CN108624685A - 一种abcg2基因多态性检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种ABCG2基因多态性检测试剂盒，所述检测试剂盒包括：底物、检测液、酶系混合液、特异性引物、三磷酸腺苷双磷酸酶和检测板，检测板上设有若干检测样孔，检测液预先封存在检测样孔中，酶系混合液包括DNA聚合酶、ATP硫酸化酶及荧光素酶，特异性引物为待测单链的特异性退火引物，所述SNP位点的待测序列包含在如序列表SEQ ID NO:1所示的序列中，测序的退火引物序列如序列表SEQ ID NO:2所示。本发明中的ABCG2基因多态性检测试剂盒可以适用于市面上所有已出现或在研究中的SNP位点及所有的特异性引物，可以根据需要随时调整试剂盒的检测内容及数量，可操作性强，有大规模的推广价值。

Description

一种ABCG2基因多态性检测试剂盒

技术领域

本发明涉及基因检测领域，尤其涉及单核苷酸多态性的检测系统，具体是指一种ABCG2基因多态性检测试剂盒。

背景技术

SNP单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)的检测技术可分为两个时代，一为凝胶时代，二为高通量时代。凝胶时代的主要技术和方法包括限制性酶切片段长度多态性分析(RFLP)、寡核苷酸连接分析(OLA)、等位基因特异聚合酶链反应分析(AS2PCR)、单链构象多态性分析(SSCP)、变性梯度凝胶电泳分析(DGGE)，虽然这些技术与高通量时代的技术原理大致一样，但是由于它不能进行自动化，只能进行小规模的SNP分型测试，所以必然会被淘汰。高通量时代的SNP分型技术按其技术原理可分为:特异位点杂交(ASH)、特异位点引物延伸(ASPE)、单碱基延伸(SBCE)、特异位点切割(ASC)和特异位点连接(ASL)5种方法。这些技术虽在某种程度上能完成对SNP的检测，但由于它们必须通过凝胶电泳进行检测，因此，距快速、高效、自动化的目标还相差甚远。传统的RFLP只能检测到SNP的一部分，测序技术既费时费力，又不易实现自动化，而且DNA链的二级结构还容易造成人工假相，使测序结果出现偏差，不适宜于SNP的检测；SSCP则很难满足自动化的需要，难以大规模开展工作。因此，这些方法均未被广泛采用。现有的SNP检测有如下方法：

探针法，其中TaqMan探针法的原理为针对一个SNP位点的两种基因型分别设计两条TaqMan探针，两条探针的5’端分别标记两种不同的荧光基团(如FAM和VIC)，3’端都标记一个淬灭荧光基团。PCR扩增过程中，TaqMan探针与对应产物模板在退火时杂交形成适合于核酸外切酶活性的底物，导致探针5’端荧光基团修饰的碱基被切割下来，从而释放荧光信号，所以PCR过程中荧光信号的出现特异指示SNP位点的基因型。探针法还包括一种改进的双杂交探针法，即FRET探针法，其主要特点是针对一个SNP位点设计一对相邻杂交的探针，其中一条探针杂交于SNP位点之上，两条荧光标记探针因荧光能量共振转移原理实现荧光检测，应用这一方法时需要对明确SNP位点信息，针对其特定的序列设计并合成特异性探针。探针法的准确性高，适合于大样本、少位点的检测，但是价格比较贵，合成探针的成本比较高，如果只是做少量样本则探针法性价比很低。

SNPshot法为基于荧光标记单碱基延伸原理的分型技术，也称小测序法，主要针对中等通量的SNP分型项目。在一个含有测序酶，四种荧光标记的ddNTP，紧挨多态位点5’端的不同长度延伸引物和PCR产物模板的反应体系中，引物延伸一个碱基即终止，经ABI测序仪电泳后，根据峰的颜色可知掺入的碱基种类，从而确定该样本的基因型，根据峰移动的胶位置确定该延伸产物对应的SNP位点。对于PCR产物模板可通过多重PCR反应体系来获得。通常用于5--30个SNP位点分析。但SNPshot法所采用的所有试剂及仪器均为进口产品，因此检测成本很高。

质谱法中常用的为Mass Array法，该法是基于Sequenom质谱仪来实现的。首先通过PCR扩增出含有SNP位点的一段DNA(SNP位点前后各50bp左右)，然后用SAP酶去除掉PCR体系中剩余的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)和引物，然后加入一单碱基延伸引物，其3’末端碱基紧挨SNP位点，采用四种ddNTP替代dNTP。这样，探针在SNP位点处仅延伸一个碱基，连接上的ddNTP与SNP位点的等位基因对应。用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)检测延伸产物与未延伸引物间的分子量差异，确定该点处碱基。但该方法的成功率一般，并且缺失数据难以补充，检测设备昂贵，检测成本高。

LDR高温链接酶法通过预制引物，和模板匹配的可以完成连接反应，不匹配的不能完成连接，最后通过毛细管跑胶检测。一个检测反应可以同时检测4--6个SNP位点。检测精准，成本低，大量数据或者少量数据都适用。但该方法对设备要求比较高，需要一代测序仪跑毛细管电泳(capillary electrophoresis)。

近年来已经在晶体上用“光刻法”实现原位合成，直接合成高密度的可控序列寡核苷酸，使DNA芯片法显示出强大威力，对SNP的检测可以自动化、批量化，并已在建立SNP图谱方面投入实际应用。2007年5月份，Affymetrix公司发布了Genome-wide SNP 6.0芯片，除包括90多万个用于单核苷酸多态性(SNP)检测探针外，还有90多万个用于拷贝数变化(CNV)检测的探针，可使全基因组平均分辨率达3kb，既可用于全基因组SNP分析，又可用于CNV分析，真正实现了一种芯片两种用途，方便研究者挖掘基因组序列变异信息。通过基因分型信息还可以鉴别中性拷贝数的杂合性缺失(copy neutral LOH)、单亲二体病(UPD)及嵌合现象(可以精确检测到20％嵌合体)。但是基因芯片的致命缺陷就是仅能针对一个SNP位点进行检测，高通量下也仅是检测数量上的提高，而针对检测方法本身的技术革新却从未有过，针对多个SNP位点的检测，基因芯片无法实现，并且芯片法需要借助配套的大型仪器，无法实现经济、普及的检测。

现有技术中均是针对某一疾病或者某一SNP位点进行的研究与探索，但是其采用的方法依旧是上述检测方法中的一种或几种，这样的方法不仅需要消耗大量的时间和金钱，花费实验者大量的时间，对设备及实验条件有很高的要求，而且能够检测的位点个数非常有限，一次检测几十个位点所需要的成本是巨大的，但日益增长的检测需要迫使本领域需要创造性的研发一种能够简易高效地检测SNP的快速检测试剂盒。

ABC转运体蛋白超家族G亚家族第2个成员ABCG2编码产生乳腺癌耐药蛋白(BCRP)，BCRP的功能是依赖ATP的外排泵，广泛分布具有分泌和排泄功能的正常组织的细胞浆膜，参与血脑屏障和胎血屏障等，因此在机体的防御机制中发挥重要作用。同时，BCRP在药物的吸收、分布和排泄过程中起着非常重要的作用，肠道细胞表达的BCRP通过将从肠腔进入细胞的药物泵回肠腔来调节药物的吸收。已知的BCRP特异性底物药包括米托蒽醌、蒽环类抗生素等抗肿瘤药物以及羟甲基戊二酰辅酶A(HMC-CoA)还原酶抑制剂等。编码BCRP的ABCG2存在广泛的遗传多态性，目前在不同种族人群中发现的单核苷酸多态已经超过50种。其中ABCG2 421在亚洲人群中最为常见，与肾细胞癌、前列腺癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)等疾病的发生与预后相关，因此快速检测该位点在临床上使用及检测具有重要的实际意义。

发明内容

本发明的目的是克服了上述现有技术的缺点，提供了一种能够快速检测ABCG2基因多态性的ABCG2基因多态性检测试剂盒。

为了实现上述目的，本发明的ABCG2基因多态性检测试剂盒所述检测试剂盒检测基因多态性位点，包括：底物、检测液、酶系混合液、特异性引物、三磷酸腺苷双磷酸酶和检测板，检测板上设有若干检测样孔，检测液预先封存在检测样孔中，酶系混合液包括DNA聚合酶、ATP硫酸化酶及荧光素酶，特异性引物为待测单链的特异性退火引物，所述SNP位点的待测序列包含在如序列表SEQ ID NO:1所示的序列中，测序的退火引物序列如序列表SEQID NO:2所示。

该方法中由于酶系不包括三磷酸腺苷双磷酸酶，故发光后的光基团及剩余的底物ddNTP不会被消耗，发光在至少30min之内不会淬灭，检测后会出现发光值不变和发光值叠加两种结论，叠加后的光强增加，便于在微量的反应体系中检测到该发光值，增加了结论的准确度，进一步地也降低了原始检测片段的加入量；而ddNTP的特性保证了加入的底物在进行了SNP位点的特异性结合后不会是的DNA碱基链继续延伸从而产生发光影响结果的准确性。

在重复配对发光值叠加后，为了保证检测的准确性，可以在检测孔中加入三磷酸腺苷双磷酸酶，消耗检测样孔中的残余ddNTP后再进行加样检测。如需进行单独出峰式的传统检测图，可将三磷酸腺苷双磷酸酶加入酶系混合液中，或在发光后加入三磷酸腺苷双磷酸酶。

优选的，底物中含ddNTPs和0.8mmol/L D-荧光素。

优选的，检测液包括0.1mol/L Tris-醋酸(pH7.7)，2mmol/L EDTA，10mmol/L醋酸镁，0.1％BSA，1mmol/L二硫苏糖醇(DTT)，2μmol/L APS，0.4g/L PVP。

优选的，酶系混合液中包括200U/L ATPsulfurylase，18U/mL Klenow和6mg/L荧光素酶。

优选的，三磷酸腺苷双磷酸酶包括3.2U/mL Apyrase。

本发明中的酶系混合液可单独存放或在生产时封存在检测样孔中，封存了酶系混合液的检测板需要按照酶系要求存放。

优选的，本试剂盒检测的待测样品均为已提取的单链DNA片段。

检测板上设有若干重复的检测样孔，检测样孔可以单独或成组使用。检测样孔的孔径为2～3mm，深度为4～10mm。

采用本发明试剂盒的SNP检测方法包括：

a.将与SNP片段特异性结合的特异性引物预加入至检测样孔中；

b.将已进行单链分离的待测SNP片段加入预加入上述检测样孔中；

c.加入过量酶系及底物，反应后检测，读取数据；

d.加入另一种底物，反应后检测，读取数据；

e.重复步骤c或d，至四种底物全部反应完成，绘制发光曲线。

优选地，步骤c具体为：

c1.加入DNA聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、荧光素酶及一种ddNTP，反应后检测发光值，读取数据。

进一步优选地，发光值为持续不断的，30min内不淬灭的荧光发光值。

作为一种优选的实施方式，步骤c还可以具体为：

c2.加入DNA聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶及ddNTP，反应后检测发光值，读取数据。

进一步地，发光值为反应完全后淬灭的、不持续的发光峰值。

上述发明内容中的试剂盒均为通用性试剂盒，可根据待测片段加入任何市售或文献记载的特异性引物，也可自行设计特异性退火引物加入检测样孔中。

优选的，检测样孔多孔为一组进行检测，检测时分别在各孔中对应加入一种固定的ddNTP，发光的孔对应的ddNTP即为检测结果。一般由于同时加入四种ddNTP，因此一般检测样孔为四孔一组。

本发明的另一个目的在于提供一种SNP位点的检测方式，所述检测方式采用对应SNP位点试剂盒进行检测与诊断。本发明中ABCG2基因多态性的检测方法，即采用ABCG2基因多态性检测试剂盒对ABCG2基因多态性进行检测。

本发明中的ABCG2基因多态性检测试剂盒中检测样孔体积小，可以有效地减少待测样品和整个反应体系的体积，使得取样及扩增过程的所需体积都可以得到的减少，检测样孔中预加入有特异性引物，底物也可预加入至其中，检测过程简便结果清晰，且发光值可以在一定时间内稳定持续发光，便于操作及检测，可以针对绝大多数的SNP位点快速检测出结果，准确率高。本发明中的ABCG2基因多态性检测试剂盒可以适用于市面上所有已出现或在研究中的SNP位点及所有的特异性引物，可以根据需要随时调整试剂盒的检测内容及数量，可操作性强，有大规模的推广价值。

附图说明

图1为本发明的ABCG2基因多态性检测试剂盒检测结果示意图。

具体实施方式

为了能够更清楚地描述本发明的技术内容，下面结合具体实施例来进行进一步的描述。

本发明的ABCG2基因多态性检测试剂盒包括：底物、检测液、酶系混合液、特异性引物、三磷酸腺苷双磷酸酶和检测板，其中底物包括ddNTP和荧光素，检测液预加入在检测板上的检测样孔中，酶系包括DNA聚合酶、ATP硫酸化酶及荧光素酶，酶系在存放条件允许的情况下也可以预加入至检测样孔中，特异性引物为待测片段的特异性退火引物。

具体的，底物中含ddNTPs和0.8mmol/L D-荧光素；

检测板为多孔板，多孔板上设有多干检测样孔，检测样孔径为2～3mm，深度为4～10mm。

检测液包括0.1mol/L Tris-醋酸(pH7.7)，2mmol/L EDTA，10mmol/L醋酸镁，0.1％BSA，1mmol/L二硫苏糖醇(DTT)，2μmol/L APS，0.4g/L PVP；

除检测板外，试剂盒还包括酶系混合液和三磷酸腺苷双磷酸酶，酶系混合液中包括200U/L ATPsulfurylase，18U/mL Klenow和6mg/L荧光素酶；三磷酸腺苷双磷酸酶包括3.2U/mL Apyrase。

实施例1

本实施例采用ABCG2的基因多态性检测试剂盒检测ABCG2的SNP：421C＞A，ABCG2421的rs号为2231142，序列长1101bp，SNP位点位于第501位，错配类型为A/C错配，具体序列如序列表SEQ ID NO:1所示，其中M表示ABCG2的SNP位点，划线部分为退火引物结合位置，SEQ ID NO:1序列具体如下：

TTCTTAATTTCTCATAGACACTTATGTGAAAAGGCAGGGAGAATCTGGAATATGGCCCTT

GTAAGGACAGTGATACCAATTCTAGTTTTTGTATCATTTCTAAAATGATACATACTACTG

TTATCCTTTTTTGCCTTTCCTTCACCTTTCTTTTCCCCTAGCTTAGAAAGATATTTTGGC

AAATCCTTGTATGAAGCAGTTTGGAAATGTCTGCTGGTAGTTAACATAATTACTTGCATT

CTATTTGGGTGTACAGATAGGGGGTGAAAAATGATTATAGCAGGCTTTGCAGACATCTAT

GGAGTTAACTGTCATTTGCAGAACTGCAGGTTCATCATTAGCTAGAACTTTACCTTAGTT

ATGTTATCTTTGTGGATTATGTTATGTATACTAAACAGTCATGGTCTTAGAAAAGACTCA

TTATCATTATGTCTCATTAAAATGCTATTTGCCTTAAGGATGATGTTGTGATGGGCACTC

TGACGGTGAGAGAAAACTTA

M

AGTTCTCAGCAGCTCTTCGGCTTGCAACAACTATGACGAATCATGAAAAAAACGAACGGA

TTAACAGGGTCATTCAAGAGTTAGGTCTGGATAAAGTGGCAGACTCCAAGGTAATGTGGA

AAAACTGAAAGCATCATGATCAGCATAAGTAGGACTTTCCCTGTGTGGATAAAATGACTC

TGATTCAGAAGTTTCCTGTAATGTGTATGGTCAAAAATGGTTGCTTTCCATAACAATGAG

AAAAGTGGCTTGTTACATAATATGAACGTGGAAATTAACCTGGAAAAAAAATCTTCACAT

TGGTTGAATTCTGCACCTGAAGTGAGGCAATGTGGTGTTGTACGTGAAAGTGTTCATCAC

CTGGCCTTTCCTTATGCTCCTCCCCCACCTCATGGTTTAAGTCACGTCTCATTCCGTGTC

TGCACTAACTTTTCTTCTTCCTCTTTTTCTCTTCCTCCTTTTAGTCACTCTTCCTCCAAG

GGACTTTGTTCCATTGCTAT

对上述片段进行扩增后，对扩增产物进行焦磷酸测序，测序步骤入下：

一、单链分离

采用武汉菲思特生物科技有限公司研发生产的单链分离器对扩增产物进行单链分离，分离过程如下：

1)结合：将45μL扩增产物双链DNA(已提纯)与3μL亲和连接体共同加入单链分离器中，使亲和连接体与双链DNA充分结合；

2)碱解：在结合后的混合液中加入NaOH碱解液，解开DNA双螺旋，解开后的一条单链DNA上带有亲和连接体，另一条单链为其互补链；

3)双链分离：12000rpm离心1min分离，带有亲和连接体的单链被截留在膜上，互补链穿膜后留在滤液中；

4)单链收集：调pH值至中性后收集单链DNA，供检测试剂盒检测使用。

二、SNP位点测序

检测孔中的特异性退火引物为ABCG2的特异性引物，引物序列如序列表SEQ IDNO：2所示：5'TTATGTCTCATTAAAATGCTAT 3'。

取分离后的单链DNA 50μL加入检测样孔中，加入特异性引物、酶系混合液放入焦磷酸测序仪中进行检测，检测时四种底物依次加入，检测发光。

当发光值达到3～4倍强度时，加入三磷酸腺苷双磷酸酶，消耗多余的ddNTP，荧光淬灭后可继续加入底物进行检测，重复操作至得到碱基序列。

图1为本实施例中SNP位点附近的碱基检测结果，测得碱基序列为“ACTTACA”其中SNP位点的碱基为“C”，加入第一个T时发光值达到2倍，再加入“T”后发光未增强。

实施例2

本实施例与实施例1的不同在于，本实施例中以四个检测样孔为一组进行检测，检测时，同时在四个样孔中各加入一种ddNTP，且加入种类固定，加入后同时观察四个样孔的发光情况，综合四个样孔的发光情况，绘制发光曲线图。

当四个样孔有一个的发光值达到四倍高度时，在四个孔中同时加入三磷酸腺苷双磷酸酶，消耗样孔内原有ddNTP后再进行检测。

实施例1和2为基础，本发明中的检测板可以单独或成组使用，检测时可适当增加空白对照或平行样孔。具体的检测条件以焦磷酸测序仪的说明书为准。

在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。

序列表

<110> 新开源弗莱（武汉）生物科技有限公司

<120> 一种ABCG2基因多态性检测试剂盒

<130> 2017

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1001

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> gene

<222> (1)..(1001)

<223> ABCG2基因序列

<400> 1

ttcttaattt ctcatagaca cttatgtgaa aaggcaggga gaatctggaa tatggccctt 60

gtaaggacag tgataccaat tctagttttt gtatcatttc taaaatgata catactactg 120

ttatcctttt ttgcctttcc ttcacctttc ttttccccta gcttagaaag atattttggc 180

aaatccttgt atgaagcagt ttggaaatgt ctgctggtag ttaacataat tacttgcatt 240

ctatttgggt gtacagatag ggggtgaaaa atgattatag caggctttgc agacatctat 300

ggagttaact gtcatttgca gaactgcagg ttcatcatta gctagaactt taccttagtt 360

atgttatctt tgtggattat gttatgtata ctaaacagtc atggtcttag aaaagactca 420

ttatcattat gtctcattaa aatgctattt gccttaagga tgatgttgtg atgggcactc 480

tgacggtgag agaaaactta magttctcag cagctcttcg gcttgcaaca actatgacga 540

atcatgaaaa aaacgaacgg attaacaggg tcattcaaga gttaggtctg gataaagtgg 600

cagactccaa ggtaatgtgg aaaaactgaa agcatcatga tcagcataag taggactttc 660

cctgtgtgga taaaatgact ctgattcaga agtttcctgt aatgtgtatg gtcaaaaatg 720

gttgctttcc ataacaatga gaaaagtggc ttgttacata atatgaacgt ggaaattaac 780

ctggaaaaaa aatcttcaca ttggttgaat tctgcacctg aagtgaggca atgtggtgtt 840

gtacgtgaaa gtgttcatca cctggccttt ccttatgctc ctcccccacc tcatggttta 900

agtcacgtct cattccgtgt ctgcactaac ttttcttctt cctctttttc tcttcctcct 960

tttagtcact cttcctccaa gggactttgt tccattgcta t 1001

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(22)

<223> ABCG2基因退火引物

<400> 2

ttatgtctca ttaaaatgct at 22

Claims (10)

1.一种ABCG2基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括：底物、检测液、酶系混合液、特异性引物、三磷酸腺苷双磷酸酶和检测板，检测板上设有若干检测样孔，检测液预先封存在检测样孔中，酶系混合液包括DNA聚合酶、ATP硫酸化酶及荧光素酶，特异性引物为待测单链的特异性退火引物，所述SNP位点的待测序列包含在如序列表SEQ IDNO:1所示的序列中，测序的退火引物序列如序列表SEQ ID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述的ABCG2基因多态性检测试剂盒，其特征在于：底物中包括ddNTPs和0.8mmol/L D-荧光素。

3.根据权利要求1所述的ABCG2基因多态性检测试剂盒，其特征在于：酶系混合液中包括200U/L ATPsulfurylase，18U/mL Klenow和6mg/L荧光素酶。

4.根据权利要求1所述的ABCG2基因多态性检测试剂盒，其特征在于：三磷酸腺苷双磷酸酶包括3.2U/mL Apyrase。

5.根据权利要求1所述的ABCG2基因多态性检测试剂盒，其特征在于：检测样孔的孔径为2～3mm，深度为4～10mm。

6.根据权利要求1所述的ABCG2基因多态性检测试剂盒，其特征在于：所述检测样孔中逐次加入ddNTP至发光。

7.根据权利要求1所述的ABCG2基因多态性检测试剂盒，其特征在于：检测样孔以四孔为一组，在四孔中同时各加入一种ddNTP，观察发光。

8.根据权利要求1所述的ABCG2基因多态性检测试剂盒，其特征在于：酶系混合液和/或特异性引物预先封存在检测样孔内。

9.根据权利要求1所述的ABCG2基因多态性检测试剂盒，其特征在于：检测样孔发光后，在样孔内加入三磷酸腺苷双磷酸酶，发光值淬灭。

10.一种ABCG2基因多态性的检测方法，其特征在于，采用如权利要求1～9任一项所述的ABCG2基因多态性检测试剂盒对ABCG2基因多态性进行检测。