KR20230011903A - Sars-cov-2를 검출하기 위한 방법 및 장치 - Google Patents

Sars-cov-2를 검출하기 위한 방법 및 장치 Download PDF

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사르말, 인크.
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Abstract

SARS-COV2를 포함하는 표적-핵산 서열의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함하는, 핵산 서열 및/또는 병원체를 검출하기 위한 방법, 시스템 및 장치가 본원에서 제공된다.

Description

SARS-COV-2를 검출하기 위한 방법 및 장치
본 발명은 표적-핵산 서열의 존재 또는 부재를 검출하는 방법에 관한 것이다.
폴리머라제 연쇄 반응은 특정한 DNA 절편의 카피의 수를 증가시켜 존재를 검출하고/거나 그 절편을 정량화하는데 또는 추가의 최종 용도, 예컨대 DNA의 양을 증가시키는 것을 위해 사용될 수 있다.
이를 위해 이는 표적화하는 서열의 시작과 끝에 어드레스된 정방향 및 역방향 프라이머에 상응하는 2개의 올리고뉴클레오티드 서열을 사용한다. 정방향 및 역방향 프라이머는 이중 가닥 DNA의 상보적 가닥에 결합한다. 폴리머라제 연쇄 반응은 온도를 이용하여 상보적 가닥 및 프라이머 올리고뉴클레오티드 사이의 혼성화 및 변성 사이클을 생성할 뿐만 아니라 폴리머라제 효소 활성을 켜고 끈다.
PCR에서 온도 수준의 특이적 서열의 반복 루프 (또한 열 사이클링으로 지칭됨)가 있다. 전형적인 PCR 반응은 30-40 사이클을 거친다. PCR 프로세스 동안 역방향 및 정방향 프라이머에 의해 한정된 출발 주형 DNA 서열의 많은 카피가 생성된다. 프라이머가 주형 서열에 결합하는 경우, 이들은 프라이머가 가장자리를 이루는 핵산의 섹션을 증폭시킨다 (그의 많은 카피를 생성함). 이중 가닥 DNA에 민감한 DNA 결합 염료는 성공적인 증폭을 인식하는데 이용되거나; 또는 초기에 켄칭된 프로브, 예를 들어, 택맨은 DNA 상의 특정한 서열의 존재 하에서 형광을 낸다. PCR의 생성물은 겔을 구동하거나 개재 형광 염료를 사용함으로써 확인되며, 이 경우, 형광 강도는 증폭된 서열의 양과 상관된다.
대부분의 PCR 적용에 대해, DNA 절편의 많은 카피에 이르게 되는 것은 실제로 필요하지 않다. PCR은 단지 정량적 PCR (qPCR)에서와 같이 절편의 초기 카피 수의 존재 또는 정량화를 위해 수행된다. 그러나, 이러한 PCR 증폭은 추가의 제한을 유발한다. 예를 들어, 증폭의 높은 특이성은 대부분의 경우에 달성될 수 없다. qPCR에서, DNA 개재 염료의 사용은 단지 이중 가닥 DNA의 존재만을 검출할 수 있다. 더욱이 많은 경우에, 프라이머 쌍은 서로에 대한 주형으로서 작용하여 원하지 않는 부산물을 증폭시킨다. 이들 비-특이적 인공물을 방지하기 위해, 택맨 프로브와 같은 방법이 개발되었다. 이 방법은 전체 반응에 복잡성의 또 다른 수준을 추가하는, 한 측에 부착된 형광단 및 다른 측에 부착된 켄처를 갖는 생성된 서열의 특이적 영역에 상보적인 추가의 프로브의 디자인을 요구한다. 택맨 또는 유사한 방법은 생성된 서열에 특이적이지만, 실제 표적 서열 및 복잡성을 증가시키는 서열의 길이의 관점에서 상이한 요구를 갖는다.
대부분의 바이러스 감염, 예컨대 코로나바이러스는 현재 치료법 또는 백신을 갖지 않는다. 조기의 및 효과적인 시험은 이들 바이러스 범유행을 대적하는데 중요하다. 세계 보건 기구는 방안의 조합을 권고한다: 신속한 진단 및 사례의 즉시 격리, 밀접 접촉한 개체에 대한 엄격한 추적 및 예방적 자가-격리. 철저한 스크리닝은 감염된 개체를 효과적으로 격리하고 바이러스의 확산을 방지하는 것을 돕는데 사용될 수 있는 조기 진단을 허용한다. 고도로 전염성인 바이러스 감염으로, 적당한 시험의 결여는 급속한 바이러스 확산 및 증상을 발현하는 사람들의 입원을 허용하여, 상당한 인간 및 경제적 손실을 초래한다.
따라서, 시험되는 개체의 현장 진료에서 핵산을 검출하는 개선된 방법에 대한 필요가 있다.
하기 단계를 포함하는, 샘플에서 핵산 서열의 존재를 검출하고/거나 정량화하는 방법이 본원에서 제공된다:
(i) 폴리머라제 효소, (ii) ATP 재생 효소, (iii) 발광 효소 (예를 들어, 반딧불이 루시페라제), (iv) 샘플로부터의 주형 핵산, (v) 특정한 표적 핵산 서열에 혼성화하는 (예를 들어, 그에 상보적인) 프라이머-프로브, 및 (vi) 성장하는 핵산 가닥의 주형 지정된 신장 합성을 수행하기 위한 구성요소를 갖는 폴리머라제-ATP 재생 효소-발광 시약 용액을 포함하는 신장 혼합물을 제공하는 단계로서, 여기서 상기 시약 용액은 ATP-재생-효소-기질 (예를 들어, ATP 술푸릴라제에 의해 APS와; AGPPase에 의해 ADP-글루코스와; PPDK에 의해 AMP+PEP와 등), 발광-기질; 및 복수의 유형의 dNTP 또는 뉴클레오티드 유사체를 포함하며, 여기서 뉴클레오티드 유사체의 각각의 유형은 폴리머라제에 의해 절단가능한 이탈기를 가지며, 여기서 이탈기는 주형 가닥에의 각각의 뉴클레오티드 유사체의 폴리머라제-의존적 결합 시 절단되는 것인 단계;
프라이머-프로브가 표적 핵산 서열에 혼성화하는 경우 하나 또는 복수의 뉴클레오티드 유사체가 주형에 순차적으로 첨가되도록 핵산 신장 합성을 수행하는 단계로서, 이로써 a) 뉴클레오티드 유사체는 폴리머라제와 회합하고, b) 뉴클레오티드 유사체는 그 뉴클레오티드 유사체 상의 이탈기가 폴리머라제에 의해 절단되는 경우 폴리머라제에 의해 주형 가닥 상에 혼입되며, 여기서 이탈기는 ATP 재생 효소에 의해 ATP-재생-효소-기질과 (예를 들어, ATP 술푸릴라제에 의해 APS와; AGPPase에 의해 ADP-글루코스와; PPDK에 의해 AMP+PEP와 등) 조합되어 ATP를 산출하고, 이어서 c) ATP를 발광-효소에 결합시키며, 여기서 발광-기질은 발광-효소에 의해 촉매되어 발광을 생성하면서 각각의 이탈기를 재생시키는 것인 단계; 및
핵산 합성이 일어나고 있는 동안 발광으로부터 광을 검출하는 단계로서, 이로써 광의 검출은 특정한 표적 핵산 서열의 존재를 지시하는 것인 단계. 방출된 발광 광은 적절한 광학 센서 및/또는 검출 장치에 의해 검출될 수 있다.
표적 핵산 검출은 뉴클레오티드가 상보적 가닥에 첨가될 때마다 생성되는 발광을 검출하여 조사 프라이머-프로브의 결합 및 쇄 신장 반응의 개시에 의해 표적의 존재를 밝힘으로써 달성된다. 표적 핵산이 존재하지 않는 경우, 프라이머-프로브는 결합하지 않을 것이고, 쇄 신장은 개시되지 않을 것이고, 검출되는 발광은 없을 것이다. 따라서, 표적 핵산이 존재하는 경우, 이는 프라이머-프로브에 의해 결합되어 쇄 신장을 개시할 것이다. 본원에서 DNA 가닥의 연속적 신장에 의한 발광 증폭 (LACES) 방법으로 지칭되는 실시양태에서, 각각의 특이적 뉴클레오티드 부착은 광학 센서/검출기에 의해 검출될 수 있는 발광 (예를 들어, 검출가능한 광) 신호를 생성할 것이다. 그 결과, 검출가능한 광 신호는 용이하게 및 신속하게 생성되고, 이는 적합한 현장 진료 (POC) 장치에서 검출될 수 있다 (도 1).
본원에서 제공된 본 발명 LACES 방법은 표적 핵산 절편의 존재, 및 그의 카피 수의 정량화를 검출하는데 사용된다. 이는 반응 혼합물 중의 조사 프라이머 (예를 들어, 프라이머-프로브) 올리고뉴클레오티드를 사용한다. 프라이머-프로브 서열이 주형 서열과 혼성화하는 경우, 폴리머라제는 이중 가닥의 단부에서 결합한다. 폴리머라제를 통한 상보적 가닥의 신장이 일어남에 따라, 피로포스페이트 (PPi)는 이탈기로서 방출된다. 본 발명에 따른 효소 시스템 (ATP 술푸릴라제, PPDK, AGPase 등)을 사용하여, PPi는 ATP로 전환된다. 이 생성된 ATP는 루시페린과 함께 루시페라제에 의해 이용되어 발광을 생성하며, 이로써 피로포스페이트 이탈기 (PPi)가 다시 방출된다. 이 방출된 피로포스페이트는 ATP 생성 효소에 의해 리사이클링되어 루시페라제에 의해 다시 사용하기 위한 ATP를 형성하여 또 다른 발광 사건을 생성하며, 그에 의해 각각의 피로포스페이트로 다수회 구동하는 효소적 루프를 생성한다. 폴리머라제가 보다 많은 뉴클레오티드를 쇄 신장을 통해 주형 핵산에 부착시킴에 따라, 보다 많은 이들 발광 생성 효소적 루프는 총 발광에 첨가되며, 이는 상보적 가닥의 신장의 결과로서 생성된 검출가능한 광을 효과적으로 증폭시키며; 그에 의해 조사되는 표적 핵산 서열의 존재를 검출하고/거나 정량화한다.
또 다른 실시양태 (도 11에 제시됨)에서, 형광 표지는 뉴클레오티드의 말단 포스페이트에 (또는 피로포스페이트 이탈기; PPi 상의 또 다른 영역에) 부착된다. 이 형광 표지의 여기 스펙트럼은 적어도 부분적으로 루시페린의 산화에 의한 생성된 발광과 매칭된다. 이 표지된 뉴클레오티드는 또한 임의로 켄처 분자 (뉴클레오티드의 염기 또는 당 중 어느 하나에 제거가능하게 또는 비-제거가능하게 부착됨)를 포함할 수 있으며, 그의 흡수 스펙트럼은 형광 표지 (뉴클레오티드의 말단 포스페이트에 부착됨)의 방출 스펙트럼과 중첩된다. 형광 표지 및 켄처 둘 다로 변형된 뉴클레오티드는 본원에서 켄칭된 뉴클레오티드로 지칭된다. 따라서, 뉴클레오티드 유사체와 폴리머라제의 상호작용 시, 폴리머라제는 부착된 형광단을 갖는 피로포스페이트 (표지된 피로포스페이트)를 방출하여, 형광 표지를 켄처로부터 분리한다. 분리되는 경우, 켄처는 형광 표지의 방출을 흡수할 수 없을 것이다. 표지된 피로포스페이트는 이어서 ATP 생성 효소와 반응하고, 동일한 형광 표지에 의해 이제 표지된 ATP (표지된 ATP)로 전환된다. 이 표지된 ATP는 이어서 루시페라제와 상호작용하여 발광을 생성하고 표지된 피로포스페이트를 방출할 것이다. 생성된 발광은 표지된 피로포스페이트 상의 형광 표지를 여기시키고, 여기된 형광단은 그의 특이적 방출 범위에서 광을 방출한다. 폴리머라제에 대한 개선된 특이성을 갖는 켄칭된 뉴클레오티드가 생성되므로, 형광 표지의 방출 스펙트럼의 범위에서 생성된 생성된 광은 생성된 신호의 특이성을 증가시키는데; 이는 이미 혼입된 뉴클레오티드가 폴리머라제와 반응되지 않은 배경에서의 다른 뉴클레오티드로부터 구별되기 때문이다. 이 실시양태에 대해, 각각의 뉴클레오티드는 동일한 표지 또는 상이한 표지로 표지될 수 있다.
본원에서 가닥의 연속적 신장에 의한 형광 활성화 (FACES)로 지칭되는 또 다른 실시양태에서, 켄칭된 뉴클레오티드는 단지 폴리머라제 효소를 포함하는 시스템에서 사용된다 (도 12). 이 경우, 외부 광원은 형광단을 여기시키는데 사용된다. 켄칭된 뉴클레오티드가 양성 샘플 표적 주형 핵산 가닥 상의 폴리머라제와 반응하는 경우, 표지된 피로포스페이트가 방출되어 주형 가닥에 부착된 뉴클레오티드의 수에 비례하는 형광 신호를 생성한다. 다시 말해서, 형광 신호는 쇄 신장 길이에 비례한다. 신장하는 가닥 내로 혼입되지 않은 켄칭된 뉴클레오티드는 켄처 분자를 갖는 형광 표지의 가까운 근접으로 인해 심지어 여기 하에서도 임의의 방출을 나타내지 않는다. 이들 비-혼입된 뉴클레오티드에 대한 형광 방출은 켄칭되며, 그에 의해 배경의 낮은 양 내지 0 양을 달성할 것이다.
본 발명 신호 증폭 핵산 서열 검출 및/또는 정량화 방법의 이점은 온도 사이클링에 대한 필요 없는 특정한 서열의 검출, 또는 DNA의 카피 수의 실질적 증가이다. 본 발명 방법을 사용하여, 특정 실시양태에서, DNA의 혼성화로부터 생성된 광은 효소적 루프로 추가로 증폭되어, 각각의 신호를 많은 효소적 사건으로 전환시켜 카피 수의 지수적 증가 대신 쇄-신장-광-방출 반응을 발생시킨다.
본원에서 제공된 본 발명 광-신호 검출 방법의 또 다른 이점은 이들이 검출가능한, 실행가능한 신호를 제공하는데 있어서 PCR보다 훨씬 더 빠르다는 것이다. 예를 들어, 전형적인 PCR은 전형적으로 최대 대략 30-40 사이클을 가지며, 여기서 각각의 사이클은 완결하는데 수 분이 걸려서 적어도 1시간 내지 수 시간의 총 실행 지속기간을 초래한다. PCR로 보다 짧은 실행을 할 수 있지만, 특이성을 포기하며; 그러한 보다 짧은 실행 사례는 프라이머, 프로브 및 주형 배치의 관점에서 매우 제한된다. 대조적으로, 표적 핵산 서열을 검출하고/거나 정량화하기 위한 본 발명 광-신호 검출 방법 (예를 들어 LACES 및 FACES)은 신장이 시작되자마자, 예컨대 증폭 루프가 즉시 결속되는 LACES 반응에서 검출가능한 신호를 생성하기 시작한다. 매우 조기에 (예를 들어, 불과 수 분 내에 등) 생성된 초기 신호는 나중의 신호에 비해 가장 높고 가장 특이적인 신호이다. 따라서, LACES에 의해 생성된 신호의 진화는 신속한 초기 증가, 이어서 긴 붕괴에 의해 기재될 수 있는 반면; 정량적 PCR로는, 이는 많은 사이클 및 훨씬 더 긴 기간 후에 검출가능하게 되고, 결국 플라토에 도달하는 지수적 증가이다. 보다 특히, LACES는 특이성을 포기하지 않고 qPCR에 비해 훨씬 더 빨리 일어나는 초기 신속한 증가 기간에서의 매우 특이적인 신호를 제공한다.
예를 들어, 본 발명의 특정한 실시양태에서, 단일 폴리머라제 또는 복수의 폴리머라제는 핵산 쇄 신장 반응 혼합물 (예를 들어, 벌크한 반응에서 또는 단일 액적에서)로 구속되고, 여기서 폴리머라제(들)는 검출되는 dNTP 혼입 신호를 생성하는 외부 광 여기로 처리되지 않는다.
특정한 실시양태에서, 개시된 발명은 특이적 조사 프라이머-프로브를 표적 서열에 혼성화하고, 이들이 dNTP를 순차적으로 혼입함에 따라 개별적 폴리머라제 효소에 의해 유발된 검출가능한 광 신호 (예를 들어, 발광, 형광 등)를 모니터링하는 것에 기반하여 특이적 표적 핵산을 검출하기 위한 기술이다. 예를 들어, 특정한 실시양태에서, 본 발명은 폴리머라제가 주형에 상보적인 dNTP 또는 뉴클레오티드 유사체를 혼입할 때마다, 피로포스페이트 이탈기 (PPi)가 혼입 프로세스 동안 생성되는 검출가능한 광 (예를 들어, 발광 및/또는 형광 등) 신호를 유발하는 프로세스를 포함하고, 여기서 이러한 검출가능한 광 (예를 들어, 발광 및/또는 형광) 신호는 본원에 기재된 바와 같은 효소 기반 발광 반응에 의해 유발된다. 다시 말해서, 이들 실시양태에서, PPi (또는 PPi + FL) 이탈기는 발광 반응을 유발하며, 그에 의해 그 특정한 dNTP에 대한 제한된 양의 시간 동안 검출가능한 광 신호를 방출한다. 프로세스는 다음 dNTP 혼입 동안 반복된다 (도 1).
보다 특히, 폴리머라제가 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트 (dNTP) 뉴클레오티드 유사체를 주형 DNA에 상보적인 가닥에 혼입할 때마다, 검출가능한 광 (예를 들어, 발광 및/또는 형광) 신호가 생성된다. 5가지 유형의 dNTP, 즉, 데옥시아데노신 트리포스페이트 (dATP), 데옥시구아노신 트리포스페이트 (dGTP), 데옥시시티딘 트리포스페이트 (dCTP), 및 데옥시티미딘 트리포스페이트 (dTTP) 및 데옥시우리딘 트리포스페이트 (dUTP)가 있다. 이전에 부착된 뉴클레오티드 유사체의 3' 모이어티에의 뉴클레오티드 유사체의 부착의 완결 시, 본원에 기재된 "폴리머라제-ATP 재생 효소-루시페라제" 3-효소 반응 내로 들어가는 이탈기에 의해 생성된 검출가능한 광 신호 (예를 들어, 발광 및/또는 형광)는 적절한 광학 센서 및/또는 검출 장치에 의해 검출된다. 다시 말해서, 주형 가닥 내로 혼입된 각각의 dNTP는 광의 검출가능한 펄스를 발생시킨다.
다른 실시양태에서, ATP 재생 효소/루시페라제 증폭 루프의 신호의 강도를 증가시키는데 유효한 조효소 A 대 루시페라제의 비로 조효소 A를 쇄 신장 혼합물에 첨가함으로써, 본 발명 핵산 신장 합성 반응에서, 이탈기에 의해 생성된 검출가능한 광 신호 (예를 들어, 발광 및/또는 형광)는 증폭되거나, ATP 재생 효소/루시페라제 증폭 루프의 신호의 강도는 증가된다.
또한, 본원에서 TEEM 방법으로 지칭되는 전기적 변조에 의한 풍부화에 의한 표적 풍부화를 위한 방법이 본원에서 제공된다. 핵산-함유 샘플로부터 표적-핵산을 풍부화하거나 단리하기 위한 본 발명 TEEM 방법은 하기 단계를 포함한다:
a. 제1 및 제2 전극을 갖는 유체 챔버에 이온을 포함하는 전해 유체 용액 및 핵산-함유 샘플을 수용하는 단계로서, 여기서 적어도 하나의 전극은 표적-핵산에 상보적인 복수의 포획-프로브가 그에 부착되어 있으며, 여기서 포획 프로브는 전극-용액 계면에 있는 것인 단계;
b. 어닐링-전압을 전극-용액 계면에 근접하여 전해 유체에 인가하여 계면에 의한 어닐링-pH 수준을 생성하는 단계로서, 여기서 어닐링-pH 수준은 핵산-함유 샘플 내의 핵산 및 포획-프로브 사이의 임의의 수의 상보적 염기 쌍의 어닐링을 유발하는 것인 단계;
c. 변성-전압을 전극-용액 계면에 근접하여 전해 유체에 인가하여 계면에 의한 변성-pH 수준을 생성하는 단계로서, 여기서 변성-pH 수준은 이중-가닥 포획-프로브의 전장보다 더 짧은 특정한 수의 염기 쌍 또는 그보다 더 짧은 특정한 범위의 염기 쌍 중 어느 하나인 포획 프로브 및 표적-핵산의 혼성화된 쌍을 포함하는 이중-가닥 핵산의 변성을 유발하는 것인 단계; 및
d. 어닐링-전압 및 변성-전압 사이의 전압을 변조하는 단계로서, 여기서 상응하는 pH 수준의 최종 적용 (예를 들어, 어닐링 또는 변성) 후, 표적-핵산은 전극 상의 포획-프로브에 결합되어 잔류함으로써 핵산-함유 샘플로부터 풍부화되거나 단리되는 것인 단계.
특정한 실시양태에서, 표적-핵산이 풍부화되거나 단리되면, 이는 이어서 검출된다. 검출은 LACES, 직접 검출, PCR, 롤링 서클 증폭, 라이게이션 및 PCR의 조합, 및 증폭에 이어서 검출 단계, 표지된 프로브, 개재 형광 염료로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의해서일 수 있다. 한 실시양태에서, 핵산-함유 샘플로부터 포획-프로브에 검출되지 않은 물질은 검출 전에 세척 제거된다. 특정한 실시양태에서, 표적-핵산은 본원에서 제공된 본 발명 LACES 방법에 의해 검출된다.
특정한 실시양태에서, pH 수준은 용액 중의 이온의 이동을 통해 생성된다. 특정 실시양태에서, 어닐링-전압 및 변성-전압 사이의 전압을 변조하는 것은 0.1 - 1000 Khz (예를 들어, 초당 100 - 1,000,000 사이클)의 범위의 변조 주파수에서 이루어진다. 특정한 실시양태에서, 전극 상의 포획-프로브의 밀도는 cm2당 100 내지 1,000,000개의 올리고뉴클레오티드 프로브이다. 특정 실시양태에서, 변조 단계 동안 변성되는 상보적 염기 쌍의 수는 1-20, 1-15, 1-10, 또는 1-5개의 염기 쌍 이중-가닥의 범위로부터 선택된다. 특정한 실시양태에서, 핵산-함유 샘플은 세포, 타액, 소변, 혈액, 모발, 정액, 타액, 골, 조직, 치아, 세포-용해물, 바이러스, 세포 핵산 또는 게놈 핵산으로부터 선택된다.
또한, 표적-핵산의 존재를 검출하기 위한 본 발명 TEEM 및 LACES 방법 둘 다를 조합한 방법이 본원에서 제공된다. 예를 들어, 하기 단계를 포함하는, 핵산-함유 샘플에서 표적-핵산 서열의 존재를 검출하는 방법이 본원에서 제공된다:
a. 제1 및 제2 전극을 갖는 유체 챔버에 이온을 포함하는 전해 유체 용액 및 핵산-함유 샘플을 수용하는 단계로서, 여기서 적어도 하나의 전극은 표적-핵산에 상보적인 복수의 포획/프라이머-프로브가 그에 부착되어 있으며, 여기서 포획/프라이머-프로브는 전극-용액 계면에 있는 것인 단계;
b. 어닐링-전압을 전극-용액 계면에 근접하여 전해 유체에 인가하여 계면에 의한 어닐링-pH 수준을 생성하는 단계로서, 여기서 어닐링-pH 수준은 핵산-함유 샘플 내의 핵산 및 포획/프라이머-프로브 사이의 임의의 수의 상보적 염기 쌍의 어닐링을 유발하는 것인 단계;
c. 변성-전압을 전극-용액 계면에 근접하여 전해 유체에 인가하여 계면에 의한 변성-pH 수준을 생성하는 단계로서, 여기서 변성-pH 수준은 이중-가닥 포획-프로브의 전장보다 더 짧은 특정한 수의 염기 쌍 또는 그보다 더 짧은 특정한 범위의 염기 쌍 중 어느 하나인 포획 프로브 및 표적-핵산의 혼성화된 쌍을 포함하는 이중-가닥 핵산의 변성을 유발하는 것인 단계; 및
d. 어닐링-전압 및 변성-전압을 변조하는 단계로서, 여기서 상응하는 pH 수준의 최종 적용 (예를 들어, 어닐링 또는 변성) 후, 표적-핵산은 전극 상의 포획/프라이머-프로브에 결합되어 잔류함으로써 핵산-함유 샘플로부터 풍부화되거나 단리되며, 여기서 결합된 표적-핵산은 주형 지정된 신장 합성을 위한 주형 가닥인 단계;
e. (i) 폴리머라제 효소, (ii) ATP 재생 효소, (iii) 발광 효소 (예를 들어, 반딧불이 루시페라제), 및 (iv) 성장하는 핵산 가닥의 주형 지정된 신장 합성을 수행하기 위한 구성요소를 갖는 폴리머라제-ATP 재생 효소-발광 시약 용액을 포함하는 신장 혼합물을 제공하는 단계로서, 여기서 상기 시약 용액은 ATP-재생-효소-기질, 발광-기질; 및 복수의 유형의 dNTP 또는 뉴클레오티드 유사체를 포함하며, 여기서 뉴클레오티드 유사체의 각각의 유형은 폴리머라제에 의해 절단가능한 이탈기를 가지며, 여기서 이탈기는 주형 가닥에의 각각의 뉴클레오티드 유사체의 폴리머라제-의존적 결합 시 절단되는 것인 단계;
f. 포획/프라이머-프로브가 표적 핵산 서열에 혼성화하는 경우 하나 또는 복수의 뉴클레오티드 유사체가 주형 가닥에 순차적으로 첨가되도록 핵산 신장 합성을 수행하는 단계로서, 이로써 a) 뉴클레오티드 유사체는 폴리머라제와 회합하고, b) 뉴클레오티드 유사체는 그 뉴클레오티드 유사체 상의 이탈기가 폴리머라제에 의해 절단되는 경우 폴리머라제에 의해 주형 가닥 상에 혼입되며, 여기서 이탈기는 ATP 재생 효소에 의해 ATP-재생-효소-기질과 조합되어 ATP를 산출하고, 이어서 c) ATP를 발광-효소에 결합시키며, 여기서 발광-기질은 발광-효소에 의해 촉매되어 발광을 생성하면서 각각의 이탈기를 재생시키는 것인 단계; 및
g. 핵산 합성이 일어나고 있는 동안 발광으로부터 광을 검출하는 단계로서, 이로써 광의 존재는 특정한 표적 핵산 서열의 존재를 지시하는 것인 단계. 한 실시양태에서, 핵산-함유 샘플로부터 포획/프라이머-프로브에 결합되지 않은 물질은 단계 (e)의 신장 반응 혼합물을 제공하기 전에 세척 제거된다.
또한, 샘플을 제조하는 것을 용이하게 하는 유전영동을 포함하는 포유동물-세포 샘플로부터 출발하여 표적-핵산을 풍부화하거나 단리하는 본 발명 TEEM 방법이 본원에서 제공된다. 예를 들어, 하기 단계를 포함하는, 포유동물-세포 샘플로부터 표적-핵산을 풍부화하거나 단리하는 방법이 본원에서 제공된다:
a. 제1 및 제2 전극을 갖는 유체 챔버에 이온을 포함하는 전해 유체 및 포유동물-세포 샘플을 수용하는 단계;
b. 세포를 용해시켜 세포-용해물을 형성하는 단계;
c. 비대칭 유전체 장을 세포-용해물을 함유하는 용액에 인가하는 단계로서, 여기서 세포-용해물 샘플로부터의 총-핵산은 적어도 하나의 전극에 의해 포획되는 것인 단계;
d. 유체 챔버로부터 비포획된 세포-용해물을 세척하는 단계;
e. 유체 챔버에서 이온을 포함하는 전해 유체 용액 내로 총-핵산을 재현탁시키는 단계로서, 여기서 적어도 하나의 전극은 표적-핵산에 상보적인 복수의 포획-프로브가 그에 부착되어 있으며, 여기서 포획 프로브는 전극-용액 계면에 있는 것인 단계;
f. 어닐링-전압을 전극-용액 계면에 근접하여 전해 유체에 인가하여 전극-용액 계면에 의한 어닐링-pH 수준을 생성하는 단계로서, 여기서 어닐링-pH 수준은 총-핵산 및 포획-프로브 사이의 임의의 수의 상보적 염기 쌍의 어닐링을 유발하는 것인 단계;
g. 변성-전압을 전극-용액 계면에 근접하여 전해 유체에 인가하여 계면에 의한 변성-pH 수준을 생성하는 단계로서, 여기서 변성-pH 수준은 이중-가닥 포획-프로브의 전장보다 더 짧은 특정한 수의 염기 쌍 또는 그보다 더 짧은 특정한 범위의 염기 쌍 중 어느 하나인 포획 프로브 및 표적-핵산의 혼성화된 쌍을 포함하는 이중-가닥 핵산의 변성을 유발하는 것인 단계; 및
h. 어닐링-전압 및 변성-전압을 변조하는 단계로서, 여기서 상응하는 pH 수준의 최종 적용 (예를 들어, 어닐링 또는 변성) 후, 표적-핵산은 전극 상의 포획/프라이머-프로브에 결합되어 잔류함으로써 총-핵산으로부터 풍부화되거나 단리되는 것인 단계.
또한, 샘플을 제조하는 것을 용이하게 하는 유전영동을 포함하는 세포-용해물 샘플로부터 출발하여 표적-핵산을 풍부화하거나 단리하는 본 발명 TEEM 방법이 본원에서 제공된다. 예를 들어, 하기 단계를 포함하는, 세포-용해물 샘플로부터 표적-핵산을 풍부화하거나 단리하는 방법이 본원에서 제공된다:
a. 제1 및 제2 전극을 갖는 유체 챔버에 이온을 포함하는 전해 유체 용액 및 세포-용해물 샘플을 수용하는 단계;
b. 비대칭 유전체 장을 세포 용해물 샘플을 함유하는 용액에 인가하는 단계로서, 여기서 세포-용해물 샘플로부터의 총-핵산은 적어도 하나의 전극 (예를 들어, 제1 전극)에 의해 포획되는 것인 단계;
c. 유체 챔버로부터 비포획된 세포-용해물을 세척하는 단계;
d. 유체 챔버에서 이온을 포함하는 전해 유체 용액 내로 총-핵산을 재현탁시키는 단계로서, 여기서 적어도 하나의 전극 (예를 들어, 제1 전극)은 표적-핵산에 상보적인 복수의 포획-프로브가 그에 부착되어 있으며, 여기서 포획 프로브는 전극-용액 계면에 있는 것인 단계;
e. 어닐링-전압을 전극-용액 계면에 근접하여 전해 유체에 인가하여 전극-용액 계면에 의한 어닐링-pH 수준을 생성하는 단계로서, 여기서 어닐링-pH 수준은 총-핵산 및 포획-프로브 사이의 임의의 수의 상보적 염기 쌍의 어닐링을 유발하는 것인 단계;
f. 변성-전압을 전극-용액 계면에 근접하여 전해 유체에 인가하여 계면에 의한 변성-pH 수준을 생성하는 단계로서, 여기서 변성-pH 수준은 이중-가닥 포획-프로브의 전장보다 더 짧은 특정한 수의 염기 쌍 또는 그보다 더 짧은 특정한 범위의 염기 쌍 중 어느 하나인 포획 프로브 및 표적-핵산의 혼성화된 쌍을 포함하는 이중-가닥 핵산의 변성을 유발하는 것인 단계; 및
g. 어닐링-전압 및 변성-전압을 변조하는 단계로서, 여기서 상응하는 pH 수준의 최종 적용 (예를 들어, 어닐링 또는 변성) 후, 표적-핵산은 전극 상의 포획/프라이머-프로브에 결합되어 잔류함으로써 풍부화되거나 단리되는 것인 단계.
특정한 실시양태에서, 총-핵산은 비대칭 유전체 장을 종료시킴으로써 유체 챔버 내로 재현탁된다. 특정 실시양태에서, 세포-용해물은 유체 챔버 내의 포유동물 세포-샘플을 용해시킴으로써 얻어진다. 특정한 실시양태에서, 표적-핵산은 LACES, 직접 검출, PCR, 롤링 서클 증폭, 라이게이션 및 PCR의 조합, 및 증폭에 이어서 검출 단계, 표지된 프로브, 개재 형광 염료로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의해 검출된다. 특정한 실시양태에서, 핵산-함유 샘플로부터 포획/프라이머-프로브에 결합되지 않은 물질은 검출 전에 세척 제거된다. 특정한 실시양태에서, 표적-핵산은 LACES 방법에 의해 검출된다. 포유동물 세포-샘플은 세포, 타액, 소변, 혈액, 모발, 정액, 타액, 골, 조직, 치아, 세포-용해물, 바이러스, 세포 핵산 또는 게놈 핵산으로부터 얻어진다.
또한, 표적-핵산을 풍부화하는 (본 발명 TEEM 방법을 통해) 및 풍부화된-핵산의 존재를 검출하고/거나 정량화하는 (본 발명 LACES 방법을 통해) 둘 다를 위한 방법이 본원에서 제공된다. 예를 들어, 하기 단계를 포함하는, 포유동물-세포 샘플로부터 표적-핵산을 풍부화하거나 단리하는 방법이 본원에서 제공된다:
a. 제1 및 제2 전극을 갖는 유체 챔버에 이온을 포함하는 전해 유체 및 포유동물-세포 샘플을 수용하는 단계;
b. 세포를 용해시켜 세포-용해물을 형성하는 단계;
c. 비대칭 유전체 장을 세포-용해물을 함유하는 용액에 인가하는 단계로서, 여기서 세포-용해물 샘플로부터의 총-핵산은 적어도 하나의 전극 (예를 들어, 제1 전극)에 의해 포획되는 것인 단계;
d. 유체 챔버로부터 비포획된 세포-용해물을 세척하는 단계;
e. 유체 챔버에서 이온을 포함하는 전해 유체 용액 내로 총-핵산을 재현탁시키는 단계로서, 여기서 적어도 하나의 전극은 표적-핵산에 상보적인 복수의 포획-프로브가 그에 부착되어 있으며, 여기서 포획 프로브는 전극-용액 계면에 있는 것인 단계;
f. 어닐링-전압을 전극-용액 계면에 근접하여 전해 유체에 인가하여 전극-용액 계면에 의한 어닐링-pH 수준을 생성하는 단계로서, 여기서 어닐링-pH 수준은 총-핵산 및 포획-프로브 사이의 임의의 수의 상보적 염기 쌍의 어닐링을 유발하는 것인 단계;
g. 변성-전압을 전극-용액 계면에 근접하여 전해 유체에 인가하여 계면에 의한 변성-pH 수준을 생성하는 단계로서, 여기서 변성-pH 수준은 이중-가닥 포획-프로브의 전장보다 더 짧은 특정한 수의 염기 쌍 또는 그보다 더 짧은 특정한 범위의 염기 쌍 중 어느 하나인 포획 프로브 및 표적-핵산의 혼성화된 쌍을 포함하는 이중-가닥 핵산의 변성을 유발하는 것인 단계; 및
h. 어닐링-전압 및 변성-전압을 변조하는 단계로서, 여기서 상응하는 pH 수준의 최종 적용 (예를 들어, 어닐링 또는 변성) 후, 표적-핵산은 전극 (예를 들어, 제1 전극) 상의 포획/프라이머-프로브에 결합되어 잔류함으로써 총-핵산으로부터 풍부화되거나 단리되며, 여기서 결합된 표적-핵산은 주형 지정된 신장 합성을 위한 주형 가닥인 단계;
i. (i) 폴리머라제 효소, (ii) ATP 재생 효소, (iii) 발광 효소 (예를 들어, 반딧불이 루시페라제), 및 (iv) 성장하는 핵산 가닥의 주형 지정된 신장 합성을 수행하기 위한 구성요소를 갖는 폴리머라제-ATP 재생 효소-발광 시약 용액을 포함하는 신장 혼합물을 제공하는 단계로서, 여기서 상기 시약 용액은 ATP-재생-효소-기질, 발광-기질; 및 복수의 유형의 dNTP 또는 뉴클레오티드 유사체를 포함하며, 여기서 뉴클레오티드 유사체의 각각의 유형은 폴리머라제에 의해 절단가능한 이탈기를 가지며, 여기서 이탈기는 주형 가닥에의 각각의 뉴클레오티드 유사체의 폴리머라제-의존적 결합 시 절단되는 것인 단계;
j. 포획/프라이머-프로브가 표적 핵산 서열에 혼성화하는 경우 하나 또는 복수의 뉴클레오티드 유사체가 주형 가닥에 순차적으로 첨가되도록 핵산 신장 합성을 수행하는 단계로서, 이로써 a) 뉴클레오티드 유사체는 폴리머라제와 회합하고, b) 뉴클레오티드 유사체는 그 뉴클레오티드 유사체 상의 이탈기가 폴리머라제에 의해 절단되는 경우 폴리머라제에 의해 주형 가닥 상에 혼입되며, 여기서 이탈기는 ATP 재생 효소에 의해 ATP-재생-효소-기질과 조합되어 ATP를 산출하고, 이어서 c) ATP를 발광-효소에 결합시키며, 여기서 발광-기질은 발광-효소에 의해 촉매되어 발광을 생성하면서 각각의 이탈기를 재생시키는 것인 단계; 및
k. 핵산 합성이 일어나고 있는 동안 발광으로부터 광을 검출하는 단계로서, 이로써 광의 검출은 특정한 표적 핵산 서열의 존재를 지시하는 것인 단계. 특정한 실시양태에서, 총-핵산으로부터의 포획/프라이머-프로브는 단계 (l)의 신장 반응 혼합물을 제공하기 전에 세척 제거된다.
또한, 하기 단계를 포함하는, 핵산-함유 샘플로부터 표적-핵산을 풍부화하거나 단리하는 본 발명 TEEM 방법이 본원에서 제공된다:
a. 제1 및 제2 전극을 갖는 유체 챔버에 이온을 포함하는 전해 유체 용액 및 핵산-함유 샘플을 수용하는 단계로서, 여기서 적어도 하나의 전극은 표적-핵산에 상보적인 복수의 포획-프로브가 그에 부착되어 있으며, 여기서 포획 프로브는 전극-용액 계면에 있는 것인 단계; 및
b. 어닐링-전압 및 변성-전압을 교대함으로써 전극-용액 계면에 근접하여 형성된 전기장을 변조하여 전극-용액 계면에 근접하여 전해 유체의 각각의 어닐링-pH 수준 및 변성-pH 수준을 생성하는 단계로서, 여기서 어닐링-pH 수준은 임의의 수의 상보적 염기 쌍의 어닐링을 유발하고; 변성-pH 수준은 1 내지 x-5개의 상보적 염기 쌍; 1 내지 x-10개; 1 내지 x-15개의 상보적 염기 쌍; 1 내지 x-20개의 상보적 염기 쌍; 1 내지 x-25개의 상보적 염기 쌍 (여기서 x는 각각의 포획-프로브의 뉴클레오티드 길이임)으로부터 선택된 범위에 상응하는 상보적 염기 쌍의 수를 갖는 이중-가닥 핵산의 변성을 유발하며, 여기서 어닐링-pH 수준의 최종 적용 후, 표적-핵산은 전극 상의 프라이머-프로브에 결합되어 잔류함으로써 핵산-함유 샘플로부터 풍부화되거나 단리되는 것인 단계.
특허 또는 출원 파일은 컬러로 실행된 적어도 하나의 도면을 함유한다. 컬러 도면(들)을 갖는 본 특허 또는 특허 출원의 사본은 신청 및 필요한 관납료의 납부 시 관청에 의해 제공될 것이다.
도 1A는 본 발명 LACES 표적 핵산 검출 방법의 한 실시양태의 일반적 예시를 나타낸다: DNA 폴리머라제는 빌딩 블록으로서 dNTP 또는 dNTP 유사체를 사용한다. 폴리머라제에의 결합 시, 피로포스페이트는 나중의 반응을 위해 절단된다.
도 1B는 절단된 피로포스페이트가 ATP 술푸릴라제 효소와의 상호작용에 의해 APS와 조합되고, 이는 각각의 피로포스페이트를 아데노신 5'-포스포술페이트 (APS)에 결합시켜 ATP (ATP)의 형성을 발생시키는 것을 나타낸다.
도 1C는 본원에 제시된 발광 반응을 위한 시약, ATP (ATP), 루시페린, 및 반딧불이 루시페라제; 및 검출가능한 발광이 일어나는 발광 반응에서의 시약의 상호작용을 나타낸다.
도 2는 AMP+PEP 및 PPDK 효소를 채용하는 본 발명 LACES 표적 핵산 검출 방법의 또 다른 실시양태의 일반적 예시를 나타낸다. 절단된 피로포스페이트는 PPDK 효소와의 상호작용에 의해 AMP+PEP와 조합되고, 이는 각각의 피로포스페이트를 AMP에 결합시켜 형성 ATP (ATP)를 발생시킨다.
도 3은 ADP-글루코스 및 AGPPase 효소를 채용하는 본 발명 LACES 표적 핵산 검출의 또 다른 실시양태의 일반적 예시를 나타낸다. 절단된 피로포스페이트는 AGPPase 효소와의 상호작용에 의해 ADP-글루코스와 조합되고, 이는 각각의 피로포스페이트를 ADP-글루코스에 결합시켜 형성 ATP (ATP)를 발생시킨다.
도 4는 다양한 ATP 술푸릴라제와의 본 발명 LACES 반응의 결과로서의 발광 생성을 나타낸다.
도 5는 다양한 반딧불이 루시페라제와의 본 발명 LACES 반응의 결과로서의 발광 생성을 나타낸다.
도 6은 다양한 dGTP-쿠마린과의 본 발명 LACES 반응의 결과로서의 발광 생성을 나타낸다.
도 7은 ATP 및 APS를 다양한 양의 무기 피로포스파타제와의 루시페라제 반응에 첨가하는 것의 결과를 나타낸다.
도 8은 발광 신호에 대한 조효소 A를 ATP 술푸릴라제/루시페라제 신호 증폭 루프 반응에 첨가하는 것의 효과를 나타낸다.
도 9A는 각각의 각각의 표적 핵산 주형 상의 단일 프라이머-프로브당 복수의 폴리머라제를 사용한 본 발명 LACES 핵산 검출 방법에서 쇄 신장을 수행하는 실시양태를 나타낸다.
도 9B는 상보적 가닥을 합성하는 것을 시작하는 폴리머라제가 그의 전형적인 핵산 쇄 신장 길이를 횡단하고, 이어서 주형으로부터 떨어지거나 해리됨에 따라, 반응 혼합물에서의 또 다른 많은 다른 폴리머라제가 주형에 즉시 결합하고, 상보적 가닥 쇄 신장 합성을 계속하기 때문에, 표적 핵산 주형의 쇄 신장이 실질적으로 연속적인 실시양태를 나타낸다.
도 10은 AMP+PEP 및 PPDK 효소를 채용하는 본 발명 LACES 표적 핵산 검출 방법의 실시양태의 또 다른 일반적 예시를 나타낸다. 절단된 피로포스페이트는 PPDK 효소와의 상호작용에 의해 AMP+PEP와 조합되고, 이는 각각의 피로포스페이트를 AMP에 결합시켜 루시페라제 반응에서의 후속 사용을 위한 형성 ATP (ATP)를 발생시켜 검출가능한 발광 광을 생성하고, 이는 본원에 기재된 효소적 루프에 의해 증폭된다.
도 11은 그 위에 형광 표지 또는 다르게는 검출가능한 표지를 갖는 켄칭된 뉴클레오티드, 및 AMP+PEP 및 PPDK 효소 시스템을 채용하는 본 발명 표적 핵산 검출 방법의 또 다른 실시양태의 일반적 예시를 나타낸다. 절단된 표지된 피로포스페이트 (즉, PPi+FL)는 PPDK 효소와의 상호작용에 의해 AMP+PEP와 조합되고, 이는 각각의 피로포스페이트를 AMP에 결합시켜 루시페라제 반응에서의 후속 사용을 위한 형성 ATP (ATP)를 발생시켜 검출가능한 발광 및/또는 형광 광을 생성하고, 이는 본원에 기재된 효소적 루프에 의해 증폭된다.
도 12는 그 위에 형광 표지 또는 다르게는 검출가능한 표지를 갖는 켄칭된 뉴클레오티드, 및 폴리머라제 효소 시스템을 채용하는 본 발명 FACES 표적 핵산 검출 방법의 실시양태의 일반적 예시를 나타낸다. 절단된 표지된 피로포스페이트 (즉, PPi+FL)는 PPDK 효소와의 상호작용에 의해 AMP+PEP와 조합되고, 이는 각각의 피로포스페이트를 AMP에 결합시켜 루시페라제 반응에서의 후속 사용을 위한 형성 ATP (ATP)를 발생시켜 검출가능한 발광 및/또는 형광 광을 생성한다.
도 13은 2관능성 포획/프라이머 프로브를 사용하여 RNA 표적-핵산을 포획하는; 및 RNA-표적-핵산 및 2관능성 포획/프라이머-프로브의 프라이머 영역 둘 다에 결합된 중간체 DNA 주형-가닥으로부터 신장하는 폴리머라제를 사용하는 본 발명 LACES 쇄 신장 반응에서의 3-웨이-연접 DNA 중간체 핵산을 사용하여 RNA 표적-핵산 (예를 들어, SARS-COV2)을 검출하는 본 발명의 실시양태의 일반적 예시를 나타낸다. 마지막 패널에 도시된 LACE 반응은 수 분 내에 피크에 도달하고 서서히 붕괴하는 신호를 생성한다. 검출은 신호의 급속한 상승 동안 제1 분 내에 일어난다.
도 14는 포획/프라이머 프로브를 사용하여 본원에서 제공된 본 발명 TEEM 방법을 사용하여 RNA 표적-핵산을 포획하는; 및 주형-표적-RNA 가닥(들)으로부터 신장하는 폴리머라제(들)를 사용하는 본 발명 LACES 쇄 신장 반응에서 프라이머 (DNA/RNA)로서 DNA 포획/프라이머-프로브를 사용하여 RNA 표적-핵산 (예를 들어, SARS-COV2)을 검출하는 본 발명의 실시양태의 일반적 예시를 나타낸다. 마지막 패널에 도시된 LACES 반응은 수 분 내에 피크에 도달하고 서서히 붕괴하는 신호를 생성한다. 검출은 신호의 급속한 상승 동안 제1 분 내에 일어난다.
도 15는 포획/프라이머 프로브를 사용하여 RNA 표적-핵산을 포획하는; 및 주형-표적-RNA 가닥으로부터 신장하는 리버스 트랜스크립타제를 사용하여 본 발명 LACES 쇄 신장 반응에서 프라이머 (DNA/RNA)로서 DNA 포획/프라이머-프로브를 사용하여 RNA 표적-핵산 (예를 들어, SARS-COV2)을 검출하는 본 발명의 실시양태의 일반적 예시를 나타낸다. 마지막 패널에 도시된 LACE 반응은 수 분 내에 피크에 도달하고 서서히 붕괴하는 신호를 생성한다. 검출은 신호의 급속한 상승 동안 제1 분 내에 일어난다.
도 16은 포획/프라이머 프로브를 사용하여 DNA 표적-핵산을 포획하는; 및 주형-표적-DNA 가닥으로부터 신장하는 폴리머라제를 사용하여 본 발명 LACES 쇄 신장 반응에서 프라이머 (DNA/DNA)로서 DNA 포획/프라이머-프로브를 사용하여 DNA 표적-핵산을 검출하는 본 발명의 실시양태의 일반적 예시를 나타낸다. 마지막 패널에 도시된 LACE 반응은 수 분 내에 피크에 도달하고 서서히 붕괴하는 신호를 생성한다. 검출은 신호의 급속한 상승 동안 제1 분 내에 일어난다.
도 17은 용해물로부터 핵산의 유전 단리 (본원에서 DIAL 프로세스로 지칭됨)를 위한 예시적인 미세유체 칩 상의 각각의 위치에서 일어나는 유전체 힘을 나타낸다.
도 18은 전기 이중 층의 조작을 나타낸다. 전극이 고체 또는 액체 이온성 도체 (전해질)와 접촉되고, 전기 포텐셜이 전극에 인가되는 경우, 카운터-이온은 전극을 향해 이동하는 반면, 공동-이온은 표면으로부터 반발되며, 이는 전극-용액 계면에서의 이온, 따라서 pH 분포를 생성한다.
도 19는 pH 분포가 전압- 및 전기장-변조에 의해 조작되는 활성 영역에서의 계면에 놓인 표면 부착된 포획-프로브를 이용하는 본 발명 전기적 변조에 의한 표적 풍부화 (TEEM) 방법의 전체적 도시를 나타낸다.
도 20은 표적-핵산의 존재 또는 부재를 검출하는 본 발명 TEEM 및 LACES 방법을 수행하기 위해 필요한 모든 시약 및 구성요소를 포함하는 예시적인 단일-사용-카트리지를 갖는 병원체의 검출을 위한 본 발명 휴대용 기기-기반 진단 시스템을 나타낸다.
도 21은 소모품 내에 있는 활성 영역 내의 전극 기하구조를 도시하는 활성 전극 어레이 디자인의 한 실시양태를 나타낸다.
도 22는 가변적이고 조정가능한 온도 조건의 일정한 42 ℃에서 12bp 핵산의 혼성화에 대한, 전기장을 인가하여 pH를 변경시킴으로써 가변적이고 조정가능한 pH 조건을 pH4에서 pH8로 변화시키는 것의 효과를 도시하는 용융 온도 밴드-곡선을 나타낸다. 결과는 pH 8에서, 미리 선택된 12 bp 결합 친화도 역치보다 더 큰, 그와 동등한, 및 그보다 작은 모든 올리고뉴클레오티드가 그의 표적에 혼성화됨을 지시한다. pH를 pH 4로 하향시키는 것은 미리 선택된 12 bp 역치보다 더 큰 올리고가 혼성화되는 것을 발생시키는 반면, 미리 선택된 12 bp 역치보다 더 작은 그러한 올리고는 변성된다.
도 23은 TEEM 방법에 대한 성능 추정 및 최적화를 나타낸다.
도 24는 신호-로드 데이터 세트를 나타낸다.
도 25는 시간-민감도 데이터 세트를 나타낸다.
도 26은 그 안에 스왑 삽입물을 갖는 소모품 칩; 및 내부에 소모품 칩 및 플런저 캡을 갖는 어댑터를 갖는 본 발명 장치 인클로저의 또 다른 실시양태를 나타낸다.
하기 단계를 포함하는, 샘플에서 핵산 서열의 존재를 검출하는 방법이 본원에서 제공된다:
(i) 폴리머라제 효소, (ii) ATP 재생 효소, (iii) 발광 효소 (예를 들어, 반딧불이 루시페라제), (iv) 샘플로부터의 주형 핵산, (v) 특정한 표적 핵산 서열에 혼성화하는 (예를 들어, 그에 상보적인) 프라이머-프로브, 및 (vi) 성장하는 핵산 가닥의 주형 지정된 신장 합성을 수행하기 위한 구성요소를 갖는 폴리머라제-ATP 재생 효소-발광 시약 용액을 포함하는 핵산 쇄 신장 혼합물을 제공하는 단계로서, 여기서 상기 시약 용액은 ATP-재생-효소-기질 (예를 들어, ATP 술푸릴라제에 의해 APS와; AGPPase에 의해 ADP-글루코스와; PPDK에 의해 AMP+PEP와 등), 발광-기질; 및 복수의 유형의 dNTP 또는 뉴클레오티드 유사체를 포함하며, 여기서 뉴클레오티드 유사체의 각각의 유형은 폴리머라제에 의해 절단가능한 이탈기를 가지며, 여기서 이탈기는 주형 가닥에의 각각의 뉴클레오티드 유사체의 폴리머라제-의존적 결합 시 절단되는 것인 단계;
프라이머-프로브가 표적 핵산 서열에 혼성화하는 경우 하나 또는 복수의 뉴클레오티드 유사체가 주형에 순차적으로 첨가되도록 핵산 신장 합성을 수행하는 단계로서, 이로써 a) 뉴클레오티드 유사체는 폴리머라제와 회합하고, b) 뉴클레오티드 유사체는 그 뉴클레오티드 유사체 상의 이탈기가 폴리머라제에 의해 절단되는 경우 폴리머라제에 의해 주형 가닥 상에 혼입되며, 여기서 이탈기는 ATP 재생 효소에 의해 ATP-재생-효소-기질과 (예를 들어, ATP 술푸릴라제에 의해 APS와; AGPPase에 의해 ADP-글루코스와; PPDK에 의해 AMP+PEP와 등) 조합되어 ATP를 산출하고, 이어서 c) ATP를 발광-효소에 결합시키며, 여기서 발광-기질은 발광-효소에 의해 촉매되어 발광을 생성하고, 피로포스페이트 이탈기는 재생되는 것인 단계; 및
핵산 합성이 일어나고 있는 동안 발광으로부터 광을 검출하는 단계로서, 이로써 광의 검출은 특정한 표적 핵산 서열의 존재를 지시하는 것인 단계.
본 발명 방법의 특정한 실시양태에서 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(i) 폴리머라제 효소, (ii) ATP 술푸릴라제, (iii) 발광 효소 (예를 들어, 반딧불이 루시페라제), (iv) 샘플로부터의 주형 핵산, (v) 특정한 표적 핵산 서열에 혼성화하는 (예를 들어, 그에 상보적인) 프라이머-프로브, 및 (vi) 성장하는 핵산 가닥의 주형 지정된 합성을 수행하기 위한 구성요소를 갖는 폴리머라제-ATP 재생 효소-발광 시약 용액을 포함하는 핵산 쇄 신장 혼합물을 제공하는 단계로서, 여기서 상기 시약 용액은 APS, 발광-기질 (예를 들어, 루시페린); 및 복수의 유형의 뉴클레오티드 유사체를 포함하며; 여기서 뉴클레오티드 유사체의 각각의 유형은 폴리머라제에 의해 절단가능한 피로포스파타제 이탈기를 가지며, 여기서 피로포스페이트 이탈기는 주형 가닥에의 각각의 뉴클레오티드 유사체의 폴리머라제-의존적 결합 시 절단되는 것인 단계; 또는
(i) 폴리머라제 효소, (ii) ADPglc 피로포스포릴라제 (AGPPase), (iii) 발광 효소 (예를 들어, 반딧불이 루시페라제), (iv) 샘플로부터의 주형 핵산, (v) 특정한 표적 핵산 서열에 혼성화하는 (예를 들어, 그에 상보적인) 프라이머-프로브, 및 (vi) 성장하는 핵산 가닥의 주형 지정된 합성을 수행하기 위한 구성요소를 갖는 폴리머라제-AGPPase-발광 시약 용액을 포함하는 핵산 쇄 신장 혼합물을 제공하는 단계로서, 여기서 상기 시약 용액은 ADP-글루코스, 발광-기질 (예를 들어, 루시페린); 및 복수의 유형의 뉴클레오티드 유사체를 포함하며; 여기서 뉴클레오티드 유사체의 각각의 유형은 폴리머라제에 의해 절단가능한 피로포스파타제 이탈기를 가지며, 여기서 피로포스파타제 이탈기는 주형 가닥에의 각각의 뉴클레오티드 유사체의 폴리머라제-의존적 결합 시 절단되는 것인 단계; 또는
(i) 폴리머라제 효소, (ii) 피루베이트 오르토포스페이트 디키나제 (PPDK), (iii) 발광 효소 (예를 들어, 반딧불이 루시페라제), (iv) 샘플로부터의 주형 핵산, (v) 특정한 표적 핵산 서열에 혼성화하는 (예를 들어, 그에 상보적인) 프라이머-프로브, 및 (vi) 성장하는 핵산 가닥의 주형 지정된 합성을 수행하기 위한 구성요소를 갖는 폴리머라제-PPDK-발광 시약 용액을 포함하는 핵산 쇄 신장 혼합물을 제공하는 단계로서, 여기서 상기 시약 용액은 AMP 및 포스포엔올피루베이트 (PEP), 발광-기질 (예를 들어, 루시페린); 및 복수의 유형의 뉴클레오티드 유사체를 포함하며; 여기서 뉴클레오티드 유사체의 각각의 유형은 폴리머라제에 의해 절단가능한 피로포스파타제 이탈기를 가지며, 여기서 피로포스파타제 이탈기는 주형 가닥에의 각각의 뉴클레오티드 유사체의 폴리머라제-의존적 결합 시 절단되는 것인 단계; 및
복수의 뉴클레오티드 유사체가 주형에 순차적으로 첨가되도록 핵산 합성을 수행하는 단계로서, 이로써 a) 뉴클레오티드 유사체는 폴리머라제와 회합하고, b) 뉴클레오티드 유사체는 그 뉴클레오티드 유사체 상의 피로포스파타제 이탈기가 폴리머라제에 의해 절단되는 경우 폴리머라제에 의해 주형 가닥 상에 혼입되고, 여기서 피로포스파타제 이탈기는 ATP 술푸릴라제에 의해 APS, AGGPase에 의해 ADP-글루코스; 및/또는 PPDK에 의해 AMP와 조합되어 ATP를 산출하고, 이어서 c) ATP를 발광-효소 (반딧불이 루시페라제)에 결합시키고, 여기서 발광-기질 (루시페린)은 발광-효소 (루시페라제)에 의해 촉매되어 제한된 (일시적/이산) 기간 동안 발광을 생성하고, 피로포스페이트 이탈기는 재생되는 것인 단계; 및
핵산 합성이 일어나고 있는 동안 발광으로부터 광을 검출하는 단계로서, 이로써 광의 검출은 특정한 표적 핵산 서열의 존재를 지시하는 것인 단계.
본원에 사용된 "폴리머라제-ATP 재생 효소-루시페라제" 또는 그의 문법적 파생어는 폴리머라제 쇄 신장 반응에 의해 생성된 피로포스페이트 이탈기를 이용하고, 피로포스페이트 이탈기 (PPi; 도 1B)를 ATP로 전환시키는 본 발명 방법에 사용될 수 있는 관련 기술분야에 공지된 임의의 연결된 3 효소 시스템을 지칭한다. 예를 들어, 연결된 3 효소 폴리머라제-ATP 재생 효소-루시페라제 시스템은 폴리머라제-ATP 술푸릴라제-발광 효소 시스템; 폴리머라제-AGPPase-발광 (문헌 [Lee et al., Analytical Biochemistry, 399 (2010) 168-173]에 개시된 바와 같음; 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨); 폴리머라제-PPDK-발광 효소 시스템 (문헌 [Zhou et al., Anal. Chem. 2006, 78,4482-4489]에 개시된 바와 같음; 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨); 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본원에 사용된 어구 "ATP-재생-효소-기질"은 본원에 사용된 각각의 ATP-재생 효소에 대한 천연 기질을 지칭한다. 예를 들어, ATP 술푸릴라제에 대한 본원에 사용된 천연 기질은 APS이고; AGGPase에 대해서는 ADP-글루코스이고; PPDK에 대해서는 AMP + PEP인 등이다.
본원에 사용된 용어 "ATP 재생 효소/루시페라제 루프" 또는 "ATP 재생 효소/루시페라제 신호 증폭 루프" 또는 그의 문법적 파생어 (예를 들어, ATP 술푸릴라제/루시페라제 루프, AGPPase/루시페라제 루프, PPDK/루시페라제 루프 등)는 일반적으로 본원에서 실시예 3에 및 도 1B-1G에 제시된 바와 같은 ATP 재생 효소 및 루시페라제 사이의 효소적 루프를 지칭하며, 이로써 루시페라제에 의해 촉매된 발광 반응 후 새로운 피로포스페이트 분자가 방출된다 (PPi) (도 1F). 이 새롭게 방출된 PPi-FL은 또 다시 ATP 재생 효소 (예를 들어, ATP 술푸릴라제, AGPPase, PPDK 등)에 대한 기질일 수 있으며, 그에 의해 ATP 재생 효소 (예를 들어, ATP 술푸릴라제, AGPPase, PPDK 등) 및 루시페라제 사이의 효소적 루프를 생성한다 (도 1G. 상부). 도 1B-1G에 나타내어진 바와 같이, 이 루프 내에서 PPi는 ATP 술푸릴라제에 의해 리사이클링되고, ATP (ATP)로 전환되며, 이는 이어서 루시페라제 방출 PPi에 의해 촉매될 수 있다. 이는 피로포스페이트 이탈기로부터 연속적인 발광 신호를 생성하며, 그에 의해 각각의 각각의 뉴클레오티드에 대한 검출 신호에 대한 증폭 메커니즘으로서 역할을 할 것이다.
본원에 사용된 어구 "핵산 쇄 신장 혼합물" 또는 "쇄 신장 혼합물", 또는 그의 문법적 파생어는 본 발명 LACES 핵산 쇄 신장 반응을 수행하는데 사용되는 구성요소를 지칭한다. 한 실시양태에서, 쇄 신장 혼합물은 (i) 폴리머라제 효소, (ii) ATP 재생 효소 (예를 들어, ATP 술푸릴라제, AGPPase, PPDK 등), (iii) 발광 효소 (예를 들어, 반딧불이 루시페라제), (iv) 샘플로부터의 주형 핵산, (v) 조사되고 있는 특정한 표적 핵산 서열에 혼성화하는 (예를 들어, 그에 상보적인) 프라이머-프로브, 및 (vi) 성장하는 핵산 가닥의 주형 지정된 합성을 수행하기 위한 구성요소를 갖는 폴리머라제-ATP 재생 효소-발광 시약 용액을 포함하고, 여기서 상기 시약 용액은 APS, ADP-글루코스, AMP+PEP 등 중 어느 하나, 발광-기질 (예를 들어, 루시페린); 및 그 안의 복수의 유형의 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 본 발명에 따르면, 사용되는 쇄 신장 혼합물은 이전의 방법에 비해 본 발명 표적 핵산 검출 방법에서 하기 이점을 제공한다: 채용되는 폴리머라제는 그의 이상적인 상태에서 기능하고; 폴리머라제 효소를 변형시킬 필요가 없고; 높은 뉴클레오티드 (예를 들어, dNTP) 농도의 사용은 최적 효율을 발생시키고; 정교한 광학장치 또는 나노구조화된 칩을 요구하지 않아 비용을 감소시키고; 이는 높은 특이성을 제공하고; 조사되는 표적 핵산의 존재를 의미하는 발광 신호를 신속하게 및 강하게 증폭시키는 긴 핵산 쇄 신장 길이 (예를 들어, 약 50 Kb 내지 1 유전자/세포)를 제공한다.
본원에 사용된 어구 "주형 핵산 샘플" 또는 "표적 주형 핵산 샘플", "표적-핵산" 또는 그의 문법적 파생어는 이중-가닥 DNA, 단일-가닥 DNA, 단일-가닥 DNA 헤어핀, DNA/RNA 하이브리드, 단일-가닥 RNA, 프라이머-프로브, 포획-프로브, 포획/프라이머-프로브, 중합화제, 및/또는 RNA 헤어핀 중 하나 이상의 결합을 위한 인식 부위를 갖는 RNA를 포함하는 임의의 적합한 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 또한, 본 발명 핵산 표적 검출 방법에 사용하기 위한 주형 핵산 또는 표적-핵산으로서 적합한 표적 폴리뉴클레오티드는 임의의 세포로부터의 게놈의 특이적 부분, 예컨대 인트론, 조절 영역, 대립유전자, 변이체 또는 돌연변이; 전체 게놈; 또는 그의 임의의 부분일 수 있다. 다른 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 mRNA, tRNA, rRNA, 리보자임, 안티센스 RNA 또는 RNAi일 수 있다. 다른 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드 샘플은 임의의 길이, 예컨대 약 10개의 염기 내지 약 100,000개의 염기, 약 10,000개의 염기 내지 약 90,000개의 염기, 약 20,000개의 염기 내지 약 80,000개의 염기, 약 30,000개의 염기 내지 약 70,000개의 염기, 약 40,000개의 염기 내지 약 60,000개의 염기, 또는 그 초과의 것일 수 있으며, 전형적인 범위는 약 10,000 내지 50,000개의 염기이다. 또한, 약 100개의 염기 내지 10,000개의 염기의 표적 주형 핵산 길이가 본원에서 고려된다.
본원에 사용하는데 적합한 주형 핵산 샘플 (또한 본원에서 표적-핵산으로 지칭됨)은 관련 기술분야에 널리 공지된 다양한 공급원으로부터 얻어질 수 있다. 예를 들어, 세포 DNA, 바이러스 DNA/RNA, 순환 무세포 DNA, 순환 종양 DNA, 타액으로부터의 DNA /RNA, 혈액으로부터의 DNA/RNA, 농업적 샘플로부터의 DNA/RNA, 동물 생물학적 유체, 환경적 샘플 (신선한 물 공급원, 바다/대양 샘플) 등으로부터의 핵산 샘플.
본원에 사용된 용어 "프라이머-프로브"는 바람직하게는 조사되고 있는 미지의 핵산의 샘플 중에서로부터의 특정한 표적 핵산 서열을 확인하는 프로브로서 또한 기능하는 쇄 신장을 개시할 수 있는 프라이머를 지칭한다. 온도 사이클링 및 변성이 없고, 혼성화 사이클은 예컨대 PCR에 대해 존재하지 않기 때문에, 본 발명 방법에 사용될 수 있는 길이 및 서열의 관점에서 프로브 디자인의 많은 유연성이 있다. 본원에서 제공된 본 발명 방법으로, PCR에 요구되는 2개의 프라이머 대신, 하나의 올리고뉴클레오티드 프로브 (예를 들어, 프라이머-프로브)를 디자인하는 것이 충분하다. 프라이머-프로브의 길이는 그것이 주형 핵산 샘플 중으로부터의 그의 각각의 표적 핵산 서열에 정확하게 결합하는 한, 임의의 크기일 수 있다. 예를 들어, 본원에 사용하는데 적합한 프라이머-프로브 길이의 다양한 범위는 20-100, 20-90, 20-80, 20-70, 20-60, 20-50, 20-40, 20-30, 5-100, 10-100, 30-100, 40-100, 50-100, 60-100, 70-100, 80-100, 90-100, 15-150, 10-200, 5-300, 20-200, 20-300, 20-400, 20-500, 20-600, 20-700, 20-800, 20-900, 20-1000, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 400, 적어도 500, 적어도 600, 적어도 700, 적어도 800, 적어도 900, 적어도 1000개의 뉴클레오티드 염기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본원에 사용하는데 적합한 프라이머-프로브 길이의 다른 적합한 범위는 5-1000개의 염기, 10-950, 15-900, 20-800, 25-700, 30-600, 35-500, 40-400, 50-300, 25-250, 25-200, 25-150, 25-100, 25-90, 25-80, 25-70, 25-60, 25-50개의 염기의 길이로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 다른 실시양태에서, 프라이머-프로브는 20-100개의 염기의 범위이다. 다른 실시양태에서, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 특이성을 증가시키기 위해 25, 30, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 및 200개의 염기 또는 그 초과로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있는 프라이머-프로브 길이에 대한 보다 긴 뉴클레오티드 서열을 선택할 수 있다. 다른 실시양태에서, PCR에 관하여, 프로브 길이 약 20개의 염기는 또한 본원에 사용하기 위해 고려된다.
ATP 재생 효소로서 ATP 술푸릴라제, AGPPase, PPDK 등 중 어느 하나를 사용하는 본원에 사용된 어구 "폴리머라제-ATP 재생 효소-발광 시약 용액", 그의 문법적 파생어, 또는 "시약 용액"은 성장하는 핵산의 주형 지정된 합성을 수행하는데 필요한 구성요소의 혼합물을 지칭한다. ATP 술푸릴라제를 사용하는 한 실시양태에서, 폴리머라제, 예를 들어, DNA pol I, ATP 술푸릴라제, 및 발광-효소 (예를 들어, 루시페라제 등)와 함께 사용하기 위한 폴리머라제 시약 용액은 APS (아데노신 5' 포스포술페이트), 루시페린 및 적합한 농도의 dNTP, 예를 들어, 본원에 기재된 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. AGPPase를 사용하는 또 다른 실시양태에서, 폴리머라제, 예를 들어, DNA pol I, AGPPase, 및 발광-효소 (예를 들어, 루시페라제 등)와 함께 사용하기 위한 폴리머라제 시약 용액은 ADP-글루코스, 루시페린 및 적합한 농도의 dNTP, 예를 들어, 본원에 기재된 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. PPDK를 사용하는 또 다른 실시양태에서, 폴리머라제, 예를 들어, DNA pol I, PPDK, 및 발광-효소 (예를 들어, 루시페라제 등)와 함께 사용하기 위한 폴리머라제 시약 용액은 AMP+PEP, 루시페린 및 적합한 농도의 dNTP, 예를 들어, 본원에 기재된 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 채용되는 dNTP의 농도는 부분적으로 본 발명 방법에 유리하게 채용되는 이탈기 (예를 들어, 형광 피로포스페이트; PPi)로부터 초래되는 낮은 형광 배경 때문에 종전에 가능하였던 것보다 훨씬 더 높다. ATP 형성 효소 (예를 들어, ATP 술푸릴라제, AGPPase, PPDK 등) 및 폴리머라제 속도는 효소의 유형 및 공급원에 따라 유의하게 다양할 수 있기 때문에, 본원에서 채용되는 ATP 재생 효소 (예를 들어, ATP 술푸릴라제, AGPPase, PPDK 등) 반응에 의해 달성되는 ATP 형성의 속도는 반응 조건, 예컨대 본원에 기재된 바와 같은 ATP 재생 효소 농도 등을 조정함으로써 별개로 조정될 수 있다.
본원에 사용된 어구 "ATP 반응"은 도 1B 및 1C에 제시된 바와 같이, 피로포스페이트 (예를 들어, 이탈기; PPi)를 ATP 재생 기질 (예를 들어, 아데노신 5' 포스포술페이트 (APS), ADP-글루코스, AMP+PEP 등 중 어느 하나)과 조합하여 ATP (ATP)를 형성할 수 있는 임의의 반응을 지칭한다. 본원에 사용하기 위한 한 실시양태에서, 피로포스페이트 이탈기는 ATP 술푸릴라제 효소 등을 사용하여 APS와 조합될 수 있다. 본원에 사용하기 위한 또 다른 실시양태에서, 피로포스페이트 이탈기는 AGPPase 효소 등을 사용하여 ADP-글루코스와 조합될 수 있다. 본원에 사용하기 위한 또 다른 실시양태에서, 피로포스페이트 이탈기는 PPDK 효소 등을 사용하여 AMP+PEP와 조합될 수 있다.
본원에 사용된 어구 "발광 반응"은 에너지를 전혀 유도하지 않거나 오로지 방출체의 온도로부터 에너지를 유도하는 광의 방출 (즉, 백열 광 이외의 광의 방출)을 생성할 수 있는 임의의 반응을 지칭한다. "발광"은 형광, 인광, 열발광, 화학발광, 전기발광 및 생체발광을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. "발광체"는 발광을 나타내는 물체를 지칭한다. 바람직한 실시양태에서, 광은 가시 스펙트럼에 있다. 그러나, 본 발명은 가시광에 제한되지 않지만, 임의의 주파수의 전자기 방사선을 포함한다. 한 실시양태에서, 본원에서 채용되는 발광 반응은 발광을 생성하기 위한 보조인자로서 ATP (ATP), 옥시루시페린, AMP를 사용하여 발광-기질, 루시페린을 촉매하고, 또한 다시 루핑하기 위해 피로포스페이트 (PPi)를 재생시켜 또 다른 ATP를 형성하는 발광 효소, 루시페라제 (예를 들어, 반딧불이 루시페라제)에 의해 유발된다 (도 1D-1F 참조).
예를 들어, 한 실시양태에서, 본원에서 고려되는 반복적인 쇄 신장 사이클은 ATP 및 무기 술페이트의 생산을 발생시키는 ATP-술푸릴라제 효소에 의해 촉매되는 APS와의 PPi의 제1 ATP 반응을 수반한다. 제2 반응, 발광 반응에서, 루시페린 및 루시페라제는 광, AMP 및 옥시루시페린을 생성하기 위한 및 피로포스페이트 (PPi)를 재생시키기 위한 에너지 공급원으로서 ATP를 소비한다 (도 1C). 따라서, 각각의 각각의 dNTP 유사체가 혼입된 후, 광의 양자는 제2 발광 반응을 통해 용액 중의 피로포스페이트 (PPi)의 각각의 분자에 대해 생성된다. 본원에서 고려되는 한 실시양태에 대한 반응의 과정에서, APS 및 루시페린은 소비되고, AMP 및 옥시루시페린은 생성되는 반면, ATP 술푸릴라제 및 루시페라제는 일정하게 잔류한다. 본 발명은 사용되는 루시페라제의 유형에 대해 제한되지 않는다. 특정 개시된 실시양태는 반딧불이 루시페라제를 이용하였지만, 관련 기술분야에 공지된 임의의 루시페라제는 개시된 방법에 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 조효소 A는 루시페라제의 분해/불활성화를 방지함으로써 루시페라제/루시페린 커플 또는 복합체를 안정화시키는 것으로 밝혀졌으며, 이는 본 발명 핵산 표적 검출 반응에서 ATP 재생 효소/루시페라제 증폭 루프의 신호의 강도를 증가시키는 효과를 갖는다. 따라서, 쇄 신장 반응에서 ATP 재생 효소/루시페라제 증폭 루프의 신호의 강도를 증가시키는 방법으로서, 본원에 제시된 본 발명 LACES 표적 핵산 검출 방법을 수행하는 단계; 및 ATP 재생 효소/루시페라제 증폭 루프의 신호의 강도를 증가시키는데 유효한 조효소 A 대 루시페라제의 비로 조효소 A를 쇄 신장 혼합물에 첨가하는 단계를 포함하는 방법이 본원에서 제공된다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 사용되는 조효소 A의 양은 쇄 신장 반응에서 ATP 재생 효소/루시페라제 증폭 루프의 신호의 강도를 증가시키는데 유효한 조효소 A:루시페라제의 비로서 본 발명 쇄 신장 혼합물 및 용액에 첨가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 사용하기 위해 고려되는 적합한 조효소 A:루시페라제 비는 1:1, 1:2, 1:5, 1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90, 1:100, 1:250, 1:150, 1:175, 1:200, 1:225, 1:250, 1:275, 1:300, 1:350, 1:400, 1:450, 1:500, 1:550, 1:600, 1:650, 1:700, 1:750, 1:800, 1:850, 1:900, 1:950, 1:1000, 1:1500, 1:2000, 1:3000, 1:4000, 1:5000 조효소 A:루시페라제 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 다른 실시양태에서, 본원에 사용하기 위해 고려되는 LACES 쇄 신장 반응에서 ATP 재생 효소/루시페라제 증폭 루프의 신호의 강도를 증가시키는데 유효한 적합한 루시페라제:조효소 A 비는 1:1, 1:2, 1:5, 1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90, 1:100, 1:250, 1:150, 1:175, 1:200, 1:225, 1:250, 1:275, 1:300, 1:350, 1:400, 1:450, 1:500, 1:550, 1:600, 1:650, 1:700, 1:750, 1:800, 1:850, 1:900, 1:950, 1:1000, 1:1500, 1:2000, 1:3000, 1:4000, 1:5000 루시페라제:조효소 A 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본원에 사용된 "폴리머라제 효소"는 핵산 합성을 수행하는 것을 담당하는 널리 공지된 단백질을 지칭한다. 본원에 사용하는데 적합한 예시적인 폴리머라제는 DNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제 및 리버스 트랜스크립타제를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 본원에 사용하기 위한 폴리머라제 효소는 DNA 폴리머라제이다. 천연 폴리머라제 매개 핵산 합성에서, 복합체는 폴리머라제 효소, 주형 핵산 서열, 및 합성 프로세스의 개시의 지점으로서 역할을 하는 프라이밍 서열 사이에 형성된다. 합성 동안, 폴리머라제는 반응 믹스로부터의 뉴클레오티드 단량체를 샘플링하여 주형 서열에서 다음 염기에 대한 그들의 상보성을 결정한다. 샘플링된 염기가 다음 염기에 상보적인 경우, 이는 성장하는 발생기 가닥 내로 혼입된다. 이 프로세스는 주형 서열의 길이를 따라 계속되어 그 주형을 효과적으로 복사한다. 단순화된 개략적 방식으로 기재되었지만, 혼입의 실제 생화학적 프로세스는 상대적으로 복잡할 수 있다. 반응 프로세스 동안, 폴리머라제 효소는 일련의 형태적 변화를 겪는다.
본원에 사용하기 위한 적합한 폴리머라제 효소는 DNA 폴리머라제를 포함하며, 이는 다양한 계통발생적 관계에 기반하여 6개의 주요한 군으로, 예를 들어, 이. 콜라이(E. coil) Pol I (부류 A), 이. 콜라이 Pol II (부류 B), 이. 콜라이 Pol III (부류 C), 유리고세균(Euryarchaeotic) Pol II (부류 D), 인간 Pol 베타 (부류 X), 및 이. 콜라이 UmuC/DinB 및 진핵생물 RAD30/크세로더마 피그멘토숨(xeroderma pigmentosum) 변이체 (부류 Y)로 분류될 수 있다. 명명법의 검토를 위해서는, 예를 들어, 문헌 [Burgers et al. (2001) "Eukaryotic DNA polymerases: proposal for a revised nomenclature" J Biol Chem. 276(47):43487-90]을 참조한다. 폴리머라제의 검토를 위해서는, 예를 들어, 문헌 [Hubscher et al. (2002) "Eukaryotic DNA Polymerases" Annual Review of Biochemistry Vol. 71: 133-163; Alba (2001) "Protein Family Review: Replicative DNA Polymerases" Genome Biology 2(1):reviews 3002.1-3002.4]; 및 [Steitz (1999) "DNA polymerases: structural diversity and common mechanisms" J Biol Chem 274:17395-17398]을 참조하며; 이의 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 많은 폴리머라제에 대한 작용의 기본적인 메커니즘은 결정되었다. 문자 그대로 수 백의 폴리머라제의 서열은 공개적으로 이용가능하며, 이들 중 많은 것에 대한 결정 구조는 결정되었거나, 상동 폴리머라제에 대한 해결된 결정 구조와의 유사성에 기반하여 추론될 수 있다.
핵산 쇄 신장에 적합한 많은 이러한 폴리머라제는 용이하게 입수가능하다. 예를 들어, 인간 DNA 폴리머라제 베타는 알앤디 시스템즈(R&D systems)로부터 입수가능하다. 본원에 사용하기 위한 적합한 DNA 폴리머라제는 에피센터(Epicenter), 지이 헬스 케어(GE Health Care), 인비트로젠(Invitrogen), 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs), 프로메가(Promega), 로슈 어플라이드 사이언스(Roche Applied Science), 시그마 알드리츠(Sigma Aldrich) 및 많은 다른 것들로부터 입수가능한 DNA 폴리머라제 I을 포함한다. DNA 폴리머라제 I의 클레노브 단편은, 예를 들어, 앰비온(Ambion), 키메륵스(Chimerx), 이엔자임 엘엘씨(eEnzyme LLC), 지이 헬스 케어, 인비트로젠, 뉴 잉글랜드 바이오랩스, 프로메가, 로슈 어플라이드 사이언스, 시그마 알드리츠 및 많은 다른 것들로부터의 재조합 및 프로테아제 소화된 버전 둘 다로 입수가능하다. PHI.29 DNA 폴리머라제는, 예를 들어, 에피센터로부터 입수가능하다. 폴리 A 폴리머라제, 리버스 트랜스크립타제 (도 15 제3 패널), 세퀘나제, SP6 DNA 폴리머라제, T4 DNA 폴리머라제, T7 DNA 폴리머라제, 및 다양한 열안정성 DNA 폴리머라제 (Taq, 핫 스타트, 티타늄 Taq 등)는 다양한 이들 및 다른 공급원으로부터 입수가능하다. 다른 상업적 DNA 폴리머라제는 뉴 잉글랜드 바이오랩스로부터 입수가능한 퓨전hM(PhusionhM) 고-충실도 DNA 폴리머라제; 프로메가로부터 입수가능한 고택(GoTaq).RTM. 플렉시(Flexi) DNA 폴리머라제; 에피센터 바이오테크놀로지스(Epicentre Biotechnologies)로부터 입수가능한 RepIiPHI.TM. .PHI.29 DNA 폴리머라제; 스트라타진(Stratagene)으로부터 입수가능한 Pfu울트라(PfuUltra).TM. 핫스타트(Hotstart) DNA 폴리머라제; 노바젠(Novagen)으로부터 입수가능한 KOD 하이파이(HiFi) DNA 폴리머라제; 및 많은 다른 것들을 포함한다.
입수가능한 DNA 폴리머라제 효소는 또한 예를 들어, 엑소뉴클레아제 활성을 감소시키거나 제거하도록 (많은 천연 DNA 폴리머라제는, 예를 들어, 시퀀싱 적용을 방해하는 교정 엑소뉴클레아제 기능을 가짐), 프로테아제 소화된 효소 단편, 예컨대 클레노브 단편 재조합을 생성함으로써 생산을 단순화하도록, 등 임의의 다양한 방식으로 변형되었다. 언급된 바와 같이, 폴리머라제는 또한 특이성, 프로세싱성의 개선, 및 폴리머라제-DNA-뉴클레오티드 복합체에서의 표지된 뉴클레오티드의 개선된 체류 시간을 부여하도록 (예를 들어, 한젤(Hanzel) 등에 의한 WO 2007/076057 뉴클레오티드 유사체 혼입을 위한 폴리머라제 및 랭크(Rank) 등에 의한 WO 2008/051530 증진된 핵산 시퀀시을 위한 폴리머라제 효소 및 시약), 분지 분획 및 전위를 변경시키도록 (예를 들어, 발명의 명칭이 "변형된 혼입 특성을 위한 폴리머라제 및 반응 조건의 조작"인 프라나브 파텔(Pranav Patel) 등에 의해 2009년 9월 4일에 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 12/584,481), 광안정성을 증가시키도록 (예를 들어, 발명의 명칭이 "광손상에 대해 저항성인 효소"인 카이트 비조른슨(Keith Bjornson) 등에 의해 2009년 3월 30일에 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 12/384,110), 및 표면-고정화된 효소 활성을 개선시키도록 (예를 들어, 한젤 등에 의한 WO 2007/075987 활성 표면 커플링된 폴리머라제 및 한젤 등에 의한 WO 2007/076057 표면 부착된 단백질의 활성을 최적화하기 위한 단백질 조작 전략) 변형되었다. 임의의 이들 입수가능한 폴리머라제는 분지 분획 형성을 감소시키고/거나, 폐쇄된 폴리머라제-DNA 복합체의 안정성을 개선시키고/거나, 반응 속도 상수를 변경시키도록 본 발명에 따라 변형될 수 있다.
분지 분획을 감소시키거나, 폐쇄된 복합체 안정성을 증가시키거나, 반응 속도 상수를 변경시키는 돌연변이를 위한 바람직한 기질인 DNA 폴리머라제는 Taq 폴리머라제, 엑소뉴클레아제 결핍성 Taq 폴리머라제, 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 1, 클레노브 단편, 리버스 트랜스크립타제 (도 15 제3 패널), 야생형 PHI-29 폴리머라제 및 이러한 폴리머라제의 유도체, 예컨대 엑소뉴클레아제 결핍성 형태를 포함하는 PHI-29 관련 폴리머라제, T7 DNA 폴리머라제, T5 DNA 폴리머라제, RB69 폴리머라제 등을 포함한다.
또한, 폴리머라제는 적용-특이적 이유로, 예컨대 예를 들어, 2009년 3월 30일에 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 12/384,110에 교시된 바와 같이 광안정성을 증가시키도록, 예를 들어, WO 2007/075987, 및 WO 2007/076057에 교시된 바와 같이 표면에 결합되는 경우 효소의 활성을 개선시키도록, 또는 인용된 참고문헌에 교시된 바와 같이 및 관련 기술분야에 통상적인 바와 같이 정제 또는 취급 태그를 포함하도록 추가로 변형될 수 있다. 유사하게, 본원에 기재된 변형된 폴리머라제는 예컨대 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 2009년 3월 30일에 출원되고, 발명의 명칭이 "2 저속-단계 폴리머라제 효소 시스템 및 방법"인 미국 특허 출원 일련 번호 12/414,191에 교시된 폴리머라제 성능, 예를 들어, 폴리머라제 속도 상수를 제어하기 위한 반응 조건을 개선시키는 다른 전략과 조합으로 채용될 수 있다.
본 발명 핵산 표적 서열 검출 방법 (도 11에 제시됨)의 또 다른 실시양태에서, 형광 표지는 dNTP 또는 뉴클레오티드 유사체의 말단 포스페이트에 (또는 피로포스페이트 이탈기; PPi 상의 또 다른 영역에) 부착된다. 이 형광 표지의 여기 스펙트럼은 루시페린의 산화에 의해 적어도 부분적으로 생성된 발광과 매칭된다. 이 표지된 뉴클레오티드는 또한 임의로 형광 표지 (뉴클레오티드의 말단 포스페이트에 부착됨)의 방출 스펙트럼과 중첩하는 흡수 스펙트럼을 갖는 뉴클레오티드의 염기 또는 당 중 어느 하나에 제거가능하게 또는 비-제거가능하게 부착된 켄처 분자를 포함한다. 형광 표지 및 켄처 둘 다로 변형된 뉴클레오티드는 본원에서 켄칭된 뉴클레오티드로 지칭된다. 따라서, 뉴클레오티드 유사체와 폴리머라제의 상호작용 시, 폴리머라제는 부착된 형광단을 갖는 피로포스페이트 (표지된 피로포스페이트)를 방출하여 켄처로부터 형광 표지를 분리한다. 분리되는 경우, 켄처는 형광 표지의 방출을 흡수할 수 없을 것이다. 이어서 표지된 피로포스페이트는 ATP 생성 효소와 반응하고, 동일한 형광 표지에 의해 이제 표지된 ATP (표지된 ATP)로 전환된다. 이어서 이 표지된 ATP는 루시페라제와 상호작용하여 발광을 생성하고 표지된 피로포스페이트를 방출할 것이다. 생성된 발광은 표지된 피로포스페이트 상의 형광 표지를 여기시키고, 여기된 형광단은 그의 특이적 방출 범위에서 광을 방출한다. 켄칭된 뉴클레오티드는 폴리머라제에 대한 개선된 특이성을 갖도록 생성되므로, 형광 표지의 방출 스펙트럼의 범위에서 생성된 생성된 광은 생성된 신호의 특이성을 증가시키는데; 이는 이미 혼입된 뉴클레오티드가 폴리머라제와 반응하지 않은 배경에서 잔류하는 뉴클레오티드로부터 구별되기 때문이다. 이 실시양태에 대해, 각각의 뉴클레오티드는 동일한 표지 또는 상이한 표지로 표지될 수 있거나, 또는 단지 1개, 또는 단지 2개, 또는 단지 3개의 뉴클레오티드는 동일한 또는 상이한 또는 임의의 다른 조합의 표지로 표지될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 뉴클레오티드 유사체가 주형 가닥 내로 혼입되는 경우 PPi 표지된 이탈기 (예를 들어, PPi + FL)가 폴리머라제에 의해 생성되는 경우, 그 표지된 피로포스페이트는 도 11에 나타내어진 바와 같이 ATP 술푸릴라제에 의해 아데노신 5' 포스포술페이트와 조합되어 표지된-ATP (ATP + FL)를 형성할 수 있도록, 뉴클레오티드 유사체는 형광단을 말단 포스페이트에 첨가함으로써 변형된다 (예를 들어, 문헌 [Yarbrough et al., J. Biol. Chem., 254:12069-12073, 1979] 참조; 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨).
대안적인 표지화 전략은 표지화 모이어티로서 무기 물질, 예컨대 나노스케일 체제에서의 그들의 반도체 구성 및 크기로 인해 고유한 형광 능력을 갖는 형광 또는 발광 나노입자, 예를 들어 나노결정, 즉 양자 점을 채용할 수 있다 (예를 들어, 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 6,861,155, 6,699,723, 7,235,361 참조). 이러한 나노결정 물질은 일반적으로, 예를 들어, 라이프 테크놀로지스(Life Technologies), (미국 캘리포니아주 칼스배드)로부터 상업적으로 입수가능하다. 다시, 이러한 화합물은 개별적인 표지화 기로서 또는 예를 들어, 다른 무기 나노결정 또는 유기 형광단과의 상호작용성 기 또는 쌍으로서 존재할 수 있다. 일부 경우에, 형광 단백질, 예컨대 녹색 형광 단백질 (GFP, EGFP), 청색 형광 단백질 (EBFP, EBFP2, 아주라이트(Azurite), 엠칼라마1(mKalama1)), 시안 형광 단백질 (ECFP, 세룰레안(Cerulean), CyPet) 및 황색 형광 단백질 유도체 (YFP, 시트린(Citrine), 비너스(Venus), YPet)가 사용될 수 있다. 또한 본원에 사용하기 위해 고려되는 것은 에컨대 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Krutzek et al., Curr Protoc Cytom. 2011 January; CHAPTER: Unit-6.31. (doi:10.1002/0471142956.cy0631s55.)]에 기재된 검출을 위한 다중 색상 코딩된 신호를 생성하는 다중극 형광 염료를 사용한 형광 세포 바코딩이다.
가닥의 연속적 신장에 의한 형광 활성화 (FACES)
본원에서 가닥의 연속적 신장에 의한 형광 활성화 (FACES)로 지칭되는 또 다른 실시양태에서, 그에 부착된 형광단 및 켄처 분자 둘 다를 갖는 "켄칭된 뉴클레오티드"는 단지 폴리머라제 효소만을 포함하는 본 발명 방법 및 시스템에 사용된다 (도 12 참조). 본원에서 제공된 이 방법에서, 외부 광원은 형광단을 여기시키는데 사용된다. 켄칭된 뉴클레오티드가 폴리머라제와 반응하고, 조사되고 있는 미지의 샘플과의 표적 핵산 서열의 프라이머-프로브 결합의 결과로서 신장하는 핵산 가닥 내로 혼입되는 경우, 표지된 피로포스페이트가 방출되어 주형 가닥에의 부착된 표지된 뉴클레오티드 유사체의 수에 비례하는 형광 신호를 생성한다. 다시 말해서, 형광 신호는 쇄 신장 길이에 비례한다. 신장하는 가닥 내로 혼입되지 않은 켄칭된 뉴클레오티드는 켄처 분자와 형광 표지의 가까운 근접으로 인해 심지어 여기 하에서도 임의의 형광 방출을 나타내지 않는다. 이들 비-혼입된 dNTP 또는 뉴클레오티드 유사체에 대한 형광 방출은 켄칭되고 배경으로서 검출되지 않을 것이다.
다른 실시양태에서, 형광 표지를 이용하는 본원에 기재된 본 발명 시스템은 또한 외부 여기와 함께 이용될 수 있다. 형광 표지는 루시페라제 반응과의 커플링이 없도록 그들의 여기 및 방출 파장이 발광 스펙트럼으로부터 멀도록 하는 방식으로 선택될 수 있다. 루시페라제 반응은 단지 표지된 ATP를 리사이클링하고 표지된 피로포스페이트를 생성하는데 사용된다. 결국, 다시 루프가 이용되지만, 이 때 폴리머라제에 의해 생성된 표지된 피로포스페이트는 외부 광원으로 여기된다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 어느 기기가 적합한지, 검정이 다중화 또는 높은 샘플 처리량을 요구하는지 여부, 및 단독으로 또는 각각의 켄처 (예를 들어, 비-제거가능한 켄처)와 조합으로 어느 유형의 형광 표지가 각각의 핵산 검출 방법 적용을 충족시키는데 요구되는 특이성 및 민감도를 제공하는지를 용이하게 결정할 수 있다. 표 1에 열거된 형광단은 유사한 상호작용성 형광단 및 여기 및 방출 스펙트럼을 나타내는 열거된 대안적인 형광단과 함께 사용될 수 있으며, 상이한 판매자로부터 입수가능한 반면; 표 2는 예시적인 켄처 모이어티의 목록을 제공한다.
하기 지침은 상이한 유형의 형광단 표지된 뉴클레오티드 및 검출 기기에 대한 적절한 형광단/켄처 조합을 선택하는데 있어서 따라질 수 있다:
이용되는 분광형광계측 기기에 기반하여, 기기의 광학장치에 의해 여기되고 검출될 수 있는 적절한 형광단 표지가 선택된다. 아르곤 블루-광 레이저가 구비된 기기는 500 내지 540 nm의 여기 파장을 갖는 형광단의 여기에 최적이지만, 보다 긴 여기 최대값을 갖는 형광단은 이 광원에 의해 덜 잘 여기되거나, 전혀 여기되지 않는다. 백색 광원, 예컨대 텅스텐-할로겐 램프를 갖는 기기는 여기 및 방출을 위한 필터를 사용하며, 동일한 효율로 400 내지 700 nm의 여기 및 방출 파장을 갖는 형광단을 여기시키고 검출할 수 있다. 이는 또한 여기 공급원으로서 발광 다이오드 및 폭넓은 범위의 형광단의 검출을 위한 방출 필터를 사용하는 기기에 대한 사례이다.
검정이 하나의 표적 DNA 서열을 검출하도록 디자인되고, 단지 하나의 형광 표지가 사용될 것인 경우, FAM, TET, 또는 HEX (또는 표 1에 열거된 그들의 대안 중 하나)는 각각의 뉴클레오티드를 표지하기 위한 우수한 형광단일 것이다. 이들 형광단은 모든 이용가능한 분광형광계측 기기 상에서 여기되고 검출될 수 있다. 또한, 이들 형광단의 포스포르아미다이트 유도체의 이용가능성 및 켄처-연결된 제어 공극 유리 칼럼의 이용가능성 때문에, 이들 표지를 갖는 형광 뉴클레오티드는 상대적으로 덜 비싸고 덜 노동 집약적인 제조의 이점을 갖는 자동화 프로세스에서 전적으로 합성될 수 있다.
표 1. 형광 혼성화 프로브에 대한 형광단 표지
Figure pct00001
A) CAL 및 쿼사르(Quasar) 형광단은 바이오서치 테크놀로지스(Biosearch Technologies)로부터 입수가능하고; B) VIC 및 NED는 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)로부터 입수가능하고; C) Cy 염료는 아머샴 바이오사이언시스(Amersham Biosciences)로부터 입수가능하고; D) 오이스터(Oyster) 형광단은 인테그레이티드 디엔에이 테크놀로지스(Integrated DNA Technologies)로부터 입수가능하고; E) LC (광 사이클러) 형광단은 로슈 어플라이드 사이언스로부터 입수가능하다.
검정이 2개 이상의 DNA 서열의 검출을 위해 디자인되고 (다중화 핵산 표적 검출 검정), 따라서 2개 이상의 형광 표지된 뉴클레오티드가 사용될 것인 경우, 서로로부터 잘 분리되는 (최소 스펙트럼 중첩) 흡수 및 방출 파장을 갖는 형광단을 선택한다. 대부분의 기기는 형광단 사이의 스펙트럼 중첩을 최소화하는 여기 및 방출 필터의 선택을 갖는다. 스펙트럼 중첩이 일어나는 정도까지, 기기는 쇄 신장 반응에 존재하는 각각의 형광단으로부터 방출 기여를 결정하는 빌트-인 알고리즘을 갖는 소프트웨어 프로그램에 의해 지지된다. 또한, 대부분의 기기는 각각의 형광단의 방출 기여의 결정을 추가로 최적화하는 검정에 이용되는 형광단에 대한 광학장치를 수동으로 보정하는 옵션을 갖는다.
형광 공명 에너지 전달 (FRET)을 이용하는 형광 뉴클레오티드의 디자인을 위해, 충분한 스펙트럼 중첩을 갖는 형광단-켄처 쌍이 선택되어야 한다. 500 내지 550 nm의 방출 최대값을 갖는 형광단, 예컨대 FAM, TET 및 HEX는 450 내지 550 nm의 흡수 최대값을 갖는 켄처, 예컨대 답실 및 BHQ-1에 의해 가장 적합하게 켄칭된다 (대안적인 켄처 표지에 대해서는 표 2 참조). 550 nm 초과의 방출 최대값을 갖는 형광단, 예컨대 로다민 (TMR, ROX 및 텍사스 레드(Texas red)를 포함함) 및 Cy 염료 (Cy3 및 Cy5를 포함함)는 550 nm 초과의 흡수 최대값을 갖는 켄처 (BHQ-2를 포함함)에 의해 적합하게 켄칭된다.
표 2. 형광 혼성화 프로브에 대한 켄처 표지
Figure pct00002
A) DDQ 또는 딥 다크 켄처(Deep Dark Quencher)는 유로젠텍(Eurogentec)으로부터 입수가능하고;
B) 이클립스(Eclipse) 켄처는 에포크 바이오사이언시스(Epoch Biosciences)로부터 입수가능하고; C) 아이오와(Iowa) 켄처는 인테그레이티드 디엔에이 테크놀로지스로부터 입수가능하고; D) BHQ 또는 블랙 홀(Black Hole) 켄처는 바이오서치 테크놀로지스로부터 입수가능하고; E) QSY 켄처는 몰리큘라 프로브스(Molecular Probes)로부터 입수가능하다.
접촉 켄칭을 이용하는 형광 뉴클레오티드의 디자인을 위해, 임의의 비-형광 켄처는 형광단으로부터의 에너지의 우수한 수용자로서 역할을 할 수 있다. 예를 들어, 특정한 실시양태에서, Cy3 및 Cy5는 BHQ-1 및 BHQ-2 켄처에 의해 가장 양호하게 켄칭된다.
형광단은 특이적 양자 수율을 나타낸다. 형광 양자 수율은 형광단이 흡수된 광을 방출된 광으로 전환시킬 수 있는 효율의 척도이다. 보다 높은 양자 수율은 보다 높은 형광 광도를 발생시킨다. 양자 수율은 pH 및 온도의 변화에 민감하다. 대부분의 핵산 쇄 신장 반응 조건 하에서, pH 및 온도는 많이 변화하지 않으며, 따라서 양자 수율은 유의하게 변화하지 않을 것이다.
본원에 제시된 바와 같이, 뉴클레오티드는 형광단의 형광을 켄칭할 수 있으며, 구아노신이 가장 효율적인 켄처이고, 이어서 아데노신, 시티딘 및 티미딘이다 (예를 들어, 문헌 [Seidel, C.A.M., Schulz, A. and Sauer, M.M.H. (1996) Nucleobase-specific quenching of fluorescent dyes. 1. Nucleobase one-electron redox potentials and their correlation with static and dynamic quenching efficiencies. J. Phys. Chem. 100, 5541-5553] 참조; 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 일반적으로, 500 내지 550 nm의 여기 파장을 갖는 형광단은 보다 긴 여기 파장을 갖는 형광단보다 뉴클레오티드에 의해 보다 효율적으로 켄칭된다.
연속적 긴 핵산 쇄 신장-길이를 달성하는 방법
검출되는 검출가능한 광 신호 (예를 들어, 발광 및/또는 형광)를 증가시키기 위해, 긴 핵산 쇄 신장-길이를 달성하는 능력은 조사되는 표적 핵산의 존재를 지시하는 검출가능한 광 신호 (예를 들어, 발광 및/또는 형광) 신호의 강도를 증가시키기 위해 요망된다. 현재 쇄 신장 접근법은 긴 핵산 쇄 신장-길이를 달성하는 그들의 능력에 있어서 제한된다. 특히, 각각의 개별적 쇄 신장 사건에 대해, 이 제한은 주형 핵산에 대한 폴리머라제의 상대 친화도로부터 발생한다. 쇄 신장 반응 동안, 폴리머라제는 결국 주형 핵산 (예를 들어, DNA 또는 RNA 등)으로부터 떨어지며, 그에 의해 그 각각의 핵산 쇄 신장 길이에서 dNTP 쇄 신장 반응을 종료시킬 것이다.
본 발명에 따르면, 폴리머라제 효소는 반응 혼합물에서의 각각의 프라이머-프로브에 대한 복수의 폴리머라제 효소에 상응하는 양으로 쇄 신장 반응 혼합물에 첨가될 수 있다.
본 발명 표적 핵산 검출 연속적 핵산 쇄 신장 방법 (예를 들어 LACES 및 FACES)의 특정한 실시양태에서, 특히 복수의 폴리머라제가 핵산 샘플에서 각각의 각각의 표적 주형 핵산을 신장시키는데 사용되는 경우, 전체 핵산 쇄 신장 길이는 단지 특정한 반응 구속 영역에 제공되는 표적 주형 핵산의 길이에 의해 제한된다. 예를 들어, 샘플 내의 각각의 단일 표적 핵산 주형에 대한 하나 또는 복수의 폴리머라제를 사용함으로써 달성될 수 있는 본원에서 고려되는 전체 핵산 쇄 신장 길이는 최대 전체 염색체의 길이, 예를 들어, 5천만 내지 약 3억개의 염기 쌍 (예를 들어, 300Mbp) 등이다. 본원에서 고려되는 다른 특정 실시양태에서, 본 발명 쇄 신장 핵산 검출 방법에 의해 달성되는 핵산 쇄 신장 길이는 적어도 200bp, 300bp, 400bp, 500bp, 600bp, 700bp, 800, bp, 900bp, 1000bp (즉, 1kbp), 5kbp 10kbp, 20kbp, 30kbp, 40kbp, 50kbp, 100kbp, 200kbp, 300kbp, 400kbp, 500kbp, 600kbp, 700kbp, 800kbp, 900kbp, 1000kbp (1Mbp), 5Mbp, 10Mbp, 20Mbp, 50Mbp, 75Mbp, 100Mbp, 200Mbp, 300Mbp, 400Mbp, 500Mbp, 600Mbp, 700Mbp, 800Mbp, 900Mpb, 1000Mbp로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본원에 사용된 어구 "복수의 폴리머라제 효소", "복수의 폴리머라제" 또는 그의 문법적 파생어는 본 발명 핵산 쇄 신장 반응 혼합물에 사용되는 각각의 각각의 프라이머-프로브에 사용되는 폴리머라제 효소의 수를 지칭한다. "복수의 폴리머라제 효소"에서의 폴리머라제의 양은 쇄 신장 반응 혼합물에 사용되는 프라이머-프로브당 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 200000, 300000, 400000, 500000, 600000, 700000, 800000, 900000, 및 적어도 1000000개의 폴리머라제 효소로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 표적 핵산 주형을 연속적으로 신장시키는 다른 실시양태에서, 폴리머라제 대 주형의 비는 쇄 신장 반응 혼합물에 사용되는 프라이머-프로브당 적어도 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 100:1, 150:1, 200:1, 250:1, 300:1, 350:1, 400:1, 450:1, 500:1, 550:1, 600:1, 650:1, 700:1, 750:1, 800:1, 850:1, 900:1, 950:1, 1000:1, 10000:1, 20000:1, 30000:1, 40000:1, 50000:1, 60000:1, 70000:1, 80000:1, 90000:1, 100000:1, 200000:1, 300000:1, 400000:1, 500000:1, 600000:1, 700000:1, 800000:1, 900000:1, 및 적어도 1000000:1 폴리머라제 효소로 이루어진 군으로부터 선택된다. 복수에서의 폴리머라제는 동일한 유형의 폴리머라제의 균질한 집합일 수 있거나, 2개 이상의 상이한 유형의 폴리머라제, 예를 들어 복수에서의 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50개 내지 100개 또는 그 초과의 상이한 폴리머라제의 이질적인 집합일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명 쇄 신장 반응 혼합물은 그 안에 신장되는 주형 핵산의 보다 큰 샘플 내에 복수의 표적 핵산 주형을 갖는다. 특정한 실시양태에서, 조사되는 표적 핵산의 존재를 검출하는 것에 추가로, 표적의 카피 수는 관련 기술분야에 널리 공지된 보정 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 대조군 표준물은 공지된 카피 수를 갖는 공지된 서열의 실행일 수 있다. 본 발명 핵산 검출 반응 (예를 들어, LACES 및/또는 FACES)의 결과는 시험 샘플에서 표적 핵산의 카피 수를 결정하기 위해 대조군 표준물과 비교될 수 있다.
본 발명 핵산 표적 검출 방법의 일부 실시양태에서, 조사되고 있는 시험 샘플 핵산 주형과 함께, 구속 영역에 하나만큼 적은 내지 복수의 프라이머-프로브가 있을 수 있도록, 효소 연쇄물은 특정한 개별적 구속 (예를 들어, 액적 등)에 제공되는 반면; 복수의 (예를 들어, 많은) 폴리머라제 효소 및 연쇄물을 형성하는 상응하는 복수의 다른 효소가 있다 (도 9A). 이 실시양태에서, 폴리머라제 효소가 표적 주형 핵산으로부터 떨어지는 (해리하는) 경우 (도 9B), 특정한 표적 핵산 주형 영역에 구속된 많은 복수의 다른 폴리머라제 중 하나는 유리하게는 및 상대적으로 즉시 주형 상의 위치에서 그의 쇄 신장을 시작하고, 여기서 이전의 폴리머라제는 버려지거나 해리된다 (도 9B). 다시 말해서, 쇄 신장은 제1 폴리머라제 효소로, 그것이 붕괴되고 주형 핵산으로부터 해리될 때까지 일어나고, 이어서 쇄 신장 반응은 제2 폴리머라제 (제1과 상이함)로, 그것이 붕괴되고 주형 핵산으로부터 해리될 때까지 계속되고, 이어서 쇄 신장 반응은 제3 폴리머라제 (제2 폴리머라제와 상이함; 특정한 쇄 신장 반응에서 제1 폴리머라제 또는 또 다른 복수의 폴리머라제일 수 있음)로, 그것이 붕괴되고 주형 핵산으로부터 해리될 때까지 계속되는 등이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이 접근법을 사용하여, 핵산 표적 검출 반응이 실행되고 있는 한, 표적 핵산 주형이 연속적으로 신장되고 있음을 용이하게 이해할 것이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 또한 본원에 개시된 신장의 실질적으로 연속적 방법을 사용하는 경우, 핵산 쇄 신장 길이는 단지 표적 핵산의 길이 및/또는 각각의 쇄 신장 반응에 사용되는 반응 구속 영역의 물리적 크기에 의해 제한됨을 용이하게 이해할 것이다.
따라서, 본원에서 제공된 본 발명 방법의 특정한 실시양태는 표적 핵산 주형을 연속적으로 쇄 신장시키는 방법을 이용한다. 이 실시양태에서, 본원에 사용된 "연속성", "표적 핵산 주형을 연속적으로 신장시키는", 또는 "표적 핵산 주형을 실질적으로 연속적으로 신장시키는"은 단일 폴리머라제가 전체 긴 핵산 쇄 신장 길이에 대해 특정한 표적 핵산을 연속적으로 신장시킬 수 있음을 의미하지 않지만, 오히려 표적 핵산 주형의 반응 영역에서의 복수의 폴리머라제 효소가 그들 사이에 함께 취해지고, 이전의 폴리머라제가 특정한 표적 핵산 주형으로부터 해리된 곳으로부터 다음의 뉴클레오티드에서 dNTP 쇄 신장을 넘겨받는데 이용가능한 다수의 폴리머라제를 연속적으로 갖는 그 복수의 폴리머라제 효소에 의해, 특정한 표적을 연속적으로 신장시킬 수 있음을 의미한다.
표적 핵산 서열을 검출하는 본 발명 연속적 핵산 쇄 신장 방법의 특정한 실시양태에서, 특히 복수의 폴리머라제가 핵산 샘플에서 각각의 각각의 표적 주형 핵산을 신장시키는데 사용되는 경우, 전체 핵산 쇄 신장 길이는 단지 특정한 반응 구속 영역에 제공되는 표적 주형 핵산의 길이에 의해 제한된다. 예를 들어, 샘플 내의 각각의 단일 표적 핵산 주형에 대해 하나 또는 복수의 폴리머라제를 사용함으로써 달성될 수 있는 본원에서 고려되는 전체 핵산 쇄 신장 길이는 최대 전체 염색체의 길이, 예를 들어, 5천만 내지 약 3억개의 염기 쌍 (예를 들어, 300Mbp) 등이다. 본원에서 고려되는 다른 특정 실시양태에서, 본 발명 쇄 신장 핵산 검출 방법에 의해 달성되는 핵산 쇄 신장 길이는 적어도 200bp, 300bp, 400bp, 500bp, 600bp, 700bp, 800, bp, 900bp, 1000bp (즉, 1kbp), 5kbp 10kbp, 20kbp, 30kbp, 40kbp, 50kbp, 100kbp, 200kbp, 300kbp, 400kbp, 500kbp, 600kbp, 700kbp, 800kbp, 900kbp, 1000kbp (1Mbp), 5Mbp, 10Mbp, 20Mbp, 50Mbp, 75Mbp, 100Mbp, 200Mbp, 300Mbp, 400Mbp, 500Mbp, 600Mbp, 700Mbp, 800Mbp, 900Mpb, 1000Mbp로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
복수의 폴리머라제에 의한 표적 주형 핵산의 실질적으로 연속적인 신장 때문에, 반응은 특정한 핵산 쇄 신장 길이를 달성하는 단일 효소의 능력에 의해 제한되지 않는다. 이는 본 발명 방법에서 보다 높은 특이성 및 낮은 오류율을 갖는 효소의 사용을 허용한다. 표적 핵산을 검출하는 본 발명 방법의 특정한 실시양태에 따르면, 반응 혼합물에서 프라이머-프로브당 1종 초과의 폴리머라제 (즉, 복수)를 사용하는 것은 무한대로 긴 핵산 쇄 신장-길이를 달성할 수 있음이 본원에서 고려된다. 본원에 제시된 바와 같이, 하나의 폴리머라제가 표적 주형 핵산으로부터 떨어지는 경우, 또 다른 폴리머라제는 이전의 폴리머라제가 내버려진 곳으로부터 계속할 것이며, 이는 유리하게는 폴리머라제가 본 발명 방법에서 수행하기 위해 선택되거나 최적화될 수 있는 방식을 변경시킨다. 이러한 이유로, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 그 폴리머라제가 또한 상대적으로 짧은 핵산 쇄 신장 길이를 가질 수 있더라도, 매우 낮은 오류율을 갖는 폴리머라제를 선택할 수 있다. 이는 이 특정한 실시양태에 대한 이점을 제공하며, 즉, 본 발명 방법에 사용하기 위해 선택된 폴리머라제는 긴 핵산 쇄 신장 길이 및 특이성 둘 다를 요구하지 않는다.
본 발명의 주형 핵산은 또한 비천연 핵산, 예컨대 PNA, 변형된 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 생물학적 RNA 또는 DNA에 전형적이지 않은 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드, 예컨대 2'-O-메틸화 올리고뉴클레오티드), 변형된 포스페이트 백본 등을 포함할 수 있다. 핵산은, 예를 들어, 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다.
본원에 사용된 어구 "뉴클레오티드 유사체"는 DNA 합성에 사용될 수 있는 변형된 뉴클레오티드 (예를 들어, 변형된 dNTP, 예컨대 dATP, dTTP, dGTP, dCTP 및 dUTP)를 지칭한다. 본 발명에 사용하기 위한 뉴클레오티드 유사체는 폴리머라제에 대한 및 선택적 절단 활성을 위한 기질일 수 있는 임의의 적합한 뉴클레오티드 유사체일 수 있다. 뉴클레오티드는 변형되고, 폴리머라제 및 다른 효소에 대한 기질로서 여전히 사용될 수 있음이 보여졌다. 뉴클레오티드 유사체의 변이체가 고려되는 경우, 폴리머라제와의 또는 또 다른 효소 활성, 예컨대 엑소뉴클레아제 활성과의 뉴클레오티드 유사체의 혼화성은 활성 검정에 의해 결정될 수 있다. 활성 검정을 수행하는 것은 간단하며, 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
뉴클레오티드 유사체는, 예를 들어, 성장하는 가닥 내로의 혼입 시 절단되는 폴리포스페이트 쇄의 부분 상에 표지를 갖는 그의 폴리포스페이트 쇄에 3개 이상의 포스페이트를 갖는 뉴클레오시드 폴리포스페이트일 수 있다. 폴리포스페이트는 순수한 폴리포스페이트, 예를 들어 --O--PO3- 또는 피로포스페이트 (예를 들어, PPi)일 수 있거나, 폴리포스페이트는 치환을 포함할 수 있다. 유사체 및 이러한 유사체를 제조하는 방법에 관한 추가의 상세사항은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 7,405,281; 9,464,107 등에서 발견될 수 있다.
5가지 유형의 dNTP, 즉, 데옥시아데노신 트리포스페이트 (dATP), 데옥시구아노신 트리포스페이트 (dGTP), 데옥시시티딘 트리포스페이트 (dCTP), 데옥시티미딘 트리포스페이트 (dTTP), 및 데옥시우라실 트리포스페이트 (dUTP)가 있다. dATP 대신, dATPαS는 dATP에 대한 치환체로서 사용될 수 있는데, 이는 그것이 DNA 폴리머라제에 대한 기질로서 작용하지만, 루시페라제에 대한 기질로서는 작용하지 않기 때문이다. 본원에 사용하기 위해 고려되는 다른 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 문헌 [Jordheim et al., Advances in the development of nucleoside and nucleotide analogues for cancer and viral diseases, Nat. Rev. Drug Discov. (2013) 12: 447-464]; 및 [Guo et al. Four-color DNA sequencing with 3'-O-modified nucleotide reversible terminators and chemically cleavable fluorescent dideoxynucleotides, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2008) 105:9145-9150] 등 (이의 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 것들은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
본원에서 제공된 본 발명 방법의 다른 실시양태는 폴리머라제에 대한 특이성을 개선시키고 루시페라제에 대한 친화도를 감소시키도록 변형된 뉴클레오티드 유사체를 실행한다. 이 실시양태의 이점은 배경 발광 생성을 유발할 수 있는 루시페라제와 직접적으로 뉴클레오티드의 비특이적 상호작용을 회피하는 것으로부터 초래된다. 예를 들어, 데옥시 아데노신 트리포스페이트 (dATP) 또는 dGTP는 ATP 대신 루시페라제에 의해 이용될 수 있음이 가능하다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 폴리머라제에 대한 그의 특이성을 개선시키면서 루시페라제에 대한 그의 친화도를 감소시키는 뉴클레오티드에 대한 변형을 포함하는 뉴클레오티드 유사체를 용이하게 선택할 수 있다.
추가의 다른 실시양태에서, dATPαS, dGTPαS, dCTPαS, dTTPαS는 dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP 대신 사용되며, 이는 폴리머라제 이외의 효소 (예를 들어, 루시페라제)와의 뉴클레오티드의 비-특이적 상호작용을 감소시키는 것으로 본원에서 고려된다.
본원에서 제공된 폴리머라제-ATP 술푸릴라제-루시페라제의 본 발명 연결된 3-효소 시스템 및 방법을 사용하여, 특정한 조사되는 표적 핵산 서열의 존재를 지시하는 발광 신호는 단지 특이적 조사 프라이머-프로브가 그의 표적 서열에 결합하고, 쇄 신장을 개시하는 경우에만 생성될 것이며, 이는 ATP-재생-효소/루시페라제 증폭 루프에 사용하기 위한 다수의 피로포스페이트 (PPi) 이탈기를 생성할 것이다.
본원에 사용된 어구 "이탈기"는 주형 핵산 가닥 내로의 각각의 dNTP의 혼입 동안 본 발명 3 효소 폴리머라제-ATP 술푸릴라제-루시페라제 반응에 의한 절단의 경우 및/또는 시 각각의 dNTP로부터 방출되는 폴리포스페이트 쇄를 지칭한다. 본원의 특정한 실시양태에서, 폴리포스페이트는 dNTP로부터 절단되고 (도 1A 및 1B), ATP로 전환되고 (ATP; 도 1B 및 1C), 이어서 후속적으로 루시페라제 반응을 통해 반응 혼합물 내로 방출되고 (도 1C), 후속적으로 반응 루프를 통해 ATP로 다시 전환되는 피로포스페이트 (PPi)이다 (도 1B, 도 1C, 도 2, 도 3 및 도 10 참조). 본 발명 표적 핵산 서열 검출 방법의 다른 실시양태에서, 이탈기는 부착된 형광 표지를 갖는 피로포스페이트 (PPi + FL)이다; 예를 들어 도 11 및 12를 참조한다.
본원에 제시된 바와 같이, 도 1C로부터의 이 피로포스페이트 (PPi) (또는 도 11 및 12로부터의 PPi + FL)는 ATP 술푸릴라제/루시페라제 증폭 루프에서 도 1B로 다시 다수회 루핑될 수 있다. 피로포스페이트 (PPi)가 다시 루핑되어 신장하는 서열 내로의 각각의 dNTP 혼입 사건에 대한 각각의 발광 신호를 증폭시킬 수 있는 횟수의 수는 적어도 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 200000, 300000, 400000, 500000, 600000, 700000, 800000, 900000, 및 적어도 1000000회로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
사용되는 반응 조건은 또한 다양한 반응의 상대 속도에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 반응 조건을 제어하는 것은 핵산 쇄 신장 반응이 높은 속도에서 주형으로부터 검출가능한 광 신호 (예를 들어, 발광 및/또는 형광) 신호를 생성하는데 성공적임을 보장하는데 있어서 유용할 수 있다. 반응 조건은, 예를 들어, 완충제의 유형 및 농도, 반응의 pH, 온도, 염의 유형 및 농도, 효소의 동역학에 영향을 미치는 특정한 첨가제의 존재, 및 금속 보조인자를 포함하는 다양한 보조인자의 유형, 농도, 및 상대량을 포함한다. 폴리머라제의 2 저속-단계 거동을 달성하거나 증진시키기 위한 반응 조건의 조작은 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 8,133,672에 상세하게 기재되어 있다.
효소적 반응은 종종 부분적으로 반응 혼합물의 pH를 제어하는데 사용되는 완충제의 존재 하에서 실행된다. 완충제의 유형은 일부 경우에 폴리머라제 반응의 동역학에, 이러한 동역학이 요망되는 경우, 2 저속-단계 동역학을 초래할 수 있는 방식으로 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 완충제로서 IRIS의 사용은 2 저속-단계 반응을 얻기 위해 유용하다. 적합한 완충제는, 예를 들어, TAPS (3-{[트리스(히드록시메틸)메틸]아미노}프로판술폰산), 비신 (N,N-비스(2-히드록시에틸)글리신), IRIS (트리스(히드록시메틸)메틸아민), ACES (N-(2-아세트아미도)-2-아미노에탄술폰산), 트리신 (N-트리스(히드록시메틸)메틸글리신), HEPES (4-2-히드록시에틸-1-피페라진에탄술폰산), TES (2-{[트리스(히드록시메틸)메틸]아미노}에탄술폰산), MOPS (3-(N-모르폴리노)프로판술폰산), PIPES (피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰산)), 및 MES (2-(N-모르폴리노)에탄술폰산)를 포함한다.
반응의 pH는 폴리머라제 반응의 동역학에 영향을 미칠 수 있으며, 2 저속-단계 동역학을 나타내는 반응을 얻기 위한 폴리머라제 반응 조건 중 하나로서 사용될 수 있다. pH는 2 저속-단계 반응 메커니즘을 생성하는 값으로 조정될 수 있다. pH는 일반적으로 약 6 내지 약 9이다. 일부 실시양태에서, pH는 약 6.5 내지 약 8.0이다. 다른 실시양태에서, pH는 약 6.5 내지 7.5이다. 특정한 실시양태에서, pH는 약 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 또는 7.5로부터 선택된다.
반응의 온도는 반응의 상대 속도가 적절한 범위에서 일어나고 있음을 보장하기 위해 조정될 수 있다. 반응 온도는 폴리머라제의 유형 또는 채용되는 선택적 절단 활성에 의존할 수 있다. 본원에 사용되는 온도는 또한 2개의 염기 사이의 수소 결합 뿐만 아니라 반응 혼합물에서 물과의 염기의 상호작용을 조작하고 제어하며, 그에 의해 반응 구성요소의 용해도를 제어하는 것으로 고려된다.
일부 실시양태에서, 반응의 동역학에 영향을 미칠 첨가제, 예컨대 마그네슘, 조효소 A 등은 반응 혼합물에 첨가될 수 있다. 일부 경우에, 첨가제는 효소의 활성 부위와 상호작용하여, 예를 들어 경쟁적 억제제로서 작용할 수 있다. 일부 경우에, 첨가제는 반응의 동역학에 영향을 미칠 방식으로 활성 부위로부터 떨어진 효소의 부분과 상호작용할 수 있다. 동역학에 영향을 미칠 수 있는 첨가제는, 예를 들어, 그의 전체 개시내용이 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 실용 특허 8,252,911에 기재된 바와 같은 반응의 속도를 변조하는 분석 반응에서 경쟁적, 그러나 다르게는 비반응성 기질 또는 억제제를 포함한다.
또 다른 예로서, 동위원소, 예컨대 중수소는 폴리머라제 반응에서 하나 이상의 단계의 속도에 영향을 미치기 위해 첨가될 수 있다. 일부 경우에, 중수소는 중수소 동위원소 효과로 인해 폴리머라제 반응에서 하나 이상의 단계를 감속시키는데 사용될 수 있다. 폴리머라제 반응의 단계의 동역학을 변경시킴으로써, 일부 경우에 본원에 기재된 바와 같은 2 저속 단계 동역학이 달성될 수 있다. 중수소 동위원소 효과는, 예를 들어, 혼입 속도를 감속시킴으로써, 예를 들어, 뉴클레오티드의 혼입의 속도를 제어하는데 사용될 수 있다. 중수소 이외의 동위원소, 예를 들어, 탄소 (예를 들어 13C), 질소, 산소, 황, 또는 인의 동위원소가 채용될 수 있다.
추가의 또 다른 예로서, 폴리머라제 반응의 동역학을 제어하는데 사용될 수 있는 첨가제는 유기 용매의 첨가를 포함한다. 용매 첨가제는 일반적으로 수용성 유기 용매이다. 용매는 모든 농도에서 가용성일 필요는 없지만, 일반적으로 폴리머라제 반응의 동역학을 제어하는데 사용되는 양에서 가용성이다. 이론에 구애되지는 않지만, 용매는 폴리머라제 반응에서 다양한 단계의 속도에 영향을 미칠 수 있는 폴리머라제 효소의 3차원 형태에 영향을 미칠 수 있는 것으로 믿어진다. 예를 들어, 용매는 형태적 변화를 수반하는 단계, 예컨대 이성질체화 단계에 영향을 미칠 수 있다. 첨가된 용매는 또한 전위 단계에 영향을 미치고, 일부 경우에 이를 감속시킬 수 있다. 일부 경우에, 용매는 수소 결합 상호작용에 영향을 미침으로써 작용한다.
뉴클레오티드 쇄 신장에서 폴리머라제 반응의 하나 이상의 단계의 속도를 제어하는데 사용될 수 있는 수 혼화성 유기 용매는, 예를 들어, 알콜, 아민, 아미드, 니트릴, 술폭시드, 에테르, 및 에스테르 및 이들 관능기 중 하나 초과를 갖는 소분자를 포함한다. 예시적인 용매는 알콜, 예컨대 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 글리세롤, 및 스몰 알콜을 포함한다. 알콜은 1, 2, 3개, 또는 그 초과의 알콜 기를 가질 수 있다. 예시적인 용매는 또한 소분자 에테르, 예컨대 테트라히드로푸란 (THF) 및 디옥산, 디메틸아세트아미드 (DMA), 디메틸술폭시드 (DMSO), 디메틸포름아미드 (DMF), 및 아세토니트릴을 포함한다.
수 혼화성 유기 용매는 폴리머라제 반응의 동역학을 제어하는데 충분한 임의의 양으로 존재할 수 있다. 용매는 일반적으로 용매 중량/중량 또는 부피/부피의 40% 미만의 양으로 첨가된다. 일부 실시양태에서 용매는 약 0.1% 내지 30%, 약 1% 내지 약 20%, 약 2% 내지 약 15%, 및 약 5% 내지 12%로 첨가된다. 동역학을 제어하기 위한 유효량은 본원에 기재된 방법 및 관련 기술분야에 공지된 것들에 의해 결정될 수 있다.
폴리머라제 반응 조건을 제어하는 또 다른 측면은 보조인자의 유형, 수준, 및 상대량의 선택과 관련된다. 예를 들어, 폴리머라제 반응의 과정 동안, 2가 금속 보조-인자, 예컨대 마그네슘 또는 망간은 효소-기질 복합체와 상호작용하여, 활성 부위의 한정에 있어서 구조적 역할을 할 것이다. 폴리머라제 반응에서의 금속 보조-인자 상호작용의 논의에 대해서는, 예를 들어, 문헌 [Arndt, et al., Biochemistry (2001) 40:5368-5375]을 참조한다. 적합한 조건은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 8,257,954에 기재된 것들을 포함한다.
본 발명 방법의 특정한 실시양태에서, 폴리머라제 반응의 속도 및 충실도는 폴리머라제가 기질 농도, 광학 여기의 양, 화학적 변형의 수준과 같은 파라미터의 관점에서 거의 이상적인 조건에서 작동하도록, dNTP 뉴클레오티드 유사체의 농도를 조정함으로써 제어된다. 따라서, 폴리머라제 효소는 그의 최대 핵산 쇄 신장-길이, 예를 들어, 자연 환경에서 달성되는 DNA 합성 길이와 유사한 대략 수 만개의 염기 쌍에 도달하는 것으로 본원에서 고려된다.
또 다른 실시양태에서, 상기 제시된 바와 같이, ATP 효소 (예를 들어, ATP 술푸릴라제) 및 폴리머라제 속도는 효소의 유형 및 공급원에 따라 유의하게 다양할 수 있기 때문에, 본원에서 채용되는 ATP 술푸릴라제 반응에 의한 ATP 생산의 속도는 반응 조건, 예컨대 ATP 술푸릴라제 농도를 조정함으로써 별개로 조정될 수 있다.
본 발명은 핵산의 샘플로부터 표적 핵산 서열을 검출하고/거나 정량화하기 위한 시스템을 포함한다. 시스템은 조사되고 있는 핵산 샘플 (예를 들어 세포 DNA, 순환 DNA 등) 내의 복수의 핵산 주형으로부터 하나 또는 복수의 표적 서열을 공동으로 검출하고/거나 정량화하는 것을 제공한다. 시스템은 본원에 기재된 모든 시약 및 방법을 포함할 수 있으며, 샘플을 함유하고, 발광 반응으로부터의 여기 광으로 샘플을 조명하고, 쇄 신장 동안 샘플로부터 방출된 광을 검출하여 각각의 dNTP가 그의 동종체 주형 핵산 상으로 폴리머라제에 의해 혼입됨에 따라 dNTP 또는 dNTP 유사체로부터 절단된 피로포스페이트 이탈기 (예를 들어, PPi)에 의해 검출된 발광으로부터의 강도 대 시간 데이터를 생성하며; 그에 의해 표적 핵산 서열의 존재를 검출하고/거나 정량화하기 위해 요구되는 기기를 제공한다.
본원에 사용된 어구 "광을 검출하는"은, 예를 들어, 루시페라제 반응으로부터 방출된 발광, 형광단으로부터 방출된 형광 등을 검출하기 위한 널리 공지된 방법을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "ATP 재생 효소/루시페라제 루프" 또는 그의 문법적 파생어 (예를 들어, ATP 술푸릴라제/루시페라제 루프, AGPPase/루시페라제 루프, PPDK/루시페라제 루프 등)는 일반적으로 ATP 재생 효소 및 루시페라제 사이의 효소적 루프를 지칭하며 (도 1A-1C 및 도 2 및 3), 이로써 루시페라제에 의해 촉매된 발광 반응 후 새로운 피로포스페이트 분자가 방출된다 (PPi) (도 1.C). 이 새롭게 방출된 PPi는 또 다시 ATP 재생 효소 (예를 들어, ATP 술푸릴라제, AGPPase, PPDK 등)에 대한 기질일 수 있으며, 그에 의해 ATP 재생 효소 (예를 들어, ATP 술푸릴라제, AGPPase, PPDK 등) 및 루시페라제 사이의 효소적 루프를 생성한다 (도 1B 및 1C). 도 1B-1C에 나타내어진 바와 같이, 이 루프 내에서 PPi는 ATP 술푸릴라제에 의해 리사이클링되고, ATP (ATP)로 전환되며, 이는 이어서 PPi를 다시 방출하면서, 루시페라제에 의해 촉매되어 검출가능한 발광 신호를 생성할 수 있다. 이는 피로포스페이트 이탈기로부터 연속적인 신호를 생성하며, 그에 의해 가장 최근의 뉴클레오티드의 효소적 혼입으로부터 생성된 루시페라제 신호에 대한 증폭 메커니즘으로서 역할을 할 것이다.
한 실시양태에서, 본원에서 제공된 표적 핵산 서열을 검출하기 위한 시스템은 일반적으로, 예를 들어, 고유한 액적 등 내에 하나 또는 복수의 단일 폴리머라제 효소, 복수의 샘플 핵산 주형, 및/또는 하나 또는 복수의 프라이머 (예를 들어, 프라이머-프로브)를 갖는 기질을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 이들 반응은 그들의 발광 신호가 유전자 합성이 일어남에 따라 각각의 핵산 표적 서열에 할당될 수 있도록 고유하게 구속된다. 본원에서 제공된 다른 실시양태에서 복수의 폴리머라제 효소는, 예를 들어, 고유한 구속, 액적 등 내의 조사되고 있는 샘플 핵산 주형 상의 단일 프라이머와 함께 사용된다. 쇄 신장 시약은 일반적으로 2가지 이상의 유형의 뉴클레오티드 유사체, 바람직하게는 dATP, dTTP, dAGP 및 dCTP에 상응하는 4가지 dNTP 또는 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 폴리머라제는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체를 프라이머로부터 연장되는 성장하는 가닥에 순차적으로 첨가한다. 각각의 첨가된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체는 생성되는 성장하는 가닥의 부분이 주형에 상보적이도록, 주형 핵산 상의 상응하는 염기에 상보적이다.
시스템은 도 1B-1C에 제시된 바와 같이 각각의 dNTP가 주형 가닥 내로 혼입되고 추가로 ATP 반응 (ATP-술푸릴라제를 통해) 및 발광 반응 (예를 들어, 반딧불이 루시페라제 + 루시페린)을 겪음에 따라 각각의 dNTP로부터 조명 신호를 제공하기 위한 발광 시약 (예를 들어, 반딧불이 루시페라제 및 루시페린)을 포함한다. 발광 반응은 검출가능한 조명 신호를 제공한다.
시스템은 주형 가닥에의 폴리머라제 효소 매개 첨가 동안 각각의 dNTP 혼입 사건에 상응하는 검출가능한 광 신호 (예를 들어, 발광 및/또는 형광)로부터의 신호를 관찰하기 위한 검출 광학장치를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 검출 광학장치는 복수의 단일 분자 폴리머라제 핵산 합성 반응을 공동으로 관찰하여, 본 발명 연결된 3 효소 (폴리머라제-ATP 술푸릴라제-루시페라제) 시스템에서 ATP를 형성하는데 사용되는 이탈기 (예를 들어, 피로포스페이트; PPi)를 통한 각각의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체 첨가의 발광 신호를 관찰한다. 각각의 관찰된 핵산 쇄 신장 반응에 대해, 검출 광학장치는 각각의 dNTP에 상응하는 각각의 발광 반응을 생성하는 각각의 PPi 이탈기로부터의 신호를 공동으로 관찰한다.
시스템은 또한 각각의 이탈기에 의해 생성된 발광 반응으로부터의 관찰된 신호를 검출하고/거나 정량화하도록 구성된 컴퓨터를 포함하며; 이로써 관찰된 신호는 조사되고 있는 특정한 핵산 서열의 존재를 검출하고/거나 정량화하는데 사용된다. 컴퓨터는 일반적으로 검출 광학장치로부터의 관찰된 신호에 관한 정보를 신호 데이터의 형태로 수신한다. 컴퓨터는 표적 핵산 서열의 존재를 검출하고/거나 정량화하기 위해 신호 데이터를 사용하여, 신호 데이터를 저장하고, 프로세싱하고, 해석한다.
본 발명과 함께 사용될 수 있는 광학 검출 시스템은, 예를 들어 미국 특허 8,802,424; 7,714,303; 및 7,820,983에 기재되어 있으며, 이의 각각은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 프로세스를 수행하는데 사용하기 위한 컴퓨터는 인텔 펜티엄(Intel Pentium) 또는 듀오코어(DuoCore) 프로세서를 실행하는 퍼스널 컴퓨터, 예컨대 PC 또는 매킨토시(Macintosh).RTM. 유형 컴퓨터로부터 UNIX, LINUX, 윈도우즈(Windows).RTM., 또는 다른 시스템을 실행하는 워크스테이션, 실험실 장비, 또는 고속 서버의 범위에 이를 수 있으며, 본 발명의 로직 프로세싱은 전적으로 소프트웨어 및/또는 펌웨어 로직 명령을 실행하는 일반 목적 로직 프로세서 (예컨대 CPU)에 의해; 또는 전적으로 또한 소프트웨어 또는 펌웨어 요소를 포함할 수 있는 실험실 또는 진단 시스템 또는 카메라 시스템 내로 혼입된 특수 목적 로직 프로세싱 회로 (예컨대 ASIC)에 의해; 또는 일반 목적 및 특수 목적 로직 회로의 조합에 의해 수행될 수 있다. 신호 데이터에 대한 데이터 포맷은 디지털 화상 기반 데이터 포맷, 예컨대 JPEG, GIF, BMP, TIFF, 또는 다른 핵산 검출 특이적 포맷을 포함하는 임의의 편리한 포맷을 포함할 수 있는 반면; 비디오 기반 포맷, 예컨대 avi, mpeg, mov, rmv, 또는 다른 비디오 포맷은 채용될 수 있다. 본 발명의 소프트웨어 프로세스는 일반적으로, 예를 들어, Matlab, C, C++, C#, NET, 비주얼 베이직(Visual Basic), 파이톤(Python), JAVA, CGI 등을 포함하는 다양한 프로그래밍 언어로 프로그래밍될 수 있다.
본 발명의 방법 및 시스템의 일부 실시양태에서, 광학 구속은 동시에 다수의 표적 주형 폴리머라제 쇄 신장 반응을 공동으로 관찰하는 능력을 증진시키는데 사용된다. 일반적으로, 광학 구속은 기재 상에 배치되고, 전자기 방사선을 제공하거나 이러한 방사선을 단지 매우 작은 공간 또는 부피로부터 유도하는데 사용된다. 이러한 광학 구속은 구조적 구속, 예를 들어, 웰, 리세스, 도관 등을 포함할 수 있거나, 이들은 검출을 제공하거나 방출된 방사선 (예를 들어, 발광 등)을 단지 매우 작은 부피로부터 유도하기 위한 다른 구성요소와 함께 광학 프로세스를 포함할 수 있다. 이러한 광학 구속의 예는, 예를 들어, 총 내부 반사 (TIR) 기반 광학 시스템을 이용하는 시스템을 포함하며, 이로써 광은 기재 내의 총 내부 반사를 산출하는 각도에서 기재의 투명 부분을 통해 지정된다.
특정한 실시양태에서, 바람직한 광학 구속은 본원에 제시된 바와 같은 표적 핵산 서열을 검출하기 위한 개별적 발명 핵산 쇄 신장 반응 혼합물을 함유할 수 있는 미세-액적 (예를 들어, 유중수 에멀젼 등)이다. 예를 들어, 핵산 쇄 신장 혼합물 반응 성분은 각각의 미세-액적이 효소의 하나의 폴리머라제-ATP 술푸릴라제-루시페라제 세트 및 관련된 시약 및 조사될 주형 핵산의 하나의 샘플을 함유하는 방식으로 분할될 수 있으며, 이로써 각각의 신호 검출 유닛은 단일 미세-액적 상에 포커싱된다. 각각의 미세-액적은 개별적 폴리머라제-ATP 술푸릴라제-루시페라제 3 효소-시스템 반응을 함유하는 단일 핵산 표적 검출 반응 셀임이 본원에서 고려된다. 미세-액적 반응 셀은 또한 유리하게는 각각의 신호 검출 유닛 상에 광을 포커싱하는 마이크로-렌즈로서 작용하는 본 발명 핵산 표적 서열 검출 방법에 유용하다.
본 발명의 기재는 일반적으로 단단하고, 종종 평면이지만, 둘 다일 필요는 없다. 기재가 광학 구속의 어레이를 포함하는 경우, 기재는 일반적으로 광학 기기와 인터페이싱하여 조명 및 광학 구속으로부터 광의 측정을 허용할 수 있는 크기 및 형상의 것일 것이다. 전형적으로, 기재는 또한 예를 들어 광학 측정을 위한 시약 및 기재 및/또는 반응 구성요소를 함유하는 액체 매질과 접촉하여 보유되도록 구성될 것이다.
기재가 광학 구속의 어레이를 포함하는 경우, 어레이는 기재의 표면 상에 광학 구속의 단일 열 또는 복수의 열을 포함할 수 있고, 여기서 복수의 레인이 존재하는 경우, 레인의 수는 통상적으로 적어도 2개, 보다 통상적으로 10개 초과, 및 보다 통상적으로 100개 초과일 것이다. 광학 구속의 대상 어레이는 기재의 x-축 또는 y-축을 수평으로 또는 대각선으로 길게 정렬할 수 있다. 개별적 구속은 기재의 표면에 걸쳐 또는 그 위에 임의의 형식으로, 예컨대 격자를 형성하도록 열 및 행으로, 또는 원형, 타원형, 계란형, 원뿔형, 직사각형, 삼각형, 또는 다면체 패턴을 형성하도록 어레이될 수 있다. 인접한 광학 구속 사이의 최근린 거리를 최소화하기 위해, 6각형 어레이가 때때로 바람직하다.
광학 구속의 어레이는 분석의 용이성, 고 처리량, 또는 다른 이점을 제공하는 구조 내로, 예컨대 미세역가 플레이트 등에 혼입될 수 있다. 이러한 설정은 또한 본원에서 "어레이의 어레이"로 지칭된다. 예를 들어, 대상 어레이는 또 다른 어레이, 예컨대 미세역가 플레이트 내로 혼입될 수 있고, 여기서 플레이트의 각각의 마이크로 웰은 광학 구속의 대상 어레이를 함유한다.
본 발명에 따르면, 구속의 어레이 (예를 들어, 반응 셀, 미세-액적 등)는 단일 기재 상에 100개 초과, 1000개 초과, 10,000개 초과, 100,000개 초과, 또는 1,000,000개 초과의 별개의 반응 셀 (예컨대 미세-액적 등)의 어레이로 제공된다. 또한, 반응 셀 어레이는 전형적으로 기재의 표면 상에 상대적으로 높은 밀도로 포함된다. 이러한 높은 밀도는 전형적으로 기재 표면적의 mm2당 10개 초과의 반응 셀, 바람직하게는, mm2당 100개 초과의 반응 셀, 및 보다 바람직하게는, mm2당 500개 또는 심지어 1000개 초과의 반응 셀, 및 많은 경우에 mm2당 100,000개 이하 또는 그 초과의 반응 셀의 밀도로 존재하는 반응 셀을 포함한다. 많은 경우에, 어레이 중의 반응 셀은 규칙적 패턴으로, 예를 들어, 주어진 어레이에서 규칙적으로 간격화된 반응 셀의 2, 5, 10, 25, 50 또는 100개 또는 그 초과의 열 및/또는 행으로 간격화되지만, 특정의 바람직한 경우에, 표준 열 및/또는 행 형식으로부터 벗어나는 어레이에 반응 셀의 조직을 제공하는 이점이 있다. 바람직한 측면에서, 기재는 기재 상의 별개의 쇄 신장 반응 영역을 한정하는 광학 구속으로서 특정한 반응 셀 미세-액적으로서 포함한다.
광학 구속의 어레이의 전체 크기는 일반적으로 수 나노미터 내지 수 밀리미터의 두께, 및 수 밀리미터 내지 50 센티미터의 폭 및/또는 길이의 범위일 수 있다. 어레이는 약 수백 마이크로미터 내지 수 밀리미터의 두께의 전체 크기를 가질 수 있으며, 목적하는 광학 구속의 수에 따라 임의의 폭 또는 길이를 가질 수 있다.
개별적 구속 사이의 간격은 대상 어레이가 채용되는 특정한 적용을 지지하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 의도된 적용이 광학 구속으로부터의 입사 파장의 회절 산란의 낮은 수준을 갖지 않는 또는 갖는 어레이의 암-시야 조명을 요구하는 경우, 개별적 구속은 입사 파장에 비해 서로에 가깝게 놓일 수 있다.
어레이에서의 개별적 구속은 약 1000 젭토리터 미만, 약 900 미만, 약 200 미만, 약 80 미만, 약 10 젭토리터 미만의 유효 관찰 부피를 제공할 수 있다. 목적하는 경우, 1 젭토리터 미만의 유효 관찰 부피가 제공될 수 있다. 바람직한 측면에서, 개별적 구속은 생리학적으로 관련된 농도에 또는 부근에 존재하는 개별적 분자, 예컨대 효소의 분해를 허용하는 유효 관찰 부피를 산출한다. 많은 생화학적 반응을 위한 생리학적으로 관련된 농도는 마이크로-몰 내지 밀리몰의 범위인데, 이는 대부분의 효소가 이들 범위에서 그들의 미카엘리스 상수를 갖기 때문이다. 따라서, 광학 구속의 바람직한 어레이는 약 1 마이크로몰 (uM) 초과, 또는 보다 바람직하게는 50 uM 초과, 또는 심지어 100 uM 초과의 농도로 존재하는 개별적 분자를 검출하기 위한 유효 관찰 부피를 갖는다. 특정한 실시양태에서, 전형적인 미세액적 크기는 10 마이크로미터 내지 200 마이크로미터의 범위이며, 따라서 전형적인 미세액적 부피는 대략 5 피코리터 내지 20 나노리터이다.
광학 구속 내의 화학적 또는 생화학적 분석의 맥락에서, 일반적으로 관심의 반응은 구속의 광학적으로 조사되는 부분 내에서, 최소로, 및 바람직하게는 쇄 신장 반응의 유일한 반응이 개별적 구속의 조사되는 부분 내에서 (예를 들어, 미세-액적 내에서 등) 일어나고 있도록 일어나는 것을 보장하는 것이 바람직하다. 관련 기술분야에 널리 공지된 다수의 방법은 일반적으로 관찰 부피 내에서 개별적 분자를 제공하는데 사용될 수 있다. 그 중에서도, 대략 1, 2, 3개, 또는 일부 다른 선택 수의 분자가 주어진 관찰 부피 내에 해당하는 것으로 예상될 것이도록, 이들의 다양한 것은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 7,763,423에 기재되어 있으며, 이는 목적하는 밀도에서 표면에 개별적 분자를 고정화하도록 디자인된 변형된 표면을 기재한다. 전형적으로, 이러한 방법은 표면 상의 이러한 기의 희석 또는 관심의 분자와 상호작용하는 중간체 또는 최종 커플링 기의 희석, 또는 이들의 조합을 통해, 표면 상의 커플링 기의 상대적으로 낮은 밀도를 제공하는 희석 기술을 이용한다. 또한, 예컨대 광학 구속을 위해 본원에서 고려되는 미세-액적 반응 셀에서 일어날, 표면에 고정화되지 않고 주어진 관찰 부피 내에 해당하는 1, 2, 3개 또는 일부 다른 선택 수의 LACES 쇄 신장 반응을 제공하기 위한 이들 희석 기술의 사용이 본원에서 고려된다. 특정한 실시양태에서, 본 발명 LACES 쇄 신장 방법에 사용하기 위한 미세-액적에서 단일 발명 방법 쇄 신장 반응을 제공하는 희석 기술이 이용된다.
본 발명의 시스템 및 방법은 관련 기술분야에 널리 공지된 시스템을 사용하여 본원에 제시된 3 효소 pol-ATP 술푸릴라제-루시페라제를 겪은 후의 뉴클레오티드 유사체의 PPi 이탈기 (예를 들어, 폴리포스페이트; PPi)로부터의 신호를 모니터링함으로써 개선된 표적 핵산 서열 결정을 발생시킬 수 있다. 일반적으로, 신호 데이터는 프로세서에 의해 수신된다. 프로세서에 의해 수신된 정보는 검출 광학장치로부터 직접적으로 올 수 있거나, 검출 광학장치로부터의 신호는 프로세서에 의해 수신되기 전에 다른 프로세서에 의해 처리될 수 있다. 다수의 초기 보정 작동이 적용될 수 있다. 이들 초기 보정 단계의 일부는 실행의 시작에서 단지 1회 또는 실행 동안 보다 많은 연속적 기초로 수행될 수 있다. 이들 초기 보정 단계는 중심 결정, 정렬, 그리딩, 드리프트 교정, 초기 배경 차감, 잡음 파라미터 조정, 프레임-속도 조정 등과 같은 것들을 포함할 수 있다. 이들 초기 보정 단계의 일부, 예컨대 비닝은 하기에 추가로 논의되는 바와 같이, 프로세서로부터 다시 검출기/카메라로의 통신을 수반할 수 있다.
일반적으로, 스펙트럼 트레이스 결정, 스펙트럼 트레이스 추출, 또는 스펙트럼 필터의 일부 유형은 초기 신호 데이터에 적용된다. 이들 여과 단계의 일부 또는 전부는 임의로 프로세스의 나중 시점에서, 예를 들어, 펄스 확인 단계 후에 수행될 수 있다. 스펙트럼 트레이스 추출/스펙트럼 필터는 다수의 잡음 감소 및 관련 기술분야에 널리 공지된 바와 같은 다른 필터를 포함할 수 있다. 스펙트럼 트레이스 결정은 본원에서 논의된 많은 예시 시스템에 대해 이 단계에서 수행되는데, 이는 수신된 초기 신호 데이터가 일련의 인접한 픽셀 검출기에 의해 포획된 광 수준, 또는 광자 카운트이기 때문이다. 예를 들어, 한 예시 시스템에서, 위치로부터의 픽셀 (또는 강도 수준)은 각각의 프레임에서 개별적 도파관에 대해 포획된다. 상이한 주파수 또는 스펙트럼의 광은 위치 중 하나 초과 상에 떨어질 것이고, 일반적으로 일부 중첩 및 가능하게는 실질적 중첩이 있다. 본 발명의 구체적인 실시양태에 따르면, 스펙트럼 트레이스 추출은 각각의 스펙트럼 트레이스에 대한 가장 높은 신호-대-잡음 비를 제공하는, 하기 논의되는 바와 같은 다양한 유형의 분석을 사용하여 수행될 수 있다.
스펙트럼 트레이스 결정에 대한 대안으로서, 본 발명의 방법은 또한 다수의 픽셀 위치에서 강도 수준으로부터 유래된 단일 신호를 분석할 수 있다 (이는 합계 스펙트럼 신호 또는 그레이-스케일 스펙트럼 신호 또는 강도 수준 신호로 지칭될 수 있음). 많은 상황에서, 그러나, 추출된 스펙트럼 트레이스가 펄스에 대해 다소 별개로 분석되는 경우 스펙트럼 추출은 보다 양호한 SNR (신호 대 잡음 비), 따라서 펄스 검출을 제공하는 것으로 밝혀졌다. 추가의 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 통계적 모델, 예컨대 히든 마르코프(Hidden Markov) 모델을 사용하여 다수의 포획된 픽셀 데이터를 분석할 수 있다.
ATP-재생-효소/루시페라제 증폭 루프 반응에 들어가는 이탈기 (예를 들어, 피로포스페이트; PPi)로부터의 발광 신호가 유의한 신호 펄스 또는 사건으로서 범주화될 수 있는지 여부가 결정된다. 일부 예시 시스템에서, 검출에 이용가능한 소수의 광자 때문에 및 검출의 속도 때문에, 다양한 통계적 분석 기술은 유의한 펄스가 검출되었는지 여부를 결정하는데 있어서 수행될 수 있다.
신호가 유의한 펄스 또는 신호 사건으로서 확인되는 경우, 추가의 임의적 스펙트럼 프로파일 비교가 스펙트럼 할당을 확인하기 위해 수행될 수 있다. 이 스펙트럼 프로파일 비교는 스펙트럼 트레이스가 펄스 확인 전에 또는 동안 결정되는 실시양태에서 임의적이다. 이 결정을 하기 위해, 이탈기 (예를 들어, 피로포스페이트; PPi)에 상응하는 채널로부터 오는 신호는 발광 신호로부터의 펄스가 혼입 사건에 상응하는지 여부를 평가하는데 사용된다.
상기 언급된 바와 같이, 신호 데이터는 프로세싱 시스템, 예를 들어, 적절하게 프로그래밍된 컴퓨터 또는 다른 프로세서 내로 입력된다. 신호 데이터는, 예를 들어, 실시간 신호 프로세싱을 위해 검출 시스템으로부터 직접적으로 입력될 수 있거나, 이는 신호 데이터 저장 파일 또는 데이터베이스로부터 입력될 수 있다. 일부 경우에, 예를 들어, 검출 시스템의 성능에 대한 즉각적 피드백을 추구하여, 검출 또는 다른 실험 파라미터를 조정하는 것을 추구하는 경우, 실시간 신호 프로세싱이 채용될 것이다. 일부 실시양태에서, 신호 데이터는 검출 시스템으로부터 적절한 파일 또는 데이터베이스에 저장되고, 반응 후에 또는 비-실시간 방식으로 프로세싱으로 처리된다.
본 발명과 함께 사용되는 신호 데이터는 다양한 형태일 수 있다. 예를 들어, 데이터는 주어진 검출기 또는 어레이 기반 검출기의 검출 지점에서 수신된 광학 신호에 대한 강도 값을 나타내는 수치 데이터일 수 있다. 신호 데이터는 화상화 검출기, 예컨대 CCD, EMCCD, ICCD 또는 CMOS 센서로부터의 화상 데이터를 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 단일 분자로부터 낮은 수의 광자를 검출하기 위해, 광전 증배관 (PMT) 및/또는 광자 카운터 유닛의 사용은 본 발명 방법에 사용하기 위해 고려된다. 어느 경우에도, 본 발명의 구체적인 실시양태에 따라 사용되는 신호 데이터는 일반적으로 강도 수준 정보 및 스펙트럼 정보 둘 다를 포함한다. 별개의 검출기 요소의 맥락에서, 이러한 스펙트럼 정보는 일반적으로 강도가 검출되는 검출기 부분 (예를 들어, 픽셀)의 장소 또는 위치의 확인을 포함할 것이다. 화상 데이터의 맥락에서, 스펙트럼 화상 데이터는 전형적으로 시스템이 전체 신호의 스펙트럼 분해를 포함하는 경우 화상화 시스템 및 검출기에 대한 보정된 스펙트럼 화상 데이터와 상관되는 화상 데이터로부터 유래된 데이터일 것이다. 스펙트럼 데이터는 검출기로부터 추출된 화상 데이터로부터 얻어질 수 있거나, 대안적으로, 스펙트럼 데이터의 유도는 스펙트럼 데이터가 검출기로부터 추출될 것이도록 검출기 상에서 일어날 수 있다.
상기 기재된 표적 핵산 서열 검출 방법에 대해, 혼입 사건으로부터의 신호의 결과가 아닌 검출 시스템에 의해 검출되는 특정 양의 광학 신호가 있을 수 있다. 이러한 신호는 시스템에서 "잡음"을 나타낼 것이고, 모니터링된 반응에 대해 내부, 검출 시스템에 대해 내부 및/또는 상기 모두에 대해 외부일 수 있는 다수의 공급원으로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 실시는 유리하게는 종래 기술 방법에 전형적으로 존재하는 잡음의 이들 전체 공급원을 감소시킨다.
검출 시스템에 대해 내부의, 그러나 반응 혼합물의 외부의 잡음의 공급원은, 예를 들어, 필터링 광학장치를 통해 흘리는 반사된 여기 방사선; 기재 또는 임의의 광학 구성요소로부터의 산란된 여기 또는 형광 방사선; 인접한 신호 공급원의 공간적 혼선; 시스템의 임의의 또는 모든 광학 구성요소의 자가-형광; 검출기, 예를 들어, CCD로부터의 판독 잡음, 예를 들어, EMCCD 카메라에 대한 게인 레지스터 잡음 등을 포함할 수 있다. 다른 시스템 유래 잡음 기여는 데이터 프로세싱 문제, 예컨대 배경 교정 오류, 포커스 드리프트 오류, 오토포커스 오류, 펄스 주파수 분해, 정렬 오류 등으로부터 올 수 있다. 추가의 다른 잡음 기여는 주위 광 간섭, 더스트 등을 포함하는 전체 시스템의 외부의 공급원으로부터 유래될 수 있다.
이들 잡음 구성요소는 혼입 사건과 연관될 수 있는 임의의 신호 펄스의 기저에 있는 배경 광자에 기여한다. 따라서, 잡음 수준은 전형적으로 임의의 신호 펄스가 통계적으로 유의한 것으로 결정될 수 있는 한계를 형성할 것이다.
전체 신호 데이터에 대한 잡음 기여의 확인은, 예를 들어, 임의의 신호 데이터가 무관한 것으로 결정되는 경우 관심의 반응의 부재 하에서의 신호 모니터링을 포함하는 관련 기술분야에 널리 공지된 다수의 방법에 의해 수행될 수 있다. 대안적으로, 및 바람직하게는, 잡음 측정이 관심의 반응에 대한 측정 시 및 그와 동시발생적으로 이루어지도록, 기준선 신호가 추정되고, 시스템에 의해 생성된 신호 데이터로부터 차감된다. 기준선의 생성 및 적용은 하기에 보다 상세하게 기재되는 다수의 수단에 의해 수행될 수 있다.
본 발명에 따르면, 신호 프로세싱 방법은 모든 비-유의한 펄스-기반 신호 사건, 및 합리적인 정도의 신뢰도로, 혼입 사건과 연관되는 것으로 간주될 수 있고, 따라서 혼입 사건으로서 시험적으로 확인될 수 있는 유의한 신호 펄스에 폭넓게 적용되는 바와 같이, 잡음 사이를 구별한다. 본 발명의 맥락에서, 신호 사건은 먼저 이러한 신호 사건이 임의의 다수의 상이한 펄스 기준을 충족시키는지 여부에 기반하여 그것이 유의한 신호 펄스를 구성하는지 여부에 대해 분류된다. 유의한 펄스로서 확인되거나 분류되면, 신호 펄스는 신호 펄스가 혼입 사건을 구성하는지 여부를 결정하기 위해 추가로 평가될 수 있다. 인정될 것인 바와 같이, 특정한 신호 사건을 유의한 펄스로, 및 궁극적으로 혼입 사건으로 지칭하기 위한 기초는 일반적으로 본원에 제시된 바와 같은 다양한 파라미터에 기반하여, 특정 양의 오류로 처리될 것이다. 한 이러한 신호 펄스 기준은 신호 사건을 유의한 신호 펄스로서 분류할 수 있는 신뢰도의 척도 또는 통계적 유의성을 제공하는 해당 신호 사건과 연관된 신호 대 모든 배경 잡음의 수준의 비 ("신호 대 잡음 비" 또는 "SNR")이다. 유의한 펄스 신호를 체계적인 또는 다른 잡음 구성요소로부터 구별하는데 있어서, 신호는 일반적으로, 예를 들어, 신호 강도, 신호 지속기간, 시간적 신호 펄스 형상, 펄스 간격, 및 펄스 스펙트럼 특징을 포함하는 다수의 계량치 중 하나 이상에서 신호 역치 수준을 초과해야 한다.
단순화된 예로서, 신호 데이터는 프로세싱 시스템 내로 입력될 수 있다. 신호 데이터가 신호 강도 및 신호 지속기간 중 하나 이상에서 신호 역치 값을 초과하는 경우, 이는 유의한 펄스 신호로 간주될 수 있다. 유사하게, 추가의 계량치가 역치로서 채용되는 경우, 신호는 특정한 신호 사건을 유의한 펄스로서 확인하는데 있어서 이러한 계량치에 대해 비교될 수 있다. 인정될 것인 바와 같이, 이 비교는 전형적으로 유의한 펄스를 확인하는데 있어서 상기 계량치 중 적어도 하나, 및 바람직하게는 적어도 2개의 이러한 역치, 및 많은 경우에 상기 역치 중 3개 또는 모든 4개를 수반할 것이다.
신호 강도, 신호 지속기간, 펄스 형상, 간격 또는 펄스 스펙트럼 특징, 또는 이들의 조합의 관점에서 신호 역치 값은 일반적으로 사전 실험 데이터로부터의 예상된 신호 프로파일에 기반하여 결정될 것이지만, 일부 경우에, 이러한 역치는 전체 신호 데이터의 백분율로부터 확인될 수 있으며, 여기서 통계적 평가는 이러한 역치화가 적절함을 지시한다. 특히, 일부 경우에, 역치 신호 강도 및/또는 신호 지속기간은 전체 신호 데이터의 특정 분율 또는 백분율을 제외한 전부를 배제하도록 설정되어, 역치의 실시간 설정을 허용할 수 있다. 다시, 그러나, 백분율 또는 절대 신호 값의 관점에서, 역치 수준의 확인은 일반적으로 이전의 실험 결과와 상관될 것이다. 대안적인 측면에서, 신호 역치는 주어진 평가의 맥락에서 결정될 수 있다. 특히, 예를 들어, 펄스 강도 역치는 절대 신호 강도에 기반할 수 있지만, 이러한 역치는, 예를 들어, 사용되는 역치에 영향을 미칠 수 있는 시약 확산을 통해, 특히 신호가 배경 수준에 비해 상대적으로 약한 경우, 신호 배경 수준의 변동을 고려하지 않을 것이다.
혼입 사건의 실시간 검출에 의존하는 특히 바람직한 측면에서, 유의한 신호 펄스의 확인은 신호 강도 및 신호 지속기간 둘 다에서 역치를 횡단하는 신호 프로파일에 의존할 수 있다. 예를 들어, 증가하는 방향에서 보다 낮은 강도 역치를 교차하는 신호가 검출되는 경우, 검출 요소, 예를 들어, 픽셀의 동일한 세트로부터의 뒤이은 신호 데이터는 신호 강도가 감소하는 방향에서 동일한 또는 상이한 강도 역치를 교차할 때까지 모니터링된다. 적절한 강도의 피크가 검출되면, 그것이 강도 역치 또는 역치들을 초과하는 기간의 지속기간은 지속기간 역치에 대해 비교된다. 피크가 충분한 지속기간의 충분하게 강한 신호를 포함하는 경우, 이는 유의한 신호 펄스로 지칭된다.
강도 및 지속기간 역치를 사용하는 것에 추가로, 또는 그에 대한 대안으로서, 펄스 분류는 펄스를 유의한 것으로서 분류하는데 있어서 다수의 다른 신호 파라미터를 채용할 수 있다. 이러한 신호 파라미터는, 예를 들어, 펄스 형상, 신호의 스펙트럼 프로파일, 예를 들어, 펄스 스펙트럼 중심, 펄스 높이, 펄스 확산 비, 펄스 간격, 총 신호 수준 등을 포함한다.
유의한 신호 펄스의 확인 후에 또는 전에, 신호 데이터는 특정한 신호 유형에 상관될 수 있다. 본 발명과 함께 사용되는 광학 검출 스킴의 맥락에서, 이는 전형적으로 신호 데이터를 발생시키는 신호의 특정한 스펙트럼 프로파일을 나타낸다.
전기적 변조에 의한 표적 풍부화 (TEEM)
또한, 하기 단계를 포함하는, 핵산-함유 샘플로부터 표적-핵산을 풍부화하거나 단리하는 방법이 본원에서 제공된다:
a. 제1 및 제2 전극을 갖는 유체 챔버에 이온을 포함하는 전해 유체 용액 및 핵산-함유 샘플을 수용하는 단계로서, 여기서 적어도 하나의 전극은 표적-핵산에 상보적인 복수의 포획-프로브가 그에 부착되어 있으며 (도 13-19에 도시됨), 여기서 포획-프로브는 전극-용액 계면에 있는 것인 단계;
b. 어닐링-전압을 전극-용액 계면에 근접하여 전해 유체에 인가하여 전극-용액 계면에 의한 어닐링-pH 수준을 생성하는 단계로서 (도 19의 사이클 X, Y 및 Z, 상부 패널), 여기서 어닐링-pH 수준은 핵산-함유 샘플 내의 핵산 및 포획-프로브 사이의 임의의 수의 상보적 염기 쌍의 어닐링을 유발하는 것인 단계;
c. 변성-전압을 전극-용액 계면에 근접하여 전해 유체에 인가하여 전극-표면 계면에 의한 변성-pH 수준을 생성하는 단계로서 (도 19의 사이클 X, Y 및 Z, 하부 패널), 여기서 변성-pH 수준은 이중-가닥 포획-프로브의 전장보다 더 짧은 특정한 수의 염기 쌍 또는 그보다 더 짧은 특정한 범위의 염기 쌍 중 어느 하나인 포획 프로브 및 표적-핵산의 혼성화된 쌍을 포함하는 이중-가닥 핵산의 변성을 유발하는 것인 단계; 및
d. 어닐링-전압 및 변성-전압 사이의 전압을 변조하는 단계로서, 여기서 상응하는 pH 수준의 최종 적용 (예를 들어, 어닐링 또는 변성) 후, 표적-핵산은 전극 상의 포획-프로브에 결합되어 잔류함으로써 핵산-함유 샘플로부터 풍부화되거나 단리되는 것인 단계 (도 19의 사이클 Z, 하부 패널).
용액 중의 핵산 (RNA 및 DNA)의 결합 동역학에 직접적으로 영향을 미치는 2가지 주요한 인자가 있다: 온도 및 pH. 종래 기술에서 지금까지는, 온도는 게노믹스에 이용되는 유일한 인자였다. 본 발명에 따르면, 본 발명 TEEM 방법은 통상적인 종래 기술 온도-기반 접근법을 전기장 및 용액 중의 이온의 이동으로 대체한다. 이는 유리하게는 게노믹스 검정에서 핵산 취급의 기간을 몇 자릿수 감소시키는데 있어서 약진을 제공한다.
본원에 사용된 어구 "핵산-함유 샘플로부터 풍부화되거나 단리된"은 핵산-함유 샘플에서 다른 핵산으로부터 목적하는 표적-핵산의 물리적 분리를 지칭한다 (예를 들어, 도 19의 사이클 Z, 하부 패널 등 참조). 처음으로, DNA 혼성화 및 변성의 전기적 조작은 핵산-함유 샘플에서 다른 핵산으로부터 표적-핵산을 풍부화하고/거나, 단리하고/거나, 분리하는데 이용된다. 본 발명에 따르면, 전압, 전기장 및 상응하는 pH 수준의 변조는 샘플 내의 비-표적 핵산이 임의의 검출 분석이 수행되기 전에 세척 제거되는 것을 허용하면서, 목적하는 표적-핵산의 정확한 포획을 허용한다.
본 발명 TEEM 방법은 전기 이중 층의 고유한 조작을 이용하여 용액에서의 정확한 지점에서 정확한 pH 수준을 생성한다. 예를 들어, 전극이 고체 또는 액체 이온성 도체 (전해질)와 접촉되고, 전기 포텐셜이 전극에 인가되는 경우, 카운터이온은 전극을 향해 이동하는 반면, 공동-이온은 표면으로부터 반발된다 (도 18 참조). 이는 전극-용액 계면에서 이온 분포, 및 따라서 pH 분포 또는 구배 (도 18에서 박스친 녹색 음영화된 영역 표지된 pH 구배; 및 도 19의 사이클 X 패널에서 박스친 음영화된 영역 참조)를 생성한다. 이는 용액에서의 정확한 지점에서 정확한 pH 수준의 생성을 허용하고, 따라서 매우 특이적 수의 핵산 염기 쌍의 혼성화 (즉, 어닐링; 및 도 19의 사이클 X 상부 패널의 녹색 음영화된 박스친 영역) 또는 변성 도 19의 사이클 X 하부 패널의 청색 음영화된 박스친 영역)을 유발한다. 이러한 정확한 제어는 온도로는 가능하지 않다.
본원에 제시된 바와 같이, 양전하 분포 (전해 유체의 양이온)는 음으로 하전된 전극에서 최대이며, 양전하는 전극에서 적용된 음전하로부터 공간 차원 상에 떨어진 거리가 증가함에 따라 감소한다. 또한 예를 들어, 양전하 분포는 음으로 하전된 전극에서 전기적 이중 층을 형성하는 히드로늄 (H3O+) 이온, 및 일부 예에서 마그네슘 (Mg2+) 이온의 축적에 의해 형성되며, 그에 의해 음으로 하전된 전극에 근접하는 이중 층의 영역에서 산성 pH 환경을 생성할 수 있다. 마찬가지로, 음전하 분포는 양으로 하전된 전극에서 전기적 이중 층을 형성하는 히드록실 (OH-) 이온의 축적에 의해 형성되며, 그에 의해 양으로 하전된 전극에 근접하는 이중 층의 영역에서 염기성 pH 환경을 생성할 수 있다.
본원에서 제공된 본 발명 TEEM 핵산 풍부화 방법은 전기장을 변조하는 것을 통해 용액 중의 이온 분포를 변조하는 것을 포함하고, 여기서 사이클을 완결하는 시간은, 예를 들어, 전도도, 이온 확산 속도, 이온의 전하 및 인가된 전압에 따라, 마이크로초 정도 내지 다른 초 미만의 지속기간일 수 있다. 본 발명에 따르면, 인가된 순전하는 이온 전하 분포 (즉, pH 수준)가 마찬가지로 변조되거나 변경되도록 변조되거나 변경된다 (예를 들어, 전극에 인가된 순 음전하 및 순 양전하 둘 다를 변조함).
본 발명 TEEM 방법은 pH 분포가 인가된 전압/전기장을 변조함으로써 조작되는 활성 "이중 층" 영역에서의 계면에 있는 표면 부착된 포획-프로브를 이용한다 (도 13-16). 샘플 내의 모든 핵산은 브라운 운동을 통해 유체 챔버의 이중-층 영역으로 주기적으로 들어간다. 활성 이중 층 영역에서 생성된 적어도 2가지 pH 분포가 있다; 어닐링-pH 수준 (도 19의 사이클 X, Y 및 Z, 상부 패널) 및 변성-pH 수준 (도 19의 사이클 X, Y 및 Z, 하부 패널). 특정한 실시양태에서, 어닐링-pH 수준은 임의의 수의 상보적 염기 쌍의 혼성화를 가능하게 한다. 반면, 변성-pH 수준은 역치보다 더 낮은 상보적 염기 쌍의 수를 변성시키면서, 특정한 역치 수 (또는 범위)에 걸쳐 단지 염기 쌍의 수 (또는 범위)가 혼성화하거나 혼성화되어 잔류하는 것을 가능하게 한다. 특정한 주파수에서 인가된 전기장을 변조함으로써, 및 따라서 변성-pH 수준 및 어닐링-pH 수준 사이의 pH 수준을 변조함으로써, 정확하게 제어된 각각의 pH-수준 (어닐링-pH 수준 또는 변성-pH 수준 중 어느 하나)을 갖는 이중-층 영역으로 들어간 표적-핵산은 포획-프로브에 결합하고 그에 결합되어 잔류하는 반면, 비목적하는 핵산 (예를 들어, 비-표적 핵산)은 포획-프로브에 결합하지 않거나, 그로부터 변성된다. 한 실시양태에서, 각각의 사이클은 약 1초 (예를 들어, 1 kH)가 걸리며, 총 풍부화, 단리 및/또는 분리 프로세스는 약 50 사이클에 완결된다.
본 발명 TEEM 방법의 이점은 그것이 표적-핵산에 결합하는 비-특이적 프라이머를 비존재하거나, 없거나, 무시가능하게 만든다는 것이다. 이는 결국 유리하게는 특히 본원에서 제공된 표적-핵산을 검출하기 위한 본 발명 LACES 방법과 조합으로 사용되는 경우, 본 발명 표적-핵산 검출 방법에서 배경 잡음이 거의 없거나 내지 전혀 없게 한다. 본 발명 TEEM 방법에 의해 제공되는 또 다른 이점은 완벽한 표적-핵산 (예를 들어, SARS-COV2 등) 혼성화가 달성된 독립적인 신호에 대한 요구가 없다는 것이다. 표적-핵산이 풍부화되거나 단리되면, 이는 관련 기술분야에 공지된 임의의 수단에 의해; 또는 본원에서 제공된 본 발명 LACES 방법에 의해 검출될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 표적 핵산이 포획-프로브 (또한 본원에서 포획-프라이머 프로브로 지칭됨)에 결합되지 않은 물질로부터 풍부화되고/거나 단리된 후, 핵산-함유 샘플은 검출 전에 세척 제거된다.
본 발명 TEEM 방법을 사용하여 표적-핵을 풍부화하거나 단리하는 맥락에서 본원에 사용된 어구 "표적-핵산이 검출된다"는 특정한 핵산의 존재를 검출하기 위해 임의의 널리 공지된 기술을 채용하는 것을 지칭한다. 표적-뉴클레오티드의 포획 후, 표적-핵산의 존재를 검출하기 위한 예시적인 방법은 LACES, 직접 검출, PCR (5'-뉴클레아제 실시간 PCR), 롤링 서클 증폭, 라이게이션 및 PCR의 조합, 및 증폭에 이어서 검출 단계, 표지된 프로브, 개재 형광 염료 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법을 포함한다.
표적-핵산을 검출하기 위한 다른 적합한 검출 시스템은 스캐닝 전자 현미경검사, 근거리 필드 스캐닝 광학 현미경검사 (NSOM), 총 내부 반사 형광 현미경검사 (TIRFM) 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 참조로 포함되는 하기 참고문헌에 의해 입증된 바와 같이, 표면 상의 나노스케일 구조를 분석하고 검출하기 위해 이러한 기술을 적용하기 위한 지침은 문헌에서 발견된다: Reimer et al., editors, Scanning Electron Microscopy: Physics of Image Formation and Microanalysis, 2nd Edition (Springer, 1998); Nie et al., Anal. Chem., 78: 1528-1534 (2006); Hecht et al., Journal Chemical Physics, 112: 7761-7774 (2000); Zhu et al., editors, Near-Field Optics: Principles and Applications (World Scientific Publishing, Singapore, 1999); 드르마나크(Drmanac), 국제 특허 공개 WO 2004/076683; Lehr et al., Anal. Chem., 75: 2414-2420 (2003); Neuschafer et al., Biosensors & Bioelectronics, 18: 489-497 (2003); 뉴스카퍼(Neuschafer) 등, 미국 특허 번호 6,289,144; 등. 특히 흥미로운 것은, 예를 들어, 뉴스카퍼 등, 미국 특허 번호 6,289,144; 및 드르마나크, 국제 특허 공개 WO 2004/076683에 개시된 바와 같은 TIRFM이다.
특정한 실시양태에서, 표적-핵산을 검출하기 위해 본 발명 방법을 채용하는 사용하기 위한 본 발명 장치 기기 (예를 들어, 도 20에 나타내어진 단일-사용-카트리지)는 3가지 기본적 구성요소를 포함한다: (i) 샘플, 검출 및 프로세싱 시약, 예를 들어 프로브, 세척 용액 등을 저장하고 이를 어레이에 전달하기 위한 유체공학 시스템; (ii) 어레이를 보유하거나 포함하고, 유통 및 전기 포텐셜 (전압) 제어 능력을 갖는 반응 유체 챔버, 또는 유동 셀; 및 (iii) 조명 및 검출 시스템 (예를 들어, 도 20에 나타내어진 휴대용 장치와 조합으로 단일-사용-카트리지). 한 실시양태에서, 유체 챔버 또는 유동 셀은 전압을 변조하는 능력을 갖는 전압 제어 서브시스템을 갖는다.
본원에 사용된 어구 "핵산-함유 샘플"은 그 안에 핵산을 함유하는 임의의 물리적 물질일 수 있다. 예시적인 핵산-함유 샘플은 세포, 타액, 소변, 혈액, 모발, 정액, 타액, 골, 조직, 치아, 세포-용해물, 바이러스, 세포-DNA, 게놈 DNA 등을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 핵산-함유 샘플은 유전영동에 의해 단리되거나 얻어질 수 있다. 예를 들어, 세포 DNA, 게놈 DNA, 바이러스 핵산 또는 총-핵산은 세포-용해물의 유전영동에 의해 단리되거나 얻어질 수 있다.
본 발명 방법은 유체 챔버에 전해 유체를 수용하는 단계를 포함한다. 본원에 사용된 어구 "유체 챔버"는 본원에 기재된 임의의 용액 혼합물, 예를 들어, 전해 유체, 신장 혼합물 등을 하우징할 수 있는 폐쇄형 구조를 지칭한다. 특정한 실시양태에서, 유체 챔버는 전기적으로 절연성 물질로 형성되고 하나 이상의 전극을 갖는 내표면을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 어구 "전해 유체"는 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있는 이온성 용액을 지칭한다: 예를 들어, 다른 것들 중에서도 H+, OH- 및 Mg2+를 포함하는 이온, 및 예를 들어, 프라이머-프로브, 폴리머라제 효소, 뉴클레오티드, 및 하나 이상의 이중-가닥 핵산 분자를 포함하는 주형 핵산 쇄-신장 시약. 본 발명 TEEM 방법은 전해 유체를 함유하는 유체 챔버의 전극에 걸쳐 전기장을 인가하거나 변조하여 (인가된 전압을 통해) 이중-가닥 핵산을 변성시키고 단일-가닥 핵산을 어닐링하는 둘 다를 하는 전해 유체의 변조된 pH 수준 (예를 들어, 변성-pH 수준 및 어닐링-pH 수준)을 생성하는 단계를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "전극"은 그를 통해 전기가 물체, 물질, 또는 영역으로 들어가거나 이탈하는 널리 공지된 도체를 지칭한다. 전극은 일반적으로 회로의 비금속 부분과 접촉시키는데 사용된다. 관련 기술분야에 널리 공지된 바와 같이, 전자 매크로-스케일 회로에 대해, 2개의 극성, 따라서 2개의 전극이 있을 필요가 있다. 본원에서 제공된 본 발명 방법 및 칩/올리고뉴클레오티드 어레이의 특정한 실시양태에서, 제2 전극은 접지될 수 있다. 다른 실시양태에서, 적어도 하나의 전극 (예를 들어, 제1 전극) 또는 둘 다의 전극은 그에 부착된 포획 프로브 및/또는 프라이머를 가질 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 양성 전극은 활성 영역에서 및 활성 "이중-층" 영역에서 높은 pH에 상응할 수 있는 음성 전극에서 낮은 pH를 생성할 수 있다. pH 수준에 기반한 변성 및 혼성화는 실질적으로 대칭적으로 작용하는 것으로 밝혀졌으며; 즉, 이중-가닥 핵산의 변성을 달성하기 위해, 보다 낮은 pH 수준 및 보다 높은 pH 수준 둘 다를 적용할 수 있다.
본원에 사용된 어구 "전극-용액 계면"은 용액 (예를 들어, 전해 유체)이 유체 챔버 내의 전극 중 하나 이상과 접촉하게 되는 위치를 지칭한다.
본원에 사용된 어구 "전극-용액 계면에 근접하여"는 상대적으로 전극-용액 계면 부근인 전해 유체의 영역을 지칭한다 (도 18에서 박스친 보다 어두운 음영화된 영역 표지된 pH 구배 참조). 인가된 전기장은 반대로 하전된 전극에 전기적으로 끌리는 제1 이온의 제1 층 및 제1 층에 전기적으로 끌리는 제2 이온의 제2 층을 포함하는 전해 유체에서 "이중-층" 공간 이온 분포를 생성한다. 이온 분포는 전극의 치수 및 기하구조, 전극 상의 인가된 전압 (예를 들어, 전기장의 규모), 및 전해 유체 중의 이온 농도에 의존한다. 일부 실시양태에서, 예를 들어, 본 발명 방법은 인가된 변성 및 어닐링 전기장의 규모 및 지속기간을 선택하고/거나 조정하는 프로세스를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, DC 전기장은 전극에 걸쳐 DC 전압을 인가함으로써 생성될 수 있다. 다른 실시양태에서, 예를 들어, 또한 DC 바이어스를 포함할 수 있는 AC 전기장이 인가될 수 있다. 예를 들어, 전하의 공간 분포는 각각의 장-제어된 어닐링-pH 수준 및 변성-pH 수준을 제공하는 인가된 외부 변성 및 어닐링 전기장을 사용하여 전해 용액 (예를 들어, 전해 유체 용액)에서 "이중 층"을 조작함으로써 생성되고 제어될 수 있다. 다른 실시양태에서, 다양한 전기장 패턴 (DC 또는 AC, 상이한 파형, 주파수, 진폭에 기반하여) 및 서열은 2개 이상의 가닥의 결합 동역학에 영향을 미치도록 생성될 수 있다.
"이중 층"은 물체가 액체 내로 정치되는 경우 물체의 표면을 둘러싸는 2개의 평행한 층, 예를 들어, 제1 및 제2 층을 지칭한다 (도 18에서 양이온의 상부 상에 층상화된 음이온의 열로서 도시됨). 제1 층 (스턴 층)은 양성 또는 음성 중 어느 하나인 표면 전하를 포함하고, 예를 들어, 본 발명 TEEM 방법에서 양성 또는 음성 전극 중 어느 하나인 물체 상으로 직접적으로 흡착된 이온에 의해 형성된다. 제2 층 (확산 층)은 제1 층을 전기적으로 스크리닝하기 위해 표면에 부착된 이온으로 구성된다. 확산 층은 물체 (예를 들어, 전극)와 느슨하게 회합된 유리 이온으로 구성된다. 이중 층은 용액의 이온 농도 및 표면 상의 전하 (또는 인가된 전압)에 따라 마이크로미터까지 연장될 수 있다. 이는 변성-pH 수준 및 어닐링-pH 수준이 각각의 변성 및 어닐링 전압 및 전기장에 의해 생성되는 전해 유체 용액 내의 영역이다 (도 18에서 박스친 보다 어두운 음영화된 영역 표지된 pH 구배 참조).
특정한 실시양태에서 포획-프로브 (또는 포획/프라이머-프로브)는 전극-용액 계면에 위치된다. 본원에 사용된 어구 "포획-프로브"는 관심의 각각의 표적-핵산에 결합할 수 있는 단일-가닥 또는 부분적으로 단일-가닥 뉴클레오티드를 지칭한다 (도 13-16에서 적색 및 녹색 영역으로서 도시됨). 포획-프로브 길이는 5-500개 또는 그 초과의 뉴클레오티드의 길이일 수 있거나; 다른 실시양태에서 5-400, 5-300, 5-200, 5-150, 5-100, 5-90, 5-80, 5-70, 5-60, 5-50, 5-40, 5-30, 5-25, 5-20, 5-15, 10-500, 10-400, 10-300, 10-200, 10-150, 10-100, 10-90, 10-80, 10-70, 10-60, 10-50, 10-40, 10-30, 10-25, 10-20, 10-15, 15-500, 15-400, 15-300, 15-200, 15-150, 15-100, 15-90, 15-80, 15-70, 15-60, 15-50, 15-40, 15-30, 15-25, 15-20, 20-500, 20-400, 20-300, 20-200, 20-150, 20-100, 20-90, 20-80, 20-70, 20-60, 20-50, 20-40, 20-30, 20-25, 25-500, 25-400, 25-300, 25-200, 25-150, 25-100, 25-90, 25-80, 25-70, 25-60, 25-50, 25-40, 또는 25-30개의 뉴클레오티드의 길이일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 포획 프로브는 또한 핵산 쇄 신장 반응, 예컨대 본원에서 제공된 본 발명 LACES 방법에서 수행된 것들에서, 본원에서 "포획/프라이머 프로브"로 지칭되는 프라이머로서 기능한다.
본원에 사용된 어구 "포획/프라이머-프로브"는 관심의 각각의 표적-핵산에 결합할 수 있는 영역을 갖고; 또한 각각의 표적-핵산 주형 상의 핵산 쇄 신장 반응을 개시하는 프라이머로서 역할을 하는 단일-가닥 또는 부분적으로 단일-가닥 뉴클레오티드를 지칭한다 (도 14-16의 각각에서 포획-프로브의 녹색 영역으로서 도시됨). 다른 실시양태에서, 포획/프라이머 프로브는 관심의 각각의 표적-핵산에 결합할 수 있는 영역 (도 13의 포획/프라이머-프로브의 녹색 영역)을 가질 수 있고; 또한 각각의 표적-핵산 주형 상의 핵산 쇄 신장 반응을 개시하는 프라이머로서 역할을 하는 영역 (도 13의 포획/프라이머-프로브의 어두운 청색 영역으로서 도시됨)을 함유한다. 포획/프라이머-프로브 길이는 5-500개 또는 그 초과의 뉴클레오티드의 길이일 수 있거나; 다른 실시양태에서 5-400, 5-300, 5-200, 5-150, 5-100, 5-90, 5-80, 5-70, 5-60, 5-50, 5-40, 5-30, 5-25, 5-20, 5-15, 10-500, 10-400, 10-300, 10-200, 10-150, 10-100, 10-90, 10-80, 10-70, 10-60, 10-50, 10-40, 10-30, 10-25, 10-20, 10-15, 15-500, 15-400, 15-300, 15-200, 15-150, 15-100, 15-90, 15-80, 15-70, 15-60, 15-50, 15-40, 15-30, 15-25, 15-20, 20-500, 20-400, 20-300, 20-200, 20-150, 20-100, 20-90, 20-80, 20-70, 20-60, 20-50, 20-40, 20-30, 20-25, 25-500, 25-400, 25-300, 25-200, 25-150, 25-100, 25-90, 25-80, 25-70, 25-60, 25-50, 25-40, 또는 25-30개의 뉴클레오티드의 길이일 수 있다.
본원에 사용된 어구 "복수의 포획-프로브" 또는 "복수의 포획/프라이머-프로브"는 1개 초과의 프로브를 지칭한다. 복수의 프로브는 임의의 기재, 전극, 칩 표면 등 상의 올리고뉴클레오티드 어레이의 형태일 수 있다. 평면 어레이 표면은 특정한 실시양태에서 이용되지만, 포획-프로브 올리고뉴클레오티드 어레이는 사실상 임의의 형상의 표면 상에 또는 전극을 포함하는 다수의 표면 상에 제작될 수 있다. 포획 및 포획/프라이머 프로브는 조사되고 있는 특정한 표적-핵산에 상보적이도록 디자인되고 구축된다. 포획 프로브가 표면 (예를 들어, 전극 등) 상에 있는 특정한 실시양태에서, 표면 (예를 들어, 전극) 상의 포획-프로브 또는 포획-프라이머 프로브의 밀도는 cm2당 약 100 내지 약 1,000,000개의 올리고뉴클레오티드 프로브의 범위이다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 단일 올리고뉴클레오티드 프로브가 그것이 사용되고 있는 본 발명 방법에 따라 프라이머-프로브, 포획-프로브 및/또는 포획/프라이머-프로브로서 기능할 수 있음을 인식할 것이다.
본원에 사용된 어구 "포획-프로브의 밀도" 또는 "포획/프라이머-프로브의 밀도"는 각각의 전극 표면 상의 프로브의 수를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 프로브의 밀도는 cm2당 올리고뉴클레오티드의 수에 의해 정량화된다. 특정한 실시양태에서, 각각의 전극 상의 올리고뉴클레오티드 포획-프로브 또는 포획/프라이머 프로브의 어레이는 cm2당 약 100, 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 10,000, 15,000, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000, 60,000, 70,000, 80,000, 90,000, 100,000, 150,000, 200,000, 250,000, 300,000, 400,000, 500,000, 600,000, 700,000, 800,000, 900,000 또는 1,000,000개 초과의 올리고뉴클레오티드 프로브로부터 선택된 밀도를 포함하는 고밀도 어레이이다.
다른 실시양태에서, 밀도는 표적-핵산의 포획이 시간의 특정 상한 내에서, 예컨대 180초, 160초, 140초, 120초, 110초, 100초, 90초, 80초, 70초, 60초, 50초, 40초, 30초, 25초, 20초, 15초, 14초, 13초, 12초, 11초, 10초, 9초, 8초, 7초, 6초, 5초, 5초, 3초, 2초, 및 1초로 완결되도록 선택된다.
예를 들어, 유체 챔버 및/또는 전극 표면의 각각의 물리적 크기에 따라, 프로브의 밀도는 예상된 표적-핵산이 500초, 400초, 300초, 200초, 180초, 120초, 100초, 90초, 80초, 70초, 60초, 50초, 40초, 30초, 25초, 20초, 15초, 10초, 9초, 8초, 7초, 6초, 5초, 4초, 3초, 2초 및 1초 미만에 포획되도록 하는 것일 수 있다.
본 발명 방법에서 인가된 전압 (전류)의 맥락에서 사용되는 경우, 본원에 사용된 어구 "변조하는", "전압을 변조하는", "전류를 변조하는" 또는 그의 문법적 파생어는 본원에서 제공된 본 발명 방법에서 적어도 2개의 상이한 전압 사이에 (예를 들어, 어닐링-전압 및 변성-전압 사이에) 교대하여, 이중-가닥 염기 쌍의 변성 및 어닐링 둘 다를 허용하는 것을 지칭한다. 인가된 전압은 본원에서 "전극-용액 계면"으로 지칭되는 전극 및 전해 유체 용액 계면에 가까운 (또는 그에 근접하여) 전기장을 생성한다. 생성된 특정한 전기장은 용액 중의 이온의 이동을 유발하며, 이는 결국 인가된 특정한 전압에 따라, 핵산이 어닐링하거나 변성하는 것을 선호하거나 유발하는 전극-용액 계면에 근접하여 각각의 pH 수준을 발생시킨다.
따라서, 각각의 변성-전압에 대해, 상응하는 각각의 변성-전기장 및 상응하는 변성-pH 수준이 있다. 마찬가지로, 각각의 어닐링-전압에 대해, 상응하는 각각의 어닐링-전기장 및 상응하는 어닐링-pH 수준이 있다. 특정한 실시양태에서, 인가된 어닐링-전압은 어닐링-전기장 및 어닐링-pH 수준을 생성하며, 이는 결국 상보적 핵산의 이중-가닥으로의 어닐링을 촉진시킨다. 인가된 변성-전압은 상보적 핵산의 단일-가닥으로의 변성을 촉진시키는 변성-전기장 및 변성-pH 수준을 생성한다. 따라서, 인가된 전압 및 생성된 상응하는 변조된 전기장을 교대하는 것은 본원에서 제공된 본 발명 방법에서 적어도 2개의 상이한 pH 수준 (예를 들어, 어닐링-pH 수준 및 변성-pH 수준)을 생성한다.
본원에 사용된 어구 "어닐링-전압"은 특정한 전해 유체 용액에서 상보적 단일-가닥 핵산의 이중-가닥으로의 어닐링을 촉진시키거나 유발하는 전압을 지칭한다. 인가된 어닐링-전압은 상응하는 어닐링-전기장 및 어닐링-pH 수준을 생성하며, 이는 결국 상보적 단일-가닥 핵산의 이중-가닥으로의 어닐링을 촉진시키거나 유발한다.
본원에 사용된 어구 "어닐링-pH 수준"은 특정한 전해 유체 용액에서 상보적 핵산의 이중-가닥으로의 어닐링을 촉진시키거나 유발하는 pH 수준을 지칭한다. 특정한 실시양태에서, 각각의 어닐링-pH 수준은 전해 유체 용액에 인가된 특정한 어닐링-전기장에 반응하여 용액 중의 이온의 이동을 통해 생성된다.
본원에 사용된 어구 "핵산-함유 샘플 내의 핵산 및 포획-프로브 사이의 임의의 수의 상보적 염기 쌍의 어닐링"은 특정한 길이의 단일-가닥 핵산의 어닐링을 촉진시키거나 유발하거나, 이중-가닥 핵산이 이중-가닥으로 잔류하는 것을 허용하는 pH 수준 조건의 범위를 지칭한다.
본원에 사용된 어구 "변성-전압"은 특정한 전해 유체 용액에서 상보적 이중-가닥 핵산의 단일-가닥으로의 변성을 촉진시키거나 유발하는 전압을 지칭한다. 인가된 변성-전압은 상응하는 변성-전기장 및 변성-pH 수준을 생성하며, 이는 결국 상보적 이중-가닥 핵산의 단일-가닥으로의 변성 (또는 분리)을 촉진시키거나 유발한다.
본원에 사용된 어구 "변성-pH 수준"은 특정한 전해 유체 용액에서 상보적 이중-가닥 핵산의 단일-가닥으로의 변성을 촉진시키거나 유발하는 pH 수준을 지칭한다. 특정한 실시양태에서, 각각의 변성-pH 수준은 전해 유체 용액에 인가된 특정한 변성-전기장에 반응하여 용액 중의 이온의 이동을 통해 생성된다.
본원에 사용된 어구 "이중-가닥 포획-프로브보다 더 짧은 이중-가닥 핵산의 변성" 또는 "이중-가닥 포획-프로브의 전장보다 더 짧은 특정한 수의 염기 쌍 또는 그보다 더 짧은 특정한 범위의 염기 쌍 중 어느 하나인 포획 프로브 및 표적-핵산의 혼성화된 쌍을 포함하는 이중-가닥 핵산의 변성"은 변성된 이중-가닥의 길이가 전장 이중-가닥 포획-프로브 또는 포획/프라이머-프로브보다 더 짧은 한, 특정한 길이의 이중-가닥 핵산의 변성을 촉진시키거나 유발하는 pH 수준 조건의 범위를 지칭한다. 한 실시양태에서, 변성되는 이중-가닥 핵산의 길이는 이중-가닥 포획-프로브보다 1-100개의 염기 쌍 더 짧으며, 이는 이중-가닥 포획 프로브의 전장보다 "더 짧은 특정한 범위의 염기 쌍"에 상응한다. 특정 실시양태에서, 인가된 특정한 변성-전압, 변성-전기장 및 변성-pH 수준은 프라이머-프로브보다 더 적은 정확한 수의 염기 쌍 길이를 변성시킬 필요는 없다. 이들 실시양태에서, 이는 본원에서 "이중-가닥 포획-프로브의 전장보다 더 짧은 특정한 범위의 염기 쌍"으로 지칭되는 전장 이중-가닥 프라이머-프로브보다 더 적은 변성된 염기 쌍 길이의 범위일 수 있다. 이에 대한 이유는 검정되는 각각의 표적 서열에 특이적으로 상보적인 보다 긴 프라이머-프로브 길이, 예를 들어 15, 20, 25, 30, 40, 50개의 뉴클레오티드 또는 그 초과의 길이에 대해, 다른 비-표적 서열이 프라이머-프로브와 공동으로 심지어 5, 10, 15, 20개 또는 그 초과의 뉴클레오티드를 가질 통계적 확률이 극도로 낮고, 따라서 프로브-표적 풍부화 변조 단계에서의 변성-전압이 선택된 각각의 포획/프라이머-프로브의 길이에 따라, 완전히 혼성화된 프라이머-프로브보다 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 25, 40, 45, 50개의 염기 쌍 또는 그 초과 더 짧은 이중-가닥 핵산을 변성시키는 (상응하는 pH 수준을 통해) 전압 양일 수 있다는 것이다. 다시 말해서, 비-표적-핵산이 포획-프로브 또는 포획/프라이머-프로브와 11개 이상의 상보적 염기 쌍 매치를 가질 통계적 확률은 무시가능할 만큼 너무 작다. 따라서, 특정한 실시양태에서, 본원에 사용하기 위해 고려되는 변성-전압의 상부 역치는 약 20개의 올리고뉴클레오티드 또는 그 초과인 포획-프로브 또는 포획/프라이머 프로브에 대해 1-5, 1-10, 1-15개의 염기 쌍의 범위에서 변성시키는 전압일 수 있다. 이 실시양태에서, 약 25개의 올리고뉴클레오티드 또는 그 초과인 포획-프로브 또는 포획/프라이머-프로브에 대해, 1 내지 20개의 염기 쌍의 범위에서 변성시키는 전압이 사용될 수 있다.
다른 실시양태에서 예를 들어, 포획/프라이머-프로브 길이가 20개의 뉴클레오티드인 경우, 전기장/전압 역치는 표적-핵산 포획의 특이성이 변성-전압 (예를 들어, 제2 pH 수준) 및 어닐링-전압 (예를 들어, 제1 pH 수준)의 변조가 없는 경우보다 실질적으로 더 높도록, 약 10 내지 15개 미만의 염기 쌍의 길이인 임의의 이중-가닥 핵산을 변성시키는 수준에서 설정될 수 있다. 이 실시양태에서, 이중-가닥 포획-프로브, 프라이머 프로브, 또는 포획/프라이머-프로브의 전장은 20개의 염기 쌍이다.
본 발명 TEEM 핵산 풍부화 또는 단리 방법의 다른 실시양태에서, 변성-pH 수준은 1 내지 x-5개의 상보적 염기 쌍; 1 내지 x-10개; 1 내지 x-15개의 상보적 염기 쌍; 1 내지 x-20개의 상보적 염기 쌍; 1 내지 x-25개의 상보적 염기 쌍; 1 내지 x-30개의 상보적 염기 쌍; 1 내지 x-35개의 상보적 염기 쌍; 1 내지 x-40개의 상보적 염기 쌍; 1 내지 x-245개의 상보적 염기 쌍; 1 내지 x-50개의 상보적 염기 쌍 (여기서 x는 각각의 포획-프로브의 뉴클레오티드 길이임)으로부터 선택된 범위에 상응하는 상보적 염기 쌍의 수를 갖는 이중-가닥 핵산의 변성을 유발한다.
25 뉴클레오티드 프라이머-프로브가 사용되는 다른 예시적인 실시양태에서, 인가된 전압/전기장은, 예를 들어, 25 염기 쌍 전장 이중-가닥 프라이머-프로브가 혼성화되어 잔류하는 것을 허용하면서, 염기 쌍 이중-가닥의 1-20, 1-15, 1-10, 또는 1-5개의 범위를 변성시키도록 선택될 수 있다. 이 실시양태에서, 이중-가닥 포획-프로브, 프라이머 프로브, 또는 포획/프라이머-프로브의 전장은 25개의 염기 쌍이다. 또 다른 예로서, 20 뉴클레오티드 프라이머-프로브가 사용되는 실시양태에서, 인가된 에너지/전압은, 예를 들어, 예를 들어 20 염기 쌍 이중-가닥 프라이머-프로브가 혼성화되어 잔류하는 것을 허용하면서, 염기 쌍 이중-가닥의 1-15, 1-10, 또는 1-5개의 범위를 변성시키도록 선택될 수 있다. 50 뉴클레오티드 프라이머-프로브가 사용되는 실시양태에서, 인가된 에너지/전압은, 예를 들어, 예를 들어 50 염기 쌍 이중-가닥이 혼성화되어 잔류하는 것을 허용하면서, 염기 쌍 이중-가닥의 1-40, 1-30, 1-20, 또는 1-10개의 범위를 변성시키도록 선택될 수 있다.
따라서, 다른 실시양태에서, 선택된 변성-전압은 5-100, 5-90, 5-80, 5-70, 5-60, 5-50, 5-40, 5-30, 5-20, 5-15, 5-10, 10-100, 10-90, 10-80, 10-70, 10-60, 10-50, 10-40, 10-30, 10-20, 10-15, 2-50, 2-40, 2-30, 2-20, 2-15, 2-10, 2-5, 3-50, 3-40, 3-30, 3-20, 3-15, 3-10, 3-5, 4-50, 4-40, 4-30, 4-20, 4-15, 및 4-10개의 뉴클레오티드 미만으로부터 선택된 포획-프로브 또는 프라이머-프로브의 길이 미만의 뉴클레오티드의 범위에서 이중-가닥 핵산을 변성시키는 (생성된 pH 수준을 통해) 양일 수 있다.
다른 특정한 실시양태에서, 특히 포획 프라이머-프로브 길이가 약 20개의 뉴클레오티드 이상인 경우, 프라이머-프로브 풍부화 단계 동안 인가되는 에너지/전압/전기장은 각각의 포획 프라이머-프로브 길이 미만의 5 bp-10bp, 10 bp-15bp, 15 bp-20bp, 20 bp-25bp 등의 범위인 임의의 이중-가닥 염기 쌍형성이 변성될 것이도록 선택될 수 있다.
다른 실시양태에서, 프라이머-프로브 변조된 변성 단계 동안 인가되는 에너지/전압/전기장은 1 bp만큼 낮게로부터 출발하여 각각의 포획 프라이머-프로브 길이 미만의 임의의 범위의 이중-가닥 염기 쌍형성이 변성될 것이도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 25 뉴클레오티드 프라이머-프로브가 사용되는 실시양태에서, 인가된 에너지/전압은 25 염기 쌍 이중-가닥이 혼성화되어 잔류하는 것을 허용하면서 24 염기 쌍 이중-가닥을 변성시킬 것이다. 또 다른 예로서, 20 뉴클레오티드 프라이머-프로브가 사용되는 실시양태에서, 인가된 에너지/전압은 20 염기 쌍 이중-가닥이 혼성화되어 잔류하는 것을 허용하면서 19 및 미만의 염기 쌍 이중-가닥을 변성시킬 것이다. 50 뉴클레오티드 프라이머-프로브가 사용되는 실시양태에서, 인가된 에너지/전압은 50 염기 쌍 이중-가닥이 혼성화되어 잔류하는 것을 허용하면서 49 및 미만의 염기 쌍 이중-가닥을 변성시킬 것이다. 40 뉴클레오티드 프라이머-프로브가 사용되는 실시양태에서, 인가된 에너지/전압은 20-30 염기 쌍 이중-가닥의 범위 미만의 임의의 염기 쌍 이중-가닥을 변성시킬 것이다.
보다 긴 프라이머-프로브가 이용되는 (예를 들어, 20개의 뉴클레오티드 또는 그 초과) 실시양태에서, 선택된 변성-전압은 1 bp 초과 각각의 포획 프라이머-프로브 길이 미만의 이중-가닥 핵산을 변성시키는 양일 수 있다. 예를 들어, 혼성화된 이중-가닥 핵산을 용융시키는데/변성시키는데 사용되는 변성-전압은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 bp 이상 각각의 포획 프라이머-프로브 길이 미만인 이중-가닥을 변성시키는 전압 양일 수 있다.
특정한 실시양태에서, 풍부화 또는 단리 동안 변조된 전기장의 사이클의 총 수는 1 x 102-1 x 1012 총 사이클; 1 x 103 - 1 x 109 총 사이클; 1 x 103 - 1 x 108 총 사이클; 1 x 103 - 1 x 107 총 사이클; 1 x 103 - 1 x 106 총 사이클 등의 범위이다. 본 발명 TEEM 방법에 이용되는 시간 및 주파수를 상관시키기 위해, 1,000 총 사이클은 5초 동안 0.2 kHz의 변조된 전기장 주파수; 10초 동안 0.1 kHz; 15초 동안 0.0666 kHz; 또는 20초 동안 0.05 kHz에 상응하는 반면; 10억 총 사이클은 5초 동안 200 MHz; 10초 동안 100 MHz; 15초 동안 66.6 MHz; 또는 20초 동안 50 MHz에 상응한다.
따라서, 전기장을 변조하기 위해 본원에서 고려되는 주파수는 0.1 kHz 내지 200 GHz의 범위이다. 다른 실시양태에서, 본원에 사용하기 위해 고려되는 주파수 범위는 0.1 kHz 내지 200 GHz; 0.1 kHz 내지 100 GHz; 0.1 kHz 내지 1 GHz; 0.1 kHz 내지 100 MHz; 0.1 kHz 내지 10 MHz; 0.1 kHz 내지 1 MHz; 0.1 kHz 내지 900 kHz; 0.1 kHz 내지 800 kHz; 0.1 kHz 내지 700 kHz; 0.1 kHz 내지 600 kHz; 0.1 kHz 내지 500 kHz; 0.1 kHz 내지 400 kHz; 0.1 kHz 내지 300 kHz; 0.1 kHz 내지 200 kHz; 0.1 kHz 내지 100 kHz; 등을 포함한다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 어닐링-전압 및 변성-전압 사이의 전압을 변조하는 것은 0.1 - 1000 Khz (예를 들어, 초당 100 - 1,000,000 사이클)의 범위의 변조 주파수에서 이루어진다.
전기장을 변조하는 (및 따라서 전극 부근의 용액 ph 수준을 변조하는) 단계에 대해 초로의 총 시간은 1 내지 500초; 1 내지 400초; 1 내지 300초; 1 내지 200초; 1 내지 100초; 1 내지 90초; 1 내지 80초; 1 내지 70초; 1 내지 60초; 1 내지 50초; 1 내지 40초; 1 내지 30초; 1 내지 25초; 1 내지 20초; 1 내지 15초; 및 1 내지 10초의 범위이다. 전기장을 변조하기 위해 본원에서 고려되는 시간의 다른 범위는 5 내지 500초; 5 내지 400초; 5 내지 300초; 5 내지 200초; 5 내지 100초; 5 내지 90초; 5 내지 80초; 5 내지 70초; 5 내지 60초; 5 내지 50초; 5 내지 40초; 5 내지 30초; 5 내지 25초; 5 내지 20초; 및 5 내지 15초이다. 따라서, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 전기장의 변조 주파수가 각각의 실시양태에 대해 특정한 시간 내에 요망되는 사이클의 총 수에 따라 다양화될 수 있음을 이해할 것이다.
본원에 사용된 어구 "상응하는 pH 수준의 최종 적용" (예를 들어, 어닐링- 또는 변성-pH 수준)은 전기장의 변조의 최종 사이클; 및 따라서 각각 포획-프로브 상으로 또는 그로부터 핵산의 어닐링 및 변성의 최종 사이클을 지칭한다. 전기장 및 각각의 pH 수준의 변조가 중단되었으면, 단지 표적-핵산은 포획-프로브 또는 포획/프라이머-프로브에 결합되어 잔류할 것이다.
본원에 사용된 어구 "포획-프로브에 결합되어 잔류하는"은 변성-전압, -전기장, 및 -pH 수준이 반응 혼합물에 인가되어 포획-프로브로부터 비-표적 핵산을 변성시키고 제거하는 동안, 포획-프로브 서열에 대한 그의 혼성화된 상태를 유지하는 표적-핵산을 지칭한다.
TEEM + LACES
본 발명 TEEM 방법의 특정한 실시양태에서, 표적-핵산을 풍부화하거나 단리하는 본 발명 방법은 표적-핵산의 존재를 검출하기 위한 본 발명 LACES 방법과 조합으로 사용된다. 따라서, 또한, 핵산-함유 샘플에서 표적-핵산 서열의 존재를 검출하는 방법이으로서, 하기 단계를 포함하는 방법이 본원에서 제공된다:
a. 제1 및 제2 전극을 갖는 유체 챔버에 이온을 포함하는 전해 유체 용액 및 핵산-함유 샘플을 수용하는 단계로서, 여기서 적어도 하나의 전극은 표적-핵산에 상보적인 복수의 포획/프라이머-프로브가 그에 부착되어 있으며, 여기서 포획/프라이머-프로브는 전극-용액 계면에 있는 것인 단계;
b. 어닐링-전압을 전극-용액 계면에 근접하여 전해 유체에 인가하여 계면에 의한 어닐링-pH 수준을 생성하는 단계로서, 여기서 어닐링-pH 수준은 핵산-함유 샘플 내의 핵산 및 포획/프라이머-프로브 사이의 임의의 수의 상보적 염기 쌍의 어닐링을 유발하는 것인 단계;
c. 변성-전압을 전극-용액 계면에 근접하여 전해 유체에 인가하여 계면에 의한 변성-pH 수준을 생성하는 단계로서, 여기서 변성-pH 수준은 이중-가닥 포획-프로브의 전장보다 더 짧은 특정한 수의 염기 쌍 또는 그보다 더 짧은 특정한 범위의 염기 쌍 중 어느 하나인 포획 프로브 및 표적-핵산의 혼성화된 쌍을 포함하는 이중-가닥 핵산의 변성을 유발하는 것인 단계; 및
d. 어닐링-전압 및 변성-전압을 변조하는 단계로서, 여기서 상응하는 pH 수준의 최종 적용 (예를 들어, 어닐링 또는 변성) 후, 표적-핵산은 전극 (예를 들어, 제1 전극) 상의 포획/프라이머-프로브에 결합되어 잔류함으로써 핵산-함유 샘플로부터 풍부화되거나 단리되며, 여기서 결합된 표적-핵산은 주형 지정된 신장 합성을 위한 주형 가닥인 단계;
e. (i) 폴리머라제 효소, (ii) ATP 재생 효소, (iii) 발광 효소 (예를 들어, 반딧불이 루시페라제), 및 (iv) 성장하는 핵산 가닥의 주형 지정된 신장 합성을 수행하기 위한 구성요소를 갖는 폴리머라제-ATP 재생 효소-발광 시약 용액을 포함하는 신장 혼합물을 제공하는 단계로서, 여기서 상기 시약 용액은 ATP-재생-효소-기질, 발광-기질; 및 복수의 유형의 dNTP 또는 뉴클레오티드 유사체를 포함하며, 여기서 뉴클레오티드 유사체의 각각의 유형은 폴리머라제 의해 절단가능한 이탈기를 가지며, 여기서 이탈기는 주형 가닥에의 각각의 뉴클레오티드 유사체의 폴리머라제-의존적 결합 시 절단되는 것인 단계;
f. 포획/프라이머-프로브가 표적 핵산 서열에 혼성화하는 경우 하나 또는 복수의 뉴클레오티드 유사체가 주형 가닥에 순차적으로 첨가되도록 핵산 신장 합성을 수행하는 단계로서, 이로써 a) 뉴클레오티드 유사체는 폴리머라제와 회합하고, b) 뉴클레오티드 유사체는 그 뉴클레오티드 유사체 상의 이탈기가 폴리머라제에 의해 절단되는 경우 폴리머라제에 의해 주형 가닥 상에 혼입되며, 여기서 이탈기는 ATP 재생 효소에 의해 ATP-재생-효소-기질과 조합되어 ATP를 산출하고, 이어서 c) ATP를 발광-효소에 결합시키며, 여기서 발광-기질은 발광-효소에 의해 촉매되어 발광을 생성하면서 각각의 이탈기를 재생시키는 것인 단계; 및
g. 핵산 합성이 일어나고 있는 동안 발광으로부터 광을 검출하는 단계로서, 이로써 광의 검출은 특정한 표적 핵산 서열의 존재를 지시하는 것인 단계. 특정한 실시양태에서, 핵산-함유 샘플로부터 포획/프라이머-프로브에 결합되지 않은 물질은 단계 (e)의 신장 반응 혼합물을 제공하기 전에 세척 제거된다.
특정한 실시양태에서 (도 13에 제시된 바와 같음), 스페이서 서열 (포획 프로브의 적색 부분)을 통해 전극에 부착된 포획/프라이머-프로브 (도 13의 모든 패널에서 적색, 녹색 및 청색으로 도시됨)는 RNA-표적-핵산 서열에 결합할 수 있는 RNA-포획-프로브 바이러스 포획 서열 (녹색 영역)을 포함한다. 이 실시양태에서, 포획/프라이머-프로브는 RNA-포획 프로브 영역에 대해 3'에, 핵산 주형 가닥 (예를 들어, DNA 주형 가닥)으로부터 핵산-쇄 신장 반응을 개시할 수 있는 프라이머-서열 (어두운 청색 영역)을 추가로 포함한다. 이 실시양태에서, 포획-프라이머 프로브의 프라이머-서열 (어두운 청색 영역)은 제3 패널에 제시된 인공 연접-DNA 주형 가닥에 상보적이다. 보다 특히, 포획-프라이머 프로브의 프라이머-서열은 포획-프로브 서열에 결합하는 RNA-표적-핵산 서열의 영역에 인접한 (상류 또는 하류 중 어느 하나 및/또는 일부 실시양태에서 바로 인접한) RNA-표적-핵산 서열의 부분/영역에 상보적인 인공 DNA 서열 영역 (도 13의 제3 패널에서 DNA 주형 서열의 녹색 영역)에 대해 5'인 인공 DNA 서열 영역 (도 13의 제3 패널에서 DNA 주형 서열의 밝은 청색 영역)에 상보적이다.
이 실시양태에서, LACES 쇄-신장 반응을 개시하기 위해, RNA-표적 핵산은 포획/프라이머-프로브의 포획-프로브 영역 (녹색 영역)에 의해 샘플로부터 포획되고; 포획된 RNA-표적 핵산의 인접한 영역은 결국 인공 연접-DNA 주형 가닥에 (도 13의 제3 패널에서 DNA 주형 가닥의 녹색 영역에서) 결합하고/이를 포획하고, 이는 결국 포획/프라이머-프로브의 프라이머-서열 (도 13의 포획/프라이머-프로브의 청색 영역)에 추가로 결합하여 핵산-쇄 신장 혼합물 내의 폴리머라제의 존재 하에서 LACES 쇄 신장을 개시한다.
본 발명 방법의 특정 실시양태에서, 본원에 사용된 포획-프로브, 포획/프라이머 프로브 또는 프라이머-프로브는 각각의 표적-핵산을 포획하도록 기능하는 프로브의 부분의 시작부 (도 13-16에서 포획-프로브의 적색 영역으로서 나타내어짐) 앞의 프로브에 스페이서 서열을 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 스페이서 서열은 전극에 직접적으로 결합되고, 전극 및 포획 서열의 시작부 (도 13-16에서 포획-프로브의 적색 영역으로서 나타내어짐) 사이에 올리고뉴클레오티드 간격을 제공한다. 본원에 사용된 어구 "스페이서 서열"은 본원에 기재된 임의의 프로브 내의 임의의 길이의 올리고뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 특정한 실시양태에서, 프로브의 스페이서 서열은 전극에 결합된다.
DIAL + TEEM
특정한 실시양태에서, 본 발명 방법은 추가의 제작 프로세스 없이 유전영동 기술과 통합될 수 있으며, 예를 들어, 따라서 샘플 취급, 정제 및 제조 단계를 포함하는 저비용 통합된 솔루션을 허용한다. 예를 들어, 인가된 전기장은 처음에 유전영동 기술에 의해 총 핵산을 단리하고 농축시키는데 사용될 수 있으며; 그 후 본 발명 TEEM 방법은 목적하는 표적-핵산을 풍부화하거나 단리하기 위해 채용된다.
따라서, 또한, 하기 단계를 포함하는, 포유동물-세포 샘플로부터 표적-핵산을 풍부화하거나 단리하는 방법이 본원에서 제공된다:
a. 제1 및 제2 전극을 갖는 유체 챔버에 이온을 포함하는 전해 유체 및 포유동물-세포 샘플을 수용하는 단계;
b. 세포를 용해시켜 세포-용해물을 형성하는 단계;
c. 비대칭 유전체 장을 세포-용해물을 함유하는 용액에 인가하는 단계로서, 여기서 세포-용해물 샘플로부터의 총-핵산은 적어도 하나의 전극 (예를 들어, 제1 전극)에 의해 포획되는 것인 단계;
d. 유체 챔버로부터 비포획된 세포-용해물을 세척하는 단계;
e. 유체 챔버에서 이온을 포함하는 전해 유체 용액 내로 총-핵산을 재현탁시키는 단계로서, 여기서 적어도 하나의 전극은 표적-핵산에 상보적인 복수의 포획-프로브가 그에 부착되어 있으며, 여기서 포획 프로브는 전극-용액 계면에 있는 것인 단계;
f. 어닐링-전압을 전극-용액 계면에 근접하여 전해 유체에 인가하여 전극-용액 계면에 의한 어닐링-pH 수준을 생성하는 단계로서, 여기서 어닐링-pH 수준은 총-핵산 및 포획-프로브 사이의 임의의 수의 상보적 염기 쌍의 어닐링을 유발하는 것인 단계;
g. 변성-전압을 전극-용액 계면에 근접하여 전해 유체에 인가하여 계면에 의한 변성-pH 수준을 생성하는 단계로서, 여기서 변성-pH 수준은 이중-가닥 포획-프로브의 전장보다 더 짧은 특정한 수의 염기 쌍 또는 그보다 더 짧은 특정한 범위의 염기 쌍 중 어느 하나인 포획 프로브 및 표적-핵산의 혼성화된 쌍을 포함하는 이중-가닥 핵산의 변성을 유발하는 것인 단계; 및
h. 어닐링-전압 및 변성-전압을 변조하는 단계로서, 여기서 상응하는 pH 수준의 최종 적용 (예를 들어, 어닐링 또는 변성) 후, 표적-핵산은 전극 상의 포획/프라이머-프로브에 결합되어 잔류함으로써 총-핵산으로부터 풍부화되거나 단리되는 것인 단계.
DIAL + TEEM
또한, 하기 단계를 포함하는, 세포-용해물 샘플로부터 표적-핵산을 풍부화하거나 단리하는 방법이 본원에서 제공된다:
a. 제1 및 제2 전극을 갖는 유체 챔버에 이온을 포함하는 전해 유체 용액 및 세포-용해물 샘플을 수용하는 단계;
b. 비대칭 유전체 장을 세포 용해물 샘플을 함유하는 용액에 인가하는 단계로서, 여기서 세포-용해물 샘플로부터의 총-핵산은 적어도 하나의 전극 (예를 들어, 제1 전극)에 의해 포획되는 것인 단계;
c. 유체 챔버로부터 비포획된 세포-용해물을 세척하는 단계;
d. 유체 챔버에서 이온을 포함하는 전해 유체 용액 내로 총-핵산을 재현탁시키는 단계로서, 여기서 적어도 하나의 전극은 표적-핵산에 상보적인 복수의 포획-프로브가 그에 부착되어 있으며, 여기서 포획 프로브는 전극-용액 계면에 있는 것인 단계;
e. 어닐링-전압을 전극-용액 계면에 근접하여 전해 유체에 인가하여 전극-용액 계면에 의한 어닐링-pH 수준을 생성하는 단계로서, 여기서 어닐링-pH 수준은 총-핵산 및 포획-프로브 사이의 임의의 수의 상보적 염기 쌍의 어닐링을 유발하는 것인 단계;
f. 변성-전압을 전극-용액 계면에 근접하여 전해 유체에 인가하여 계면에 의한 변성-pH 수준을 생성하는 단계로서, 여기서 변성-pH 수준은 이중-가닥 포획-프로브의 전장보다 더 짧은 특정한 수의 염기 쌍 또는 그보다 더 짧은 특정한 범위의 염기 쌍 중 어느 하나인 포획 프로브 및 표적-핵산의 혼성화된 쌍을 포함하는 이중-가닥 핵산의 변성을 유발하는 것인 단계; 및
g. 어닐링-전압 및 변성-전압을 변조하는 단계로서, 여기서 상응하는 pH 수준의 최종 적용 (예를 들어, 어닐링 또는 변성) 후, 표적-핵산은 전극 상의 포획/프라이머-프로브에 결합되어 잔류함으로써 풍부화되거나 단리되는 것인 단계.
특정한 실시양태에서, 총-핵산은 비대칭 유전체 장을 종료시킴으로써 유체 챔버 내로 재현탁된다. 특정 실시양태에서, 세포-용해물은 유체 챔버 내의 포유동물 세포-샘플을 용해시킴으로써 얻어진다. 특정한 실시양태에서, 표적-핵산은 본원에 추가로 제시된 바와 같이, LACES, 직접 검출, PCR, 롤링 서클 증폭, 라이게이션 및 PCR의 조합, 및 증폭에 이어서 검출 단계, 표지된 프로브, 개재 형광 염료 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의해 검출된다. 특정한 실시양태에서, 핵산-함유 샘플로부터 포획/프라이머-프로브에 결합되지 않은 물질은 검출 전에 세척 제거된다. 특정한 실시양태에서, 표적-핵산은 LACES 방법에 의해 검출된다. 포유동물 세포-샘플은 세포, 타액, 소변, 혈액, 모발, 정액, 타액, 골, 조직, 치아, 세포-용해물, 바이러스, 세포 핵산 또는 게놈 핵산으로부터 얻어진다.
본원에 사용된 어구 "포유동물-세포 샘플"은 임의의 형태로 임의의 공급원에 함유된, 또는 그로부터 얻어진 세포를 지칭한다. 예를 들어, 세포는 조직, 타액, 소변, 혈액, 모발, 정액, 타액, 골, 치아 등 내에 있을 수 있다.
본원에 사용된 어구 "세포를 용해시켜 세포-용해물을 형성하는"은 그의 완전성을 손상시키는, 예를 들어, 세정제, 바이러스, 효소, 또는 삼투압 메커니즘 등에 의해 세포를 파괴하는 널리 공지된 프로세스를 지칭한다. 용해된 세포의 내용물을 함유하는 유체는 "세포-용해물"로 지칭되며, 또한 분해된 임의의 바이러스로부터의 핵산 내용물을 함유함이 이해된다. 세포 용해는 본원에서 그렇지 않다면 DNA를 변성시킬 수 있는 전단력을 회피하기 위해 세포를 파괴 개방하는데 사용된다.
본원에 사용된 어구 "세포-용해물 샘플로부터의 총-핵산"은 세포 (예를 들어, 세포 DNA), 바이러스 입자 (예를 들어, 바이러스 핵산) 및/또는 체액 (예를 들어, 혈액, 혈청, 소변 등)을 포함하는 샘플 내의 어떠한 공급원으로부터의 수집되거나 분석되는 특정한 샘플 내의 실질적으로 모든 핵산을 지칭한다.
본원에 사용된 어구 "유체 챔버로부터 비포획된 세포-용해물을 세척하는"은 유체 챔버로부터, 전극에 의해 결합되거나 포획되지 않은 세포-용해물의 비-핵산 부분을 세척하는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 어구 "총-핵산을 재현탁시키는"은 포획된 분자, 이 경우 샘플 내의 핵산이 그들의 포획을 유발한 조건을 중단시킴으로써 용액으로 다시 들어가게 하는 것을 허용하는 널리 공지된 프로세스를 지칭한다.
본원에 사용된 어구 "비대칭 유전체 장" 또는 "유전영동 힘", 또는 그의 문법적 파생어는 비균일한 AC 전기장에서 분극화가능한 입자 상에 작용하는 힘이다 (도 17). 본원에 사용된 "유전영동"은 유전체 힘에 반응한 모이어티의 이동이다. 유전영동 (DEP)은 비균일한 전기장에서 극성 또는 분극화가능한 입자의 유도된 운동에 기반하여 생물학적 거대분자 및 마이크로스케일 나노입자에 적용가능한 무접촉 조작 기술이다. DEP는 인가된 장의 주파수에 및 입자 및 주의의 매질의 분극화 특성 사이의 차이에 의존하는 거대분자에 대한 힘을 생성한다 (도 17).
본 발명에 따르면, 용해물로부터의 핵산의 유전 단리 (본원에서 DIAL로 지칭됨)는 샘플의 모든 다른 구성요소로부터 샘플에서의 다른 세포로부터의 바이러스 RNA 뿐만 아니라 DNA를 함유하는 핵산을 단리하는데 사용된다. 본원에 사용된 DIAL 프로세스에서, 대상체로부터의 수집된 샘플은 화학적 용해 완충제와 혼합된다. 초기 화학적 용해 프로세스 후, 용액은 세포로부터 용액 내로 방출된 바이러스 RNA 및 다른 핵산 (DNA, RNA)과 함께 세포 용해물 및 다른 혈액 구성요소 (지질, 단백질, 소분자 등)를 함유한다. DIAL은 샘플에서의 모든 다른 구성요소로부터의 핵산의 특유의 물리적 특성에 따라 모든 핵산 (RNA 및 DNA)을 단리하는데 사용된다.
본 발명 방법에 따르면, DIAL 프로세스는 본 발명 TEEM 및 LACES 방법을 포함하는 전체 DeTaiL 프로세스에 사용되는 정확한 동일한 칩 디자인을 이용한다. 따라서, 본 발명 방법 및 장치 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드 칩 및/또는 어레이)의 이점은 모든 3개의 프로세스가 동일한 미세유체 장치 및/또는 유체 챔버에서 수행될 수 있다는 것이며, 이는 샘플이 얻어지고/거나 장치 내로 들어오자마자 신속한 현장 진료 분석을 허용한다.
일반적으로 2가지 유형의 유전영동, 즉, 양성 유전영동 및 음성 유전영동이 있다. 양성 유전영동에서, 입자는 유전영동에 의해 강한 장 영역을 향해 이동된다. 음성 유전영동에서, 입자는 유전영동에 의해 약한 장 영역을 향해 이동된다. 모이어티가 양성 또는 음성 유전영동을 나타내는지 여부는 입자가 주위의 매질보다 더 많이 또는 더 적게 분극화가능한지 여부에 의존한다.
모이어티의 "유전 특성"은 적어도 부분적으로, 유전체 장에 대한 모이어티의 반응을 결정하는 특성이다. 모이어티의 유전 특성은 모이어티의 유효 전기 전도도 및 모이어티의 유효 전기 유전율을 포함한다. 균질한 조성물의 입자, 예를 들어, 폴리스티렌 비드에 대해, 유효 전도도 및 유효 유전율은 전기장의 주파수에 독립적이다. 비균질한 조성물, 예를 들어 세포 또는 세포-용해물의 모이어티에 대해, 유효 전도도 및 유효 유전율은 그의 세포-핵산을 포함하는 세포의 표면 (막) 및 내부 부분 둘 다의 유효 전도도 및 유효 유전율을 고려한 값이며, 전기장의 주파수에 따라 다양할 수 있다. 또한, 전기장에서 모이어티에 의한 유전체 힘 경험은 그의 크기에 의존하며; 따라서, 모이어티의 전체 크기는 본원에서 모이어티의 유전 특성인 것으로 간주된다. 그의 유전 특성에 기여하는 모이어티의 특성은 모이어티 상의 순전하; 모이어티의 조성 (모이어티 상의, 내의, 또는 그 전반에 걸친 화학기 또는 모이어티의 분포를 포함함); 모이어티의 크기; 모이어티의 표면 배치; 모이어티의 표면 전하; 및 모이어티의 형태를 포함한다.
본원에 사용된 "진행파 유전영동"은 진행파 전기장에 반응한 모이어티의 이동이다. 어구 "진행파 유전영동 (DEP) 힘"은 진행파 전기장으로 인해 입자 또는 분자 상에 생성되는 힘을 지칭한다. 이상적인 진행파 장은 입자의 위치의 선형 함수인 AC 전기장 구성요소의 위상 값의 분포를 특징으로 한다. 진행파 전기장은 적절한 AC 신호를 칩 상에 적절하게 배열된 미세전극에 인가함으로써 확립될 수 있다. 진행파-전기장을 생성하기 위해, 각각 상이한 위상 값을 갖는 적어도 3가지 유형의 전기적 신호를 인가하는 것이 필요하다. 진행파 전기장을 생성하는 예는 4개의 위상-직각 신호 (0, 90, 180 및 270 도)를 사용하여 칩 표면 상에 패턴화된 4개의 선형, 평행 전극을 활성화시키는 것이다. 이러한 4개의 전극은 기본적, 반복 단위를 형성하는데 사용될 수 있다. 적용에 따라, 서로의 옆에 위치한 2개 초과의 이러한 단위가 있을 수 있다. 이는 전극 위의 또는 부근의 공간에서 진행 전기장을 생성할 것이다. 전극 요소가 관련 기술분야에 널리 공지된 특정 공간적으로 순차적인 순서에 따라 배열되는 한, 위상-시퀀싱된 신호를 인가하는 것은 전극에 가까운 영역에서 진행 전기장의 확립을 발생시킬 것이다.
DIAL + TEEM + LACES
또한, 포유동물-세포 샘플로부터 출발하여 본 발명 TEEM 및 LACES 방법과 함께 DIAL을 이용하는 포괄적인 "DeTaiL" 방법이 본원에서 제공된다. 예를 들어, 하기 단계를 포함하는, 포유동물-세포 샘플로부터 표적-핵산을 풍부화하거나 단리하는 방법이 본원에서 제공된다:
a. 제1 및 제2 전극을 갖는 유체 챔버에 이온을 포함하는 전해 유체 및 포유동물-세포 샘플을 수용하는 단계;
b. 세포를 용해시켜 세포-용해물을 형성하는 단계;
c. 비대칭 유전체 장을 세포-용해물을 함유하는 용액에 인가하는 단계로서, 여기서 세포-용해물 샘플로부터의 총-핵산은 적어도 하나의 전극 (예를 들어, 제1 전극)에 의해 포획되는 것인 단계;
d. 유체 챔버로부터 비포획된 세포-용해물을 세척하는 단계;
e. 유체 챔버에서 이온을 포함하는 전해 유체 용액 내로 총-핵산을 재현탁시키는 단계로서, 여기서 적어도 하나의 전극은 표적-핵산에 상보적인 복수의 포획-프로브가 그에 부착되어 있으며, 여기서 포획 프로브는 전극-용액 계면에 있는 것인 단계;
f. 어닐링-전압을 전극-용액 계면에 근접하여 전해 유체에 인가하여 전극-용액 계면에 의한 어닐링-pH 수준을 생성하는 단계로서, 여기서 어닐링-pH 수준은 총-핵산 및 포획-프로브 사이의 임의의 수의 상보적 염기 쌍의 어닐링을 유발하는 것인 단계;
g. 변성-전압을 전극-용액 계면에 근접하여 전해 유체에 인가하여 계면에 의한 변성-pH 수준을 생성하는 단계로서, 여기서 변성-pH 수준은 이중-가닥 포획-프로브의 전장보다 더 짧은 특정한 수의 염기 쌍 또는 그보다 더 짧은 특정한 범위의 염기 쌍 중 어느 하나인 포획 프로브 및 표적-핵산의 혼성화된 쌍을 포함하는 이중-가닥 핵산의 변성을 유발하는 것인 단계; 및
h. 어닐링-전압 및 변성-전압을 변조하는 단계로서, 여기서 상응하는 pH 수준의 최종 적용 (예를 들어, 어닐링 또는 변성) 후, 표적-핵산은 전극 (예를 들어, 제1 전극) 상의 포획/프라이머-프로브에 결합되어 잔류함으로써 총-핵산으로부터 풍부화되거나 단리되며, 여기서 결합된 표적-핵산은 주형 지정된 신장 합성을 위한 주형 가닥인 단계;
i. (i) 폴리머라제 효소, (ii) ATP 재생 효소, (iii) 발광 효소 (예를 들어, 반딧불이 루시페라제), 및 (iv) 성장하는 핵산 가닥의 주형 지정된 신장 합성을 수행하기 위한 구성요소를 갖는 폴리머라제-ATP 재생 효소-발광 시약 용액을 포함하는 신장 혼합물을 제공하는 단계로서, 여기서 상기 시약 용액은 ATP-재생-효소-기질, 발광-기질; 및 복수의 유형의 dNTP 또는 뉴클레오티드 유사체를 포함하며, 여기서 뉴클레오티드 유사체의 각각의 유형은 폴리머라제에 의해 절단가능한 이탈기를 가지며, 여기서 이탈기는 주형 가닥에의 각각의 뉴클레오티드 유사체의 폴리머라제-의존적 결합 시 절단되는 것인 단계;
j. 포획/프라이머-프로브가 표적 핵산 서열에 혼성화하는 경우 하나 또는 복수의 뉴클레오티드 유사체가 주형 가닥에 순차적으로 첨가되도록 핵산 신장 합성을 수행하는 단계로서, 이로써 a) 뉴클레오티드 유사체는 폴리머라제와 회합하고, b) 뉴클레오티드 유사체는 그 뉴클레오티드 유사체 상의 이탈기가 폴리머라제에 의해 절단되는 경우 폴리머라제에 의해 주형 가닥 상에 혼입되며, 여기서 이탈기는 ATP 재생 효소에 의해 ATP-재생-효소-기질과 조합되어 ATP를 산출하고, 이어서 c) ATP를 발광-효소에 결합시키며, 여기서 발광-기질은 발광-효소에 의해 촉매되어 발광을 생성하면서 각각의 이탈기를 재생시키는 것인 단계; 및
k. 핵산 합성이 일어나고 있는 동안 발광으로부터 광을 검출하는 단계로서, 이로써 광의 검출은 특정한 표적 핵산 서열의 존재를 지시하는 것인 단계.
특정한 실시양태에서, 총-핵산으로부터 포획/프라이머-프로브에 결합되지 않은 물질은 단계 (l)의 신장 반응 혼합물을 제공하기 전에 세척 제거된다.
또한, 하기 단계를 포함하는, 생체분자-함유 샘플에서 미리 선택된 역치 값 초과에서 서로에 결합하는 생체분자의 쌍을 확인하거나 선택하는 방법이 본원에서 제공된다:
a. 서로에 비-공유 결합하는 적어도 한 쌍의 생체분자를 갖는 샘플을 제공하는 단계; 및
b. 미리 선택된 역치 값 초과 또는 미만에서 생체분자의 결합 친화도를 변조하는 2개 이상의 가변적이고 조정가능한 물리적 또는 화학적 조건을 갖는 풍부화 용액에 샘플을 노출시키는 단계로서, 여기서 선택된 가변적이고 조정가능한 조건은 함께 작동하여 미리 선택된 역치 수준보다 더 낮은 결합 친화도를 갖는 생체분자의 쌍을 분리하고, 여기서 결합 친화도는 2개 이상의 조정가능한 조건 중 하나 이상에 의해 변조될 수 있는 것인 단계. 특정한 실시양태에서, 풍부화 용액은 안정하다.
본원에 사용된 용어 "생체분자" 또는 생물학적 분자는 하나 이상의 전형적으로 생물학적인 프로세스, 예컨대 세포 분열, 형태형성, 또는 발생에 필수적인 유기체에 존재하는 분자를 지칭한다. 생체분자는 큰 거대분자 (또는 다가음이온), 예컨대 단백질, 탄수화물, 지질, 및 핵산, 뿐만 아니라 소분자, 예컨대 1차 대사물, 2차 대사물 및 천연 생성물을 포함한다. 이 부류의 물질에 대한 보다 일반적인 명칭은 생물학적 물질이다. 생체분자는 살아 있는 유기체의 중요한 요소이며, 그들 생체분자는 종종 유기체 내에서 생산된 내인성이다. 예시적인 생체분자는, 예를 들어, RNA, DNA, PNA, 합성 올리고, 펩티드, 단백질, 압타머, 유기 소분자 등을 포함한다.
본원에 사용된 어구 "풍부화 용액"은 그의 물리적 및 화학적 조건을 제공하는 다수의 물리적 및 화학적 구성요소를 갖는 전해질 용액을 지칭한다. 특정한 실시양태에서 풍부화 용액은 "안정한 풍부화 용액"이다. 안정한 풍부화 용액은 2개 이상의 가변적이고 조정가능한 물리적 또는 화학적 조건에 대한 미리 선택된 조건 또는 값을 지칭하며, 이는 이들 물리적 또는 화학적 조건이 풍부화 용액에서 확립된 후, 이들이 변경되지 않고, 그 역치 초과의 결합 친화도를 갖고 따라서 동종체 생체분자 쌍 (예를 들어, 그의 동종체 항원에 결합하는 항체; 그의 동종체 수용체에 결합하는 리간드; 및 그의 상보적 가닥에 결합하는 핵산 등)에 결합하는 분자를 선택하는 것을 허용하는 미리 선택된 결합 친화도 역치를 달성하도록 기능하는 것이다.
본원에 사용된 어구 "가변적이고 조정가능한"은 생체분자의 목적하는 쌍 (예를 들어, 그의 동종체 항원에 밴딩하는 항체; 그의 동종체 수용체에 결합하는 리간드; 및 그의 상보적 가닥에 결합하는 핵산 등)에 대한 미리 선택된 결합 친화도 역치를 미세 조정하는 (조정가능한) 각각의 용액에서 상향 (증가된) 또는 하향 (감소된) 조정될 수 있는 물리적 또는 화학적 조건을 지칭한다. 예시적인 "가변적이고 조정가능한" 물리적 및 화학적 조건은, 예를 들어, 온도, pH, 전기장, 이온 강도, 염 농도, 이온 농도, 점도, 전도도, 용해도 등을 포함한다.
본원에 사용된 어구 "결합 친화도"는 서로에 대한 2개의 생체분자의 상대 결합 강도를 지칭한다. 예를 들어, 상보적 핵산의 생체분자 쌍에 대해, 2개의 분자 사이의 상보성이 보다 높을 수록, 결합 친화도는 보다 높을 것이다. 항체/항원 생체분자 쌍에 관하여, KD는 항체 및 그의 항원 사이의 평형 해리 상수, 즉, koff/kon의 비이다. KD 및 친화도는 반비례 관계이다. KD 값은 항체의 농도 (특정한 실험에 필요한 항체의 양), 및 따라서 보다 낮은 KD 값 (보다 낮은 농도) 및 따라서 보다 높은 항체의 친화도와 관련된다. KD 값의 예시적인 범위는 10-4 내지 10-6 (μM 민감도), 10-7 내지 10-9 (nM), 10-10 내지 10-12 (pM), 10-13 내지 10-15 (fM 민감도) 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
한 실시양태에서, 생체분자의 쌍은 동일한 유형의 생체분자 (예를 들어, 핵산의 쌍, 쌍 단백질, 등)일 수 있거나, 또 다른 실시양태에서, 쌍은 2개의 상이한 유형의 생체분자, 예컨대 단백질 및 핵산 쌍, 유기 소분자 및 단백질 쌍 등일 수 있는 둘 다일 수 있다.
특정한 실시양태에서, 조정가능한 조건은 온도, pH, 전기장, 이온 강도, 염 농도, 이온 농도, 점도, 전도도, 및 용해도로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 생체분자는 올리고뉴클레오티드, 단백질, 탄수화물, 항체, 압타머 등의 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 풍부화 용액은 친화도의 미리 선택된 역치 미만의 결합된 생체분자를 분리하는 pH 수준을 갖는 전해질을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "전해질"은 극성 용매, 예컨대 물에 용해되는 경우 전기적으로 전도성 용액을 생성하는 물질을 지칭한다. 용해된 전해질은 양이온 및 음이온으로 분리되며, 이는 용매를 통해 균일하게 분산된다. 전기적으로, 이러한 용액은 중성이다. 전기 포텐셜이 이러한 용액에 인가되는 경우, 용액의 양이온은 전자의 풍부성을 갖는 전극으로 끌려가는 반면, 음이온은 전자의 결핍을 갖는 전극으로 끌려간다. 용액 내에서 반대 방향으로의 음이온 및 양이온의 이동은 전류가 된다.
특정한 실시양태에서, 풍부화 용액에의 노출 후, 샘플은 제2 용액 내로 전달된다. 특정한 실시양태에서, 제2 용액은 풍부화 용액과는 상이한 pH를 갖는 전해질이다. 한 실시양태에서, 제2 용액은 풍부화 용액에의 노출 후 잔류하는 결합된 분자를 검출하는 구성요소를 갖는 용액이다. 다른 실시양태에서, 구성요소는 본원에서 제공된 본 발명 방법에 사용되는 LACES 구성요소를 포함한다. 특정 실시양태에서, 구성요소는 결합된 분자를 검출하는 2차 분자를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 2차 분자는 표지된 생체분자일 수 있다.
본원에 사용된 예시적인 생체분자는, 예를 들어, RNA, DNA, PNA, 합성 올리고, 펩티드, 단백질, 압타머, 유기 소분자 등을 포함한다. 다른 실시양태에서, 표지는 금, 은, 철-산화물, 양자 점, 다른 나노결정, 실리카, 및 plga로 이루어진 군으로부터 선택된 형광 표지 및/또는 나노입자를 포함한다.
본 발명 방법의 다른 실시양태에서, 샘플은 풍부화 용액 및 제2 용액 사이에 1회 초과 사이클링된다. 특정한 실시양태에서, 쌍의 생체분자 중 하나는 표면에 부착된다. 특정한 실시양태에서, 생체분자의 쌍은 상보적 핵산이고; 풍부화 용액은 pH 2 - pH 10; pH 3 - pH 9; pH 4 - pH 8; pH 5 - pH7; pH 2 - pH9; pH 2 - pH8; pH 2 - pH 7; pH 2 - pH6; pH 2 - pH5; pH 3 - pH 10; pH 4 - pH 10; pH 5 - pH 10; pH 6 - pH 10; 및 pH 7 - pH 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 범위의 pH인 가변적이고 조정가능한 조건을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 가변적이고 조정가능한 조건은 1-99, 2-98, 3-95, 4-94, 5-90, 10-85, 15-70, 20-65, 25-60, 30- 50, 10-80,10-70, 10-60, 10-50, 10-40, 10-30, 10-20, 15-90, 15-80, 15-60 , 15-50, 15-40, 15-30, 20-90, 20-80, 20-70, 20-60, 20-50, 20-40 및 20-30℃로 이루어진 군으로부터 선택된 범위의 온도이다.
특정 실시양태에서, 미리 선택된 역치는 5-20, 5-30, 5-40, 5-50, 10-20, 10-30, 10-40, 10-50, 10-60, 10-70, 10-80, 10-90, 10-100, 20-100, 20-90, 20-80, 20-70, 20-60, 20-50, 20-40, 20-30, 5-100, 10-100, 30-100, 40-100, 50-100, 60-100, 70-100, 80-100, 90-100, 15-150, 10-200, 5-300, 20-200, 20-300, 20-400, 20-500, 20-600, 20-700, 20-800, 20-900, 20-1000, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 400, 적어도 500, 적어도 600, 적어도 700, 적어도 800, 적어도 900, 적어도 1000개의 뉴클레오티드 염기로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 염기 길이이다. 특정한 실시양태에서, 미리 선택된 역치는 12개의 염기 쌍의 뉴클레오티드 염기 길이이다.
본 발명 방법의 다른 실시양태에서, 생체분자의 쌍은 리간드 및 그의 동종체 수용체 또는 항체 및 그의 동종체 항원이고; 풍부화 용액은 pH 2 - pH 10; pH 3 - pH 9; pH 4 - pH 8; pH 5- pH7; pH 2 - pH9; pH 2 - pH8; pH 2 - pH 7; pH 2 - pH6; pH 2 - pH5; pH 3 - pH 10; pH 4 - pH 10; pH 5 - pH 10; pH 6 - pH 10; 및 pH 7 - pH 10으로부터 선택된 범위의 pH인 가변적이고 조정가능한 조건을 포함한다. 다른 실시양태에서, 가변적이고 조정가능한 조건은 1-99, 2-98, 3-95, 4-94, 5-90, 10-85, 15-70, 20-65, 25-60, 30- 50, 10-80,10-70, 10-60, 10-50, 10-40, 10-30, 10-20, 15-90, 15-80, 15-60 , 15-50, 15-40, 15-30, 20-90, 20-80, 20-70, 20-60, 20-50, 20-40, 및 20-30℃로 이루어진 군으로부터 선택된 범위의 온도이다. 청구항 92. 미리 선택된 역치가 10-4 내지 10-6 (μM 민감도), 10-7 내지 10-9 (nM), 10-10 내지 10-12 (pM), 및 10-13 내지 10-15 (fM 민감도)로 이루어진 군으로부터 선택된 KD 값으로 표현되는 결합 친화도인 청구항 90 내지 91의 방법.
또한, 미리 선택된 역치 값 초과 또는 미만에서 생체분자의 결합 친화도를 변조하는 2개 이상의 가변적이고 조정가능한 물리적 또는 화학적 조건을 포함하는 풍부화 용액으로서, 여기서 가변적이고 조정가능한 조건은 서로에 비-공유 결합하는 생체분자의 쌍을 분리하도록 선택되며, 여기서 생체분자의 쌍의 결합 친화도는 미리 선택된 역치 값 초과 또는 미만이며, 여기서 결합 친화도는 2개 이상의 조정가능한 조건 중 하나 이상에 의해 변조되는 것인 풍부화 용액이 본원에서 제공된다.
미세유체 칩 & 장치
또한, 장치 내에 본원에서 제공된 각각의 본 발명 DeTaiL 프로세스 (예를 들어, DIAL, TEEM 및 LACES)를 통합하고, 샘플 수집의 시간으로부터 신속한 현장 진료 결과를 생성하는 병원체 (예를 들어, SARS-CoV-2 바이러스 등)의 검출을 위한 휴대용 기기-기반 진단 시스템이 본원에서 제공된다. 특정한 실시양태에서, 신속한 현장 진료 결과는 30, 25, 20, 25, 20, 15, 10, 5분으로부터 선택된 시간 미만에 일어난다. 특정한 실시양태에서, 신속한 결과는 5분 미만에 일어난다. 본 발명 플랫폼은 본원에서 제공된 본 발명 LACE 및 TEEM 방법을 현재 이용가능한 구성요소와 함께 포함하여 금 표준 임상 및 중앙 실험실 결과를 갖는 필적하는 결과를 달성하는 낮은 시스템 복잡성을 갖는 사용자-친화성 휴대용 장치와 함께, 샘플 제조, 풍부화, 강력한 돌파구 신호 증폭 검정의 강력하고 유려한 조합을 생성한다.
본원에서 제공된 본 발명 전자적 변조 (TEEM) 및 신호 증폭 기반 발광 검출 기술 (LACE)을 사용하여, 본 발명 장치 및/또는 시스템은 금 표준 특이성 및 민감도 성능을 생성하는 핵산, 예컨대 예를 들어 바이러스 RNA를 검출할 수 있다. 본 발명 장치는 그 내에 모든 필요한 시약을 포함하고, 중요하게는, 교차 오염을 방지하는 폐기물용 밀봉된 저장소를 갖는 단일-사용 카트리지 (도 20 참조)를 이용하고, 소모품 단일-사용 카트리지가 시스템 내로 삽입되면 임의의 추가의 작동자 관련 없이, 인간 핵산-함유 샘플, 예컨대 현재 표준 비인두 스왑 뿐만 아니라 구강인두 및 비강 스왑 등을 직접적으로 프로세싱한다.
본 발명 시스템 및 장치 플랫폼은 현재 주류 방법에 비해 하기 이점을 제공한다:
· 통합된, 단일-챔버 캐스케이드 샘플 정제, 표적 풍부화, 신호 증폭-기반 발광 검출 반응,
· 전자적 변조 및 신호 증폭 기반 발광 검출에 의한 신속한 샘플 제조 및 풍부화, 및
· 오염 제어에 대한 최소 필요를 요구하는 모든 폐쇄형 시스템.
따라서, 특정한 실시양태에서, 표적-핵산을 검출하기 위한 본 발명 방법을 채용하는 사용하기 위한 본 발명 단일-사용-카트리지 장치 기기 (예를 들어, 도 20에 나타내어진 단일-사용-카트리지)이며, (i) 샘플, 검출 및 프로세싱 시약, 예를 들어 프로브, 세척 용액 등을 저장하고 이를 어레이에 전달하기 위한 유체공학 시스템; (ii) 어레이를 보유하거나 포함하고, 유통 및 전기 포텐셜 (전압) 제어 능력을 갖는 반응 유체 챔버, 또는 유동 셀; 및 (iii) 조명 및 검출 시스템 (예를 들어, 도 20에 나타내어진 휴대용 장치와 조합으로 단일-사용-카트리지)을 포함하는 기기가 본원에서 제공된다. 한 실시양태에서, 유체 챔버 또는 유동 셀은 전압을 변조하는 능력을 갖는 전압 제어 서브시스템을 갖는다.
본원에 사용된 "단일-사용 카트리지"는 그 안에 본 발명 TEEM 및 LACES 방법을 수행하기 위한 구성요소 및 시약을 함유하고; 따라서 조사되고 있는 표적-핵산의 존재 또는 부재를 허용하는 미세유체 구조이다. 단일-사용 카트리지는 임의의 칩, 유체 칩, 칩 장치, 기재, 또는 본원에 기재된 어레이 등일 수 있다.
또한, 핵산 쇄 신장을 위한 표준 샘플 제조 및 검출 플랫폼과 호환가능할 수 있는 본 발명 방법을 수행하기 위한 유체 칩 장치가 본원에서 제공된다. 한 실시양태에서, 유체 칩 장치는 그 위에 적어도 제1 금속 전극을 갖는 저장소 또는 유체 챔버를 함유할 수 있다. 전극의 상이한 높이 (예를 들어, 전극 사이의 거리) 및 기하구조는 확산 층 및 전기 이중 층의 최대 효율 및 조작을 위해 사용될 수 있다. 유체 칩 장치는 이러한 표준 플랫폼에 포함되어 전극에서 인가된 전압을 제공할 수 있는 전기적 신호 공급원 (예를 들어, 기능 발전기)과 전기적으로 인터페이싱될 수 있다.
칩 장치는 본 발명 TEEM 방법을 위한 전하의 변조를 실행하도록 작동될 수 있다. 예를 들어, 변성을 위해, 낮은 pH 및/또는 높은 pH가, 예를 들어, 전극 배치 및/또는 전극 상의 인가된 전기적 신호에 기반하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 어닐링 및 변성을 위해, 상이한 pH 수준이 생성될 수 있다. 상이한 챔버 높이는 표적-핵산이 샘플로부터 풍부화되고 단리될 수 있는 속도에 영향을 미치도록 유체 챔버에서 구성될 수 있다. 장치는 입구 및 출구 포트 또는 영역을 포함할 수 있다. 포획-프로브 및 포획/프라이머-프로브 올리고뉴클레오티드는 전극 표면에 부착될 수 있는 반면, 반응 용액은 전극에 인가된 전압이 변조되는 동안 변하지 않고 유지될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명 쇄 신장 검출 방법을 수행하기 위한 유체 칩 장치는, 예를 들어, 연속적 또는 간헐적 유속을 포함하는 전해 유체를 운반하도록 구조화된 채널, 또는 복수의 채널을 갖는 전기적으로 절연성인 기재를 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 시스템에서 적합한 칩은 능동 칩을 포함한다. 보다 특히, 본 발명의 통합된 바이오칩 시스템에서 적어도 하나의 칩은 능동 칩이다. 능동 칩은 에너지가, 예를 들어, 전력 공급으로부터 그들에 공급되는 경우 물리적 힘을 생성할 수 있는 마이크로-스케일 구조를 포함하는 칩이다. 따라서, 본 발명의 방법에 사용되는 인가된 물리적 힘은 에너지 공급원 (때때로 "신호 공급원"으로 지칭됨), 예를 들어, 전압 등, 및 에너지를 본 발명에 유용한 힘의 유형으로 전환시킬 수 있는 구조를 요구한다. 따라서, 능동 칩은 적어도 부분적으로 본 발명의 방법에 사용되는 물리적 힘의 공급원을 공급하는 칩으로서 기재된다. 인가된 에너지를 본 발명에 유용한 힘의 유형으로 전환시킬 수 있는 마이크로-스케일 구조는 비제한적 예로서, 전기영동 및 유전영동 힘을 생성하기 위한 전극, 전자기 또는 자기영동 또는 자기 힘을 생성하기 위한 전자기 유닛, 및 음향 힘을 생성하기 위한 압전 변환기일 수 있다. 이들이 포함하는 마이크로스케일 구조의 유형에 따라, 이들은, 예를 들어, 전기영동 또는 유전영동 칩 (전극을 포함함), 전자기 칩 (전자기 유닛을 포함함) 또는 음향 칩 (압전 변환기를 포함함)으로 지칭될 수 있다. 칩은 또한 광학 소자, 미세-모세관 또는 팁, 가열 소자 (예를 들어, 금속 와이어), 펠티에(Peltier) 소자, 마이크로-밸브, 또는 마이크로-펌프를 포함할 수 있다.
능동 칩은 칩 표면 상으로 또는 내로 물리적 힘 소자를 수립함으로써 (예를 들어, 전자기 유닛, 압전 변환기, 또는 전극), 또는 칩의 표면 상으로 기능적 층, 예컨대, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 어레이 또는 단백질 어레이를 적용하여 예를 들어, 수동 칩을 제조함으로써, 또는 둘 다의 조합에 의해 구축될 수 있다. 본 발명의 수동 또는 능동 칩 상에 제공될 수 있는 다른 물질은 핵산 분자; 효소, 촉매, 또는 기재 (검출에 사용되는 효소, 촉매, 및 기재를 포함하나 이에 제한되지는 않음); 절연층, 또는 칩 표면에의 하나 이상의 샘플 구성요소의 비특이적 결합 또는 상호작용을 방지하기 위해 제공되는 물질의 코팅 또는 층을 포함하는 시약; 복합체; 및 심지어 바이러스 및 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는 특이적 결합 구성원을 포함한다. 이들 물질은 임의로 본 발명의 시스템의 칩의 웰 또는 채널에 제공될 수 있다. 칩 표면 (칩 상의 마이크로-스케일 구조를 포함함)과의 하나 이상의 샘플 구성요소의 비특이적 또는 비바람직한 상호작용을 방지하기 위한 코팅 또는 층으로서 사용될 수 있는 물질은 칩의 "상부 층"을 형성할 수 있고, 중합체, 화합물, 예컨대 이산화규소, 계면활성제, 또는 생체분자, 예컨대 BSA의 얇은 (100 옹스트롬 미만) 층일 수 있다.
능동 칩의 예는 유리 기재 상의 유전영동 전극 어레이 (예를 들어, 문헌 [Dielectrophoretic Manipulation of Particles by Wang et al., in IEEE Transaction on Industry Applications, Vol. 33, No. 3, May/June, 1997, pages 660-669"]), 미세제작된 생체전자공학 칩 상의 개별적으로 어드레스가능한 전극 어레이 (예를 들어, 문헌 [Preparation and Hybridization Analysis of DNA/RNA from E. coli on Microfabricated Bioelectronic Chips by Cheng et al., Nature Biotechnology, Vol. 16, 1998, pages 541-546]), 모세관 전기영동 칩 (예를 들어, 문헌 [Combination of Sample-Preconcentration and Capillary Electrophoresis On-Chip by Lichtenberg, et al., in Micro Total Analysis Systems 2000 edited by A. van den Berg et al., pages 307-310]), 미국 특허 번호 6,029,518에 개시된 음향 힘 칩을 포함하나 이에 제한되지는 않으며; 이의 각각은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
통상적인 및 진행파 유전영동에 사용되는 칩을 포함하는 유전영동 칩에 대해, 칩 상의 전극은 임의의 형상, 예컨대 직사각형, 벌집형, 삼각형, 원형 등의 것일 수 있다. 전극은 다양한 패턴, 예를 들어, 나선형, 평행, 깍지형, 다항식 등으로 배열될 수 있다. 전극 어레이는 관련 기술분야에 공지된 방법, 예를 들어, 전기도금, 스퍼터링, 포토리소그래피 또는 에칭에 의해 칩 상에 제작될 수 있다. 전극을 포함하는 칩의 예는 유리 기재 상의 유전영동 전극 어레이 (예를 들어, 문헌 [Dielectrophoretic Manipulation of Particles by Wang et al., in IEEE Transaction on Industry Applications, Vol. 33, No. 3, May/June, 1997, pages 660-669]), 미세제작된 생체전자공학 칩 상의 개별적으로 어드레스가능한 전극 어레이 (예를 들어, 문헌 [Preparation and Hybridization Analysis of DNA/RNA from E. coli on Microfabricated Bioelectronic Chips by Cheng et al., Nature Biotechnology, Vol. 16, 1998, pages 541-546]), 및 모세관 전기영동 칩 (예를 들어, 문헌 [Combination of Sample-Preconcentration and Capillary Electrophoresis On-Chip by Lichtenberg, et al., in Micro Total Analysis Systems 2000 edited by A. van den Berg et al., pages 307-310])을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 한 실시양태에서, 통합된 바이오칩 시스템은 단일 칩을 포함한다. 이 측면에서, 단일-칩 통합된 바이오칩 시스템은 적어도 2개의 순차적 작업 (예를 들어, 적어도 TEEM 및 LACES 또는 적어도 DIAL 및 TEEM; 또는 DIAL, TEEM 및 LACES)을 수행할 수 있는 능동 칩을 포함한다. 바람직하게는, 단일-칩 시스템의 능동 칩은 적어도 2개의 순차적 작업, 예를 들어, 유전영동 및 전기장의 변조 등을 수행하는 상이한 기능적 요소를 포함한다. 하나 초과의 기능을 수행하는 칩은 하나 이상의 상이한 기능적 요소의 조합, 예컨대, 예를 들어, 특이적 결합 구성원, 기재, 시약, 또는 적어도 부분적으로 칩 상에서 수행되는 프로세스 또는 작업에 사용되는 물리적 힘의 하나 이상의 공급원을 제공하는 마이크로-스케일 구조를 포함하는 상이한 유형의 마이크로-스케일 구조를 가질 수 있다. 본 발명의 시스템이 상이한 기능적 요소를 갖는 칩을 포함하는 실시양태에서, 상이한 기능적 요소를 갖는 칩의 영역은 샘플 구성요소가 상이한 기능적 요소 중에서 자유롭게 및 용이하게 확산가능하도록, 가깝게 근접할 수 있다. 다른 실시양태에서, 상이한 기능적 요소는 서로와 적어도 부분적으로 산재된다. 대안적으로, 다중 힘 칩에서, 상이한 기능적 요소는, 특정한 상이한 물리적 힘-생성 요소에서, 서로에 관하여 수직으로 배향된 상이한 구조적으로 연결된 기재에서 제공될 수 있다.
도 26에 도시된 특정한 실시양태에서, 마이크로프로세싱 유닛; 스텝퍼 모터 및 전기 작동기; 및 광학 검출기를 포함하는 필드 기기가 본원에서 제공된다. 마이크로프로세싱 유닛은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 임의의 수의 규격품 구성요소를 포함할 수 있다. 광학 검출기는 보통의 CCD/CMOS 기반 검출기 시스템일 수 있다. 광학 경로는 특정 실시양태에서, 짧은 광학 경로이다.
본 발명의 키트
본원에 기재된 방법의 상업화에서, 본 발명의 포획-프로브 및/또는 포획/프라이머-프로브 어레이의 구축을 위한 및 다양한 적용을 위해 이를 사용하기 위한 특정 키트는 특히 유용하다. 일반적으로, 본 발명의 키트는 본원에 기재된 바와 같은 임의의 올리고뉴클레오티드/프로브 어레이 및/또는 본원에서 제공된 본 발명 방법을 수행하기 위한 이러한 포획-프로브-어레이 또는 칩을 생성하고/거나 사용하기 위한 시약 및 분자를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 포획-프로브 어레이를 구축하기 위한 키트는 부착된 포획-프로브 올리고뉴클레오티드를 갖는 표면을 갖는 지지체, 조사되고 있는 특정한 표적-핵산 (예를 들어, SARS-COV2 서열)에 대한 인식 서열을 갖는 포획-프로브를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이러한 키트는 이러한 표적-핵산과의 쇄 신장 반응을 수행하기 위한 시약을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 시약은 폴리머라제, 리버스 트랜스크립타제 (도 15, 제3 패널), dNTP, 프라이머, 완충제 등을 포함한다.
본 발명의 표적-핵산-검출-어레이의 적용을 위한 키트는 표적-뉴클레오티드 서열의 존재를 결정하기 위한 키트 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 키트는 전형적으로 표면을 갖는 적어도 하나의 지지체 및 본 발명의 포획-프로브 어레이를 구축하는데 또는 그로 본 발명 LACES 또는 TEEM 방법을 수행하는데 필요한 또는 유용한 1종 이상의 시약을 포함한다. 이러한 시약은 제한 없이 핵산 프라이머, 프로브, 어댑터, 효소 (예를 들어, 폴리머라제) 등을 포함하고, 상업적 유통에 적합한 패키지, 예컨대 제한 없이 박스, 밀봉된 파우치, 블리스터 팩 및 상자에서 용기, 예컨대 제한 없이 바이알, 튜브 또는 보틀에 각각 패키징된다. 패키지는 전형적으로 패키징된 물질의 사용을 지시하는 표지 또는 패키징 삽입물을 함유한다. 본원에 사용된 "패키징 물질"은 제한 없이 용기, 바이알, 튜브, 보틀, 파우치, 블리스터 패키징, 표지, 태그, 지시서 쉬트 및 패키지 삽입물을 포함하는 키트에서의 시약의 분포를 위한 패키징에 사용되는 임의의 물품을 포함한다.
이러한 키트의 특정한 실시양태에서, 표면은 별개의 영역의 어레이를 갖는 평면 표면일 수 있다. 별개의 영역은 부착된 포획 프로브를 가질 수 있으며, 어댑터는 연쇄체가 포획 올리고뉴클레오티드 및 어댑터 올리고뉴클레오티드의 상보적 영역 사이의 복합체의 형성에 의해 별개의 영역에 부착될 수 있도록, 포획 올리고뉴클레오티드에 상보적인 영역을 각각 가질 수 있다.
실시예
실시예 1 - 발광-기반 표적 핵산 검출
혼입된 dNTP로부터 방출되면, 피로포스페이트 (PPi)는 ATP 술푸릴라제와 상호작용하며, 이는 피로포스페이트를 아데노신 5'-포스포술페이트 (APS)에 결합시켜 ATP를 산출한다 (도 1B 및 1C).
상기 생성된 ATP (ATP)는 기질로서 루시페린을 사용하는 반딧불이 루시페라제에 결합하는데 사용된다 (도 1C). 보조인자로서 작용하는 ATP (ATP)로, 반딧불이 루시페라제는 루시페린을 촉매한다 (도 1C; 및 도 2, 도 3 및 도 10). 효소적 촉매작용의 결과로서, 루시페린은 옥시루시페린으로 전환되고, 발광은 또한 생성된다 (도 1C). 반응의 부산물로서, 아데노신 모노포스페이트 및 PPi가 생성된다. 이는 발광의 이산 및 제한된 기간 동안 검출가능한 발광 방출을 발생시킨다 (도 1C). 따라서, DNA 폴리머라제와 상호작용하는 dNTP의 결과로서, 발광 광은 발광-효소 및 발광-기질에 의해 생성된 발광 반응에 의해 생성된 발광 시 생성된다. 각각의 발광 광은 광 소실 전에 검출된다.
이 dNTP 혼입 프로세스는 표적 핵산 서열이 검출되고/거나 목적하는 핵산 쇄 신장-길이가 달성된 때까지 반복된다.
실시예 2 - 발광 생성에 영향을 미치는 파라미터
실시예 2A - ATP 술푸릴라제, 반딧불이 루시페라제, 및 발광-기질 - dGTP-쿠마린의 다양한 각각의 농도의 효과
이 반응에서, 4개의 염기 (dATP, dGTP, dTTP, dCTP)의 혼합물에 의해 형성된 20 bp 영역의 출발 서열을 제외하고 모두 시토신 염기로 구성된 300 bp 단일-가닥 DNA 주형을 생성하였다. 주형 DNA에 추가로, 반응은 출발 서열에 상보적인 프라이머 올리고뉴클레오티드, dGTP-쿠마린, ATP 술푸릴라제, 아데노신 5'-포스포술페이트, 반딧불이 루시페라제 (발광-효소로서), 및 루시페린 (발광-기질로서)을 함유하였다. ATP 술푸릴라제, 반딧불이 루시페라제, 및 발광-기질, dGTP-쿠마린의 다양한 각각의 농도의 효과는 각각 도 4-6에 나타내어진다. 도 4-6에서 볼 수 있는 바와 같이, dGTP-쿠마린 (말단 포스페이트에서 쿠마린에 의해 표지된 dGTP임)으로 출발하여, 본원에 이용된 폴리머라제-ATP 술푸릴라제-반딧불이 루시페라제의 이 연결된 3-효소 시스템은 최종 단계에서 발광을 생성하는 것으로 밝혀졌다.
실시예 2B - ATP 술푸릴라제 및 APS를 루시페라제 반응에 첨가하는 것의 효과
서열 혼합물의 하기 시약을 이 실험에 사용하였다:
10x TAE 완충제 17.5 uL
루시페라제 (1M 트리스 중 5 mg/ml) (1:50) 17.5uL--------- 250ng 시그마
Cyc-Luc(10mg/mL) (1xTAE 중 1:10) 35 uL----------- 5ug 이엠디 밀리포어
ATP (100mM) (1:5k) 35 uL------------------------------- 1.2 uM 시그마
CoA (10mM) (1:20) 35 uL----------------------------------- 2mM 시그마
MgCl2 (10mM) = (rxn당 2.5 uL)-------------------------------- 1mM NEB
PPase 1x(=희석 없음) (200 U/mL) = 0.5 uL---------------- 0.1 U 시그마
ASulf (300 U/mL) = 0.5 uL--------------------------------- 0.15 U NEB
APS (10mM) = 1 uL-------------------------------------- 377 uM 시그마
형광 신호 수준에 대한 ATP 술푸릴라제/루시페라제 신호 증폭 루프의 효과를 연구하기 위해, ATP술푸릴라제-루시페라제 커플 단독을 관찰할 수 있다. 반응을 750ng의 루시페라제, 5μg의 Cyc-Luc 루시페린, 1.2 μM의 ATP, 2mM의 조효소 A, 1mM MgCl2, 0.15 단위의 ATP 술푸릴라제, 377 μM의 APS를 갖는 1X TAE 완충제에서 수행하였다. 피로포스파타제의 변동은 0.1, 0.005 및 0.002 단위 양에 상응한다. 루시페라제, ATP, 조효소 A, 피로포스파타제 및 APS는 시그마로부터 얻었다. ATP 술푸릴라제 및 MgCl2는 NEB로부터 얻었다.
처음에 피로포스파타제 및 MgCl2를 384-웰 마이크로플레이트에서 관련된 웰 내로 분배시켰다. 이어서 완충제, 루시페라제 및 조효소 A의 마스터믹스를 제조하고, 혼합하고, 관련된 웰 내로 동등한 양으로 분배시켰다. 이어서 Cyc-Luc 루시페린을 각각의 웰에 첨가하고, 마지막으로 ATP를 각각의 웰에 첨가하였다. 이어서 플레이트를 15초 동안 진탕한 후, 측정을 플루오스타 옵티마(FLUOstar Optima) 플레이트 판독기로부터 취하였다.
이 실시예에서, 기질로서 루시페린을 사용하는 루시페라제 반응 단독에 상응하는 표준 반응은 도 7에서 실선 플롯으로서 나타내어진다. 도 7에서, 실선 플롯은 규칙적인 루시페라제 반응로부터 예상된 바와 같은 발광 신호의 상승 및 붕괴를 나타낸다. 시간 3000초에서, ATP-술푸릴라제 및 APS를 표준 반응에 첨가하였으며, 도 7에서 볼 수 있는 바와 같이, 이는 ATP 술푸릴라제/루시페라제 신호 증폭 루프를 시작하였고, 신호의 증폭을 유발하였다 (도 7, 3000초에서 시작하는 실선 플롯 참조). 이들 결과는 본 발명 핵산 표적 서열 검출 방법에 의해 생성된 발광 신호가 ATP 재생 효소 (이 실시예에서 ATP 술푸릴라제) 및 그의 동종체 ATP 재생 효소 기질 (이 실시예에서 APS)의 첨가에 의해 증폭될 수 있으며, 이는 ATP 술푸릴라제/루시페라제 신호 증폭 루프를 개시함을 지시한다.
표준 반응과 유사한 3가지 다른 반응을 수행하였으며, 여기서 무기 피로포스페이트의 다양한 상대 희석을 1X의 MgCl2와 함께, 0.02X (1:50 희석), 0.05X (1:20 희석) 및 1X (희석 없음)의 피로포스파타제 1X의 양으로 첨가하였다. 도 7에서 보여진 바와 같이, 루프 신호는 무기 피로포스파타제 (0.02X Ppase 점선 플롯 및 0.05X Ppase 파선 플롯)의 첨가로 감소된다. 무기 피로포스파타제의 보다 높은 농도에서, 루프는 완전히 감소된다 (1X Ppase 파선 플롯). 이는 ATP 술푸릴라제/루시페라제 신호 증폭 루프에 의해 증폭된 발광 신호의 수준이 PPi의 연속적이고 반복된 생성으로부터 초래되며, 이는 피로포스파타제에 의해 없어질 수 있음을 지시한다.
실시예 2C - 발광 신호에 대한 조효소 A를 ATP 술푸릴라제/루시페라제 신호 증폭 루프 반응에 첨가하는 것의 효과
발광 신호 수준에 대한 조효소 A를 ATP 술푸릴라제/루시페라제 신호 증폭 루프에 첨가하는 것의 효과를 실시예 2B에서와 같은 표준 루시페라제 반응을 실행함으로써 연구하였다. 반응을 750ng의 루시페라제, 5μg의 Cyc-Luc 루시페린, 1.2 μM의 ATP, 2mM의 조효소 A, 1mM MgCl2 0.15 단위의 ATP 술푸릴라제, 200 μM의 APS를 갖는 1X TAE 완충제에서 수행하였다. 루시페라제, ATP, 조효소 A, 및 APS는 시그마로부터 얻었다. ATP 술푸릴라제 및 MgCl2는 NEB로부터 얻었다. 처음에 ATP 술푸릴라제, APS, 조효소 A 및 MgCl2를 384-웰 마이크로플레이트에서 관련된 웰 내로 분배시켰다. 이어서 완충제, 루시페라제 및 Cyc-Luc 루시페린의 마스터믹스를 제조하고, 혼합하고, 관련된 웰 내로 동등한 양으로 분배시켰다. 이어서 ATP를 각각의 웰에 첨가하였다. 이어서 플레이트를 15초 동안 진탕한 후, 측정을 플루오스타 옵티마 플레이트 판독기로부터 취하였다.
루시페라제, 루시페린 및 ATP를 함유하는 표준 루시페라제 반응의 발광 방출의 결과는 도 8의 어두운 실선 플롯에 나타내어진다. 도 8에서, 어두운 실선 플롯은 규칙적인 루시페라제 반응으로부터 예상된 바와 같은 발광 신호의 상승 및 붕괴를 나타낸다. 파선 플롯은 ATP 술푸릴라제 및 APS와의 루시페라제 반응을 나타낸다. 도 8의 밝은 선 플롯은 APS 및 조효소 A와 함께 루시페라제-ATP 술푸릴라제 연쇄물에 대한 사례를 나타낸다. APS 및 조효소 공동-투여의 이 실시예에서, 발광 신호 수준은 훨씬 더 높고, 신호는 보다 더 내구성있다. 이들 결과는 조효소 A가 신호에 대한 양성 효과를 가짐을 지시하며, 이는 루시페라제에 대한 손상을 방지하고, 루시페라제/루시페린 커플을 안정화하며, 그에 의해 루프 효율을 개선시킴으로써 일어나는 것으로 믿어진다.
본 실시양태를 특히 본원의 예시 실시양태를 참고로 나타내고 기재하였지만, 하기 청구범위에 의해 한정되는 바와 같은 본 실시양태의 정신 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 형태 및 상세사항에 있어서 다양한 변화가 그에 이루어질 수 있음이 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해될 것이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 통상적인 실험 이하를 사용하여, 본원에 기재된 구체적인 절차에 대한 다수의 등가물을 인식하거나, 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 본 발명의 범위 내인 것으로 간주되며, 하기 청구범위에 의해 커버된다. 본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 비-특허 문헌 간행물, 특허, 및 특허 출원의 내용은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 그들 특허, 출원 및 다른 문서의 적절한 구성요소, 프로세스, 및 방법은 본 발명 및 그의 실시양태를 위해 선택될 수 있다.

Claims (94)

  1. 하기 단계를 포함하는, 샘플에서 핵산 서열의 존재를 검출하는 방법:
    (i) 폴리머라제 효소, (ii) ATP 재생 효소, (iii) 발광 효소 (예를 들어, 반딧불이 루시페라제), (iv) 주형 핵산 샘플, (v) 특정한 표적 핵산 서열에 혼성화하는 (예를 들어, 그에 상보적인) 프라이머-프로브, 및 (vi) 성장하는 핵산 가닥의 주형 지정된 신장 합성을 수행하기 위한 구성요소를 갖는 폴리머라제-ATP 재생 효소-발광 시약 용액을 포함하는 신장 혼합물을 제공하는 단계로서, 여기서 상기 시약 용액은 ATP-재생-효소-기질, 발광-기질; 및 복수의 유형의 dNTP 또는 뉴클레오티드 유사체를 포함하며, 여기서 뉴클레오티드 유사체의 각각의 유형은 폴리머라제에 의해 절단가능한 이탈기를 가지며, 여기서 이탈기는 주형 가닥에의 각각의 뉴클레오티드 유사체의 폴리머라제-의존적 결합 시 절단되는 것인 단계;
    프라이머-프로브가 표적 핵산 서열에 혼성화하는 경우 하나 또는 복수의 뉴클레오티드 유사체가 주형에 순차적으로 첨가되도록 핵산 신장 합성을 수행하는 단계로서, 이로써 a) 뉴클레오티드 유사체는 폴리머라제와 회합하고, b) 뉴클레오티드 유사체는 그 뉴클레오티드 유사체 상의 이탈기가 폴리머라제에 의해 절단되는 경우 폴리머라제에 의해 주형 가닥 상에 혼입되며, 여기서 이탈기는 ATP 재생 효소에 의해 ATP-재생-효소-기질과 조합되어 ATP를 산출하고, 이어서 c) ATP를 발광-효소에 결합시키며, 여기서 발광-기질은 발광-효소에 의해 촉매되어 발광을 생성하면서 각각의 이탈기를 재생시키는 것인 단계; 및
    핵산 합성이 일어나고 있는 동안 발광으로부터 광을 검출하는 단계로서, 이로써 광의 검출은 특정한 표적 핵산 서열의 존재를 지시하는 것인 단계.
  2. 제1항에 있어서, 이탈기가 피로포스페이트인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 발광-효소가 루시페라제인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 루시페라제가 반딧불이 루시페라제인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 발광-기질이 루시페린인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리머라제 효소가 DNA 폴리머라제 또는 RNA 폴리머라제로부터 선택되는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, ATP 재생 효소가 ATP 술푸릴라제, AGPPase, 및 PPDK로부터 선택되는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, ATP-재생-효소-기질이 APS, ADP-글루코스, 및 AMP + PEP로부터 선택되는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 이탈기가 ATP 술푸릴라제에 의해 APS와; AGPPase에 의해 ADP-글루코스와; 또는 PPDK에 의해 AMP+PEP와 조합되는 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오티드 유사체의 유형이 dATP, dTTP, dGTP, dCTP, dUTP, dGTPαS, dCTPαS, dTTPαS 및 dATPαS를 포함하는 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 프라이머-프로브가 20-100, 20-90, 20-80, 20-70, 20-60, 20-50, 20-40, 20-30, 5-100, 10-100, 30-100, 40-100, 50-100, 60-100, 70-100, 80-100, 90-100, 15-150, 10-200, 5-300, 20-200, 20-300, 20-400, 20-500, 20-600, 20-700, 20-800, 20-900, 20-1000, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 400, 적어도 500, 적어도 600, 적어도 700, 적어도 800, 적어도 900, 적어도 1000개의 뉴클레오티드 염기로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 염기 길이를 갖는 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, ATP 재생 효소/루시페라제 증폭 루프의 신호의 강도를 증가시키는데 유효한 조효소 A 대 루시페라제의 비로 조효소 A를 폴리머라제-ATP 재생 효소-발광 시약 용액에 첨가하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 조효소 A:루시페라제 비가 1:1, 1:2, 1:5, 1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90, 1:100, 1:250, 1:150, 1:175, 1:200, 1:225, 1:250, 1:275, 1:300, 1:350, 1:400, 1:450, 1:500, 1:550, 1:600, 1:650, 1:700, 1:750, 1:800, 1:850, 1:900, 1:950, 1:1000, 1:1500, 1:2000, 1:3000, 1:4000, 1:5000 조효소 A:루시페라제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  14. 제12항에 있어서, 루시페라제:조효소 A 비가 1:1, 1:2, 1:5, 1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90, 1:100, 1:250, 1:150, 1:175, 1:200, 1:225, 1:250, 1:275, 1:300, 1:350, 1:400, 1:450, 1:500, 1:550, 1:600, 1:650, 1:700, 1:750, 1:800, 1:850, 1:900, 1:950, 1:1000, 1:1500, 1:2000, 1:3000, 1:4000, 1:5000 루시페라제:조효소 A로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 폴리머라제 효소가 사용되는 것인 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 폴리머라제 효소가 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 200000, 300000, 400000, 500000, 600000, 700000, 800000, 900000, 및 적어도 1000000개의 폴리머라제 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 양으로 사용되는 것인 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 폴리머라제 효소가 적어도 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 100:1, 150:1, 200:1, 250:1, 300:1, 350:1, 400:1, 450:1, 500:1, 550:1, 600:1, 650:1, 700:1, 750:1, 800:1, 850:1, 900:1, 950:1, 1000:1, 10000:1, 20000:1, 30000:1, 40000:1, 50000:1, 60000:1, 70000:1, 80000:1, 90000:1, 100000:1, 200000:1, 300000:1, 400000:1, 500000:1, 600000:1, 700000:1, 800000:1, 900000:1, 및 적어도 1000000:1로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리머라제 대 주형의 비로 사용되는 것인 방법.
  18. 핵산 신장 합성 반응에서 ATP 재생 효소/루시페라제 증폭 루프의 신호의 강도를 증가시키는 방법으로서, 제1항의 방법을 수행하는 단계; 및 ATP 재생 효소/루시페라제 증폭 루프의 신호의 강도를 증가시키는데 유효한 조효소 A 대 루시페라제의 비로 조효소 A를 시퀀싱 혼합물에 첨가하는 단계를 포함하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 조효소 A:루시페라제 비가 1:1, 1:2, 1:5, 1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90, 1:100, 1:250, 1:150, 1:175, 1:200, 1:225, 1:250, 1:275, 1:300, 1:350, 1:400, 1:450, 1:500, 1:550, 1:600, 1:650, 1:700, 1:750, 1:800, 1:850, 1:900, 1:950, 1:1000, 1:1500, 1:2000, 1:3000, 1:4000, 1:5000 조효소 A:루시페라제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  20. 제18항에 있어서, 루시페라제:조효소 A 비가 1:1, 1:2, 1:5, 1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90, 1:100, 1:250, 1:150, 1:175, 1:200, 1:225, 1:250, 1:275, 1:300, 1:350, 1:400, 1:450, 1:500, 1:550, 1:600, 1:650, 1:700, 1:750, 1:800, 1:850, 1:900, 1:950, 1:1000, 1:1500, 1:2000, 1:3000, 1:4000, 1:5000 루시페라제:조효소 A로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, ATP 재생 효소가 ATP 술푸릴라제인 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 이탈기가 주형 가닥 내로의 dNTP 또는 뉴클레오티드 유사체 혼입 시 형광 표지된 피로포스페이트 (PPi + FL)이도록 형광 표지가 dNTP 또는 뉴클레오티드 유사체의 말단 포스페이트에 부착되고; 형광 신호가 생성된 발광의 결과로서 검출되는 것인 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 켄처 분자가 dNTP 또는 뉴클레오티드 유사체의 염기 또는 당 중 어느 하나에 제거가능하게 또는 비-제거가능하게 부착되는 것인 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 켄처 분자가 형광 표지의 방출 스펙트럼과 중첩하는 흡수 스펙트럼을 갖는 것인 방법.
  25. 하기 단계를 포함하는, 샘플에서 핵산 서열의 존재를 검출하는 방법:
    (i) 폴리머라제 효소, (ii) 주형 핵산 샘플, (iii) 주형 핵산 샘플에 존재할 것으로 의심되는 특정한 표적 핵산 서열에 혼성화하는 프라이머-프로브, 및 (iv) 복수의 유형의 켄칭된 dNTP 또는 켄칭된 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 신장 혼합물을 제공하는 단계로서, 여기서 dNTP 또는 뉴클레오티드 유사체의 각각의 유형은 폴리머라제에 의해 절단가능한 표지된 이탈기를 가지며, 여기서 표지된 이탈기는 주형 가닥에의 각각의 뉴클레오티드 유사체의 폴리머라제-의존적 결합 시 절단되는 것인 단계;
    프라이머-프로브가 조사되고 있는 표적 핵산 서열에 혼성화하는 경우 하나 또는 복수의 dNTP 또는 뉴클레오티드 유사체가 주형에 순차적으로 첨가되도록 핵산 신장 합성을 수행하며; 그에 의해 표지된 이탈기를 절단하는 단계;
    외부 여기 광원을 제공하는 단계; 및
    핵산 합성이 일어나고 있는 동안 표지된 이탈기로부터 방출된 광 (예를 들어, 형광 방출)을 검출하는 단계로서, 이로써 광의 검출은 검정되는/조사되는 주형 핵산 샘플 내의 특정한 표적 핵산 서열의 존재를 지시하는 것인 단계.
  26. 제25항에 있어서, 표지된 이탈기가 형광 표지된 이탈기인 방법.
  27. 하기 단계를 포함하는, 핵산-함유 샘플로부터 표적-핵산을 풍부화하거나 단리하는 방법:
    a. 제1 및 제2 전극을 갖는 유체 챔버에 이온을 함유하는 전해 유체 용액 및 핵산-함유 샘플을 수용하는 단계로서, 여기서 적어도 하나의 전극은 표적-핵산에 상보적인 복수의 포획-프로브가 그에 부착되어 있으며, 여기서 포획 프로브는 전극-용액 계면에 있는 것인 단계;
    b. 어닐링-전압을 전극-용액 계면에 근접하여 전해 유체에 인가하여 계면에 의한 어닐링-pH 수준을 생성하는 단계로서, 여기서 어닐링-pH 수준은 핵산-함유 샘플 내의 핵산 및 포획-프로브 사이의 임의의 수의 상보적 염기 쌍의 어닐링을 유발하는 것인 단계;
    c. 변성-전압을 전극-용액 계면에 근접하여 전해 유체에 인가하여 계면에 의한 변성-pH 수준을 생성하는 단계로서, 여기서 변성-pH 수준은 이중-가닥 포획-프로브보다 더 짧은 이중-가닥 핵산의 변성을 유발하는 것인 단계; 및
    d. 어닐링-전압 및 변성-전압 사이의 전압을 변조하는 단계로서, 여기서 상응하는 pH 수준의 최종 적용 후, 표적-핵산은 전극 상의 포획-프로브에 결합되어 잔류함으로써 핵산-함유 샘플로부터 풍부화되거나 단리되는 것인 단계.
  28. 제27항에 있어서, 표적-핵산이 검출되는 것인 방법.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 표적-핵산이 LACES, 직접 검출, PCR, 롤링 서클 증폭, 라이게이션 및 PCR의 조합, 및 증폭에 이어서 검출 단계, 표지된 프로브, 개재 형광 염료로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의해 검출되는 것인 방법.
  30. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산-함유 샘플로부터 포획-프로브에 결합되지 않은 물질이 검출 전에 세척 제거되는 것인 방법.
  31. 제27항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 표적-핵산이 LACES 방법에 의해 검출되는 것인 방법.
  32. 제27항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, pH 수준이 용액 중의 이온의 이동을 통해 생성되는 것인 방법.
  33. 제27항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 어닐링-전압 및 변성-전압 사이의 전압을 변조하는 것이 0.1 - 1000 Khz (예를 들어, 초당 100 - 1,000,000 사이클)의 범위의 변조 주파수에서 이루어지는 것인 방법.
  34. 제27항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 전극 상의 포획-프로브의 밀도가 cm2당 100 내지 1,000,000개의 올리고뉴클레오티드 프로브인 방법.
  35. 제27항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 변조 단계 동안 변성되는 상보적 염기 쌍의 수가 1-20, 1-15, 1-10, 또는 1-5개의 염기 쌍 이중-가닥의 범위로부터 선택되는 것인 방법.
  36. 제27항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산-함유 샘플이 세포, 타액, 소변, 혈액, 모발, 정액, 타액, 골, 조직, 치아, 세포-용해물, 바이러스, 세포 핵산 또는 게놈 핵산으로부터 선택되는 것인 방법.
  37. 하기 단계를 포함하는, 핵산-함유 샘플에서 표적-핵산 서열의 존재를 검출하는 방법:
    a. 제1 및 제2 전극을 갖는 유체 챔버에 이온을 포함하는 전해 유체 용액 및 핵산-함유 샘플을 수용하는 단계로서, 여기서 적어도 하나의 전극은 표적-핵산에 상보적인 복수의 포획/프라이머-프로브가 그에 부착되어 있으며, 여기서 포획/프라이머-프로브는 전극-용액 계면에 있는 것인 단계;
    b. 어닐링-전압을 전극-용액 계면에 근접하여 전해 유체에 인가하여 계면에 의한 어닐링-pH 수준을 생성하는 단계로서, 여기서 어닐링-pH 수준은 핵산-함유 샘플 내의 핵산 및 포획/프라이머-프로브 사이의 임의의 수의 상보적 염기 쌍의 어닐링을 유발하는 것인 단계;
    c. 변성-전압을 전극-용액 계면에 근접하여 전해 유체에 인가하여 계면에 의한 변성-pH 수준을 생성하는 단계로서, 여기서 변성-pH 수준은 이중-가닥 포획-프로브보다 더 짧은 이중-가닥 핵산의 변성을 유발하는 것인 단계; 및
    d. 어닐링-전압 및 변성-전압을 변조하는 단계로서, 여기서 상응하는 pH 수준의 최종 적용 후, 표적-핵산은 전극 상의 포획/프라이머-프로브에 결합되어 잔류함으로써 핵산-함유 샘플로부터 풍부화되거나 단리되며, 여기서 결합된 표적-핵산은 주형 지정된 신장 합성을 위한 주형 가닥인 단계;
    e. (i) 폴리머라제 효소, (ii) ATP 재생 효소, (iii) 발광 효소 (예를 들어, 반딧불이 루시페라제), 및 (iv) 성장하는 핵산 가닥의 주형 지정된 신장 합성을 수행하기 위한 구성요소를 갖는 폴리머라제-ATP 재생 효소-발광 시약 용액을 포함하는 신장 혼합물을 제공하는 단계로서, 여기서 상기 시약 용액은 ATP-재생-효소-기질, 발광-기질; 및 복수의 유형의 dNTP 또는 뉴클레오티드 유사체를 포함하며, 여기서 뉴클레오티드 유사체의 각각의 유형은 폴리머라제에 의해 절단가능한 이탈기를 가지며, 여기서 이탈기는 주형 가닥에의 각각의 뉴클레오티드 유사체의 폴리머라제-의존적 결합 시 절단되는 것인 단계;
    f. 포획/프라이머-프로브가 표적 핵산 서열에 혼성화하는 경우 하나 또는 복수의 뉴클레오티드 유사체가 주형 가닥에 순차적으로 첨가되도록 핵산 신장 합성을 수행하는 단계로서, 이로써 a) 뉴클레오티드 유사체는 폴리머라제와 회합하고, b) 뉴클레오티드 유사체는 그 뉴클레오티드 유사체 상의 이탈기가 폴리머라제에 의해 절단되는 경우 폴리머라제에 의해 주형 가닥 상에 혼입되며, 여기서 이탈기는 ATP 재생 효소에 의해 ATP-재생-효소-기질과 조합되어 ATP를 산출하고, 이어서 c) ATP를 발광-효소에 결합시키며, 여기서 발광-기질은 발광-효소에 의해 촉매되어 발광을 생성하면서 각각의 이탈기를 재생시키는 것인 단계; 및
    g. 핵산 합성이 일어나고 있는 동안 발광으로부터 광을 검출하는 단계로서, 이로써 광의 검출은 특정한 표적 핵산 서열의 존재를 지시하는 것인 단계.
  38. 제37항에 있어서, 핵산-함유 샘플로부터 포획/프라이머-프로브에 결합되지 않은 물질이 단계 (e)의 신장 반응 혼합물을 제공하기 전에 세척 제거되는 것인 방법.
  39. 하기 단계를 포함하는, 포유동물-세포 샘플로부터 표적-핵산을 풍부화하거나 단리하는 방법:
    a. 제1 및 제2 전극을 갖는 유체 챔버에 이온을 포함하는 전해 유체 및 포유동물-세포 샘플을 수용하는 단계;
    b. 세포를 용해시켜 세포-용해물을 형성하는 단계;
    c. 비대칭 유전체 장을 세포-용해물을 함유하는 용액에 인가하는 단계로서, 여기서 세포-용해물 샘플로부터의 총-핵산은 적어도 하나의 전극에 의해 포획되는 것인 단계;
    d. 유체 챔버로부터 비포획된 세포-용해물을 세척하는 단계;
    e. 유체 챔버에서 이온을 포함하는 전해 유체 용액 내로 총-핵산을 재현탁시키는 단계로서, 여기서 적어도 하나의 전극은 표적-핵산에 상보적인 복수의 포획-프로브가 그에 부착되어 있으며, 여기서 포획 프로브는 전극-용액 계면에 있는 것인 단계;
    f. 어닐링-전압을 전극-용액 계면에 근접하여 전해 유체에 인가하여 전극-용액 계면에 의한 어닐링-pH 수준을 생성하는 단계로서, 여기서 어닐링-pH 수준은 총-핵산 및 포획-프로브 사이의 임의의 수의 상보적 염기 쌍의 어닐링을 유발하는 것인 단계;
    g. 변성-전압을 전극-용액 계면에 근접하여 전해 유체에 인가하여 계면에 의한 변성-pH 수준을 생성하는 단계로서, 여기서 변성-pH 수준은 이중-가닥 포획-프로브보다 더 짧은 이중-가닥 핵산의 변성을 유발하는 것인 단계; 및
    h. 어닐링-전압 및 변성-전압을 변조하는 단계로서, 여기서 상응하는 pH 수준의 최종 적용 후, 표적-핵산은 전극 상의 포획/프라이머-프로브에 결합되어 잔류함으로써 총-핵산으로부터 풍부화되거나 단리되는 것인 단계.
  40. 제39항에 있어서, 총-핵산이 비대칭 유전체 장을 종료시킴으로써 유체 챔버 내로 재현탁되는 것인 방법.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 세포-용해물이 유체 챔버 내의 포유동물 세포-샘플을 용해시킴으로써 얻어지는 것인 방법.
  42. 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 표적-핵산이 검출되는 것인 방법.
  43. 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 표적-핵산이 LACES, 직접 검출, PCR, 롤링 서클 증폭, 라이게이션 및 PCR의 조합, 및 증폭에 이어서 검출 단계, 표지된 프로브, 개재 형광 염료로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의해 검출되는 것인 방법.
  44. 제39항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산-함유 샘플로부터 포획/프라이머-프로브에 결합되지 않은 물질이 검출 전에 세척 제거되는 것인 방법.
  45. 제39항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 표적-핵산이 LACES 방법에 의해 검출되는 것인 방법.
  46. 제39항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물 세포-샘플이 세포, 타액, 소변, 혈액, 모발, 정액, 타액, 골, 조직, 치아, 세포-용해물, 바이러스, 세포 핵산 또는 게놈 핵산으로부터 얻어지는 것인 방법.
  47. 하기 단계를 포함하는, 포유동물-세포 샘플로부터 표적-핵산을 풍부화하거나 단리하는 방법:
    a. 제1 및 제2 전극을 갖는 유체 챔버에 이온을 포함하는 전해 유체 및 포유동물-세포 샘플을 수용하는 단계;
    b. 세포를 용해시켜 세포-용해물을 형성하는 단계;
    c. 비대칭 유전체 장을 세포-용해물을 함유하는 용액에 인가하는 단계로서, 여기서 세포-용해물 샘플로부터의 총-핵산은 적어도 하나의 전극에 의해 포획되는 것인 단계;
    d. 유체 챔버로부터 비포획된 세포-용해물을 세척하는 단계;
    e. 유체 챔버에서 이온을 포함하는 전해 유체 용액 내로 총-핵산을 재현탁시키는 단계로서, 여기서 적어도 하나의 전극은 표적-핵산에 상보적인 복수의 포획-프로브가 그에 부착되어 있으며, 여기서 포획 프로브는 전극-용액 계면에 있는 것인 단계;
    f. 어닐링-전압을 전극-용액 계면에 근접하여 전해 유체에 인가하여 전극-용액 계면에 의한 어닐링-pH 수준을 생성하는 단계로서, 여기서 어닐링-pH 수준은 총-핵산 및 포획-프로브 사이의 임의의 수의 상보적 염기 쌍의 어닐링을 유발하는 것인 단계;
    g. 변성-전압을 전극-용액 계면에 근접하여 전해 유체에 인가하여 계면에 의한 변성-pH 수준을 생성하는 단계로서, 여기서 변성-pH 수준은 이중-가닥 포획-프로브보다 더 짧은 이중-가닥 핵산의 변성을 유발하는 것인 단계; 및
    h. 어닐링-전압 및 변성-전압을 변조하는 단계로서, 여기서 상응하는 pH 수준의 최종 적용 후, 표적-핵산은 전극 상의 포획/프라이머-프로브에 결합되어 잔류함으로써 총-핵산으로부터 풍부화되거나 단리되며, 여기서 결합된 표적-핵산은 주형 지정된 신장 합성을 위한 주형 가닥인 단계;
    i. (i) 폴리머라제 효소, (ii) ATP 재생 효소, (iii) 발광 효소 (예를 들어, 반딧불이 루시페라제), 및 (iv) 성장하는 핵산 가닥의 주형 지정된 신장 합성을 수행하기 위한 구성요소를 갖는 폴리머라제-ATP 재생 효소-발광 시약 용액을 포함하는 신장 혼합물을 제공하는 단계로서, 여기서 상기 시약 용액은 ATP-재생-효소-기질, 발광-기질; 및 복수의 유형의 dNTP 또는 뉴클레오티드 유사체를 포함하며, 여기서 뉴클레오티드 유사체의 각각의 유형은 폴리머라제에 의해 절단가능한 이탈기를 가지며, 여기서 이탈기는 주형 가닥에의 각각의 뉴클레오티드 유사체의 폴리머라제-의존적 결합 시 절단되는 것인 단계;
    j. 포획/프라이머-프로브가 표적 핵산 서열에 혼성화하는 경우 하나 또는 복수의 뉴클레오티드 유사체가 주형 가닥에 순차적으로 첨가되도록 핵산 신장 합성을 수행하는 단계로서, 이로써 a) 뉴클레오티드 유사체는 폴리머라제와 회합하고, b) 뉴클레오티드 유사체는 그 뉴클레오티드 유사체 상의 이탈기가 폴리머라제에 의해 절단되는 경우 폴리머라제에 의해 주형 가닥 상에 혼입되며, 여기서 이탈기는 ATP 재생 효소에 의해 ATP-재생-효소-기질과 조합되어 ATP를 산출하고, 이어서 c) ATP를 발광-효소에 결합시키며, 여기서 발광-기질은 발광-효소에 의해 촉매되어 발광을 생성하면서 각각의 이탈기를 재생시키는 것인 단계; 및
    k. 핵산 합성이 일어나고 있는 동안 발광으로부터 광을 검출하는 단계로서, 이로써 광의 검출은 특정한 표적 핵산 서열의 존재를 지시하는 것인 단계.
  48. 제47항에 있어서, 총-핵산으로부터 포획/프라이머-프로브에 결합되지 않은 물질이 단계 (l)의 신장 반응 혼합물을 제공하기 전에 세척 제거되는 것인 방법.
  49. 하기 단계를 포함하는, 세포-용해물 샘플로부터 표적-핵산을 풍부화하거나 단리하는 방법:
    a. 제1 및 제2 전극을 갖는 유체 챔버에 이온을 포함하는 전해 유체 용액 및 세포-용해물 샘플을 수용하는 단계;
    b. 비대칭 유전체 장을 세포 용해물 샘플을 함유하는 용액에 인가하는 단계로서, 여기서 세포-용해물 샘플로부터의 총-핵산은 적어도 하나의 전극에 의해 포획되는 것인 단계;
    c. 유체 챔버로부터 비포획된 세포-용해물을 세척하는 단계;
    d. 유체 챔버에서 이온을 포함하는 전해 유체 용액 내로 총-핵산을 재현탁시키는 단계로서, 여기서 적어도 하나의 전극은 표적-핵산에 상보적인 복수의 포획-프로브가 그에 부착되어 있으며, 여기서 포획 프로브는 전극-용액 계면에 있는 것인 단계;
    e. 어닐링-전압을 전극-용액 계면에 근접하여 전해 유체에 인가하여 전극-용액 계면에 의한 어닐링-pH 수준을 생성하는 단계로서, 여기서 어닐링-pH 수준은 총-핵산 및 포획-프로브 사이의 임의의 수의 상보적 염기 쌍의 어닐링을 유발하는 것인 단계;
    f. 변성-전압을 전극-용액 계면에 근접하여 전해 유체에 인가하여 계면에 의한 변성-pH 수준을 생성하는 단계로서, 여기서 변성-pH 수준은 이중-가닥 포획-프로브보다 더 짧은 이중-가닥 핵산의 변성을 유발하는 것인 단계; 및
    g. 어닐링-전압 및 변성-전압을 변조하는 단계로서, 여기서 상응하는 pH 수준의 최종 적용 후, 표적-핵산은 전극 상의 포획/프라이머-프로브에 결합되어 잔류함으로써 풍부화되거나 단리되는 것인 단계.
  50. 하기 단계를 포함하는, 핵산-함유 샘플로부터 표적-핵산을 풍부화하거나 단리하는 방법:
    a. 제1 및 제2 전극을 갖는 유체 챔버에 이온을 포함하는 전해 유체 용액 및 핵산-함유 샘플을 수용하는 단계로서, 여기서 적어도 하나의 전극은 표적-핵산에 상보적인 복수의 포획-프로브가 그에 부착되어 있으며, 여기서 포획 프로브는 전극-용액 계면에 있는 것인 단계; 및
    b. 어닐링-전압 및 변성-전압을 교대함으로써 전극-용액 계면에 근접하여 형성된 전기장을 변조하여 전극-용액 계면에 근접하여 전해 유체의 각각의 어닐링-pH 수준 및 변성-pH 수준을 생성하는 단계로서, 여기서 어닐링-pH 수준은 임의의 수의 상보적 염기 쌍의 어닐링을 유발하고; 변성-pH 수준은 1 내지 x-5개의 상보적 염기 쌍; 1 내지 x-10개; 1 내지 x-15개의 상보적 염기 쌍; 1 내지 x-20개의 상보적 염기 쌍; 1 내지 x-25개의 상보적 염기 쌍 상보적 염기 쌍 (여기서 x는 각각의 포획-프로브의 뉴클레오티드 길이임)으로부터 선택된 범위에 상응하는 상보적 염기 쌍의 수를 갖는 이중-가닥 핵산의 변성을 유발하며, 여기서 어닐링-pH 수준의 최종 적용 후, 표적-핵산은 전극 상의 프라이머-프로브에 결합되어 잔류함으로써 핵산-함유 샘플로부터 풍부화되거나 단리되는 것인 단계.
  51. 하기 단계를 포함하는, 핵산-함유 샘플로부터 표적-핵산을 풍부화하거나 단리하는 방법:
    a. 제1 및 제2 전극을 갖는 유체 챔버에 이온을 포함하는 전해 유체 용액 및 핵산-함유 샘플을 수용하는 단계로서, 여기서 적어도 하나의 전극은 표적-핵산에 상보적인 복수의 포획-프로브가 그에 부착되어 있으며, 여기서 포획 프로브는 전극-용액 계면에 있는 것인 단계;
    b. 어닐링-전압을 전극-용액 계면에 근접하여 전해 유체에 인가하여 계면에 의한 어닐링-pH 수준을 생성하는 단계로서, 여기서 어닐링-pH 수준은 핵산-함유 샘플 내의 핵산 및 포획-프로브 사이의 임의의 수의 상보적 염기 쌍의 어닐링을 유발하는 것인 단계;
    c. 변성-전압을 전극-용액 계면에 근접하여 전해 유체에 인가하여 계면에 의한 변성-pH 수준을 생성하는 단계로서, 여기서 변성-pH 수준은 이중-가닥 포획-프로브의 전장보다 더 짧은 특정한 수의 염기 쌍 또는 그보다 더 짧은 특정한 범위의 염기 쌍 중 어느 하나인 포획 프로브 및 표적-핵산의 혼성화된 쌍을 포함하는 이중-가닥 핵산의 변성을 유발하는 것인 단계; 및
    d. 어닐링-전압 및 변성-전압 사이의 전압을 변조하는 단계로서, 여기서 상응하는 pH 수준의 최종 적용 후, 표적-핵산은 전극 상의 포획-프로브에 결합되어 잔류함으로써 핵산-함유 샘플로부터 풍부화되거나 단리되는 것인 단계.
  52. 제51항에 있어서, 표적-핵산이 검출되는 것인 방법.
  53. 제51항 또는 제52항에 있어서, 표적-핵산이 LACES, 직접 검출, PCR, 롤링 서클 증폭, 라이게이션 및 PCR의 조합, 및 증폭에 이어서 검출 단계, 표지된 프로브, 및 개재 형광 염료로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의해 검출되는 것인 방법.
  54. 제51항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산-함유 샘플로부터 포획-프로브에 결합되지 않은 물질이 검출 전에 세척 제거되는 것인 방법.
  55. 제51항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 어닐링-전압 및 변성-전압 사이의 전압을 변조하는 것이 0.1 - 1000 Khz의 범위의 변조 주파수에서 이루어지고,
    pH 수준이 용액 중의 이온의 이동을 통해 생성되고,
    전극 상의 포획-프로브의 밀도가 cm2당 100 내지 1,000,000개의 올리고뉴클레오티드 프로브이고,
    변조 단계 동안 변성되는 상보적 염기 쌍의 수가 1-20, 1-15, 1-10, 또는 1-5개의 염기 쌍 이중-가닥의 범위로부터 선택되고;
    핵산-함유 샘플이 세포, 타액, 소변, 혈액, 모발, 정액, 타액, 골, 조직, 치아, 세포-용해물, 바이러스, 세포 핵산 또는 게놈 핵산으로부터 선택되는 것인
    방법.
  56. 제51항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산-함유 샘플이 세포-용해물의 유전영동에 의해 얻어지는 것인 방법.
  57. 하기 단계를 포함하는, 핵산-함유 샘플에서 표적-핵산 서열의 존재를 검출하는 방법:
    a. 제1 및 제2 전극을 갖는 유체 챔버에 이온을 포함하는 전해 유체 용액 및 핵산-함유 샘플을 수용하는 단계로서, 여기서 적어도 하나의 전극은 표적-핵산에 상보적인 복수의 포획/프라이머-프로브가 그에 부착되어 있으며, 여기서 포획/프라이머-프로브는 전극-용액 계면에 있는 것인 단계;
    b. 어닐링-전압을 전극-용액 계면에 근접하여 전해 유체에 인가하여 계면에 의한 어닐링-pH 수준을 생성하는 단계로서, 여기서 어닐링-pH 수준은 핵산-함유 샘플 내의 핵산 및 포획/프라이머-프로브 사이의 임의의 수의 상보적 염기 쌍의 어닐링을 유발하는 것인 단계;
    c. 변성-전압을 전극-용액 계면에 근접하여 전해 유체에 인가하여 계면에 의한 변성-pH 수준을 생성하는 단계로서, 여기서 변성-pH 수준은 이중-가닥 포획-프로브의 전장보다 더 짧은 특정한 수의 염기 쌍 또는 그보다 더 짧은 특정한 범위의 염기 쌍 중 어느 하나인 포획 프로브 및 표적-핵산의 혼성화된 쌍을 포함하는 이중-가닥 핵산의 변성을 유발하는 것인 단계; 및
    d. 어닐링-전압 및 변성-전압을 변조하는 단계로서, 여기서 상응하는 pH 수준의 최종 적용 후, 표적-핵산은 전극 상의 포획/프라이머-프로브에 결합되어 잔류함으로써 핵산-함유 샘플로부터 풍부화되거나 단리되며, 여기서 결합된 표적-핵산은 주형 지정된 신장 합성을 위한 주형 가닥인 단계;
    e. (i) 폴리머라제 효소, (ii) ATP 재생 효소, (iii) 발광 효소, 및 (iv) 성장하는 핵산 가닥의 주형 지정된 신장 합성을 수행하기 위한 구성요소를 갖는 폴리머라제-ATP 재생 효소-발광 시약 용액을 포함하는 신장 혼합물을 제공하는 단계로서, 여기서 상기 시약 용액은 ATP-재생-효소-기질, 발광-기질; 및 복수의 유형의 dNTP 또는 뉴클레오티드 유사체를 포함하며, 여기서 뉴클레오티드 유사체의 각각의 유형은 폴리머라제에 의해 절단가능한 이탈기를 가지며, 여기서 이탈기는 주형 가닥에의 각각의 뉴클레오티드 유사체의 폴리머라제-의존적 결합 시 절단되는 것인 단계;
    f. 포획/프라이머-프로브가 표적 핵산 서열에 혼성화하는 경우 하나 또는 복수의 뉴클레오티드 유사체가 주형 가닥에 순차적으로 첨가되도록 핵산 신장 합성을 수행하는 단계로서, 이로써 a) 뉴클레오티드 유사체는 폴리머라제와 회합하고, b) 뉴클레오티드 유사체는 그 뉴클레오티드 유사체 상의 이탈기가 폴리머라제에 의해 절단되는 경우 폴리머라제에 의해 주형 가닥 상에 혼입되며, 여기서 이탈기는 ATP 재생 효소에 의해 ATP-재생-효소-기질과 조합되어 ATP를 산출하고, 이어서 c) ATP를 발광-효소에 결합시키며, 여기서 발광-기질은 발광-효소에 의해 촉매되어 발광을 생성하면서 각각의 이탈기를 재생시키는 것인 단계; 및
    g. 핵산 합성이 일어나고 있는 동안 발광으로부터 광을 검출하는 단계로서, 이로써 광의 검출은 특정한 표적 핵산 서열의 존재를 지시하는 것인 단계.
  58. 제57항에 있어서, 표적-핵산이 SARS-COV2인 방법.
  59. 제57항 또는 제58항에 있어서, 핵산-함유 샘플로부터 포획/프라이머-프로브에 결합되지 않은 물질이 단계 (e)의 신장 반응 혼합물을 제공하기 전에 세척 제거되는 것인 방법.
  60. 제57항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 이탈기가 피로포스페이트이고,
    발광-효소가 반딧불이 루시페라제이고,
    발광-기질이 루시페린이고,
    폴리머라제 효소가 DNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제 또는 리버스 트랜스크립타제로부터 선택되고,
    ATP 재생 효소가 ATP 술푸릴라제, AGPPase, 및 PPDK로부터 선택되는 것인
    방법.
  61. 제57항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, ATP-재생-효소-기질이 APS, ADP-글루코스, 및 AMP + PEP로부터 선택되는 것인 방법.
  62. 제57항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 이탈기가 ATP 술푸릴라제에 의해 APS와; AGPPase에 의해 ADP-글루코스와; 또는 PPDK에 의해 AMP+PEP와 조합되는 것인 방법.
  63. 제57항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오티드 유사체의 유형이 dATP, dTTP, dGTP, dCTP, dUTP, dGTPαS, dCTPαS, dTTPαS 및 dATPαS를 포함하는 것인 방법.
  64. 제57항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 프라이머-프로브가 20-100, 20-90, 20-80, 20-70, 20-60, 20-50, 20-40, 20-30, 5-100, 10-100, 30-100, 40-100, 50-100, 60-100, 70-100, 80-100, 90-100, 15-150, 10-200, 5-300, 20-200, 20-300, 20-400, 20-500, 20-600, 20-700, 20-800, 20-900, 20-1000, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 400, 적어도 500, 적어도 600, 적어도 700, 적어도 800, 적어도 900, 적어도 1000개의 뉴클레오티드 염기로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 염기 길이를 갖는 것인 방법.
  65. 제57항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, ATP 재생 효소/루시페라제 증폭 루프의 신호의 강도를 증가시키는데 유효한 조효소 A 대 루시페라제의 비로 조효소 A를 폴리머라제-ATP 재생 효소-발광 시약 용액에 첨가하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  66. 제57항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 폴리머라제 효소가 사용되는 것인 방법.
  67. 제57항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산-함유 샘플이 세포-용해물의 유전영동에 의해 얻어지는 것인 방법.
  68. 표적-핵산을 검출하기 위한 장치로서, (i) 샘플, 검출 및 프로세싱 시약을 저장하고 이를 어레이에 전달하기 위한 유체공학 시스템; (ii) 제1 및 제2 전극을 갖는 반응 유체 챔버로서, 여기서 적어도 하나의 전극은 복수의 포획-프로브가 그에 부착되어 있으며, 상기 유체 챔버는 유통 및 전압 제어 능력을 갖는 것인 반응 유체 챔버; 및 (iii) 조명 및 검출 시스템을 포함하는 장치.
  69. 제68항에 있어서, 유체 챔버가 전압을 변조하는 능력을 갖는 전압 제어 서브시스템을 갖는 것인 장치.
  70. 제68항 또는 제69항에 있어서, 상기 장치가 단일-사용 카트리지이고, 표적-핵산이 SARS-COV2인 장치.
  71. 하기 단계를 포함하는, 생체분자-함유 샘플에서 미리 선택된 역치 값 초과에서 서로에 결합하는 생체분자의 쌍을 확인하는 방법:
    a. 서로에 비-공유 결합하는 적어도 한 쌍의 생체분자를 갖는 샘플을 제공하는 단계; 및
    b. 미리 선택된 역치 값 초과 또는 미만에서 생체분자의 결합 친화도를 변조하는 2개 이상의 가변적이고 조정가능한 물리적 또는 화학적 조건을 갖는 풍부화 용액에 샘플을 노출시키는 단계로서, 여기서 선택된 가변적이고 조정가능한 조건은 함께 작동하여 미리 선택된 역치 수준보다 더 낮은 결합 친화도를 갖는 생체분자의 쌍을 분리하며, 여기서 결합 친화도는 2개 이상의 조정가능한 조건 중 하나 이상에 의해 변조될 수 있는 것인 단계.
  72. 제71항에 있어서, 풍부화 용액이 안정한 것인 방법.
  73. 제71항 또는 제72항에 있어서, 조정가능한 조건이 온도, pH, 전기장, 이온 강도, 염 농도, 이온 농도, 점도, 전도도, 및 용해도로부터 선택되는 것인 방법.
  74. 제71항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 생체분자가 올리고뉴클레오티드, 단백질, 탄수화물, 항체, 압타머 등의 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  75. 제71항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 풍부화 용액이 친화도의 미리 선택된 역치 미만의 결합된 생체분자를 분리하는 pH 수준을 갖는 전해질을 포함하는 것인 방법.
  76. 제71항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 풍부화 용액에의 노출 후, 샘플이 제2 용액 내로 전달되는 것인 방법.
  77. 제75항에 있어서, 제2 용액이 풍부화 용액과는 상이한 pH를 갖는 전해질인 방법.
  78. 제75항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 용액이 풍부화 용액에의 노출 후 잔류하는 결합된 분자를 검출하는 구성요소를 갖는 용액인 방법.
  79. 제7항에 있어서, 구성요소가 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 LACES 구성요소를 포함하는 것인 방법.
  80. 제78항 또는 제79항에 있어서, 구성요소가 결합된 분자를 검출하는 2차 분자를 포함하는 것인 방법.
  81. 제80항에 있어서, 2차 분자가 표지된 생체분자인 방법.
  82. 제81항에 있어서, 생체분자가 RNA, DNA, PNA, 합성 올리고, 펩티드, 단백질, 압타머, 유기 소분자 등을 포함하는 것인 방법.
  83. 제81항 또는 제82항에 있어서, 표지가 금, 은, 철-산화물, 양자 점, 다른 나노결정, 실리카, 및 plga로 이루어진 군으로부터 선택된 형광 표지 및/또는 나노입자를 포함하는 것인 방법.
  84. 제71항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 풍부화 용액 및 제2 용액 사이에 1회 초과 사이클링되는 것인 방법.
  85. 제71항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 쌍의 생체분자 중 하나가 표면에 부착되는 것인 방법.
  86. 제71항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 생체분자의 쌍이 상보적 핵산이고; 풍부화 용액이 pH 2 - pH 10; pH 3 - pH 9; pH 4 - pH 8; pH 5 - pH7; pH 2 - pH9; pH 2 - pH8; pH 2 - pH 7; pH 2 - pH6; pH 2 - pH5; pH 3 - pH 10; pH 4 - pH 10; pH 5 - pH 10; pH 6 - pH 10; 및 pH 7 - pH 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 범위의 pH인 가변적이고 조정가능한 조건을 포함하는 것인 방법.
  87. 제71항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 가변적이고 조정가능한 조건이 1-99, 2-98, 3-95, 4-94, 5-90, 10-85, 15-70, 20-65, 25-60, 30- 50, 10-80,10-70, 10-60, 10-50, 10-40, 10-30, 10-20, 15-90, 15-80, 15-60 , 15-50, 15-40, 15-30, 20-90, 20-80, 20-70, 20-60, 20-50, 20-40, 및 20-30℃로 이루어진 군으로부터 선택된 범위의 온도인 방법.
  88. 제71항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 미리 선택된 역치가 5-20, 5-30, 5-40, 5-50, 10-20, 10-30, 10-40, 10-50, 10-60, 10-70, 10-80, 10-90, 10-100, 20-100, 20-90, 20-80, 20-70, 20-60, 20-50, 20-40, 20-30, 5-100, 10-100, 30-100, 40-100, 50-100, 60-100, 70-100, 80-100, 90-100, 15-150, 10-200, 5-300, 20-200, 20-300, 20-400, 20-500, 20-600, 20-700, 20-800, 20-900, 20-1000, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 400, 적어도 500, 적어도 600, 적어도 700, 적어도 800, 적어도 900, 적어도 1000개의 뉴클레오티드 염기로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 염기 길이인 방법.
  89. 제71항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 미리 선택된 역치가 12개의 염기 쌍의 뉴클레오티드 염기 길이인 방법.
  90. 제71항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 생체분자의 쌍이 리간드 및 그의 동종체 수용체 또는 항체 및 그의 동종체 항원이고; 풍부화 용액이 pH 2 - pH 10; pH 3 - pH 9; pH 4 - pH 8; pH 5 - pH7; pH 2 - pH9; pH 2 - pH8; pH 2 - pH 7; pH 2 - pH6; pH 2 - pH5; pH 3 - pH 10; pH 4 - pH 10; pH 5 - pH 10; pH 6 - pH 10; 및 pH 7 - pH 10으로부터 선택된 범위의 pH인 가변적이고 조정가능한 조건을 포함하는 것인 방법.
  91. 제90항에 있어서, 가변적이고 조정가능한 조건이 1-99, 2-98, 3-95, 4-94, 5-90, 10-85, 15-70, 20-65, 25-60, 30- 50, 10-80,10-70, 10-60, 10-50, 10-40, 10-30, 10-20, 15-90, 15-80, 15-60 , 15-50, 15-40, 15-30, 20-90, 20-80, 20-70, 20-60, 20-50, 20-40, 및 20-30℃로 이루어진 군으로부터 선택된 범위의 온도인 방법.
  92. 제90항 또는 제91항에 있어서, 미리 선택된 역치가 10-4 내지 10-6 (μM 민감도), 10-7 내지 10-9 (nM), 10-10 내지 10-12 (pM), 및 10-13 내지 10-15 (fM 민감도)로 이루어진 군으로부터 선택된 KD 값으로 표현되는 결합 친화도인 방법.
  93. 생체분자의 결합 친화도를 미리 선택된 역치 값 초과 또는 미만에서 변조하는 2개 이상의 가변적이고 조정가능한 물리적 또는 화학적 조건을 포함하는 풍부화 용액으로서, 여기서 가변적이고 조정가능한 조건은 서로에 비-공유 결합하는 생체분자의 쌍을 분리하도록 선택되며, 여기서 생체분자의 쌍의 결합 친화도는 미리 선택된 역치 값 초과 또는 미만이며, 여기서 결합 친화도는 2개 이상의 조정가능한 조건 중 하나 이상에 의해 변조되는 것인 풍부화 용액.
  94. 제52항에 있어서, 표적-핵산이 SARS-COV2인 방법.
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