上述排列一起使用。示例性热稳定DNA聚合酶包括但不限于Taq、DNA聚合酶、高保真DNA聚合酶、DNA聚合酶、Expand高保真聚合酶、HotTub聚合酶、Pwo聚合酶、Tfl聚合酶、Tli聚合酶、UlTma聚合酶、Pfu聚合酶、Vent聚合酶或Deep Vent聚合酶。
待修饰的酶的化学修饰包括将该酶与有机醛、卤代甲酸盐、酸酐、羧酸或其组合反应。该卤代甲酸酯可为氟代甲酸盐、氯代甲酸盐、溴代甲酸盐、碘代甲酸盐或砹代甲酸盐。在一些情况下,化学修饰包括将酶与醛反应。有时,化学修饰包括将酶与酸酐反应。该酸酐可为乙酸酐、马来酸酐、柠康酸酐(citroconic anhydride)、琥珀酸酐、戊二酸酐、二苯基酐、二羧酸酐、萘二甲酸酐、邻苯二甲酸酐或本领域已知的任何其他酸酐。有时,该酸酐可为均苯四酸二酐或萘四甲酸酐。在一些情况下,该化学反应可为乙酰化。有时,该化学反应可为柠康酰化。
有时,该化学反应对该酶的蛋白质序列中至少一个赖氨酸的ε氨基的一个氢进行修饰。有时,该化学反应对该酶的蛋白质序列中至少一个赖氨酸的ε氨基的两个氢进行修饰。该化学反应可中和或逆转经修饰的赖氨酸的侧链的电荷。
化学修饰的酶的蛋白质序列中至少一个赖氨酸的至少一个ε氨基可被包含烃的有机部分取代。该烃可为脂肪烃、芳香烃、包含双键,或其任意组合。该脂肪烃可以是支链或直链的。该脂肪烃可为甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、壬基、辛基或通式CnH2n+1(n=1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更大)的任何脂肪烃。该烃可为甲基。该烃可包括甲基和双键。该烃可包括羧酸和双键。该烃可包括甲基、羧酸和双键。该烃可包括羧酸酯和双键。该烃可包括甲基、羧酸酯和双键。该烃可包括甲基、羧酸和双键,其中该羧酸和甲基各自直接与该双键连接。该烃可包括甲基、羧酸和双键,其中该羧酸和甲基各自直接与该双键连接并且彼此是顺式的。该烃可包括甲基、羧酸和双键,其中该羧酸和甲基各自直接与该双键连接并且彼此是反式的。碱性侧链可为赖氨酸侧链。有机部分可为方案5中所示的有机部分。有机部分可为方案6A、方案6B,或方案6A和方案6B二者的组合中所示的有机部分。
所公开的酶的化学修饰可通过其反应性赖氨酸残基的乙酰化或柠康酰化来完成(参见方案1-4)。萤火虫萤光素酶、ATP硫酸化酶和己糖激酶中分别有39个、22个和39个赖氨酸残基。萤火虫萤光素酶、ATP硫酸化酶和己糖激酶中的所有赖氨酸残基都可被修饰。有时,萤火虫萤光素酶中至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38或39个赖氨酸残基被修饰。在一些情况下,萤火虫萤光素酶中至多2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39个或更少的赖氨酸残基被修饰。可通过乙酰化、柠康酰化,或乙酰化和柠康酰化方法的组合来修饰萤火虫萤光素酶。
在一些情况下,ATP硫酸化酶中至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个赖氨酸残基被修饰。在一些情况下,ATP硫酸化酶中至多2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22个或更少的赖氨酸残基被修饰。可通过乙酰化、柠康酰化,或乙酰化和柠康酰化方法的组合来修饰ATP硫酸化酶。
在一些情况下,己糖激酶中至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38或39个赖氨酸残基被修饰。在一些情况下,己糖激酶中至多2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39个或更少的赖氨酸残基被修饰。可通过乙酰化、柠康酰化,或乙酰化和柠康酰化方法的组合来修饰己糖激酶。
可在反应中添加改性剂(Modifier)以防止一些赖氨酸残基被修饰。在一些情况下,向反应中添加至少0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4毫摩尔(mM)或更多的ATP/APS以防止一些赖氨酸残基被修饰。有时,向反应中添加至多1、1.5、2、2.5、3、3.5、4毫摩尔(mM)或更少的ATP/APS以防止一些赖氨酸残基被修饰。在一些情况下,向反应中添加至少0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4毫摩尔(mM)或更多的ATP/APS以防止活性位点赖氨酸残基的修饰。在一些情况下,向反应中添加至多1、1.5、2、2.5、3、3.5、4毫摩尔(mM)或更少的ATP/APS以防止活性位点赖氨酸残基的修饰。
使酶成为热稳定的化学修饰
在一些实例中,通过化学反应使ATP硫酸化酶、经修饰的萤光素酶和经修饰的己糖激酶中的至少一种成为热稳定的。该化学反应可在整个酶上进行。在一些情况下,该化学反应在酶的一部分上进行。该化学反应可以是完全的或部分的。在一些实例中,该化学反应中和带正电荷的氨基酸。有时,该化学反应将带正电荷的氨基酸逆转成带负电荷的经修饰的氨基酸。带正电荷的氨基酸可包括赖氨酸、组氨酸或精氨酸。该修饰可以经由离子键合物质、极性键合物质、氢键键合物质进行,或可为使用共价键键合的修饰。在一些情况下,该修饰涉及与中和物质或带负电荷的物质如酸复合。带负电荷的氨基酸可包括天冬氨酸或谷氨酸。在一些情况下,共价键合涉及将醚、醇、酯或酸与带负电荷氨基酸的侧链中的至少一个远端氨基共价结合。下文示出的示例性修饰方案仅出于说明目的,而不应被解释为以任何方式进行限制。
在一些情况下,修饰是如方案1所示的修饰,其中
方案1.
R1、R2可为氢、脂肪族(直链或直链的)、芳香族或共轭的。R1和R2可包含一个或多个酸、酯、醇或醚基团。酸可为羧酸、硫代羧酸、磺酸或膦酸。R1和R2可以相同或不同。氨基酸链1和氨基酸链2指出同一肽(即,酶)的两个不同部分,所例示的氨基酸为该肽的一部分。
修饰可以是如方案2所示的修饰,其中
方案2.
R1、R2可为氢、脂肪族(直链或直链的)、芳香族或共轭的。R1和R2可包含一个或多个酸、酯、醇或醚基团。酸可为羧酸、硫代羧酸、磺酸或膦酸。R1和R2可以相同或不同。
修饰可以是如方案3所示的修饰,其中
方案3.
R2、R3、R4可为氢、脂肪族(直链或直链的)、芳香族或共轭的。R1和R2可包含一个或多个酸、酯、醇或醚基团。酸可为羧酸、硫代羧酸、磺酸或膦酸。R1和R2可以相同或不同。R1可为氢或脂肪族(直链或直链的),并且n可为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更大。
修饰可以是如方案4所示的修饰,其中
方案4.
R4可包含羧酸、硫代羧酸、磺酸或膦酸。R1、R2和R3可以相同或不同。R1、R2或R3可为氢或脂肪族(直链或直链的)。n可为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更大。在一个实例中,R1为氢,R2与R3不同,R2和R3之一为氢。R2和R3之一为脂肪族化合物CmH2m+1,其中m可为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更大。
方案5
方案5示出了与乙酸酐反应后的经修饰赖氨酸残基的一个具体实例。
方案6
方案6示出了与柠康酸酐反应后的赖氨酸残基的经修饰形式的两个具体实例(方案6A和方案6B)。
Taq聚合酶
在一些方面,本发明包括用于本文公开的方法的扩增酶。该扩增酶可为聚合酶。该聚合酶可为Taq聚合酶。该Taq聚合酶可为天然Taq聚合酶,或经修饰的Taq聚合酶。如本文所用的,Taq聚合酶是指任何Taq聚合酶(天然Taq聚合酶或经修饰的Taq聚合酶)。该Taq聚合酶可为通过将Taq聚合酶定制工程化并在细胞中产生而制备的无污染(例如,多核苷酸污染)Taq聚合酶。定制工程化可以包括编码定制工程化Taq聚合酶蛋白质的基因序列的定制工程化、将Taq聚合酶蛋白定制工程化,或其组合。细胞(即,宿主细胞)可包括任何合适的细胞,如天然衍生的细胞或遗传修饰的细胞。宿主细胞可为真核细胞或原核细胞。真核细胞可包括真菌、动物细胞或植物细胞。在一些情况下,真核细胞包括酵母。有时,该酵母是能够将多糖消化成二氧化碳和乙醇的酵母。有时,该酵母为面包酵母或啤酒酵母或酒酵母(例如,接合酵母(Zygosaccharomyces)或酒香酵母)。啤酒酵母可包括酿酒酵母、巴斯德酵母(以前称为卡尔酵母)、布鲁塞尔酒香酵母、异酒香酵母、班图酒香酵母、纳氏酒香酵母、南斯酒香酵母、布鲁塞尔德克酵母或异型德克酵母。其他酵母物种如下所示。原核细胞可为细菌细胞。细菌细胞可为革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。有时,该革兰氏阴性菌是厌氧的、棒状的或两者皆具。在一些情况下,该革兰氏阴性菌为大肠杆菌。动物细胞可包括来自脊椎动物或无脊椎动物的细胞。动物细胞可包括来自海洋无脊椎动物、鱼、昆虫、两栖动物、爬行动物或哺乳动物的细胞。
革兰氏阳性菌可为放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)或软壁菌门(Tenericutes)。革兰氏阴性菌可为产水菌门(Aquificae)、异常球菌-栖热菌门(Deinococcus-Thermus)、纤维杆菌门(Fibrobacteres)-绿菌门(Chlorobi)/拟杆菌门(Bacteroidetes)(FCB群)、梭杆菌门(Fusobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、浮霉菌门(Planctomycetes)-疣微菌门(Verrucomicrobia)/衣原体门(PVC群)、变形菌门(Proteobacteria)、螺旋体门(Spirochaetes)或互养菌门(Synergistetes)。其他细菌可为酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、产金菌门(Chrysiogenetes)、蓝藻门(Cyanobacteria)、脱铁杆菌门(Deferribacteres)、网团菌门(Dictyoglomi)、热脱硫杆菌门(Thermodesulfobacteria)或热袍菌门(Thermotogae)。细菌细胞可为大肠杆菌、肉毒梭菌或大肠杆菌(Coli bacilli)。
真菌包括子囊菌纲(ascomycetes),如酵母、霉菌、丝状真菌、担子菌纲(basidiomycetes)或接合菌纲(zygomycetes)。酵母可包括子囊菌门(Ascomycota)或担子菌门(Basidiomycota)。子囊菌门可包括酵母亚门(Saccharomycotina)(真酵母,例如,酿酒酵母(面包酵母))或外囊菌亚门(Taphrinomycotina)(例如,裂殖酵母纲(Schizosaccharomycetes)(裂变酵母))。担子菌门可包括伞菌亚门(Agaricomycotina)(例如,银耳纲(Tremellomycetes))或柄锈菌亚门(Pucciniomycotina)(例如,小葡萄菌纲(Microbotryomycetes))。
酵母或丝状真菌可包括酵母属、裂殖酵母属(chizosaccharomyces)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、接合酵母(Zygosaccharomyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、毛孢子菌属(Trichosporon)、红冬孢酵母属(Rhodosporidi)、曲霉属(Aspergillus)、镰孢属(Fusarium)或木霉属(Trichoderma)。酵母或丝状真菌可包括酿酒酵母、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、博伊丁假丝酵母(Candida boidini)、白色假丝酵母(Candida albicans)、热带假丝酵母(Candidatropicalis)、星形假丝酵母(Candida stellatoidea)、光滑假丝酵母(Candidaglabrata)、克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)、近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)、季也蒙假丝酵母(Candida guilliermondii)、维斯假丝酵母(Candidaviswanathii)、葡萄牙假丝酵母(Candida lusitaniae)、胶红酵母(Rhodotorulamucilaginosa)、甲醇毕赤酵母(Pichia metanolica)、安格斯毕赤酵母(Pichia angusta)、巴斯德毕赤酵母、异常毕赤酵母(Pichia anomala)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、茁芽丝孢酵母(Trichosporon pullulans)、红冬孢酵母(Rhodosporidium toru)-黑曲霉(Aspergillusniger)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、米曲霉(Aspergillus oryzae)或里氏木霉(Trichoderma reesei)。酵母还可包括解脂耶氏酵母、布鲁塞尔酒香酵母、星形假丝酵母(Candida stellata)、粟酒裂殖酵母、戴尔有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)、拜尔接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)、新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)、格特隐球酵母(Cryptococcus gattii)或布拉尔酵母(Saccharomyces boulardii)。有时,酵母为巴斯德毕赤酵母。有时,酵母为酿酒酵母。有时,酵母为酿酒酵母S288c(NP_013551.1)。
细胞可为软体动物、节肢动物、环节动物或海绵动物的细胞。哺乳动物细胞可为灵长类、猿、马、牛、猪、犬、猫或啮齿动物的细胞。哺乳动物可为灵长类、猿、狗、兔或雪貂。啮齿动物可为小鼠、大鼠、仓鼠、沙鼠、仓鼠、栗鼠、花式大鼠或豚鼠。鸟细胞可为金丝雀、长尾鹦鹉或鹦鹉的细胞。爬行动物细胞可为龟、蜥蜴或蛇的细胞。鱼细胞可为热带鱼的细胞。鱼细胞可为斑马鱼(例如,斑马鱼(Danio rerio))的细胞。在一些情况下,细胞可为线虫(例如,秀丽隐杆线虫(C.elegans))的细胞。两栖动物细胞可为青蛙的细胞。节肢动物细胞可为狼蛛或寄居蟹的细胞。
还可以使用可衍生自上述物种的敲除或敲入形式的细胞。工程化可包括遗传载体如PIC-9的使用。该载体可包含至少编码下列两种蛋白质的一种或多种多核苷酸:DNA聚合酶和白蛋白。DNA聚合酶可包括来自水生栖热菌的聚合酶(Taq聚合酶)、末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)(也被称为DNA核苷酸外转移酶(DNTT)或末端转移酶)、逆转录酶(RT)或本领域已知的任何其他多核苷酸聚合酶。其他聚合酶包括但不限于Bst DNA聚合酶、Bsu DNA聚合酶、Crimson Taq DNA聚合酶、Deep VentR TMDNA聚合酶、Deep VentR TM(exo-)DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶I,Klenow片段(3’-5’exo-)DNA聚合酶I(大Klenow片段)、TaqDNA聚合酶、热启动Taq DNA聚合酶、M-MuLV逆转录酶;OneDNA聚合酶、One热启动DNA聚合酶、phi29 DNA聚合酶、热启动Flex DNA聚合酶、高保真DNA聚合酶、热启动DNA聚合酶、硫化叶菌(Sulfolobus)DNA聚合酶IV、T4DNA聚合酶、TheminatorTMDNA聚合酶、VentR TMDNA聚合酶以及VentR TM(exo-)DNA聚合酶。
DNA聚合酶可为栖热菌属、芽孢杆菌属、热球菌属(Thermococcus)、火球菌属(Pyrococcus)、气火菌属(Aeropyrum)、产液菌属(Aquifex)、硫化叶菌属(Sulfolobus)、火叶菌属(Pyrolobus)或甲烷火菌属(Methanopyrus)的DNA聚合酶。DNA聚合酶可包括来自以下物种的聚合酶:水生栖热菌、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜火产液菌(Aquifex pyrophilus)、地衣芽孢杆菌(Geothermobacteriumferrireducens)、海栖热袍菌(Thermotoga maritime)、那不勒斯栖热袍菌(Thermotoganeopolitana)、Thermotoga petrophila、Thermotoga naphthophila、下层酸菌(Acidianusinfernus)、敏捷气火菌(Aeropyrum pernix)、闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)、深处古生球菌(Archaeoglobus profundus)、Caldivirga maquilingensis、Desulfurococcus amylolyticus、运动硫还原球菌(Desulfurococcus mobilis)、粘硫还原球菌(Desulfurococcus mucosus)、超嗜热广古菌(Ferroglobus placidus)、超嗜热性铁还原古菌(Geoglobus ahangari)、丁醇栖高温菌(Hyperthermus butylicus)、Ignicoccusislandicus、Ignicoccus pacificus、詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)、Methanococcus fervens、火源甲烷球菌(Methanococcus igneus)、Methanococcusinfernus、坎氏甲烷嗜热菌(Methanopyrus kandleri)、炽热甲烷嗜热菌(Methanothermusfervidus)、集结甲烷嗜热菌(Methanothermus sociabilis)、Palaeococcus ferrophilus、Pyrobaculum aerophilum、Pyrobaculum calidifontis、冰岛热棒菌(Pyrobaculumislandicum)、Pyrobaculum oguniense、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)、深海火球菌(Pyrococcus abyssi)、超嗜热火球菌(Pyrococcus horikoshii)、沃氏火球菌(Pyrococcuswoesei)、深海热网菌(Pyrodictium abyssi)、布氏热网菌(Pyrodictium brockii)、隐蔽热网菌(Pyrodictium occultism)、延胡索酸火叶菌(Pyrolobus fumarii)、海葡萄嗜热菌(Staphylothermus marinus)、Stetteria hydrogenophila、硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobussolfataricus)、希氏硫化叶菌(Sulfolobus shibatae)、Sulfolobus tokodaii、Sulfophobococcus zilligii、大涌硫球菌(Sulfurisphaera ohwakuensis)、Thermococcuskodakaraensis、速生热球菌(Thermococcus celer)、Thermococcus litoralis、Thermodiscus maritimus、下垂热丝菌(Thermofilum pendens)、附着热变形菌、嗜中性热变形菌(Thermoproteus neutrophilus)、Thermosphaera aggregans、Vulcanisaetadistributa或Vulcanisaeta souniana。
白蛋白可包括天然白蛋白或遗传修饰的白蛋白。白蛋白可包括血清白蛋白。血清白蛋白可包括哺乳动物血清白蛋白。哺乳动物血清白蛋白可包括人血清白蛋白或牛血清白蛋白。
载体可包括来源于真核来源或原核来源的任何合适的载体。载体可来自细菌(例如,大肠杆菌)、昆虫、酵母(例如,巴斯德毕赤酵母),或哺乳动物来源。细菌载体可包括pACYC177、pASK75、pBAD载体系列、pBADM载体系列、pET载体系列、pETM载体系列、pGEX载体系列、pHAT、pHAT2、pMal-c2、pMal-p2、pQE载体系列、pRSET A、pRSET B、pRSET C、pTrcHis2系列、pZA31-Luc、pZE21-MCS-1、pFLAG ATS、pFLAG CTS、pFLAG MAC、pFLAG Shift-12c、pTAC-MAT-1、pFLAG CTC或pTAC-MAT-2。在一些情况下,载体为来自大肠杆菌的pET21。昆虫载体可包括pFastBac1、pFastBac DUAL、pFastBac ET、pFastBac HTa、pFastBac HTb、pFastBac HTc、pFastBac M30a、pFastBact M30b、pFastBac、M30c、pVL1392、pVL1393、pVL1393M10、pVL1393M11、pVL1393M12、FLAG载体如pPolh-FLAG1或pPolh-MAT 2,或MAT载体如pPolh-MAT1,或pPolh-MAT2。酵母载体可包括pDESTTM14载体、pDESTTM15载体、pDESTTM17载体、pDESTTM24载体、pYES-DEST52载体、pBAD-DEST49目的载体、pAO815毕赤酵母载体、pFLD1巴斯德毕赤酵母载体、pGAPZA、B和C巴斯德毕赤酵母载体、pPIC3.5K毕赤酵母载体、pPIC6A、B和C毕赤酵母载体、pPIC9K毕赤酵母载体、pTEF1/Zeo、pYES2酵母载体、pYES2/CT酵母载体、pYES2/NT A、B和C酵母载体,或pYES3/CT酵母载体。在一些实例中,载体是来自巴斯德毕赤酵母的pPIC9。哺乳动物载体可包括瞬时表达载体或稳定表达载体。哺乳动物瞬时表达载体可包括p3xFLAG-CMV 8、pFLAG-Myc-CMV 19、pFLAG-Myc-CMV 23、pFLAG-CMV 2、pFLAG-CMV 6a,b,c、pFLAG-CMV 5.1、pFLAG-CMV 5a,b,c、p3xFLAG-CMV 7.1、pFLAG-CMV 20、p3xFLAG-Myc-CMV24、pCMV-FLAG-MAT1、pCMV-FLAG-MAT2、pBICEP-CMV 3或pBICEP-CMV 4。哺乳动物稳定表达载体可包括pFLAG-CMV 3、p3xFLAG-CMV 9、p3xFLAG-CMV 13、pFLAG-Myc-CMV 21、p3xFLAG-Myc-CMV 25、pFLAG-CMV 4、p3xFLAG-CMV 10、p3xFLAG-CMV 14、pFLAG-Myc-CMV 22、p3xFLAG-Myc-CMV 26、pBICEP-CMV 1或pBICEP-CMV 2。
在一些实例中,对载体构建体进行工程改造,使得当由载体携带的序列被表达成蛋白质时,与能够结合白蛋白(例如,血清白蛋白)的蛋白质的遗传密码相对应的蛋白质与对应于聚合酶(例如,Taq聚合酶)的蛋白质共价连接。所产生的白蛋白修饰的聚合酶尤其可导致在不使用抗聚合酶抗体的情况下扩增多核苷酸,同时获得干净的扩增产物。能够结合白蛋白的蛋白质可衍生自链球菌蛋白G。蛋白质结合白蛋白可包括ABD1、ABD2和ABD3结构域中的至少一个。该白蛋白可为血清白蛋白。该聚合酶可为Taq聚合酶。
在一些实例中,能够结合白蛋白的蛋白质与蛋白质聚合酶(例如,Taq聚合酶)之间的共价连接将允许该聚合酶在Taq聚合酶的n-末端处被能够结合白蛋白的蛋白质修饰。在一些情况下,该共价连接将允许蛋白质聚合酶在白蛋白的N-末端处被白蛋白修饰。有时,聚合酶与能够结合白蛋白的蛋白质之间的共价连接是通过直接的共价连接。聚合酶与能够结合白蛋白的蛋白质之间的共价连接偶尔是通过间隔区分子连接。间隔区分子可为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个共价连接的氨基酸。间隔区分子可为嵌合肽、有机分子、糖、肽、多核苷酸或核酸单体。该有机分子可为脂肪族分子、共轭分子或芳香族分子。该共轭有机分子可包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个共轭键。该糖可为单糖、二糖、寡糖或多糖。该聚合酶可为Taq聚合酶。该白蛋白可为血清白蛋白或人血清白蛋白。有时,该白蛋白为牛血清白蛋白。
本发明描述了用于在宿主细胞中产生聚合酶(例如,Taq聚合酶)的方法。这些方法可包括在任何上述宿主细胞中的经修饰或工程化的Taq聚合酶和抗Taq聚合酶。在一些实例中,本发明描述了用于在宿主细胞(例如,酵母或细菌)中产生Taq聚合酶的方法。这些方法可包括在宿主细胞中的经修饰或工程化的Taq聚合酶和抗Taq聚合酶。
本发明可包括小规模、中等规模或大规模的高通量蛋白质生产方法。这些方法包括在任何上述宿主细胞中同时产生多种蛋白质。在一些实例中,该方法可包括在细菌或酵母中同时产生多种蛋白质。有时,该酵母为巴斯德毕赤酵母。有时,该酵母为酿酒酵母。有时,该酵母为酿酒酵母S288c(NP_013551.1)。有时,该细菌为大肠杆菌。
与没有能够结合白蛋白的蛋白质的聚合酶相比,并入能够结合白蛋白的蛋白质的经修饰的聚合酶(例如,Taq聚合酶)构建体可具有更高的持续处理能力。如本文所用的,持续处理能力是在聚合酶与DNA解离之前,通过该聚合酶添加的核苷酸的平均数目。与非白蛋白修饰的聚合酶相比,并入能够结合白蛋白的蛋白质的Taq聚合酶构建体可具有至少1x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、11x、12x、13x、14x、15x、16x、17x、18x、19x、20x、30x、40x、50x或更高的持续处理速率。
与不包含能够结合白蛋白的蛋白质的聚合酶相比,并入能够结合白蛋白的蛋白质的聚合酶(例如,Taq聚合酶)构建体可具有更快的延伸速率。如本文所用的,延伸速率是每个聚合酶(例如,DNA聚合酶)分子每秒聚合的核苷酸的最大数目。并入能够结合白蛋白的蛋白质的聚合酶(例如,Taq聚合酶)构建体可具有至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、90、120秒/千碱基或更快的延伸速率。
与非白蛋白修饰的聚合酶相比,并入能够结合白蛋白的蛋白质的聚合酶(例如,Taq聚合酶)构建体可具有更高的保真度。如本文所用的,保真度是聚合酶准确复制DNA分子的能力。可以用错误率描述保真度。并入能够结合白蛋白的蛋白质的Taq聚合酶构建体可具有至多1x10-3、5x10-4、1x10-4、5x10-5、1x10-5、5x10-6或更低的错误率。并入能够结合白蛋白的蛋白质的Taq聚合酶构建体可具有至少1x10-3、5x10-4、1x10-4、5x10-5、1x10-5、5x10-6或更高的错误率。
在一些情况下,本发明包括可改善富含GC的体系扩增的Taq聚合酶缓冲液。这样的Taq聚合酶缓冲液可应用于单细胞分析和下一代测序。可调节缓冲液组分以提高扩增效率。例如,缓冲液组分包括MgCl2、KCl、Tris-HCl、吐温20和BSA。缓冲液组分可包括(碱土金属)(卤素)2、(碱金属)(卤素)、Tris-HCl、吐温20和BSA。单价卤素阴离子可为氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)、碘(I)、砹(At)或其任何组合。碱金属单价阳离子可为锂(Li)、钠(Na)、钾(K)、铷(Rb)、铯(Cs)、钫(Fr)或其任何组合。碱土金属二价阳离子可为铍(Be)、镁(Mg)、钙(Ca)、锶(Sr)、钡(Ba)、镭(Ra)或其任何组合。可调节一种或多种组分以提高扩增效率。可升高或降低MgCl2、KCl、Tris-HCl、吐温20以及BSA或HSA的浓度。可升高或降低MgCl2以及BSA或HSA的浓度以提高扩增效率。可升高或降低(碱土金属)(卤素)2、(碱金属)(卤素)、Tris-HCl、吐温20以及BSA或HSA的浓度。可升高或降低(碱土金属)(卤素)2和BSA的浓度以提高扩增效率。
本发明可包括用于多核苷酸扩增方法的检测测定。有时,该扩增方法包括实时PCR。相对于可商购获得的多核苷酸扩增试剂盒,扩增的多核苷酸偶尔将具有提高的灵敏度(参见,例如,图11C)。这种提高的灵敏度可以是至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、500或更多的灵敏度提高。
本发明有时包括高灵敏度实时基因测序仪,该测序能力可包括集成的用于高灵敏度基因扩增分析(如实时PCR)的硬件和化学技术。在一个实例中,测序方法可包括颜色(即,生色团)、荧光或磷光的光学感测。有时,测序方法可包括生物发光的感测。
在一些实例中,本发明包括用于检测多核苷酸的设备、系统、方法和试剂盒。如本文其他地方所述,试剂盒可包含用于多核苷酸(例如,DNA)扩增的试剂和缓冲液,用于进一步促进扩增过程或允许扩增过程定量的其他酶。
扩增方法可包括并入能够结合白蛋白的蛋白质序列的聚合酶构建体,其可能需要或可能不需要抗聚合酶抗体,如本领域使用的抗Taq聚合酶抗体。该白蛋白可为血清白蛋白。该白蛋白可为哺乳动物白蛋白(例如,人或牛白蛋白)。抗Taq聚合酶抗体可防止Taq DNA聚合酶在储存条件(例如,低温)下被激活,防止PCR扩增期间的非特异性扩增和引物二聚体形成。抗Taq聚合酶可包括来自eENZYME LLC、BIORON、GeneON或TOYOBO的抗Taq聚合酶单克隆抗体,以及AccuStartTMTaq抗体(Quanta BioSciences)。
并入能够结合白蛋白的蛋白质序列的聚合酶(例如,Taq聚合酶)构建体可与任何合适的多核苷酸测序技术一起使用。这类测序技术可包括常规测序方法,如Sanger测序、Illumina(Solexa)测序、焦磷酸测序、下一代测序、Maxam-Gilbert测序、链终止法、鸟枪法测序、桥式PCR。下一代测序方法可包括大规模平行标记测序、聚合酶克隆测序、SOLiD测序、Ion Torrent半导体测序、DNA纳米球测序、Heliscope单分子测序、单分子实时(SMRT)测序。可使用的其他测序方法包括纳米孔DNA测序、隧穿电流DNA测序、杂交测序、质谱测序、微流体Sanger测序、基于显微术的技术、RNA聚合酶测序、体外病毒高通量测序,或本领域使用的任何其他测序方法。
所述方法可进一步包括使用DNA连接酶如T4连接酶、大肠杆菌连接酶、任何哺乳动物连接酶如DNA连接酶I、DNA连接酶III、DNA连接酶IV、真核DNA连接酶、热稳定连接酶,或本领域已知的任何其他连接酶。
所述扩增方法可用来扩增多核苷酸。多核苷酸扩增可包括任何扩增,如聚合酶链反应(PCR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、自我持续序列复制(3SR)、环介导的等温扩增(LAMP)、链置换扩增(SDA)、全基因组扩增、多重置换扩增、链置换扩增、解旋酶依赖性扩增、切口酶扩增反应、重组聚合酶扩增、逆转录PCR、连接介导的PCR、甲基化特异性PCR,或本领域已知的任何其他扩增。全基因组扩增应用可包括IVF、CTC癌症检测、单细胞研究,干细胞研究需要样品保存或干净的扩增。在本发明的一些实例中,本文使用的扩增方法包括在多核苷酸链的扩增过程中释放焦磷酸的扩增反应。
Taq聚合酶构建体
在一些情况下,本文公开了一种包含扩增酶和能够结合白蛋白的蛋白质的多核苷酸扩增酶。该扩增酶可为聚合酶蛋白质。该聚合酶蛋白质可为DNA聚合酶。示例性的DNA聚合酶在本文其他地方公开,并且可包括但不限于Bst DNA聚合酶、Bsu DNA聚合酶、CrimsonTaq DNA聚合酶、Deep VentR TMDNA聚合酶、Deep VentR TM(exo-)DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶I,Klenow片段(3’-5’exo-)、DNA聚合酶I(大Klenow片段)、Taq DNA聚合酶、热启动Taq DNA聚合酶、M-MuLV逆转录酶;OneDNA聚合酶、One热启动DNA聚合酶、phi29DNA聚合酶、热启动Flex DNA聚合酶、高保真DNA聚合酶、热启动DNA聚合酶、硫化叶菌DNA聚合酶IV、T4DNA聚合酶、TheminatorTMDNA聚合酶、VentR TMDNA聚合酶以及VentR TM(exo-)DNA聚合酶。在一些情况下,该聚合酶蛋白质为Taq聚合酶。在一些情况下,该Taq聚合酶为天然Taq聚合酶或经修饰的Taq聚合酶。在一些情况下,该Taq聚合酶为经修饰的Taq聚合酶。在一些情况下,能够结合白蛋白的蛋白质含有白蛋白结合位点(ABS)。
经修饰的Taq聚合酶构建体可含有经修饰的Taq聚合酶部分和ABS部分。经修饰的Taq聚合酶构建体可进一步包含多组氨酸标签(6xHis标签)。经修饰的Taq聚合酶构建体可进一步包含多组氨酸标签(6xHis标签)和ABS。在一些情况下,使用HIS(6)(即,6XHis标签)作为纯化标签。有时,使用ABP作为纯化标签。参见作为实例的图3。在一些情况下,将ABS并入免疫球蛋白结合蛋白中。可将ABS并入蛋白G如链球菌蛋白G中。ABS可并入白蛋白结合蛋白(ABP)。有时,ABS是ABP,如来自链球菌蛋白G的ABP。在一些情况下,Taq聚合酶融合蛋白被称为His(6)-ABS-Taq聚合酶。His(6)标签、ABS和Taq聚合酶可以彼此直接相连。His(6)标签、ABS和Taq聚合酶可通过间隔区相连。示例性的His(6)-ABS-Taq聚合酶构建体如图3所示。在一些情况下,该His(6)-ABS-Taq聚合酶构建体为如901、902、903、904、905或906所示的构建体。该His(6)-ABS-Taq聚合酶构建体可为如901所示的构建体。可将His(6)-ABS-Taq聚合酶构建体进一步修饰以除去6xHis标签部分,如907所示。可在纯化过程期间或之后切去6xHis标签部分。间隔区E可含有允许从ABS-Taq聚合酶部分上除去6xHis标签的酶切位点。可将His(6)-ABS-Taq聚合酶构建体进一步修饰以除去6xHis标签部分和ABS部分,如908所示。间隔区F也可含有酶切位点。有时,间隔区E中的酶切位点与间隔区F中的酶切位点相同。间隔区E中的酶切位点可与间隔区F中的酶切位点不同。
ABS、HIS(6)或二者与经修饰的Taq聚合酶蛋白质之间的距离由间隔区E和间隔区F限定。间隔区E和间隔区F都代表分子连接,如共价连接。间隔区E可为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个共价连接的氨基酸。间隔区F可为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个共价连接的氨基酸。间隔区E中共价连接的氨基酸的数目可以与间隔区F中共价连接的氨基酸的数目不同。间隔区E中共价连接的氨基酸的数目可以与间隔区F中共价连接的氨基酸的数目相同。该间隔区分子可为嵌合肽、有机分子、糖、肽、多核苷酸或核酸单体。该有机分子可为脂肪族分子、共轭分子或芳香族分子。该共轭有机分子可包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个共轭键。该糖可为单糖、二糖、寡糖或多糖。在一些实例中,间隔区E与间隔区F相同。在一些情况下,间隔区E与间隔区F不同。
如本文所公开的,在一些情况下,ABS从蛋白G获得。蛋白G是在革兰氏阳性菌的表面上充当细菌受体的免疫球蛋白结合蛋白。在一些情况下,蛋白G在C组和G组链球菌中表达。ABP可从G148菌株链球菌蛋白G(SpG)获得。
含有ABS的蛋白G蛋白质的任何部分均可连接至经修饰的Taq聚合酶。在一些情况下,该ABS为ABP。有时,ABS为蛋白G的ABD1、ABD2和ABD3区中的至少一个。BB区可连接至Taq聚合酶。ABP区可连接至Taq聚合酶。ABD区可连接至Taq聚合酶。在一些情况下,整个链球菌蛋白G连接至Taq聚合酶。在一些情况下,His(6)部分进一步连接至具有ABS的经修饰的Taq聚合酶构建体。His(6)部分可连接至Taq聚合酶连接(这样的构建体缺少白蛋白结合位点)。
在一些情况下,ABS进一步包含第二结合位点。第二结合位点可在ABP内。第二结合位点可通过直接共价连接或非直接方式(例如,间隔区)与ABP连接。第二结合位点可在与ABP结合位点不同的位点,并且不干扰ABP与白蛋白的相互作用。第二结合位点可为识别膜蛋白的结构域的结合位点。该膜蛋白可为来自细菌的I型膜蛋白。该膜蛋白可为链球菌蛋白A(SpA)。第二结合位点可识别SpA的一个或多个结构域。有时,第二结合位点识别SpA的结构域B。第二结合位点偶尔识别结构域B的类似物——Z结构域。在一些情况下,第二结合位点为Z结构域结合位点。在一些情况下,ABP进一步包含本文中被称为ABP-Z的Z结构域结合位点。可采用用于制备靶蛋白构建体的一般程序产生ABS构建体。在一些情况下,ABS构建体在图2中描述。
可通过任何合适的诱变方法生成经修饰的Taq聚合酶。在一些情况下,通过定点诱变方法生成经修饰的Taq聚合酶。如上文所公开的,定点诱变是一种允许在感兴趣的基因内进行特定改变或修饰的方法。定点诱变可采用盒式诱变法、PCR定点诱变、全质粒诱变、Kunkel法或体内定点诱变法。可通过随机诱变方法生成经修饰的Taq聚合酶。随机诱变是一种生成具有不同功能性质的蛋白质突变体文库的方法。可采用易错PCR法、滚环易错PCR法、增变菌株法、临时增变菌株法、插入诱变法、甲磺酸乙酯法、亚硝酸法或DNA改组实现随机诱变。在一些情况下,采用易错PCR法的随机诱变用来生成经修饰的Taq聚合酶。
在一些情况下,扩增酶和白蛋白构建体是热稳定的。该扩增酶可为聚合酶蛋白质。该聚合酶蛋白质可为DNA聚合酶。示例性DNA聚合酶在本文其他地方描述,并且可包括但不限于Bst DNA聚合酶、Bsu DNA聚合酶、Crimson Taq DAN聚合酶、Deep VentR TMDNA聚合酶、Deep VentR TM(exo-)DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶I,Klenow片段(3’-5’exo-)DNA聚合酶I(大Klenow片段)、Taq DNA聚合酶、热启动Taq DNA聚合酶、M-MuLV逆转录酶;OneDNA聚合酶、One热启动DNA聚合酶、phi29DNA聚合酶、热启动Flex DNA聚合酶、高保真DNA聚合酶、热启动DNA聚合酶、硫化叶菌DNA聚合酶IV、T4DNA聚合酶、TheminatorTMDNA聚合酶、VentR TMDNA聚合酶以及VentR TM(exo-)DNA聚合酶。该DNA聚合酶可为Taq聚合酶。扩增酶和白蛋白构建体可为Taq聚合酶和白蛋白构建体。该Taq聚合酶和白蛋白构建体可以是热稳定的。热稳定的Taq聚合酶和白蛋白构建体在至少50、51、52、53、54、55摄氏度或更高的温度下可以是稳定的。在一些情况下,本文公开了一种对ATP具有亲和力并且对至少两种其他dNTP具有相似亲和力的经修饰的己糖激酶。该dNTP可为天然核苷或非天然核苷。dNTP可包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP或dUTP。每种核苷酸对己糖激酶的结合亲和力可为至少1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、250微摩尔(μM)或更高。核苷酸对己糖激酶的结合亲和力可为至多1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、250纳摩尔(nM)或更低。因此,各种核苷酸的相似的结合亲和力可以在上文提及的最小值和最大值限定的范围内。例如,相似的结合亲和力可在50至150微摩尔(μM)之间。相似的结合亲和力可在70至100微摩尔(μM)之间。在一些情况下,本文公开了一种识别ATP但不识别dATP的经修饰的萤光素酶。在一些情况下,本文公开了允许在更高的温度下进行测序反应的热稳定酶。在一些情况下,所述更高的温度为至少50、51、52、53、54、55摄氏度或更高的温度。有时,更高的温度消除了对辅助蛋白质如单链DNA结合蛋白(SSB)的需要,从而防止DNA二级结构的形成。在一些情况下,本文所述的测序方法如图4所示。
在图4中,dNTP被多核苷酸(例如,DNA)聚合酶如Taq聚合酶以迭代的方式掺入至DNA模板上。该聚合酶可为并入能够结合白蛋白的蛋白质的酶构建体,例如,具有ABS的Taq聚合酶构建体。该聚合酶可为能够与白蛋白结合的Taq聚合酶构建体。在一些情况下,该白蛋白为人白蛋白或牛白蛋白。白蛋白可为血清白蛋白(例如,人血清白蛋白或牛血清白蛋白)。该白蛋白可为任何白蛋白类型,例如牛白蛋白或人白蛋白。该白蛋白可为血清白蛋白。有时,控制每种类型dNTP的引入。可将dNTP类型逐一引入反应混合物中。在一些情况下,生成了DNA产物和无机焦磷酸盐(PPi)(201)。在偶联的反应中,在APS的存在下,PPi被ATP硫酸化酶转化成ATP(202)。随后在光生成反应中由萤光素酶检测ATP(203)。在糖(例如,己糖)的存在下,由糖磷酸酶(例如,己糖激酶)将过量的核苷酸如ATP和dNTP转化成ADP和dNDP,同时己糖被转化为糖(例如,己糖)磷酸盐(204)。在一些情况下,所产生的光的量与所掺入的核苷酸的量成比例。在一些情况下,总输出形成可被定量或定性监测的光谱(light profile)。
在一些情况下,采用用于制备靶蛋白构建体的一般程序产生Taq聚合酶构建体。有时,通过使用如上文提及的生物工程化的宿主产生Taq聚合酶构建体。如本文其他地方所述,经修饰的Taq聚合酶蛋白质的纯化可采用用于纯化上述靶蛋白构建体的一般程序,其中靶蛋白为经修饰的Taq聚合酶蛋白质。在一些情况下,纯化方案为图2所示的方案。
在分子诊断领域的应用
在本发明的一些方面,本发明在分子诊断领域如感染原鉴别、遗传性疾病、癌症基因检测和基因变异如单核苷酸多态性中是有用的。本文公开的发明可用于鉴别感染原。如本文所用的,感染原是在宿主生物体如哺乳动物如人中引起感染的病原,如病毒、细菌、真菌、线虫或原生动物。
示例性的感染性病毒包括:逆转录病毒科(例如,人免疫缺陷病毒,如HIV-1(也被称为HTLV-III、LAV或HTLV-III/LAV,或HIV-III;及其他分离株,如HIV-LP);小核糖核酸病毒科(例如,脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒;肠道病毒、人柯萨奇病毒、鼻病毒、埃柯病毒);杯状病毒科(例如,引起胃肠炎的毒株);披膜病毒科(例如,马脑炎病毒、风疹病毒);黄病毒科(例如,登革热病毒、脑炎病毒、黄热病病毒);冠状病毒科(例如,冠状病毒);弹状病毒科(例如,水泡性口炎病毒、狂犬病病毒);纤丝病毒科(例如,埃博拉病毒);副粘病毒科(例如,副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒);正粘病毒科(例如,流感病毒);布尼亚病毒科(例如,汉坦病毒、布尼亚病毒、白蛉病毒和内罗毕病毒);砂粒样病毒科(出血热病毒);呼肠病毒科(例如,呼肠孤病毒、环状病毒和轮状病毒);双RNA病毒科;肝脱氧核糖核酸病毒科(乙型肝炎病毒);细小病毒科(细小病毒);乳多空病毒科(乳头瘤病毒、多瘤病毒);腺病毒科(多数腺病毒);疱疹病毒科(1型和2型单纯疱疹病毒(HSV)、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV)、疱疹病毒);痘病毒科(类天花病毒、痘苗病毒、痘病毒)、虹彩病毒科(例如,非洲猪瘟病毒)或未分类的病毒(例如,海绵状脑病的病原、丁型肝炎病原(被认为是乙型肝炎病毒的有缺陷的卫星体))、非甲非乙型肝炎病原(1级=内部传播;2级=肠胃外传播(即,丙型肝炎);诺瓦克病毒及相关病毒,以及星形病毒)。
示例性的感染性细菌包括幽门螺杆菌(Helicobacter pyloris)、布氏疏螺旋体(Borelia burgdorferi)、侵肺军团菌(Legionella pneumophilia)、分枝杆菌属(Mycobacteria)的种(例如,结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、鸟分枝杆菌(M.avium)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、戈登分枝杆菌(M.gordonae))、金黄色葡萄球菌、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、单核细胞增生利斯特氏菌、酿脓链球菌(A群链球菌)、无乳链球菌(B群链球菌)、链球菌(绿色群)、粪链球菌(Streptococcus faecalis)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、链球菌(厌氧种)、肺炎链球菌、致病性弯曲杆菌属的种(Campylobacter sp.)、肠球菌属的种(Enterococcus sp.)、流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)、炭疽芽孢杆菌、白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、棒杆菌属的种(Corynebacterium sp.)、猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、产气荚膜梭菌、破伤风梭菌、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、杀鼠巴斯德氏菌(Pasturella multocida)、拟杆菌属的种(Bacteroidessp.)、具核梭形菌(Fusobacterium nucleatum)、念珠状链杆菌(Streptobacillusmoniliformis)、苍白密螺旋体(Treponema pallidum)、极细密螺旋体(Treponemapertenue)、钩端螺旋体(Leptospira)或衣氏放线杆菌(Actinomyces israelli)。
示例性的感染性真菌包括:新型隐球酵母、荚膜组织胞浆菌(Histoplasmacapsulatum)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、皮炎芽生菌(Blastomycesdermatitidis)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)或白色假丝酵母。
示例性的感染性线虫包括蛔虫(蛔虫属)、丝虫、钩虫、蛲虫、圆形虫或鞭虫。
示例性的感染性原生动物包括棘阿米巴属(Acanthamoeba)、狒狒巴拉姆希阿米巴(Balamuthia mandrillaris)、内蜒属(Endolimax)、溶组织内阿米巴(Entamoebahistolytica)、兰伯氏贾第虫(Giardia lamblia)或疟原虫属的种(Plasmodium spp.)。
在一些实例中,本文公开的发明对鉴别遗传病况是有用的。示例性的遗传病况包括22q11.2缺失综合征、安格尔曼综合征、卡纳万病、Charcot–Marie–Tooth病、色盲、猫叫综合征(Cri du chat)、囊性纤维化、唐氏综合征、迪谢内肌营养不良、血色素沉着病、血友病、克兰费尔特综合征、神经纤维瘤病、苯丙酮尿症、多囊肾病、普-威综合征、镰状细胞病、泰-萨病或特纳综合征。
在一些情况下,本文公开的发明可用于癌症基因测试,例如,用于优化治疗方案或根据存在的癌症类型将患者群体分层成耐药患者或初次使用药物患者。在一些情况下,该癌症为实体瘤或血液系统癌症。在一些情况下,该实体瘤为肉瘤或癌。在一些情况下,该血液系统癌症为白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤或B细胞恶性肿瘤。
示例性的肉瘤包括:肺泡状横纹肌肉瘤;软组织腺泡状肉瘤;成釉细胞瘤;血管肉瘤;软骨肉瘤;脊索瘤;软组织的透明细胞肉瘤;去分化脂肪肉瘤;硬纤维瘤;结缔组织增生性小圆细胞肿瘤;胚胎型横纹肌肉瘤;上皮样纤维肉瘤;上皮样血管内皮瘤;上皮样肉瘤;成感觉神经细胞瘤;尤因肉瘤;肾外横纹肌样瘤;骨外粘液样软骨肉瘤;骨外骨肉瘤;纤维肉瘤;巨细胞瘤;血管外皮细胞瘤;婴儿型纤维肉瘤;炎性成肌纤维细胞瘤;卡波西肉瘤;骨平滑肌肉瘤;脂肪肉瘤;骨脂肪肉瘤;恶性纤维组织细胞瘤(MFH);骨恶性纤维组织细胞瘤(MFH);恶性间叶瘤;恶性周围神经鞘瘤;间充质软骨肉瘤;粘液纤维肉瘤;粘液样脂肪肉瘤;粘液炎性成纤维细胞肉瘤;伴血管周围上皮细胞分化的肿瘤;骨肉瘤;骨旁骨肉瘤;伴血管周围上皮细胞分化的肿瘤;骨膜骨肉瘤;多形性脂肪肉瘤;多形性横纹肌肉瘤;PNET/骨外尤因肿瘤;横纹肌肉瘤;圆细胞脂肪肉瘤;小细胞骨肉瘤;孤立性纤维瘤;滑膜肉瘤或毛细血管扩张性骨肉瘤。
示例性的癌包括:肛门癌;阑尾癌;胆管癌(即,胆管上皮癌);膀胱癌;脑肿瘤;乳腺癌;宫颈癌;结肠癌;原发性不明癌(CUP);食道癌;眼癌;输卵管癌;胃肠癌;肾癌;肝癌;肺癌;髓母细胞瘤;黑素瘤;口癌;卵巢癌;胰腺癌;甲状旁腺病;阴茎癌;垂体瘤;前列腺癌;直肠癌;皮肤癌;胃癌;睾丸癌;喉癌;甲状腺癌;子宫癌;阴道癌;或外阴癌。
示例性的T细胞恶性肿瘤包括:未另外指定的外周T细胞淋巴瘤(PTCL-NOS)、间变性大细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、母细胞性NK细胞淋巴瘤、肠病型T细胞淋巴瘤、肝脾γ-δT细胞淋巴瘤、淋巴母细胞淋巴瘤、鼻NK/T细胞淋巴瘤或治疗相关的T细胞淋巴瘤。
示例性的B细胞恶性肿瘤包括:慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、高危CLL或非CLL/SLL淋巴瘤。在一些情况下,该癌症为滤泡性淋巴瘤(FL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、多发性骨髓瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、结边缘区B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、非伯基特高恶性B细胞淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤(PMBL)、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞淋巴瘤、B细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、浆细胞瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤或淋巴瘤样肉芽肿病。
在一些情况下,本文公开的发明对检测个体中是否存在遗传变异是有用的。如本文所用的,遗传变异包括一个或多个核苷酸的缺失和插入、不同核苷酸发生的易位(例如,单点突变,如SNP或碱基对置换),或多个核苷酸重复的次数的变化。在一些情况下,该遗传变异为单核苷酸多态性(SNP)。SNP为单核苷酸变异,并有时可导致疾病。在一些情况下,根据在群体中的发生率,SNP为常见SNP或罕见SNP。在一些情况下,本文公开的发明对检测是否存在常见SNP是有用的。在一些情况下,本文公开的发明对检测是否存在罕见SNP是有用的。
仪器
在本发明的一些方面,本发明包括基因检测机器、装置、设备或系统。这样的机器、装置、设备或系统可包括以下的一个或多个:上述专用试剂的区室、样品制备区室、储存室、用于检测生物发光的机构(例如,光学检测器)、加热元件、冷却元件、样品移动元件(即,推动装置或抽吸装置,如一个或多个泵)、样品混合元件(即,搅拌器、混合器、涡旋器)、通道(例如,封闭通道、开放通道、微流体通道)、集成有生物信息学软件的专用计算机、软件和输出设备(例如,声音、显示、震动或打印机)。在一些实例中,软件允许控制一个或多个区室或仪器的编程和运行方法的操作、监测结果的状态或处理。有时,软件进一步允许与一种或多种其他的机器、装置、设备或系统或中央命令系统或其任意组合进行通信。有时,试剂包括化学修饰的酶(例如,与HIS(6)和/或ABS偶联的不识别dATP的突变萤光素酶、具有HIS(6)和/或ABS萤光素酶构建体、具有HIS(6)和/或ABS的己糖激酶构建体、ATP硫酸化酶)、专用的多核苷酸扩增酶(例如,并入能够结合白蛋白的蛋白质序列的聚合酶构建体)、核苷、待扩增和测序的靶多核苷酸、多核苷酸引物。专用扩增酶可以能够拷贝任何长度的多核苷酸片段,如短多核苷酸片段、中等多核苷酸片段、长多核苷酸片段或全基因组。多核苷酸可为DNA或RNA。有时对该方法进行修改,使得扩增的DNA变得固定化,或设置有用于附接至固体支持体上的手段。例如,可将PCR引物固定化,或设置有用于附接至固体支持体上的手段。载体也可包含用于附接至固体支持体上的手段。有时,该机器、装置、设备或系统可包括微流体装置。
在本发明的一些方面,公开了一种用于多核苷酸测序的系统,其包括通过以互补的方式将核苷多磷酸分子与待扩增的至少一种多核苷酸杂交而扩增至少一种待扩增的多核苷酸、连接杂交的核苷多磷酸分子以形成与至少一种待扩增的多核苷酸互补的多核苷酸链,以及释放至少一个焦磷酸。该连接可为共价连接。该系统中还公开了参与将至少一个焦磷酸转化成ATP的试剂和酶,以及参与通过在酶(其将至少一种糖磷酸化以产生至少一种磷酸化的糖)的存在下使ATP反应而将至少一种糖磷酸化的本文公开的试剂和酶。多磷酸可包括至少3、4、5、6、7、8个或更多个磷酸。该系统可含有集成模块,其中每个模块具有例如样品制备、扩增或反应监测的任务。一个或多个模块可含有允许完成一个或多个模块的任务的专用软件。在一些情况下,一个模块为微流体装置。该系统可含有单独的单元,该单独的单元单独起作用以完成本发明中公开的过程的一部分,或串联地起作用以完成本发明中公开的过程。每个单独的单元可具有例如样品制备任务,如制备试剂盒,扩增任务,如PCR机器,或例如用发光计进行的反应监测任务。一个或多个单独的单元可含有不同的软件。在一些情况下,一个单元为微流体装置。
本公开内容提供了被编程用于执行本公开内容的方法的计算机控制系统。图8示出了被编程或以其他方式配置以控制基因检测系统的计算机系统1001。计算机系统1001可调控单个流体相在本公开内容的基因检测系统内的流动的各个方面,诸如,例如,控制基因检测系统的各个组件以检测多核苷酸序列,如单链多核苷酸或双链多核苷酸(如RNA、DNA或任何修饰的或非天然的多核苷酸序列)。计算机系统1001包括中央处理器(CPU,本文中也称为“处理器”和“计算机处理器”)1005,其可为单核或多核处理器,或用于并行处理的多个处理器。计算机系统1001还包括存储器或存储位置1010(例如,随机存取存储器、只读存储器、闪速存储器)、电子存储单元1015(例如,硬盘)、用于与一个或多个其他系统通信的通信接口1020(例如,网络适配器),以及外围设备1025,如高速缓存、其他存储器、数据存储和/或电子显示适配器。存储器1010、存储单元1015、接口1020和外围设备1025通过通信总线(实线)如主板与CPU 1005通信。存储单元1015可为用于存储数据的数据存储单元(或数据存储库)。在通信接口1020的帮助下,计算机系统1001可以可操作地耦合至计算机网络(“网络”)1030。网络1030可为因特网、互联网和/或外联网,或与因特网通信的内联网和/或外联网。在一些情况下,网络1030为电信和/或数据网络。网络1030可包括一个或多个计算机服务器,该一个或多个计算机服务器可实现分布式计算,如云计算。在一些情况下,在计算机系统1001的帮助下,网络1030可实现对等网络,该对等网络可使耦合至计算机系统1001的装置用作客户端或服务器。
CPU 1005可执行可体现在程序或软件中的一系列机器可读指令。该指令可存储在存储位置如存储器1010中。CPU 1005执行的操作的实例可包括提取、解码、执行和回写。
存储单元1015可存储文件,如驱动程序、库和保存的程序。存储单元1015可存储用户数据,例如用户偏好和用户程序。在一些情况下,计算机系统1001可包括在计算机系统1001外部,如位于通过内联网或因特网与计算机系统1001通信的远程服务器上的一个或多个附加数据存储单元。
计算机系统1001可通过网络1030与一个或多个远程计算机系统进行通信。例如,计算机系统1001可与用户的远程计算机系统(例如,操作者或终端用户)进行通信。远程计算机系统的实例包括个人计算机(例如,便携式PC)、平板(slate)或平板电脑(例如, Galaxy Tab)、电话、智能电话(例如,iPhone、支持Android的设备、)或个人数字助理。用户可经由网络1030访问计算机系统1001。在一些情况下,终端用户为实验室技术人员、医生、客户、患者或研究人员。
如本文所述的方法可通过存储在计算机系统1001的电子存储位置如存储器1010或电子存储单元1015上的机器(例如,计算机处理器)可执行代码的方式实施。机器可执行代码或机器可读代码可以以软件的形式提供。在使用期间,代码可由处理器1005执行。在一些情况下,可从存储单元1015检索代码并将其存储在存储器1010上,以供处理器1005准备访问。在一些情况下,可以排除电子存储单元1015,并将机器可执行指令存储在存储器1010上。
可将代码预编译并配置为与具有适于执行该代码的处理器的机器一起使用,或者可在运行期间将其编译。可以以编程语言的方式提供代码,可选择该程序语言以使代码能够以预编译或原样编译的方式执行。
本文提供的系统和方法的方面,如计算机系统1001,可体现在编程中。技术的各个方面可被认作“产品”或“制品”,该“产品”或“制品”通常为在一类机器可读介质上携带或于其中体现的机器(或处理器)可执行代码和/或相关数据的形式。机器可执行代码可被存储在电子存储单元如存储器(例如,只读存储器、随机存取存储器、闪速存储器)或硬盘上。“存储”型介质可以包括计算机、处理器等的任何或全部有形存储器,或其相关模块,如各种半导体存储器、磁带驱动器、磁盘驱动器等,其可随时为软件编程提供非暂时性存储。有时可通过因特网或各种其他电信网络来通信软件的全部或部分。例如,这样的通信可以使得软件能够从一个计算机或处理器加载到另一个计算机或处理器,例如从管理服务器或主机加载至应用服务器的计算机平台中。因此,可承载软件要素的另一类型的介质包括如跨越本地设备之间的物理接口、通过有线和光学陆上网络以及经由各种空中链路使用的光波、电波和电磁波。携带这类波的物理元件,如有线或无线链路、光学链路等,也可被认为是携带该软件的介质。如本文所使用的,除非限于非暂时性有形“存储”介质,否则诸如计算机或机器“可读介质”等术语是指参与向处理器提供指令以供执行的任何介质。
因此,机器可读介质如计算机可执行代码可采取许多形式,包括但不限于有形存储介质、载波介质或物理传输介质。非易失性存储介质包括,例如,光盘或磁盘,如任何计算机等中的任何存储设备,如可用于实现附图中所示的数据库等的存储设备。易失性存储介质包括动态存储器,如这类计算机平台的主存储器。有形传输介质包括同轴电缆;铜线和光纤,包括在计算机系统内构成总线的导线。载波传输介质可采取电信号或电磁信号的形式,或声波或光波,如在射频(RF)和红外(IR)数据通信期间产生的那些。因此,计算机可读介质的常见形式包括例如:软盘、柔性盘、硬盘、磁带、任何其他磁性介质、CD-ROM、DVD或DVD-ROM、任何其他光学介质、穿孔卡片纸带、具有孔图案的任何其他物理存储介质、RAM、ROM、PROM和EPROM、FLASH-EPROM、任何其他存储器芯片或匣、传送数据或指令的载波、传送这类载波的电缆或链路,或计算机可从中读取编程代码和/或数据的任何其他介质。这些形式的计算机可读介质中有许多可参与将一个或多个系列的一个或多个指令携带至处理器以供执行。
计算机系统1001可包括电子显示器或可与该电子显示器通信,该电子显示器包含用于提供例如基因系统的各个方面的用户界面(UI)。一个方面的实例可以是由该系统检测到的多核苷酸的水平。显示器可任选地包括绝对或相对多核苷酸水平、多核苷酸的序列和关于任何遗传改变的数据,以及用户的历史遗传数据,或任何比较用的或正常的多核苷酸数据。任何上述多核苷酸水平以及收集到该水平的相应历史或比较用的日期和时间均可保存在任何上述存储系统或其组合中,并且可被计算机系统和/或用户访问。可由计算机系统、用户或二者来实现保存。历史数据可被计算机系统、用户或二者访问。所显示的历史水平可以是由用户选择的过去的日期和/或时间,或者是预定日期和/或时间的历史水平。显示器还可包括基因检测系统的所有组件的草图。该草图可显示特定组件的当前操作状态。该草图可显示系统内的反应物、多核苷酸、溶剂、缓冲液、酶的水平、流体的任何其他性质,或其任何组合。该草图还可显示上述实时水平、历史水平或两者。显示器还可包括可允许手动控制高灵敏度基因检测系统的任何组件的用户界面。这样的用户控制可通过用户使用触摸屏、遥控设备、计算机“鼠标”、小键盘、键盘、触摸板、触控笔、操纵杆、指轮、语音识别界面、本领域中已知的任何其他用户输入界面或其组合来实现。UI的实例包括但不限于图形用户界面(GUI)和基于web的用户界面。
本公开内容的方法和系统可通过一种或多种算法来实现。可通过软件在由一个或多个计算机处理器执行时实现算法。在一些实例中,可使用用于比较或评估测序数据的一种或多种算法。
组合物和试剂盒
本公开内容还提供了用于本文所述的方法的组合物和试剂盒。该组合物可包含本文所述的任何组分、反应混合物和/或中间体,及其任意组合。例如,本公开内容提供了用于本文所述的方法的检测试剂。可提供任何合适的试剂,包括HIS(6)、Z结构域和/或ABS聚合酶(例如,DNA聚合酶)、HIS(6)和/或ABS己糖激酶、不识别dATP的突变萤光素酶,HIS(6)、Z结构域和/或ABS萤光素酶、不识别dATP的HIS(6)和/或ABS突变萤光素酶、化学修饰的己糖激酶、化学修饰的HIS(6)和/或ABS己糖激酶、不识别dATP的化学修饰的突变萤光素酶、化学修饰的HIS(6)和/或ABS萤光素酶、不识别dATP的化学修饰的HIS(6)和/或ABS突变萤光素酶、化学修饰的萤光素酶、ABS硫酸化酶、化学修饰的ABS硫酸化酶、腺苷三磷酸双磷酸酶、化学修饰的腺苷三磷酸双磷酸酶,或其任何组合。其他检测试剂可包括用于与靶DNA杂交的引物、脱氧核苷酸,或可选的脱氧核苷酸类似物,任选地包括替代dATP的、能够充当聚合酶的底物但不能充当PPi检测酶的底物的dATP类似物,以及用于进行PCR反应的缓冲液。在一些情况下,引物与靶DNA足够互补以允许退火。
在一些情况下,本公开内容提供了一种用于多核苷酸测序的试剂盒,其包含:多核苷酸扩增试剂;糖磷酸化酶;以及生物发光酶,其中该试剂盒不包括核苷酸降解酶。糖磷酸化酶可为任意的上述糖磷酸化酶,并且生物发光酶可为任意的上述生物发光酶。该试剂盒可进一步包含将焦磷酸转化为ATP的酶。将焦磷酸转化为ATP的酶可为ATP硫酸化酶。有时,该试剂盒进一步包含DNA连接酶。DNA连接酶的一个实例为T4连接酶。该试剂盒可进一步包含处理单元。处理单元的一个实例可为计算机。该试剂盒可进一步包含专用软件、光检测系统、用于检测电磁辐射的检测系统、输入单元或输出单元。输出单元的一个实例可为音频装置、视觉装置或打印机。视觉装置可为屏幕,如计算机屏幕。该试剂盒可进一步包含通道。在一些情况下,该通道为微流体通道。在一些情况下,生物发光酶不识别dATP。生物发光酶在高于50摄氏度下可以是热稳定的。该试剂盒可进一步包含糖磷酸化酶。该试剂盒可进一步包含糖。
在一些情况下,本公开内容提供了一种用于多核苷酸测序的试剂盒,其包含:多核苷酸扩增试剂;以及不识别dATP的生物发光酶,其中该试剂盒不包括识别dATP的生物发光酶。糖磷酸化酶可为任意的上述糖磷酸化酶,并且生物发光酶可为任意的上述生物发光酶。该试剂盒可进一步包含将焦磷酸转化为ATP的酶。将焦磷酸转化为ATP的酶可为ATP硫酸化酶。有时,该试剂盒进一步包含DNA连接酶。DNA连接酶的一个实例为T4连接酶。该试剂盒可进一步包含处理单元。处理单元的一个实例可为计算机。该试剂盒可进一步包含专用软件、光检测系统、用于检测电磁辐射的检测系统、输入单元或输出单元。输出单元的一个实例可为音频装置、视觉装置或打印机。视觉装置可为屏幕,如计算机屏幕。该试剂盒可进一步包含通道。在一些情况下,该通道为微流体通道。在一些情况下,生物发光酶在高于50摄氏度下是热稳定的。该试剂盒可进一步包含糖磷酸化酶。该试剂盒可进一步包含糖。该试剂盒可不包括核苷酸降解酶。在一些情况下,该试剂盒进一步包含核苷酸降解酶。核苷酸降解酶的一个实例为腺苷三磷酸双磷酸酶。
在一些情况下,本公开内容提供了一种用于多核苷酸测序的试剂盒,其包含:多核苷酸扩增试剂;以及在高于50摄氏度下稳定的生物发光酶,其中该试剂盒不包括最多在50摄氏度时稳定的生物发光酶。糖磷酸化酶可为任意的上述糖磷酸化酶,并且生物发光酶可为任意的上述生物发光酶。在一些情况下,该生物发光酶不识别dATP。该试剂盒可进一步包含将焦磷酸转化为ATP的酶。将焦磷酸转化为ATP的酶可为ATP硫酸化酶。有时,该试剂盒进一步包含DNA连接酶。DNA连接酶的一个实例为T4连接酶。该试剂盒可进一步包含处理单元。处理单元的一个实例可为计算机。该试剂盒可进一步包含专用软件、光检测系统、用于检测电磁辐射的检测系统、输入单元或输出单元。输出单元的一个实例可为音频装置、视觉装置或打印机。视觉装置可为屏幕,如计算机屏幕。该试剂盒可进一步包含通道。在一些情况下,该通道为微流体通道。该试剂盒可进一步包含糖磷酸化酶。该试剂盒可进一步包含糖。在一些实例,该试剂盒不包含核苷酸降解酶。在一些情况下,该试剂盒进一步包含核苷酸降解酶。核苷酸降解酶的一个实例为腺苷三磷酸双磷酸酶。
在一些情况下,本公开内容提供了一种用于多核苷酸测序的试剂盒,其包含:多核苷酸扩增试剂;使至少一种核苷多磷酸失活的热稳定酶;以及生物发光酶。使至少一种核苷多磷酸失活的酶可为任意的上述糖磷酸化酶,或核苷降解酶。糖磷酸化酶的一个实例为己糖激酶。核苷降解酶的一个实例为腺苷三磷酸双磷酸酶。生物发光酶可为任意的上述生物发光酶。在一些情况下,该生物发光酶不识别dATP。该试剂盒可进一步包含将焦磷酸转化为ATP的酶。将焦磷酸转化为ATP的酶可为ATP硫酸化酶。有时,该试剂盒进一步包含DNA连接酶。DNA连接酶的一个实例为T4连接酶。该试剂盒可进一步包含处理单元。处理单元的一个实例可为计算机。该试剂盒可进一步包含专用软件、光检测系统、用于检测电磁辐射的检测系统、输入单元或输出单元。输出单元的一个实例可为音频装置、视觉装置或打印机。视觉装置可为屏幕,如计算机屏幕。该试剂盒可进一步包含通道。在一些情况下,该通道为微流体通道。该试剂盒可进一步包含糖磷酸化酶。该试剂盒可进一步包含糖。在一些实例,该试剂盒不包含核苷酸降解酶。在一些实例,该试剂盒不包含糖磷酸化酶。
本公开内容还提供了用于实施本发明方法的试剂盒。相应地,在适当的包装中提供多种试剂盒。这些试剂盒可用于任一种或多种本文所述的用途,并可相应地含有关于检测靶DNA的存在或不存在的说明书,并且可含有关于结果解释的说明书。试剂盒可为诊断试剂盒,例如,适用于检测本文记载的任何感染原、遗传基因、癌基因和生物标志物、遗传异常和/或遗传变异的诊断试剂盒。试剂盒可含有本公开内容中提供的任意组合物,包括上文记载的那些。
尽管本文已经示出并描述了本发明的一些示例,但对本领域技术人员而言将明显的是,这些示例仅以举例的方式提供。并不意味着本发明被说明书中提供的具体实例所限制。尽管已参考上述说明书描述了本发明,但并非意在以限制的意义解释本文中实例的描述和说明。在不脱离本发明的情况下,本领域技术人员将会想到许多变化、改变和替换。此外,应当理解,本发明的所有方面都不限于本文所阐述的具体描述、配置或相对比例,这取决于各种条件和变量。应当理解,在实施本发明时可以采用本文所述的本发明实例的各种替代方案。因此,预期本发明还将涵盖任何这样的替代、修改、变化或等同物。旨在用以下权利要求限定本发明的范围,并由此涵盖在这些权利要求的范围内的方法和结构及其等同物。
尽管本文已经示出并描述了本发明的一些示例,但对本领域技术人员而言将明显的是,这些示例仅以举例的方式提供。在不脱离本发明的情况下,本领域技术人员将会想到许多变化、改变和替换。应当理解,在实施本发明时可以采用本文所述的本发明示例的各种替代方案。旨在用以下权利要求限定本发明的范围,并由此涵盖在这些权利要求的范围内的方法和结构及其等同物。
实施例
这些实施例仅为了说明目的而提供,而不是限制本文提供的权利要求的范围。
实施例1:用于生成经修饰的萤光素酶和经修饰的己糖激酶的易错PCR。
大肠杆菌DH5α用于大肠杆菌克隆实验。大肠杆菌Rosetta 2(DE3)(EMDMillipore,Billerica,MA,USA)用作表达实验的宿主。巴斯德毕赤酵母菌株KM71、SMD1168或GS115用作酵母表达实验的宿主。
易错PCR用于向萤火虫萤光素酶和酿酒酵母己糖激酶同工酶B基因中引入分子多样性。在此方法中,可通过在Mn2+离子和比例不平衡的dNTP的存在下降低Taq DNA聚合酶的保真度而在靶基因的任何位置处生成随机突变。使用来自Agilent Technologies的GeneMorph II随机诱变试剂盒。该试剂盒含有Mutazyme II DNA聚合酶(2.5U/μL)、10×Mutazyme II反应缓冲液和dNTP混合物(10mM每种dNTP)。3–4μg质粒用于epPCR文库的克隆和表达,对于大肠杆菌和巴斯德毕赤酵母分别采用载体pET21和pPIC9。
使用有利于粘性末端定向克隆并在表达载体多克隆位点内切割的限制酶进行载体(~3μg)和epPCR产物(~1μg)的切割,直至完成。
图9示出了用于生成经修饰的己糖激酶的易错PCR方法。如图9C所示,使用细菌萤光素酶或氧化还原酶,通过活性测定进一步测试经修饰的己糖激酶的活性。图10示出了用于生成经修饰的萤火虫萤光素酶的易错PCR方法。
实施例2:赖氨酸残基的乙酰化
使用在pH 8.0的50mM磷酸钠中的乙酸酐,采用每mol氨基50倍摩尔过量的乙酸酐进行赖氨酸残基的乙酰化。将10ml在磷酸盐缓冲液中的20mg/ml蛋白质溶液与三分之一体积的饱和乙酸钠混合,并将温度和pH维持在0-4℃或8.0℃。在持续搅拌下,在约1小时内完成反应。
实施例3:赖氨酸残基的柠康酰化
使用柠康酸酐进行赖氨酸残基的柠康酰化(Khajeh等人,2001,Enzyme andMicrobial Technology,28,543-549)。蛋白质浓度为在10ml100mM硼酸盐缓冲液(pH 8.0)中4mg/ml,并通过逐步添加改性剂的3μL等份,同时通过添加2M NaOH将搅拌溶液的pH保持在8.0,于室温下进行该过程。反应完成后,溶液的pH保持稳定,并且将反应混合物相对于pH7.5的20mM Tris充分透析。
实施例4:通过荧光确定赖氨酸修饰的程度
在乙酰化或柠康酰化完成后,确定了酶中赖氨酸修饰的程度。向约2mg/ml的5μl蛋白质溶液中混入250μl 100mM Na2HPO4、90μl去离子水和在乙腈中的100μl 1mM荧光胺,并在黑暗中温育10min。使用390/490nm的激发/发射波长测量荧光(参见Schmitt等人,2005,Anal.Biochem.338,201-215,Morshedi等人,2010,Biochimica Biophysica Acta,1804,714-722)。
实施例5:用于生成经修饰的Taq聚合酶的易错PCR
克隆
大肠杆菌DH5α用于大肠杆菌克隆实验。大肠杆菌Rosetta 2(DE3)(EMDMillipore,Billerica,MA,USA)用作表达实验的宿主。巴斯德毕赤酵母菌株KM71、SMD1168或GS115用作酵母表达实验的宿主。
从水生栖热菌菌株YT-1中扩增编码Taq聚合酶的基因。将该基因克隆至载体pET21中,该载体含有与亲和标签Bio-His6-ABP的N-末端融合体的编码序列。
或者,通过Genscript(Piscataway,NJ,USA),用针对在巴斯德毕赤酵母中表达而优化的密码子来合成编码N-末端融合白蛋白结合蛋白(ABP)的Taq聚合酶的基因。添加侧翼XhoI/NotI限制位点,使得编码序列可被插入至载体YpDC541中,以创建具有酿酒酵母的α-交配分泌信号并且将处于甲醇诱导型醇氧化酶启动子控制下的融合体。将YpDC541-ABP-Taq构建体整合至巴斯德毕赤酵母菌株KM71、SMD1168或GS115中。
采用大肠杆菌系统的生长、表达和纯化
具有质粒pET21-Tag-Taq的大肠杆菌Rosetta 2(DE3)细胞用于表达实验。使细胞在37℃下于补充有100μg/ml羧苄青霉素和34μg/ml氯霉素的Terrific Broth(47.6g/l,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)中生长,直至OD600达到0.6。分别以0.5mM和0.1mM的终浓度添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和D-生物素。细胞在37℃下再生长4hr。
在Bio-His6-ABP-Taq于大肠杆菌中重组表达之后,通过亲和色谱将蛋白质纯化。首先将细胞离心,并使用洗涤缓冲液(50mM Tris-HCl,pH 8.0、0.2M NaCl、0.05%吐温20和1mM EDTA)将其重悬至原始起始体积的1:20。添加溶菌酶(1mg/ml)、DNA酶I(100U)、MgCl2(2.5mM)和CaCl2(0.5mM),并将悬浮液在37℃下温育2hr。将细胞超声处理,加热至75℃持续1hr,然后在10,000×g下离心25min。离心后,将上清液过滤(0.22μm),之后加载至使用HSA(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)和NHS-Sepharose(GE Healthcare,Pittsburgh,PA,USA)制备的5ml人血清白蛋白(HSA)-Sepharose柱上。加载后,用150ml洗涤缓冲液(50mMTris-HCl,pH 8.0、0.2M NaCl、0.05%吐温20和1mM EDTA)及随后用高盐洗涤缓冲液(含有2M NaCl的洗涤缓冲液)洗柱,以除去残留的DNA污染物。接下来应用50ml预洗脱洗液(10mMNH4Ac,pH 5.5),随后用10ml 0.5M HAc,pH 2.8洗脱。将洗脱的样品收集于1ml 1M Tris-HCl,pH 8.0中,并通过超滤离心浓缩机(Vivaproducts,Littleton,MA,USA)将缓冲液更换成2×储存缓冲液(40mM Tris-HCl,pH 8.0、200mM KCl、0.2mM EDTA、2mM二硫苏糖醇)。添加甘油、吐温20和IGEPAL CA-360至终浓度分别为50%、0.5%和0.5%,并将样品储存于-20℃下。
采用酵母系统的生长、表达和纯化
根据毕赤酵母表达试剂盒手册(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中的方案使酵母培养物生长。为了积累生物质,使培养物在30℃下在YPD培养基中生长,直至OD600达到>10。为了蛋白质表达,将酵母细胞离心、以OD600为10重悬于BMMY培养基(1%酵母提取物、2%蛋白胨、100mM磷酸钾pH 6.0、1.34%YNB、4×10-5%生物素、1%甲醇)中,并在每24hr添加1%甲醇补充物的情况下于30℃下生长2-3天。
在ABP-Taq于巴斯德毕赤酵母中重组表达之后,通过亲和色谱将蛋白质纯化。首先将培养物离心以除去细胞,然后使其通过0.22μm过滤器。然后将该溶液加至使用HSA(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)和NHS-Sepharose(GE Healthcare,Pittsburgh,PA,USA)制备的5ml人血清白蛋白(HSA)-Sepharose柱上。加载后,用150ml洗涤缓冲液(50mMTris-HCl,pH 8.0、0.2M NaCl、0.05%吐温20和1mM EDTA)及随后用高盐洗涤缓冲液(含有2M NaCl的洗涤缓冲液)洗柱,以除去残留的DNA污染物。然后应用50ml预洗脱洗液(10mMNH4Ac,pH 5.5),随后用10ml 0.5M HAc,pH 2.8洗脱。将洗脱的样品收集于1ml 1M Tris-HCl,pH 8.0中,并通过超滤离心浓缩机(Vivaproducts,Littleton,MA,USA)将缓冲液更换成2×储存缓冲液(40mM Tris-HCl,pH 8.0、200mM KCl、0.2mM EDTA、2mM二硫苏糖醇)。添加甘油、吐温20和IGEPAL CA-360至终浓度分别为50%、0.5%和0.5%,并将样品储存于-20℃下。
图11示出了Taq聚合酶-ABS构建体在从大肠杆菌或酵母细胞中纯化后的凝胶电泳。图11A显示了考马斯染色的SDS-PAGE凝胶,其显示出在大肠杆菌中产生的Bio-His6-ABP-Taq聚合酶。在细胞裂解、加热并离心后,使细胞裂解物经过用于一步亲和纯化的HSA-Sepharose柱。泳道M为分子量梯(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA,USA)。泳道1为细胞裂解物。泳道2为柱流过物。泳道3为柱洗脱物。Bio-His6-ABP-Taq的预期分子量为113kDa。图11B示出了扩增的DNA的凝胶电泳。泳道3和泳道4代表在不存在抗Taq聚合酶抗体的情况下在大肠杆菌中表达的、使用具有ABP和HIS(6)的Taq聚合酶蛋白质构建体扩增的DNA。图11C将Taq聚合酶(Ninja Taq)与几种可商购获得的Taq聚合酶进行了比较。图11D在不同的BSA或HSA浓度下将Taq聚合酶(Ninja Taq)与几种可商购获得的Taq聚合酶进行了比较。图11E示出了考马斯染色的SDS-PAGE凝胶,其显示出在巴斯德毕赤酵母中产生的ABP-Taq聚合酶。在离心和过滤后,使细胞培养上清液经过用于一步亲和纯化的HSA-Sepharose柱。泳道1为柱流过物,而泳道2为柱洗脱物。ABP-Taq的预期分子量为109kDa。图11示出了琼脂糖凝胶,其显示出通过在巴斯德毕赤酵母和大肠杆菌中产生的Taq聚合酶进行的PCR扩增。泳道1、2和3示出了在25μL PCR反应中在1μL、0.2μL和0.04μL酶的情况下于巴斯德毕赤酵母中产生的第1批Taq聚合酶的产物。泳道4、5和6示出了在25μL PCR反应中在1μL、0.2μL和0.04μL酶的情况下于巴斯德毕赤酵母中产生的第2批Taq聚合酶的产物。泳道7、8和9示出了在25μLPCR反应中在1μL、0.2μL和0.04μL酶的情况下于大肠杆菌中产生的Taq聚合酶的产物。
实施例6:萤火虫萤光素酶(北美萤火虫)突变体在大肠杆菌中的表达蛋白质表达:
使含有pT7ZbasicII-萤光素酶的大肠杆菌细胞在30℃下于含有补充有卡那霉素(50mg/l)的50ml胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)+酵母提取物(30g/l胰蛋白酶大豆肉汤,MerckKgaA,Darmstadt,Germany;5g/l酵母提取物)的摇瓶中生长过夜。第二天早晨,用10ml过夜培养物将培养(cultivation)接种于在5升摇瓶中的含有卡那霉素(50mg/l)的500ml新鲜TSB+YE中。使细胞在30℃下生长,直到OD600nm达到约1.0。然后通过添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至1mM终浓度来诱导蛋白质产生,并且继续培养三个半小时。
使用Zbasic标签的蛋白质纯化:
阳离子交换。将含有5ml S-Sepharose FF阳离子交换树脂(GE Health,USA)的预填充柱用5个柱体积(CV)的含有200mM NaCl的50mM Tris-HCl pH 7.5(缓冲液A)预平衡。采用液相色谱系统FPLC(GE Health,USA),以3ml/min的流速将样品加载至柱子上。用约5至10CV的缓冲液A以3ml/min的流速将未结合的物质从柱子上洗掉,直至280nm处的吸光度低于50mAU。采用线性NaCl梯度(0.2-1)M/20CV洗脱Zbasic-萤光素酶突变物。将洗脱的蛋白质收集在5ml级分中,并针对萤光素酶活性进行筛选。通过SDS-PAGE对显示出萤光素酶活性的级分进行分析,并合并相关的级分。
图12显示了本文所述的经修饰萤光素酶的示例性PCR诱变。
图13示出了本文所述的示例性经修饰萤光素酶的萤光素酶活性。图13A显示了具有3个突变(I423L、D436G和L530R)的野生型萤光素酶。图13B显示了具有五个突变(T214A、I232A、F295L、E354K和L550V)的Thermo野生型萤光素酶。图13C显示了具有8个突变(T214A、I232A、F295L、E354K、L550V、I423L、D436G和L530R)的突变萤光素酶。图13D显示了具有四个突变(T214A、I232A、F295L和I423L)的Thermo野生型萤光素酶。
图14显示了对具有不同突变的经修饰萤光素酶进行的说明性SDS-PAGE。TWT是指具有T214A、I232A、F295L、E354K和L550V突变的热野生型。WT3M是指具有I423L、D436G和L530R突变的经修饰的萤光素酶。T3M是指具有T214A、I232A、F295L、E354K、L550V、I423L、D436G和L530R突变的经修饰的萤光素酶。
图15示出了本文所述的各种经修饰的萤光素酶在四个不同温度下的测试。通过在1mM ATP反应中添加1ul萤光素酶来进行反应。随着温度的升高,Promega萤光素酶丧失活性,但本文所述的经修饰的萤光素酶在图15所示的各个温度下保持其活性。这表明这些酶在所测试的最高温度(65℃)下具有较高的总活性。
图16A-图16C显示了示例性的经修饰萤光素酶在各个温度下的dATP活性,该活性以相对于其ATP活性的百分比示出。Promega萤光素酶用作对照。
图17示出了Promega萤光素酶与本文所述示例性的经修饰萤光素酶之间萤光素酶活性的比较,该活性以相对于其在27℃下的原始活性的百分比示出。当温度从27℃上升至65℃时,Promega萤光素酶的活性降低至约20%,而示例性的经修饰萤光素酶的活性降低至约60%。
实施例7
将野生型己糖激酶(巴斯德毕赤酵母)在大肠杆菌、酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母中克隆并表达。图18示出了己糖激酶的示例性PCR诱变。图19示出了本文所述的示例性己糖激酶构建体。图20A-图20C示出了包含Z-basic标签的示例性萤光素酶和己糖激酶构建体设计。图21A-图21B示出了在27℃(A)和50℃(B)下,腺苷三磷酸双磷酸酶和己糖激酶对dATP的活性。图22A-图22B显示了在27℃(A)和50℃(B)下,腺苷三磷酸双磷酸酶和己糖激酶对dNTP的活性。
实施例8
下面示出了本文所述的萤光素酶和己糖激酶的蛋白质和核酸序列。
SEQ ID NO:1和2分别提供了示例性萤火虫萤光素酶(北美萤火虫)核酸和蛋白质序列。
SEQ ID NO:1
atggaagatgcgaaaaacattaaaaaaggcccggcgccgttttatccgctggaagatggcaccgcgggcgaacagctgcataaagcgatgaaacgctatgcgctggtgccgggcaccattgcgtttaccgatgcgcatattgaagtgaacattacctatgcggaatattttgaaatgagcgtgcgcctggcggaagcgatgaaacgctatggcctgaacaccaaccatcgcattgtggtgtgcagcgaaaacagcctgcagttttttatgccggtgctgggcgcgctgtttattggcgtggcggtggcgccggcgaacgatatttataacgaacgcgaactgctgaacagcatgaacattagccagccgaccgtggtgtttgtgagcaaaaaaggcctgcagaaaattctgaacgtgcagaaaaaactgccgattattcagaaaattattattatggatagcaaaaccgattatcagggctttcagagcatgtatacctttgtgaccagccatctgccgccgggctttaacgaatatgattttgtgccggaaagctttgatcgcgataaaaccattgcgctgattatgaacagcagcggcagcaccggcagcccgaaaggcgtggcgctgccgcatcgcaccgcgtgcgtgcgctttagccatgcgcgcgatccgatttttggcaaccagattattccggataccgcgattctgagcgtggtgccgtttcatcatggctttggcatgtttaccaccctgggctatctgatttgcggctttcgcgtggtgctgatgtatcgctttgaagaagaactgtttctgcgcagcctgcaggattataaaattcagagcgcgctgctggtgccgaccctgtttagcttttttgcgaaaagcaccctgattgataaatatgatctgagcaacctgcatgaaattgcgagcggcggcgcgccgctgagcaaagaagtgggcgaagcggtggcgaaacgctttcatctgccgggcattcgccagggctatggcctgaccgaaaccaccagcgcgattctgattaccccggaaggcgatgataaaccgggcgcggtgggcaaagtggtgccgttttttgaagcgaaagtggtggatctggataccggcaaaaccctgggcgtgaaccagcgcggcgaactgtgcgtgcgcggcccgatgattatgagcggctatgtgaacgatccggaagcgaccaacgcgctgattgataaagatggctggctgcatagcggcgatattgcgtattgggatgaagatgaacatttttttattgtggatcgcctgaaaagcctgattaaatataaaggctgccaggtggcgccggcggaactggaaagcattctgctgcagcatccgaacatttttgatgcgggcgtggcgggcctgccgggcgatgatgcgggcgaactgccggcggcggtggtggtgctggaacatggcaaaaccatgaccgaaaaagaaattgtggattatgtggcgagccaggtgaccaccgcgaaaaaactgcgcggcggcgtggtgtttgtggatgaagtgccgaaaggcctgaccggcaaactggatgcgcgcaaaattcgcgaaattctgattaaagcgaaaaaaggcggcaaaagcaaactg
SEQ ID NO:2
Met E D A K N I K K G P A P F Y P L E D G T A G E Q L H K A Met K R YA L V P G T I A F T D A H I E V N I T Y A E Y F E Met S V R L AE A Met K R YG L N T N H R I V V C S E N S L Q F F Met P V L G AL F I G V A V A P A N D IY N E R E L L N S Met N I S Q P T V V F V S K K G L Q K I LN V Q K K L P I IQ K I I I Met D S K T D Y Q G F Q S Met Y T F V T S H L P P G F N E Y D F V PE S F D R D K T I A L I Met N S S G S T G S P K G V A L P H R T A C V R F S HA R D P I F G N Q I I P D T A I L S V V P F H H G F G Met F T T L G Y L I C GF R V V L Met Y R F E E E L F L R S L Q D Y K I Q S A L L V P T L F S F F A KS T L I D K Y D L S N L H E I A S G G A P L S K E V G E A V A K R F H L P G IR Q G Y G L T E T T S A I L I T P E G D D K P G A V G K V V P F F E A K V V DL D T G K T L G V N Q R G E L C V R G P Met I Met S G Y V N D P E A T N A L ID K D G W L H S G D I A Y W D E D E H F F I V D R L K S L I K Y K G C Q V A PA E L E S I L L Q H P N I F D A G V A G L P G D D A G E L P A A V V V L E H GK T Met T E K E I V D Y V A S Q V T T A K K L R G G V V F V D E V P K G L T GK L D A R K I R E I L I K A K K G G K S K L
SEQ ID NO:3和4分别提供了示例性巴斯德毕赤酵母己糖激酶基因和蛋白质序列。
SEQ ID NO:3
atggttcacttaggggcgaagaagcctcagcatagaaaaggatatctatttaatcagcttagtccagagttacgaaaagcttataaagaagtagaggcacagttcgttgtatcaactcccaggttaaagcagatagtggatcaatttgttgctgaattgaaggaaggcttgaaatcaagcagctctaacatcccaatgctacctacctgggtgatggatttccccacaggagaggaaactggagactatctcgcaattgacctgggcgggaccaatataagggttatattggtcagactgttgggaaataggaagtttgataccattcaatcaaaatatgttttgcctaaatggatcagaacctccacatcaaatgaactttggctttttattgctcaatgtgtgaagactttcattgatgaagagtttgattatagagaaagtccggaagacccaatccccttagggttcacattttcttaccctgcattccaaagtaggattaattcgggtgtcttacaacgttggacgaaaggatttgatattccggacgttgaaggccatgacgttgtccctatgctgcaagacgcattggaatcattgggattgtccgttgtggtagtggctttaattaatgacactacaggcactttggtagcttctacgtatacggatccagagactaaaatgggactgatatttggaactggtgttaatggtgcatactatgatacgataagttcggtctcaaagatatcaaatgctcttccaccagatattcaagaggatgcaagtatggccatcaactgcgaatacggtgcttttgacaataacatctcagttctacctaggaccaaatacgatgatacaattgatttagaatcgcccagaccagggcaacagtcgtatgaaaaaatgatatcaggctattatcttggagaattgttacgattggtgcttgtagatttgcaccatcaaggacacattttcaagggacaaacaatcgggaaactaaatgaaccgttcattatggatacatcctttcctgcgagaattgaagaggatccgtttgagaatctatgtgagactggagaactttttaacagcctaggaattgaaactacggttcccgaaagagaactgattagacgaatttgcgaactcataggaacaagagcagccagactgtcagtatgtagcattgccgcaatttgcaaaaaacgaggctacaagaaagcccattgtgctgctgatggctctgtcttcacccgctatccttatttccctgacagagctgcaagagcgctccgagatatattccaatggggccattcaactccggacttagttactgtagttccagcagaagatggctcgggagttggggcagctattattgctgcactgaccaaacaacggatggcaaatggtgaatccgtgggccttgacgaatatcaccctcaagatggaaaggatagtaactaa
SEQ ID NO:4
Met V H L G A K K P Q H R K G Y L F N Q L S P E L R K A Y K E V E A QF V V S T P R L K Q I V D Q F V A E L K E G L K S S S S N I P Met L P T W VMet D F P T G E E T G D Y L A I D L G G T N I R V I L V R L L G N R K F D T IQ S K Y V L P K W I R T S T S N E L W L F I A Q C V K T F I D E E F D Y R E SP E D P I P L G F T F S Y P A F Q S R I N S G V L Q R W T K G F D I P D V E GH D V V P Met L Q D A L E S L G L S V V V V A L I N D T T G T L V A S T Y T DP E T K Met G L I F G T G V N G A Y Y D T I S S V S K I S N A L P P D I Q E DA S Met A I N C E Y G A F D N N I S V L P R T K Y D D T I D L E S P R P G Q QS Y E K Met I S G Y Y L G E L L R L V L V D L H H Q G H I F K G Q T I G K L NE P F I Met D T S F P A R I E E D P F E N L C E T G E L F N S L G I E T T V PE R E L I R R I C E L I G T R A A R L S V C S I A A I C K K R G Y K K A H C AA D G S V F T R Y P Y F P D R A A R A L R D I F Q W G H S T P D L V T V V P AE D G S G V G A A I I A A L T K Q R Met A N G E S V G L D E Y H P Q D G K D SN终止
SEQ ID NO:5和6分别提供了示例性酿酒酵母己糖激酶基因和蛋白质序列。
SEQ ID NO:5
atggttcatttaggtccaaaaaaaccacaagccagaaagggttccatggccgatgtgccaaaggaattgatgcaacaaattgagaattttgaaaaaattttcactgttccaactgaaactttacaagccgttaccaagcatttcatttccgaattggaaaagggtttgtccaagaagggtggtaacattccaatgattccaggttgggttatggatttcccaactggtaaggaatccggtgatttcttggccattgatttgggtggtaccaacttgagagttgtcttagtcaagttgggcggtgaccgtacctttgacaccactcaatctaagtacagattaccagatgctatgagaactactcaaaatccagacgaattgtgggaatttattgccgactctttgaaagcttttattgatgagcaattcccacaaggtatctctgagccaattccattgggtttcaccttttctttcccagcttctcaaaacaaaatcaatgaaggtatcttgcaaagatggactaaaggttttgatattccaaacattgaaaaccacgatgttgttccaatgttgcaaaagcaaatcaccaagaggaatatcccaattgaagttgttgctttgataaacgacactaccggtactttggttgcttcttactacactgacccagaaactaagatgggtgttatcttcggtactggtgtcaatggtgcttactacgatgtttgttccgatatcgaaaagctacaaggaaaactatctgatgacattccaccatctgctccaatggccatcaactgtgaatacggttccttcgataatgaacatgtcgttttgccaagaactaaatacgatatcaccattgatgaagaatctccaagaccaggccaacaaacctttgaaaaaatgtcttctggttactacttaggtgaaattttgcgtttggccttgatggacatgtacaaacaaggtttcatcttcaagaaccaagacttgtctaagttcgacaagcctttcgtcatggacacttcttacccagccagaatcgaggaagatccattcgagaacctagaagataccgatgacttgttccaaaatgagttcggtatcaacactactgttcaagaacgtaaattgatcagacgtttatctgaattgattggtgctagagctgctagattgtccgtttgtggtattgctgctatctgtcaaaagagaggttacaagaccggtcacatcgctgcagacggttccgtttacaacagatacccaggtttcaaagaaaaggctgccaatgctttgaaggacatttacggctggactcaaacctcactagacgactacccaatcaagattgttcctgctgaagatggttccggtgctggtgccgctgttattgctgctttggcccaaaaaagaattgctgaaggtaagtccgttggtatcatcggtgcttaa
SEQ ID NO:6
MVHLGPKKPQARKGSMADVPKELMQQIENFEKIFTVPTETLQAVTKHFISELEKGLSKKGGNIPMIPGWVMDFPTGKESGDFLAIDLGGTNLRVVLVKLGGDRTFDTTQSKYRLPDAMRTTQNPDELWEFIADSLKAFIDEQFPQGISEPIPLGFTFSFPASQNKINEGILQRWTKGFDIPNIENHDVVPMLQKQITKRNIPIEVVALINDTTGTLVASYYTDPETKMGVIFGTGVNGAYYDVCSDIEKLQGKLSDDIPPSAPMAINCEYGSFDNEHVVLPRTKYDITIDEESPRPGQQTFEKMSSGYYLGEILRLALMDMYKQGFIFKNQDLSKFDKPFVMDTSYPARIEEDPFENLEDTDDLFQNEFGINTTVQERKLIRRLSELIGARAARLSVCGIAAICQKRGYKTGHIAADGSVYNRYPGFKEKAANALKDIYGWTQTSLDDYPIKIVPAEDGSGAGAAVIAALAQKRIAEGKSVGIIGA*
本文描述的实施例和实施方案仅出于说明目的,并且对本领域技术人员提示的各种修改或改变将被包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围内。
序列表
<110> 菲尔莫兹姆公司
<120> 基因检测平台
<130> 46681-702.601
<150> US 62/044,872
<151> 2014-09-02
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1650
<212> DNA
<213> 北美萤火虫
<400> 1
atggaagatg cgaaaaacat taaaaaaggc ccggcgccgt tttatccgct ggaagatggc 60
accgcgggcg aacagctgca taaagcgatg aaacgctatg cgctggtgcc gggcaccatt 120
gcgtttaccg atgcgcatat tgaagtgaac attacctatg cggaatattt tgaaatgagc 180
gtgcgcctgg cggaagcgat gaaacgctat ggcctgaaca ccaaccatcg cattgtggtg 240
tgcagcgaaa acagcctgca gttttttatg ccggtgctgg gcgcgctgtt tattggcgtg 300
gcggtggcgc cggcgaacga tatttataac gaacgcgaac tgctgaacag catgaacatt 360
agccagccga ccgtggtgtt tgtgagcaaa aaaggcctgc agaaaattct gaacgtgcag 420
aaaaaactgc cgattattca gaaaattatt attatggata gcaaaaccga ttatcagggc 480
tttcagagca tgtatacctt tgtgaccagc catctgccgc cgggctttaa cgaatatgat 540
tttgtgccgg aaagctttga tcgcgataaa accattgcgc tgattatgaa cagcagcggc 600
agcaccggca gcccgaaagg cgtggcgctg ccgcatcgca ccgcgtgcgt gcgctttagc 660
catgcgcgcg atccgatttt tggcaaccag attattccgg ataccgcgat tctgagcgtg 720
gtgccgtttc atcatggctt tggcatgttt accaccctgg gctatctgat ttgcggcttt 780
cgcgtggtgc tgatgtatcg ctttgaagaa gaactgtttc tgcgcagcct gcaggattat 840
aaaattcaga gcgcgctgct ggtgccgacc ctgtttagct tttttgcgaa aagcaccctg 900
attgataaat atgatctgag caacctgcat gaaattgcga gcggcggcgc gccgctgagc 960
aaagaagtgg gcgaagcggt ggcgaaacgc tttcatctgc cgggcattcg ccagggctat 1020
ggcctgaccg aaaccaccag cgcgattctg attaccccgg aaggcgatga taaaccgggc 1080
gcggtgggca aagtggtgcc gttttttgaa gcgaaagtgg tggatctgga taccggcaaa 1140
accctgggcg tgaaccagcg cggcgaactg tgcgtgcgcg gcccgatgat tatgagcggc 1200
tatgtgaacg atccggaagc gaccaacgcg ctgattgata aagatggctg gctgcatagc 1260
ggcgatattg cgtattggga tgaagatgaa cattttttta ttgtggatcg cctgaaaagc 1320
ctgattaaat ataaaggctg ccaggtggcg ccggcggaac tggaaagcat tctgctgcag 1380
catccgaaca tttttgatgc gggcgtggcg ggcctgccgg gcgatgatgc gggcgaactg 1440
ccggcggcgg tggtggtgct ggaacatggc aaaaccatga ccgaaaaaga aattgtggat 1500
tatgtggcga gccaggtgac caccgcgaaa aaactgcgcg gcggcgtggt gtttgtggat 1560
gaagtgccga aaggcctgac cggcaaactg gatgcgcgca aaattcgcga aattctgatt 1620
aaagcgaaaa aaggcggcaa aagcaaactg 1650
<210> 2
<211> 550
<212> PRT
<213> 北美萤火虫
<400> 2
Met Glu Asp Ala Lys Asn Ile Lys Lys Gly Pro Ala Pro Phe Tyr Pro
1 5 10 15
Leu Glu Asp Gly Thr Ala Gly Glu Gln Leu His Lys Ala Met Lys Arg
20 25 30
Tyr Ala Leu Val Pro Gly Thr Ile Ala Phe Thr Asp Ala His Ile Glu
35 40 45
Val Asn Ile Thr Tyr Ala Glu Tyr Phe Glu Met Ser Val Arg Leu Ala
50 55 60
Glu Ala Met Lys Arg Tyr Gly Leu Asn Thr Asn His Arg Ile Val Val
65 70 75 80
Cys Ser Glu Asn Ser Leu Gln Phe Phe Met Pro Val Leu Gly Ala Leu
85 90 95
Phe Ile Gly Val Ala Val Ala Pro Ala Asn Asp Ile Tyr Asn Glu Arg
100 105 110
Glu Leu Leu Asn Ser Met Asn Ile Ser Gln Pro Thr Val Val Phe Val
115 120 125
Ser Lys Lys Gly Leu Gln Lys Ile Leu Asn Val Gln Lys Lys Leu Pro
130 135 140
Ile Ile Gln Lys Ile Ile Ile Met Asp Ser Lys Thr Asp Tyr Gln Gly
145 150 155 160
Phe Gln Ser Met Tyr Thr Phe Val Thr Ser His Leu Pro Pro Gly Phe
165 170 175
Asn Glu Tyr Asp Phe Val Pro Glu Ser Phe Asp Arg Asp Lys Thr Ile
180 185 190
Ala Leu Ile Met Asn Ser Ser Gly Ser Thr Gly Ser Pro Lys Gly Val
195 200 205
Ala Leu Pro His Arg Thr Ala Cys Val Arg Phe Ser His Ala Arg Asp
210 215 220
Pro Ile Phe Gly Asn Gln Ile Ile Pro Asp Thr Ala Ile Leu Ser Val
225 230 235 240
Val Pro Phe His His Gly Phe Gly Met Phe Thr Thr Leu Gly Tyr Leu
245 250 255
Ile Cys Gly Phe Arg Val Val Leu Met Tyr Arg Phe Glu Glu Glu Leu
260 265 270
Phe Leu Arg Ser Leu Gln Asp Tyr Lys Ile Gln Ser Ala Leu Leu Val
275 280 285
Pro Thr Leu Phe Ser Phe Phe Ala Lys Ser Thr Leu Ile Asp Lys Tyr
290 295 300
Asp Leu Ser Asn Leu His Glu Ile Ala Ser Gly Gly Ala Pro Leu Ser
305 310 315 320
Lys Glu Val Gly Glu Ala Val Ala Lys Arg Phe His Leu Pro Gly Ile
325 330 335
Arg Gln Gly Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Thr Ser Ala Ile Leu Ile Thr
340 345 350
Pro Glu Gly Asp Asp Lys Pro Gly Ala Val Gly Lys Val Val Pro Phe
355 360 365
Phe Glu Ala Lys Val Val Asp Leu Asp Thr Gly Lys Thr Leu Gly Val
370 375 380
Asn Gln Arg Gly Glu Leu Cys Val Arg Gly Pro Met Ile Met Ser Gly
385 390 395 400
Tyr Val Asn Asp Pro Glu Ala Thr Asn Ala Leu Ile Asp Lys Asp Gly
405 410 415
Trp Leu His Ser Gly Asp Ile Ala Tyr Trp Asp Glu Asp Glu His Phe
420 425 430
Phe Ile Val Asp Arg Leu Lys Ser Leu Ile Lys Tyr Lys Gly Cys Gln
435 440 445
Val Ala Pro Ala Glu Leu Glu Ser Ile Leu Leu Gln His Pro Asn Ile
450 455 460
Phe Asp Ala Gly Val Ala Gly Leu Pro Gly Asp Asp Ala Gly Glu Leu
465 470 475 480
Pro Ala Ala Val Val Val Leu Glu His Gly Lys Thr Met Thr Glu Lys
485 490 495
Glu Ile Val Asp Tyr Val Ala Ser Gln Val Thr Thr Ala Lys Lys Leu
500 505 510
Arg Gly Gly Val Val Phe Val Asp Glu Val Pro Lys Gly Leu Thr Gly
515 520 525
Lys Leu Asp Ala Arg Lys Ile Arg Glu Ile Leu Ile Lys Ala Lys Lys
530 535 540
Gly Gly Lys Ser Lys Leu
545 550
<210> 3
<211> 1485
<212> DNA
<213> 巴斯德毕赤酵母
<400> 3
atggttcact taggggcgaa gaagcctcag catagaaaag gatatctatt taatcagctt 60
agtccagagt tacgaaaagc ttataaagaa gtagaggcac agttcgttgt atcaactccc 120
aggttaaagc agatagtgga tcaatttgtt gctgaattga aggaaggctt gaaatcaagc 180
agctctaaca tcccaatgct acctacctgg gtgatggatt tccccacagg agaggaaact 240
ggagactatc tcgcaattga cctgggcggg accaatataa gggttatatt ggtcagactg 300
ttgggaaata ggaagtttga taccattcaa tcaaaatatg ttttgcctaa atggatcaga 360
acctccacat caaatgaact ttggcttttt attgctcaat gtgtgaagac tttcattgat 420
gaagagtttg attatagaga aagtccggaa gacccaatcc ccttagggtt cacattttct 480
taccctgcat tccaaagtag gattaattcg ggtgtcttac aacgttggac gaaaggattt 540
gatattccgg acgttgaagg ccatgacgtt gtccctatgc tgcaagacgc attggaatca 600
ttgggattgt ccgttgtggt agtggcttta attaatgaca ctacaggcac tttggtagct 660
tctacgtata cggatccaga gactaaaatg ggactgatat ttggaactgg tgttaatggt 720
gcatactatg atacgataag ttcggtctca aagatatcaa atgctcttcc accagatatt 780
caagaggatg caagtatggc catcaactgc gaatacggtg cttttgacaa taacatctca 840
gttctaccta ggaccaaata cgatgataca attgatttag aatcgcccag accagggcaa 900
cagtcgtatg aaaaaatgat atcaggctat tatcttggag aattgttacg attggtgctt 960
gtagatttgc accatcaagg acacattttc aagggacaaa caatcgggaa actaaatgaa 1020
ccgttcatta tggatacatc ctttcctgcg agaattgaag aggatccgtt tgagaatcta 1080
tgtgagactg gagaactttt taacagccta ggaattgaaa ctacggttcc cgaaagagaa 1140
ctgattagac gaatttgcga actcatagga acaagagcag ccagactgtc agtatgtagc 1200
attgccgcaa tttgcaaaaa acgaggctac aagaaagccc attgtgctgc tgatggctct 1260
gtcttcaccc gctatcctta tttccctgac agagctgcaa gagcgctccg agatatattc 1320
caatggggcc attcaactcc ggacttagtt actgtagttc cagcagaaga tggctcggga 1380
gttggggcag ctattattgc tgcactgacc aaacaacgga tggcaaatgg tgaatccgtg 1440
ggccttgacg aatatcaccc tcaagatgga aaggatagta actaa 1485
<210> 4
<211> 494
<212> PRT
<213> 巴斯德毕赤酵母
<400> 4
Met Val His Leu Gly Ala Lys Lys Pro Gln His Arg Lys Gly Tyr Leu
1 5 10 15
Phe Asn Gln Leu Ser Pro Glu Leu Arg Lys Ala Tyr Lys Glu Val Glu
20 25 30
Ala Gln Phe Val Val Ser Thr Pro Arg Leu Lys Gln Ile Val Asp Gln
35 40 45
Phe Val Ala Glu Leu Lys Glu Gly Leu Lys Ser Ser Ser Ser Asn Ile
50 55 60
Pro Met Leu Pro Thr Trp Val Met Asp Phe Pro Thr Gly Glu Glu Thr
65 70 75 80
Gly Asp Tyr Leu Ala Ile Asp Leu Gly Gly Thr Asn Ile Arg Val Ile
85 90 95
Leu Val Arg Leu Leu Gly Asn Arg Lys Phe Asp Thr Ile Gln Ser Lys
100 105 110
Tyr Val Leu Pro Lys Trp Ile Arg Thr Ser Thr Ser Asn Glu Leu Trp
115 120 125
Leu Phe Ile Ala Gln Cys Val Lys Thr Phe Ile Asp Glu Glu Phe Asp
130 135 140
Tyr Arg Glu Ser Pro Glu Asp Pro Ile Pro Leu Gly Phe Thr Phe Ser
145 150 155 160
Tyr Pro Ala Phe Gln Ser Arg Ile Asn Ser Gly Val Leu Gln Arg Trp
165 170 175
Thr Lys Gly Phe Asp Ile Pro Asp Val Glu Gly His Asp Val Val Pro
180 185 190
Met Leu Gln Asp Ala Leu Glu Ser Leu Gly Leu Ser Val Val Val Val
195 200 205
Ala Leu Ile Asn Asp Thr Thr Gly Thr Leu Val Ala Ser Thr Tyr Thr
210 215 220
Asp Pro Glu Thr Lys Met Gly Leu Ile Phe Gly Thr Gly Val Asn Gly
225 230 235 240
Ala Tyr Tyr Asp Thr Ile Ser Ser Val Ser Lys Ile Ser Asn Ala Leu
245 250 255
Pro Pro Asp Ile Gln Glu Asp Ala Ser Met Ala Ile Asn Cys Glu Tyr
260 265 270
Gly Ala Phe Asp Asn Asn Ile Ser Val Leu Pro Arg Thr Lys Tyr Asp
275 280 285
Asp Thr Ile Asp Leu Glu Ser Pro Arg Pro Gly Gln Gln Ser Tyr Glu
290 295 300
Lys Met Ile Ser Gly Tyr Tyr Leu Gly Glu Leu Leu Arg Leu Val Leu
305 310 315 320
Val Asp Leu His His Gln Gly His Ile Phe Lys Gly Gln Thr Ile Gly
325 330 335
Lys Leu Asn Glu Pro Phe Ile Met Asp Thr Ser Phe Pro Ala Arg Ile
340 345 350
Glu Glu Asp Pro Phe Glu Asn Leu Cys Glu Thr Gly Glu Leu Phe Asn
355 360 365
Ser Leu Gly Ile Glu Thr Thr Val Pro Glu Arg Glu Leu Ile Arg Arg
370 375 380
Ile Cys Glu Leu Ile Gly Thr Arg Ala Ala Arg Leu Ser Val Cys Ser
385 390 395 400
Ile Ala Ala Ile Cys Lys Lys Arg Gly Tyr Lys Lys Ala His Cys Ala
405 410 415
Ala Asp Gly Ser Val Phe Thr Arg Tyr Pro Tyr Phe Pro Asp Arg Ala
420 425 430
Ala Arg Ala Leu Arg Asp Ile Phe Gln Trp Gly His Ser Thr Pro Asp
435 440 445
Leu Val Thr Val Val Pro Ala Glu Asp Gly Ser Gly Val Gly Ala Ala
450 455 460
Ile Ile Ala Ala Leu Thr Lys Gln Arg Met Ala Asn Gly Glu Ser Val
465 470 475 480
Gly Leu Asp Glu Tyr His Pro Gln Asp Gly Lys Asp Ser Asn
485 490
<210> 5
<211> 1461
<212> DNA
<213> 酿酒酵母
<400> 5
atggttcatt taggtccaaa aaaaccacaa gccagaaagg gttccatggc cgatgtgcca 60
aaggaattga tgcaacaaat tgagaatttt gaaaaaattt tcactgttcc aactgaaact 120
ttacaagccg ttaccaagca tttcatttcc gaattggaaa agggtttgtc caagaagggt 180
ggtaacattc caatgattcc aggttgggtt atggatttcc caactggtaa ggaatccggt 240
gatttcttgg ccattgattt gggtggtacc aacttgagag ttgtcttagt caagttgggc 300
ggtgaccgta cctttgacac cactcaatct aagtacagat taccagatgc tatgagaact 360
actcaaaatc cagacgaatt gtgggaattt attgccgact ctttgaaagc ttttattgat 420
gagcaattcc cacaaggtat ctctgagcca attccattgg gtttcacctt ttctttccca 480
gcttctcaaa acaaaatcaa tgaaggtatc ttgcaaagat ggactaaagg ttttgatatt 540
ccaaacattg aaaaccacga tgttgttcca atgttgcaaa agcaaatcac caagaggaat 600
atcccaattg aagttgttgc tttgataaac gacactaccg gtactttggt tgcttcttac 660
tacactgacc cagaaactaa gatgggtgtt atcttcggta ctggtgtcaa tggtgcttac 720
tacgatgttt gttccgatat cgaaaagcta caaggaaaac tatctgatga cattccacca 780
tctgctccaa tggccatcaa ctgtgaatac ggttccttcg ataatgaaca tgtcgttttg 840
ccaagaacta aatacgatat caccattgat gaagaatctc caagaccagg ccaacaaacc 900
tttgaaaaaa tgtcttctgg ttactactta ggtgaaattt tgcgtttggc cttgatggac 960
atgtacaaac aaggtttcat cttcaagaac caagacttgt ctaagttcga caagcctttc 1020
gtcatggaca cttcttaccc agccagaatc gaggaagatc cattcgagaa cctagaagat 1080
accgatgact tgttccaaaa tgagttcggt atcaacacta ctgttcaaga acgtaaattg 1140
atcagacgtt tatctgaatt gattggtgct agagctgcta gattgtccgt ttgtggtatt 1200
gctgctatct gtcaaaagag aggttacaag accggtcaca tcgctgcaga cggttccgtt 1260
tacaacagat acccaggttt caaagaaaag gctgccaatg ctttgaagga catttacggc 1320
tggactcaaa cctcactaga cgactaccca atcaagattg ttcctgctga agatggttcc 1380
ggtgctggtg ccgctgttat tgctgctttg gcccaaaaaa gaattgctga aggtaagtcc 1440
gttggtatca tcggtgctta a 1461
<210> 6
<211> 486
<212> PRT
<213> 酿酒酵母
<400> 6
Met Val His Leu Gly Pro Lys Lys Pro Gln Ala Arg Lys Gly Ser Met
1 5 10 15
Ala Asp Val Pro Lys Glu Leu Met Gln Gln Ile Glu Asn Phe Glu Lys
20 25 30
Ile Phe Thr Val Pro Thr Glu Thr Leu Gln Ala Val Thr Lys His Phe
35 40 45
Ile Ser Glu Leu Glu Lys Gly Leu Ser Lys Lys Gly Gly Asn Ile Pro
50 55 60
Met Ile Pro Gly Trp Val Met Asp Phe Pro Thr Gly Lys Glu Ser Gly
65 70 75 80
Asp Phe Leu Ala Ile Asp Leu Gly Gly Thr Asn Leu Arg Val Val Leu
85 90 95
Val Lys Leu Gly Gly Asp Arg Thr Phe Asp Thr Thr Gln Ser Lys Tyr
100 105 110
Arg Leu Pro Asp Ala Met Arg Thr Thr Gln Asn Pro Asp Glu Leu Trp
115 120 125
Glu Phe Ile Ala Asp Ser Leu Lys Ala Phe Ile Asp Glu Gln Phe Pro
130 135 140
Gln Gly Ile Ser Glu Pro Ile Pro Leu Gly Phe Thr Phe Ser Phe Pro
145 150 155 160
Ala Ser Gln Asn Lys Ile Asn Glu Gly Ile Leu Gln Arg Trp Thr Lys
165 170 175
Gly Phe Asp Ile Pro Asn Ile Glu Asn His Asp Val Val Pro Met Leu
180 185 190
Gln Lys Gln Ile Thr Lys Arg Asn Ile Pro Ile Glu Val Val Ala Leu
195 200 205
Ile Asn Asp Thr Thr Gly Thr Leu Val Ala Ser Tyr Tyr Thr Asp Pro
210 215 220
Glu Thr Lys Met Gly Val Ile Phe Gly Thr Gly Val Asn Gly Ala Tyr
225 230 235 240
Tyr Asp Val Cys Ser Asp Ile Glu Lys Leu Gln Gly Lys Leu Ser Asp
245 250 255
Asp Ile Pro Pro Ser Ala Pro Met Ala Ile Asn Cys Glu Tyr Gly Ser
260 265 270
Phe Asp Asn Glu His Val Val Leu Pro Arg Thr Lys Tyr Asp Ile Thr
275 280 285
Ile Asp Glu Glu Ser Pro Arg Pro Gly Gln Gln Thr Phe Glu Lys Met
290 295 300
Ser Ser Gly Tyr Tyr Leu Gly Glu Ile Leu Arg Leu Ala Leu Met Asp
305 310 315 320
Met Tyr Lys Gln Gly Phe Ile Phe Lys Asn Gln Asp Leu Ser Lys Phe
325 330 335
Asp Lys Pro Phe Val Met Asp Thr Ser Tyr Pro Ala Arg Ile Glu Glu
340 345 350
Asp Pro Phe Glu Asn Leu Glu Asp Thr Asp Asp Leu Phe Gln Asn Glu
355 360 365
Phe Gly Ile Asn Thr Thr Val Gln Glu Arg Lys Leu Ile Arg Arg Leu
370 375 380
Ser Glu Leu Ile Gly Ala Arg Ala Ala Arg Leu Ser Val Cys Gly Ile
385 390 395 400
Ala Ala Ile Cys Gln Lys Arg Gly Tyr Lys Thr Gly His Ile Ala Ala
405 410 415
Asp Gly Ser Val Tyr Asn Arg Tyr Pro Gly Phe Lys Glu Lys Ala Ala
420 425 430
Asn Ala Leu Lys Asp Ile Tyr Gly Trp Thr Gln Thr Ser Leu Asp Asp
435 440 445
Tyr Pro Ile Lys Ile Val Pro Ala Glu Asp Gly Ser Gly Ala Gly Ala
450 455 460
Ala Val Ile Ala Ala Leu Ala Gln Lys Arg Ile Ala Glu Gly Lys Ser
465 470 475 480
Val Gly Ile Ile Gly Ala
485
<210> 7
<211> 57
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 7
Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Pro Lys
50 55
<210> 8
<211> 57
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 8
Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Glu Glu Glu Ala Glu Glu Glu Ile
1 5 10 15
Glu Glu Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Glu Glu Ala Phe Ile Glu
20 25 30
Ser Leu Glu Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Pro Lys
50 55
<210> 9
<211> 57
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 9
Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Arg Arg Arg Ala Arg Arg Glu Ile
1 5 10 15
Arg His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Arg Ala Phe Ile Arg
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Pro Lys
50 55
<210> 10
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 10
Met Ala Ser Ser Leu Arg Gln Ile Leu Asp Ser Gln Lys Ile Glu Trp
1 5 10 15
Arg Ser Asn Ala Gly Gly Ala Ser
20
<210> 11
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 11
atggctagta gcctgcgcca gatcctggac agccagaaaa tcgaatggcg cagcaacgct 60
ggtggtgcta gt 72
<210> 12
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 12
Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
1 5 10 15
Claims (72)
1.一种用于测量在多核苷酸复制过程中释放的焦磷酸的方法,其包括:
a.在反应混合物中进行多核苷酸复制,其中该复制导致至少一个焦磷酸的释放;
b.将所述焦磷酸转化成ATP;
c.向所述反应混合物中添加至少一种糖;以及
d.使用对dATP的识别受损的热稳定萤光素酶检测所述ATP。
2.如权利要求1所述的方法,其中所述添加至少一种糖在所述多核苷酸复制之后。
3.如权利要求2所述的方法,其中所述糖被磷酸化。
4.如权利要求3所述的方法,其中所述糖的磷酸化消除过量的核苷酸。
5.如权利要求4所述的方法,其中所述糖的磷酸化包括使用糖磷酸化酶。
6.如权利要求1所述的方法,其中所述热稳定萤光素酶为热稳定的萤火虫萤光素酶。
7.如权利要求1或6所述的方法,其中所述热稳定萤光素酶在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基T214、I232、F295、E354、I423、D436、L530和L550相对应的一个或多个位置处包含修饰。
8.如权利要求7所述的方法,其中所述修饰包括T214A、I232A、F295L、E354K、I423L、D436G、L530R和L550V。
9.如权利要求8所述的方法,其中所述修饰包括T214A、I232A、F295L、I423L和L550V。
10.如权利要求1所述的方法,其中所述热稳定萤光素酶的识别受损是对dATP的亲和力的降低。
11.如权利要求1或6-10中任一项所述的方法,其中所述热稳定萤光素酶不识别dATP但识别ATP。
12.如权利要求1或6-11中任一项所述的方法,其中所述热稳定萤光素酶进一步包含选自白蛋白结合蛋白或Z结构域的结合蛋白。
13.如权利要求1所述的方法,其中所述转化在ATP硫酸化酶的存在下进行。
14.如权利要求13所述的方法,其中所述ATP硫酸化酶是热稳定的。
15.如权利要求1所述的方法,其中所述多核苷酸复制进一步包括以下步骤
a.使与至少一种靶多核苷酸的至少一部分互补的互补多核苷酸与所述至少一种靶多核苷酸杂交;
b.使一种核苷多磷酸与所述至少一种靶多核苷酸杂交,其中该核苷选自腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶;以及
c.将所述一种核苷多磷酸与所述互补多核苷酸连接以延伸所述互补多核苷酸。
16.如权利要求1所述的方法,其中所述多核苷酸复制在高于50摄氏度的温度下进行。
17.如权利要求1所述的方法,其中所述多核苷酸复制在至少50摄氏度、至少55摄氏度、至少60摄氏度、至少65摄氏度或至少70摄氏度的温度下进行。
18.如权利要求1或15所述的方法,其中所述多核苷酸复制在聚合酶的存在下进行。
19.如权利要求18所述的方法,其中所述聚合酶为Taq聚合酶。
20.如权利要求19所述的方法,其中所述Taq聚合酶为天然Taq聚合酶、重组Taq聚合酶或经修饰的Taq聚合酶。
21.如权利要求1所述的方法,其中该方法不包括单链结合蛋白(SSB)的使用。
22.如权利要求5所述的方法,其中所述糖磷酸化酶为己糖激酶。
23.如权利要求22所述的方法,其中所述己糖激酶为进一步包含选自白蛋白结合蛋白或Z结构域的结合蛋白的经修饰的己糖激酶。
24.如权利要求22或23所述的方法,其中所述己糖激酶在酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母或大肠杆菌中表达。
25.如权利要求22-24中任一项所述的方法,其中所述己糖激酶为热稳定的己糖激酶。
26.如权利要求12或23所述的方法,其中所述白蛋白结合蛋白包含ABP(121aa)、BB(214aa)、ABD(46aa)、ADB1结合位点、ADB2结合位点或ADB3结合位点。
27.如权利要求26所述的方法,其中所述ABD对白蛋白的亲和力为1.5纳摩尔或更低。
28.如权利要求27所述的方法,其中所述白蛋白为血清白蛋白。
29.如权利要求27所述的方法,其中所述白蛋白为人血清白蛋白。
30.如权利要求1、6-12或22-25中任一项所述的方法,其中所述己糖激酶、萤光素酶或ATP硫酸化酶被化学修饰。
31.如权利要求30所述的方法,其中所述化学修饰的己糖激酶、萤光素酶或ATP硫酸化酶包括对所述己糖激酶、萤光素酶或硫酸化酶的碱性侧链的化学中和或化学酸化。
32.如权利要求30所述的方法,其中所述化学修饰的己糖激酶、萤光素酶或ATP硫酸化酶包含乙酰化或柠康酰化。
33.一种热稳定萤光素酶,其促进生物发光反应并且对作为底物的dATP的识别受损。
34.如权利要求33所述的热稳定萤光素酶,其中该热稳定萤光素酶在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基T214、I232、F295、E354、I423、D436、L530和L550相对应的一个或多个位置处包含修饰。
35.如权利要求34所述的热稳定萤光素酶,其中所述修饰包括T214A、I232A、F295L、E354K、I423L、D436G、L530R和L550V。
36.如权利要求35所述的热稳定萤光素酶,其中所述修饰包括T214A、I232A、F295L、I423L和L550V。
37.如权利要求33所述的热稳定萤光素酶,其中该热稳定萤光素酶被进一步化学修饰。
38.如权利要求37所述的热稳定萤光素酶,其中所述化学修饰的萤光素酶包括对萤光素酶的碱性侧链的化学中和或化学酸化。
39.如权利要求37所述的热稳定萤光素酶,其中所述化学修饰的萤光素酶包含乙酰化或柠康酰化。
40.如权利要求33-39中任一项所述的热稳定萤光素酶,其中该热稳定萤光素酶在权利要求1-32的方法中使用。
41.一种生物发光酶构建体,其包含生物发光酶和选自白蛋白结合蛋白或Z结构域的结合部分。
42.如权利要求41所述的酶构建体,其中所述生物发光酶为萤光素酶。
43.如权利要求42所述的酶构建体,其中所述萤光素酶在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基T214、I232、F295、E354、I423、D436、L530和L550相对应的一个或多个位置处包含修饰。
44.如权利要求43所述的酶构建体,其中所述修饰包括T214A、I232A、F295L、E354K、I423L、D436G、L530R和L550V。
45.如权利要求44所述的酶构建体,其中所述修饰包括T214A、I232A、F295L、I423L和L550V。
46.如权利要求41所述的酶构建体,其中所述白蛋白结合蛋白包含BB、ABD、ABP、ABD1、ABD2或ABD3。
47.如权利要求41所述的酶构建体,其进一步包含His(6)部分。
48.如权利要求47所述的酶构建体,其中所述结合部分序列连接在所述生物发光酶序列的5’并进一步连接至His(6)序列的3’,或者连接在HIS(6)序列的5’并进一步连接至所述生物发光酶序列的3’。
49.如权利要求47所述的酶构建体,其中所述HIS(6)序列连接在所述生物发光酶序列的5’并进一步连接至所述结合部分序列的3’,或者连接在所述结合部分序列的5’并进一步连接至所述生物发光酶序列的3’。
50.如权利要求47所述的酶构建体,其中所述生物发光酶序列连接在所述结合部分序列的5’并进一步连接至His(6)序列的3’,或者连接在HIS(6)序列的5’并进一步连接至所述结合部分序列的3’。
51.一种包含选自白蛋白结合蛋白或Z结构域的结合部分的糖磷酸化酶构建体,其中所述糖磷酸化酶将至少一种糖磷酸化以产生至少一种磷酸化的糖。
52.如权利要求51所述的酶构建体,其中所述糖磷酸化酶为己糖激酶。
53.如权利要求51所述的酶构建体,其中所述白蛋白结合蛋白包含ABP(121aa)、BB(214aa)、ABD(46aa)、ADB1结合位点、ADB2结合位点或ADB3结合位点。
54.如权利要求53所述的酶构建体,其中所述ABD对白蛋白的亲和力为1.5纳摩尔或更低。
55.如权利要求54所述的酶构建体,其中所述白蛋白为人血清白蛋白或牛血清白蛋白。
56.如权利要求52所述的酶构建体,其中该酶构建体进一步包含HIS(6)部分。
57.如权利要求56所述的酶构建体,其中该酶构建体包括图5、19或20C中所示的构建体。
58.如权利要求52所述的酶构建体,其中该酶构建体在酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母或大肠杆菌中表达。
59.一种包含选自白蛋白结合蛋白或Z结构域的结合部分的糖磷酸化酶,其中该酶对选自dTTP、dCTP、dGTP、dUTP和dATP的至少两种核苷酸具有相似的结合亲和力。
60.如权利要求59所述的酶,其中该酶将至少一种糖磷酸化以产生至少一种磷酸化的糖。
61.如权利要求60所述的酶,其中相似的结合亲和力在至少1微摩尔到至多250微摩尔的范围内。
62.如权利要求59所述的酶,其中该酶以相似的效率使所述核苷酸与至少一种糖反应。
63.如权利要求59所述的酶,其中该酶以相似的速率使所述核苷酸与至少一种糖反应。
64.如权利要求62或63所述的酶,其中所述糖为己糖。
65.如权利要求64所述的酶,其中所述己糖选自葡萄糖、阿洛糖、阿卓糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖和塔罗糖。
66.如权利要求59-65中任一项所述的酶,其中该酶为己糖激酶。
67.如权利要求66所述的酶,其中己糖激酶构成权利要求51-58的构建体。
68.如权利要求66或67所述的酶,其中己糖激酶被进一步化学修饰。
69.如权利要求68所述的酶,其中所述化学修饰的己糖激酶包括对萤光素酶的碱性侧链的化学中和或化学酸化。
70.如权利要求68所述的酶,其中所述化学修饰的己糖激酶包含乙酰化或柠康酰化。
71.如权利要求68-70中任一项所述的酶,其中所述化学修饰的己糖激酶为热稳定的己糖激酶。
72.如权利要求59-71中任一项所述的酶,其中所述糖磷酸化酶在权利要求1-32的方法中使用。
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