KR20230151913A - 항-igsf1 항체 및 항-pd-1 항체를 포함하는 암 치료용 약학 조성물 - Google Patents
항-igsf1 항체 및 항-pd-1 항체를 포함하는 암 치료용 약학 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 항-IGSF1 항체 및 항-PD-1 항체를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 항-IGSF1 항체는 IGSF1에 높은 특이성과 높은 결합력을 나타냈다. 상기 항-IGSF1 항체는 IGSF1이 과발현된 인간 폐암 세포를 이식한 인간화 마우스의 종양 성장을 억제시키고, 종양 조직 내 사이토카인의 발현을 증가시켰다. 또한, 상기 항-IGSF1 항체 및 항-PD-1 항체를 마우스 대장암 세포주가 이식된 종양 모델 마우스에 병용 투여할 경우, 항-IGSF1 항체 또는 항-PD-1 항체의 단독 투여와 비교하여 월등한 종양 성장 억제 활성을 나타냈다. 따라서, 항-IGSF1 항체 및 항-PD-1 항체를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 암 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 IGSF1에 특이적으로 결합하는 항-IGSF1 항체 또는 이의 단편 및 항-PD-1 항체를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
암의 치료에 있어 항암제와 같은 화학적 치료 용법은 어느 정도 효과를 거두고 있으나, 암의 다양한 발병 기전과 항암제 내성으로 인하여 많은 연구가 요구되고 있다. 최근 수십년간 진단과 치료 기술의 발달로 암 치료율이 향상되었으나, 많은 진행성 암에 있어서 5년 생존율은 5 내지 50%에 머무르고 있다. 또한, 일부 암에 있어서는 다양한 연구와 치료에도 불구하고 지난 20년간의 생존율이 크게 변하지 못한 상태이다. 특히, 암은 종래의 암 치료 요법에 의해 쉽게 치료되지 못하고 재발이 일어나고 있으며 다른 부위로의 전이가 일어나므로, 보다 본질적인 치료 방법이 요구되고 있는 실정이다. 이에, 암의 악성화, 전이 및 재발의 원인으로 판단되는 암 세포의 특징이 되는 바이오마커를 타겟으로 암을 치료하기 위한 물질 개발에 관심이 높아지고 있다.
한편, 대한민국 공개공보 제2016-0014564호에서는 IGSF1(immunoglobulin superfamily member 1) 유전자가 MET(mesenchymal-epithelial transition factor) 저해제에 대한 감수성 예측용 바이오마커로 사용할 수 있다는 점을 개시하고 있다. 상기 문헌에서는, 암 환자를 치료하기 전에 상기 바이오마커를 이용하여 환자 개개인의 감수성을 판정함으로써 치료 효과가 높은 항암제를 선택할 수 있음을 개시하고 있다.
최근 키트루다(Keytruda®)와 같은 면역관문 억제제가 각광을 받고 있다. 면역관문 억제제는 우리 몸의 면역계를 활성화시켜 암 세포를 공격하도록 도움을 주는 항암제이다. 키트루다와 같은 항-PD-1 항체는 T 세포의 특정 수용체(PD-1)에 결합하여 암세포가 활동성 T 세포의 감시 체계를 피하는 경로를 차단하여, 인체 내 T 세포가 암세포를 공격할 수 있게 함으로써 항암 효과를 나타내게 된다(대한민국 공개공보 제2018-0030580호). 현재까지 암 치료는 암세포의 특징인 빠르게 분열하는 세포를 죽이는데 초점을 맞추었기 때문에, 암세포뿐만 아니라 정상 세포 중 빠르게 분열하는 세포에도 작용하여 부작용이 나타났다. 그러나, 면역항암제는 암 환자의 면역체계를 활용해 암세포에 영향을 주므로 기존 항암제의 전형적인 부작용이 거의 없다고 알려져 있다.
이에, 본 발명자들은 암을 효과적으로 치료하기 위한 치료제를 개발하기 위해 연구한 결과, IGSF1의 C 말단에 특이적으로 결합하는 항-IGSF1 항체 및 항-PD-1 항체를 함께 사용하였을 시, 뛰어난 항암 효과를 나타낸다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 목적 달성을 위해, 본 발명의 일 측면은, IGSF1의 C 말단에 특이적으로 결합하는 항-IGSF1 항체 또는 이의 단편 및 항-PD-1 항체를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 항-IGSF1 항체는 IGSF1에 높은 특이성과 높은 결합력을 나타냈다. 본 발명에 따른 항-IGSF1 항체는 IGSF1이 과발현된 폐암 세포 스페로이드와 인간 말초 단핵세포를 공동 배양 시, 스페로이드 내의 면역세포의 침윤을 증가시켰다. 또한, 본 발명에 따른 항-IGSF1 항체는 IGSF1이 과발현된 인간 폐암 세포를 이식한 인간화 마우스의 종양 성장을 억제시키고, 종양 조직 내 사이토카인의 발현을 증가시켰다. 상기 결과를 통해 항-IGSF1 항체는 IGSF1 발현이 증가된 폐암 조직 내로 면역세포의 침윤 및 면역반응을 증가시킴으로써 종양 성장을 억제시킬 수 있음을 확인하였다. 뿐만 아니라, 상기 항-IGSF1 항체 및 항-PD-1 항체를 마우스 대장암 세포주가 이식된 종양 모델 마우스에 병용 투여할 경우, 항-IGSF1 항체 또는 항-PD-1 항체의 단독 투여와 비교하여 월등한 종양 성장 억제 활성을 나타냈다. 따라서, 항-IGSF1 항체 및 항-PD-1 항체를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 암 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 IGSF1 과발현 인간 폐암 세포(NCI-H292 IGSF1 O/E) 및 대조군(NCI-H292 MOCK)에서 IGSF1 발현량을 웨스턴 블롯 및 RT-PCR을 통해 확인한 도면이다.
도 2는 IGSF1 과발현 인간 폐암 세포(NCI-H292 IGSF1 O/E) 및 대조군(NCI-H292 MOCK) 스페로이드와 인간 말초 단핵세포(PBMC)를 공동 배양 시, 스페로이드 내에 존재하는 종양 침윤 림프구(TIL)를 확인한 도면이다.
도 3은 IGSF1 과발현 인간 폐암 세포(NCI-H292 IGSF1 O/E) 또는 대조군(NCI-H292 MOCK)을 이식한 마우스의 종양 조직에서 종양 침윤 림프구의 존재를 확인하기 위하여, hCD45+ 세포의 분포 정도를 유세포 분석을 통해 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 IGSF1 과발현 인간 폐암 세포(NCI-H292 IGSF1 O/E) 또는 대조군(NCI-H292 MOCK)을 이식한 마우스의 종양 조직에서 IGSF1의 발현 및 종양 침윤 림프구의 존재를 면역조직화학염색법(immunohistochemistry)으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 IGSF1 항원에 대한 WM-A1-3389 항체의 결합 친화도를 ELISA를 이용하여 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 세포 내 IGSF1 항원에 대한 WM-A1-3389 항체의 결합 친화도를 FACS 분석을 이용하여 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 IGSF1 과발현 인간 폐암 세포(NCI-H292 IGSF1 O/E) 및 대조군(NCI-H292 MOCK)에서 세포에서 발현되는 IGSF1에 대한 WM-A1-3389 항체의 결합력을 FACS 분석을 이용하여 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 2종의 IGSF1 과발현 인간 폐암 세포(NCI-H292 IGSF1 O/E 및 HEK293E IGSF1 O/E) 및 대조군(NCI-H292 MOCK 및 HEK293E MOCK)에 shIGSF1을 처리한 IGSF1 녹다운(K/D) 세포주에서 WM-A1-3389 항체의 결합 특이성을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 IGSF1 과발현 인간 폐암 세포(NCI-H292 IGSF1 O/E) 스페로이드와 인간 말초 단핵세포(PBMC)를 공동 배양 시, IgG 또는 WM-A1-3389 항체 처리 후 스페로이드 내에 존재하는 종양 침윤 림프구(TIL)를 현미경 이미지를 통해 확인한 도면이다.
도 10은 IGSF1 과발현 인간 폐암 세포(NCI-H292 IGSF1 O/E) 및 대조군(NCI-H292 MOCK) 스페로이드와 인간 말초 단핵세포(PBMC)를 공동 배양 시, IgG 또는 WM-A1-3389 항체 처리 후 스페로이드 내의 HMGB1의 발현을 나타낸 그래프이다.
도 11은 IGSF1 과발현 인간 폐암 세포(NCI-H292 IGSF1 O/E)를 이식한 마우스 모델에서 IgG 또는 WM-A1-3389 항체 투여군의 종양 크기를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 12는 IGSF1 과발현 인간 폐암 세포(NCI-H292 IGSF1 O/E)를 이식한 마우스 모델에서 IgG 또는 WM-A1-3389 항체 투여군의 개체별 종양 크기를 나타낸 그래프이다.
도 13은 코카서스 인종(caucasian) 폐암 환자 조직에서 IGSF1의 발현 정도를 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 14는 마우스 유래 대장암 세포주(MC38)를 이식한 마우스 모델에서 WM-A1-3389 항체 투여군, 항-PD-1 항체 투여군 또는 WM-A1-3389 항체 및 항-PD-1 항체 병용 투여군의 종양 크기를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 15는 마우스 유래 대장암 세포주(CT26)를 이식한 마우스 모델에서 WM-A1-3389 항체 투여군, 항-PD-1 항체 투여군 또는 WM-A1-3389 항체 및 항-PD-1 항체 병용 투여군의 종양 크기를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 16은 마우스 유래 폐암 세포주(LLC1)를 이식한 마우스 모델에서 WM-A1-3389 항체 투여군, 항-PD-1 항체 투여군 또는 WM-A1-3389 항체 및 항-PD-1 항체 병용 투여군의 종양 크기를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 IGSF1 과발현 인간 폐암 세포(NCI-H292 IGSF1 O/E) 및 대조군(NCI-H292 MOCK) 스페로이드와 인간 말초 단핵세포(PBMC)를 공동 배양 시, 스페로이드 내에 존재하는 종양 침윤 림프구(TIL)를 확인한 도면이다.
도 3은 IGSF1 과발현 인간 폐암 세포(NCI-H292 IGSF1 O/E) 또는 대조군(NCI-H292 MOCK)을 이식한 마우스의 종양 조직에서 종양 침윤 림프구의 존재를 확인하기 위하여, hCD45+ 세포의 분포 정도를 유세포 분석을 통해 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 IGSF1 과발현 인간 폐암 세포(NCI-H292 IGSF1 O/E) 또는 대조군(NCI-H292 MOCK)을 이식한 마우스의 종양 조직에서 IGSF1의 발현 및 종양 침윤 림프구의 존재를 면역조직화학염색법(immunohistochemistry)으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 IGSF1 항원에 대한 WM-A1-3389 항체의 결합 친화도를 ELISA를 이용하여 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 세포 내 IGSF1 항원에 대한 WM-A1-3389 항체의 결합 친화도를 FACS 분석을 이용하여 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 IGSF1 과발현 인간 폐암 세포(NCI-H292 IGSF1 O/E) 및 대조군(NCI-H292 MOCK)에서 세포에서 발현되는 IGSF1에 대한 WM-A1-3389 항체의 결합력을 FACS 분석을 이용하여 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 2종의 IGSF1 과발현 인간 폐암 세포(NCI-H292 IGSF1 O/E 및 HEK293E IGSF1 O/E) 및 대조군(NCI-H292 MOCK 및 HEK293E MOCK)에 shIGSF1을 처리한 IGSF1 녹다운(K/D) 세포주에서 WM-A1-3389 항체의 결합 특이성을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 IGSF1 과발현 인간 폐암 세포(NCI-H292 IGSF1 O/E) 스페로이드와 인간 말초 단핵세포(PBMC)를 공동 배양 시, IgG 또는 WM-A1-3389 항체 처리 후 스페로이드 내에 존재하는 종양 침윤 림프구(TIL)를 현미경 이미지를 통해 확인한 도면이다.
도 10은 IGSF1 과발현 인간 폐암 세포(NCI-H292 IGSF1 O/E) 및 대조군(NCI-H292 MOCK) 스페로이드와 인간 말초 단핵세포(PBMC)를 공동 배양 시, IgG 또는 WM-A1-3389 항체 처리 후 스페로이드 내의 HMGB1의 발현을 나타낸 그래프이다.
도 11은 IGSF1 과발현 인간 폐암 세포(NCI-H292 IGSF1 O/E)를 이식한 마우스 모델에서 IgG 또는 WM-A1-3389 항체 투여군의 종양 크기를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 12는 IGSF1 과발현 인간 폐암 세포(NCI-H292 IGSF1 O/E)를 이식한 마우스 모델에서 IgG 또는 WM-A1-3389 항체 투여군의 개체별 종양 크기를 나타낸 그래프이다.
도 13은 코카서스 인종(caucasian) 폐암 환자 조직에서 IGSF1의 발현 정도를 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 14는 마우스 유래 대장암 세포주(MC38)를 이식한 마우스 모델에서 WM-A1-3389 항체 투여군, 항-PD-1 항체 투여군 또는 WM-A1-3389 항체 및 항-PD-1 항체 병용 투여군의 종양 크기를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 15는 마우스 유래 대장암 세포주(CT26)를 이식한 마우스 모델에서 WM-A1-3389 항체 투여군, 항-PD-1 항체 투여군 또는 WM-A1-3389 항체 및 항-PD-1 항체 병용 투여군의 종양 크기를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 16은 마우스 유래 폐암 세포주(LLC1)를 이식한 마우스 모델에서 WM-A1-3389 항체 투여군, 항-PD-1 항체 투여군 또는 WM-A1-3389 항체 및 항-PD-1 항체 병용 투여군의 종양 크기를 측정하여 나타낸 그래프이다.
본 발명의 일 측면은, IGSF1의 C 말단에 특이적으로 결합하는 항-IGSF1 항체 또는 이의 단편 및 항-PD-1 항체를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
항-PD-1 항체
본 명세서에서 사용된 용어, "PD-1(programmed cell death protein 1)"은 CD279로 지칭되며, 활성화된 T 세포의 표면에 발현되는 단백질이다. 암세포 표면에 있는 단백질인 PD-L1(B7-H1) 및 PD-L2(B7-DC)와 반응하여 TCR(T cell receptor) 및 CD28로 매개된 T-세포 활성, 성장 인자 및 사이토카인 생성을 억제하여 음성 신호전달을 유도한다. PD-1 억제제는 예를 들어, 펨브롤리주맙(키트루다®), MK-3475, 니볼루맙(옵디보®), 세미플리맙(립타요®), JTX-4014, 스파르탈리주맙, 캄렐리주맙, 신틸리맙, 티슬레리주맙, 토리팔리맙, 도스탈리맙, INCMGA00012, AMP-224, 및 AMP-514이다.
항-IGSF1 항체
본 명세서에서 사용된 용어, "IGSF1"은 인간 및 다른 포유류 종의 X 염색체에서 발견되는 IGSF1 유전자에 의해 암호화된 막단백질이다. 정상세포에서 IGSF1의 기능에 대해서는 잘 알려져 있지 않으나, IGSF1 돌연변이는 IGSF1 결핍 증후군(IGSF1 deficiency syndrome) 또는 중추성 갑상선 기능 저하증 등의 질병을 유발하는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 상기 IGSF1은 포유류의 IGSF1이라면 제한없이 포함될 수 있으나, 바람직하게는 인간 IGSF1을 의미할 수 있다. 또한, 본 발명에서 상기 IGSF1 단백질은 천연형 또는 변이체 IGSF1 단백질을 모두 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 천연형 IGSF1 단백질이란 천연형 IGSF1 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 일반적으로 지칭하며, 상기 천연형 IGSF1 단백질의 아미노산 서열이란 천연 발생 IGSF1에서 발견되는 아미노산 서열을 일반적으로 지칭한다. 상기 IGSF1에 대한 정보는 미국국립보건원의 GenBank 등 공지의 데이터베이스로부터 얻을 수 있으며, 예를 들어 Genbank accession number NP_001164433.1의 아미노산 서열(서열번호 19)을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어, "항체"는 특정 항원과 면역학적으로 반응하는 면역글로불린 분자로, 항원을 특이적으로 인식하는 단백질 분자를 의미한다. 상기 항체는 전체(whole) 항체, 단일클론항체, 다클론항체, 단일 도메인 항체, 단쇄 항체, 다중특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 인트라바디(intrabody), scFv, Fab 단편, F(ab') 단편, 이황화 결합으로 연결한 Fv(sdFv) 및 상기 중 임의의 에피토프(epitope) 결합 단편을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어, "항-IGSF1 항체"는 IGSF1에 결합할 수 있는 항체를 의미하며, 본 발명에서 "IGSF1에 특이적인 항체"와 혼용되어 사용될 수 있다. 특히, 항-IGSF1 항체는 IGSF1의 C 말단에 특이적으로 결합할 수 있다. 상기 항체의 형태는 전체(whole) 항체 및 항체 단편을 모두 포함할 수 있다.
면역글로불린의 중쇄 및 경쇄는 각각 불변영역(constant region) 및 가변영역(variable region)을 포함할 수 있다. 면역글로불린의 경쇄 및 중쇄 가변영역은, 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR)이라 불리는 3개의 다변가능한 영역 및 4개의 구조 영역(framework region, FR)을 포함한다. 상기 CDR은 주로 항원의 에피토프에 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N 말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3로 불리고, 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다.
본 발명의 항-IGSF1 항체 또는 이의 단편은 서열번호 1의 H-CDR1, 서열번호 2의 H-CDR2 및 서열번호 3의 H-CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역(VH)을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 IGSF1에 특이적인 항체 및 이의 단편은 서열번호 4의 L-CDR1, 서열번호 5의 L-CDR2 및 서열번호 6의 L-CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역(VL)을 포함할 수 있다. 이때, 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 7의 아미노산 서열을 가질 수 있으며, 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 8의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 본 명세서에서 상기 항체는 WM-A1-3389로 지칭될 수 있다.
상기 항체의 중쇄 가변영역은 서열번호 7의 아미노산 서열과 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일성 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 항체의 경쇄 가변영역은 서열번호 8의 아미노산 서열과 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일성 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다.
면역글로불린 중쇄 불변영역(CH)은 상이한 아미노산 조성 및 순서를 나타내므로, 상이한 유형의 항원성을 보유한다. 따라서, 면역글로불린은 다섯 가지 카테고리로 분류될 수 있으며, 면역글로불린 이소형, 즉, IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로 지칭될 수 있다. 이에 상응하는 중쇄는 각각 μ 사슬, δ 사슬, γ 사슬, α 사슬 및 ε 사슬이다. 또한, 힌지 영역(hinge region)의 아미노산 조성 및 중쇄 이황화 결합의 수와 위치에 따라, 동일한 유형의 Ig는 상이한 하위 유형으로 분류될 수 있다. 예를 들어, IgG는 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4로 분류될 수 있다. 경쇄는 상이한 불변영역에 따라 κ 또는 λ 사슬로 분류될 수 있다. 다섯 가지 유형의 IgG 각각은 κ 또는 λ 사슬을 가질 수 있다.
본 발명의 항-IGSF1 항체 또는 이의 단편이 불변영역을 포함하는 경우, IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래, 또는 이들이 부분적으로 혼합(hybrid)된 불변영역을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "혼합된(hybrid)"은 단쇄 면역글로불린 중쇄 불변영역 내에 2개 이상의 상이한 기원의 면역글로불린 중쇄 불변영역에 해당하는 서열이 존재함을 의미한다. 예를 들어 IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM의 CH1, CH2 및 CH3으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1개 내지 4개 도메인으로 이루어진 도메인의 하이브리드가 가능하다.
또한, 본 발명의 상기 항-IGSF1 항체 또는 이의 단편이 경쇄 불변영역(LC)을 포함하는 경우, 상기 경쇄 불변영역은 λ 또는 κ 경쇄 유래일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "항체 단편"은 항원-결합 활성을 갖는 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편뿐만 아니라, IGSF1에 결합하는 Fv 단편인 scFv 단편을 지칭하며, 본 발명에 기술된 항체의 CDR 영역을 포함한다. Fv 단편은 불변 영역 없이, 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하며, 모든 항원-결합 자리를 보유하는 최소 항체 단편이다.
약학 조성물
본 발명의 항-IGSF1 항체 또는 이의 단편 및 항-PD-1 항체를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 암에 대하여 예방 또는 치료 효능을 나타낸다.
이때, 상기 암은 IGSF1이 과발현되어 있는 암일 수 있다.
또한, 상기 암은 위암, 간암, 폐암, 비소세포 폐암, 대장암, 방관암, 골암, 혈액암, 유방암, 흑색종양, 갑상선암, 부갑성선암, 골수암, 직장암, 인후암, 후두암, 식도암, 췌장암, 설암, 피부암, 죄종양, 자궁암, 두부암, 경부암, 담낭암, 구강암, 항문 부근암, 결장암 및 중추신경계 종양으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "예방"은 상기 약학 조성물의 투여에 의해 암의 발생을 억제하거나 그의 발병을 지연시키는 모든 행위를 말한다. 상기 용어 "치료"는 상기 약학 조성물의 투여에 의해 암의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다.
본 발명의 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에서 상기 항-IGSF1 항체 또는 이의 단편 및 항-PD-1 항체는 항암 활성을 나타낼 수 있는 한, 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 임의의 양(유효량)으로 포함될 수 있다. 여기서, "유효량"이란 항암 효과를 유도할 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 유효성분으로서 상기 항체를 조성물의 총 중량을 기준으로 약 0.1 중량% 내지 약 90 중량%, 구체적으로 약 0.5 중량% 내지 약 75 중량%, 보다 구체적으로 약 1 중량% 내지 약 50 중량%로 함유할 수 있다.
생체이용률과 같은 약동학적 파라미터(pharmacokinetic parameters) 및 클리어런스율(clearance rate)과 같은 기본적인 파라미터(underlying parameters)도 효능에 영향을 줄 수 있다. 따라서, "향상된 효능"(예를 들어, 효능의 개선)은 향상된 약동학적 파라미터 및 향상된 효능에 기인할 수 있으며, 시험 동물 또는 인간 대상체에서 클리어런스율 및 종양 성장을 비교하거나, 생존, 재발율 또는 질병이 없는 상태에서 생존과 같은 파라미터를 비교하여 측정될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "효능(efficacy)"은 1년, 5년, 또는 10년과 같이 일정 기간에 걸쳐 생존 또는 질병이 없는 상태에서 생존(disease-free survival)과 같은 하나 이상의 파라미터에 의해 결정될 수 있다. 뿐만 아니라, 상기 파라미터는 개체에서 적어도 하나의 종양의 크기가 억제되는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은, 통상적인 방법에 따라 제제로 배합되는 통상적이고 무독성인 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다.
상기 약학적으로 허용가능한 담체는 환자에게 전달하기에 적절한 비-독성 물질이면 어떠한 담체라도 가능하다. 증류수, 알코올, 지방, 왁스 및 비활성 고체가 담체로 포함될 수 있다. 약물학적으로 허용되는 애쥬번트(완충제, 분산제) 또한 약물학적 조성물에 포함될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 한 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 감미제, 용해 보조제, 습윤제, 유화제, 등장화제, 흡수제, 항산화제, 보존제, 활택제, 충전제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.
본 발명의 조성물은 비경구 투여(예컨대, 근육내, 정맥내 또는 피하 주사)를 위한 다양한 제형으로 제조될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제, 비강 흡입제 및 좌제의 형태로 제제화될 수 있다. 주사용 제제에는 멸균된 수용액제, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다. 한편, 주사제에는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제, 방부제 등과 같은 종래의 첨가제가 포함될 수 있다.
약제학적 조성물의 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 구체적으로 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주된다.
본 발명의 항체 또는 조성물은 치료학적으로 유효한 양 또는 약학적으로 유효한 양으로 환자에 투여될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "투여"란, 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 국소 투여, 비내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
여기서, "치료학적으로 유효한 양" 또는 "약학적으로 유효한 양"이란 대상 질환을 예방 또는 치료하는데 유효한 화합물 또는 조성물의 양으로서, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다. 상기 유효량의 수준은 환자의 건강 상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 일 구체예에서, 치료학적으로 유효한 양은 암을 치료하는데 효과적인 약물의 양을 의미한다.
구체적으로, 본 발명의 조성물에서 항체의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 kg 당 약 0.1 mg 내지 약 1,000 mg, 또는 약 5 mg 내지 약 200 mg을 매일, 격일 또는 2주 내지 3주 간격으로 투여하거나, 1일 1회 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로, 본 발명의 범위는 이에 한정되지 않는다.
상기 용어 "개체"란 본 발명의 조성물이 적용(처방)될 수 있는 대상을 의미하며, 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 포유동물일 수 있다. 바람직하게는, 인간일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 항체 또는 이를 포함하는 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 이때, 상기 다른 치료제는 항암 활성의 상승, 보강을 위하여 이미 안전성이 검증되고 항암 활성을 갖는 것으로 공지된 임의의 화합물이나 천연 추출물을 추가로 포함할 수 있다.
상기한 요소들을 모두 고려하여 최소한의 부작용으로 또는 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, 암 예방 또는 치료용 약제를 제조하기 위한 본 발명의 항-IGSF1 항체 또는 이의 단편 및 항-PD-1 항체를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물의 용도를 제공한다. 여기서, 항-IGSF1 항체 및 이의 단편, 항-PD-1 항체, 암, 예방 및 치료는 상술한 바와 동일하다.
본 발명의 또 다른 측면은, 본 발명의 항-IGSF1 항체 또는 이의 단편 및 항-PD-1 항체를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물의 암 예방 또는 치료 용도를 제공한다. 여기서 항-IGSF1 항체 및 이의 단편, 항-PD-1 항체, 암, 예방 및 치료는 상술한 바와 동일하다.
본 발명의 또 다른 측면은, 항-IGSF1 항체 또는 이의 단편 및 항-PD-1 항체를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 여기서 항-IGSF1 항체 및 이의 단편, 항-PD-1 항체, 암, 투여, 치료 및 예방은 상술한 바와 동일하다.
상기 개체는 포유동물일 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수 있다. 또한, 상기 개체는 암 환자이거나 암을 앓을 가능성이 큰 개체일 수 있다.
상기 약학 조성물의 투여 경로, 투여량 및 투여 횟수는 환자의 상태 및 부작용의 유무에 따라 다양한 방법 및 양으로 대상에게 투여될 수 있고, 최적의 투여 방법, 투여량 및 투여 횟수는 통상의 기술자가 적절한 범위로 선택할 수 있다. 또한, 상기 항-IGSF1 항체 또는 이의 단편은 암에 대하여 치료 효과가 공지된 다른 약물 또는 생화학적 활성물질과 병용하여 투여되거나, 다른 약물과의 조합 제제 형태로 제형화될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 항-IGSF1 항체 제작
실시예 1.1. IGSF1 항원 발현 및 정제
Jurkat 세포 cDNA 라이브러리에서 PCR 방법을 통해 IGSF1의 세포외 도메인만을 증폭한 후, N293F 벡터(와이바이오로직스(주))를 이용하여 카복시 말단(C 말단)에 인간 Fc(fragment crystallizable region) 및 His-태그(His-tag)를 융합시켜 IGSF1 단백질 발현 벡터를 제작하였다. HEK293F 세포에 제작한 IGSF1 발현 벡터를 형질감염(transfection)시킨 후, 1 mM 발프로산(valporic acid, valproate)을 첨가한 배지에서 6일 동안 배양하였다. 이후, protein A 아가로오즈(agarose)를 사용하여 IGSF1 세포외 도메인을 1차 정제한 후, Superdex 200 겔 여과 크로마토그래피를 이용하여 IGSF1 세포외 도메인을 2차 정제한 후, 항체 선별에 사용하였다.
실시예 1.2. IGSF1 인간 항체의 선별
IGSF1 항원을 코팅하고 블로킹한 후, 준비된 인간 항체 라이브러리 파아지(와이바이오로직스(주))를 이용하여 바이오패닝(와이바이오로직스(주))을 진행하여 항원에 특이적으로 결합한 파아지들만 용출(elution)하였다. 첫 번째 라운드의 바이오패닝에서 증폭된 파아지를 이용하여 두 번째 및 세 번째 라운드의 바이오패닝을 수행하였다. 각 라운드의 바이오패닝을 통해 얻어진 양성 파아지 항체 풀(pool)에 대한 항원과의 특이성을 확인하고자 ELISA를 수행하였다. 또한, 세 번째 라운드를 통해 얻어진 파아지 풀에 항-IGSF1 항체가 인리치(enrich)된 것을 확인하였다. 각 폴리 파아지 ELISA에서 결합능이 큰 세 번째 라운드의 패닝으로부터 수 백 종의 모노클론들을 선별하였고, 이를 이용하여 ELISA 분석을 통해 IGSF1에 특이적으로 결합하는지 여부를 확인하여 예비 항체 클론을 확보하였다. 선별된 예비 항체 클론들에 대해 DNA 염기서열 분석을 통해 염기서열이 서로 다른 파아지를 99종 선별하였다. 선별된 99종의 양성 파아지 클론들은 항원인 IGSF1에는 강하게 결합하였으나, 다른 항원들에 대해서는 결합하지 않는 것을 확인하였다. 상기 방법을 통해 추가적으로 다양한 다른 항원을 이용하여 IGSF1 항원에 특이성을 나타내는 항체를 선별한 결과 총 95종을 선별할 수 있었다.
실시예 1.3. IGSF1 항원에 대한 특이성 확인
선별한 항체에 대해 IGSF1을 비롯한 다른 항원들에 대한 특이성을 ELISA 방법을 통해 비교 분석하였다. 대조군 항원들인 mFc, hRAGE-Fc, CD58-Fc, ITGA6-Fc 등 다양한 종류의 불특정 항원에 대해서 파아지 클론들의 결합 여부를 확인하였다. 이와 같은 확인을 통해 수득한 항체들에 대해 파아지에서 IgG whole 벡터로 전환하였다. 전환된 95개 클론의 중쇄 서열 및 경쇄 서열이 파아지 항체의 서열과 일치하는 것을 확인하였다. 수득된 항체 중 가장 최적화된 항체를 선별하고, 이를 "WM-A1-3389"라 명명하였다. WM-A1-3389 항체의 CDR 서열은 하기 표 1과 같다.
| WM-A1-3389 | ||
| CDR | 아미노산 서열 | 서열번호 |
| H-CDR1 | GGTFSTYA | 1 |
| H-CDR2 | IIPFVGTV | 2 |
| H-CDR3 | VRDGGRSYFDS | 3 |
| L-CDR1 | TSNIGSNL | 4 |
| L-CDR2 | DNH | 5 |
| L-CDR3 | VAWDDSLNGYV | 6 |
실시예 1.4. WM-A1-3389 항체 생산
WM-A1-3389 항체를 생산하기 위하여, 중쇄(서열번호 21)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 23)를 N293F 벡터(와이바이오로직스(주))에 적재하였다(이하, HC DNA). 또한, 경쇄(서열번호 22)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 24)를 N293F 벡터(와이바이오로직스(주))에 적재하였다(이하, LC DNA). 상기 벡터를 세포에 형질전환 시킨 후, WM-A1-3389 항체를 수득 및 정제하였다. 정제된 단백질은 SDS-PAGE를 통해 확인하였다.
| 아미노산 서열 | 서열번호 | |
| 중쇄(heavy chain) | QVQLVQSGAEVKRPGSSVKVSCKASGGTFSTYAISWVRQAPGQGLEWMGRIIPFVGTVDYAQKFQDRVTITADKSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCVRDGGRSYFDSWGPGILVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK | 21 |
| 경쇄(light chain) | QFVLTQPPSVSAAPGQDVIISCSGNTSNIGSNLVSWFQQFPETAPKLLIYDNHKRPSGISDRFSGTKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCVAWDDSLNGYVFGTGTKVTVLRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | 22 |
실시예 2. IGSF1 발현과 종양 침윤 림프구의 관련성 분석
실시예 2.1. IGSF1 과발현 세포주 제작
IGSF1을 인간 폐암 세포주인 NCI-H292 또는 인간 배아 신장 세포주 HEK293E 세포에 과발현시켜, IGSF1이 과발현된 세포주를 제작하였다(도 1). 이때, MOCK는 IGSF1 발현이 없는 대조군이다.
구체적으로, IGSF1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 포함된 발현 벡터(OriGene Technologies, Inc., Cat No.RC209621)를 인간 폐암 세포주 NCI-H292 세포 또는 인간 배아 신장 세포주 HEK293F 세포에 형질감염(transfection)시켰다. 이후, G418(neomycin)이 포함된 배지에서 배양하여 형질감염된 세포를 선별하였다. 선별된 클론들에 대해서 IGSF1 발현 수준을 확인하여, 가장 높은 IGSF1 발현을 보인 클론을 선택하여 실험에 사용하였다. MOCK는 IGSF1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 적재되지 않은 공벡터를 의미한다.
실시예 2.2. 폐암 세포주 스페로이드에서 IGSF1 발현과 종양 침윤 림프구의 관련성 분석
폐암에서 IGSF1 발현과 종양 침윤 림프구(tumor-infiltrating lymphocytes, TIL)와의 상관관계를 세포 수준에서 확인하기 위하여, IGSF1을 과발현시킨 폐암 세포를 이용한 스페로이드에서 종양 침윤 림프구를 확인하였다.
먼저, 폐암 세포 스페로이드를 제작하기 위하여, NCI-H292 IGSF1 O/E 세포 및 NCI-H292 MOCK 세포를 각각 2×104 세포/웰(well)이 되도록 U-Bottom 96-웰 플레이트(Nunc, 174925)에 접종(seeding)하여 37℃, CO2 인큐베이터에서 72시간 동안 배양하였다. 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)는 1,200 rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 PBS에 재현탁하여 준비하였다. CFSE(carboxyfluorescein succinimidyl ester, Invitrogen, C34554)에 DMSO 18 ㎕를 넣어 5 mM 농도로 만들고, PBS에 1 mM이 되도록 희석하였다. 준비한 말초혈액 단핵세포 1×106 세포/㎖ 당 1 mM CFSE 용액을 1 ㎕씩 첨가한 뒤, 37℃, CO2 인큐베이터에서 10분간 염색하였다. 이후, PBS 양의 5배 분량의 FBS(fetal bovine serum)가 포함된 배지를 염색한 말초혈액 단핵세포(PBMC)가 포함된 용액에 첨가하였다. 그 후, 37℃, CO2 인큐베이터에서 5분간 반응시켰다. 1,200 rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 제거한 후, 염색된 말초혈액 단핵세포를 배지에 재현탁시켜 실험에 사용할 말초혈액 단핵세포를 준비하였다.
그 후, 형성된 스페로이드를 2웰씩 초저부착 96-웰 플레이트(Corning, CLS3474)에 옮긴 후, CFSE로 염색된 말초혈액 단핵세포를 1×105 세포/웰이 되도록 접종하여 37℃, CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 공동 배양하였다. 종양 침윤 림프구(TIL)는 형광 현미경을 통해 관찰하였다. 이때, NCI-H292 MOCK 세포는 IGSF1 과발현 세포에 대한 대조군으로 사용하였다.
그 결과, IGSF1 과발현 인간 폐암 세포(NCI-H292 IGSF1 O/E) 스페로이드에서 대조군(NCI-H292 MOCK)에 비해 종양 침윤 림프구(TIL)가 감소하는 것을 확인하였다(도 2).
실시예 2.3. 폐암 세포주를 이식한 인간화 마우스의 종양 조직에서 IGSF1 발현과 종양 침윤 림프구의 관련성 분석
폐암에서 IGSF1의 발현과 종양 침윤 림프구(TIL)와의 상관관계를 in vivo 수준에서 확인하기 위하여, IGSF1을 과발현시킨 인간 폐암 세포를 이식한 인간화 마우스의 종양 조직에서 종양 침윤 림프구를 확인하였다.
구체적으로, 인간 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 이식한 NSG 마우스(SID(NSGA) mice, F)에 IGSF1 과발현 인간 폐암 세포주인 NCI-H292 IGSF1 O/E 세포 또는 대조군인 NCI-H292 MOCK 세포를 한 마리당 5×106 세포로 이식 후 17일째에 마우스의 종양 부분을 채취하였다.
채취된 종양에서 각각 인간 말초혈액 단핵세포를 분리하여 FACS 분석하고, 종양 조직의 면역조직화학염색(immunohistochemistry)을 통해 종양 조직 내의 종양 침윤 림프구 및 IGSF1 발현량을 확인하였다. 종양에 침윤된 인간 말초혈액 단핵세포를 확인하기 위하여, 먼저 종양 조직에 collagenase B(Roche, cat. #11088815001)를 처리하고 37℃에서 2시간 이상 반응시켜 종양 조직을 분해시켰다. 종양 조직이 완전히 세포로 분해되면 l ㎖ 파이펫으로 파이펫팅하여 단일 세포로 분리하였다.
분리된 단일 세포를 50 ㎖ 튜브(SPL, cat. #50050)로 옮긴 뒤, PBS 20 ㎖로 세척하였다. 이후, 1,200 rpm에서 3분간 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 남아있는 세포에 DNase I(Roche, cat. #11284932001)을 처리하여 37℃에서 20분간 반응시켰다. 반응 후, PBS를 20 ㎖ 첨가하고, 1,200 rpm에서 3분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 남아있는 세포에 0.25% Trysin/EDTA(GIBCO, cat. #15400-054)를 처리하였다. 세포를 잘 혼합한 후, 새로운 50 ㎖ 튜브 상에 셀 스트레이너(cell strainer; SPL, cat. #93070)를 배치하고 세포를 걸러주었다. 걸러진 세포가 있는 튜브에 20 ㎖ PBS를 첨가하고 잘 혼합하였다. 이후, 1,200 rpm에서 3분간 원심분리하고 상층액을 제거한 후, 남아있는 세포에 Stain Buffer(BD, cat. #554656) 1 ㎖을 넣고 세척하였다.
분리한 세포의 비특이성 항체 반응을 차단하기 위해, Human Fc block(BD, cat. #564219)을 2 ㎍씩 첨가하고 10분간 상온에서 반응시켰다. 반응 후, 항-인간 CD45(BD, cat. #564357) 항체를 첨가하고, 4℃에서 30분간 암(dark) 상태로 반응시켰다. 반응 후, Stain Buffer 1 ㎖을 첨가하여 세척하였다. 이후, 1,200 rpm에서 3분간 원심분리하고 상층액을 제거하여 세포를 수집하였다. 수집된 세포에 Stain Buffer를 200 ㎕씩 첨가하여 BD LSRFortessaTM Flow Cytometer로 분석하였다(도 3).
또한, 면역조직화학염색법을 통해 종양 내 발현된 종양 림프구 분포 및 IGSF1의 발현을 확인하였다. 구체적으로, 인간 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 이식한 NSG 마우스(SID(NSGA) mice, F)에 인간 폐암 세포주인 NCI-H292 IGSF1 O/E 세포 또는 NCI-H292 MOCK 세포를 한 마리당 5×106 세포로 이식하였다. 이식 후 17일째에 마우스에서 채취한 종양 조직의 절편을 탈파라핀화(deparaffinization)하고 재수화하였다.
이후, 열-유도된 에피토프 복구를 위해 표적 복구 완충액에 담궈 전자레인지에서 15분 동안 가열하였다. 가열 후, 표적 복구 완충액에서 30분 동안 놓아둔 후, 트리스 완충 식염수-0.05% 트윈 20(TBS-T)으로 3회 세척하고, 블로킹 용액으로 60분간 블로킹하였다. 1차 항체로 항-IGSF1 항체(Santacruz, sc-393786)를 1:100 희석하여 4℃에서 밤새(overnight) 결합시켰다. 다음날, TBS-T로 3회 세척하고, 내인성 퍼옥시다제 차단 시약(Cell Marque, 925B)으로 상온에서 5분간 반응시켰다. 이후, 2차 항체(Vector, PK-6101 PK-6102)를 상온에서 60분간 결합시켰다. TBS-T로 3회 세척 후, 아비딘-바이오틴과 60분 동안 반응시켰다. 최종 DAB 염색(Vector, SK-4100)을 실시한 후 탈수 과정을 거쳐 조직 염색을 마무리하고, 염색된 조직 절편을 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 대조군(NCI-H292 MOCK)에 비해 IGSF1 과발현 인간 폐암 세포(NCI-H292 IGSF1 O/E)가 이식된 인간화 마우스의 종양 조직에서 인간 면역세포인 hCD45+ 세포가 감소하는 것을 확인하였다(도 4).
실시예 3. 항-IGSF1 항체의 결합 친화도 분석
실시예 3.1.
In vitro
수준에서 항-IGSF1 항체의 결합 친화도 분석
WM-A1-3389 항체의 IGSF1 항원에 대한 결합 친화도(binding affinity)를 ELISA 분석을 이용하여 in vitro 수준에서 확인하였다.
구체적으로, 100 ng IGSF1을 처리하여 96-웰 플레이트를 코팅(coating)한 후, 4% skim milk(PBST)를 200 ㎕씩 첨가하여 상온에서 1시간 동안 블로킹하였다. WM-A1-3389 항체를 4% skim milk(PBST)에 1/3씩 12개 농도로 연속 희석하여 처리한 후, 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, PBST로 웰을 세척하고 인간 IgG Fc-HRP 항체를 처리하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 다음, PBST로 웰을 세척한 후, TMB 과산화효소 기질(peroxidase substrate)을 첨가하여 발색 정도를 확인하였다. 이때, 확인은 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 그 결과를 비교 분석하였다.
분석 결과, WM-A1-3389 항체의 Kd 값이 2.2×10-11로, IGSF1 항원에 대해 높은 결합 친화도를 나타냈다(도 5).
실시예 3.2. 세포 내 IGSF1에 대한 항-IGSF1 항체의 결합 친화능 분석
세포 수준에서 WM-A1-3389 항체의 IGSF1 항원에 대한 결합 친화 정도를 확인하기 위하여, IGSF1 과발현 인간 폐암 세포(NCI-H292 IGSF1 O/E) 및 대조군(NCI-H292 MOCK)을 이용하여 IGSF1에 대한 WM-A1-3389 항체의 결합력을 확인하였다.
구체적으로, NCI-H292 IGSF1 O/E 세포 및 NCI-H292 MOCK 세포의 배지를 제거하고, PBS로 1회 세척한 뒤, 0.25% trypsin-EDTA를 2 ㎖ 처리하여 세포를 분리하였다. 분리된 세포는 2% FBS 및 0.05% sodium azide가 포함된 PBS(이하, FACS 버퍼) 8 ㎖로 희석한 뒤, 1,200 rpm에서 1분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 이후, 세포를 1×105 세포/㎖이 되도록 FACS 버퍼로 재현탁시켰다. 재현탁 후, FACS 튜브에 1 ㎖씩 세포를 분주하고 1,200 rpm에서 1분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다.
FACS 튜브에 남아있는 세포 펠렛(pellet)을 볼텍싱(vortexing)하고, WM-A1-3389 항체를 FACS 버퍼 200 ㎕당 20 μM에서 0 μM까지 1/4씩 희석하여 총 12개의 농도로 첨가한 후, 4℃에서 30분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 각 튜브에 FACS 버퍼를 1 ㎖씩 첨가하고 1,200 rpm에서 1분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 이 과정을 총 2회 실시하였다. 또한, FACS 튜브에 남아있는 세포 펠렛을 볼텍싱하고, FITC가 표지된 염소 항-인간 IgG 항체(Invitrogen, 62-8411)를 FACS 버퍼 200 ㎕당 5 ㎍/㎖씩 첨가하고 4℃에서 차광하여 30분동안 반응시켰다. 반응 종료 후, 각 튜브에 FACS 버퍼를 1 ㎖씩 첨가하고 1,200 rpm에서 1분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 이 과정을 총 2회 실시하였다.
마지막으로, 상층액 제거 후 남아있는 세포 펠렛을 FACS 버퍼 200 ㎕에 재현탁하여 FACS 분석하였다. FACS 분석은 BD LSRFortessaTM Flow Cytometer를 이용하여 각 세포에 표지된 FITC 형광값을 측정하였다. 이후, FlowJo 소프트웨어를 사용하여 결과를 분석하였고, EC50 값은 sigma plot 프로그램을 사용하여 계산하였다. 이때, NCI-H292 MOCK 세포는 IGSF1 과발현 세포에 대한 대조군으로 사용하였다.
분석 결과, 대조군(NCI-H292 MOCK)에서는 WA-A1-3389 항체의 농도와 무관하게 결합이 확인되지 않았다. 반면, IGSF1이 과발현된 인간 폐암 세포(NCI-H292 IGSF1 O/E)에서는 WM-A1-3389 항체의 EC50 값이 69 nM로 확인되었다(도 6).
실시예 4. 세포 내 IGSF1 항원에 대한 항-IGSF1 항체의 항원 특이성 분석
세포 수준에서 IGSF1 항원에 대한 WM-A1-3389 항체의 항원 특이적 결합 능력(target selectivity)을 분석하기 위하여, IGSF1이 과발현된 인간 폐암 세포(NCI-H292 IGSF1 O/E)를 이용하여, 세포에서 발현되는 IGSF1에 대한 WM-A1-3389 항체의 결합 정도를 확인하였다.
구체적으로, IGSF1이 과발현된 인간 폐암 세포(NCI-H292 IGSF1 O/E) 및 이의 대조군(NCI-H292 MOCK)의 배지를 제거하고, PBS로 1회 세척한 뒤, 0.25% trypsin-EDTA를 2 ㎖ 처리하여 세포를 분리하였다. 분리된 세포는 2% FBS 및 0.05% sodium azide가 포함된 PBS(이하, FACS 버퍼) 8 ㎖로 희석한 뒤, 1,200 rpm에서 1분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 이후, 세포를 1×105 세포/㎖이 되도록 FACS 버퍼로 재현탁시켰다. 재현탁 후, FACS 튜브에 1 ㎖씩 세포를 분주하고 1,200 rpm에서 1분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다.
FACS 튜브에 남아있는 세포 펠렛을 볼텍싱하고, 인간 IgG isotype 항체(Bio X cell, BE0297) 또는 WM-A1-3389 항체를 FACS 버퍼 200 ㎕ 당 0.4 ㎍씩 넣은 후 4℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 종료 후, 각 튜브에 FACS 버퍼를 1 ㎖씩 첨가하고 1,200 rpm에서 1분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 이 과정을 총 2회 실시하였다. FACS 튜브에 남아있는 세포 펠렛을 볼텍싱하고, FITC가 표지된 염소 항-인간 IgG 항체(Invitrogen, 62-8411)를 FACS 버퍼 200 ㎕ 당 0.4 ㎍씩 첨가하고 4℃에서 차광하여 30분 동안 반응시켰다.
반응이 끝나고 각 튜브에 FACS 버퍼를 1 ㎖씩 첨가하고 1,200 rpm에서 1분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 이 과정을 총 2회 실시하였다. 마지막으로, 상층액 제거 후 남아있는 세포 펠렛을 FACS 버퍼 200 ㎕에 재현탁하여 FACS 분석하였다. FACS 분석은 BD LSRFortessaTM Flow Cytometer를 이용하여 각 세포에 표지된 FITC 형광값을 측정하고, FlowJo 소프트웨어를 사용하여 결과를 분석하였다. 이때, NCI-H292 MOCK 세포는 IGSF1 과발현 세포에 대한 대조군으로 사용하였고, 인간 IgG isotype은 WM-A1-3389 항체에 대한 대조군으로 사용하였다.
그 결과, WM-A1-3389 항체 처리군은 IgG isotype 처리군과 비교하여 대조군(NCI-H292 MOCK)에서는 2.6%의 결합력을 보였고, IGSF1 과발현 세포(NCI-H292 IGSF1 O/E)에서는 78.9%의 결합을 나타냈다(도 7).
다음으로, IGSF1이 과발현된 NCI-H292 IGSF1 O/E 세포 및 HEK293E IGSF1 O/E 세포에 IGSF1을 코딩하는 mRNA에 특이적으로 결합하는 shRNA(이하, shIGSF1)를 형질주입하여 IGSF1의 발현을 감소시킨(이하, IGSF1 K/D 세포) 뒤, 세포 내 IGSF1 항원에 대한 WM-A1-3389 항체의 결합력을 측정하였다. 이때, 형질주입(IGSF1 K/D)의 대조군으로서 shIGSF1을 사용하지 않은 scramble RNA(이하, sc 세포)를 사용하였고, WM-A1-3389 항체에 대한 대조군으로 인간 IgG isotype을 사용하였다. WM-A1-3389 항체의 항원 특이성은 sc 세포에서의 결합력을 기준으로 IGSF1 K/D 세포에서의 결합력을 비교하였다. 또한, IGSF1 과발현 세포에 대한 대조군으로 각각 NCI-H292 MOCK 세포 및 HEK293E MOCK 세포를 사용하였다.
구체적으로, NCI-H292(IGSF1 O/E 및 MOCK) 및 HEK293E(IGSF1 O/E 및 MOCK) 세포주의 배지를 제거하고, PBS로 1회 세척한 뒤, NCI-H292 세포는 0.25% trypsin-EDTA, HEK293E 세포는 0.05% trypsin-EDTA를 각각 2 ㎖씩 처리하여 세포를 분리하였다. 분리된 세포는 배양 배지 8 ㎖로 희석한 뒤, 800 rpm에서 3분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 남아있는 세포를 각각 1×105 세포/㎖(NCI-H292), 0.5×105 세포/㎖(HEK293E) 농도가 되도록 재현탁시킨 후, 60 mm 배양 플레이트에 3 ㎖씩 첨가하고, 37℃ 세포 인큐베이터에서 하루 동안 배양하였다. 다음 날 shIGSF1 형질주입을 진행하였다. 1.5 ㎖ 튜브에 jet PRIME 버퍼 200 ㎕와 shIGSF1 10 nM을 첨가하고 혼합하였다. 이후, jet PRIME 시약 4 ㎕를 첨가하고 혼합하여 상온에서 10분간 반응시켰다. 또한, 전날 준비해 놓은 세포의 배지를 교체한 후, 형질주입 혼합물을 200 ㎕씩 각 세포에 첨가하여 세포 인큐베이터에서 24시간 동안 반응시켰다. 24시간 후 새로운 배양 배지로 교체하고, 24시간 동안 추가 배양하였다.
형질주입이 끝난 세포는 배지를 제거하고, 상기와 같은 방법으로 FACS 분석을 수행하였다.
그 결과, sc 세포주에서 인간 IgG isotype 처리군 대비 WM-A1-3389 항체 결합을 확인하였다. 또한, 상기 결합력을 기준으로 IGSF1 발현을 감소시켰을 때(IGSF1 K/D 세포), WM-A1-3389 항체의 결합력이 함께 감소하는 것을 확인하였다(도 8).
실시예 5. 폐암 세포 스페로이드에서 항-IGSF1 항체의 면역 항암 효능 분석
세포 수준에서 WM-A1-3389 항체의 면역 항암 효능을 분석하기 위하여, 폐암 세포 스페로이드와 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 공동 배양하여 종양 침윤 림프구(TIL) 및 면역원성 세포 사멸을 확인하였다.
폐암 세포 스페로이드와 말초혈액 단핵세포의 공동 배양은 실시예 2.2와 동일한 방법으로 수행하였다.
공동 배양한 세포와 상층액을 튜브에 모아 1,200 rpm에서 2분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 세포 펠렛은 0.25% trypsin-EDTA 500 ㎕를 처리하여 단일 세포로 만든 후, 2% FBS와 0.05% NaN3를 첨가한 PBS(이하, FACS 버퍼) 2 ㎖로 희석하였다. 이후, 1,200 rpm에서 3분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 남은 세포 펠렛을 FACS 버퍼 200 ㎕에 재현탁시킨 후, 항-HMGB1 항체(Biolegend, 651408)를 첨가하여 4℃에서 30분간 염색시켰다.
각 튜브에 FACS 버퍼 1 ㎖씩 넣고, 1,200 rpm에서 2분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 이 과정을 총 2회 실시하였다. 이후, BD LSRFortessaTM Flow Cytometer를 이용하여 분석하였다. FACS 분석 결과는 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 또한, 종양 침윤 림프구(TIL)는 형광 현미경을 통해 관찰하였다. 이때, WM-A1-3389 항체에 대한 대조군으로 인간 IgG isotype을 사용하였다.
그 결과, IGSF1 과발현 폐암 세포(NCI-H292 IGSF1 O/E) 스페로이드에서 대조군에 비해 WM-A1-3389 항체 처리군에서 종양 침윤 림프구(TIL)가 증가하는 것을 확인하였다(도 9). 또한, 면역원성 세포 사멸(ICD)도 IGSF1 과발현 폐암 세포 스페로이드에서 대조군에 비해 WM-A1-3389 항체 처리군에서 증가하는 것을 확인하였다(도 10).
실시예 6. 폐암 세포주를 이식한 종양 마우스 모델에서 항-IGSF1 항체 단독 투여에 의한
종양 성장 억제 효능 분석
동물 수준에서의 WM-A1-3389 항체의 항암 효능을 확인하기 위하여, 말초혈액 단핵세포 인간화 모델(PBMC humanized model) 마우스에 IGSF1이 과발현된 인간 폐암 세포(NCI-H292 IGSF1 O/E)를 이식한 후, WM-A1-3389 항체의 종양 성장 억제 효능을 평가하였다.
구체적으로, 6주령 암컷 말초혈액 단핵세포 인간화 마우스(Gem biosciences)를 구입하여 1주 동안 순화시킨 후, IGSF1이 과발현 인간 폐암 세포 NCI-H292 IGSF1 O/E(5×106 세포/마리)를 PBS와 마트리겔(Matrigel)에 희석하여 마우스의 오른쪽 배측면에 피하(200 ㎕)로 주사하였다. 종양의 크기가 약 120 mm3이 되었을 때 IgG isotype(대조군) 또는 WM-A1-3389 항체를 각각 10 mg/kg 용량으로 복강 투여하였다. 투여는 3일에 한 번씩 4주 동안 실시하였으며, 주 2회 마우스의 종양 크기와 체중을 측정하였다. 투여 22일째 되는 날, 위성군(Satellite group) 마우스의 혈액과 종양을 채취하여 FACS 분석을 실시하였다. 투여가 종료된 후, 실험 동물을 안락사시켜 종양을 적출하여 무게를 측정하였다. WM-A1-3389 항체에 대한 대조군으로 인간 IgG isotype을 사용하였다.
그 결과, WM-A1-3389 항체 투여군은 대조군에 비해 종양 성장 억제 효능이 높게 나타났으며, 약 64.5%의 종양 억제율(TGI)을 보였다(도 11). 또한, 개별 개체들에 대해서도 종양 성장이 억제되는 것을 확인하였다(도 12).
실시예 7. 코카서스 인종 폐암 환자 조직에서 IGSF1 발현 분석
코카서스 인종(caucasian) 폐암 환자 조직에서 IGSF1의 발현을 면역조직화학염색법으로 확인하였다.
구체적으로, 인간 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer) 환자 조직 절편을 탈파라핀화하고 재수화하였다. 이후, 열-유도된 에피토프 복구를 위해 표적 복구 완충액에 담근 후, 전자레인지에서 15분 동안 가열하였다. 가열 후, 표적 복구 완충액에 30분간 추가 반응시켰다. 이후, 트리스 완충 식염수 0.05% 트윈 20(TBS-T)으로 3회 세척한 다음, 블로킹 용액으로 60분 동안 블로킹하였다. 1차 항체로 항-IGSF1 항체(Santacruz, sc-393786)를 1:100으로 희석하여 4℃에서 밤새(overnight) 결합시켰다. 다음 날, 조직 절편을 TBS-T로 3회 세척한 후, 내인성 퍼옥시다제 차단 시약(Cell Marque, 925B)으로 5분 동안 반응시켰다. 이후, 2차 항체(Vector, PK-6101 PK-6102)를 처리하여 상온에서 60분 동안 결합시켰다. 결합시킨 다음 TBS-T로 3회 세척하였다. 세척 후 아비딘-바이오틴을 처리하고 60분 동안 반응시켰다. 이후, DAB 염색(Vector, SK-4100)을 수행하였으며, 염색된 조직 절편을 현미경을 통해 관찰하였다(도 13).
실시예 8. 다양한 암 세포주를 이식한 종양 마우스 모델에서 항-IGSF1 항체 및 항암제 병용 투여에 의한 종양 성장 억제 효능 분석
실시예 8.1. 대장암 세포주 MC38 이식 동계(syngeneic) 마우스 모델에 대한 항-IGSF1 항체 및 항암제 병용 투여에 따른 항종양 효과
동물 수준에서 WM-A1-3389 항체와 항-PD-1 항체의 병용 투여 시 항암 효능을 확인하기 위하여, 대장암 세포주인 MC38을 이식한 마우스 모델에 WM-A1-3389 항체 및 항-PD-1 항체를 병용 투여 후 종양 성장 억제 효능을 평가하였다.
구체적으로, 5 주령 암컷 C57BL/6 마우스(Orient Bio)를 구입하여 1주 동안 순화시킨 후, 마우스 대장암 세포주 MC38(2.5×105 세포/마리)을 PBS에 희석하여 마우스의 오른쪽 배 측면에 피하(100 ㎕)로 주사하였다. 종양의 크기가 약 100 mm3이 되었을 때 mIgG(음성 대조군)(Sigma Aldrich, I5381), WM-A1-3389 항체, 또는 항-PD-1 항체(Bio X Cell, BE0146(RMP1-14))를 각각 10 mg/kg 용량으로, 또는 WM-A1-3389 항체 및 항-PD-1 항체를 각각 10 mg/kg씩 총 20 mg/kg 용량으로 복강 투여하였다. 투여는 3일에 한 번씩 2주 동안 투여 실시하였으며, 주 2회 마우스의 종양 크기와 체중을 측정하였다. 투여가 종료된 후, 실험 동물을 안락사시켜 종양을 적출하여 무게를 측정하였다.
그 결과, 음성 대조군과 비교하여 WM-A1-3389 항체 투여군, 항-PD-1 항체 투여군, 및 WM-A1-3389 항체 및 항-PD-1 항체 병용 투여군 모두에서 종양 성장 억제 효능을 확인하였다. 특히, WM-A1-3389 항체 및 항-PD-1 항체 병용 투여군에서는 WM-A1-3389 항체 또는 항-PD-1 항체 단독 투여군에 비하여 뛰어난 종양 성장 억제 효능을 나타냈다(도 14 및 표 3).
| WM-A1-3389 항체 | 항-PD-1 항체 | 병용(WM-A1-3389 항체+항-PD-1 항체) | |
| 투여 용량 (mg/kg) | 10 | 10 | 10 + 10 |
| TGI (%) | 39.1 ± 7.2 | 43.3 ± 5.2 | 68.2 ± 8.1 |
실시예 8.2. 대장암 세포주 CT26 이식 동계 마우스 모델에 대한 항-IGSF1 항체 및 항암제 병용 투여에 따른 항종양 효과
WM-A1-3389 항체 및 항-PD-1 항체의 병용 투여에 따른 항암 효능을 확인하기 위하여, 상기 실시예 8.1.과 동일한 방법으로 수행하되 본 실시예에서는 이식 세포주로서 대장암 세포주인 CT26을 사용하고, 수여 마우스(recipient mouse)로는 5주령 암컷 BALB/c 마우스를 사용하였다.
대장암 세포주인 CT26을 이식한 마우스 모델에 WM-A1-3389 항체 및 항-PD-1 항체를 병용 투여한 후 종양 성장 억제 효능을 분석해 본 결과, 음성 대조군과 비교하여 WM-A1-3389 항체 투여군, 항-PD-1 항체 투여군, 및 WM-A1-3389 항체 및 항-PD-1 항체 병용 투여군 모두에서 종양 성장 억제 효능을 확인하였다. 특히, WM-A1-3389 항체 및 항-PD-1 항체 병용 투여군에서는 WM-A1-3389 항체 또는 항-PD-1 항체 단독 투여군에 비하여 뛰어난 종양 성장 억제 효능을 나타냈다(도 15 및 표 4).
| WM-A1-3389 항체 | 항-PD-1 항체 | 병용(WM-A1-3389 항체+항-PD-1 항체) | |
| 투여 용량 (mg/kg) | 10 | 10 | 10 + 10 |
| TGI (%) | 39.8 ± 5.6 | 3.6 ± 8.6 | 73.3 ± 5.8 |
실시예 8.3. 폐암 세포주 LLC1 이식 동계 마우스 모델에 대한 항-IGSF1 항체 및 항암제 병용 투여에 따른 항종양 효과
WM-A1-3389 항체 및 항-PD-1 항체의 병용 투여에 따른 항암 효능을 확인하기 위하여, 상기 실시예 8.1.과 동일한 방법으로 수행하되 본 실시예에서는 이식 세포주로서 폐암 세포주인 LLC1을 사용하였으며, 투여는 3일에 한 번씩 11일 동안 투여 진행하였다.
폐암 세포주인 LLC1을 이식한 마우스 모델에 WM-A1-3389 항체 및 항-PD-1 항체를 병용 투여한 후 종양 성장 억제 효능을 분석해 본 결과, 음성 대조군과 비교하여 WM-A1-3389 항체 투여군, 항-PD-1 항체 투여군, 및 WM-A1-3389 항체 및 항-PD-1 항체 병용 투여군 모두에서 종양 성장 억제 효능을 확인하였다. 특히, WM-A1-3389 항체 및 항-PD-1 항체 병용 투여군에서는 WM-A1-3389 항체 또는 항-PD-1 항체 단독 투여군에 비하여 뛰어난 종양 성장 억제 효능을 나타냈다(도 16 및 표 5).
| WM-A1-3389 항체 | 항-PD-1 항체 | 병용(WM-A1-3389 항체+항-PD-1 항체) | |
| 투여 용량 (mg/kg) | 10 | 10 | 10 + 10 |
| TGI (%) | 55.4 ± 10.5 | 22.2 ± 12.0 | 84.9 ± 2.6 |
Claims (5)
- IGSF1의 C 말단에 특이적으로 결합하는 항-IGSF1 항체 또는 이의 단편 및 항-PD-1 항체를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 항-IGSF1 항체는 서열번호 1의 H-CDR1, 서열번호 2의 H-CDR2 및 서열번호 3의 H-CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및
서열번호 4의 L-CDR1, 서열번호 5의 L-CDR2 및 서열번호 6의 L-CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 것인, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제2항에 있어서,
상기 중쇄 가변영역은 서열번호 7의 아미노산 서열을 가지며;
상기 경쇄 가변영역은 서열번호 8의 아미노산 서열을 가지는 것인, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 항-PD-1 항체는 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 세미플리맙, JTX-4014, 스파르탈리주맙, 캄렐리주맙, 신틸리맙, 티슬레리주맙, 토리팔리맙, 도스탈리맙, INCMGA00012, AMP-224 및 AMP-514로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것인, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 암은 위암, 간암, 폐암, 비소세포 폐암, 대장암, 방관암, 골암, 혈액암, 유방암, 흑색종양, 갑상선암, 부갑성선암, 골수암, 직장암, 인후암, 후두암, 식도암, 췌장암, 설암, 피부암, 죄종양, 자궁암, 두부암, 경부암, 담낭암, 구강암, 항문 부근암, 결장암 및 중추신경계 종양으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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