KR20210020864A - 단일 분자 서열분석 방법 - Google Patents

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KR20210020864A
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이난츠 오탁
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사르말, 인크.
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Abstract

본원에는 발광 반응을 위한 성분을 포함하여, 폴리머라제 효소, 주형 핵산, 및 폴리머라제 시약 용액을 활용하여 단일 핵산 분자를 서열분석하기 위한 방법 및 시스템이 제공된다.

Description

단일 분자 서열분석 방법
본 발명은 단일 분자 핵산 서열분석을 위한 방법에 관한 것이다.
현재 서열분석 기술은 짧은-판독(short-read) 서열분석 및 긴-판독(long-read) 서열분석의 두가지 주요 범주로 그룹화될 수 있다. 각각의 범주에서, DNA는 최대 특정 수의 뉴클레오티드 또는 염기쌍(bp)의 길이를 갖는 조각으로 절단된다. 모든 경우에, DNA의 모든 조각은 2 차원 어레이로 확산되고 적어도 하나의 센서가 DNA 조각과 일치하는 곳에 상응하는 센서 어레이에 의해 검출된다.
짧은-판독 서열분석 접근법은 결찰을 통한 서열분석(SBL) 및 합성을 통한 서열분석(SBS)을 포함하는 단순 주기 기반 기술이다. SBL 접근법은 SOLID(Thermo Fisher) 및 Complete Genomics(BGI)를 포함한다. SOLID를 사용하면 약 75 개 염기쌍(bp)의 판독 길이에 도달하는 반면 Complete Genomics 접근법을 사용하면 28 내지 100 개 염기쌍 판독이 실현가능하다. 이들 접근법을 사용하면 구조적 변이 및 게놈 어셈블리가 가능하지 않으며 동종중합체 오류에 취약하다. 상기 접근법의 실행 시간은 대략 수 일이다. Illumina 및 Qiagen의 GeneReader 기술은 순환 가역 종결과 함께 SBS 접근법을 사용한다. 이 접근법은 최대 300 bp에 도달할 수 있다. 그러나, 주요 단점은 AT 및 GC 풍부 영역, 치환 오류 및 반감기 양성률의 과소 표시이다. 반면에, 454 파이로시퀀싱(pyrosequencing) 및 Ion Torrent(Thermo Fisher)와 같은 다른 SBS 접근법은 단일-뉴클레오티드 첨가/종결을 사용한다. 454 파이로시퀀싱은 400 bp에 도달할 수 있는 반면 Ion Torrent는 700 bp 판독 길이를 달성할 수 있다. 그러나, 이들 기술은 현장 진단에 더 빠르고 우수하지만, 또한 삽입/결실 오류의 우세, 및 동종중합체 영역 오류를 포함한 많은 단점이 있다. 이들은 긴 범위의 게놈 또는 전사체 구조를 밝히는데 사용될 수 없으며, 쌍형성된 말단 서열분석을 수행할 수 없다.
긴-판독 서열분석 접근법은 합성 긴-판독 서열분석 또는 실시간 긴-판독 서열분석의 두가지 주요 유형을 포함한다. Illumina 및 10X Genomics에 의해 사용되는 긴-판독 서열분석으로 맞춰진 합성은 바코드에 영향을 주고 큰 단편의 컴퓨터를 사용한 어셈블리를 허용하는 라이브러리 제조에 초점을 맞춘다. 사실, 이들 기술은 실제로 긴-판독을 수행하지 않고, 오히려 짧은-판독을 수행하며, 여기서 DNA 조각은 바코딩 접근법을 사용하여 조직화되어, 분석 동안 일부 복잡성을 제거하는데 도움을 주고, 실제 긴-판독 방법과 유사한 데이터를 수득하게 한다. 그러나, 이 접근법은 부분적으로 훨씬 더 많은 적용범위를 요구하기 때문에 매우 많은 비용이 든다. 다른 유형의 긴-판독 서열분석은 Pacific Biosciences 및 Oxford Nanopore Technologies에 의해 사용된 실시간 긴-판독 서열분석이다. 합성 긴-판독 서열분석과는 달리, 실시간 긴-판독 서열분석은 증폭된 DNA의 클론 집단에 의존하지 않고 화학적 순환을 필요로 하지 않는다. Nanopore의 기술은 약 30%의 매우 높은 오류율을 가지며, 또한 비용에 상당히 기여하는 매우 높은 적용범위를 필요로 한다. 변형된 염기를 사용하는 것은 또한 분석을 훨씬 더 복잡하게 만드는 고유한 신호를 생성하는 Nanopore의 기술에는 특히 어려웠다. Pacific Biosciences는 최대 4000-5000 bp의 판독 길이에 도달할 수 있다. 그러나, 긴 판독의 경우 약 15%의 높은 단일-패스 오류율로 인해, 높은 적용범위를 필요로 하여, 1 Gb 서열분석에 $1000 초과의 비용이 든다(예를 들어, Goodwin et al., Nat. Rev. Genet. 17:333-351; 2016 참조). 또한, 이들 방법에 의해 활용되는 열적 배경 존재 및 여기 에너지는 중요한 반응에 사용되는 DNA 폴리머라제를 손상시켜, 궁극적으로 이 기술의 판독 길이 및 적용가능성을 제한한다. 또한, 생성된 발광은 폴리머라제에 의해 부착된 뉴클레오티와는 무관한 일반적 스펙트럼이므로, 파이로시퀀싱은 각 뉴클레오티드가 모든 결합 이벤트로부터 신호를 수집하여 하나씩 투여되는 주기-기반 접근법을 필요로 한다. 이는 다음 뉴클레오티드를 투여하기 위해 결합되지 않은 뉴클레오티드를 제거하는 세척 주기로 이어진다.
대다수의 현재 기술은 단위 당 뉴클레오티드의 짧은 판독 길이(약 40-100 개 염기 길이)를 제공하므로, 가장 어려운 문제 중 하나는 작은 서열 조각을 하나의 큰 의미있는 서열로 정렬하고, 높은 적용범위 데이터를 분석하고 생성된 데이터 로드를 강력한 슈퍼 컴퓨터를 사용하여 복잡한 알고리즘으로 후처리하는 것이다. 차세대 단일 분자 기반 서열분석 기술은 잠재적으로 이 문제를 해결할 수 있다. 그러나, 이들 선행 기술 각각은 신뢰할 수 있는 데이터를 수득하기 위해 종종 약 30X 내지 100X의 높은 적용범위(서열의 동일한 영역의 다중 판독)를 필요로 하는 높은 오류율을 갖는다.
따라서, 단일 분자 핵산 서열분석을 위한 개선된 방법이 필요하다.
본원에는 하기 단계를 포함하는, 핵산 주형을 서열분석하는 방법이 제공된다:
(i) 폴리머라제 효소, (ii) ATP 재생 효소, (iii) 발광 효소(예를 들어, 반딧불이 루시퍼라제), (iv) 주형 핵산, 및 (iii) 성장 핵산 가닥의 주형 유도 합성을 수행하기 위한 성분을 갖는 폴리머라제-ATP 재생 효소-발광 시약 용액을 포함하는 서열분석 혼합물을 제공하며, 여기서 상기 시약 용액은 ATP-재생-효소-기질(예를 들어, APS, ADP-글루코스, AMP + PEP 등), 발광-기질(예를 들어, 루시페린); 및 복수의 유형의 뉴클레오티드 유사체를 포함하며; 여기서 각 유형의 뉴클레오티드 유사체는 폴리머라제에 의해 절단가능한 표지된 이탈기를 갖고, 각 유형의 뉴클레오티드 유사체는 상이한 표지를 가지며, 여기서 표지된 이탈기는 각각의 뉴클레오티드 유사체가 주형 가닥에 폴리머라제-의존적 결합하면 절단되는 것인, 단계;
복수의 뉴클레오티드 유사체가 a) 뉴클레오티드 유사체가 폴리머라제와 회합하고, b) 뉴클레오티드 유사체 상의 표지된 이탈기가 폴리머라제에 의해 절단될 때 해당 뉴클레오티드 유사체가 폴리머라제에 의해 주형 가닥에 혼입되며, 여기서 표지된 이탈기는 ATP 재생 효소에 의해 ATP-재생-효소-기질과 (예를 들어, ATP 술푸릴라제에 의해 APS와; AGPPase에 의해 ADP-글루코스와; PPDK에 의해 AMP+PEP와 등) 조합되어 표지된-ATP를 생성한 다음, c) 표지된-ATP가 발광-효소(반딧불이 루시퍼라제)에 결합하는 주형에 순차적으로 첨가되도록 핵산 합성을 수행하며, 여기서 발광-기질(루시페린)은 발광-효소(루시퍼라제)에 의해 촉매되어 제한된(일시적/신중한) 시간 동안 발광을 생성하고 각각의 표지된 이탈기를 재생하며, 여기서 상기 발광은 각각의 표지된 이탈기 상에서 표지를 유발하여(여기하여) 광을 생성하는 것인, 단계; 및
핵산 합성이 발생하는 동안 표지로부터 광을 검출하고, 각 신중한 발광 기간(이벤트) 동안 검출된 광을 사용하여, 주형 핵산의 서열을 결정하는 단계.
본 발명의 서열분석 방법(또한 본원에서 FLASH 서열분석 방법으로도 언급됨)의 주요 이점은 기존 방법으로 발생하는 것과 같이, 폴리머라제 효소가 특정 표면에 부착되거나, 또는 신호를 생성하는 데 사용되는 외부 광 여기에 다중 노출되는 것과 같이, 본 발명의 반응 조건에서 손상되지 않는다는 것이다. 본 발명의 방법에서, 폴리머라제는 변형되거나, 부착되거나, 외부 광원에 노출되거나, 또는 그렇지 않으면 이의 고유한 쇄 신장 기능을 수행하지 못하도록 압력을 받지 않는다. 이는 유리하게 기존 방법보다 훨씬 적은 적용범위로 고유한 환경에서 발생하는 것만큼 정확도 높은 충실도로 매우 긴 판독 길이에 도달할 수 있는 더 긴 기능화 폴리머라제를 야기한다.
예를 들어, 본 발명의 특정 구현예에서, 단일 폴리머라제 또는 복수의 폴리머라제는 단일 액적에서 서열분석 반응 혼합물로 한정되며, 여기서 폴리머라제(들)는 검출될 dNTP 혼입 신호를 생성하기 위해 외부 광 여기에 적용되지 않는다.
특정 구현예에서, 서열분석 혼합물은 표지된 피로포스페이트를 2 개의 포스페이트 이온으로 전환할 수 있는 피로포스파타제 효소를 추가로 포함한다. 효소 농도의 비율은 ATP 술푸릴라제/루시퍼라제 루프 활성이 피로포스파타제 활성보다 몇자리 수 더 높도록(orders of magnitude higher than) 조정된다. 일 구현예에서, ATP-술푸릴라제/루시퍼라제 루프의 상대 반응 속도는 피로포스파타제 반응보다 103-1012 배 더 빠르다. 또 다른 구현예에서, 루시퍼라제 및 피로포스파타제는 나노매트릭스에 공동-캡슐화된다. 일 구현예에서, 나노매트릭스는 음으로 하전된 나노입자이다. 이 구현예에서, 표지된 ATP(ATP-FL)는 루시퍼라제 및 피로포스파타제가 공동-캡슐화되어 있는 음으로 하전된 매트릭스로 확산될 수 있다. 특정 구현예에서, 표지된-ATP가 발광-효소에 결합하는 단계 c)는 나노매트릭스 내에서 발생하며, 여기서 발광-기질은 발광-효소에 의해 촉매된다.
본 발명의 방법은 전체 게놈 서열분석, SNP-변이체 검출 등을 포함한 다양한 용도에 유용하다. 기존 방법에 비해 본 발명의 방법의 하나의 이점은 형광단 표지를 여기하는 제어된 고유하게 정의된 신중한 및/또는 일시적 제한된 발광 기간을 생성하기 위해 예를 들어 반딧불이 루시퍼라제 및 루시페린을 사용하여 발광 반응에서 형광단으로 표지된 ATP(예를 들어, 표지된-ATP)를 활용하는 것이다. 놀랍게도 이러한 표지된-ATP는 반딧불이 루시퍼라제 및 루시페린을 사용하여 발광 반응에서 기능할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 기존 방법에 비해 본 발명의 방법의 또 다른 이점은 DNA 폴리머라제에 대한 손상이 발생하지 않도록 형광단 표지를 여기하기 위해 발광 반응에 의해 활용되는 광 강도를 감소시키는 것이다. 예를 들어, 발광 광 강도는 기존 서열분석 방법과 비교하여 적어도 5-배, 10-배, 25-배, 50-배, 75-배, 100-배 최대 적어도 1,000-배까지 감소될 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에서 활용된 표지(예를 들어, 형광단)를 여기하는 데 횔용되는 광 강도의 감소는 적어도 5-배, 10-배, 25-배, 50-배, 75-배, 100-배, 200-배, 300-배, 400-배, 500-배, 600-배, 700-배, 800-배, 900-배, 1000-배, 2000-배 등일 수 있다. 이러한 이점은 DNA 폴리머라제의 더 긴 기능화를 야기하여, 더 긴 판독 길이를 생성한다.
개시된 발명은 dNTP를 순차적으로 혼입할 때 개별적인 폴리머라제 효소를 모니터링하는 것에 기초한 단일 분자 서열분석 기술이다. 특정 구현예에서, 본 발명은 폴리머라제가 주형에 상보적인 dNTP를 혼입할 때마다, 형광 신호가 혼입 프로세스 동안 일시적으로, 고유하게 및/또는 신중하게 생성되는 프로세스를 포함하며, 여기서 이러한 형광은 일시적, 고유한 및/또는 신중한 발광 반응으로부터의 여기에 의해 유발된다. 다시 말해서, 발광 반응은 여기 스펙트럼 등을 통해, 표지된 이탈기(예를 들어, 표지된 피로포스페이트)를 유발하여 해당 특정 dNTP에 특이적인 제한된 시간 동안 검출가능한 광 신호를 방출한다. 다음 dNTP 혼입을 위해 프로세스를 반복한다(도 1).
보다 특히, 폴리머라제가 주형 DNA에 상보적인 가닥에 변형된 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트(dNTP) 뉴클레오티드 유사체를 혼입할 때마다, 부착된 뉴클레오티드 유형에 특이적인 형광 신호가 생성된다. 네 가지 유형의 dNTP, 즉 데옥시아데노신 트리포스페이트(dATP), 데옥시구아노신 트리포스페이트(dGTP), 데옥시시티딘 트리포스페이트(dCTP), 및 데옥시티미딘 트리포스페이트(dTTP)가 있다. 각각의 뉴클레오티드는 폴리머라제 효소에 의해 상보적 가닥에 부착되는 동안 고유한 형광 신호(예를 들어, 적색, 황색, 녹색, 또는 청색 등)를 생성한다. 이전에 부착된 뉴클레오티드 유사체의 3' 모이어티에 뉴클레오티드 유사체의 부착이 완료되면, 이탈기에 의해 생성된 형광은 적절한 형광 센서 및/또는 검출 장치에 의해 검출된 다음, 일부 구현예에서, 후속적으로 해당하는 각각의 dNTP 혼입에 대한 발광 반응의 하락에 의해 신속하게 종결된다. 다시 말해서, 주형 가닥에 혼입된 각 dNTP는 고유하고 해당하는 각각의 dNTP 혼합 이벤트를 나타내는 신중하고 제한된 기간의 광 펄스(형광 신호)를 야기한다.
다른 구현예에서, 이탈기에 의해 생성된 형광은 적절한 형광 센서 및/또는 검출 장치에 의해 증폭되고 검출된 다음, 일부 구현예에서, 후속적으로 해당하는 각각의 dNTP 혼입에 대한 발광 반응의 하락에 의해 신속하게 종결된다.
또한 본원에는 ATP 재생 효소/루시퍼라제 루프로부터 검출가능한 광 신호를 증폭하는 방법이 제공되며, 상기 상법은 다음과 같다.
서열분석은 뉴클레오티드가 뉴클레오티드의 유형을 보여주는 상보적 가닥에 첨가될 때마다 생성되는 형광을 검출함으로써 달성된다. 따라서, 각 특이적 뉴클레오티드 부착은 형광 센서에 의해 검출될 수 있는 형광 신호의 짧은 피크를 생성한다. 결과적으로, 계속되는 순차적인 색상의 데이터 어레이가 생성되며, 이는 뉴클레오티드 서열의 상응하는 데이터 어레이로 전환될 수 있다 (도 1).
본원에 개시된 본 발명의 방법에 의해 제공되는 이점은 단순성 및 검출 동안 배경 신호를 유의하게 감소시켜 민감도를 개선하는 혁신적인 화학물질에 있다. 본 발명의 방법에 따르면, 시약 및 효소를 수반하는 반응 조건의 변형이 적으면 특이성, 효율성 및 속도가 개선된다. 또한, 본 발명의 방법에 따르면, 폴리머라제는 거의 이상적인 조건에서 작동하고, 높은 민감도 및 특이성을 함께 활용하여 유의하게 적은 후처리 및 생성된 데이터의 분석을 요구함으로서 DNA 폴리머라제 분자 당 수만 개의 염기 정도로 매우 긴 판독 길이에 도달하는 것으로 고려된다. 본원에 개시된 본 발명의 방법의 조합된 특징은 경쟁 기술과 비교하여 테스트 당 시간을 상당히 감소시키는 것 외에도 높은 특이성을 달성하면서, 각각의 장치 및 각 실행 둘 다에 대한 비용을 감소시킨다. 따라서, 개시된 본 발명의 방법 및 시스템은 특이성에 악영향을 미치지 않으면서 매우 낮은 비용 및 실시간 서열분석 시스템의 실현을 허용한다.
문헌의 원용
본원에서, 본 명세서에 언급된 모든 허여된 특허, 공개된 특허 출원, 및 비특허 공개물은 각 개별적인 허여된 특허, 공개된 특허 출원, 또는 비특허 공개물이 구체적이고 개별적으로 참조에 의해 포함되는 것으로 나타내는 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
도 1a는 본 발명의 서열분석 방법의 일 구현예의 일반적인 예시를 도시한다: DNA 폴리머라제는 빌딩 블록으로서 각각의 형광단 수준으로 변형된 dNTP를 사용한다. 폴리머라제에 결합하면, 형광체 분자를 함유하는 피로포스페이트는 이후 반응을 위해 절단된다.
도 1b는 형광단이 주형 가닥에 부착된 각각의 뉴클레오티드 유사체의 폴리머라제-의존적 결합 및 형광단이 부착된 표지된 피로포스페이트의 절단을 도시하며, 이는 다음으로 ATP 술푸릴라제와 상호작용하여, 각각의 표지된 피로포스페이트를 아데노신 5'-포스포술페이트(APS)에 결합시켜, 표지된 ATP(ATP + FL)를 생성한다.
도 1c는 표지된 ATP의 형성을 도시한다.
도 1d는 본원에 제시된 발광 반응을 위한 시약, 표지된-ATP(ATP+FL), 루시페린, 및 반딧불이 루시퍼라제를 도시한다.
도 1e는 발광 반응에서 시약의 상호작용을 도시하며, 이로부터 표지된 피로포스페이트는 수반되는 발광의 결과로서 형광을 발할 것이다.
도 1f는 폴리머라제와 뉴틀레오티드 유사체 dNTP 상호작용 동안, 표지된-ATP로부터 표지된 피로포스페이트가 절단되면 형광이 생성되어, 각각의 형광단의 색상에 상응하는 형광 신호를 생성하는 것을 추가로 도시한다. 각 유형의 뉴클레오티드 유사체가 상이한 표지(예를 들어, 상이한 FL)를 갖도록, 각 뉴클레오티드 유사체 dNTP의 클래스에 대한 고유한 색상의 형광단이 있다.
도 1g는 실시예 2에 제시된 바와 같은 다양한 ATP 술푸릴라제, 반딧불이 루시퍼라제, 또는 dGTP-쿠마린 양에 의한 폴리머라제-ATP 술푸릴라제-루시퍼라제 반응(또한 FLASH 반응으로도 언급됨)의 결과로서 발광 생성을 도시한다.
도 2는 다양한 ATP 술푸릴라제를 사용한 본 발명의 FLASH 서열분석 반응의 결과로서 발광 생성을 도시한다.
도 3은 다양한 반딧불이 루시퍼라제를 사용한 본 발명의 FLASH 서열분석 반응의 결과로서 발광 생성을 도시한다.
도 4는 다양한 dGTP-쿠마린을 사용한 본 발명의 FLASH 서열분석 반응의 결과로서 발광 생성을 도시한다.
도 5는 실시예 4에 기재된 바와 같은 루시퍼라제 및 피로포스타제를 공동-캡슐화하기 위한 순 양전하를 갖는 다공성 매트릭스를 도시한다.
도 6은 형광으로 표지 및 비표지된 dGTP로 본 발명의 FLASH 서열분석 반응을 수행한 결과를 도시한다.
도 7은 다양한 양의 무기 포스파타제를 사용하여 ATP 및 APS를 루시퍼라제 반응에 첨가한 결과를 도시한다.
도 8은 ATP 술푸릴라제/루시퍼라제 신호 증폭 루프 반응에 코엔자임 A의 첨가가 발광 신호에 미치는 영향을 도시한다.
도 9a는 액적에 상응하는 구속 영역에서 FLASH 반응 시약을 한정하는 구현예를 도시하고; 복수의 폴리머라제 및 복수의 프라이머를 갖는 서열 혼합물에서 단일 표적 핵산 주형을 도시한다.
도 9b는 액적에 상응하는 구속 영역에서 FLASH 반응 시약을 한정하는 구현예를 도시하고; 단일 표적 핵산 주형만이 서열분석되도록, 복수의 표적 핵산 주형, 복수의 폴리머라제 및 단일 프라이머를 갖는 서열 혼합물을 도시한다.
도 9c는 액적에 상응하는 구속 영역에서 FLASH 반응 시약을 한정하는 구현예를 도시하고; 복수의 폴리머라제를 갖는 서열 혼합물에서 단일 자기-프라이밍 표적 핵산 주형을 도시한다.
도 10a는 표적 주형 핵산의 후속 결합을 위한 프라이머가 고체 표면 기질에 부착되어 있는 구성을 도시한다.
도 10b는 프라이머의 후속 결합을 위한 표적 핵산 주형이 고체 표면 기질에 부착되어 있는 구성을 도시한다.
도 11a는 단일 표적 핵산 주형 상에서 복수의 폴리머라제를 사용하여 본 발명의 서열분석 방법을 시작하는 구현예를 도시한다.
도 11b는 상보적 가닥을 합성하기 시작하는 폴리머라제가 전형적인 판독 길이를 가로지른 다음, 주형으로부터 떨어지거나 또는 해리될 때, 반응 혼합물에서 많은 다른 폴리머라제 중 또 다른 폴리머라제가 주형에 즉시 결합하고 상보적 가닥 서열분석 합성을 계속하기 때문에 표적 주형의 서열분석이 실질적으로 계속되는 구현예를 도시한다.
도 12는 수많은 동일한 프라이머가 단일 전체 반응 챔버, 또는 개별적인 신중한 반응 챔버에 있을 수 있는 신중한 유전자좌에서 기질 각각에 결합된 구현예를 도시한다. 이들 프라이머는 본질적으로 동일한 표적 주형 핵산에 결합한다.
도 13은 수많은 상이한(상호 배타적) 프라이머가 단일 전체 반응 챔버, 또는 개별적인 신중한 반응 챔버에 있을 수 있는 신중한 유전자좌에서 기질 각각에 결합된 구현예를 도시한다. 이들 프라이머는 상이한, 상호 배타적 표적 주형 핵산에 결합한다.
도 14는 주형 가닥에 dNTP 혼입의 생화학적 프로세스의 단순화된 개략도를 도시한다.
본원에는 핵산 주형을 서열분석하는 방법이 제공되며, 여기서 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(i) 폴리머라제 효소, (ii) ATP 재생 효소, (iii) 발광 효소(예를 들어, 반딧불이 루시퍼라제), (iv) 주형 핵산, 및 (iii) 성장 핵산 가닥의 주형 유도 합성을 수행하기 위한 성분을 갖는 폴리머라제-ATP 재생 효소-발광 시약 용액을 포함하는 서열분석 혼합물을 제공하며, 여기서 상기 시약 용액은 ATP-재생-효소-기질(예를 들어, APS, ADP-글루코스, AMP + PEP 등), 발광-기질(예를 들어, 루시페린); 및 복수의 유형의 뉴클레오티드 유사체를 포함하며; 여기서 각 유형의 뉴클레오티드 유사체는 폴리머라제에 의해 절단가능한 표지된 이탈기를 갖고, 각 유형의 뉴클레오티드 유사체는 상이한 표지를 가지며, 여기서 표지된 이탈기는 각각의 뉴클레오티드 유사체가 주형 가닥에 폴리머라제-의존적 결합하면 절단되는 것인, 단계;
복수의 뉴클레오티드 유사체가 a) 뉴클레오티드 유사체가 폴리머라제와 회합하고, b) 뉴클레오티드 유사체 상의 표지된 이탈기가 폴리머라제에 의해 절단될 때 해당 뉴클레오티드 유사체가 폴리머라제에 의해 주형 가닥에 혼입되며, 여기서 표지된 이탈기는 ATP 재생 효소에 의해 ATP-재생-효소-기질과 (예를 들어, ATP 술푸릴라제에 의해 APS와; AGPPase에 의해 ADP-글루코스와; PPDK에 의해 AMP+PEP와 등) 조합되어 표지된-ATP를 생성한 다음, c) 표지된-ATP가 발광-효소(반딧불이 루시퍼라제)에 결합하는 주형에 순차적으로 첨가되도록 핵산 합성을 수행하, 여기서 발광-기질(루시페린)은 발광-효소(루시퍼라제)에 의해 촉매되어 제한된(일시적/신중한) 시간 동안 발광을 생성하고 각각의 표지된 이탈기를 재생하며, 여기서 상기 발광은 각각의 표지된 이탈기 상에서 표지를 유발하여(여기하여) 광을 생성하는 것인, 단계; 및
핵산 합성이 발생하는 동안 표지로부터 광을 검출하고, 각 신중한 발광 기간(이벤트) 동안 검출된 광을 사용하여, 주형 핵산의 서열을 결정하는 단계.
본 발명의 특정 구현예에서 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(i) 폴리머라제 효소, (ii) ATP 술푸릴라제, (iii) 발광 효소(예를 들어, 반딧불이 루시퍼라제), (iv) 주형 핵산, 및 (iii) 성장 핵산 가닥의 주형 유도 합성을 수행하기 위한 성분을 갖는 폴리머라제-술푸릴라제-발광 시약 용액을 포함하는 서열분석 혼합물을 제공하며, 여기서 상기 시약 용액은 APS, 발광-기질(예를 들어, 루시페린); 및 복수의 유형의 뉴클레오티드 유사체를 포함하며; 여기서 각 유형의 뉴클레오티드 유사체는 폴리머라제에 의해 절단가능한 표지된 이탈기를 갖고, 각 유형의 뉴클레오티드 유사체는 상이한 표지를 가지며, 여기서 표지된 이탈기는 각각의 뉴클레오티드 유사체가 주형 가닥에 폴리머라제-의존적 결합하면 절단되는 것인, 단계; 또는
(i) 폴리머라제 효소, (ii) ADPglc 피로포스포릴라제(AGPPase), (iii) 발광 효소(예를 들어, 반딧불이 루시퍼라제), (iv) 주형 핵산, 및 (iii) 성장 핵산 가닥의 주형 유도 합성을 수행하기 위한 성분을 갖는 폴리머라제-AGPPase-발광 시약 용액을 포함하는 서열분석 혼합물을 제공하며, 여기서 상기 시약 용액은 ADP-글루코스, 발광-기질(예를 들어, 루시페린); 및 복수의 유형의 뉴클레오티드 유사체를 포함하며; 여기서 각 유형의 뉴클레오티드 유사체는 폴리머라제에 의해 절단가능한 표지된 이탈기를 갖고, 각 유형의 뉴클레오티드 유사체는 상이한 표지를 가지며, 여기서 표지된 이탈기는 각각의 뉴클레오티드 유사체가 주형 가닥에 폴리머라제-의존적 결합하면 절단되는 것인, 단계; 또는
(i) 폴리머라제 효소, (ii) 피루베이트 오르토포스페이트 디키나제(PPDK), (iii) 발광 효소(예를 들어, 반딧불이 루시퍼라제), (iv) 주형 핵산, 및 (iii) 성장 핵산 가닥의 주형 유도 합성을 수행하기 위한 성분을 갖는 폴리머라제-PPDK-발광 시약 용액을 포함하는 서열분석 혼합물을 제공하며, 여기서 상기 시약 용액은 AMP 및 포스포에날피루베이트(PEP), 발광-기질(예를 들어, 루시페린); 및 복수의 유형의 뉴클레오티드 유사체를 포함하며; 여기서 각 유형의 뉴클레오티드 유사체는 폴리머라제에 의해 절단가능한 표지된 이탈기를 갖고, 각 유형의 뉴클레오티드 유사체는 상이한 표지를 가지며, 여기서 표지된 이탈기는 각각의 뉴클레오티드 유사체가 주형 가닥에 폴리머라제-의존적 결합하면 절단되는 것인, 단계; 및
복수의 뉴클레오티드 유사체가 a) 뉴클레오티드 유사체가 폴리머라제와 회합하고, b) 뉴클레오티드 유사체 상의 표지된 이탈기가 폴리머라제에 의해 절단될 때 해당 뉴클레오티드 유사체가 폴리머라제에 의해 주형 가닥에 혼입되며, 여기서 표지된 이탈기는 ATP 술푸릴라제에 의해 APS와, AGGPase에 의해 ADP-글루코스와; 및/또는 PPDK에 의해 AMP와 조합하여, 표지된-ATP를 생성한 다음, c) 표지된-ATP가 발광-효소(반딧불이 루시퍼라제)에 결합하는 주형에 순차적으로 첨가되도록 핵산 합성을 수행하며, 여기서 발광-기질(루시페린)은 발광-효소(루시퍼라제)에 의해 촉매되어 제한된(일시적/신중한) 시간 동안 발광을 생성하고 각각의 표지된 이탈기를 재생하며, 여기서 상기 발광은 각각의 표지된 이탈기 상에서 표지를 유발하여(여기하여) 광을 생성하는 것인, 단계; 및
핵산 합성이 발생하는 동안 표지로부터 광을 검출하고, 각 신중한 발광 기간(이벤트) 동안 검출된 광을 사용하여, 주형 핵산의 서열을 결정하는 단계.
본원에 사용된 바와 같이, "폴리머라제-ATP 재생 효소-루시퍼라제" 또는 이의 문법적 변이는 폴리머라제 쇄 신장 서열분석 반응에 의해 생성된 표지된 피로포스페이트를 활용하고, 표지된 피로포스페이트(PPi; 도 1b)를 ATP로 전환하는 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 당업계에 알려진 임의의 연결된 3 효소 시스템을 지칭한다. 예를 들어, 연결된 3 효소 폴리머라제-ATP 재생 효소-루시퍼라제 시스템은 폴리머라제-ATP 술푸릴라제-발광 효소 시스템; 폴리머라제-AGPPase-발광(Lee et al., Analytical Biochemistry, 399 (2010) 168-173에 개시된 바와 같으며; 모든 목적을 위해 전문이 본원에 참조로 포함됨); 폴리머라제-PPDK-발광 효소 시스템(Zhou et al., Anal. Chem. 2006, 78,4482-4489에 개시된 바와 같으며; 모든 목적을 위해 전문이 본원에 참조로 포함됨); 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 어구 "ATP-재생-효소-기질"은 본원에 사용된 각각의 ATP-재생 효소에 대한 천연 기질을 지칭한다. 예를 들어, 본원에 사용된 천연 기질은 ATP 술푸릴라제의 경우 APS이고; AGGPase의 경우 ADP-글루코스이며; PPDK의 경우 AMP + PEP 등이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "ATP 재생 효소/루시퍼라제 루프" 또는 "ATP 재생 효소/루시퍼라제 신호 증폭 루프" 이의 문법적 변이(예를 들어, ATP 술푸릴라제/루시퍼라제 루프, AGPPase/루시퍼라제 루프, PPDK/루시퍼라제 루프 등)는 일반적으로 루시퍼라제에 의해 촉매된 발광체 반응 후 부착된 형광체 표지(PPi+FL)를 여전히 갖는 새로운 피로포스페이트 분자가 방출되는, 본원의 실시예 3 및 도 1b-1g에 제시된 바와 같은 ATP 재생 효소 및 루시퍼라제 사이의 효소적 루프를 지칭한다(도 1f). 이 새롭게 방출된 PPi-FL은 다시 한 번 ATP 재생 효소(예를 들어, ATP 술푸릴라제, AGPPase, PPDK 등)에 대한 기질이 될 수 있으며, 이에 의해 ATP 재생 효소(예를 들어, ATP 술푸릴라제, AGPPase, PPDK 등) 및 루시퍼라제 사이에 효소적 루프를 생성한다(도 1g.상단). 도 1b-1g에 도시된 바와 같이, 이 루프 PPi+FL 내에서 ATP 술푸릴라제에 의해 재순환되고 형광으로 표지된 ATP(ATP-FL)로 전환된 다음, PPi-FL을 방출하는 루시퍼라제에 의해 촉매될 수 있다. 이는 표지된 피로포스페이트로부터 연속적인 신호를 생성하고, 이에 의해 가장 최근의 뉴클레오티드에 대한 서열분석 신호의 증폭 메커니즘으로서 역할을 할 것이다.
특정 구현예에서, 서열분석 혼합물은 표지된 피로포스페이트를 2 개의 포스페이트 이온으로 전환할 수 있는 피로포스파타제 효소를 추가로 포함하며, 이는 쇄 신장 서열분석 반응에서 다음 dNTP의 혼입 전에 본 발명의 방법에서 "ATP 재생 효소/루시퍼라제 신호 증폭 루프"를 파괴하는 기능을 한다. 본원에 사용하기 위한 예시적인 연결 폴리머라제-ATP 재생 효소-루시퍼라제-피로포스파타제 4 효소 시스템은 폴리머라제-ATP술푸릴라제-루시퍼라제-피로포스파타제; 폴리머라제-AGPPase-루시퍼라제-피로포스파타제; 및 폴리머라제-PPDK-루시퍼라제-피로포스파타제 등을 포함한다. 이 구현예에서, 효소 농도의 비율은 ATP 재생 효소/루시퍼라제 루프 활성이 피로포스파타제 활성보다 몇자리 수 더 높도록 조정된다. 연결 폴리머라제-ATP 재생 효소-루시퍼라제-피로포스파타제 4 효소 시스템이 사용되는 일 구현예에서, ATP 재생 효소/루시퍼라제 루프의 상대 반응 속도는 피로포스파타제 반응보다 103-1012, 103-1011, 103-1010, 103-109, 103-108, 103-107, 및 103-106 배 등 더 빠르게 선택된다. 다른 구현예에서, ATP 재생 효소/루시퍼라제 루프의 상대 반응 속도는 피로포스파타제 반응보다 적어도 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012 배 등 더 빠르게 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 구현예에서, 본 발명의 서열분석 방법에서 피로포스파타제 반응의 속도 대비 ATP 재생 효소/루시퍼라제 루프 반응의 속도; 또는 ATP 재생 효소/루시퍼라제 루프 반응의 전체 시간 길이를 제어하기 위해, ATP 재생 효소 대 피로포스파타제 효소의 비율은 변형되고 조정될 수 있다. 따라서, 본원에는 본원에 기재된 FLASH 서열분석 방법을 수행하는 단계; 및 ATP 재생 효소/루시퍼라제 증폭 루프의 신호에 대한 시간 길이를 조절하는 데 효과적인 피로포스파타제 대 ATP 재생 효소의 비율로 피로포스파타제를 서열분석 혼합물에 첨가하는 단계를 포함하는, 서열분석 반응에서 ATP 재생 효소/루시퍼라제 증폭 루프의 신호에 대한 시간 길이를 조절하는 방법이 제공된다.
본원에 사용하기 위해 선택되는 ATP 재생 효소에 따라, ATP 재생 효소/루시퍼라제 증폭 루프의 신호에 대한 시간 길이를 조절하는 데 효과적인, 본원에 사용하기 위해 고려되는 예시적인 ATP 재생 효소:피로포스파타제 효소 비율은 1:1, 1:2, 1:5, 1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90, 1:100, 1:250, 1:150, 1:175, 1:200, 1:225, 1:250, 1:275, 1:300, 1:350, 1:400, 1:450, 1:500, 1:550, 1:600, 1:650, 1:700, 1:750, 1:800, 1:850, 1:900, 1:950, 1:1000, 1:1500, 1:2000, 1:3000, 1:4000, 1:5000 ATP 재생 효소:피로포스파타제 효소 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 마찬가지로, 본원에 사용하기 위해 선택되는 ATP 재생 효소에 따라, 본원에 사용하기 위해 고려되는 예시적인 피로포스파타제:ATP 재생 효소 비율은 1:1, 1:2, 1:5, 1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90, 1:100, 1:250, 1:150, 1:175, 1:200, 1:225, 1:250, 1:275, 1:300, 1:350, 1:400, 1:450, 1:500, 1:550, 1:600, 1:650, 1:700, 1:750, 1:800, 1:850, 1:900, 1:950, 1:1000, 1:1500, 1:2000, 1:3000, 1:4000, 1:5000 피로포스파타제:ATP 재생 효소 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
ATP 술푸릴라제 및 APS가 본 발명의 서열분석 방법에 사용되는 특정 구현예에서, 본원에 사용하기 위해 고려되는 예시적인 ATP 술푸릴라제 효소:피로포스파타제 효소 비율은 1:1, 1:2, 1:5, 1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90, 1:100, 1:250, 1:150, 1:175, 1:200, 1:225, 1:250, 1:275, 1:300, 1:350, 1:400, 1:450, 1:500, 1:550, 1:600, 1:650, 1:700, 1:750, 1:800, 1:850, 1:900, 1:950, 1:1000, 1:1500, 1:2000, 1:3000, 1:4000, 1:5000 ATP 술푸릴라제 효소:피로포스파타제 효소 등으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 서열분석 혼합물은 dNTP를 AMP로 분해할 수 있는 아피라제 효소를 추가로 포함하며, 이는 쇄 신장 서열분석 반응에서 다음 dNTP의 혼입 전에 본 발명의 방법에서 "ATP 재생 효소/루시퍼라제 신호 증폭 루프"를 파괴하는 기능을 한다. 본원에 사용하기 위한 예시적인 연결 폴리머라제-ATP 재생 효소-루시퍼라제-피로포스파타제 4 효소 시스템은 폴리머라제-ATP술푸릴라제-루시퍼라제-아피라제; 폴리머라제-AGPPase-루시퍼라제-아피라제; 및 폴리머라제-PPDK-루시퍼라제-아피라제 등을 포함한다. 이 구현예에서, 효소 농도의 비율은 ATP 재생 효소/루시퍼라제 루프 활성이 아피라제 활성보다 몇자리 수 더 높도록 조정된다. 연결 폴리머라제-ATP 재생 효소-루시퍼라제-피로포스파타제 4 효소 시스템이 사용되는 일 구현예에서, ATP 재생 효소/루시퍼라제 루프의 상대 반응 속도는 아피라제 반응보다 103-1012, 103-1011, 103-1010, 103-109, 103-108, 103-107, 및 103-106 배 등 더 빠르게 선택된다. 다른 구현예에서, ATP 재생 효소/루시퍼라제 루프의 상대 반응 속도는 아피라제 반응보다 적어도 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012 배 등 더 빠르게 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 구현예에서, 본 발명의 서열분석 방법에서 아피라제 반응의 속도 대비 ATP 재생 효소/루시퍼라제 루프 반응의 속도; 또는 ATP 재생 효소/루시퍼라제 루프 반응의 전체 시간 길이를 제어하기 위해, ATP 재생 효소 대 아피라제 효소의 비율은 변형되고 조절될 수 있다. 본원에 사용하기 위해 선택된 ATP 재생 효소에 따라, 본원에 사용하기 위해 고려되는 예시적인 ATP 재생 효소:아피라제 효소 비율은 1:1, 1:2, 1:5, 1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90, 1:100, 1:250, 1:150, 1:175, 1:200, 1:225, 1:250, 1:275, 1:300, 1:350, 1:400, 1:450, 1:500, 1:550, 1:600, 1:650, 1:700, 1:750, 1:800, 1:850, 1:900, 1:950, 1:1000, 1:1500, 1:2000, 1:3000, 1:4000, 1:5000 ATP 재생 효소:아피라제 효소 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 마찬가지로, 본원에 사용하기 위해 선택된 ATP 재생 효소에 따라, 본원에 사용하기 위해 고려되는 예시적인 아피라제:ATP 재생 효소 비율은 1:1, 1:2, 1:5, 1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90, 1:100, 1:250, 1:150, 1:175, 1:200, 1:225, 1:250, 1:275, 1:300, 1:350, 1:400, 1:450, 1:500, 1:550, 1:600, 1:650, 1:700, 1:750, 1:800, 1:850, 1:900, 1:950, 1:1000, 1:1500, 1:2000, 1:3000, 1:4000, 1:5000 아피라제:ATP 재생 효소 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 방법의 또 다른 구현예에서, 루시퍼라제 및 피로포스파타제는 나노매트릭스에서 공동-캡슐화된다. 일 구현예에서, 나노매트릭스는 도 5에 제시된 바와 같이, 음으로 하전된 나노입자이다. 이 구현예에서, 표지된 ATP(ATP-FL)는 루시퍼라제 및 피로포스파타제가 공동-캡슐화된 음으로 하전된 매트릭스로 확산될 수 있다. 특정 구현예에서, 표지된-ATP가 발광-효소에 결합하는 단계 c)는 나노매트릭스 내에서 발생하며, 여기서 발광-기질은 발광-효소에 의해 촉매된다.
본원에 사용된 바와 같이, 어구 "서열분석 혼합물"은 본 발명의 단일 분자 서열분석 반응을 수행하는 데 사용되는 성분을 지칭한다. 일 구현예에서, 서열분석 혼합물은 (i) 폴리머라제 효소, (ii) ATP 재생 효소(예를 들어, ATP 술푸릴라제, AGPPase, PPDK 등), (iii) 발광 효소(예를 들어, 반딧불이 루시퍼라제), (iv) 주형 핵산, 및 (iii) 성장 핵산 가닥의 주형 유도 합성을 수행하기 위한 성분을 갖는 폴리머라제-ATP 재생 효소-발광 시약 용액을 포함하며, 여기서 상기 시약 용액은 APS, ADP-글루코스, AMP+PEP 등, 발광-기질(예를 들어, 루시페린); 및 그 안에 복수의 유형의 표지된 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 본 발명에 따르면, 사용되는 서열분석 혼합물은 이전 서열분석 방법에 비해 본 발명의 서열분석 방법에서 다음 이점을 제공한다: 폴리머라제는 이상적인 상태에서 기능을 이용하고; 폴리머라제 효소를 변형시킬 필요가 없고; 높은 뉴클레오티드(예를 들어, dNTP) 농도의 사용은 최적의 효율성을 야기하고; 발광 반응을 통해 매우 낮은 강도, 신중하고 제한된 기간의 여기 광만을 필요로 하여, 유리하게는 형광단의 광퇴색을 감소시키고 폴리머라제 효소의 변성을 감소시키며; 사실상 형광체 배경을 제공하지 않아, 염기 호출의 특이성 및 민감도를 개선시키고; 정교한 광학 또는 나노구조화 칩 설계를 필요로 하지 않아, 비용을 감소시키고; 높은 특이성을 제공하여, 높은 적용범위에 대한 필요성을 감소시키고; 선행 기술 방법에 비해 훨씬 적게 요구되는 컴퓨터 처리로 긴 판독 길이(예를 들어, 1 개 유전자/셀(cell)에 대해 약 50 Kb)를 제공한다.
본원에 사용된 바와 같이, 어구 "폴리머라제-ATP 재생 효소-발광 시약 용액", ATP 재생 효소로서 ATP 술푸릴라제, AGPPase, PPDK 등을 사용한 이의 문법적 변이, 또는 "시약 용액"은 성장 핵산의 주형 유도 합성을 수행하는데 필요한 성분의 혼합물을 지칭한다. ATP 술페릴라제를 사용하는 일 구현예에서, 폴리머라제, 예를 들어, DNA pol I, ATP 술푸릴라제, 및 발광-효소(예를 들어, 루시퍼라제 등)와 사용하기 위한 폴리머라제 시약 용액은 APS(아데노신 5' 포스포술페이트), 루시페린 및 적합한 농도의 dNTP, 예를 들어, 본원에 기재된 형광단-변형된 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. AGPPase를 사용하는 또 다른 구현예에서, 폴리머라제, 예를 들어, DNA pol I, AGPPase, 및 발광-효소(예를 들어, 루시퍼라제 등)와 사용하기 위한 폴리머라제 시약 용액은 ADP-글루코스, 루시페린 및 적합한 농도의 dNTP, 예를 들어, 본원에 기재된 형광단-변형된 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. PPDK를 사용하는 또 다른 구현예에서, 폴리머라제, 예를 들어, DNA pol I, PPDK, 및 발광-효소(예를 들어, 루시퍼라제 등)와 사용하기 위한 폴리머라제 시약 용액은 AMP+PEP, 루시페린 및 적합한 농도의 dNTP, 예를 들어, 본원에 기재된 형광단-변형된 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 특정 구현예에서, 이용되는 dNTP의 농도는 부분적으로 표지된 이탈기(예를 들어, 형광체 피로포스페이트; PPi)로부터 발생하는 낮은 형광체 배경이 본 발명의 방법에서 유리하게 이용되기 때문에 종전에 가능한 것보다 훨씬 더 높다. 표지된-ATP 형성 효소(예를 들어, ATP 술푸릴라제, AGPPase, PPDK 등) 및 폴리머라제 속도는 효소의 유형 및 공급원에 따라 유의하게 달라질 수 있기 때문에, 본원에 이용된 ATP 재생 효소(예를 들어, ATP 술푸릴라제, AGPPase, PPDK 등) 반응에 의해 달성되는 표지된-ATP 형성 속도는 본원에 기재된 바와 같이 ATP 재생 효소 농도 등과 같은 반응 조건을 조정함으로써 별도로 조정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 어구 "표지된-ATP 반응"은 도 1b 및 1c에 제시된 바와 같이, 형광단으로 표지된 피로포스페이트(PPi+FL)를 ATP 재생 기질(예를 들어, 아데노신 5' 포스포술페이트(APS), ADP-글루코스, AMP+PEP 등)과 조합하여 표지된-ATP(ATP + FL)를 형성할 수 있는 임의의 반응을 지칭한다. 본원에 사용하기 위한 일 구현예에서, 표지된 피로포스페이트는 ATP 술푸릴라제 효소 등을 사용하여 APS와 조합될 수 있다. 본원에 사용하기 위한 또 다른 구현예에서, 표지된 피로포스페이트는 AGPPase 효소 등을 사용하여 ADP-글루코스와 조합될 수 있다. 본원에 사용하기 위한 또 다른 구현예에서, 표지된 피로포스페이트는 PPDK 효소 등을 사용하여 AMP+PEP와 조합될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 어구 "발광 반응"은 방출체의 온도로부터 에너지를 전혀 유도하지 않거나 또는 단독으로 유도하는 광의 방출(즉, 백열광 이외의 광의 방출)을 생성할 수 있는 임의의 반응을 지칭한다. "발광"은 형광, 인광, 열발광, 화학발광, 전장발광 및 생물발광을 포함하나 이에 제한되지 않는다. "발광체"는 발광을 나타내는 물체를 지칭한다. 바람직한 구현예에서, 광은 가시 스펙트럼 내에 있다. 그러나, 본 발명은 가시광으로 제한되지 않지만, 임의의 주파수의 전자기 복사를 포함한다. 일 구현예에서, 본원에 이용되는 발광 반응은 보조인자로서 표지된-ATP(ATP+FL)를 사용하여 발광-기질인 루시페린을 촉매하여, 발광, 옥시루시페린, AMP를 생성하고 또한 표지된 피로포스페이트(PPi+FL)를 재생하는 발광 효소, 루시퍼라제(예를 들어, 반딧불이 루시퍼라제)에 의해 유발된다(도 1d-1f 참조).
예를 들어, 일 구현예에서, 본원에서 고려되는 반복적 서열분석 주기는 표지된-ATP 및 무기 술페이트의 생산을 야기하는 ATP-술푸릴라제 효소에 의해 촉매된 PPi와 APS의 첫번째 표지된-ATP 반응을 수반한다. 두번째 반응에서, 발광 반응, 루시페린 및 루시퍼라제는 에너지원으로서 ATP를 소비하여 광, AMP 및 옥시루시페린을 생성하고 표지된 피로포스페이트(PPi+FL)를 재생한다(도 1d-1f). 따라서, 각 dNTP 유사체가 각각 혼입된 후, 용액 중 표지된 피로포스페이트(PPi +FL)의 각각에 분자에 대해 광양자가 생성된다. 본원에서 고려되는 일 구현예에 대한 반응 과정에서, APS 및 루시페린은 소비되고 AMP 및 옥시루시페린은 생성되는 반면, ATP 술푸릴라제 및 루시퍼라제는 일정하게 유지된다. 본 발명은 사용되는 루시퍼라제 유형으로 제한되지 않는다. 특정 개시된 구현예는 반딧불이 루시퍼라제를 활용하였지만, 당업계에 알려진 임의의 루시퍼라제가 개시된 방법에 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 코엔자임 A는 루시퍼라제의 분해/탈활성화를 방지함으로써 루시퍼라제/루시페린 커플 또는 복합체를 안정화시켜, 서열분석 반응에서 ATP 재생 효소/루시퍼라제 증폭 루프의 신호 강도를 증가시키는 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본원에는 본원에 제시된 본 발명의 FLASH 서열분석 방법을 수행하는 단계; 및 ATP 재생 효소/루시퍼라제 증폭 루프의 신호 강도를 증가시키는 데 효과적인 코엔자임 A 대 루시퍼라제의 비율로 코엔자임 A를 서열분석 혼합물에 첨가하는 단계를 포함하는, 서열분석 반응에서 ATP 재생 효소/루시퍼라제 증폭 루프의 신호 강도를 증가시키는 방법이 제공된다.
따라서, 일부 구현예에서, 본원에 사용되는 코엔자임 A의 양은 서열분석 반응에서 ATP 재생 효소/루시퍼라제 증폭 루프의 신호 강도를 증가시키는 데 효과적인 코엔자임 A:루시퍼라제의 비율로서 본 발명의 서열분석 혼합물 및 용액에 첨가될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 사용하기 위해 고려되는 적합한 코엔자임 A:루시퍼라제 비율은 1:1, 1:2, 1:5, 1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90, 1:100, 1:250, 1:150, 1:175, 1:200, 1:225, 1:250, 1:275, 1:300, 1:350, 1:400, 1:450, 1:500, 1:550, 1:600, 1:650, 1:700, 1:750, 1:800, 1:850, 1:900, 1:950, 1:1000, 1:1500, 1:2000, 1:3000, 1:4000, 1:5000 코엔자임 A:루시퍼라제 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 다른 구현예에서, 서열분석 반응에서 ATP 재생 효소/루시퍼라제 증폭 루프의 신호 강도를 증가시키는 데 효과적인 본원에 사용하기 위해 고려되는 적합한 루시퍼라제:코엔자임 A 비율은 1:1, 1:2, 1:5, 1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90, 1:100, 1:250, 1:150, 1:175, 1:200, 1:225, 1:250, 1:275, 1:300, 1:350, 1:400, 1:450, 1:500, 1:550, 1:600, 1:650, 1:700, 1:750, 1:800, 1:850, 1:900, 1:950, 1:1000, 1:1500, 1:2000, 1:3000, 1:4000, 1:5000 루시퍼라제:코엔자임 A 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "폴리머라제 효소"는 핵산 합성을 수행하는 데 책임이 있는 널리 알려진 단백질을 지칭한다. 본원에 사용하기 위한 바람직한 폴리머라제 효소는 DNA 폴리머라제이다. 천연 폴리머라제 변형된 핵산 합성에서, 복합체는 폴리머라제 효소, 주형 핵산 서열, 및 합성 프로세스의 시작점으로 역할을 하는 프라이밍 서열 사이에 형성된다. 합성 동안, 폴리머라제는 반응 믹스로부터 뉴클레오티드 단량체를 샘플링하여 주형 서열에서 다음 염기에 대한 상보성을 결정한다. 샘플링된 염기가 다음 염기에 대해 상보적일 때, 성장 초기 가닥에 혼입된다. 이 프로세스는 주형 서열 길이에 따라 계속되어 해당 주형을 효과적으로 복제한다. 단순화된 도식 방식으로 기재되어 있지만, 실제 생화학적 혼입 프로세스는 비교적 복잡할 수 있다. 도표로 나타낸 혼입 생화학은 도 14에 제공된다. 이 다이아그램은 뉴클레오티드 혼입 메커니즘을 완전히 설명하지 않는다. 반응 프로세스 동안, 폴리머라제 효소는 메커니즘에서 필수적 단계일 수 있는 일련의 형태적 변화를 겪는다.
도 14에 도시된 바와 같이, 합성 프로세스는 단계 2에서 프라이밍된 핵산 주형(D)이 폴리머라제(P)에 결합하여 시작한다. 복합체와의 뉴클레오티드(N) 결합은 단계 4에서 발생한다. 단계 6은 개방형에서 폐쇄형 형태로 폴리머라제의 이성질체화를 나타낸다. 단계 8은 뉴클레오티드가 성장 가닥에 혼입되는 화학 단계이다. 단계 10에서, 폴리머라제 이성질체화는 폐쇄형에서 개방형 위치로 발생한다. 혼입 시 절단되는 폴리포스페이트 성분은 단계 12에서 복합체로부터 방출된다. 도면은 피로포스페이트의 방출을 도시하지만, 표지된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체가 사용될 때, 방출된 성분은 피로포스페이트와 상이할 수 있는 것으로 이해된다. 많은 경우에, 본 발명의 시스템 및 방법은 방출된 성분이 염료에 연결된 폴리포스페이트(예를 들어, 표지 피로포스페이트; PPi)를 포함하도록 말단 포스페이트 상에서 표지를 갖는 뉴클레오티드 유사체를 사용한다. 그 다음에 천연 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체 기질을 사용하여, 폴리머라제를 단계 14에서 주형 상에 전좌시킨다. 전좌 후, 폴리머라제는 또 다른 뉴클레오티드를 첨가하고 반응 주기를 전후하여 계속하는 위치에 있다.
본원에 사용하기에 적합한 폴리머라제 효소는 다양한 계통 발생 관계에 기초하여 6 개의 주요 그룹, 예를 들어, 이. 콜라이(E. coil) Pol I(클래스 A), 이. 콜라이 Pol II(클래스 B), 이. 콜라이 Pol III(클래스 C), 유리고세균(Euryarchaeotic) Pol II(클래스 D), 인간 Pol 베타(클래스 X), 및 이. 콜라이 UmuC/DinB 및 진핵생물 RAD30/색소피부건조증 변이체(클래스 Y)로 분류될 수 있는 DNA 폴리머라제를 포함한다. 명명법의 검토를 위해, 예를 들어, Burgers et al. (2001) "Eukaryotic DNA Polymerases: proposal for a revised nomenclature" J Biol Chem. 276(47):43487-90을 참조한다. 폴리머라제의 검토를 위해, 예를 들어, Hubscher et al. (2002) "Eukaryotic DNA Polymerases" Annual Review of Biochemistry Vol. 71: 133-163; Alba (2001) "Protein Family Review: Replicative DNA Polymerases" Genome Biology 2(1):reviews 3002.1-3002.4; 및 Steitz (1999) "DNA Polymerase: structural diversity and common mechanisms" J Biol Chem 274:17395-17398을 참조하며; 각각은 그 전문에 본원에 참조로 포함된다. 수많은 폴리머라제에 대한 기본적인 작용 메커니즘이 결정되었다. 문자 그대로 수백 개의 폴리머라제의 서열이 공개적으로 이용가능하며, 이들 중 많은 것에 대한 결정 구조가 결정되었거나, 또는 상동 폴리머라제에 대해 해결된 결정 구조와의 유사성에 기초하여 추론될 수 있다.
핵산 서열분석에 적합한 많은 이러한 폴리머라제는 쉽게 이용가능하다. 예를 들어, 인간 DNA 폴리머라제 베타는 R&D systems로부터 이용가능하다. 본원에 사용하기에 적합한 DNA 폴리머라제는 Epicenter, GE Health Care, Invitrogen, New England Biolabs, Promega, Roche Applied Science, Sigma Aldrich 등으로부터 이용가능한 DNA 폴리머라제 I을 포함한다. DNA 폴리머라제 I의 클레노브(Klenow) 단편은 예를 들어, Ambion, Chimerx, eEnzyme LLC, GE Health Care, Invitrogen, New England Biolabs, Promega, Roche Applied Science, Sigma Aldrich 등으로부터 재조합 및 프로테아제 분해 버전 둘 다로 이용가능하다. PHI.29 DNA 폴리머라제는 예를 들어, Epicentre로부터 이용가능하다. Poly A 폴리머라제, 리버스 트랜스크립타제, 시쿼나제(Sequenase), SP6 DNA 폴리머라제, T4 DNA 폴리머라제, T7 DNA 폴리머라제, 및 다양한 내열성 DNA 폴리머라제(Taq, 핫 스타트, 티타늄 Taq 등)는 다양한 이들 및 다른 공급원으로부터 이용가능하다. 다른 상업용 DNA 폴리머라제는 New England Biolabs로부터 이용가능한 PhusionhM 고충실도 DNA 폴리머라제; Promega로부터 이용가능한 GoTaq.RTM. Flexi DNA 폴리머라제; Epicentre Biotechnologies로부터 이용가능한 RepIiPHI.TM. .PHI.29 DNA 폴리머라제; Stratagene으로부터 이용가능한 PfuUltra.TM. Hotstart DNA 폴리머라제; Novagen으로부터 이용가능한 KOD HiFi DNA 폴리머라제 등을 포함한다.
이용가능한 DNA 폴리머라제 효소는 또한 예를 들어, 엑소뉴클레아제 활성을 감소시키거나 또는 제거하기 위해(많은 천연 DNA 폴리머라제는 예를 들어, 서열분석 적용을 방해하는 교정 엑소뉴클레아제 기능을 가짐), 클레노브 단편 재조합과 같은 프로테아제 분해 효소 단편을 제조함으로써 생산을 단순화하기 위해 등 임의의 다양한 방식으로 변형되었다. 언급된 바와 같이, 폴리머라제는 또한 폴리머라제-DNA-뉴클레오티드 복합체에서 표지된 뉴클레오티드의 특이성, 진행성, 및 개선된 체류 시간의 개선을 부여하기 위해(예를 들어, Hanzel 등에 의한 WO 2007/076057 POLYMERASES FOR NUCLEOTIDE ANALOGUE INCORPORATION 및 Rank 등에 의한 WO 2008/051530 POLYMERASE ENZYMES AND REAGENTS FOR ENHANCED NUCLEIC ACID SEQUENCING), 분지 단편 및 전좌를 변경하기 위해(예를 들어, 발명의 명칭 "ENGINEERING POLYMERASES AND REACTION CONDITIONS FOR MODIFIED INCORPORATION PROPERTIES"로 Pranav Patel 등에 의해 2009년 9월 4일 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 제12/584,481호), 광안정성을 증가시키기 위해(예를 들어, 발명의 명칭 "Enzymes Resistant to Photodamage"로 Keith Bjornson 등에 의해 2009년 3월 30일 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 제12/384,110호), 및 표면-고정화 효소 활성을 개선하기 위해(예를 들어, Hanzel 등에 의한 WO 2007/075987 ACTIVE SURFACE COUPLED POLYMERASES 및 Hanzel 등에 의한 WO 2007/076057 PROTEIN ENGINEERING STRATEGIES TO OPTIMIZE ACTIVITY OF SURFACE ATTACHED PROTEINS) 변형되었다. 임의의 이러한 이용가능한 폴리머라제는 본 발명에 따라 변형되어 분지화 분획 형성을 감소시키고/시키거나, 폐쇄형 폴리머라제-DNA 복합체의 안정성을 개선시키고/시키거나, 및/또는 반응 속도 상수를 변경시킬 수 있다.
분지화 분획을 감소시키거나, 폐쇄형 복합체 안정성을 증가시키거나, 또는 반응 속도 상수를 변경시키는 돌연변이에 바람직한 기질인 DNA 폴리머라제는 Taq 폴리머라제, 엑소뉴클레아제 결핍 Taq 폴리머라제, 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 1, 클레노브 단편, 리버스 트랜스크립타제, 야생형 PHI-29 폴리머라제 및 엑소뉴클레아제 결핍 형태와 같은 이러한 폴리머라제의 변이체를 포함하는 PHI-29 관련 폴리머라제, T7 DNA 폴리머라제, T5 DNA 폴리머라제, RB69 폴리머라제 등을 포함한다.
또한, 폴리머라제는 예를 들어, 2009년 3월 30일 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 제12/384,110호에 교시된 바와 같이 광안정성을 증가시키기 위해, 예를 들어, WO 2007/075987, 및 WO 2007/076057에 교시된 바와 같이, 표면에 결합될 때 효소의 활성을 개선시키기 위해, 또는 인용된 참고문헌에서 교시된 바와 같고 당업계에서 일반적인 바와 같은 정제 또는 취급 태그를 포함하기 위해서와 같은 적용-특이적 이유로 추가로 변형될 수 있다. 유사하게, 본원에 기재된 변형된 폴리머라제는 폴리머라제 성능을 개선하는 다른 전략, 예를 들어, 2009년 3월 30일 출원되고, "Two slow-step polymerase enzyme systems and methods"라는 발명의 명칭의 미국 특허 출원 일련 번호 제12/414,191호에 교시된 바와 같dl 폴리머라제 속도 상수를 제어하는 반응 조건과 조합하여 이용될 수 있으며, 상기 문헌은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
단일 분자 반응에서 긴 판독-길이를 달성하는 방법
긴 판독-길이를 달성하는 능력은 기존 서열분석 방법에 대해 달성하기 힘든 목표였다. 모든 현대의 서열분석 접근법은 긴 판독-길이를 달성하는 능력이 제한되어 있다. 특히, 단일 분자 서열분석 방법의 경우 이 제한은 주형 DNA에 대한 폴리머라제의 상대 친화성에서 비롯된다. 서열분석 반응 동안, 폴리머라제는 결국 주형 DNA으로부터 떨어지며 이에 의해 해당하는 각각의 판독 길이에서 dNTP 쇄 신장 반응을 종결할 것이다. 예를 들어 Pacific Biosciences SMRT 기술을 사용하면, 셀 당 하나의 주형 및 하나의 폴리머라제가 있다. 이들 단일 폴리머라제 서열분석 반응의 경우, 단일 폴리머라제가 주형으로부터 해리될 때(떨어질 때), 해당하는 특정 판독 길이는 전형적으로 약 700 개 염기 쌍(bp)인 것으로 여겨지는 것에 상응하는 비교적 짧은 판독 길이에서 종결된다.
본 발명에 따르면, 본원에는 하기 단계를 포함하는, 주형 핵산을 서열분석하는 방법이 제공된다:
표적 주형 핵산, 복수의 유형의 뉴클레오티드 유사체, 및 복수의 폴리머라제 효소를 포함하는 서열분석 혼합물을 제공하는 단계;
복수의 뉴클레오티드 유사체가 주형에 순차적으로 첨가되도록 핵산 합성을 수행하는 단계; 및
핵산 합성이 발생하는 동안 각각의 뉴클레오티드 유사체를 검출하여, 주형 핵산의 서열을 결정하는 단계.
본원에 사용된 바와 같이, 어구 "복수의 폴리머라제 효소", "복수의 폴리머라제" 또는 이의 문법적 변이는 단일 서열분석 반응 혼합물에서 사용되는 폴리머라제 효소의 수를 지칭한다. "복수의 폴리머라제 효소"에서 폴리머라제의 양은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 200000, 300000, 400000, 500000, 600000, 700000, 800000, 900000, 및 적어도 1000000 개의 폴리머라제 효소로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 표적 핵산 주형을 연속적으로 서열분석하는 다른 구현예에서, 폴리머라제 대 주형의 비율은 적어도 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 100:1, 150:1, 200:1, 250:1, 300:1, 350:1, 400:1, 450:1, 500:1, 550:1, 600:1, 650:1, 700:1, 750:1, 800:1, 850:1, 900:1, 950:1, 1000:1, 10000:1, 20000:1, 30000:1, 40000:1, 50000:1, 60000:1, 70000:1, 80000:1, 90000:1, 100000:1, 200000:1, 300000:1, 400000:1, 500000:1, 600000:1, 700000:1, 800000:1, 900000:1, 및 적어도 1000000:1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 복수의 폴리머라제는 동일한 유형의 폴리머라제의 동종 집합일 수 있거나, 또는 2 개 이상의 상이한 유형의 폴리머라제, 예를 들어 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 최대 100 개 이상의 복수의 상이한 폴리머라제의 이종 집합일 수 있다.
일 구현예에서, 단일 서열분석 반응 혼합물은 그 안에 서열분석될 단지 하나(단일) 표적 주형 핵산을 갖는다. 다른 구현예에서, 단일 서열분석 반응 혼합물은 그 안에 서열분석될 하나 초과, 또는 다중, 또는 복수의 표적 주형 핵산을 갖는다. 특정 구현예에서, 하나의 표적 주형 핵산이 개별적인 광학 구속물로 제공된다.
본 발명의 FLASH 서열분석 방법의 일부 구현예에서, 효소 연결은 구속 영역에 하나의 주형 표적 핵산만이 있는 반면, 복수의(예를 들어, 많은) 폴리머라제 효소 및 연결을 형성하는 상응하는 복수의 다른 효소가 있도록, 특정 개별적인 구속물(예를 들어, 액적 등)로 제공된다(도 9). 이 구현예에서, 폴리머라제 효소가 표적 주형 핵산으로부터 떨어질 때(해리될 때)(도 11b), 특정 표적 핵산 주형 영역에 한정된 많은 복수의 다른 폴리머라제 중 하나가 이전에 폴리머라제가 중단되거나 또는 해리된 주형 상의 위치에서 유리하게 및 상대적으로 즉시 쇄 신장을 시작한다(도 11b). 다시 말해서, 서열분석 쇄 신장은 첫번째 폴리머라제 효소가 주형 핵산으로부터 분해되고 해리될 때까지 발생한 다음, 서열분석 쇄 신장 반응은 두번째 폴리머라제(첫번째와 상이함)가 주형 핵산 핵산으로부터 분해되고 해리될 때까지 계속된 다음, 서열분석 쇄 신장 반응은 세번째 폴리머라제(두번째 pol와 상이함; 이는 특정 서열분석 반응에서 첫번째 pol 또는 복수의 pol 중 또 다른 것일 수 있음)가 주형 핵산으로부터 분해되고 해리될 때까지 등 계속된다. 당업자는 이 접근법을 사용하여, 서열분석 반응이 실행되는 한 표적 핵산 주형이 연속적으로 서열분석되는 것을 쉽게 이해할 것이다. 당업자는 또한 본원에 개시된 실질적으로 연속적인 서열분석 방법을 사용할 때, 판독 길이가 표적 핵산의 길이 및/또는 각각의 쇄 신장 반응에 사용되는 반응 구속 영역의 물리적 크기에 의해서만 제한되는 것을 쉽게 이해할 것이다.
따라서, 본원에는 표적 핵산 주형을 연속적으로 서열분석하는 방법이 제공된다. 이 구현예에서, 본원에 사용된 바와 같이 "연속성", "표적 핵산 주형을 연속적으로 서열분석하는", 또는 "표적 핵산 주형을 실질적으로 연속적으로 서열분석하는"은 단일 폴리머라제가 전체 긴 판독 길이에 대해 특정 표적 핵산을 연속적으로 서열분석할 수 있음을 의미하는 것이 아니라, 표적 핵산 주형의 반응 영역에서 복수의 폴리머라제 효소가 이들 사이에서 함께 취해져서 이전에 폴리머라제가 특정 표적 핵산 주형으로부터 해리되는 곳으로부터 다음 뉴클레오티드에서 dNTP 쇄 신장을 취하는 데 이용가능한 수많은 폴리머라제를 연속적으로 갖는 복수의 폴리머라제 효소에 의해서 특정 표적을 연속적으로 서열분석할 수 있음을 의미한다.
본 발명의 연속 FLASH 서열분석 방법의 특정 구현예에서, 특히 복수의 폴리머라제가 단일 표적 주형 핵산을 서열분석하는 데 사용되는 경우, 전체 판독 길이는 특정 반응 구속 영역에 제공되는 표적 주형 핵산의 길이에 의해서만 제한된다. 예를 들어, 단일 표적 핵산 주형 상의 복수의 폴리머라제를 사용함으로써 달성될 수 있는 본원에서 고려되는 전체 판독 길이는 전체 염색체의 최대 길이, 예를 들어, 5천 만 내지 약 3억 개의 염기 쌍(예를 들어, 300Mbp) 등이다. 본원에서 고려되는 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 서열분석 방법에 의해 달성되는 판독 길이는 적어도 200bp, 300bp, 400bp, 500bp, 600bp, 700bp, 800, bp, 900bp, 1000bp(즉, 1kbp), 5kbp 10kbp, 20kbp, 30kbp, 40kbp, 50kbp, 100kbp, 200kbp, 300kbp, 400kbp, 500kbp, 600kbp, 700kbp, 800kbp, 900kbp, 1000kbp (1Mbp), 5Mbp, 10Mbp, 20Mbp, 50Mbp, 75Mbp, 100Mbp, 200Mbp, 300Mbp, 400Mbp, 500Mbp, 600Mbp, 700Mbp, 800Mbp, 900Mpb, 1000Mbp로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
복수의 폴리머라제에 의한 표적 주형 핵산의 실질적으로 연속적인 서열분석 때문에, 반응은 특정 판독 길이를 달성하는 단일 효소의 능력으로 제한되지 않는다. 이는 본 발명의 방법에서 더 높은 특이성 및 낮은 오류율을 갖는 효소의 사용을 허용한다. 본 발명의 FLASH 서열분석 방법의 특정 구현예에 따르면, 하나의 주형, 및 하나 초과의 폴리머라제(즉, 복수)를 사용하여 무한히 긴 판독-길이를 달성할 수 있음이 본원에서 고려된다. 본원에 제시된 바와 같이, 하나의 폴리머라제가 표적 주형 핵산에서 떨어지면, 또 다른 폴리머라제가 이전에 폴리머라제가 중단된 곳으로부터 계속될 것이며, 유리하게는 폴리머라제가 본 발명의 FLASH 서열분석 방법에서 수행하도록 선택되거나 또는 최적화될 수 있는 방식을 변경한다. 이러한 이유로, 폴리머라제가 또한 비교적 짧은 판독 길이를 가질 수 있을지라도, 당업자는 매우 낮은 오류율을 갖는 폴리머라제를 선택할 수 있다. 이는 본 발명의 서열분석 방법에 사용하기 위해 선택된 폴리머라제가 긴 판독 길이 및 특이성 둘 다를 필요로 하지 않는다는 점에서 이 특정 구현예에 대한 이점을 제공한다.
본원에 사용된 바와 같이, 어구 "주형 핵산" 또는 "표적 주형 핵산"은 이중 가닥 DNA, 단일 가닥 DNA, 단일 가닥 DNA 헤어핀, DNA/RNA 하이브리드, 중합제의 결합을 위한 인식 부위를 갖는 RNA, 및 RNA 헤어핀을 포함한 임의의 적합한 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 또한, 본 발명의 서열분석 방법에 사용하기 위한 주형 핵산으로 적합한 표적 폴리뉴클레오티드는 인트론, 조절 영역, 대립유전자, 변이체 또는 돌연변이와 같은 세포 게놈의 특정 부분; 전체 게놈; 또는 이의 임의의 부분일 수 있다. 다른 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 mRNA, tRNA, rRNA, 리보자임, 안티센스 RNA 또는 RNAi일 수 있다. 단일 폴리머라제만이 특정 표적을 서열분석하는 데 사용하기 위해 고려되는 다른 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 약 10 개 염기 내지 약 100,000 개 염기, 약 10,000 개 염기 내지 약 90,000 개 염기, 약 20,000 개 염기 내지 약 80,000 개 염기, 약 30,000 개 염기 내지 약 70,000 개 염기, 약 40,000 개 염기 내지 약 60,000 개 염기, 또는 그 이상과 같은 임의의 길이일 수 있으며, 전형적인 범위는 약 10,000 - 50,000 개 염기이다. 또한 이 특정 단일 폴리머라제 구현예에서, 약 100 개 염기 내지 약 10,000 개 염기의 표적 주형 핵산 길이가 본원에서 고려된다.
본 발명의 주형 핵산은 또한 PNA, 변형된 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 2'-O-메틸화 올리고뉴클레오티드와 같은 생물학적 RNA 또는 DNA에 전형적이지 않은 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드), 변형된 포스페이트 백본 등과 같은 비천연 핵산을 포함할 수 있다. 핵산은 예를 들어, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 어구 "뉴클레오티드 유사체"는 DNA 합성에 사용될 수 있는 변형된 뉴클레오티드(예를 들어, 변형된 dNTP 예컨대 dATP, dTTP, dGTP, dCTP 및 dUTP)를 지칭한다. 본 발명에 사용하기 위한 뉴클레오티드 유사체는 폴리머라제 및 선택적 절단 활성을 위한 기질이 될 수 있는 임의의 적합한 뉴클레오티드 유사체일 수 있다. 뉴클레오티드는 변형되고 여전히 폴리머라제 및 다른 효소를 위한 기질로서 사용될 수 있는 것으로 제시되었다. 뉴클레오티드 유사체의 변이체가 고려되는 경우, 폴리머라제 또는 엑소뉴클레아제 활성과 같은 또 다른 효소 활성과 뉴클레오티드 유사체의 호환성은 활성 검정에 의해 결정될 수 있다. 활성 검정을 수행하는 것은 간단하고 당업계에 널리 알려져 있다.
뉴클레오티드 유사체는 예를 들어, 성장 가닥으로 혼입 시 절단된 폴리포스페이트 쇄 부분 상에 표지를 갖는 폴리포스페이트 쇄에서 3 개 이상의 포스페이트를 갖는 뉴클레오시드 폴리포스페이트일 수 있다. 폴리포스페이트는 순수한 폴리포스페이트, 예를 들어 --O--PO3- 또는 피로포스페이트(예를 들어, PPi)일 수 있거나, 또는 폴리포스페이트는 치환을 포함할 수 있다. 유사체 및 이러한 유사체의 제조 방법에 관한 추가 세부사항은 미국 특허 제7,405,281호; 제9,464,107호 등에서 찾을 수 있으며; 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
대안적인 표지화 전략은 형광체 또는 발광체 나노입자와 같은 표지화 모이어티로서 무기 물질, 예를 들어 나노결정, 즉 나노규모 체제에서 반도체 구성 및 크기로 인해 고유한 형광체 능력을 보유하는 양자점을 이용할 수 있다(예를 들어, 미국 특허 번호 제6,861,155호, 제6,699,723호, 제7,235,361호 참조, 이들은 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함됨). 이러한 나노결정 물질은 일반적으로 예를 들어, Life Technologies, (캘리포니아주 칼스배드 소재)로부터 상업적으로 이용가능하다. 다시, 이러한 화합물은 개별적인 표지화 기 또는 예를 들어, 다른 무기 나노결정 또는 유기 형광단과의 상호작용 기 또는 쌍으로 존재할 수 있다. 일부 경우에 녹색 형광체 단백질(GFP, EGFP), 청색 형광체 단백질(EBFP, EBFP2, Azurite, mKalama1) 시안 형광체 단백질(ECFP, Cerulean, CyPet) 및 황색 형광체 단백질 유도체(YFP, Citrine, Venus, YPet)와 같은 형광체 단백질이 사용될 수 있다. 또한 Krutzek et al., Curr Protoc Cytom. 2011 January; CHAPTER: Unit-6.31. (doi:10.1002/0471142956.cy0631s55.)에 기재된 바와 같이, 검출을 위한 다중 색상 코딩된 신호를 생성하는 다중극 형광 염료를 사용하는 형광체 셀 바코딩이 본원에 사용하기 위해 고려되며; 상기 문헌은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
바람직한 구현예에서, 뉴클레오티드 유사체는 형광단을 말단 포스페이트에 첨가함으로써 변형되어(예를 들어, Yarbrough et al., J. Biol. Chem., 254:12069-12073, 1979 참조; 모든 목적을 위해 전문이 본원에 참조로 포함됨), PPi 표지된 이탈기(예를 들어, PPi + FL)가 뉴클레오티드 유사체가 주형 가닥에 혼입될 때 폴리머라제에 의해 생성되는 경우, 해당 표지된 피로포스페이트가 도 1b 및 1c에 도시된 바와 같이 ATP 술푸릴라제에 의해 아데노신 5' 포스포술페이트와 조합되어 표지된-ATP(ATP + FL)를 형성할 수 있도록 한다. 네 가지 유형의 dNTP, 즉 데옥시아데노신 트리포스페이트(dATP), 데옥시구아노신 트리포스페이트(dGTP), 데옥시시티딘 트리포스페이트(dCTP), 및 데옥시티미딘 트리포스페이트(dTTP)가 있다. dATP 대신에, dATPαS는 DNA 폴리머라제에 대한 기질로서 작용하지만 루시퍼라제에 대해 작용하지 않으므로 dATP에 대한 대체물로서 사용될 수 있다. 본원에 개시된 본 발명의 방법의 바람직한 구현예에서, 폴리머라제가 변형된 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트(dNTP) 뉴클레오티드 유사체를 주형 DNA에 상보적인 가닥에 혼입할 때마다, 부착된 뉴클레오티드의 클래스 또는 유형에 특이적인 형광 신호(예를 들어, dATP, dATPαS, dTTP, dGTP 및 dCTP, 또는 당업계에 널리 알려진 변형된 뉴클레오티드 각각에 대한 고유한 신호)가 생성되도록 각각의 dNTP 각각은 다른 dNTP에 비해 상이한 고유한 형광단을 사용하여 변형된다. 본원에 사용하기 위해 고려되는 다른 변형된 뉴클레오티드는 Jordheim et al., Advances in the development of nucleoside and nucleotide analogues for cancer and viral diseases, Nat. Rev. Drug Discov. (2013) 12: 447-464; 및 Guo et al. Four-color DNA terminators with 3'-O-modified nucleotide reversible terminators and chemically cleavable fluorescent dideoxynucleotides, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2008) 105:9145-9150 등(각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 것들과 같이 당업계에 널리 알려져 있다.
특정 구현예에서, 본원에 사용하기 위한 예시적인 뉴클레오티드 유사체, 또는 표지된 dNTP는 하기를 포함한다:
감마-(6-아미노헥실)-2'-데옥시아데노신-5'-트리포스페이트, ATTO680, 트리에틸암모늄으로 표지됨;
감마-(6-아미노헥실)-2'-데옥시시티딘-5'-트리포스페이트, ATTO680, 트리에틸암모늄 염으로 표지됨;
감마-(6-아미노헥실)-2'-데옥시티미딘-5'-트리포스페이트, ATTO680, 트리에틸암모늄 염으로 표지됨;
감마-[(6-아미노헥실)이미도]-dGTP - ATTO-647N;
감마-[(6-아미노헥실)이미도]-dGTP - Cy5;
감마-(6-아미노헥실)-dGTP - Cy5;
감마-(6-아미노헥실)-2'-데옥시티미딘-5'-트리포스페이트, Alexa700, 트리에틸암모늄 염으로 표지됨;
감마-(6-아미노헥실)-2'-데옥시아데노신-5'-트리포스페이트, Alexa660, 트리에틸암모늄 염으로 표지됨;
감마-(6-아미노헥실)-2'-데옥시티미딘-5'-트리포스페이트, ATTO700, 트리에틸암모늄 염으로 표지됨 등.
또 다른 구현예에서, dATPαS, dGTPαS, dCTPαS, dTTPαS는 dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP 대신에 사용되며, 이는 뉴클레오티드와 폴리머라제 이외의 효소(예를 들어, 루시퍼라제)의 비특이적 상호작용을 감소시키기 위해 본원에서 고려된다.
각 뉴클레오티드는 폴리머라제 효소에 의해 상보적 가닥에 부착되어 있는 동안 고유한 형광 신호(예를 들어, 적색, 황색, 녹색, 또는 청색 등)를 효과적으로 생성한다. 뉴클레오티드 유사체가 이전에 부착된 뉴클레오티드 유사체의 3' 모이어티에 부착이 완료되면, 후속 표지된-ATP 및 발광 반응의 결과로서 표지된 피로포스페이트 이탈기에 의해 생성된 형광(예를 들어, 형광체 피로포스페이트; PPi + FL)은 각각의 발광 반응의 신중하고 제한된 기간 동안 적절한 형광 센서 및/또는 검출 장치에 의해 검출된다(도 1f).
본원에 제공된 본 발명의 연결된 3-효소 시스템 및 폴리머라제-ATP 술푸릴라제-루시퍼라제의 방법을 사용하여, 특정 유형의 뉴클레오티드를 나타내는 특정 신호는 뉴클레오티드와 폴리머라제-ATP 술푸릴라제-루시퍼라제의 특이적 상호작용 동안에만 생성될 것이다. 폴리머라제 전후 상호작용 상태는 유사할 것이며; 신호는 폴리머라제와의 상호작용 동안 "변화"할 것이다. 예를 들어, 본원에 기재된 일 구현예에서:
1- 초기에는 외부 광 여기가 없기 때문에, 배경 형광이 없거나 또는 매우 낮다.
2- 본 발명의 방법의 폴리머라제-ATP 술푸릴라제-루시퍼라제 상호작용 동안, 특이적 유형의 형광이 생성된다.
3- 각각의 발광 반응이 중단된 후 표지된 피로포스페이트 신호(PPi + FL)는 초기 상태로 돌아간다.
본원에 사용된 바와 같이, 어구 "표지된 이탈기"는 그 안에 부착된 표지, 예를 들어, 형광단 등을 갖는 폴리포스페이트 쇄를 지칭하며, 이는 각각의 dNTP가 주형 핵산 가닥에 혼입되는 동안 본 발명의 3 효소 폴리머라제-ATP 술푸릴라제-루시퍼라제 반응에 의해 절단될 때 및/또는 절단 시 각각의 dNTP로부터 방출된다. 본원의 특정 구현예에서, 폴리포스페이트는 dNTP로부터 절단되고(도 1a 및 1b), 표지된 ATP로 전환된 다음(ATP+FL; 도 1b 및 1c) 후속적으로 본원에 제시된 바와 같이 각각의 신중한 제한된 기간 발광 반응의 종결 전에 후속 형광 검출을 위한 루시퍼라제 반응을 통해 반응 혼합물로 방출된(도 1d-1f) 형광으로 표지된 피로포스페이트(PPi + FL)이다(도 1f 참조).
본원에 제시된 바와 같이, 이 형광으로 표지된 피로포스페이트(PPi + FL)는 도 1g에 도시된 Pi+Fl 및 Pi로 전환(분해)되기 전에, ATP 술푸릴라제/루시퍼라제 증폭 루프에서 여러 번 도 1b로 여러 번 반복될 수 있다. 형광으로 표지된 피로포스페이트(PPi + FL)가 반복되어 각 dNTP를 신장 서열로 혼입하기 위한 각각의 형광 신호를 증폭시킬 수 있는 횟수는 적어도 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 200000, 300000, 400000, 500000, 600000, 700000, 800000, 900000, 및 적어도 1000000 회로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
사용되는 반응 조건은 또한 다양한 반응의 상대 속도에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 반응 조건을 제어하는 것은 서열분석 방법이 주형 내에서 높은 속도로 성공적으로 염기를 호출하도록 하는데 유용할 수 있다. 반응 조건은 예를 들어, 완충제 유형 및 농도, 반응 pH, 온도, 염 유형 및 농도, 효소 동역학에 영향을 미치는 특정 첨가제의 존재, 및 금속 보조인자를 포함한 다양한 보조인자의 유형, 농도, 및 상대량을 포함한다. 폴리머라제의 두 가지 느린-단계 거동을 달성하거나 또는 향상시키기 위한 반응 조건의 조작은 본원에 참조로 포함된 미국 특허 제8,133,672호에 상세히 기재되어 있다.
효소적 반응은 종종 부분적으로 반응 혼합물의 pH를 제어하기 위해 사용되는 완충제의 존재 하에 실행된다. 완충제 유형은 일부 경우에 폴리머라제 반응의 동역학이 바람직할 때, 두 가지 느린-단계 동역학으로 이어질 수 있는 방식으로 이러한 동역학에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 완충제로서 IRIS의 사용은 두 가지 느린-단계 반응을 수득하는 데 유용하다. 적합한 완충제는 예를 들어, TAPS(3-{[트리스(히드록시메틸)메틸]아미노}프로판술폰산), 비신(N,N-비스(2-히드록시에틸)글리신), IRIS(트리스(히드록시메틸)메틸아민), ACES(N-(2-아세트아미도)-2-아미노에탄술폰산), 트리신(N-트리스(히드록시메틸)메틸글리신), HEPES 4-2-히드록시에틸-1-피페라진에탄술폰산), TES(2-{[트리스(히드록시메틸)메틸]아미노}에탄술폰산), MOPS(3-(N-모르폴리노)프로판술폰산), PIPES(피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰산)), 및 MES(2-(N-모르폴리노)에탄술폰산)을 포함한다.
반응 pH는 폴리머라제 반응의 동역학에 영향을 미칠 수 있고, 폴리머라제 반응 조건 중 하나로서 사용되어 두 가지 느린-단계 동역학을 나타내는 반응을 수득할 수 있다. pH는 두 가지 느린-단계 반응 메커니즘을 생성하는 값으로 조정될 수 있다. pH는 일반적으로 약 6 내지 약 9이다. 일부 구현예에서, pH는 약 6.5 내지 약 8.0이다. 다른 구현예에서, pH는 약 6.5 내지 7.5이다. 특정 구현예에서, pH는 약 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 또는 7.5로부터 선택된다.
반응 온도는 반응의 상대 속도가 적절한 범위에서 발생하도록 조정될 수 있다. 반응 온도는 폴리머라제의 유형 또는 이용되는 선택적 절단 활성에 따를 수 있다. 본원에서 사용되는 온도는 또한 반응 혼합물 중 물과 염기의 상호작용 뿐만 아니라 2 개의 염기 사이의 수소 결합을 조작 및 제어하여, 이에 의해 반응 성분의 용해도를 제어하는 것이 고려된다.
일부 구현예에서, 마그네슘, 코엔자임 A 등과 같은 첨가제는 반응의 동역학에 영향을 미칠 반응 혼합물에 첨가될 수 있다. 일부 경우에, 첨가제는 효소의 활성 부위와 상호작용하여, 예를 들어 경쟁 억제제로서 작용할 수 있다. 일부 경우에, 첨가제는 반응의 동역학에 영향을 미치는 방식으로 활성 부위로부터 떨어진 효소 부분과 상호작용할 수 있다. 동역학에 영향을 미칠 수 있는 첨가제는 예를 들어, 전체 개시내용이 모든 목적을 위해 전문이 본원에 참조로 포함된 미국 실용 특허 제8,252,911호에 기재된 바와 같이, 경쟁적이지만 그렇지 않으면 분석 반응에서 반응 속도를 조절하기 위한 비반응성 기질 또는 억제제를 포함한다.
또 다른 예로써, 중수소와 같은 동위원소가 첨가되어 폴리머라제 반응에서 하나 이상의 단계 속도에 영향을 미칠 수 있다. 일부 경우에, 중수소는 중수소 동위원소 효과로 인해 폴리머라제 반응에서 하나 이상의 단계를 늦추기 위해 사용될 수 있다. 폴리머라제 반응 단계의 동역학을 변경시킴으로써, 일부 경우에 본원에 기재된 바와 같이, 두 가지 느린 단계 동역학이 달성될 수 있다. 예를 들어, 중수소 동위원소 효과를 사용하여 예를 들어, 혼입 속도를 늦춤으로써 뉴클레오티드의 혼입 속도를 제어할 수 있다. 중수소 이외의 동위원소, 예를 들어, 탄소(예를 들어 13C), 질소, 산소, 황, 또는 인의 동위원소가 또한 이용될 수 있다.
또 다른 예로써, 폴리머라제 반응의 동역학을 제어하는 데 사용될 수 있는 첨가제는 유기 용매의 첨가를 포함한다. 용매 첨가제는 일반적으로 수용성 유기 용매이다. 용매는 모든 농도에서 용해될 필요는 없지만, 일반적으로 폴리머라제 반응의 동역학을 제어하는 데 사용되는 양으로 용해된다. 이론에 얽매이지 않지만, 용매는 폴리머라제 반응에서 다양한 단계의 속도에 영향을 미칠 수 있는 폴리머라제 효소의 3차원 형태에 영향을 미칠 수 있는 것으로 여겨진다. 예를 들어, 용매는 이성질체화 단계와 같은 형태 변화를 수반하는 단계에 영향을 미칠 수 있다. 첨가된 용매는 또한 전좌 단계를 영향을 미칠 수 있고, 일부 경우에 느려질 수 있다. 일부 경우에, 용매는 수소 결합 상호작용에 영향을 미침으로써 작용한다.
단일 분자 서열분석에서 폴리머라제 반응의 하나 이상의 단계 속도를 제어하는 데 사용될 수 있는 수호환성 유기 용매는 예를 들어, 알코올, 아민, 아미드, 니트릴, 술폭시드, 에테르, 및 에스테르 및 이들 작용기 중 하나 초과를 갖는 소분자를 포함한다. 예시적인 용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 글리세롤, 및 작은 알코올과 같은 알코올을 포함한다. 알코올은 1, 2, 3 개, 또는 그 이상의 알코올 기를 가질 수 있다. 예시적인 용매는 또한 테트라히드로푸란(THF) 및 디옥산, 디메틸아세트아미드(DMA), 디메틸술폭시드(DMSO), 디메틸포름아미드(DMF), 및 아세토니트릴과 같은 소분자 에테르를 포함한다.
수호환성 유기 용매는 폴리머라제 반응의 동역학을 제어하기에 충분한 임의의 양으로 존재할 수 있다. 용매는 일반적으로 용매 중량 기준 또는 부피 기준 40% 미만의 양으로 첨가된다. 일부 구현예에서 용매는 약 0.1% 내지 30%, 약 1% 내지 약 20%, 약 2% 내지 약 15%, 및 약 5% 내지 12%로 첨가된다. 동역학을 제어하는데 효과적인 양은 본원에 기재된 방법 및 당업계에 알려진 방법에 의해 결정될 수 있다.
폴리머라제 반응 조건을 제어하는 또 다른 측면은 보조인자의 유형, 수준, 및 상대량의 선택에 관한 것이다. 예를 들어, 폴리머라제 반응 과정 동안, 마그네슘 또는 망간과 같은 2가 금속 보조인자는 효소-기질 복합체와 상호작용하여, 활성 부위를 한정하는 데 구조적 역할을 할 것이다. 폴리머라제 반응에서 금속 보조인자 상호작용의 논의를 위해, 예를 들어, Arndt, et al., Biochemistry (2001) 40:5368-5375를 참조한다. 적합한 조건은 모든 목적을 위해 전문이 본원에 참조로 포함된 미국 특허 제8,257,954호에 기재된 것들을 포함한다.
본 발명의 방법의 특정 구현예에서, 폴리머라제 반응의 속도 및 충실도는 폴리머라제가 기질 농도, 광학 여기의 양, 화학적 변형의 수준과 같은 매개변수 측면에서 거의 이상적인 조건에서 작동하도록 dNTP 뉴클레오티드 유사체의 농도를 조정함으로써 제어된다. 따라서, 폴리머라제 효소는 자연 설정에서 달성된 DNA 합성 길이와 유사한 최대 판독-길이, 예를 들어 대략적으로 수만 개의 염기 쌍에 도달하는 것이 본원에서 고려된다. 이는 장치 복잡성을 감소시키고 효소적 민감도 및 특이성을 증가시켜 오류율을 낮추고 따라서 적용범위를 낮춘다. 이는 장치 비용 뿐만 아니라 게놈 당 비용을 감소시킬 뿐만 아니라, 단일-뉴클레오티드 중합 검출, 구조적 변이, 및 게놈 어셈블리와 같은 적용을 매우 컴팩트한 시스템에서 가능하게 만든다.
또 다른 구현예에서, 상기 제시된 바와 같이, 표지된-ATP 효소(예를 들어, ATP 술푸릴라제) 및 폴리머라제 속도는 효소의 유형 및 공급원에 따라 유의하게 달라질 수 있기 때문에, 본원에서 이용되는 ATP 술푸릴라제 반응에 의한 표지된-ATP 생산 속도는 ATP 술푸릴라제 농도와 같은 반응 조건을 조정함으로써 별도로 조정될 수 있다.
본 발명은 핵산 주형의 서열분석을 위한 시스템을 포함한다. 시스템은 복수의 핵산 주형을 동시에 서열분석한다. 시스템은 본원에 기재된 시약 및 방법 모두를 혼입할 수 있고, 샘플을 함유하고, 샘플을 발광 반응으로부터의 여기 광으로 발광하고, 서열분석 동안 샘플로부터 방출된 광을 검출하여 각각의 dNTP가 폴리머라제에 의해 동계 주형 dna 위에 혼입될 때 표지된-ATP 유사체; 및 각각의 표지된 이탈기, 예를 들어, 형광단-표지된 피로포스페이트로부터 절단된 표지된 이탈기(예를 들어, PPi + FL)로부터 강도 대 시간 데이터를 생성하여, 순차적인 강도 대 시간 데이터를 사용하여 주형의 서열을 결정하는데 필요한 계측기를 제공한다.
본원에 사용된 바와 같이, 어구 "광을 검출하는"은 예를 들어, 형관단 표지가 각각의 신호를 방출하는 여기 상태에 있을 때 이러한 표지로부터 방출된 형광을 검출하는 널리 알려진 방법을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "피로포스파타제 효소"는 피로포스페이트를 2 개의 포스페이트 이온으로 가수분해하는 것을 촉매하는 데 책임이 있는 널리 알려진 단백질을 지칭한다. 본원에 사용하기 위한 예시적인 피로포스파타제 효소는 US 5,843,665에 기재된 인간 피로포스파타제; 및 Yang, Z and Wensel, T G(1992) J Biol Chem 267: 24634-40, 24641-7에 기재된 소 피로포스파타제이며; 각각 그 전문이 참조로 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "ATP 재생 효소/루시퍼라제 루프" 또는 이의 문법적 변이(예를 들어, ATP 술푸릴라제/루시퍼라제 루프, AGPPase/루시퍼라제 루프, PPDK/루시퍼라제 루프 등)는 일반적으로 ATP 재생 효소 및 루시퍼라제 사이의 효소적 루프를 지칭하며(도 1b-1g), 루시퍼라제에 의해 촉매된 발광체 반응 후 부착된 형광체 표지(PPi+FL)를 여전히 갖는 새로운 피로포스페이트 분자가 방출된다(도 1f). 이 새롭게 방출된 PPi-FL은 다시 한 번 ATP 재생 효소(예를 들어, ATP 술푸릴라제, AGPPase, PPDK 등)에 대한 기질일 수 있으며 이에 의해 ATP 재생 효소(예를 들어, ATP 술푸릴라제, AGPPase, PPDK 등) 및 루시퍼라제 사이에 효소적 루프를 생성한다(도 1g.상단). 도 1b-1g에 도시된 바와 같이, 이 루프와 함께 PPi+FL은 ATP 술푸릴라제에 의해 재순환되고 형광으로 표지된 ATP(ATP-FL)로 전환된 다음, PPi-FL을 방출하는 루시퍼라제에 의해 촉매될 수 있다. 이는 표지된 피로포스페이트로부터 연속적인 신호를 생성하고, 이에 의해 가장 최근의 뉴클레오티드에 대한 서열분석 신호의 증폭 메커니즘으로서 역할을 할 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "공동-캡슐화된", 캡슐화하다 또는 이의 문법적 변이는 루시퍼라제 및 피로포스파타제(무기)와 같은 2 개 이상의 효소가 본원에 제시된 다공성 나노매트릭스와 같은 캡슐(예를 들어, 나노매트릭스 또는 나노입자)에 혼입되는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "나노매트릭스"는 한정된 공간 내에서 효소 및 반응물을 캡슐화할 수 있는 밀폐된 구조를 형성하는 생체적합성 또는 중합체 물질로 전형적으로 구성된 나노규모 코팅, 구조 또는 용기를 지칭한다. 나노매트릭스는 모든 분자를 투과할 수 없지만, 대신에 원하는 분자의 하위세트만이 벽 또는 막을 통과할 수 있다. 예를 들어, 나노매트릭스는 특정 반응이 특정 효소를 캡슐화하는 나노매트릭스 내에서만 발생할 수 있도록 효소를 반응 혼합물 내의 특정 공간에 한정한다. 일 구현예에서, 캡슐화된 효소는 루시퍼라제 및 피로포스파타제(예를 들어, 무기 등)이다. 본원에 사용하기 위한 예시적인 나노매트릭스는 예를 들어, US 201/0067191A1 및 Zhou et al., Acta Pharmaceutica Sinica B (2018), www//dli.org/10/1016/j.apsb.2018.01.007에 제시되고; 나노입자(예를 들어, 다공성 실리카 나노입자) 등을 포함한다. 나노매트릭스 및/또는 나노입자는 US 2016/0067191A1에 기재된 바와 같이 전하를 옮길 수 있으며, 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 일 구현예에서, 나노매트릭스는 음으로 하전된 나노입자이다.
일 구현예에서, 서열분석을 위한 시스템은 일반적으로 예를 들어, 고유한 액적 등 내에서 복수의 단일 폴리머라제 효소, 단일 주형, 또는 단일 프라이머를 갖는 기질을 포함한다. 고도로 진행적인 효소 폴리머라제 반응의 경우, 폴리머라제 효소, 핵산 주형, 및 프라이머를 포함하는 각각은 유전자 합성이 발생할 때 신호가 각각의 뉴클레오티드에 할당될 수 있도록 고유하게 한정된다. 본원에 제공되는 다른 구현예에서 복수의 폴리머라제 효소는 예를 들어, 고유한 구속물, 액적 등 내에서 단일 주형 및/또는 단일 프라이머와 함께 사용될 수 있다. 서열분석 시약은 일반적으로 dATP, dTTP, dAGP 및 dCTP에 상응하는 2 개 이상의 유형의 뉴클레오티드 유사체, 바람직하게는 4 개의 뉴클레오티드 유사체를 포함하며, 각 뉴클레오티드 유사체는 상이한 표지로 표지된다. 폴리머라제는 순차적으로 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체를 성장 가닥에 순차적으로 첨가하여, 프라이머로부터 연장된다. 각각 첨가된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체는 생성되는 성장 가닥의 일부가 주형에 상보적이도록 주형 핵산에 대한 상응하는 염기에 상보적이다.
시스템은 도 1b-1f에 제시된 바와 같이 주형 가닥에 혼입되고 표지된-ATP 반응(ATP-술푸릴라제를 통해) 및 발광 반응(예를 들어, 반딧불이 루시퍼라제 + 루시페린)을 추가로 겪을 때 각각의 dNTP로부터 표지된 피로포스페이트 이탈기를 발광하기 위한 발광 시약(예를 들어, 반딧불이 루시퍼라제 및 루시페린)을 포함한다. 발광 반응은 절단된 표지된 피로포스페이트(더이상 표지된 ATP에 결합되지 않음) 상의 표지를 여기할 파장 범위에서 각각의 표지된 이탈기를 발광한다(도 1e 및 1f 참조).
시스템은 주형 가닥에 폴리머라제 효소 매개 첨가 동안 각각의 표지된-ATP(ATP +FL; 각각의 dNTP에 상응)로부터 절단된 표지된 이탈기로부터 신호를 관찰하기 위한 검출 광학을 추가로 포함한다. 검출 광학은 복수의 단일 분자 폴리머라제 서열분석 반응을 동시에 관찰하여, 본 발명의 연결된 3 효소(폴리머라제-ATP 술푸릴라제-루시퍼라제) 시스템에서 표지된-ATP로부터 궁극적으로 절단된 표지된 이탈기(예를 들어, 형광단-표지된 피로포스페이트; PPi)를 통해 각각에 대한 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체 첨가를 관찰한다. 관찰된 단일 분자 폴리머라제 서열분석 반응 각각에 대해, 검출 광학은 동시에 각각의 dNTP에 상응하는 각각의 발광 반응에 의해 여기된 각각의 형광단-표지를 나타내는 표지된 이탈기 각각으로부터 신호를 동시에 관찰하며, 각각의 신중하고 제한된 기간까지, 각각의 신호는 각각의 발광(예를 들어, 루시퍼라제/루시페린) 반응으로부터 발광체 신호의 하락 및 종결로 인해 중단된다.
시스템은 또한 각각의 이탈기로부터 관찰된 신호를 사용하여 성장 가닥에 첨가된 뉴클레오티드 유사체 유형을 결정하도록 구성된 컴퓨터를 포함하며; 표지된 이탈기로부터 관찰된 신호를 사용하여 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체 유형이 성장 가닥에 혼입되는지 여부를 나타낸다. 컴퓨터는 일반적으로 신호 데이터의 형태로 검출 광학으로부터 관찰된 신호에 관한 정보를 수신한다. 컴퓨터는 염기 호출 서열을 생성하기 위해 신호 데이터를 사용하여, 신호 데이터를 저장, 처리, 및 해석한다. 염기 호출은 서열 결정을 보조하기 위해 컴퓨터에 주어진 다른 정보화 조합된 수신된 신호 데이터로부터 주형 서열의 컴퓨터 추정치를 나타낸다.
본 발명과 함께 사용될 수 있는 광학 검출 시스템은 예를 들어 미국 특허 제8,802,424호; 제7,714,303호; 및 제7,820,983호에 기재되어 있으며, 각각은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 프로세스를 수행하는 데 사용하기 위한 컴퓨터는 Intel Pentium 또는 DuoCore 프로세서를 실행하는 PC 또는 Macintosh.RTM. 유형 컴퓨터와 같은 개인용 컴퓨터부터, UNIX, LINUX, Windows.RTM., 또는 다른 시스템을 실행하는 워크스테이션, 실험실 장비, 또는 고속 서버까지 다양할 수 있으며, 본 발명의 로직(Logic) 처리는 소프트웨어 및/또는 펌웨어 로직 명령을 실행하는 범용 로직 프로세스(예컨대 CPU)에 의해 전적으로; 또는 소프트웨어 또는 펌웨어 요소를 또한 포함할 수 있는 실험실 또는 진단 시스템 또는 카메라 시스템에 혼입되는 특용 로직 처리 회로(예컨대 ASIC)에 의해 전적으로; 또는 범용 및 특용 로직 회로의 조합에 의해 수행될 수 있다. 신호 데이터에 대한 데이터 포맷은 JPEG, GIF, BMP, TIFF와 같은 디지털 이미지 기반 데이터 포맷, 또는 "fastq" 또는 "qseq" 포맷(Illumina)을 포함한 다른 서열분석 특이적 포맷을 포함한 임의의 편리한 포맷을 포함할 수 있는 반면; avi, mpeg, mov, rmv과 같은 비디오 기반 포맷, 또는 다른 비디오 포맷이 이용될 수 있다. 본 발명의 소프트웨어 프로세스는 일반적으로 예를 들어, Matlab, C, C++, C#, NET, Visual Basic, Python, JAVA, CGI 등을 포함한 다양한 프로그래밍 언어로 프로그래밍될 수 있다.
본 발명의 방법 및 시스템의 일부 구현예에서, 광학 구속물을 사용하여 동시에 다중 단일 분자 폴리머라제 서열분석 반응을 함께 관찰하는 능력을 향상시킨다. 일반적으로, 광학 구속물은 기질 상에 배치되고 전자기 복사를 제공하거나 또는 매우 작은 공간 또는 부피에서만 이러한 복사를 유도하는 데 사용된다. 이러한 광학 구속물은 구조적 구속물, 예를 들어, 벽, 오목부, 도관 등을 포함할 수 있거나, 또는 매우 작은 부피에서만 검출을 제공하거나 또는 방출된 복사를 유도하기 위해 다른 성분과 함께 광학 프로세스를 포함할 수 있다. 이러한 광학 구속물의 예는 예를 들어, 기질 내에서 전반사를 생성하는 각도에서 기질의 투명한 부분을 통해 광이 유도되는 전반사(TIR) 기반 광학 시스템을 활용하는 시스템을 포함한다.
특정 구현예에서, 바람직한 광학 구속물은 본원에 제시된 개별적인 서열분석 반응을 함유할 수 있는 미세액적(예를 들어, 유중수 에멀젼 등)이다. 예를 들어, 서열분석 혼합물 반응 성분은 각 미세액적이 효소의 하나의 폴리머라제-ATP 술푸릴라제-루시퍼라제 세트 및 각 신호 검출 단위가 단일 미세액적에 집중되는 관련 시약 및 하나의 주형 핵산을 함유하는 방식으로 스플릿될 수 있다. 각 미세액적은 개별적인 단일 분자 서열분석 반응을 함유하는 단일 분자 반응 셀임이 본원에 고려된다. 미세액적 반응 셀은 또한 유리하게는 광을 각각의 신호 검출 단위에 집중시키기 위한 마이크로 렌즈로서 작용하기 위해 본 발명의 서열분석 방법에서 유용하다.
본 발명의 기질은 일반적으로 단단하고, 종종 평면이지만, 어느 하나일 필요는 없다. 기질이 광학 구속물의 어레이를 포함하는 경우, 기질은 일반적으로 광학 계측기와 인터페이스로 접속하여 광학 구속물로부터 조명 및 광 측정을 허용할 수 있는 크기 및 형상의 것일 수 있다. 전형적으로, 기질은 또한 광학 측정을 위해, 예를 들어 시약 및 기질 및/또는 형광단-표지된 피로포스페이트와 같은 표지된 성분을 함유하는 액체 매질과 접촉하여 유지되도록 구성될 것이다.
구속 영역에서 본 발명의 서열분석 혼합물의 성분을 제공하기 위한 예시적인 구현예는 많은 다른 구성 중에서, 도 9-13에 도시된 것들을 포함한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 각 표적 핵산 주형은 개별적인 각각의 신호 검출기의 표면에 결합된다. 일 구현예에서, 핵산 주형은 예를 들어, 금 표면에 대한 티올 결합 등을 통해 당업계에 널리 알려진 수많은 방법을 사용하여 표면 또는 고체 기질에 직접 결합되거나 또는 부착될 수 있다(도 10b). 다른 구현예에서, DNA 주형은 실란, NHS 에스테르 등을 통해 각각의 표면에 직접 결합되거나 또는 부착될 수 있다. 다른 구현예에서, 서열분석을 위한 프라이머는 개별적인 각각의 신호 검출기의 표면에 결합될 수 있다(도 10a). 본원에 제시된 바와 같이, 각 부착은 개별적인 신호 검출기의 표면 상에 있을 수 있다. 예시적인 신호 검출기가 본원에 기재되었으며, CCD, CMOS 센서의 픽셀일 수 있거나, 또는 광검출기, 또는 어레이를 형성하는 광전자 배전관 등일 수 있다.
기질이 광학 구속물의 어레이를 포함하는 경우, 어레이는 기질의 표면 상에 광학 구속물의 단일 행 또는 복수의 행을 포함할 수 있으며, 여기서 복수의 렌즈가 존재할 때, 렌즈의 수는 흔히 적어도 2 개, 보다 흔히 10 개 초과, 및 보다 흔히 100 개 초과일 것이다. 광학 구속물의 대상 어레이는 기질의 x-축 또는 y-축에 대해 수평으로 또는 대각선으로 길게 정렬될 수 있다. 개별적인 구속물은 격자를 형성하거나, 또는 원형, 타원형, 계란형, 원뿔형, 직사각형, 삼각형, 또는 다면체 패턴을 형성하기 위한 행 및 열에서와 같이 기질의 표면을 가로지르거나 또는 이에 걸쳐 임의의 포맷으로 어레이될 수 있다. 인접한 광학 구속물 사이의 가장 가까운 이웃 거리를 최소화하기 위해, 때때로 육각형 어레이가 바람직하다.
광학 구속물의 어레이는 마이크로타이어 플레이트 등과 같이, 분석의 용이성, 높은 처리량, 또는 다른 이점을 제공하는 구조로 혼입될 수 있다. 이러한 설정은 또한 "어레이의 배열"로서 본원에 언급된다. 예를 들어, 대상 어레이는 마이크로타이터 플레이트와 같은 다른 어레이에 혼입될 수 있으며 여기서 플레이트의 각 마이크로 웰은 광학 구속물의 대상 어레이를 함유한다.
본 발명에 따르면, 구속물(예를 들어, 반응 셀, 미세액적 등)의 어레이는 단일 기질 상에 100 개 초과, 1000 개 초과, 10,000 개 초과, 100,000 개 초과, 또는 1,000,000 개 초과의 별개의 반응 셀(예컨대 미세액적 등)의 어레이로 제공된다. 또한, 반응 셀 어레이는 전형적으로 기질의 표면 상에 상대적으로 높은 밀도로 구성된다. 이러한 높은 밀도는 전형적으로 mm2 당 10 개 초과의 반응 셀, 바람직하게는 기질 표면적의 mm2 당 100 개 초과의 반응 셀, 및 보다 바람직하게는, mm2 당 500 개 초과 또는 심지어 1000 개의 반응 셀 및 많은 경우에 mm mm2 당 최대 또는 100,000 개 초과의 반응 셀의 밀도로 존재하는 반응 셀을 포함한다. 많은 경우에, 어레이에서 반응 셀은 규칙적 패턴, 예를 들어, 주어진 어레이에서 규칙적으로 이격된 반응 셀의 2, 5, 10, 25, 50 또는 100 개 또는 그 이상의 행 및/또는 열로 이격되어 있지만, 특정 바람직한 경우에, 표준 행 및/또는 열 포맷에서 벗어나는 어레이에서 반응 셀의 조직을 제공하는 이점이 있다. 바람직한 측면에서, 기질은 기질 상의 별개의 단일 분자 서열분석 반응 영역을 정의하기 위한 광학 구속물로서 특정 반응 셀 미세액적을 포함한다.
광학 구속물의 어레이의 전체 크기는 일반적으로 수 나노미터 내지 수 밀리미터 두께, 및 수 밀리미터 내지 50 센티미터 너비 및/또는 길이 범위일 수 있다. 어레이는 약 수백 미크론 내지 수 밀리미터 두께로 전체 크기를 가질 수 있고 원하는 광학 구속물의 수에 따라 임의의 너비 또는 길이를 가질 수 있다.
개별적인 구속물 사이의 간격은 대상 어레이가 이용될 특정 적용을 지원하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 의도된 적용이 광학 구속물로부터 입사 파장의 회절 산란 없이 또는 낮은 수준의 회절 산란으로 어레이의 암시야 조명을 필요로 하는 경우, 개별적인 구속물은 입사 파장 대비 서로 가깝게 배치될 수 있다.
어레이에서 개별적인 구속물은 약 1000 제토리터(zeptoliter) 미만, 약 900 미만, 약 200 미만, 약 80 미만, 약 10 제토리터 미만의 효과적인 관찰 부피를 제공할 수 있다. 바람직한 경우, 1 제토리터 미만의 효과적인 관찰 부피가 제공될 수 있다. 바람직한 측면에서, 개별적인 구속물은 생리학적으로 관련된 농도로 또는 근접하여 존재하는 효소와 같은 개별적인 분자의 해상도를 허용하는 효과적인 관찰 부피를 생성한다. 많은 생화학적 반응에 대한 생리학적으로 관련된 농도는 마이크로몰 내지 밀리몰 범위인데, 대부분의 효소가 이 범위에서 미카엘리스(Michaelis) 상수를 갖기 때문이다. 따라서, 광학 구속물의 바람직한 어레이는 약 1 마이크로몰(uM)보다 더 높은 농도, 또는 보다 바람직하게는 50 uM 보다 더 높은 농도, 또는 심지어 100 uM보다 더 높은 농도로 존재하는 개별적인 분자를 검출하기 위한 효과적인 관찰 부피를 갖는다. 특정 구현예에서, 전형적인 미세액적 크기는 10 마이크로미터 내지 200 마이크로미터 범위이며, 따라서 전형적인 미세액적 부피는 약 5 피코리터 내지 20 나노리터이다.
광학 구속물 내에서 화학적 또는 생화학적 분석의 맥락에서, 관심있는 반응이 구속물의 광학적으로 조사된 부분 내에서 최소한으로 발생하고, 바람직하게는 단일 분자 폴리머라제 서열분석 반응의 반응만이 개별적인 구속물의 조사된 부분 내에서(예를 들어, 미세액적 등 내에서) 발생하도록 보장하는 것이 일반적으로 바람직하다. 당업계에 널리 알려진 다수의 방법은 일반적으로 관찰 부피 내에서 개별적인 분자를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 이들 중 다양한 것은 모든 목적을 위해 전문이 본원에 참조로 포함된 미국 특허 제7,763,423호에 기재되어 있으며, 대략적으로 1, 2, 3 개 또는 일부 다른 선택된 수의 분자가 주어진 관찰 부피 내에서 속할 것으로 예상될 수 있도록 특히 개별적인 분자를 표면에 원하는 밀도로 고정화시키도록 설계된 변형된 표면을 기재하고 있다. 전형적으로, 이러한 방법은 표면 상에 비교적 낮은 밀도의 커플링 기를 제공하기 위해, 표면 상의 이러한 기의 희석 또는 관심 분자와 상호작용하는 중간 또는 최종 커플링 기의 희석, 또는 이들의 조합을 통한 희석 기술을 활용한다. 또한 광학 구속물에 대해 본원에서 고려되는 미세액적 반응 셀에서 발생할 수 있는 것과 같이, 표면에 고정화되지 않고 주어진 관찰 부피 내에 속하도록 1, 2, 3 개 또는 일부 다른 선택된 수의 단일 분자 서열분석 반응을 제공하기 위한 이들 희석 기술의 사용이 본원에서 고려된다. 특정 구현예에서, 희석 기술은 본 발명의 서열분석 방법에서 사용하기 위한 미세액적에서 단일 분자 서열분석 반응을 제공하기 위해 활용된다.
본 발명의 시스템 및 방법은 당업계에 널리 알려진 시스템을 사용하여 본원에 제시된 3 효소 pol-ATP 술푸릴라제-루시퍼라제(예를 들어, 폴리포스페이트 표지; PPi + FL)를 겪은 후 뉴클레오티드 유사체의 표지된 이탈기로부터 신호를 모니터링함으로써 개선된 서열 결정 및 개선된 염기 호출을 야기할 수 있다. 일반적으로, 신호 데이터는 프로세서에 의해 수신된다. 프로세서에 의해 수신된 정보는 검출 광학으로부터 직접적으로 발생할 수 있거나, 또는 검출 광학으로부터의 신호는 프로세서에 의해 수신되기 전에 다른 프로세서에 의해 처리될 수 있다. 다수의 초기 보정 작동이 적용될 수 있다. 이들 초기 보정 단계 중 일부는 실행 시작 시 1 회만 수행되거나 또는 실행 동안 보다 연속적 기준으로 수행될 수 있다. 이들 초기 보정 단계는 중심 결정, 정렬, 그리딩(gridding), 드리프트 교정, 초기 배경 차감, 노이즈 매개변수 조정, 프레임 속도 조정 등과 같은 것들을 포함할 수 있다. 비닝(binning)과 같이, 이들 초기 보정 단계 중 일부는 하기 추가로 논의된 바와 같이, 프로세서에서 검출기/카메라로 다시 통신하는 것을 수반할 수 있다.
일반적으로, 일부 유형의 스펙트럼 트레이스 결정, 스펙트럼 트레이스 추출, 또는 스펙트럼 필터가 초기 신호 데이터에 적용된다. 이들 여과 단계 중 일부 또는 전부는 임의적으로 프로세스의 이후 지점, 예를 들어, 펄스 식별 단계 후 수행될 수 있다. 스펙트럼 트레이스 추출/스펙트럼 필터는 다수의 노이즈 감소 및 당업계에 널리 알려진 바와 같은 다른 필터를 포함할 수 있다. 스펙트럼 트레이스 결정은 수신된 초기 신호 데이터가 일련의 인접한 픽셀 검출기에 의해 캡쳐된 광 수준, 또는 광자 카운트이기 때문에 이 단계에서 본원에서 논의된 많은 예시적인 시스템에 대해 수행된다. 예를 들어, 일 예시적인 시스템에서, 위치로부터의 픽셀(또는 강도 수준)은 각 프레임에서 개별적인 도파관에 대해 캡쳐된다. 상이한 주파수 또는 스펙트럼의 광은 위치 중 하나 초과에 속할 것이며 일반적으로 일부 중첩하고 아마 실질적인 중첩이 있을 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 스펙트럼 트레이스 추출은 하기 논의된 바와 같이, 각 스펙트럼 트레이스에 대한 가장 높은 신호 대 노이즈 비를 제공하는 다양한 유형의 분석을 사용하여 수행될 수 있다.
스펙트럼 트레이스 결정에 대한 대안으로서, 본 발명의 방법은 또한 다중 픽셀 위치에서 강도 수준으로부터 유래된 단일 신호를 분석할 수 있다(이는 합산된 스펙트럼 신호 또는 그레이 스케일 스펙트럼 신호 또는 강도 수준 신호로 언급될 수 있음). 그러나, 많은 상황에서, 스펙트럼 추출은 더 나은 SNR(신호 대 노이즈 비)을 제공하고 따라서 추출된 스펙트럼 트레이스가 펄스에 대해 다소 별개로 분석될 때 펄스 검출을 제공하는 것으로 밝혀졌다. 추가 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 Hidden Markov Model과 같은 통계 모델을 사용하여 다중 캡쳐된 픽셀 데이터를 분석할 수 있다. 본 발명의 서열분석 방법 및 본원에 제공된 시스템에서, 초기 신호 데이터로부터 다중(예를 들어, 4 개) 스펙트럼 트레이스를 결정하는 것은 바람직한 방법이다.
표지된 이탈기(예를 들어, 표지된-피로포스페이트; PPi + FL)로부터의 신호가 유의한 신호 펄스 또는 이벤트로 분류될 수 있는지 여부가 결정된다. 일부 예시적인 시스템에서, 검출에 이용가능한 적은 수의 광자 및 검출 속도로 인해, 유의한 펄스가 검출되었는지 여부를 결정하는 데 다양한 통계 분석 기술이 수행될 수 있다.
신호가 유의한 펄스 또는 신호 이벤트로서 식별되는 경우, 추가 임의적인 스펙트럼 프로파일 비교를 수행하여 스펙트럼 할당을 확인할 수 있다. 이 스펙트럼 프로파일 비교는 스펙트럼 트레이스가 펄스 식별 전에 또는 도중에 결정되는 구현예에서 임의적이다. 일단 색상이 주어진 혼입 신호(예를 들어, 형광단-표지된 dNTP)에 할당되면, 해당 할당은 혼입된 각각의 염기, 또는 주형 서열에서 이의 보체를 호출하는 데 사용된다. 이 결정을 수행하기 위해, 표지된 이탈기(예를 들어, 표지된-피로포스페이트; PPi + FL)에 상응하는 채널에서 발생하는 신호를 사용하여 뉴클레오티드 표지로부터의 펄스가 혼입 이벤트에 상응하는지 여부를 평가한다. 그 다음에 호출된 염기의 편집을 추가적인 처리에 적용하여 선형 서열 정보, 예를 들어, 주형 서열에서 뉴클레오티드의 연속적인 서열, 더 긴 콘틱(contig) 내에 어셈블리 서열 단편 등을 제공한다.
상기 언급된 바와 같이, 신호 데이터는 처리 시스템, 예를 들어, 적절하게 프로그래밍된 컴퓨터 또는 다른 프로세서에 입력된다. 신호 데이터는 예를 들어 실시간 신호 처리를 위해 검출 시스템으로부터 직접 입력될 수 있거나, 또는 신호 데이터 저장 파일 또는 데이터베이스로부터 입력될 수 있다. 일부 경우에, 예를 들어, 검출 시스템의 성능에 대한 즉각적인 피드백을 찾고, 검출 또는 다른 실험적 매개변수를 조정하는 경우, 실시간 신호 처리가 이용될 것이다. 일부 구현예에서, 신호 데이터는 검출 시스템으로부터 적절한 파일 또는 데이터베이스에 저장되고 반응후 또는 비실시간 방식으로 처리된다.
본 발명과 함께 사용되는 신호 데이터는 다양한 형태일 수 있다. 예를 들어, 데이터는 주어진 검출기 또는 어레이 기반 검출기의 검출 지점에서 수신된 광학 신호에 대한 강도 값을 나타내는 수치 데이터일 수 있다. 신호 데이터는 CCD, EMCCD, ICCD 또는 CMOS 센서와 같은 이미징 검출기로부터의 이미지 데이터를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 단일 분자로부터 적은 수의 광자를 검출하기 위해, 광전자 배증관 튜브(PMT) 및/또는 광자 카운터 단위의 사용이 본 발명의 방법에서 사용하기 위해 고려된다. 어느 경우에서든, 본 발명의 특정 구현예에 따라 사용되는 신호 데이터는 일반적으로 강도 수준 정보 및 스펙트럼 정보 둘 다를 포함한다. 별개의 검출기 요소의 맥락에서, 이러한 스펙트럼 정보는 일반적으로 강도가 검출되면 검출기 부분의 장소 또는 위치(예를 들어, 픽셀)의 식별을 포함할 것이다. 이미지 데이터의 맥락에서, 스펙트럼 이미지 데이터는 전형적으로 시스템이 전체 신호의 스펙트럼 해상도를 포함할 때 이미징 시스템 및 검출기에 대한 보정된 스펙트럼 이미지 데이터와 연관되는 이미지 데이터로부터 유도된 데이터일 것이다. 스펙트럼 데이터는 검출기로부터 추출된 이미지 데이터로부터 수득될 수 있거나, 또는 대안적으로, 스펙트럼 데이터가 검출기로부터 추출될 수 있도록 스펙트럼 데이터의 유도가 검출기 상에서 발생할 수 있다.
상기 기재된 서열분석 방법의 경우, 혼입 이벤트로부터 신호의 결과가 아닌 검출 시스템에 의해 검출된 특정 양의 광학 신호가 있을 수 있다. 이러한 신호는 시스템에서 "노이즈"를 나타낼 것이며, 모니터링된 반응 내부, 검출 시스템 내부 및/또는 상기 모두의 외부에 있을 수 있는 다수의 공급원으로부터 유도될 수 있다. 본 발명의 실시는 유리하게는 선행 기술 방법에 전형적으로 존재하는 이러한 전체 노이즈 공급원을 감소시킨다. 본 발명에 따라 유리하게 감소되는 반응 내부의 선행 기술 노이즈의 예는 예를 들어, 검출 이벤트와 회합되지 않는 형광체 표지, 예를 들어, 유리된 표지, 용액 중에 확산된 비혼입된 염기와 회합된 표지, 복합체와 회합되지만 혼입되지 않는 염기의 존재; 개별적인 관찰 부피 또는 영역 중 다중 복합체의 존재; 관찰 부피 내에서 기질 또는 효소 복합체에 염료 또는 뉴클레오티드의 비특이적 흡착; 예를 들어 다른 형광체 성분으로 오염된, 오염된 뉴클레오티드 유사체; 약한 형광일 수 있는 다른 반응 성분; 예를 들어, 반응 조건의 결과로서 스펙트럼으로 이동하는 염료 성분 등을 포함한다. 다음 뉴클레오티드 유사체의 혼입 전에 신중하고 제한된 기간의 폴리머라제-ATP-술푸릴라제-루시퍼라제 반응을 겪는 각각의 dNTP의 이탈기에 대한 형광체 표지로부터 형광체 신호 검출 및 정보의 제어된 사용은 유리하게는 노이즈의 공급원을 감소 또는 제거시켜, 이에 의해 시스템의 신호 대 노이즈를 개선시키고, 염기 호출 및 회합된 서열 결정의 품질을 개선시키는 방식을 제공한다.
검출 시스템 내부에 있지만, 반응 혼합물 외부에 있는 노이즈의 공급원은 예를 들어, 필터링 광학을 통해 흘러나오는 반사된 여기 복사; 기질 또는 임의의 광학 성분으로부터 산란된 여기 또는 형광체 복사; 인접한 신호 공급원의 공간적 누화; 시스템의 임의의 또는 모든 광학 성분의 자동-형광; 검출기, 예를 들어, CCD로부터 판독 노이즈(read noise), 예를 들어, EMCCD 카메라에 대한 이득 레지스터 노이즈(gain register noise) 등을 포함할 수 있다. 다른 시스템 유도된 노이즈 기여는 배경 교정 오류, 초점 드리프트 오류, 자동초점 오류, 펄스 주파수 해상도, 정렬 오류 등과 같은 데이터 처리 문제로부터 발생할 수 있다. 여전히 다른 노이즈 기여가 주변 광 간섭, 먼지 등을 포함한 전체 시스템 외부의 공급원으로부터 유도될 수 있다.
이들 노이즈 성분은 혼입 이벤트와 회합될 수 있는 임의의 신호 펄스에 기본이 되는 배경 광자에 기여한다. 이와 같이, 노이즈 수준은 전형적으로 임의의 신호 펄스가 통계적으로 유의한 것으로 결정될 수 있는 제한을 형성할 것이다.
전체 신호 데이터에 대한 노이즈 기여의 식별은 예를 들어, 관심 반응의 부재 하에 신호 모니터링을 포함하여, 당업계에 널리 알려진 다수의 방법에 의해 수행될 수 있으며, 여기서 임의의 신호 데이터는 관련이 없는 것으로 결정된다. 대안적으로, 및 바람직하게는, 기준선 신호가 추정되고 시스템에 의해 생성된 신호 데이터로부터 차감되어, 노이즈 측정이 관심 반응에 대한 측정과 동시에 이루어지게 한다. 기준선의 생성 및 적용은 하기 보다 상세하게 기재된 다수의 수단에 의해 수행될 수 있다.
본 발명에 따르면, 신호 처리 방법은 모든 유의하지 않은 펄스-기반 신호 이벤트에 광범위하게 적용될 때 노이즈, 및 합리적인 신뢰성 정도로, 이와 회합된 것으로 간주될 수 있는 유의한 신호 펄스 사이를 구분하고, 따라서 혼입 이벤트로 잠정적으로 식별될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 신호 이벤트는 먼저 이러한 신호 이벤트가 다수의 상이한 펄스 기준 중 임의의 것을 충족하는지 여부에 기초하여 유의한 신호 펄스를 구성하는지 여부에 대해 분류된다. 일단 유의한 펄스로 식별되거나 또는 분류되면, 신호 펄스는 신호 펄스가 혼입 이벤트를 구성하는지 여부를 결정하기 위해 추가로 평가될 수 있고 특정 혼입된 염기로 호출될 수 있다. 이해되는 바와 같이, 유의한 펄스로서, 및 궁극적으로 혼입 이벤트로서 특정 신호 이벤트를 호출하기 위한 기준은 일반적으로 본원에 제시된 바와 같은 다양한 매개변수에 기초하여, 특정 양의 오류를 겪을 것이다. 이와 같이, 펄스로서, 및 궁극적으로 혼입 이벤트 또는 식별된 염기로서 신호 데이터의 분류를 수반하는 본 발명의 측면은 동일하거나 또는 유사한 오류를 겪고, 이러한 명명법은 논의의 목적을 위해 그리고 호출된 염기가 실제로 주어진 서열의 주어진 위치에 있는 염기라는 절대적인 확실성의 표시가 아니라 호출된 염기가 서열에서 교정 염기라는 어느 정도 신뢰성으로 예상된다는 표시로 사용됨이 이해될 것이다.
이러한 신호 펄스 기준 중 하나는 모든 배경 노이즈의 수준에 대한 해당 신호 이벤트와 연관된 신호의 비율("신호 대 노이즈 비"또는 "SNR")이며, 유의한 신호 펄스로서 신호 이벤트를 분류할 수 있는 것과의 신뢰성 또는 통계적 유의성의 척도를 제공한다. 유의한 펄스 신호를 시스템적 또는 다른 노이즈 성분과 구별하는 데 있어서, 신호는 일반적으로 예를 들어, 신호 강도, 신호 지속시간, 시간적 신호 펄스 형상, 펄스 간격, 및 펄스 스펙트럼 특성을 포함한 다수의 메트릭 중 하나 이상에서 신호 임계 수준을 초과해야 한다.
단순화된 예로써, 신호 데이터는 처리 시스템에 입력될 수 있다. 신호 데이터가 신호 강도 및 신호 지속시간 중 하나 이상에서 신호 임계값을 초과하는 경우, 유의한 펄스 신호로 간주될 수 있다. 유사하게, 추가 메트릭이 임계값으로 이용되는 경우, 신호는 특정 신호 이벤트를 유의한 펄스로서 식별하는 데 있어서 이러한 메트릭에 대해 비교될 수 있다. 이해되는 바와 같이, 이러한 비교는 전형적으로 유의한 펄스를 식별하는 데 있어서 상기 메트릭 중 적어도 하나, 및 바람직하게는 적어도 2 개의 이러한 임계값, 및 많은 경우에 상기 임계값 중 3 또는 4 개 모두를 수반할 것이다.
신호 임계값은, 신호 강도, 신호 지속시간, 펄스 형상, 간격 또는 펄스 스펙트럼 특성, 또는 이들의 조합의 측면에서든, 일반적으로 이전 실험적 데이터로부터 예상되는 신호 프로파일에 기초하여 결정될 것이지만, 일부 경우에, 이러한 임계값은 전체 신호 데이터의 백분율로부터 식별될 수 있으며, 여기서 통계적 평가는 이러한 임계값이 적절함을 나타낸다. 특히, 일부 경우에, 임계 신호 강도 및/또는 신호 지속시간은 전체 신호 데이터의 특정 분율 또는 백분율을 제외한 모든 것을 제외하도록 설정되어, 임계값의 실시간 설정을 허용할 수 있다. 그러나, 다시 임계 수준의 식별은, 백분율 또는 절대 신호 값의 측면에서, 일반적으로 이전의 실험적 결과와 연관될 것이다. 대안적인 측면에서, 신호 임계값은 주어진 평가의 맥락에서 결정될 수 있다. 특히, 예를 들어, 펄스 강도 임계값은 절대 신호 강도에 기초할 수 있지만, 이러한 임계값은 예를 들어, 시약 확산을 통해, 특히 신호가 배경 수준과 비교하여 상대적으로 약한 경우에 사용된 임계값에 영향을 미칠 수 있는 신호 배경 수준에서 변이를 고려하지 않을 것이다. 이와 같이, 특정 측면에서, 본 발명의 방법은 해당 특정 반응의 배경 형광을 결정하며, 염료 또는 염료 표지된 유사체를 미세액적으로 자유롭게 확산시키는 기여가 최소이거나 또는 존재하지 않기 때문에 상대적으로 작고, 예를 들어, 배경 형광단 확산에 대한 펄스 강도의 비율로서, 또는 통계적 방법, 예를 들어, 5 시그마 등에 의해 원하는 수준만큼 실제 배경보다 초과하여 신호 임계값을 설정한다. 최소 형광단 확산 배경과 같은 실제 반응 배경을 교정함으로써, 임계값은 염료 농도, 레이저 출력 등에 대한 변이의 영향에 대해 자동적으로 보정된다. 반응 배경이란 관심 반응과 특이적으로 연관된 배경 신호 수준을 의미하며 배경에 대한 시스템적 기여와는 반대로 반응 조건, 예를 들어, 시스템 또는 기질 성분의 자가형광, 레이저 블리드스루(bleedthrough) 등에 따라 달라질 것으로 예상될 것이다.
혼입 이벤트의 실시간 검출에 의존하는 특히 바람직한 측면에서, 유의한 신호 펄스의 식별은 신호 강도 및 신호 지속시간 들 다에서 임계값을 가로지르는 신호 프로파일에 의존할 수 있다. 예를 들어, 증가하는 방향으로 더 낮은 강도 임계값을 교차하는 신호가 검출될 때, 동일한 검출 요소 세트, 예를 들어 픽셀로부터 뒤따르는 신호 데이터는 신호 강도가 감소하는 방향으로 동일하거나 또는 상이한 강도 임계값을 교차할 때까지 모니터링된다. 일단 적절한 강도의 피크가 검출되면, 강도 임계값 또는 임계값들이 초과되는 동안 기간의 지속시간은 지속시간 임계값에 대해 비교된다. 피크가 충분한 지속시간의 충분히 강렬한 신호를 포함하는 경우, 유의한 신호 펄스라고 부른다.
강도 및 지속시간 임계값을 사용하는 것에 더하여 또는 대안적으로, 펄스 분류는 펄스를 유의한 것으로 분류하는 데 있어서 다수의 다른 신호 매개변수를 이용할 수 있다. 이러한 신호 매개변수는 예를 들어, 펄스 형상, 신호의 스펙트럼 프로파일, 예를 들어, 펄스 스펙트럼 중심, 펄스 높이, 펄스 확산 비율, 펄스 간격, 총 신호 수준 등을 포함한다.
유의한 신호 펄스의 식별 전후에, 신호 데이터는 특정 신호 유형과 연관될 수 있다. 본 발명과 함께 사용되는 광학 검출 방식의 맥락에서, 이는 전형적으로 신호 데이터를 발생시키는 신호의 특정 스펙트럼 프로파일을 나타낸다. 특히, 본 발명의 방법 및 프로세스와 함께 사용되는 광학 검출 시스템은 일반적으로 구별가능한 스펙트럼 프로파일을 갖는 광학 신호를 수신하도록 구성되며, 각 스펙트럼으로 구별가능한 신호 프로파일은 일반적으로 상이한 반응 이벤트와 연관될 수 있다. 핵산 서열분석의 경우에, 예를 들어, 각 스펙트럼으로 구별가능한 신호는 핵산 서열의 주어진 위치에 혼입되거나 또는 존재하는 특이적 뉴클레오티드와 연관되거나 또는 나타낼 수 있다. 결과적으로, 검출 시스템은 이러한 신호를 수신하고 스펙트럼에 기초하여 신호를 분리하는 광학 트레인을 포함한다. 그 다음에 상이한 신호는 상이한 검출기로, 단일 어레이 기반 검출기 상의 상이한 위치로 향하게 되거나, 또는 동일한 이미징 검출기에서 차등적으로 이미지화된다(예를 들어, 미국 특허 제7,805,081호를 참조하며, 이는 모든 목적을 위해 전문이 본원에 참조로 포함됨).
상이한 신호 스펙트럼에 대해 상이한 검출기를 이용하는 시스템의 경우에, 주어진 신호에 신호 유형(논의의 용이성을 위해, 이하에서 "색상 분류" 또는 "스펙트럼 분류"로 언급됨)의 할당은 데이터가 유래된 검출기와 신호 펄스를 연관시키는 문제이다. 특히, 각 분리된 신호 성분이 별개의 검출기에 의해 검출되는 경우, 해당 검출기에 의한 신호의 검출은 신호가 필수 색상으로 분류되는 것을 나타낸다.
그러나, 바람직한 측면에서, 본 발명과 함께 사용되는 검출 시스템은 전체 신호의 상이한 스펙트럼 성분 모두 또는 적어도 일부가 상이한 스펙트럼 성분 사이의 구별을 허용하는 방식으로 이미지화될 때 이미징 검출기를 활용한다. 따라서, 다중 신호 성분은 동일한 전체 검출기를 향하지만, 예를 들어, 이미징 검출기에서 상이한 픽셀 세트로 이미징되고, 구별가능한 스펙트럼 이미지(및 연관된 이미지 데이터)를 발생시키는 검출기의 완전히 또는 부분적으로 상이한 영역에서 발생할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 스펙트럼 또는 스펙트럼 이미지는 일반적으로 반응 위치로부터 수신된 광학 신호의 스펙트럼 확산에 의해 야기되는 다중 강도를 갖는 픽셀 이미지 또는 프레임(임의적으로 1차원으로 감소된 데이터)을 나타낸다.
가장 단순한 형태로, 검출기에서 연속적인 검출 요소 또는 픽셀 그룹에 대한 신호 이벤트 발생에 색상을 할당하는 것은 별개의 검출기에 대해 제시된 것과 유사한 방식으로 달성될 수 있음이 이해될 것이다. 특히, 신호가 이미지화되고, 신호 데이터가 유도되는 픽셀 그룹의 위치는 신호 성분의 색상을 나타낸다. 그러나, 특히 바람직한 측면에서, 신호 성분의 공간적 분리는 상이한 색상의 신호가 중첩된 픽셀 세트에서 이미지화되도록 완벽하지 않을 수 있다. 이와 같이, 신호 식별은 일반적으로 신호가 발생하는 다중 픽셀(또는 신호 성분의 전체 이미지)의 집합적 정체에 기초할 것이다.
일단 특정 신호가 유의한 펄스로서 식별되고 특정 스펙트럼으로 할당되면, 스펙트럼으로 할당된 펄스는 펄스가 혼입 이벤트로 호출될 수 있고, 결과적으로, 초기 가닥에서 혼입된 염기, 또는 주형 서열에서 이의 보체를 호출하는지 여부를 결정하기 위해 추가로 평가될 수 있다. 표지된 이탈기(예를 들어, 형광단 표지된 피로포스페이트; PPi + FL)로부터의 신호를 사용하여 염기가 호출되어야 하는지 식별한다. 상기 제시된 바와 같이, 일 구현예에서, 본 발명의 3 효소 폴리머라제-ATP 술푸릴라제-루시퍼라제 반응 시스템을 사용함으로써, 혼입 이벤트에 대해 높은 신뢰성으로 연관될 수 있는 특징적인 신호 세트가 생성된다.
또한, 색상 할당된 펄스 데이터로부터 염기의 호출은 전형적으로 염기가 호출되는 신뢰 수준을 다시 식별하는 테스트를 이용할 것이다. 전형적으로, 이러한 테스트는 유의한 펄스를 식별하는 데 사용되는 다수의 동일한 데이터 매개변수를 포함하여, 신호가 수신된 데이터 환경을 고려할 것이다. 예를 들어, 이러한 테스트는 배경 신호 수준, 인접한 펄스 신호 매개변수(간격, 강도, 지속시간 등), 스펙트럼 이미지 해상도, 및 다양한 다른 매개변수의 고려 사항을 포함할 수 있다. 이러한 데이터를 사용하여 색상 할당된 신호 펄스에 대한 주어진 염기 호출에 점수를 할당할 수 있으며, 이러한 점수는 호출된 염기가 예를 들어, 100 분의 1(99% 정확도), 1000 분의 1(99.9% 정확도), 10,000 분의 1(99.99% 정확도), 100,000 분의 1(99.999% 정확도), 또는 그 이상으로 부정확할 확률과 연관된다. 크로마토그래피적으로 유도된 서열 데이터에 대한 PHRED 또는 유사한 유형의 점수화와 유사하게, 이러한 점수를 사용하여 서열분석 데이터에 대한 정확성의 표시를 나타내고/내거나 불충분한 정확성의 서열 정보를 필터링할 수 있다.
일단 염기가 충분한 정확도로 호출되면, 그 다음에 동일한 서열분석 실행, 및 동일한 프라이머 연장 반응에서 호출된 후속 염기는 이전에 호출된 염기 각각에 첨부되어 주형 또는 초기 가닥의 전체 서열에서 염기의 서열을 제공할 수 있다. 반복적 처리 및 추가 데이터 처리를 사용하여 주어진 서열에 대해 임의의 공백을 채우거나, 임의의 잘못되게 호출된 염기를 교정할 수 있다.
본 발명의 구체적 구현예에 따른 반응 위치의 어레이에 대한 혼입 반응에 의한 서열분석의 분석은 모든 목적을 위해 전문이 참조로 포함된 미국 특허 제9,447,464호의 도 13에 그래프로 도시된 바와 같이 수행될 수 있다). 예를 들어, 카메라로 캡쳐한 데이터는 영화로 나타내며, 이는 또한 스펙트럼의 시간 순서이다. 스펙트럼 보정 주형을 사용하여 스펙트럼으로부터 트레이스를 추출한다. 그 다음에 트레이스에서 식별된 펄스를 사용하여 스펙트럼 데이터로 돌아가고 해당 데이터로부터 각 펄스에 대한 시간적으로 평균낸 펄스 스펙트럼을 생성하며, 이러한 펄스 스펙트럼은 효소 형태적 변화와 관련된 이벤트에 대한 스펙트럼을 포함할 것이다. 그 다음에 스펙트럼 보정 주형을 또한 사용하여 특정 염기에 대한 펄스 스펙트럼을 분류한다. 그 다음에 염기 분류 및 펄스 및 트레이스 메트릭을 저장하거나 또는 추가 분석을 위해 다른 로직으로 통과시킨다. 다운스트림 분석은 염기 호출에 대한 혼입 이벤트의 결정을 지원하기 위해 효소 형태적 변화로부터 정보를 사용하는 것을 포함한다. 본 발명에서 사용하기 위한 추가 염기 호출 및 서열 결정 방법은 예를 들어, US 8,182,993에 기재된 것들을 포함할 수 있으며, 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
폴리머라제에 대해 보다 최적화된 환경에서 폴리머라제의 사용을 허용하는 본 발명의 단일 분자 서열분석 방법의 이점은 서열분석 실행 당 달성되는 매우 낮은 오류율이거나; 또는 다시 말해서 서열분석 실행 당 수득되는 실질적으로 매우 높은 수준의 서열 정확도이다. 예를 들어, 천연 폴리머라제는 1 억 개의 염기 당 1 개의 오류를 생성하고; 이는 본원에 제공되는 본 발명의 FLASH 서열분석 방법에 대한 표적 오류율로서 본원에서 고려된다. 또한 표적 핵산 주형 당 복수의 폴리머라제를 사용하는 본 발명에 따르면, 오류율은 판독 길이와 무관하며; 따라서, 오류율은 더 높은 충실도의 폴리머라제를 선택함으로써 개선될 수 있고 결과적으로 적은 적용범위가 필요하며; 복수의 폴리머라제를 사용함으로서 매우 긴 판독 길이를 여전히 달성할 수 있다. 적용범위를 간주하기 전에 실행 당 본 발명의 방법에서 사용되는 폴리머라제에 의해 달성된 오류율은 1%-30%, 1%-20%, 1%-10%, 1%-5%, 1%-3%, 1%-2%, 0.000001% - 1%, 0.00001%-1%, 0.0001% - 1%, 0.001%-1%, 0.01%-1%, 0.000001%-0.00001%, 0.000001%-0.0001%, 0.000001%-0.001%로부터 선택된 범위에 있는 것으로 고려된다.
이러한 이점은 산업 표준으로 정의된 정확한 서열을 수득하는 데 필요한 전체 적용범위를 감소시키며, 뉴클레오티드 서열을 수득하는 전체 비용을 상응하게 감소시킨다. 본원에 사용된 바와 같이, 적용범위는 산업 표준 내에서 특정 표적 핵산 서열에 대한 정확한 서열을 수득하는 데 필요한 서열분석 실행의 수를 지칭한다.
실시예
실시예 1 - 발광-기반 단일 분자 서열분석
단일 분자 서열분석 반응을 겪기 전에, 각각의 형광단은 dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP 각각에 대한 상응하는 dNTP의 말단 포스페이트에 부착된다. 각 dNTP 염기(A, T, G, C)에 대해 상이한 형광단이 있다(도 1a). 외부 광 여기가 없기 때문에 이 때 형광이 생성되지 않으므로, 화학적으로 급랭될 수 있는 형광단을 선택할 필요가 없다. 단일 분자 서열분석 반응 동안, DNA 폴리머라제와 상호작용하면, DNA 폴리머라제는 dNTP 뉴클레오티드 유사체가 상보적 주형 가닥에 결합하는 동안 떨어지고 이에 부착된 추가 형광단 표지를 포함하는 피로포스페이트(PPi+FL)를 방출한다(도 1a 및 1b). 이 경우 외부 광 여기가 없고 표지된 형광단의 동적, 정적 또는 임의의 다른 형태의 급랭 메커니즘이 필요하지 않다.
일단 방출되면, 표지된 피로포스페이트(PPi + FL)는 ATP 술푸릴라제와 상호작용하며, 표지된 피로포스페이트는 아데노신 5'-포스포술페이트(APS)에 결합하여 여전히 형광단 표지(ATP+FL)를 함유하는 표지된-ATP를 생성한다(도 1b 및 1c).
상기 생성된 표지된-ATP(ATP+FL)를 사용하여 기질로서 루시페린을 사용하는 반딧불이 루시퍼라제에 결합시킨다(도 1d 및 1e). 표지된 ATP(ATP+FL)가 보조인자로 작용하면, 반딧불이 루시퍼라제는 루시페린을 촉매한다(도 1d-1f). 효소적 촉매작용의 결과로, 루시페린은 옥시루시페린으로 전환되고 또한 발광은 신중하고 제한된 시간 동안 생성된다(도 1f). 반응 부산물로, 아데노신 모노포스페이트 및 PPi+FL이 생성된다. 표지된 피로포스페이트(PPi + FL)에 부착된 형광단은 발광 반응의 결과로 제한된 시간 동안 생성된 발광에 의해 여기된다. 이는 신중하고 제한된 시간(수명)의 발광 동안 검출가능한 형광 방출을 야기하며, 형광 발광 스펙트럼은 특정 형광단에 대한 각각의 dNTP에 상응한다(도 1f). 따라서, dNTP가 DNA 폴리머라제와 상호작용한 결과로, 발광-효소 및 발광-기질에 의해 생성된 발광 반응에 의해 생성된 발광으로 형광 광이 생성되어, 특정 dNTP에 대해 선택된 형광단의 색상에 상응하는 형광 신호를 생성한다. 이러한 상호작용의 특이성은 발광 생산 및 PPi+FL의 근접성에 의해 추가로 증가된다. 각각의 형광체 광은 일 구현예에서와 같이, 다음 dNTP의 첨가 전에 신중하고 제한된 시간 후 광이 사라지기 전에 검출된다.
이 dNTP 혼입 프로세스는 원하는 핵산 판독-길이가 달성될 때까지 반복된다.
실시예 2 -발광 생성에 영향을 미치는 매개변수
실시예 2A - ATP 술푸릴라제, 반딧불이 루시퍼라제, 및 발광-기질 - dGTP-쿠마린의 각각의 농도 변화 효과
이 반응에서, 4 개의 염기(dATP, dGTP, dTTP, dCTP)의 혼합물로 형성된 20 bp 영역의 시작 서열을 제외한 모든 사이토신 염기로 구성된 300 bp 단일 가닥 DNA 주형을 생성하였다. 주형 DNA 외에도, 반응은 시작 서열, dGTP-쿠마린, ATP 술푸릴라제, 아데노신 5'-포스포술페이트, 반딧불이 루시퍼라제(발광-효소), 및 루시페린(발광-기질)에 상보적인 프라이머 올리고뉴클레오티드를 함유하였다. ATP 술푸릴라제, 반딧불이 루시퍼라제, 및 발광-기질, dGTP-쿠마린의 각각의 농도 변화 효과는 각각 도 2-4에 도시되어 있다. 도 2-4에서 볼 수 있는 바와 같이, dGTP-쿠마린(이는 말단 포스페이트에서 쿠마린에 의해 표지된 dGTP임)으로 시작하여, 본원에서 활용된 폴리머라제-ATP 술푸릴라제-반딧불이 루시퍼라제의 이 연결된 3-효소 시스템(또한 FLASH 접근법으로도 지정됨)은 놀랍게도 최종 단계에서 발광을 생성하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 특정 경우에, 쿠마린의 여기 스펙트럼은 385 nm에서 피크인 반면 방출 스펙트럼은 502 nm에서 피크이므로, 이 반응에 의해 생성된 발광(560 nm에서 피크)은 결과적으로 쿠마린으로부터 형광 방출을 관찰하는 데 사용될 수 없다.
그러나, 다른 구현예에서, DDAO([7-히드록시-9H-(1,3-디클로로-9,9-디메틸아크리딘-2-온)]) 등과 같이, 거의 560 nm 여기 스펙트럼을 갖는 형광단 표지는 각각의 dNTP에 상응하는 검출가능한 광 형광 방출을 생성할 것으로 본원에서 고려된다. 예를 들어, 하기 표지된 dNTP를 합성하고 본 발명의 방법과 함께 본원에 사용하기 위해 Jena Bioscience(독일 예나 소재)로부터 수득하였다:
감마-(6-아미노헥실)-2'-데옥시아데노신-5'-트리포스페이트, ATTO680, 트리에틸암모늄으로 표지됨;
감마-(6-아미노헥실)-2'-데옥시시티딘-5'-트리포스페이트, ATTO680, 트리에틸암모늄 염으로 표지됨;
감마-(6-아미노헥실)-2'-데옥시티미딘-5'-트리포스페이트, ATTO680, 트리에틸암모늄 염으로 표지됨;
감마-[(6-아미노헥실)이미도]-dGTP - ATTO-647N;
감마-[(6-아미노헥실)이미도]-dGTP - Cy5;
감마-(6-아미노헥실)-dGTP - Cy5;
감마-(6-아미노헥실)-2'-데옥시티미딘-5'-트리포스페이트, Alexa700, 트리에틸암모늄 염으로 표지됨;
감마-(6-아미노헥실)-2'-데옥시아데노신-5'-트리포스페이트, Alexa660, 트리에틸암모늄 염으로 표지됨; 및
감마-(6-아미노헥실)-2'-데옥시티미딘-5'-트리포스페이트, ATTO700, 트리에틸암모늄 염으로 표지됨.
실시예 2B -루시퍼라제 반응에 ATP 술푸릴라제 및 APS 첨가의 효과
서열 혼합물의 하기 시약을 본 실험에서 사용하였다:
10x TAE 완충제 17.5 uL
루시퍼라제(1M Tris 중 5 mg/ml)(1:50) 17.5uL --------------- 250ng Sigma
Cyc-Luc(10mg/mL)(1xTAE 중 1:10) 35 uL--------------- 5ug EMD Millipore
ATP(100mM)(1:5k) 35 uL --------------------------- 1.2 uM Sigma
CoA(10mM)(1:20) 35 uL ------------------------------------- 2mM Sigma
MgCl2(10mM) =(rxn 당 2.5 uL)-------------------- 1mM NEB
PPase 1x(=희석 없음)(200 U/mL) = 0.5 uL ------------------- 0.1 U Sigma
ASulf(300 U/mL) = 0.5 uL---------------------------- 0.15 U NEB
APS(10mM) = 1 uL---------------------------------- 377 uM Sigma
ATP 술푸릴라제/루시퍼라제 신호 증폭 루프가 형광체 신호 수준에 미치는 영향을 연구하기 위해, ATP술푸릴라제-루시퍼라제 커플 단독을 관찰할 수 있다. 반응은 750ng의 루시퍼라제, 5μg의 Cyc-Luc 루시페린, 1.2 μM의 ATP, 2mM의 코엔자임 A, 1mM MgCl2 0.15 유닛의 ATP 술푸릴라제, 377 μM의 APS를 함유하는 1X TAE 완충제에서 수행하였다. 피로포스파타제의 변이는 0.1, 0.005 및 0.002 유닛 양에 상응한다. 루시퍼라제, ATP, 코엔자임 A, 피로포스파타제 및 APS는 Sigma로부터 수득하였다. ATP 술푸릴라제 및 MgCl2는 NEB로부터 수득하였다.
초기에 피로포스파타제 및 MgCl2를 384-웰 마이크로플레이트의 관련 웰에 분배하였다. 그 다음에 완충제, 루시퍼라제 및 코엔자임 A의 마스터믹스를 제조하고, 혼합하고 동일한 양으로 관련 웰에 분배하였다. 그 다음에 Cyc-Luc 루시페린을 각 웰에 첨가하고 최종적으로 ATP를 각 웰에 첨가하였다. 그 다음에 FLUOstar Optima 플레이트 판독기에서 측정하기 전에 플레이트를 15 초 동안 흔들었다.
본 실시예에서, 루시퍼라제 반응 단독에 상응하고 기질로서 루시페린을 사용하는 표준 반응은 도 7에서 실선 프롯으로 도시되어 있다. 도 7에서, 실선 플롯은 규칙적인 루시퍼라제 반응으로부터 예상된 바와 같이 발광 신호의 상승 및 하락을 제시한다. 3000 초에서, ATP-술푸릴라제 및 APS를 표준 반응에 첨가하였으며, 이는 도 7에서 볼 수 있는 바와 같이, ATP 술푸릴라제/루시퍼라제 신호 증폭 루프를 시작하고 신호의 증폭을 유발하였다(도 7, 3000 초에서 시작하는 실선 플롯 참조). 이러한 결과는 본 발명의 서열분석 방법에 의해 생성된 발광 신호(및 따라서 후속 형광 신호)가 ATP 재생 효소(본 실시예에서 ATP 술푸릴라제) 및 이의 동계 ATP 재생 효소 기질(본 실시예에서 APS)의 첨가에 의해 증폭되어, ATP 술푸릴라제/루시퍼라제 신호 증폭 루프를 개시할 수 있음을 나타낸다.
표준 반응과 유사한 세 가지 다른 반응을 수행하였으며, 여기서 무기 피로포스페이트의 다양한 상대 희석믈을 1X의 MgCl2와 함께 0.02X(1:50 희석), 0.05X(1:20 희석) 및 1X(희석 없음)의 피로포스파타제 1X의 양으로 첨가하였다. 도 7에서 볼 수 있는 바와 같이, 루프 신호는 무기 피로포스파타제의 첨가로 감소된다(0.02X Ppase 점 플롯 및 0.05X Ppase 쇄선 플롯). 무기 피로포스파타제의 농도가 높을수록, 루프는 완전히 감소한다(1X Ppase 쇄선 플롯). 이는 ATP 술푸릴라제/루시퍼라제 신호 증폭 루프에 의해 증폭된 발광 신호의 수준이 ATP 술푸릴라제의 농도에 비해 피로포스파타제의 농도 비율을 조정함으로써 유리하게 제어될 수 있음을 나타낸다.
실시예 2C - ATP 술푸릴라제/루시퍼라제 신호 증폭 루프 반응에 보조효소 A 첨가가 발광 신호에 미치는 영향
실시예 2B에서와 같이 표준 루시퍼라제 반응을 실행함으로써 ATP 술푸릴라제/루시퍼라제 신호 증폭 루프에 코엔자임 A의 첨가가 발광체 신호 수준에 미치는 영향을 연구하였다. 반응은 750ng의 루시퍼라제, 5μg의 Cyc-Luc 루시페린, 1.2 μM의 ATP, 2mM의 코엔자임 A, 1mM MgCl2 0.15 유닛의 ATP 술푸릴라제, 200 μM의 APS를 함유하는 1X TAE 완충제에서 수행하였다. 루시퍼라제, ATP, 코엔자임 A, 및 APS는 Sigma로부터 수득하였다. ATP 술푸릴라제 및 MgCl2는 NEB로부터 수득하였다. 초기에 ATP 술푸릴라제, APS, 코엔자임 A 및 MgCl2를 384-웰 마이크로플레이트에서 관련 웰에 분배하였다. 그 다음에 완충제, 루시퍼라제 및 Cyc-Luc 루시페린의 마스터믹스를 제조하고, 혼합하고 동일한 양으로 관련 웰에 분배하였다. 그 다음에 ATP를 각 웰에 첨가하였다. 그 다음에 FLUOstar Optima 플레이트 판독기에서 측정하기 전에 플레이트를 15 초 동안 흔들었다.
루시퍼라제, 루시페린 및 ATP를 함유하는 표준 루시퍼라제 반응의 발광 방출 결과는 도 8에 진한 실선 플롯으로 도시되어 있다. 도 8에서, 진한 실선 플롯은 규칙적인 루시퍼라제 반응으로부터 예상된 바와 같이 발광체 신호의 상승 및 하락을 도시한다. 파선 플롯은 ATP 술푸릴라제 및 APS와의 루시퍼라제 반응을 도시한다. 도 8의 연한 선 플롯은 APS 및 코엔자임 A와 함께 루시퍼라제-ATP 술푸릴라제 연결의 경우를 도시한다. APS 및 보조효소 공-투여의 이 실시예에서, 형광체 신호 수준은 훨씬 더 높고 신호는 더 지속적이다. 이러한 결과는 코엔자임 A가 신호에 긍정적인 영향을 미치며, 루시퍼라제에 대한 손상을 방지하고 루시퍼라제/루시페린 커플을 안정화시켜 이에 의해 루프 효율성을 개선함으로써 발생하는 것으로 여겨진다는 것을 나타낸다.
실시예 3 -효소적 루프를 파괴하는 효소 비율 조정
루시퍼라제에 의해 촉매된 발광체 반응 후 부착된 형광체 수준(PPi+FL)을 여전히 갖는 새로운 피로포스페이트 분자가 방출된다(도 1f). 이 새롭게 방출된 PPi-FL은 다시 한 번 ATP 술푸릴라제에 대한 기질이 되어 이에 의해 ATP 술푸릴라제 및 루시퍼라제 사이에 효소적 루프를 생성할 수 있다(도 1g.상단). 이 루프 PPi+FL이 ATP 술푸릴라제에 의해 재순환되고 형광으로 표지된 ATP(ATP-FL)로 전환되면, 그 다음에 PPi-FL을 방출하는 루시퍼라제에 의해 촉매될 수 있다. 이는 표지된 피로포스페이트로부터 연속적인 신호를 생성하여, 이에 의해 가장 최근의 뉴클레오티드에 대한 서열분석 신호의 증폭 메커니즘으로서 역할을 할 것이다. 그러나, 이 루프 동안, 폴리머라제가 주형에 또 다른 뉴클레오티드 혼입을 겪는 경우, 계속되는 PPi-FL 루프는 판독 시 오류를 야기할 수 있다.
이 반응 루프를 파괴하기 위해, 피로포스파타제 효소가 반응에 도입된다(도 1g. 하단). 피로포스파타제는 피로포스페이트를 2 개의 포스페이트 이온으로 가수분해를 촉매하여 루프를 파괴한다. 그러나, 피로포스파타제는 또한 폴리머라제에 의한 뉴클레오티드 혼입 직후 방출된 초기 피로포스페이트를 사용할 수 있다. 이는 혼입의 결과로서 생성된 신호의 손실을 야기할 수 있다.
신호 손실을 줄이고 또한 루프의 증폭 효과로부터 이익을 얻기 위해 피로포스파타제 활성을 제어하는 다중 접근법이 있다:
먼저, 효소 농도의 비율은 ATP 술푸릴라제 활성이 피로포스파타제 활성보다 더 높은 방식으로 조정된다. 이는 폴리머라제 반응에 의해 생성된 피로포스페이트와 피로포스파타제의 초기 상호작용을 매우 어렵게 만들고 또한 증폭 효과를 달성하기 위해 루프가 다수 회 실행되도록 할 것이다. 그러나, 결국, 피로포스페이트와 일부 상호작용이 있을 것이며, 이는 루프를 중지하거나 또는 판독 오류를 야기할 수 있을 것이다. 피로포스파타제 및 ATP 술푸릴라제의 비율이 이에 따라 조정되는 경우, 이 오류는 매우 드물지만 루프를 중지하기 전에 일부 증폭 효과를 허용한다. 폴리머라제 혼입은 피로포스파타제 및 ATP 술푸릴라제 활성 둘 다보다 더 느리므로 루프는 새로운 뉴클레오티드의 혼입 전에 다수 회 계속된다.
폴리머라제의 반응 속도, ATP-술푸릴라제/루시퍼라제 루프 뿐만 아니라 피로포스페이트의 가수분해는 서로 독립적으로 각각 조정될 수 있다. 여기서, 목표는 피로포스페이트가 피로포스파타제에 의해 가수분해되기 전에 ATP-술푸릴라제/루시퍼라제 루프가 발생하는 횟수를 최대화하고; 폴리머라제가 또 다른 혼입 이벤트를 겪기 전에 루프가 종료되었는지 확인하는 것이다. 또 다른 고려사항은 피로포스페이트의 상호작용이 피로포스파타제와 비교하여 ATP 술푸릴라제와 더 상호작용할 수 있어야 한다는 점이며, 그렇지 않으면 피로포스페이트가 폴리머라제에 의해 방출된 직후 가수분해되는 경우 판독 오류가 있을 수 있다.
폴리머라제의 반응 속도는 전형적으로 초 당 약 1000 개 뉴클레오티드를 사용한 반응에서 다른 효소와 비교하여 극적으로 느리고(또는 더 느림)(Fijalkowska, et al., FEMS Microbiol. Rev. 36, 1105-1121 (2012); 및 Lapenta, F. et al. PLOS ONE 11, e0152915 (2016)); 뉴클레오티드 혼입 이벤트는 피로포스페이트의 생성을 위해 필요하므로, ATP-술푸릴라제/루시퍼라제 루프의 상대 반응 속도를 피로포스페이트보다 약 102-109 배 더 빠르게 조정하여, 통계적으로 뉴클레오티드 당 10-1-10-4%의 오류율을 보장하는 것이 본원에서 고려된다. 다른 구현예에서, ATP-술푸릴라제/루시퍼라제 루프의 상대 반응 속도를 피로포스페이트보다 약 103-109 배 더 빠르게 조정하는 것이 또한 본원에서 고려된다. 다른 구현예에서, ATP-술푸릴라제/루시퍼라제 루프의 상대 반응 속도를 피로포스페이트보다 약 103, 104, 105, 106, 107, 108, 및 109 배 더 빠르게 조정하는 것이 또한 본원에서 고려된다. 선행 기술 서열분석 기술의 전형적인 오류율이 실행 당 >15%인 것을 고려하면(Goodwin, et al., Nat. Rev. Genet. 17, 333-351 (2016)), 본 발명의 방법은 통상적인 접근법에 비해 유의한 개선을 제공한다. 이 구성은 또한 또 다른 뉴클레오티드 혼입 이벤트가 발생하기 전에 ATP-술푸릴라제/루시퍼라제 루프를 수회 거친 후 피로포스페이트 가수분해가 발생하도록 가장 느린 반응인 피로포스페이트 가수분해가 폴리머라제보다 여전히 훨씬 더 빠른 방식으로 조정될 수 있다.
실시예 4 - 효소적 루프를 피하기 위한 루시퍼라제 및 피로포스파타제의 공동-캡슐화
ATP 술푸릴라제 및 루시퍼라제 사이의 효소적 반응 루프를 피하는 또 다른 방식으로(도 1g-상단), 이상적으로 음으로 하전된 나노/마이크로 매트릭스(도 5)에서 루시퍼라제 및 피로포스파타제의 공동-캡슐화가 사용된다. 이 매트릭스는 루시퍼라제 및 피로포스파타제의 높은 캡슐화를 갖는 나노입자 형태일 수 있다. ATP 분자는 본질적으로 순 전하를 나타내지 않는 반면 PPi-FL은 순 음전하를 나타낸다. 폴리머라제에 의한 혼입 반응 후 PPi-FL이 방출된 후, 매트릭스의 전하는 PPi-FL을 밀어낼 것이므로 PPi-FL은 음으로 하전된 매트릭스 내에서 캡슐화되는 피로포스페이트보다 ATP 술푸릴라제와 상호작용할 가능성이 더 높다. ATP 술푸릴라제는 표지된 ATP(ATP-FL)를 방출한다. ATP-FL은 음전하를 나타내지 않으므로, 루시퍼라제 및 피로포스파타제가 캡슐화되는 음으로 하전된 매트릭스로 확산될 수 없다. 그 다음에, ATP-FL은 루시퍼라제와 상호작용한다. PPi-FL이 방출될 때 먼저 매트릭스 내에서 PPi-FL을 포스페이트 이온으로 전환할 피로포스파타제와 마주쳐서 시스템에서 임의의 다른 반응으로 재순환될 형광체 표지를 제거한다.
특정 구현예에서, 루시퍼라제 및 피로포스파타제 효소는 전문이 본원에 참조로 포함된 US 4,975,278에 기재된 가교에 의해서와 같이, 당업계에 널리 알려진 방법을 사용하여 서로 연결되거나 또는 테터링될 수 있다.
실시예 5 - 표지된 기질로 기능하는 표지된 효소적 연결은 발광 및 형광 둘 다를 생성한다.
선행 기술의 파이로시퀀싱 방법과는 대조적으로, 본 발명의 FLASH 서열분석 방법은 실시간 단일 분자 서열분석을 달성하기 위해 파이로시퀀싱에 사용되는 유사한 3 개의 효소 연결과 조합된 감마 포스페이트 표지된 뉴클레오티드를 사용한다. 본 발명의 FLASH 방법에서, 반응에 수반되는 각 효소는 표지된 기질의 전환을 촉매한다. 첫번째 반응에서, 폴리머라제는 dNTP 표지된 감마 포스페이트를 부착하여, 표지된 피로포스페이트의 절단을 야기한다(도 1a 및 1b 참조). 다음으로, 표지된 ATP 술푸릴라제는 표지된 피로포스페이트 및 APS를 사용하여 표지된 ATP를 생성하며(도 1c), 여기서 생성된 ATP는 여전히 감마 포스페이트에서 원래 표지를 운반한다. 그 다음에, 해당 표지된 ATP는 루시퍼라제에 의해 추가로 사용되어 표지된 피로포스페이트를 방출하고 발광을 생성한다(도 1d-1f). 발광 생성 이전 단계 중 어느 것이 실패하면 판독을 막을 수 있지만, 발광 생성은 이러한 이전 단계가 성공적으로 완료되었음을 확인하는 것이다.
서열 혼합물의 하기 시약을 본 실험에서 사용하였다:
10x TAE 2.5 uL
루시퍼라제(1M Tris 중 5 mg/ml) 0.25uL ------------------- 1.25 ug Sigma
Cyc-Luc(10mg/mL)(dMSO 중 1:10) 2.5 uL------------ 2.5ug EMD Millipore
시쿼나제 완충제(10X) 2.5 uL Thermofisher
시쿼나제(13U/uL) = 0.25uL -------------------(3.25 유닛) Thermofisher
주형 500nM = 0.5uL ---------------------------------------- 10nM IDT
프라이머 100uM = 0.5uL ------------------------------------- 2 uM IDT
dGTP,Cy5,Atto647 1mM = 5uL --------------------- 200uM Jena Bioscience
MgSO4(100mM) =(rxn 당 1.25 uL) -------------------- 1mM NEB
ASulf(300 U/mL) = 0.25 uL ----------------------------0.075 U NEB
APS(10mM) = 0.5 uL ----------------------------------200 uM Sigma
본 실시예에서, 본원에 제시된 본 발명의 FLASH 서열분석 반응을 수행하였다. 반응은 1.25 μg의 루시퍼라제, 2.5μg의 Cyc-Luc 루시페린, 325 유닛의 시쿼나제, 10nM 사이토신-동종중합체, 2 μM 프라이머, 200 μM dGTP, , 200 μM dGTP-Cy5, , 200 μM dGTP- ATTO-647, 1mM MgSO4 , 0.075 유닛의 ATP 술푸릴라제, 200 μM의 APS를 함유하는 1X TAE 완충제 및 10X 시쿼나제 완충제에서 수행하였다. 루시퍼라제, 및 APS는 Sigma로부터 수득하였다. ATP 술푸릴라제 및 MgSO4는 NEB로부터 수득하였다. 시쿼나제 및 시쿼나제 완충제는 Thermofisher로부터 수득하였다. 사이토신-동종중합체 및 프라이머는 IDT로부터 수득하였다. dGTP-ATTO647은 Jena Biosciences로부터 수득하였다.
초기에 2 개의 별개의 마스터 믹스를 제조하였다. 첫번째 마스터 믹스는 물, 시쿼나제 반응 완충제, 시쿼나제, 사이토신-동종중합체, 프라이머, APS 및 ATP 술푸릴라제를 함유하였다. 두번째 마스터 믹스는 물 1x TAE 완충제, MgSO4, 루시퍼라제 및 Cyc-Luc 루시페린을 함유하였다. 각 마스터 믹스를 혼합하고 각 마스터 믹스의 분취량을 취하고 합하였으며, 이 때 dNTP를 첨가하여 FLASH 반응을 준비하였다. 이 반응을 384-웰 마이크로플레이트 상의 웰에 배치한 다음 렌즈가 장착된 맞춤형 광학 설정에 배치하여 광 출력에 초점을 맞추고 PMT 광검출기로 광을 검출하였다. 각 필터는 수동으로 변화시켜 각 FLASH 반응 믹스의 스펙트럼을 수득하였다.
본 실시예에서, 본원에 제시된 본 발명의 FLASH 서열분석 반응을 수행하였으며, 여기서 서열분석 혼합물은 폴리머라제-ATP술푸릴라제-루시퍼라제 연결을 함유하였고 표적 주형 핵산은 사이토신-동종중합체*(서열번호:1)였다. 이 경우, 외부 여기 공급원은 없으므로, 스펙트럼은 외부 증폭이 없는 발광 스펙트럼이다. 결과는 모든 반응이 완료된 경우에만 발광이 생성될 수 있는 발광 생성을 제시한다. 따라서, 결과는 서열분석 방법의 모든 반응이 완료되었음을 나타낸다. 도 6에 도시된 스펙트럼으로부터 볼 수 있는 바와 같이, 비표지된 dGTP가 용액에 첨가될 때, 기재된 효소 연결의 성공적인 작동을 입증하는 발광이 생성되었다(도 6; 진한 실선 플롯). 감마-포스페이트-표지된-dGTP가 비표지된 dGTP 대신에 사용되었을 때, 다시, 모든 반응의 완료를 입증하는 발광 신호가 관찰되었다. 그러나, 이들 2 개의 감마-포스페이트-표지된-dGTP의 경우, 놀랍게도 dGTP-ATTO647의 형광 방출 피크에 상응하는 약 670 nm(도 6; 연한 실선 플롯); 및 dGTP-Cy5의 형광 방출 피크에 상응하는 약 680 nm(도 6; 파선 플롯)에서 추가 형광 방출 피크가 또한 관찰되었다. 이러한 특정 경우, 형광체 표지는 Cy5이다. 이는 기질이 표지될 때, 이 효소적 연결이 여전히 표지된 기질로 기능하여 발광으로 이어짐을 확인한다. 또한, 루시퍼라제 반응으로부터 생성된 발광을 사용하여 해당 루시퍼라제 발광 반응에 의해 생성된 표지된 피로포스페이트를 여기하였음을 제시하였다(도 1e-1f). 따라서, 루시퍼라제에 의해 방출된 피로포스페이트에서 형광체 표지의 여기에 상응하는 프로세스의 또 다른 주요 이벤트가 입증되었으며, 여기서 이 여기는 도 1d-1f에 도시된 루시퍼라제 반응에 의해 생성된 발광에 의해 유발되었다. 이러한 결과는 표지된 ATP 및 루시퍼라제를 사용한 루시페린의 촉매작용이 각각의 표지된 dNTP 각각에 특이적인 형광체 광의 방출을 야기함을 제시한다.
* 주형 DNA(서열번호:1) (5'- CCC CCC CCC CCC CCC CCC CCC CCC CCC CCC CCC CCC CCC CCC CCC CCC CCC CCC CCC CCC CCC CCC CCC CCC CCC CCC CCC CCC CCC CCC AAA TCT TAT CAT CGG TCG GTG - 3')
프라이머(서열번호:2)(5'- CAC CGA CCG ATG ATA AGA TTT G -3')
본 구현예는 특히 본원의 예시적인 구현예를 참조하여 도시되고 기재되었지만, 형태 및 세부사항의 다양한 변화가 하기 청구범위에 의해 정의된 바와 같은 본 구현예의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 그 안에서 이루어질 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다. 당업자는 통상적인 실험만을 사용하여 본원에 기재된 특정 절차에 대한 수많은 등가물을 인식하거나, 또는 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 본 발명의 범위 내에 있는 것을 간주되고 하기 청구범위에 의해 포괄된다. 본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 비특허 문헌 간행물, 특허, 및 특허 출원의 내용은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 이러한 특허, 출원 및 다른 문서의 적절한 성분, 프로세스, 및 방법이 본 발명 및 이의 구현예를 위해 선택될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Innovasion Labs, Inc. <120> METHODS FOR SINGLE MOLECULE SEQUENCING <130> 124667-002WO1 <140> PCT/US19/22156 <141> 2019-03-13 <150> US 62/642,373 <151> 2018-03-13 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 111 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Template DNA <400> 1 cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc 60 cccccccccc cccccccccc cccccccccc aaatcttatc atcggtcggt g 111 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 caccgaccga tgataagatt t 21

Claims (33)

  1. 하기 단계를 포함하는, 핵산 주형을 서열분석하는 방법(method for sequencing):
    (i) 폴리머라제 효소, (ii) ATP 재생 효소, (iii) 발광 효소, (iv) 주형 핵산, 및 (iii) 성장 핵산 가닥의 주형 유도 합성을 수행하기 위한 성분을 갖는 폴리머라제-ATP 재생 효소-발광 시약 용액을 포함하는 서열분석 혼합물을 제공하는 단계로서, 여기서 상기 시약 용액은 ATP-재생-효소-기질, 발광-기질; 및 복수의 유형의 뉴클레오티드 유사체를 포함하며; 여기서 각 유형의 뉴클레오티드 유사체는 폴리머라제에 의해 절단가능한 표지된 이탈기를 갖고, 각 유형의 뉴클레오티드 유사체는 상이한 표지를 가지며, 여기서 표지된 이탈기는 각각의 뉴클레오티드 유사체가 주형 가닥에 폴리머라제-의존적 결합하면 절단되는 것인, 제공하는 단계;
    복수의 뉴클레오티드 유사체가, a) 뉴클레오티드 유사체가 폴리머라제와 회합하고, b) 뉴클레오티드 유사체 상의 표지된 이탈기가 폴리머라제에 의해 절단될 때 해당 뉴클레오티드 유사체가 폴리머라제에 의해 주형 가닥에 혼입되며, 여기서 표지된 이탈기는 ATP 재생 효소에 의해 ATP-재생-효소-기질과 조합되어 표지된-ATP를 생성한 다음, c) 표지된-ATP가 발광-효소에 결합함으로써, 주형에 순차적으로 첨가되도록 핵산 합성을 수행하는 단계로서, 여기서 발광-기질은 발광-효소에 의해 촉매되어 제한된 시간 동안 발광을 생성하고 각각의 표지된 이탈기를 재생하며, 여기서 상기 발광은 각각의 표지된 이탈기 상에서 표지를 유발하여 광을 생성하는 것인, 수행하는 단계; 및
    핵산 합성이 발생하는 동안 표지로부터 광을 검출하고, 그리고 각 신중한 발광 기간 동안 검출된 광을 사용하여, 주형 핵산의 서열을 걸정하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 유사체가 말단 포스페이트에 부착된 형광단에 의해 변형되는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 이탈기가 표지된 피로포스페이트인, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피로포스페이트가 형광단으로 표지되는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드의 각 염기가 다른 염기에 비해 고유한 형광단으로 표지되는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발광-효소가 루시퍼라제인, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 루시퍼라제가 반딧불이 루시퍼라제인, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발광-기질이 루시페린인, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리머라제 효소가 DNA 폴리머라제인, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ATP 재생 효소가 ATP 술푸릴라제, AGPPase, 및 PPDK로부터 선택되는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ATP-재생-효소-기질이 APS, ADP-글루코스, 및 AMP + PEP로부터 선택되는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표지된 이탈기가 ATP 술푸릴라제에 의해 APS와; AGPPase에 의해 ADP-글루코스와; 또는 PPDK에 의해 AMP+PEP와 조합되는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 유사체의 유형이 dATP, dTTP, dGTP, dCTP, dUTP, dGTPαS, dCTPαS, dTTPαS 및 dATPαS를 포함하는, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 서열분석 혼합물이 표지된 피로포스페이트를 2 개의 포스페이트 이온으로 전환할 수 있는 피로포스파타제 효소를 추가로 포함하는, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 효소 농도의 비율이 ATP 술푸릴라제/루시퍼라제 루프 활성이 피로포스파타제 활성보다 몇자리 수 더 높도록(orders of magnitude higher than) 조정되는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 ATP-술푸릴라제/루시퍼라제 루프의 상대 반응 속도가 피로포스파타제 반응보다 적어도 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012 배 더 빠르게 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  17. 제7항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 루시퍼라제 및 피로포스파타제가 나노매트릭스에 공동-캡슐화되는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 나노매트릭스가 음으로 하전된 나노입자인, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 표지된 ATP(ATP-FL)가 루시퍼라제 및 피로포스파타제가 공동-캡슐화된 음으로 하전된 나노매트릭스에 확산될 수 있는, 방법.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표지된-ATP를 발광-효소에 결합하는 단계 c)에서, 발광-기질은 상기 발광-효소에 의해 촉매되며 나노매트릭스 내에서 발생하는 것인, 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 폴리머라제 효소가 사용되는, 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 폴리머라제 효소가 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 200000, 300000, 400000, 500000, 600000, 700000, 800000, 900000, 및 적어도 1000000 개의 폴리머라제 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 양으로 사용되는, 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 폴리머라제 효소가 적어도 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 100:1, 150:1, 200:1, 250:1, 300:1, 350:1, 400:1, 450:1, 500:1, 550:1, 600:1, 650:1, 700:1, 750:1, 800:1, 850:1, 900:1, 950:1, 1000:1, 10000:1, 20000:1, 30000:1, 40000:1, 50000:1, 60000:1, 70000:1, 80000:1, 90000:1, 100000:1, 200000:1, 300000:1, 400000:1, 500000:1, 600000:1, 700000:1, 800000:1, 900000:1, 및 적어도 1000000:1로 이루어진 군으로부터 선택된, 폴리머라제 대 주형의 비율로 사용되는, 방법.
  24. 하기 단계를 포함하는, 주형 핵산을 서열분석하는 방법:
    표적 주형 핵산, 복수의 유형의 뉴클레오티드 유사체, 및 복수의 폴리머라제 효소를 포함하는 서열분석 혼합물을 제공하는 단계;
    복수의 뉴클레오티드 유사체가 주형에 순차적으로 첨가되도록 핵산 합성을 수행하는 단계; 및
    핵산 합성이 발생하는 동안 각각의 뉴클레오티드 유사체를 검출하여, 주형 핵산의 서열을 결정하는 단계.
  25. 제24항에 있어서, 복수의 폴리머라제 효소가 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 200000, 300000, 400000, 500000, 600000, 700000, 800000, 900000, 및 적어도 1000000 개의 폴리머라제 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 양으로 사용되는, 방법.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 복수의 폴리머라제 효소가 적어도 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 100:1, 150:1, 200:1, 250:1, 300:1, 350:1, 400:1, 450:1, 500:1, 550:1, 600:1, 650:1, 700:1, 750:1, 800:1, 850:1, 900:1, 950:1, 1000:1, 10000:1, 20000:1, 30000:1, 40000:1, 50000:1, 60000:1, 70000:1, 80000:1, 90000:1, 100000:1, 200000:1, 300000:1, 400000:1, 500000:1, 600000:1, 700000:1, 800000:1, 900000:1, 및 적어도 1000000:1로 이루어진 군으로부터 선택된, 폴리머라제 대 주형의 비율로 사용되는, 방법.
  27. 서열분석 반응에서 ATP 재생 효소/루시퍼라제 증폭 루프의 신호 강도를 증가시키는 방법으로서, 제1항의 방법을 수행하는 단계; 및 ATP 재생 효소/루시퍼라제 증폭 루프의 신호 강도를 증가시키는 데 효과적인 코엔자임 A 대 루시퍼라제의 비율로, 코엔자임 A를 서열분석 혼합물에 첨가하는 단계를 포함하는, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 코엔자임 A:루시퍼라제 비율이 1:1, 1:2, 1:5, 1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90, 1:100, 1:250, 1:150, 1:175, 1:200, 1:225, 1:250, 1:275, 1:300, 1:350, 1:400, 1:450, 1:500, 1:550, 1:600, 1:650, 1:700, 1:750, 1:800, 1:850, 1:900, 1:950, 1:1000, 1:1500, 1:2000, 1:3000, 1:4000, 1:5000 코엔자임 A:루시퍼라제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  29. 제27항에 있어서, 상기 루시퍼라제:코엔자임 A 비율이 1:1, 1:2, 1:5, 1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90, 1:100, 1:250, 1:150, 1:175, 1:200, 1:225, 1:250, 1:275, 1:300, 1:350, 1:400, 1:450, 1:500, 1:550, 1:600, 1:650, 1:700, 1:750, 1:800, 1:850, 1:900, 1:950, 1:1000, 1:1500, 1:2000, 1:3000, 1:4000, 1:5000 루시퍼라제:코엔자임 A로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  30. 서열분석 반응에서 ATP 재생 효소/루시퍼라제 증폭 루프의 신호 시간 길이를 조절하는 방법으로서, 제1항의 방법을 수행하는 단계; 및 ATP 재생 효소/루시퍼라제 증폭 루프의 신호 시간 길이를 조절하는 데 효과적인 피로포스파타제 대 ATP 재생 효소의 비율로, 피로포스파타제를 서열분석 혼합물에 첨가하는 단계를 포함하는, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 ATP 재생 효소/루시퍼라제 증폭 루프의 신호 시간 길이를 조절하는 데 효과적인 ATP 재생 효소:피로포스파타제 효소 비율이 1:1, 1:2, 1:5, 1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90, 1:100, 1:250, 1:150, 1:175, 1:200, 1:225, 1:250, 1:275, 1:300, 1:350, 1:400, 1:450, 1:500, 1:550, 1:600, 1:650, 1:700, 1:750, 1:800, 1:850, 1:900, 1:950, 1:1000, 1:1500, 1:2000, 1:3000, 1:4000, 1:5000 ATP 재생 효소:피로포스파타제 효소로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  32. 제30항에 있어서, 상기 ATP 재생 효소/루시퍼라제 증폭 루프의 신호 시간 길이를 조절하는 데 효과적인 피로포스파타제:ATP 재생 효소 비율이 1:1, 1:2, 1:5, 1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90, 1:100, 1:250, 1:150, 1:175, 1:200, 1:225, 1:250, 1:275, 1:300, 1:350, 1:400, 1:450, 1:500, 1:550, 1:600, 1:650, 1:700, 1:750, 1:800, 1:850, 1:900, 1:950, 1:1000, 1:1500, 1:2000, 1:3000, 1:4000, 1:5000 피로포스파타제:ATP 재생 효소로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  33. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ATP 재생 효소가 ATP 술푸릴라제인, 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20230011903A (ko) * 2019-11-19 2023-01-25 사르말, 인크. Sars-cov-2를 검출하기 위한 방법 및 장치
CA3173699A1 (en) * 2020-03-27 2021-09-30 Inanc ORTAC Lash methods for single molecule sequencing & target nucleic acid detection
EP4139052A4 (en) * 2020-04-21 2023-10-18 Roche Diagnostics GmbH HIGH-THROUGHPUT NUCLEIC ACID SEQUENCING USING SINGLE MOLECULE SENSOR ARRAYS
WO2022073493A1 (en) * 2020-10-09 2022-04-14 Bgi Shenzhen Co., Ltd. Methods and compositions for bioluminescence-based sequencing
CA3199745A1 (en) * 2020-10-27 2022-05-05 Quantum-Si Incorporated Calibration of single-molecule detection system
WO2024031306A1 (zh) * 2022-08-09 2024-02-15 深圳华大生命科学研究院 一种双荧光素酶报告基因检测系统及其应用
WO2024067674A1 (zh) * 2022-09-28 2024-04-04 深圳华大智造科技股份有限公司 测序方法
WO2024098185A1 (en) * 2022-11-07 2024-05-16 GeneSense Technology Inc., Shanghai (CN) Nucleic acid sequencing using self-luminescence

Family Cites Families (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4975A (en) 1847-02-20 Tailor s measure
US278A (en) 1837-07-17 Improvement in making soap
GB9620209D0 (en) * 1996-09-27 1996-11-13 Cemu Bioteknik Ab Method of sequencing DNA
US5843665A (en) 1996-10-31 1998-12-01 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Human pyrophosphatase
US6607829B1 (en) 1997-11-13 2003-08-19 Massachusetts Institute Of Technology Tellurium-containing nanocrystalline materials
US6699723B1 (en) 1997-11-25 2004-03-02 The Regents Of The University Of California Organo luminescent semiconductor nanocrystal probes for biological applications and process for making and using such probes
GB2342651B (en) 1998-09-18 2001-10-17 Massachusetts Inst Technology Biological applications of semiconductor nanocrystals
US7056661B2 (en) * 1999-05-19 2006-06-06 Cornell Research Foundation, Inc. Method for sequencing nucleic acid molecules
CA2513889A1 (en) * 2003-01-29 2004-08-19 454 Corporation Double ended sequencing
US7264934B2 (en) * 2004-06-10 2007-09-04 Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. Rapid parallel nucleic acid analysis
GB0416944D0 (en) * 2004-07-29 2004-09-01 Lumora Ltd Method for determining the amount of template nucleic acid present in a sample
WO2007002204A2 (en) * 2005-06-21 2007-01-04 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Pyrosequencing methods and related compostions
US7805081B2 (en) 2005-08-11 2010-09-28 Pacific Biosciences Of California, Inc. Methods and systems for monitoring multiple optical signals from a single source
US7405281B2 (en) 2005-09-29 2008-07-29 Pacific Biosciences Of California, Inc. Fluorescent nucleotide analogs and uses therefor
US7763423B2 (en) 2005-09-30 2010-07-27 Pacific Biosciences Of California, Inc. Substrates having low density reactive groups for monitoring enzyme activity
CN101365807A (zh) 2005-12-22 2009-02-11 加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司 用于掺入核苷酸类似物的聚合酶
AU2006331512B2 (en) 2005-12-22 2012-02-23 Pacific Biosciences Of California, Inc. Active surface coupled polymerases
EP3936857B1 (en) 2006-09-01 2023-06-21 Pacific Biosciences Of California, Inc. Substrates, systems and methods for analyzing materials
WO2008051530A2 (en) 2006-10-23 2008-05-02 Pacific Biosciences Of California, Inc. Polymerase enzymes and reagents for enhanced nucleic acid sequencing
US7714303B2 (en) 2007-05-10 2010-05-11 Pacific Biosciences Of California, Inc. Methods and systems for analyzing fluorescent materials with reduced authofluorescence
US8182993B2 (en) 2007-06-06 2012-05-22 Pacific Biosciences Of California, Inc. Methods and processes for calling bases in sequence by incorporation methods
AU2009204461A1 (en) 2008-01-10 2009-07-16 Pacific Biosciences Of California, Inc. Methods and systems for analysis of fluorescent reactions with modulated excitation
US8530164B2 (en) 2008-09-05 2013-09-10 Pacific Biosciences Of California, Inc. Method for sequencing using branching fraction of incorporatable nucleotides
CA2715385A1 (en) 2008-02-12 2009-08-20 Pacific Biosciences Of California, Inc. Compositions and methods for use in analytical reactions
EP2263087B1 (en) 2008-03-13 2017-08-09 Pacific Biosciences of California, Inc. Labeled reactants and their uses
EP2271751B1 (en) 2008-03-31 2015-07-22 Pacific Biosciences of California, Inc. Generation of modified polymerases for improved accuracy in single molecule sequencing
EP2274446B1 (en) 2008-03-31 2015-09-09 Pacific Biosciences of California, Inc. Two slow-step polymerase enzyme systems and methods
US9127259B2 (en) 2008-03-31 2015-09-08 Pacific Biosciences Of California, Inc. Enzymes resistant to photodamage
US8603741B2 (en) 2010-02-18 2013-12-10 Pacific Biosciences Of California, Inc. Single molecule sequencing with two distinct chemistry steps
ES2805802T3 (es) 2013-04-18 2021-02-15 Univ California Recubrimientos a nanoescala para la encapsulación de entidades biológicas
EP3189162A1 (en) * 2014-09-02 2017-07-12 Pharmozyme, Inc. Genetic detection platform
CN107849605B (zh) * 2015-07-21 2021-08-20 欧姆尼欧美公司 核酸测序方法和系统
CN108603227A (zh) * 2015-11-18 2018-09-28 卡利姆·U·米尔 超分辨率测序
US11486000B2 (en) * 2016-12-16 2022-11-01 Sarmal, Inc. Methods for single molecule sequencing

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