JPWO2013133351A1 - 新規fgfr3融合体 - Google Patents
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Abstract
Description
多発性骨肉腫において、FGFR3遺伝子が染色体間転座によりIgH遺伝子と融合し、この転座によって形成された蛋白質の異常により細胞の異常増殖がおこり軟骨発育不全症の原因遺伝子となることが知られている(非特許文献3)。また、末梢性T細胞悪性リンパ腫において、染色体間転座によりFGFR3遺伝子とETV6遺伝子との融合が知られている(非特許文献4)。また膀胱癌などにおいてFGFR3遺伝子の活性化点変異が知られており、これらの活性化点変異遺伝子をマウス正常細胞NIH3T3細胞に導入すると癌細胞様に形質転換することが知られているが、野生型のFGFR3単独では形質転換はおこらないことが知られている(非特許文献5)。
トランスフォーミング アシディック コイルド−コイル コンテイニングプロテイン3(transforming, acidic coiled−coil containing protein 3;TACC3)遺伝子はFGFR3遺伝子と同じ染色体4番短腕に存在し16個のエキソンからなる。コードする蛋白質はスピンドルモーター蛋白質として、有糸分裂紡錘体の安定化に関わることが知られている(非特許文献6)。
これまで、野生型のFGFR3単独では、癌細胞に形質転換しないものと考えられていたが、野生型であってもTACC3と融合することで、癌細胞に形質転換することは、非常に驚くべきことであった。また、このFGFR3とTACC3との融合蛋白質は、驚くべきことに、FGFR3キナーゼのカルボキシ末端側で融合していることが確認されており、現在までに知られているアミノ末端での融合キナーゼとは異なる構造をしていた。
本発明者は、これらの知見から、これらの融合遺伝子の検出法を構築し、そのためのキット、プライマーセット及びプローブセットを提供し、これらの融合遺伝子又はそれにコードされる融合蛋白質を検出することにより、融合蛋白質の阻害剤による薬物治療の対象となる癌患者を選別することを可能とした。さらに、該融合蛋白質阻害剤(特には、化合物A〜E、Dovitinib、AZD4547、BGJ398又はLY2874455)がFGFR3とTACC3との融合蛋白質の活性を阻害し、FGFR3とTACC3との融合蛋白質を発現する(すなわち、FGFR3遺伝子とTACC3遺伝子との融合遺伝子陽性又はFGFR3とTACC3との融合蛋白質陽性の)癌(例えば肺癌や膀胱癌)などに有効であることを見出した。
[1]被験者から得た試料中の、下記に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は該ポリペプチドの存在を検出する工程を含むことを特徴とする、ファイブロブラストグロースファクターレセプター3(FGFR3)遺伝子とトランスフォーミング アシディック コイルド−コイル コンテイニングプロテイン3(TACC3)遺伝子との融合遺伝子又はFGFR3とTACC3との融合蛋白質の検出方法:
配列番号2のアミノ酸番号461〜947、配列番号4のアミノ酸番号461〜982、配列番号6のアミノ酸番号461〜996、配列番号26のアミノ酸番号461〜1043又は配列番号28のアミノ酸番号461〜1040に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
[2]前記ポリペプチドが、配列番号2のアミノ酸番号461〜947、配列番号4のアミノ酸番号461〜982、配列番号6のアミノ酸番号461〜996、配列番号26のアミノ酸番号461〜1043又は配列番号28のアミノ酸番号461〜1040に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号2のアミノ酸番号461〜947、配列番号4のアミノ酸番号461〜982、配列番号6のアミノ酸番号461〜996、配列番号26のアミノ酸番号461〜1043又は配列番号28のアミノ酸番号461〜1040に示されるアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチドである、[1]に記載の方法、
[3]前記ポリペプチドが、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号26又は配列番号28に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチドである、[1]に記載の方法、
[4]前記ポリペプチドが、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号26又は配列番号28に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号26又は配列番号28に示されるアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチドである、[1]に記載の方法、
[5]前記ポリペプチドが、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号26又は配列番号28に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、[1]に記載の方法、
[6]下記に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、FGFR3遺伝子とTACC3遺伝子との融合遺伝子の検出用キット:
配列番号2のアミノ酸番号461〜947、配列番号4のアミノ酸番号461〜982、配列番号6のアミノ酸番号461〜996、配列番号26のアミノ酸番号461〜1043又は配列番号28のアミノ酸番号461〜1040に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
[7]前記ポリペプチドが、配列番号2のアミノ酸番号461〜947、配列番号4のアミノ酸番号461〜982又は配列番号6のアミノ酸番号461〜996に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号2のアミノ酸番号461〜947、配列番号4のアミノ酸番号461〜982、配列番号6のアミノ酸番号461〜996、配列番号26のアミノ酸番号461〜1043又は配列番号28のアミノ酸番号461〜1040に示されるアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチドである、[6]に記載のキット、
[8]前記ポリペプチドが、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号26又は配列番号28に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチドである、[6]に記載のキット、
[9]前記ポリペプチドが、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号26又は配列番号28に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号26又は配列番号28に示されるアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチドである、[6]に記載のキット、
[10]前記ポリペプチドが、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号26又は配列番号28に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、[6]に記載のキット、
[11]FGFR3遺伝子とTACC3遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、下記a)〜e)からなる群より選択されるプライマーセット:
a)配列番号1に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット、
b)配列番号3に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット、及び
c)配列番号5に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット、
d)配列番号25に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット、
e)配列番号27に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット、
[12]配列番号1の塩基番号1〜2280の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号1の塩基番号2281〜2856の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット、
[13]配列番号3の塩基番号1〜2280の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号3の塩基番号2281〜2961の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット、
[14]配列番号5の塩基番号1〜2368の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号5の塩基番号2369〜3003の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット、
[15]配列番号25の塩基番号1〜2242の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号25の塩基番号2243〜3144の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット、
[16]配列番号27の塩基番号1〜2233の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号27の塩基番号2234〜3135の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット、
[17]FGFR3遺伝子とTACC3遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプローブセットであって、下記a)〜c)からなる群より選択されるプローブセット:
a)配列番号1の塩基番号1〜2280の任意の連続する少なくとも16塩基に対して相補的なオリゴヌクレオチドを含む複数種の隣接したプローブペアからなるプローブセット(好ましくは、20種のプローブセットを含む)、及び、配列番号1の塩基番号2281〜2856の任意の連続する少なくとも16塩基に対して相補的なオリゴヌクレオチドを含む複数種の隣接したプローブペアからなるプローブセット(好ましくは、20種のプローブセットを含む)を含むプローブセット、
b)配列番号3の塩基番号1〜2280の任意の連続する少なくとも16塩基に対して相補的なオリゴヌクレオチドを含む複数種の隣接したプローブペアからなるプローブセット(好ましくは、20種のプローブセットを含む)、及び、配列番号3の塩基番号2281〜2961の任意の連続する少なくとも16塩基に対して相補的なオリゴヌクレオチドを含む複数種の隣接したプローブペアからなるプローブセット(好ましくは、20種のプローブセットを含む)を含むプローブセット、
c)配列番号5の塩基番号1〜2368の任意の連続する少なくとも16塩基に対して相補的なオリゴヌクレオチドを含む複数種の隣接したプローブペアからなるプローブセット(好ましくは、20種のプローブセットを含む)、及び、配列番号5の塩基番号2369〜3003の任意の連続する少なくとも16塩基に対して相補的なオリゴヌクレオチドを含む複数種の隣接したプローブペアからなるプローブセット(好ましくは、20種のプローブセットを含む)を含むプローブセット、
[18]前記ポリヌクレオチドの存在を検出する工程が、被験者から得た試料及び[17]記載のプローブセットを用いてインサイチュハイブリダイゼーションを行う工程、ハイブリダイゼーションのシグナルを増幅する工程、並びに前記のシグナルの重なりを検出する工程を含むことを特徴とする、[1]〜[5]のいずれかに記載のFGFR3遺伝子とTACC3遺伝子との融合遺伝子の検出方法、
[19]FGFR3遺伝子とTACC3遺伝子との融合遺伝子を検出するための[17]に記載のプローブセット及びハイブリダイズしたシグナルを増幅する試薬を含む、FGFR3遺伝子とTACC3遺伝子との融合遺伝子の検出用キット、
[20]前記ポリペプチドの存在を検出する工程が、i)被験者から得た試料に該ポリペプチドのFGFR3遺伝子由来部分を認識する抗体(一次抗体)及び該ポリペプチドのTACC3遺伝子由来部分を認識する抗体(一次抗体)を接触させる工程、ii)該一次抗体にそれぞれ結合する、オリゴヌクレオチドを連結したそれぞれの二次抗体を添加する工程、iii)該二次抗体が連結した該オリゴヌクレオチドと部分的に相補的な二種類のオリゴヌクレオチド及びそれらが近接した際にライゲーションさせて該二次抗体間に環状構造を形成することができるライゲースを含有するライゲーション溶液を添加し、ライゲーション反応させる工程、iv)形成された環状構造に沿って核酸を伸長させる工程、v)伸長した核酸にハイブリダイズすることのできる標識されたオリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせる工程、及び、vi)該標識シグナルを検出する工程を含むことを特徴とする、[1]〜[5]のいずれかに記載のFGFR3とTACC3との融合蛋白質の検出方法、
[21][1]〜[5]のいずれかに記載のFGFR3とTACC3との融合蛋白質の検出方法で使用するための、前記融合ポリペプチドのFGFR3遺伝子由来部分を認識する抗体(一次抗体)及び前記融合ポリペプチドのTACC3遺伝子由来部分を認識する抗体(一次抗体)、該一次抗体にそれぞれ結合する、オリゴヌクレオチドを連結した二次抗体、該二次抗体に連結した該オリゴヌクレオチドと部分的に相補的な二種類のオリゴヌクレオチド、それらが近接した際にライゲーションさせて該二次抗体間に環状構造を形成することができるライゲース、及び標識されたオリゴヌクレオチドプローブを含む、FGFR3とTACC3との融合蛋白質の検出用キット、
[22]下記に記載のポリペプチドを阻害する物質を含有する、FGFR3遺伝子とTACC3遺伝子との融合遺伝子陽性又はFGFR3とTACC3との融合蛋白質陽性の癌治療用医薬組成物:
配列番号2のアミノ酸番号461〜947、配列番号4のアミノ酸番号461〜982又は配列番号6のアミノ酸番号461〜996に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
[23]前記ポリペプチドが、配列番号2のアミノ酸番号461〜947 、配列番号4のアミノ酸番号461〜982又は配列番号6のアミノ酸番号461〜996に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号2のアミノ酸番号461〜947、配列番号4のアミノ酸番号461〜982又は配列番号6のアミノ酸番号461〜996に示されるアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチドである、[22]に記載の医薬組成物、
[24]前記ポリペプチドが、配列番号2のアミノ酸番号461〜947、配列番号4のアミノ酸番号461〜982又は配列番号6のアミノ酸番号461〜996に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、[22]に記載の医薬組成物、
[25]前記ポリペプチドが、配列番号2、配列番号4又は配列番号6に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチドである、[22]に記載の医薬組成物、
[26]前記ポリペプチドが、配列番号2、配列番号4又は配列番号6に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号2、配列番号4又は配列番号6に示されるアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチドである、[22]に記載の医薬組成物、
[27]前記ポリペプチドが、配列番号2、配列番号4又は配列番号6に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである[22]に記載の医薬組成物、
[28]前記ポリペプチドを阻害する物質が、Dovitinib、AZD4547、BGJ398又はLY2874455である、[22]〜[27]のいずれかに記載の癌治療用医薬組成物、
[29]前記癌が、肺癌又は膀胱癌である、[22]〜[27]のいずれかに記載の癌治療用医薬組成物。
[30]FGFR3遺伝子とTACC3遺伝子との融合遺伝子陽性又はFGFR3とTACC3との融合蛋白質陽性の癌治療用医薬組成物の製造のための、下記に記載のポリペプチドを阻害する物質の使用:
配列番号2のアミノ酸番号461〜947、配列番号4のアミノ酸番号461〜982又は配列番号6のアミノ酸番号461〜996に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
[31]FGFR3遺伝子とTACC3遺伝子との融合遺伝子陽性又はFGFR3とTACC3との融合蛋白質陽性の癌の治療のための、下記に記載のポリペプチドを阻害する物質の使用:
配列番号2のアミノ酸番号461〜947、配列番号4のアミノ酸番号461〜982又は配列番号6のアミノ酸番号461〜996に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
[32]FGFR3遺伝子とTACC3遺伝子との融合遺伝子陽性又はFGFR3とTACC3との融合蛋白質陽性の癌の治療のための、下記に記載のポリペプチドを阻害する物質:
配列番号2のアミノ酸番号461〜947、配列番号4のアミノ酸番号461〜982又は配列番号6のアミノ酸番号461〜996に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
[33]下記に記載のポリペプチドを阻害する物質の有効量を対象に投与することからなる、FGFR3遺伝子とTACC3遺伝子との融合遺伝子陽性又はFGFR3とTACC3との融合蛋白質陽性の癌の治療方法:
配列番号2のアミノ酸番号461〜947、配列番号4のアミノ酸番号461〜982又は配列番号6のアミノ酸番号461〜996に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
下記工程を含むことを特徴とするFGFR3遺伝子とTACC3遺伝子との融合遺伝子陽性の癌(特には肺癌又は膀胱癌)の存在の検出方法:
被験者から得た試料中の、下記(1)〜(3)に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在を検出する工程、
(1)配列番号2のアミノ酸番号461〜947(又は配列番号2)、配列番号4のアミノ酸番号461〜982(又は配列番号4)、配列番号6のアミノ酸番号461〜996(又は配列番号6)、配列番号26のアミノ酸番号461〜1043(又は配列番号26)又は配列番号28のアミノ酸番号461〜1040(又は配列番号28)に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
(2)配列番号2のアミノ酸番号461〜947(又は配列番号2)、配列番号4のアミノ酸番号461〜982(又は配列番号4)、配列番号6のアミノ酸番号461〜996(又は配列番号6)、配列番号26のアミノ酸番号461〜1043(又は配列番号26)又は配列番号28のアミノ酸番号461〜1040(又は配列番号28)に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号2のアミノ酸番号461〜947(又は配列番号2)、配列番号4のアミノ酸番号461〜982(又は配列番号4)、配列番号6のアミノ酸番号461〜996(又は配列番号6)、配列番号26のアミノ酸番号461〜1043(又は配列番号26)又は配列番号28のアミノ酸番号461〜1040(又は配列番号28)に示されるアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、あるいは、
(3)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号26又は配列番号28に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
に関する。
また、本発明は、
該ポリヌクレオチドの存在を検出する工程が、被験者から得た試料及び前記[17]記載の標識プローブセットを用いてインサイチュハイブリダイゼーションを行う工程、並びに前記標識のシグナルの重なりを検出する工程を含むことを特徴とする、本段落に記載のFGFR3遺伝子とTACC3遺伝子との融合遺伝子陽性の癌(特には肺癌又は膀胱癌)の存在の検出方法、
に関する。
下記工程を含むことを特徴とするFGFR3遺伝子とTACC3遺伝子との融合遺伝子陽性の癌(特には肺癌又は膀胱癌)の診断方法:
被験者から得た試料中の、下記(1)〜(3)に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在を検出する工程、
(1)配列番号2のアミノ酸番号461〜947(又は配列番号2)、配列番号4のアミノ酸番号461〜982(又は配列番号4)、配列番号6のアミノ酸番号461〜996(又は配列番号6)、配列番号26のアミノ酸番号461〜1043(又は配列番号26)又は配列番号28のアミノ酸番号461〜1040(又は配列番号28)に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
(2)配列番号2のアミノ酸番号461〜947(又は配列番号2)、配列番号4のアミノ酸番号461〜982(又は配列番号4)、配列番号6のアミノ酸番号461〜996(又は配列番号6)、配列番号26のアミノ酸番号461〜1043(又は配列番号26)又は配列番号28のアミノ酸番号461〜1040(又は配列番号28)に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号2のアミノ酸番号461〜947(又は配列番号2)、配列番号4のアミノ酸番号461〜982(又は配列番号4)、配列番号6のアミノ酸番号461〜996(又は配列番号6)、配列番号26のアミノ酸番号461〜1043(又は配列番号26)又は配列番号28のアミノ酸番号461〜1040(又は配列番号28)に示されるアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、あるいは、
(3)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号26又は配列番号28に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
に関する。
また、本発明は、
該ポリヌクレオチドの存在を検出する工程が、被験者から得た試料及び前記[17]記載の標識プローブセットを用いてインサイチュハイブリダイゼーションを行う工程、並びに前記標識のシグナルの重なりを検出する工程を含むことを特徴とする、本段落に記載のFGFR3遺伝子とTACC3遺伝子との融合遺伝子陽性の癌(特には肺癌又は膀胱癌)の診断方法、
に関する。
また、別の態様として、本発明は、上記2つの態様の診断方法によりFGFR3遺伝子とTACC3遺伝子との融合遺伝子陽性の癌(特には肺癌又は膀胱癌)と診断された患者に対して本発明のポリペプチドを阻害する物質(ある態様では化合物AZD4547、化合物Dovitinib、化合物BGJ398又は化合物LY2874455)を投与することを含む、FGFR3遺伝子とTACC3遺伝子との融合遺伝子陽性の癌(特には肺癌又は膀胱癌)の治療方法、
に関する。
下記工程を含むことを特徴とするFGFR3遺伝子とTACC3遺伝子との融合遺伝子陽性の癌(特には肺癌又は膀胱癌)の存在の検出方法:
(1)被験者から得た試料を鋳型とし、前記[11]〜[16]のいずれかに記載されたプライマーセットを用いてPCRを行う工程、及び
(2)PCR産物の存在を検出する工程、
に関する。
下記工程を含むことを特徴とするFGFR3遺伝子とTACC3遺伝子との融合遺伝子陽性の癌(特には肺癌又は膀胱癌)の診断方法:
(1)被験者から得た試料を鋳型とし、前記[11]〜[16]のいずれかに記載されたプライマーセットを用いてPCRを行う工程、及び
(2)PCR産物の存在を検出する工程、
に関する。
また、別の態様として、本発明は、上記の診断方法によりFGFR3遺伝子とTACC3遺伝子との融合遺伝子陽性の癌(特には肺癌又は膀胱癌)と診断された患者に対して本発明のポリペプチドを阻害する物質(ある態様では化合物AZD4547、化合物Dovitinib、化合物BGJ398又は化合物LY2874455)を投与することを含む、FGFR3遺伝子とTACC3遺伝子との融合遺伝子陽性の癌(特には肺癌又は膀胱癌)の治療方法、
に関する。
下記工程を含むことを特徴とする、染色体の再構成(genomic rearrangement)を検出する方法:
被験者から得た試料中の、下記(1)〜(3)に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在を検出する工程、
(1)配列番号2のアミノ酸番号461〜947(又は配列番号2)、配列番号4のアミノ酸番号461〜982(又は配列番号4)配列番号6のアミノ酸番号461〜996(又は配列番号6)、配列番号26のアミノ酸番号461〜1043(又は配列番号26)又は配列番号28のアミノ酸番号461〜1040(又は配列番号28)に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
(2)配列番号2のアミノ酸番号461〜947(又は配列番号2)、配列番号4のアミノ酸番号461〜982(又は配列番号4)配列番号6のアミノ酸番号461〜996(又は配列番号6)、配列番号26のアミノ酸番号461〜1043(又は配列番号26)又は配列番号28のアミノ酸番号461〜1040(又は配列番号28)に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号2のアミノ酸番号461〜947(又は配列番号2)、配列番号4のアミノ酸番号461〜982(又は配列番号4)配列番号6のアミノ酸番号461〜996(又は配列番号6)、配列番号26のアミノ酸番号461〜1043(又は配列番号26)又は配列番号28のアミノ酸番号461〜1040(又は配列番号28)に示されるアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、あるいは、
(3)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号26又は配列番号28に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
に関する。
下記工程を含むことを特徴とする、染色体の再構成(genomic rearrangement)を検出する方法:
(1)i)被験者から得た試料、ii)FGFR3遺伝子をコードする5’側ゲノム領域を含む蛍光標識プローブ(第一プローブ)、及びiii)TACC3遺伝子をコードする3’ゲノム領域を含む蛍光標識プローブ(第二プローブ)を用い(ここで、第一プローブと第二プローブの蛍光は異なる)、インサイチュハイブリダイゼーションを行う工程、及び
(2)前記標識のシグナルの重なりを検出する工程、
に関する。
下記工程を含むことを特徴とするFGFR3遺伝子とTACC3遺伝子との融合遺伝子陽性の癌(特には肺癌又は膀胱癌)の存在の検出方法:
(1)i)被験者から得た試料、ii)FGFR3遺伝子をコードする5’側ゲノム領域を含む蛍光標識プローブ(第一プローブ)、及びiii)TACC3遺伝子をコードする3’ゲノム領域を含む蛍光標識プローブ(第二プローブ)を用い(ここで、第一プローブと第二プローブの蛍光は異なる)、インサイチュハイブリダイゼーションを行う工程、及び
(2)前記標識のシグナルの重なりを検出する工程、
に関する。
下記工程を含むことを特徴とするFGFR3遺伝子とTACC3遺伝子との融合遺伝子陽性の癌(特には肺癌又は膀胱癌)の診断方法:
(1)i)被験者から得た試料、ii)FGFR3遺伝子をコードする5’側ゲノム領域を含む蛍光標識プローブ(第一プローブ)、及びiii)TACC3遺伝子をコードする3’ゲノム領域を含む蛍光標識プローブ(第二プローブ)を用い(ここで、第一プローブと第二プローブの蛍光は異なる)、インサイチュハイブリダイゼーションを行う工程、及び
(2)前記標識のシグナルの重なりを検出する工程、
に関する。
また、別の態様として、本発明は、上記の診断方法によりFGFR3遺伝子とTACC3遺伝子との融合遺伝子陽性の癌(特には肺癌又は膀胱癌)と診断された患者に対して本発明のポリペプチドを阻害する物質(ある態様では化合物AZD4547、化合物Dovitinib、化合物BGJ398、又は化合物LY2874455)を投与することを含む、FGFR3遺伝子とTACC3遺伝子との融合遺伝子陽性の癌(特には肺癌又は膀胱癌)の治療方法、
に関する。
下記(1)〜(3)に記載のポリペプチド(以下、「本発明のポリペプチド」とも称する)又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(以下、「本発明のポリヌクレオチド」とも称する):
(1)配列番号2のアミノ酸番号461〜947(又は配列番号2)、配列番号4のアミノ酸番号461〜982(又は配列番号4)、配列番号6のアミノ酸番号461〜996(又は配列番号6)、配列番号26のアミノ酸番号461〜1043(又は配列番号26)又は配列番号28のアミノ酸番号461〜1040(又は配列番号28)に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
(2)配列番号2のアミノ酸番号461〜947(又は配列番号2)、配列番号4のアミノ酸番号461〜982(又は配列番号4)、配列番号6のアミノ酸番号461〜996(又は配列番号6)、配列番号26のアミノ酸番号461〜1043(又は配列番号26)又は配列番号28のアミノ酸番号461〜1040(又は配列番号28)に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号2のアミノ酸番号461〜947(又は配列番号2)、配列番号4のアミノ酸番号461〜982(又は配列番号4)、配列番号6のアミノ酸番号461〜996(又は配列番号6)、配列番号26のアミノ酸番号461〜1043(又は配列番号26)又は配列番号28のアミノ酸番号461〜1040(又は配列番号28)に示されるアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、あるいは、
(3)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号26又は配列番号28に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
に関する。
(1)配列番号2のアミノ酸番号461〜947(又は配列番号2)、配列番号4のアミノ酸番号461〜982(又は配列番号4)、配列番号6のアミノ酸番号461〜996(又は配列番号6)、配列番号26のアミノ酸番号461〜1043(又は配列番号26)又は配列番号28のアミノ酸番号461〜1040(又は配列番号28)に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
(2)配列番号2のアミノ酸番号461〜947(又は配列番号2)、配列番号4のアミノ酸番号461〜982(又は配列番号4)、配列番号6のアミノ酸番号461〜996(又は配列番号6)、配列番号26のアミノ酸番号461〜1043(又は配列番号26)又は配列番号28のアミノ酸番号461〜1040(又は配列番号28)に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号2のアミノ酸番号461〜947(又は配列番号2)、配列番号4のアミノ酸番号461〜982(又は配列番号4)、配列番号6のアミノ酸番号461〜996(又は配列番号6)、配列番号26のアミノ酸番号461〜1043(又は配列番号26)又は配列番号28のアミノ酸番号461〜1040(又は配列番号28)に示されるアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、あるいは、
(3)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号26又は配列番号28に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
に関する。
下記工程を含むことを特徴とするFGFR3とTACC3との融合蛋白質陽性の癌(特には肺癌又は膀胱癌)の存在の検出方法:
被験者から得た試料中の、下記(1)〜(3)に記載のポリペプチドの存在を検出する工程、
(1)配列番号2のアミノ酸番号461〜947(又は配列番号2)、配列番号4のアミノ酸番号461〜982(又は配列番号4)、配列番号6のアミノ酸番号461〜996(又は配列番号6)、配列番号26のアミノ酸番号461〜1043(又は配列番号26)又は配列番号28のアミノ酸番号461〜1040(又は配列番号28)に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
(2)配列番号2のアミノ酸番号461〜947(又は配列番号2)、配列番号4のアミノ酸番号461〜982(又は配列番号4)、配列番号6のアミノ酸番号461〜996(又は配列番号6)、配列番号26のアミノ酸番号461〜1043(又は配列番号26)又は配列番号28のアミノ酸番号461〜1040(又は配列番号28)に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号2のアミノ酸番号461〜947(又は配列番号2)、配列番号4のアミノ酸番号461〜982(又は配列番号4)、配列番号6のアミノ酸番号461〜996(又は配列番号6)、配列番号26のアミノ酸番号461〜1043(又は配列番号26)又は配列番号28のアミノ酸番号461〜1040(又は配列番号28)に示されるアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、あるいは、
(3)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号26又は配列番号28に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
に関する。
下記工程を含むことを特徴とするFGFR3とTACC3との融合蛋白質陽性の癌(特には肺癌又は膀胱癌)の診断方法:
被験者から得た試料中の、下記(1)〜(3)に記載のポリペプチドの存在を検出する工程、
(1)配列番号2のアミノ酸番号461〜947(又は配列番号2)、配列番号4のアミノ酸番号461〜982(又は配列番号4)、配列番号6のアミノ酸番号461〜996(又は配列番号6)、配列番号26のアミノ酸番号461〜1043(又は配列番号26)又は配列番号28のアミノ酸番号461〜1040(又は配列番号28)に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
(2)配列番号2のアミノ酸番号461〜947(又は配列番号2)、配列番号4のアミノ酸番号461〜982(又は配列番号4)、配列番号6のアミノ酸番号461〜996(又は配列番号6)配列番号26のアミノ酸番号461〜1043(又は配列番号26)又は配列番号28のアミノ酸番号461〜1040(又は配列番号28)に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号2のアミノ酸番号461〜947(又は配列番号2)、配列番号4のアミノ酸番号461〜982(又は配列番号4)、配列番号6のアミノ酸番号461〜996(又は配列番号6)、配列番号26のアミノ酸番号461〜1043(又は配列番号26)又は配列番号28のアミノ酸番号461〜1040(又は配列番号28)に示されるアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、あるいは、
(3)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号26又は配列番号28に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
に関する。
また、別の態様として、本発明は、上記の診断方法によりFGFR3とTACC3との融合蛋白質陽性の癌(特には肺癌又は膀胱癌)と診断された患者に対して、上記(1)〜(3)に記載のポリペプチドを阻害する物質(ある態様では化合物AZD4547、化合物Dovitinib、化合物BGJ398、又は化合物LY2874455)を投与することを含むFGFR3遺伝子とTACC3遺伝子との融合遺伝子陽性の癌(特には肺癌又は膀胱癌)の治療方法、
に関する。
また、Hum Mol Genet. 2012. Nov21(Hum Mol Genet. 2013 Feb 15;22(4):795−803)には、癌化能を有するFGFR3とTACC3との融合遺伝子(本発明のFGFR3−TACC3_v1)が膀胱癌に存在することが報告されているが、本発明のFGFR3−TACC3_v1を開示した本願最先の優先日(2012年3月8日)及び本願第2の優先日(2012年9月5日)後の文献である。当該文献には、本発明のFGFR3−TACC3_v2、FGFR3−TACC3_v3、FGFR3−TACC3_v5a、及びFGFR3−TACC3_v5bやその検出方法プライマーセット、プローブセット、検出キットは全く開示も示唆もされていない。また、肺癌についての記載も示唆もない。
さらに、J Clin Invest. 2013 February 1; 123(2): 855_865.にはいくつかの癌化能を有するFGFR3遺伝子とTACC3遺伝子との融合遺伝子がグリオブラストーマに存在することが報告されているが、本文献は、本発明のFGFR3−TACC3_v1及びFGFR3−TACC3_v2を開示した本願最先の優先日(2012年3月8日)、本願第2の優先日(2012年9月5日)及び本願第3の優先日(2012年12月21日)より後に出版された文献である。当該文献には、本発明のFGFR3−TACC3_v3、FGFR3−TACC3_v5a、及びFGFR3−TACC3_v5bやその検出方法プライマーセット、プローブセット、検出キットは全く開示も示唆もされていない。また、肺癌及び膀胱癌についての記載も示唆もない。
本発明の検出方法は、融合遺伝子又は融合蛋白質を検出する方法であり、該方法は、被験者から得た試料中の、特定のポリヌクレオチド、又は、ポリペプチドの存在を検出する工程を含む。被験者から得た試料としては、被験者からの採取物(生体から分離した試料)、具体的には、任意の採取された組織、体液(好ましくは血液)、肺胞・気管支洗浄液、生検された試料、尿中癌細胞、喀痰試料を用いるが、好適には、被験者の肺患部又は膀胱患部の生検試料又は喀痰試料を用いる。試料からゲノムDNAを抽出して用いることができ、またその転写産物(ゲノムが転写及び翻訳される結果生じる産物;例えばmRNA、cDNA、蛋白質)を用いることができる。特にはmRNA又はcDNAを調製して用いることが好ましい。また、試料をフォルマリン固定してパラフィンに包埋して安定化した標本(FFPE)を用いることができる。FFPEを薄くスライスしたFFPE切片中を用いてもよい。FFPE切片中を用いれば、そこに存在するポリヌクレオチドやポリペプチドを直接検出することができる。
(1)配列番号2のアミノ酸番号461〜947、配列番号4のアミノ酸番号461〜982、配列番号6のアミノ酸番号461〜996、配列番号26のアミノ酸番号461〜1043又は配列番号28のアミノ酸番号461〜1040に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド[以下、「相同ポリペプチド」とも称する]、
(2)配列番号2のアミノ酸番号461〜947、配列番号4のアミノ酸番号461〜982、配列番号6のアミノ酸番号461〜996、配列番号26のアミノ酸番号461〜1043又は配列番号28のアミノ酸番号461〜1040に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号2のアミノ酸番号461〜947、配列番号4のアミノ酸番号461〜982、配列番号6のアミノ酸番号461〜996、配列番号26のアミノ酸番号461〜1043又は配列番号28のアミノ酸番号461〜1040に示されるアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド[以下、「機能的等価改変体ポリペプチド」とも称する]、あるいは、
(3)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号26又は配列番号28に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(1)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号26又は配列番号28に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
(2)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号26又は配列番号28に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号26又は配列番号28に示されるアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、あるいは、
(3)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号26又は配列番号28に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
Gap penalty = 10
Extend penalty = 0.5
Matrix = EBLOSUM62
本発明のプライマーセットを含む検出用キットには、少なくとも、本発明の検出方法における検出対象ポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマー(プライマーセットとも称する)が含まれる。本発明のプライマーセットは、検出対象ポリヌクレオチド増幅用のプライマーとして機能するポリヌクレオチドのセットである。
FGFR3遺伝子に由来する部分から設計されるセンスプライマー及びTACC3遺伝子に由来する部分から設計されるアンチセンスプライマーを含む、FGFR3遺伝子とTACC3遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、該アンチセンスプライマーは「検出対象ポリヌクレオチド」にストリンジェントな条件下(好ましくは、よりストリンジェントな条件下)でハイブリダイズする核酸分子(好ましくは、少なくとも16塩基の核酸分子)からなり、該センスプライマーは「検出対象ポリヌクレオチド」の相補鎖にストリンジェントな条件(好ましくは、よりストリンジェントな条件下)でハイブリダイズする核酸分子(好ましくは、少なくとも16塩基の核酸分子)からなる、プライマーセット
が含まれる。
本発明のプライマーセットにおいて、センスプライマー又はアンチセンスプライマーの一方を、該融合ポリヌクレオチドの融合点(前述)を含む部分に対応するように設計してもよい。
(1)配列番号1の塩基番号1から2280間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号1の塩基番号2281から2856間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
(2)配列番号3の塩基番号1から2280間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号3の塩基番号2281から2961間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
(3)配列番号5の塩基番号1から2368間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号5の塩基番号2369から3003間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
(4)配列番号25の塩基番号1〜2242の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号25の塩基番号2243〜3144の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット、
[16]配列番号27の塩基番号1〜2233の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号27の塩基番号2234〜3135の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット
また、本発明のプライマーは、通常、15〜40塩基、好ましくは16〜24塩基、更に好ましくは18〜24塩基、特に好ましくは20〜24塩基の鎖長を有する。
FGFR3遺伝子に由来する部分(例えば、前記融合ポリヌクレオチド(mRNA)のFGFR3遺伝子領域内の任意の部分)から設計したプローブとTACC3遺伝子に由来する部分(例えば、前記融合ポリヌクレオチド(mRNA)のTACC3遺伝子領域内の任意の部分)から設計したプローブとを含む、FGFR3遺伝子とTACC3遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプローブセットであって、各プローブは「検出対象ポリヌクレオチド」にハイブリダイズする核酸分子からなる、プローブセットが含まれる。
ある態様では、各プローブは、分岐DNAプローブ(branched DNA probe)であり、配列情報に基づいた分岐DNAプローブはアフィメトリクス社より入手できる。
(1)配列番号1の塩基番号1〜2280の任意の連続する少なくとも16塩基に対して相補的なオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアからなるプローブセットを複数種(好ましくは、20種のプローブセットを含む)、及び、配列番号1の塩基番号2281〜2856の任意の連続する少なくとも16塩基に対して相補的なオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアからなるプローブセットを複数種(好ましくは、20種のプローブセットを含む)を含むプローブセット、
(2)配列番号3の塩基番号1〜2280の任意の連続する少なくとも16塩基に対して相補的なオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアからなるプローブセットを複数種(好ましくは、20種のプローブセットを含む)及び配列番号3の塩基番号2281〜2961の任意の連続する少なくとも16塩基に対して相補的なオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアからなるプローブセットを複数種(好ましくは、20種のプローブセットを含む)を含むプローブセット、
(3)配列番号5の塩基番号1〜2368の任意の連続する少なくとも16塩基に対して相補的なオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアからなるプローブセットを複数種(好ましくは、20種のプローブセットを含む)及び配列番号5の塩基番号2369〜3003の任意の連続する少なくとも16塩基に対して相補的なオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアからなるプローブセットを複数種(好ましくは、20種のプローブセットを含む)を含むプローブセット。
ここで、隣接したプローブペアからなるプローブセットは、多い方がシグナルが得られやすいため、好ましい。ある態様では、20種程度が用いられる。
癌患者の検体から単離同定した融合ポリヌクレオチド(実施例1〜3)は、癌の原因遺伝子であることが示され(実施例8、実施例11)、一部の肺癌又は膀胱癌患者に融合ポリヌクレオチドの存在が検出された(実施例4〜6)。更に、本発明のポリペプチドの活性及び/又は発現を阻害することにより足場非依存性の細胞増殖が阻害される(すなわち抗癌作用が示される)という本発明者らが見出した新規な知見(実施例9、実施例12、実施例13、実施例14、実施例16)から、本発明のポリペプチドを阻害(本発明のポリペプチドの活性及び/又は発現を阻害)する物質は、本発明のポリヌクレオチド陽性又は本発明のポリペプチド陽性の癌治療効果を有することがわかった。
本発明には、本発明のポリペプチドを阻害する物質(例えば、後述の医薬組成物の有効成分をスクリーニングする方法のいずれかによって得られた物質[例えば、二重鎖核酸(siRNAを含む)、蛋白質(抗体又は抗体断片を含む)、ペプチド、又はそれ以外の化合物])を有効成分とする本発明のポリヌクレオチド陽性又は本発明のポリペプチド陽性の癌治療用医薬組成物が包含される。
また、公知のFGFR3阻害活性を有する低分子化合物(FGFR3阻害剤)から後述の医薬組成物の有効成分をスクリーニングする方法によって選択した化合物を本発明の医薬組成物における有効成分として用いることができる。特に、化合物AZD4547、化合物Dovitinib、化合物BGJ398及び化合物LY2874455を例示することができる。
(1)3,5-ジメトキシ安息香酸メチル(1g)とアセトニトリル(20mL)の混合物を氷冷し、N-フルオロ-N'-(クロロメチル)トリエチレンジアミンビス(テトラフルオロボラート) (4.09g)を加え、室温で終夜撹拌した。反応混合物に飽和重曹水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウム及び塩基性シリカゲルを加え、30分間撹拌した後、濾過した。濾液を減圧濃縮した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン)で精製し、2,6-ジフルオロ-3,5-ジメトキシ安息香酸メチル(292mg)を得た。
ESI+:233.
(2)2,6-ジフルオロ-3,5-ジメトキシ安息香酸メチル(10g)とテトラヒドロフラン(50mL)の混合物を氷冷し、水素化ホウ素リチウム(3.0M テトラヒドロフラン溶液, 43mL)を加えた後、室温で65時間撹拌した。反応混合物を再び氷冷し、さらに水素化ホウ素リチウム(3.0M テトラヒドロフラン溶液, 14mL)を加え、室温で22時間撹拌した。反応混合物を氷冷し、氷水(300mL)の中にゆっくり加えた。さらに濃塩酸(25mL)をゆっくり加えて、室温で1時間撹拌した。トルエン/酢酸エチル(1:1)で抽出し、有機層を飽和重曹水及び飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した。濾液を減圧濃縮し、(2,6-ジフルオロ-3,5-ジメトキシフェニル)メタノール(8.67g)を得た。
ESI+:205.
(3)(2,6-ジフルオロ-3,5-ジメトキシフェニル)メタノール(1.71g)、トリエチルアミン(2.57mL)及びテトラヒドロフラン(34mL)の混合物を氷冷し、メタンスルホニル クロリド(716μL)を加えた後、1時間撹拌した。反応混合物に水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濾過した。濾液を減圧濃縮し、2,6-ジフルオロ-3,5-ジメトキシベンジル メタンスルホネート(2.32g)を得た。
NMR2:3.04(3H,s),3.88(6H,s),5.34(2H,s),6.72(1H,t,J=8.2Hz).
(4)2-クロロ-5-ヒドロキシピリミジン(4.38g)、炭酸カリウム(9.27g)及びN,N-ジメチルホルムアミド(79mL)の混合物に、2,6-ジフルオロ-3,5-ジメトキシベンジル メタンスルホネート(7.89g)を加えた後、60℃で1時間撹拌した。反応混合物に水を加え、生じた固体を濾取し、水で洗浄した後、減圧乾燥し、2-クロロ-5-[(2,6-ジフルオロ-3,5-ジメトキシベンジル)オキシ]ピリミジン(8.53g)を得た。
APCI/ESI+:317.
(5)アルゴン雰囲気下、2-クロロ-5-[(2,6-ジフルオロ-3,5-ジメトキシベンジル)オキシ]ピリミジン(1.03g)、3-メトキシ-4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]アニリン(1.29g)、1,1'-ビナフタレン-2,2'-ジイルビス(ジフェニルホスフィン)(609mg)、炭酸セシウム(3.19g)及びジオキサン(20.6mL)の混合物に、酢酸パラジウム(146mg)を室温で加え、100℃で4時間撹拌した。反応混合物に水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後濾過した。濾液を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール/濃アンモニア水)、続いて塩基性シリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル)で精製した後、酢酸エチル、続いてエタノールで再結晶し、5-[(2,6-ジフルオロ-3,5-ジメトキシベンジル)オキシ]-N-{3-メトキシ-4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]フェニル}ピリミジン-2-アミン(化合物A:830mg)を得た。
ESI+:585.
NMR1:1.45-1.60(2H,m),1.73-1.84(2H,m),2.14(3H,s),2.17-2.58(11H,m),3.24-3.36(2H,m),3.75(3H,s),3.87(6H,s),5.16(2H,s),6.79(1H,d,J=8.8Hz),7.07(1H,t,J=8.4Hz),7.24(1H,dd,J=8.8,2.4Hz),7.32(1H,d,J=2.4Hz),8.29(2H,s),9.21(1H,s).
(1)アルゴン雰囲気下、製造例1(4)と同様の方法で製造した2-クロロ-5-[ (2,6-ジフルオロ-3,5-ジメトキシベンジル)オキシ]ピリミジン(800mg)、2-(4-アミノ-1H-ピラゾール-1-イル)エタノール(642mg)、1,1'-ビナフタレン-2,2'-ジイルビス(ジフェニルホスフィン)(472mg)、炭酸セシウム(2.47g)及びジオキサン(16mL)の混合物に、酢酸パラジウム(113mg)を室温で加え、100℃で6時間撹拌した。反応混合物に水とクロロホルムを加え、不溶物をセライト濾過で濾別した後、濾液をクロロホルムで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後濾過した。濾液を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール)で精製し、2-[4-({5-[(2,6-ジフルオロ-3,5-ジメトキシベンジル)オキシ]ピリミジン-2-イル}アミノ)-1H-ピラゾール-1-イル]エタノール(化合物B:139mg)を得た。
ESI+:408.
NMR1:3.69(2H,dd,J=11.0,5.6Hz),3.87(6H,s),4.07(2H,t,J=5.6Hz),4.83(1H,t,J=5.4Hz),5.14(2H,s),7.07(1H,t,J=8.4Hz),7.45(1H,d,J=0.6Hz),7.88(1H,d,J=0.6Hz),8.26(2H s),9.20(1H,s).
(1)アルゴン雰囲気下、製造例1(4)と同様の方法で製造した2-クロロ-5-[(2,6-ジクロロ-3,5-ジメトキシベンジル)オキシ]ピリミジン(1.33g)、1-(テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)-1H-ピラゾール-4-アミン(913mg)、1,1'-ビナフタレン-2,2'-ジイルビス(ジフェニルホスフィン)(785mg)、炭酸セシウム(4.11g)及びジオキサン(26.6mL)の混合物に、酢酸パラジウム(189mg)を室温で加え、100℃で4時間撹拌した。反応混合物に水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濾過した。濾液を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン)で精製し、5-[(2,6-ジフルオロ-3,5-ジメトキシベンジル)オキシ]-N-[1-(テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)-1H-ピラゾール-4-イル]ピリミジン-2-アミン(1.73g)を得た。
APCI/ESI+:448.
(2)5-[(2,6-ジフルオロ-3,5-ジメトキシベンジル)オキシ]-N-[1-(テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)-1H-ピラゾール-4-イル]ピリミジン-2-アミン(3.59g)及びメタノール(20mL)の混合物に、4M塩化水素/ジオキサン溶液(40mL)を加え、室温で6時間撹拌した。反応混合物を減圧濃縮した後、残渣に飽和重曹水を加えた。生じた固体を濾取し、ジエチルエーテルで洗浄した後、減圧乾燥し、5-[(2,6-ジフルオロ-3,5-ジメトキシベンジル)オキシ]-N-(1H-ピラゾール-4-イル)ピリミジン-2-アミン(2.9g)を得た。
APCI/ESI+: 364.
(3)5-[(2,6-ジフルオロ-3,5-ジメトキシベンジル)オキシ]-N-(1H-ピラゾール-4-イル)ピリミジン-2-アミン(50mg)、炭酸カリウム(57mg)及びN,N-ジメチルホルムアミド(1mL)の混合物に[(4S)-2,2-ジメチル-1,3-ジオキソラン-4-イル]メチル 4-メチルベンゼンスルホネート(118mg)を加え、60℃で1時間、110℃で4日間撹拌した。反応混合物に水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、濾過した。濾液を減圧濃縮した後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン)で精製し、5-[(2,6-ジフルオロ-3,5-ジメトキシベンジル)オキシ]-N-(1-{[(4R)-2,2-ジメチル-1,3-ジオキソラン-4-イル]メチル}-1H-ピラゾール-4-イル)ピリミジン-2-アミン(39mg)を得た。
APCI/ESI+:478.
(4)5-[(2,6-ジフルオロ-3,5-ジメトキシベンジル)オキシ]-N-(1-{[(4R)-2,2-ジメチル-1,3-ジオキソラン-4-イル]メチル}-1H-ピラゾール-4-イル)ピリミジン-2-アミン(45mg)及びテトラヒドロフラン(2mL)の混合物に1M塩酸(1mL)を加え、50℃で3時間撹拌した。反応混合物に飽和重曹水を加え、クロロホルムで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濾過した。濾液を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール)で精製した後、酢酸エチルで固化し、(2R)-3-[4-({5-[(2,6-ジフルオロ-3,5-ジメトキシベンジル)オキシ]ピリミジン-2-イル}アミノ)-1H-ピラゾール-1-イル]プロパン-1,2-ジオール(化合物C:25mg)を得た。
ESI+:438.
NMR1:3.23-3.38(2H,m),3.72-3.80(1H,m),3.84-3.96(7H,m),4.15(1H,dd,J=13.8,4.1Hz),4.67(1H,t,J=5.6Hz),4.91(1H,d,J=5.3Hz),5.14(2H,s),7.06(1H,t,J=8.4Hz),7.45(1H,d,J=0.6Hz),7.87(1H,d,J=0.6Hz),8.26(2H,s),9.21(1H,s).
(1)製造例1(5)と同様にして、4-(4-メチルピペラジン-1-イル)アニリン、及び、製造例1(4)と同様の方法で製造した2-クロロ-5-[(2,6-ジフルオロ-3,5-ジメトキシベンジル)オキシ]ピリミジンを原料として用いて、5-[(2,6-ジフルオロ-3,5-ジメトキシベンジル)オキシ]-N-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)フェニル]ピリミジン-2-アミン(化合物D)を得た。
ESI+:472.
NMR1:2.21(3H,s),2.41-2.48(4H,m),2.98-3.08(4H,m),3.87(6H,s),5.15(2H,s),6.81-6.90(2H,m),7.07(1H,t,J=8.4Hz),7.47-7.55(2H,m),8.26(2H,s),9.15(1H,s).
(1)(1-メチル-3-ニトロ-1H-ピラゾール-5-イル)メタノール(398mg)、3,4-ジヒドロ-2H-ピラン(459μL)及び酢酸エチル(8mL)の混合物に、p-トルエンスルホン酸 一水和物(96mg)を加え、室温で1.5時間撹拌した。さらに3,4-ジヒドロ-2H-ピラン(459μL)及びp-トルエンスルホン酸 一水和物(96mg)を加え、室温で1.5時間撹拌した。反応混合物に水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濾過した。濾液を減圧濃縮した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル)で精製し、1-メチル-3-ニトロ-5-[(テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イルオキシ)メチル]-1H-ピラゾール(487mg)を得た。
APCI/ESI+:242.
(2)アルゴン雰囲気下、1-メチル-3-ニトロ-5-[(テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イルオキシ)メチル]-1H-ピラゾール(487mg)、テトラヒドロフラン(4.9mL)及びエタノール(4.9mL)の混合物に、10%パラジウム-炭素(50mg)を加えた。水素雰囲気下、12時間撹拌した後、セライト濾過により不溶物を除いた。濾液を減圧濃縮し、1-メチル-5-[(テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イルオキシ)メチル]-1H-ピラゾール-3-アミン(426mg)を得た。
APCI/ESI+:212.
(3)製造例3(1)と同様にして、1-メチル-5-[(テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イルオキシ)メチル]-1H-ピラゾール-3-アミン、及び、製造例1(4)と同様の方法で製造した2-クロロ-5-[(2,6-ジクロロ-3,5-ジメトキシベンジル)オキシ]ピリミジンを原料として用いて、5-[(2,6-ジフルオロ-3,5-ジメトキシベンジル)オキシ]-N-{1-メチル-5-[(テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イルオキシ)メチル]-1H-ピラゾール-3-イル}ピリミジン-2-アミンを得た。
APCI/ESI+:492.
(4)5-[(2,6-ジフルオロ-3,5-ジメトキシベンジル)オキシ]-N-{1-メチル-5-[(テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イルオキシ)メチル]-1H-ピラゾール-3-イル}ピリミジン-2-アミン(706mg)とメタノール(8mL)の混合物に4M塩化水素/ジオキサン溶液(8mL)を加え、室温で3時間撹拌した。反応混合物を減圧濃縮した後、残渣に飽和重曹水を加え、クロロホルムで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濾過した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン)で精製し、[3-({5-[(2,6-ジフルオロ-3,5-ジメトキシベンジル)オキシ]ピリミジン-2-イル}アミノ)-1-メチル-1H-ピラゾール-5-イル]メタノール(444mg)を得た。
ESI+:408.
(5)[3-({5-[(2,6-ジフルオロ-3,5-ジメトキシベンジル)オキシ]ピリミジン-2-イル}アミノ)-1-メチル-1H-ピラゾール-5-イル]メタノール(350mg)、トリエチルアミン(359μL)、ジクロロメタン(7mL)及びテトラヒドロフラン(7mL)の混合物を氷冷し、メタンスルホニル クロリド(120μL)を加えた後、室温で3時間撹拌した。反応混合物に水及び酢酸エチルを加え、生じた固体を濾取した後、減圧乾燥し、[3-({5-[(2,6-ジフルオロ-3,5-ジメトキシベンジル)オキシ]ピリミジン-2-イル}アミノ)-1-メチル-1H-ピラゾール-5-イル]メチル メタンスルホネート(218mg)を得た。
NMR2:2.96(3H,s),3.85(3H,s),3.89(6H,s),5.16(2H,s),5.25(2H,s),6.68(1H,t,J=8.0Hz),6.91(1H,s),7.63(1H,brs),8.24(2H,s).
(6)[3-({5-[(2,6-ジフルオロ-3,5-ジメトキシベンジル)オキシ]ピリミジン-2-イル}アミノ)-1-メチル-1H-ピラゾール-5-イル]メチル メタンスルホネート(795mg)とN-メチルピロリドン(15.9mL)の混合物に、1-メチルピペラジン(901μL)を加え、80℃で2時間撹拌した。反応混合物に水及び飽和重曹水を加え、生じた固体を濾取した後、濾液をクロロホルムで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濾過した。濾液を減圧濃縮し、残渣を先に濾取した固体と合わせた後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール)、続いて塩基性シリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/メタノール)で精製した後、エタノール/ジイソプロピルエーテルにて固化し、5-[(2,6-ジフルオロ-3,5-ジメトキシベンジル)オキシ]-N-{1-メチル-5-[(4-メチルピペラジン-1-イル)メチル]-1H-ピラゾール-3-イル}ピリミジン-2-アミン(化合物E:168mg)を得た。
ESI+:490.
NMR1:2.14(3H,s),2.18-2.53(8H,m),3.45(2H,s),3.67(3H,s),3.87(6H,s),5.15(2H,s),6.46(1H,s),7.06(1H,t,J=8.4Hz),8.26(2H,s),9.42(1H,s).
医薬組成物の有効成分をスクリーニングする方法には、[1]本発明のポリペプチドを阻害する物質をスクリーニングする方法と、[2]本発明のポリヌクレオチド陽性又は本発明のポリペプチド陽性の癌(好ましくは肺癌又は膀胱癌)治療剤をスクリーニングする方法とが含まれる。
[1]本発明のポリペプチドを阻害(本発明のポリペプチドの活性及び/又は発現を阻害)する物質をスクリーニングする方法
本発明のポリペプチドを阻害する物質のスクリーニング方法は、下記工程(i)〜(iii)を含む限り、特に限定されるものではない:
(i)本発明のポリペプチド又は本発明のポリペプチドを発現している細胞に試験物質を接触させる工程、
(ii)該ポリペプチドが阻害されるか否かを分析する工程、及び
(iii)該ポリペプチドを阻害する物質を選択する工程。
(a)インビトロ(in vitro)型スクリーニング方法;
(1)本発明のポリペプチドに試験物質を接触させる工程、(2)該ポリペプチドの活性が阻害されるか否かを分析する工程、及び(3)該ポリペプチドの活性を阻害する物質を選択する工程を含むことを特徴とする、本発明のポリペプチドの活性を阻害する物質をスクリーニングする方法。
(1)本発明のポリペプチドを発現している細胞に試験物質を接触させる工程、(2)該ポリペプチドの活性が阻害されるか否かを分析する工程、及び(3)該ポリペプチドの活性を阻害する物質を選択する工程を含むことを特徴とする、本発明のポリペプチドの活性を阻害する物質をスクリーニングする方法。
(1)本発明のポリペプチドを発現している細胞に試験物質を接触させる工程、(2)該ポリペプチドの発現が阻害されるか否かを分析する工程、及び(3)該ポリペプチドの発現を阻害する物質を選択する工程を含むことを特徴とする、本発明のポリペプチドの発現を阻害する物質をスクリーニングする方法。
インビトロ型スクリーニング方法には、精製した本発明のポリペプチドに試験物質を添加して接触させ(接触させる工程)、該試験物質により本発明のポリペプチドの活性が阻害されたか否かを、試験物質を接触させなかった場合の本発明のポリペプチドの活性に比較して分析し(分析する工程)、本発明のポリペプチドの活性を阻害する物質(すなわち本発明のポリヌクレオチド陽性又は本発明のポリペプチド陽性の癌(好ましくは肺癌又は膀胱癌)治療剤)を選択する方法が含まれる。
細胞型スクリーニング方法には、本発明のポリペプチドを発現している細胞と試験物質を混合(すなわち添加)して接触させ(接触させる工程)、該試験物質により本発明のポリペプチドの活性が阻害されたか否かを、試験物質を接触させなかった場合の本発明のポリペプチドの活性に比較して分析し(分析する工程)、本発明のポリペプチドの活性を阻害する物質(すなわち本発明のポリヌクレオチド陽性又は本発明のポリペプチド陽性の癌(好ましくは肺癌又は膀胱癌)治療剤)を選択する方法が含まれる。具体的には、例えば以下のように実施できる。
発現阻害型スクリーニング方法には、本発明のポリペプチドを発現している細胞と試験物質を混合(すなわち添加)して接触させ(接触させる工程)、該試験物質により本発明のポリペプチドの発現が阻害されたか否かを、試験物質を接触させなかった場合の本発明のポリペプチドの発現に比較して分析し(分析する工程)、本発明のポリペプチドの発現を阻害する物質(すなわち本発明のポリヌクレオチド陽性又は本発明のポリペプチド陽性の癌治療剤(特には肺癌又は膀胱癌)治療剤)を選択する方法が含まれる。具体的には、例えば以下のように実施できる。
本発明のポリペプチドを阻害(本発明のポリペプチドの活性及び/又は発現を阻害)する物質をスクリーニングする方法は、本発明のポリヌクレオチド陽性又は本発明のポリペプチド陽性の癌(好ましくは肺癌又は膀胱癌)治療剤をスクリーニングする方法として利用できる。すなわち、本発明のポリヌクレオチド陽性又は本発明のポリペプチド陽性の癌治療剤をスクリーニングする方法は、上記[1]本発明のポリペプチドを阻害する物質をスクリーニングする方法のi)、ii)及びiii)を含む。
選択された物質が本発明のポリヌクレオチド陽性又は本発明のポリペプチド陽性の癌(特には肺癌又は膀胱癌)治療活性を有することを確認する工程としては、公知の評価方法又はそれを改良した方法、例えば、本発明のポリペプチドを発現した培養細胞や腫瘍モデル動物に選択された物質を処置し分析する方法を実施する工程が挙げられる(臨床腫瘍学 セカンドエディション、癌と化学療法社)。
肺癌臨床検体(米国アステランド社)200検体に対して、逆転写酵素(SuperScriptIII、ライフテクノロジーズ社)及びランダムプライマー(ランダムプライマーズ、ライフテクノロジーズ社)を用いて、キットのプロトコールにしたがって逆転写反応を行い、cDNAを合成した。
次に、配列番号7で示されるFGFR3_TACC3_RT_F及び配列番号8で示されるFGFR3_TACC3_RT_Rのプライマーを用いて、上記で得たcDNAを鋳型として、DNAポリメラーゼ(TaKaRa Ex Taq;タカラバイオ株式会社)を用いてPCR(98℃10秒、55℃15秒、68℃1分30秒を30サイクル)を行った。その後、10倍希釈した前述PCR産物を鋳型として、配列番号9で示されるFGFR3_TACC3_nested_F及び配列番号10で示されるFGFR3_TACC3_nested_Rのプライマーを用い、同じDNAポリメラーゼを用いてPCR(98℃15秒、55℃15秒、68℃1分を30サイクル)を行った。PCR反応後、電気泳動したところ、サンプルLg344のみで、約500base pair(bp)のPCR産物を得た。
その後、PCR産物をダイデオキシシーケンス法により配列決定した(BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit;ライフテクノロジーズ社)。この結果、約500bpのPCR産物は、NCBIに登録されているFGFR3遺伝子(NM_001163213.1)のコーディングシーケンス(以下CDS)のエキソン18の3'末端が、TACC3遺伝子(NM_006342.1)のCDSのエキソン11の5’末端と融合している配列であることが明らかになった。
扁平上皮肺癌患者肺癌組織由来RNA(米国アステランド社)Lg344検体RNAに対して、逆転写酵素(SuperScriptIII、ライフテクノロジーズ社)及びオリゴ(dT)プライマー(オリゴ (dT)20プライマー、ライフテクノロジーズ社)を用いて、キットのプロトコールにしたがって逆転写反応を行い、cDNAを合成した。
次に、配列番号11で示されるFGFR3−TACC3_cloning_F及び配列番号12で示されるFGFR3−TACC3_cloning_Rのプライマーを用いて、上記で得たcDNAを鋳型として、DNAポリメラーゼ(KOD −plus− Ver.2;東洋紡績株式会社)を用いてPCR(98℃15秒、60℃15秒、68℃3分30秒を25サイクル)を行った。その後、10倍希釈した前述PCR産物を鋳型として、配列番号13で示されるFGFR3_TACC3_cloning_BamHI_F及び配列番号14で示されるFGFR3_TACC3_cloning_EcoRI_Rのプライマーを用い、同じDNAポリメラーゼを用いてPCR(98℃15秒、55℃15秒、68℃3分30秒を25サイクル)を行った。PCR反応後、電気泳動したところ、約2.9kbpのPCR産物を得た。PCR産物をクローニングベクター(TOPO XL PCR Cloning Kit;ライフテクノロジーズ社)にクローニングした。インサートはダイデオキシシーケンス法により配列を決定した(BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit;ライフテクノロジーズ社)。この結果、約2.9kbpのPCR産物では、NCBIに登録されているFGFR3遺伝子(NM_001163213.1)のCDSの5'末端からエキソン18の3'末端までが、TACC3遺伝子(NM_006342.1)のCDSのエキソン11の5’末端からCDSの3’末端までと融合している転写産物(FGFR3−TACC3_v1)(配列番号1)が存在していることが明らかになった。配列番号1によりコードされるポリペプチドを配列番号2に示す。
また、FGFR3−TACC3_v1のORF全長を蛋白質として発現するため、上記クローニングベクターを制限酵素BamHIで37℃、3時間の酵素反応を行い制限酵素処理したDNA断片を精製し、さらにEcoRIで37℃、3時間の酵素反応を行い制限酵素処理したDNA断片を精製した。このORFを含むDNA断片を発現ベクター(pMXs−puro;コスモバイオ社)のマルチクローニングサイトに存在するBamHI及びEcoRIサイトにクローニングし発現プラスミド(FGFR3−TACC3_v1/pMXs−puro)を構築した。
膀胱癌臨床検体(米国アステランド社)59検体に対して、逆転写酵素(SuperScriptIII、ライフテクノロジーズ社)及びランダムプライマー(ランダムプライマーズ、ライフテクノロジーズ社)を用いて、キットのプロトコールにしたがって逆転写反応を行い、cDNAを合成した。
次に、配列番号7で示されるFGFR3_TACC3_RT_F及び配列番号8で示されるFGFR3_TACC3_RT_Rのプライマーを用いて、上記で得たcDNAを鋳型として、DNAポリメラーゼ(TaKaRa Ex Taq;タカラバイオ株式会社)を用いてPCR(98℃10秒、55℃15秒、68℃1分30秒を30サイクル)を行った。その後、10倍希釈した前述PCR産物を鋳型として、配列番号9で示されるFGFR3_TACC3_nested_F及び配列番号10で示されるFGFR3_TACC3_nested_Rのプライマーを用い、同じDNAポリメラーゼを用いてPCR(98℃15秒、55℃15秒、68℃1分を30サイクル)を行った。PCR反応後、電気泳動したところ、サンプルBd106検体で、約600bpのPCR産物を得たことがわかった。
その後、PCR産物をダイデオキシシーケンス法により配列決定した(BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit;ライフテクノロジーズ社)。この結果、約600bpのPCR産物は、NCBIに登録されているFGFR3遺伝子(NM_001163213.1)のCDSのエキソン18の3'末端が、TACC3遺伝子(NM_006342.1)のCDSのエキソン10の5’末端と融合している配列であることが明らかになった。
膀胱癌患者膀胱癌組織由来RNA(米国アステランド社)Bd106検体RNAに対して、逆転写酵素(SuperScriptIII、ライフテクノロジーズ社)及びオリゴ(dT)プライマー(オリゴ (dT)20プライマー、ライフテクノロジーズ社)を用いて、キットのプロトコールにしたがって逆転写反応を行い、cDNAを合成した。
次に、配列番号11で示されるFGFR3−TACC3_cloning_F及び配列番号12で示されるFGFR3−TACC3_cloning_Rのプライマーを用いて、上記で得たcDNAを鋳型として、DNAポリメラーゼ(KOD −plus− Ver.2;東洋紡績株式会社)を用いてPCR(98℃15秒、60℃15秒、68℃3分30秒を25サイクル)を行った。その後、10倍希釈した前述PCR産物を鋳型として、配列番号13で示されるFGFR3_TACC3_cloning_BamHI_F及び配列番号14で示されるFGFR3_TACC3_cloning_EcoRI_Rのプライマーを用い、同じDNAポリメラーゼを用いてPCR(98℃15秒、55℃15秒、68℃3分30秒を25サイクル)を行った。PCR反応後、電気泳動したところ、約3.0kbpのPCR産物を得たことがわかった。PCR産物をクローニングベクター(TOPO XL PCR Cloning Kit;ライフテクノロジーズ社)にクローニングした。インサートはダイデオキシシーケンス法により配列を決定した(BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit;ライフテクノロジーズ)。この結果、約3.0kbpのPCR産物では、NCBIに登録されているFGFR3遺伝子(NM_001163213.1)のCDSの5'末端からエキソン18の3'末端までが、TACC3(NM_006342.1)のCDSのエキソン10の5’末端からCDSの3’末端までと融合している転写産物(FGFR3−TACC3_v2)(配列番号3)が存在していることが明らかになった。配列番号3によりコードされるポリペプチドを配列番号4に示す。
また、FGFR3−TACC3_v2のORF全長を蛋白質として発現するため、上記クローニングベクターを制限酵素BamHIで37℃、3時間の酵素反応を行い制限酵素処理したDNA断片を精製し、さらにEcoRIで37℃、3時間の酵素反応を行い制限酵素処理したDNA断片を精製した。このORFを含むDNA断片を発現ベクター(pMXs−puro;コスモバイオ社)のマルチクローニングサイトに存在するBamHI及びEcoRIサイトにクローニングし発現プラスミド(FGFR3−TACC3_v2/pMXs−puro)を構築した。
膀胱癌臨床検体(米国アステランド社)59検体に対して、逆転写酵素(SuperScriptIII、ライフテクノロジーズ社)及びランダムプライマー(ランダムプライマーズ、ライフテクノロジーズ社)を用いて、キットのプロトコールにしたがって逆転写反応を行い、cDNAを合成した。
次に、配列番号7で示されるFGFR3_TACC3_RT_F及び配列番号8で示されるFGFR3_TACC3_RT_Rのプライマーを用いて、上記で得たcDNAを鋳型として、DNAポリメラーゼ(TaKaRa Ex Taq;タカラバイオ株式会社)を用いてPCR(98℃10秒、55℃15秒、68℃1分30秒を30サイクル)を行った。その後、10倍希釈した前述PCR産物を鋳型として、配列番号9で示されるFGFR3_TACC3_nested_F及び配列番号10で示されるFGFR3_TACC3_nested_Rのプライマーを用い、同じDNAポリメラーゼを用いてPCR(98℃15秒、55℃15秒、68℃1分を30サイクル)を行った。PCR反応後、電気泳動したところ、サンプルBd021検体で、約650bpのPCR産物を得たことがわかった。
その後、PCR産物をダイデオキシシーケンス法により配列決定した(BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit;ライフテクノロジーズ社)。この結果、約650bpのPCR産物は、NCBIに登録されているFGFR3遺伝子(NM_001163213.1)のCDSのエキソン19の途中配列が、TACC3遺伝子(NM_006342.1)のイントロン10−11の一部に融合し、さらにTACC3遺伝子のCDSのエキソン11の5’末端と融合している配列であることが明らかになった。
膀胱癌患者膀胱癌組織由来RNA(米国アステランド社)Bd021検体RNAに対して、逆転写酵素(SuperScriptIII、ライフテクノロジーズ社)及びオリゴ(dT)プライマー(オリゴ (dT)20プライマー、ライフテクノロジーズ社)を用いて、キットのプロトコールにしたがって逆転写反応を行い、cDNAを合成した。
次に、配列番号11で示されるFGFR3−TACC3_cloning_F及び配列番号12で示されるFGFR3−TACC3_cloning_Rのプライマーを用いて、上記で得たcDNAを鋳型として、DNAポリメラーゼ(KOD −plus− Ver.2;東洋紡績株式会社)を用いてPCR(98℃15秒、60℃15秒、68℃3分30秒を25サイクル)を行った。その後、10倍希釈した前述PCR産物を鋳型として、配列番号13で示されるFGFR3_TACC3_cloning_BamHI_F及び配列番号14で示されるFGFR3_TACC3_cloning_EcoRI_Rのプライマーを用い、同じDNAポリメラーゼを用いてPCR(98℃15秒、55℃15秒、68℃3分30秒を25サイクル)を行った。PCR反応後、電気泳動したところ、約3.0kbpのPCR産物を得たことがわかった。PCR産物をクローニングベクター(TOPO XL PCR Cloning Kit;ライフテクノロジーズ社)にクローニングした。インサートはダイデオキシシーケンス法により配列を決定した(BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit;ライフテクノロジーズ社)。この結果、約3.0kbpのPCR産物では、NCBIに登録されているFGFR3遺伝子(NM_001163213.1)のCDSの5'末端からエキソン19の途中配列が、TACC3遺伝子(NM_006342.1)のイントロン10−11の一部に融合し、さらにTACC3のCDSのエキソン11の5’末端からCDSの3'末端までと融合している転写産物(FGFR3−TACC3_v3)(配列番号5)が存在していることが明らかになった。配列番号5によりコードされるポリペプチドを配列番号6に示す。
また、FGFR3−TACC3_v3のORF全長を蛋白質として発現するため、上記クローニングベクターを制限酵素BamHIで37℃、3時間の酵素反応を行い制限酵素処理したDNA断片を精製し、さらにEcoRIで37℃、3時間の酵素反応を行い制限酵素処理したDNA断片を精製した。このORFを含むDNA断片を発現ベクター(pMXs−puro;コスモバイオ社)のマルチクローニングサイトに存在するBamHI及びEcoRIサイトにクローニングし発現プラスミド(FGFR3−TACC3_v3/pMXs−puro)を構築した。
肺癌臨床検体由来RNA(米国アステランド社)200サンプルからcDNAを作製し、cDNAを基質とし、配列番号15で示されるFGFR3-TACC3(F18T11)_qPCR_F及び配列番号16で示されるFGFR3-TACC3(F18T11)_qPCR_Rをプライマーセットとして、定量的PCRキット(Power SYBR Green PCR Master Mix;ライフテクノロジーズ社)を用い、アプライドバイオシステムズ7900HTシステムにて、定量PCR(95℃ 10分の後、95℃15秒、59℃60秒を45サイクル)を行い遺伝子発現量を測定した。その結果、肺癌検体においては上述のサンプルLg344のみで増幅が確認された。また、膀胱癌臨床検体由来RNA(米国アステランド社)59サンプルからcDNAを作製し、cDNAを基質として同様に実施し、複数の検体から増幅が確認された。
膀胱癌臨床検体由来RNA(米国アステランド社)59サンプルからcDNAを作製し、cDNAを基質とし、配列番号17で示されるFGFR3-TACC3(F18T10)_qPCR_F及び配列番号18で示されるFGFR3-TACC3(F18T10)_qPCR_Rをプライマーセットとして、定量的PCRキット(Power SYBR Green PCR Master Mix;ライフテクノロジーズ社)を用い、アプライドバイオシステムズ7900HTシステムにて、定量PCR(95℃ 10分の後、95℃15秒、59℃60秒 を45サイクル)を行い遺伝子発現量を測定した。その結果、膀胱癌検体において複数の検体から増幅が確認された。
膀胱癌臨床検体由来RNA(米国アステランド社)59サンプルからcDNAを作製し、cDNAを基質とし、配列番号19で示されるFGFR3-TACC3(F19T11)_qPCR_F及び配列番号20で示されるFGFR3-TACC3(F19T11)_qPCR_Rをプライマーセットとして、定量的PCRキット(Power SYBR Green PCR Master Mix;ライフテクノロジーズ社)を用い、アプライドバイオシステムズ7900HTシステムにて、定量PCR(95℃ 10分の後、95℃15秒、59℃60秒 を45サイクル)を行い遺伝子発現量を測定した。その結果、膀胱癌検体において複数の検体から増幅が確認された。
FGFR3−TACC3_v1/pMXs−puro(実施例1)を9μg、トランスフェクション試薬(FUGENE(登録商標)HD、Roche社)を用いて、Platinum−E細胞にトランスフェクションを実施した。トランスフェクション24時間後に10%牛血清(ニチレイバイオサイエンス社)を含むD−MEM培地(Dulbecco's Modified Eagle Medium培地;インビトロジェン社)を交換し、さらに24時間の培地上清を採取しレトロウイルス溶液を作製した。
実施例7においてFGFR3−TACC3_v1/pMXs−puroを用いて作製したウイルス溶液にポリブレン(Polybrene;SIGMA−ALDRICH社)を4μg/mLの濃度で添加したのち、NIH3T3細胞に添加し感染させた。添加6時間後に10%牛血清(ニチレイバイオサイエンス社)を含むD−MEM培地に交換し、感染1日後に10%牛血清(ニチレイバイオサイエンス社)及び1μg/mLのピューロマイシン(SIGMA−ALDRICH社)を含むD−MEM培地(インビトロジェン社)に交換し、5%CO2存在下、37℃で4週間培養を続け、FGFR3−TACC3_v1を安定発現するNIH3T3細胞を取得した。(FGFR3−TACC3_v1発現/NIH3T3細胞と命名した。)
FGFR3−TACC3_v1発現/NIH3T3細胞の足場非依存的増殖亢進能を検討するため、96ウェルスフェロイドプレート(スミロンセルタイトスフェロイド96U;住友ベークライト社)にFGFR3−TACC3_v1発現/NIH3T3細胞及び空ベクターであるpMXs−puroを感染させたNIH3T3細胞(Mock/NIH3T3細胞)を、それぞれ1ウェル当り1×103個となるように10%牛血清(ニチレイバイオサイエンス社)を含むD−MEM培地(インビトロジェン社)で播種した。5%CO2存在下、37℃で培養後、翌日(Day1)及び4日後(Day4)の細胞数を細胞数測定試薬(CELLTITER−GloTM Luminescent Cell Viability Assay;Promega社)を用いてマニュアルの方法に従って測定した。検出には発光測定装置を用いた。Mock/NIH3T3細胞はDay1からDay4までで細胞数のカウントは増加しなかったのに対してFGFR3−TACC3_v1発現/NIH3T3細胞はDay1からDay4までで約3.1倍の細胞数のカウントの増加が確認された。以上のことから、FGFR3−TACC3_v1発現/NIH3T3細胞は足場非依存的細胞増殖を示すことが明らかとなった。
足場非依存的な細胞増殖の測定(コロニー法など)は、化合物の抗癌作用(薬理効果)を検討する系として知られている(臨床腫瘍学 セカンドエディション、癌と化学療法社)。コロニー法に代わる細胞非接着性の増殖を測定する方法として、前述のようなスフェロイドプレートを用いる方法がある。
96ウェルスフェロイドプレート(スミロンセルタイトスフェロイド96U;住友ベークライト社)に、FGFR3−TACC3_v1発現/NIH3T3細胞を、1ウェル当り1×103個となるように10%牛胎児血清を含むDMEM培地で播種した。また、ポジティブコントロール用に培地のみ添加したウェルを調製した。5%CO2存在下、37℃にて一晩培養後、Dovitinib、AZD4547及びBGJ398を最終濃度100nMで添加した。ネガティブコントロールとして化合物の溶媒であるDMSOを化合物添加時と同濃度(0.1%)になるように添加した。その後、5%CO2存在下、37℃で4日間培養し、細胞数測定試薬(CellTiter−GloTM Luminescent Cell Viability Assay;Promega社)を添加し20分撹拌した後、発光測定装置を用いて測定した。ポジティブコントロール、ネガティブコントロールの値をそれぞれ100%阻害値、0%阻害値として各化合物の増殖阻害%を算出した。その結果、Dovitinib、AZD4547及びBGJ398の阻害%はそれぞれ40%、74%、92%であった。
以上の結果は、FGFR3−TACC3_v1を発現する癌細胞や腫瘍の増殖をFGFR3−TACC3融合ポリペプチドの阻害剤が阻害できることを示している。
本発明のポリペプチド阻害剤による治療の有効性が期待される適用対象者を本発明の検出方法により識別することで、テーラーメード医療が実践できることが示された。
実施例2及び3で作製したFGFR3−TACC3_v2/pMXs−puro及びFGFR3−TACC3_v3/pMXs−puroを用い、実施例7の方法に従いレトロウイルス溶液を作製した。
実施例10においてFGFR3−TACC3_v2/pMXs−puro及びFGFR3−TACC3_v3/pMXs−puroを用いて作製したウイルス溶液を用いて、実施例8の方法に従いFGFR3−TACC3_v2及びFGFR3−TACC3_v3を安定発現するNIH3T3細胞を取得した。(それぞれFGFR3−TACC3_v2発現/NIH3T3細胞及びFGFR3−TACC3_v3発現/NIH3T3細胞と命名した。)
FGFR3−TACC3_v2発現/NIH3T3細胞及びFGFR3−TACC3_v3発現/NIH3T3細胞の足場非依存的増殖亢進能を検討するため、実施例8と同様の方法で検討した。Mock/NIH3T3細胞はDay1からDay4までで細胞数のカウントは増加しなかったのに対して、FGFR3−TACC3_v2発現/NIH3T3細胞はDay1からDay4までで約2.8倍の細胞数のカウントの増加が確認された。また、FGFR3−TACC3_v3発現/NIH3T3細胞はDay1からDay4までで約2.3倍の細胞数のカウントの増加が確認された。以上のことから、FGFR3−TACC3_v2発現/NIH3T3細胞及びFGFR3−TACC3_v3発現/NIH3T3細胞は足場非依存的細胞増殖を示すことが明らかとなった。
実施例9と同様の方法でFGFR3−TACC3_v2発現/NIH3T3細胞及びFGFR3−TACC3_v3発現/NIH3T3細胞増殖阻害作用の評価を行った。その結果、FGFR3−TACC3_v2発現/NIH3T3細胞に対するDovitinib、AZD4547及びBGJ398の阻害%はそれぞれ21%、60%、90%であった。また、FGFR3−TACC3_v3発現/NIH3T3細胞に対するDovitinib、AZD4547及びBGJ398の阻害%はそれぞれ32%、51%、87%であった。
以上の結果は、FGFR3−TACC3_v2及びFGFR3−TACC3_v3を発現する癌細胞や腫瘍の増殖をFGFR3−TACC3融合ポリペプチド阻害剤が阻害できることを示している。
FGFR3−TACC3融合ポリペプチド阻害剤による治療の有効性が期待される適用対象者を本発明の検出方法により識別することで、テーラーメード医療が実践できることが示された。
リン酸緩衝生理食塩水(Phosphate buffered saline、 PBS)に懸濁したFGFR3−TACC3_v1発現/NIH3T3細胞3×106個を4週齡の雄性cann.Cg−Foxn1Nu/Crlcrlj(Nu/Nu)ヌードマウス(日本チャールズリバー社)の背部皮下に注射して植えつけた。植付け3日後にFGFR3−TACC3融合ポリペプチド阻害剤であるAZD4547及びBGJ398の投与を開始した。試験は溶媒群及び化合物群を各4匹から5匹で行い、0.5%メチルセルロース(methylCELLULOSE、信越化学工業株式会社)/99.5%蒸留水の組成の溶媒にAZD4547及びBGJ398を懸濁し、それぞれ30mg/kgを経口投与した。投与は11日間1日1回行い、体重及び腫瘍径を2日から3日毎に測定した。腫瘍体積の算出には以下の式を用いた。
[腫瘍体積(mm3)]=[腫瘍の長径(mm)]×[腫瘍の短径(mm)]2×0.5
化合物投与開始日及び投与終了日の溶媒群の腫瘍体積をそれぞれ100%阻害、0%阻害としてAZD4547及びBGJ398の阻害率を算出した。結果、AZD4547及びBGJ398はFGFR3−TACC3_v1発現/NIH3T3細胞(腫瘍)の増殖をそれぞれ51%、90%阻害した。
FGFR3−TACC3_v2発現/NIH3T3細胞及びFGFR3−TACC3_v3発現/NIH3T3細胞に対する抗腫瘍作用も同様に検討した。結果、AZD4547及びBGJ398は、FGFR3−TACC3_v2発現/NIH3T3細胞(腫瘍)の増殖をそれぞれ61%及び90%阻害した。またFGFR3−TACC3_v3発現/NIH3T3細胞(腫瘍)の増殖をそれぞれ73%及び88%阻害した。
下記以外は実施例13と同様にして、AZD4547及びBGJ398のキナーゼ阻害作用を観察した。FGFR3−TACC3_v1発現/NIH3T3細胞3×106個を植えつけ、植付け3日後にAZD4547及びBGJ398の投与を開始した。試験は溶媒群及び化合物群各5匹で行い、最終投与4時間後に解剖して腫瘍を摘出した。その後、溶解液(Cell Lysis Buffer;Cell Signaling Technology社、Phosphatase Inhibitor Cocktail;Thermo Scientific社、Complete;Roche社)を用いて腫瘍の蛋白質抽出液を速やかに調製し、腫瘍内の総FGFR3及びリン酸化FGFR3の測定をELISAキット(R&D社)を用いて実施した。ELISAは添付の手順書に従って実施したが、検出は化学発光試薬(BMケミルミネッセンスELISA基質;Roche社)及び発光測定装置(ARVO;PerkinElmer社)による化学発光の検出へと変更した。
リン酸化FGFR3値を総FGFR3値で補正した値(リン酸化FGFR3/総FGFR3)をリン酸化レベルとし、溶媒群のリン酸化レベルを0%阻害、絶対値0を100%阻害として各化合物群のチロシン自己リン酸化阻害率を算出した。結果、AZD4547及びBGJ398群では溶媒群に比べ腫瘍内のFGFR3−TACC3融合ポリペプチドv1のチロシン自己リン酸化がそれぞれ58%、77%減少していた。
FGFR3−TACC3_v2発現/NIH3T3細胞及びFGFR3−TACC3_v3発現/NIH3T3細胞に対しても同様に検討した結果、AZD4547及びBGJ398群では溶媒群に比べ、腫瘍内のFGFR3−TACC3_v2のチロシン自己リン酸化がそれぞ54%、66%減少していた。また、腫瘍内のFGFR3−TACC3_v3のチロシン自己リン酸化がそれぞれ78%、85%減少していた。
これらの結果から、上記動物モデルにおけるAZD4547及びBGJ398の抗腫瘍作用が腫瘍内のFGFR3−TACC3融合ポリペプチドのキナーゼ活性を阻害する作用に基づくことが確認された。
膀胱癌患者由来細胞株RT−112(Leibniz−Institut DSMZ−Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbHより購入)より精製したRNAに対して、逆転写酵素(SuperScriptIII、ライフテクノロジーズ社)及びオリゴ(dT)プライマー(オリゴ (dT)20プライマー、ライフテクノロジーズ社)を用いて、キットのプロトコールにしたがって逆転写反応を行い、cDNAを合成した。
次に、配列番号11で示されるFGFR3−TACC3_cloning_F及び配列番号12で示されるFGFR3−TACC3_cloning_Rのプライマーを用いて、上記で得たcDNAを鋳型として、DNAポリメラーゼ(KOD −plus− Ver.2;東洋紡績株式会社)を用いてPCR(98℃15秒、60℃15秒、68℃3分30秒を25サイクル)を行った。その後、10倍希釈した前述PCR産物を鋳型として、配列番号13で示されるFGFR3_TACC3_cloning_BamHI_F及び配列番号14で示されるFGFR3_TACC3_cloning_EcoRI_Rのプライマーを用い、同じDNAポリメラーゼを用いてPCR(98℃15秒、55℃15秒、68℃3分30秒を25サイクル)を行った。PCR反応後、電気泳動した結果、約2.9kbpのPCR産物が得られた。PCR産物をクローニングベクター(TOPO XL PCR Cloning Kit;ライフテクノロジーズ社)にクローニングし、インサートをダイデオキシシーケンス法(BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit;ライフテクノロジーズ社)により配列を決定した結果、NCBIに登録されているFGFR3遺伝子(NM_001163213.1)のCDSの5'末端からエキソン18の3'末端までが、TACC3遺伝子(NM_006342.1)のCDSのエキソン11の5’末端からCDSの3'末端までと融合している転写産物(FGFR3−TACC3_v1)(配列番号1)と同一であることが明らかになった。
96ウェルスフェロイドプレート(スミロンセルタイトスフェロイド96U;住友ベークライト)に、RT−112細胞を、1ウェル当り2×103個となるように10%牛胎児血清を含むRPMI1640培地で播種した。また、ポジティブコントロール用に培地のみ添加したウェルを調製した。5%CO2存在下、37℃にて一晩培養後、Dovitinib、AZD4547及びBGJ398を最終濃度100nMでそれぞれ添加した。ネガティブコントロールとして化合物の溶媒であるDMSOを化合物添加時と同濃度(0.1%)になるように添加した。その後、5%CO2存在下、37℃で5日間培養し、細胞数測定試薬(CellTiter−GloTM Luminescent Cell Viability Assay;Promega社)を添加し20分撹拌した後、発光測定装置を用いて測定した。ポジティブコントロール、ネガティブコントロールの値をそれぞれ100%阻害値、0%阻害値として各化合物の増殖阻害%を算出した。その結果、Dovitinib、AZD4547及びBGJ398の阻害%はそれぞれ80%、90%、90%であった。
細胞中のFGFR3−TACC3融合ポリペプチドを検出する方法を以下の通り構築した。FGFR3−TACC3_v1発現/NIH3T3細胞及びネガティブコントロールとしてNIH3T3細胞を培養した。PBSにて1回洗浄後、細胞を溶解液(Cell Lysis Buffer;Cell Signaling Technology社、Phosphatase Inhibitor Cocktail;Thermo Scientific社、Complete;Roche社)にて氷上で10分溶解させた。遠心後得られた上清に対して抗FGFR3抗体(SIGMA−ALDRICH社)を添加し4℃にて一晩反応させた。その後、プロテインGビーズ(Protein G Sepharose 4 Fast Flow;GE Healthcare社)を添加し4時間免疫沈降を行った。遠心後に沈降物を洗浄液(組成は上述の溶解液と同様)にて4回洗浄し、SDS溶液添加後5分間煮沸させ沈殿物を懸濁した。遠心後この上清に対して抗TACC3抗体(R and D systems社)を用いたイムノブロッティングを行った。結果、FGFR3−TACC3_v1発現/NIH3T3細胞の免疫沈降物では、FGFR3−TACC3融合ポリペプチドv1が検出されたが、NIH3T3細胞では検出されなかった。FGFR3−TACC3_v2発現/NIH3T3細胞及びFGFR3−TACC3_v3発現/NIH3T3細胞に対しても同様に検討した結果、FGFR3−TACC3_v2発現/NIH3T3細胞及びFGFR3−TACC3_v3発現/NIH3T3細胞の免疫沈降物において、FGFR3−TACC3融合ポリペプチドv2及びFGFR3−TACC3融合ポリペプチドv3がそれぞれ検出された。また、RT−112細胞に対しても同様の方法で検討した結果、FGFR3−TACC3融合ポリペプチドv1が検出された。
以上の結果から、抗FGFR3抗体及び抗TACC3抗体を組み合わせて用いることで、FGFR3−TACC3融合ポリペプチドを発現している癌細胞や癌組織中の本発明のポリペプチドの存在を検出することが可能となり、本発明のポリペプチド陽性癌患者を判定することが可能であることが明らかとなった。
FGFR3−TACC3_v1発現/NIH3T3細胞、FGFR3−TACC3_v2発現/NIH3T3細胞又はFGFR3−TACC3_v3発現/NIH3T3細胞を4週齡雄ヌードマウス(CAnN・Cg−Foxn1nu/CrlCrlj(nu/nu)、日本チャ−ルスリバー)の皮下に3×106個にて移植し、15日後、細胞塊の増殖を確認し担癌マウスを作製した。
作製した担癌マウスから、増殖した癌細胞を含む組織を切り出し、生理食塩水で洗浄後、10%中性緩衝ホルマリン(SIGMA−ALDRICH社)で室温で48〜144時間固定し、自動包埋装置(ティッシューテックVIP、サクラファインテックジャパン株式会社)を用いて定法に従い脱水したのち、パラフィン(ティッシュプレップ、株式会社ファルマ)に包埋した。パラフィン包埋後の組織サンプルを厚さ5μmで切り出しFFPE切片とした。
準備したFFPE切片をヒートブロック(MG−2200;東京理化器械株式会社)上で60℃、15分間加熱したのち、10%ホルマリン(和光純薬工業株式会社)で室温、30分間固定した。PBS(Invitrogen社)で3回洗浄、完全に乾燥し、キシレン(和光純薬工業株式会社)で室温、10分間処理した。次に、FFPE切片をPBSで3回洗浄し、Pretreatment Solution(Affymetrix社)で100℃、10分間煮沸した。さらに、精製水で2回、PBSで1回洗浄し、Protease Solution(Affymetrix社)でインキュベータ(HybEZ Hybridization System;Advanced Cell Diagnostics社)内で40℃、20分間処理した。その後、PBSで3回洗浄し、4%ホルマリン(和光純薬工業株式会社)で室温、5分間固定し、PBSで3回洗浄した。FGFR3遺伝子(GenBank登録番号:NM_000142.3)の塩基配列のうち、全てのバリアントに共通する塩基番号2851〜4281に特異的なbrancedDNAプローブ(QuantiGene ViewRNA Probe Set Type4;Affymetrix社)、及びTACC3遺伝子(GenBank登録番号:NM_006342.1)の塩基配列のうち塩基番号2200〜2838に特異的なbrancedDNAプローブ(QuantiGene ViewRNA Probe Set Type1;Affymetrix社)を、Probe Set Diluent QT(Affymetrix社)で40倍希釈し、Probe Set Solutionを作製した。本溶液をFFPE切片に添加し、インキュベータ内で40℃、2時間反応させ、ポリヌクレオチド(mRNA)にハイブリダイゼーションさせた。その後、FFPE切片をWash Buffer(Affymetrix社)で3回洗浄し、PreAmplifier Mix QT(Affymetrix社)でインキュベータ内で40℃、25分間反応させた。さらに、FFPE切片をWash Bufferで3回洗浄し、Amplifier Mix QT(Affymetrix社)でインキュベータ内で40℃、15分間反応させた。Wash Bufferで3回洗浄し、Label Probe Mix(Affymetrix社)を25分の1容量含むLabel Probe Diluent QT(Affymetrix社)でインキュベータ内で40℃、30分間反応させた。次に、Wash Bufferで2回、PBSで1回洗浄し、蛍光色素DAPI(Affymetrix社)を含むPBSで室温、15分間反応させた。PBSで2回洗浄したあと、封入剤EcoMount(Biocare Medical社)で封入し、共焦点レーザー顕微鏡(LSM700;Carl Zeiss社)で蛍光観察した。FGFR3−TACC3_v1発現/NIH3T3細胞、FGFR3−TACC3_v2発現/NIH3T3細胞及びFGFR3−TACC3_v3発現/NIH3T3細胞のFFPE切片のいずれにおいてもFGFR3のシグナル及びTACC3のシグナルが検出され、さらにFGFR3のシグナルとTACC3のシグナルのほとんどが共局在した。これによりFGFR3−TACC3融合遺伝子を強制的に発現させた細胞を含むFFPE切片では、FGFR3のシグナルとTACC3のシグナルが共局在することが示された。
実施例18と同様の手順でヒト膀胱癌患者由来細胞株RT−112細胞及びヒト胃癌患者由来細胞株HSC−39細胞のFFPE標本を作製し、ISH法によるFGFR3−TACC3融合ポリヌクレオチド(mRNA)の検出を行った。実施例18のヒートブロックによる処理以降の方法で処理し、封入後の標本を蛍光観察した。取得した画像をIN Cell Analyzer 2000(GE Healthcare社)で解析したところ、FGFR3−TACC3_v1を発現するRT−112細胞(実施例15)のFFPE切片では共局在するFGFR3のシグナルとTACC3のシグナルが多数検出されたのに対し、実施例番号23記載のRT−PCRによってFGFR3−TACC3融合ポリヌクレオチド(mRNA)を発現しないことを確認しているHSC−39細胞のFFPE切片では共局在するFGFR3のシグナルとTACC3のシグナルはほとんど検出されなかった。これにより、FGFR3−TACC3融合遺伝子を内在的に発現する細胞を含むFFPE切片においてFGFR3のシグナルとTACC3のシグナルが共局在し、FGFR3−TACC3融合遺伝子を発現しない細胞では共局在しないことから、このような共局在シグナルを測定することにより、FGFR3−TACC3融合遺伝子の有無を判定できることが示された。
米国アステランド社から購入した膀胱癌患者由来組織のFFPE切片を、実施例18のヒートブロックによる処理以降の方法で処理し、封入後の切片を蛍光観察した。取得した画像をIN Cell Analyzer 2000(GE Healthcare社)で解析したところ、FGFR3−TACC3融合ポリヌクレオチド(mRNA)を発現しないことを実施例23記載のRT−PCR法によって確認した膀胱癌患者組織由来FFPE切片と比較して、FGFR3−TACC3_v2を発現することを実施例23記載のRT−PCR法によって確認した膀胱癌患者組織由来FFPE切片では、共局在するFGFR3のシグナルとTACC3のシグナルの数が明らかに多かった。
英国ティッシュソリューションズ社から購入した複数の膀胱癌患者組織由来FFPE切片についても同様の方法にて、FGFR3のシグナルとTACC3のシグナルの共局在を調べた。その結果、FGFR3−TACC3融合ポリヌクレオチド(mRNA)を発現しないことを実施例23記載のRT−PCR法によって確認した膀胱癌患者組織由来FFPE切片と比較して、FGFR3−TACC3融合ポリヌクレオチド(mRNA)を発現することを前述の実施例記載のRT−PCR法によって確認した膀胱癌患者組織由来FFPE切片では、共局在するFGFR3のシグナルとTACC3のシグナルの数が明らかに多かった。
これにより、膀胱癌患者組織由来FFPE切片においても、共局在するシグナルを観察することにより、FGFR3−TACC3融合遺伝子の有無を判定できることが示された。
(1)FLAGタグ融合発現プラスミド(FGFR3−TACC3_v1(N−FLAG)/pcDNA3.1/Zeo(+)、FGFR3−TACC3_v2(N−FLAG)/pcDNA3.1/Zeo(+)及びFGFR3−TACC3_v3(N−FLAG)/pcDNA3.1/Zeo(+))の構築
5’末端にFLAGタグを融合させたFGFR3−TACC3融合ポリヌクレオチドを取得するために、実施例1、2及び3でクローニングしたベクターを鋳型として用いて、5’末端にFLAGタグを付加させるPCRを実施した。配列番号21で示されるFGFR3_N_FLAG_BamHI及び配列番号14で示されるFGFR3_TACC3_cloning_EcoRI_Rのプライマー及びDNAポリメラーゼ(KOD −plus− Ver.2;東洋紡績株式会社)を用いてPCR(98℃15秒、55℃15秒、68℃3分30秒を12サイクル)を行った。PCR産物をクローニングベクター(TOPO XL PCR Cloning Kit;ライフテクノロジーズ社)へクローニングした。インサートはダイデオキシシーケンス法により配列を決定した(BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit;ライフテクノロジーズ社)。この結果、PCR産物は配列番号1、配列番号3及び配列番号5に記載されている配列のうち、ファーストメチオニンをコードする3塩基(ATG)が削除され、開始コドンとFLAGタグをコードする核酸配列(配列番号22)が5’末端に付加された核酸配列であることを確認した。これらによりコードされるポリペプチドを、それぞれFGFR3−TACC3_v1(N−FLAG)融合ポリペプチド、FGFR3−TACC3_v2(N−FLAG)融合ポリペプチド及びFGFR3−TACC3_v3(N−FLAG)融合ポリペプチドと称し、これらを総称してFGFR3−TACC3(N−FLAG)融合ポリペプチドと称する。また、これらのFLAG配列を付加したFGFR3−TACC3_v1(N−FLAG)、FGFR3−TACC3_v2(N−FLAG)及びFGFR3−TACC3_v3(N−FLAG)のORF全長を蛋白質として発現する発現ベクター構築のため、上記クローニングベクターを制限酵素BamHIで37℃、3時間の酵素反応を行い制限酵素処理したDNA断片を精製し、さらにEcoRIで37℃、3時間の酵素反応を行い制限酵素処理したDNA断片を精製した。このORFを含むDNA断片を発現ベクター(pcDNA3.1/Zeo(+);ライフテクノロジーズ社)のマルチクローニングサイトに存在するBamHI及びEcoRIサイトにクローニングし発現プラスミド(FGFR3−TACC3_v1(N−FLAG)/pcDNA3.1/Zeo(+)、FGFR3−TACC3_v2(N−FLAG)/pcDNA3.1/Zeo(+)及びFGFR3−TACC3_v3(N−FLAG)/pcDNA3.1/Zeo(+))を構築した。
トランスフェクション実施前日に、コラーゲンコートされた15cmディッシュ1枚あたり0.5×107個のHEK293細胞を10%牛胎児血清を含むD−MEM培地を用いて10枚培養した。トランスフェクション当日に、FGFR3−TACC3_v1(N−FLAG)/pcDNA3.1/Zeo(+)、FGFR3−TACC3_v2(N−FLAG)/pcDNA3.1/Zeo(+)及びFGFR3−TACC3_v3(N−FLAG)/pcDNA3.1/Zeo(+)をそれぞれディッシュ1枚あたり27μg、トランスフェクション試薬(FUGENE(登録商標)HD;Roche社)を81μL用いて、HEK293細胞にトランスフェクションを実施した。トランスフェクション24時間後に培地を取り除きPBSにて3回洗浄し、1mLのPBSを加えセルスクレイパー(コーニング社)により細胞を剥がした後、ポリプロピレン製チューブに回収した。1200rpmで5分間遠心した後、上清を取り除き150μLの細胞溶解液(50mM Tris HCl(pH8.0)、150mM NaCl、1%NP−40、1mM EDTA、プロテアーゼ阻害剤カクテルcomplete(ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社))を加え氷上にて30分間インキュベーションし細胞を溶解させた。遠心後得られた上清中に存在するFGFR3−TACC3_v1(N−FLAG)融合ポリペプチド、FGFR3−TACC3_v2(N−FLAG)融合ポリペプチド及びFGFR3−TACC3_v3(N−FLAG)融合ポリペプチドをそれぞれM2抗体アフィニティゲル(ANTI−FLAG M2 Affinity Gel;SIGMA−ALDRICH社)を用いて製品情報に記載された方法に従って精製した。洗浄及び溶出は洗浄液(50mM Tris HCl(pH8.0)、150mM NaCl、1%NP−40、1mM EDTA、プロテアーゼ阻害剤カクテルcomplete(ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社))、溶出液(20mM Tris HCl(pH7.4)、10mM MgCl2、10mM MnCl2、0.5mg/mL FLAG peptide)をそれぞれ使用し、100μLの溶出液を得た。FGFR3−TACC3_v1(N−FLAG)融合ポリペプチド、FGFR3−TACC3_v2(N−FLAG)融合ポリペプチド及びFGFR3−TACC3_v3(N−FLAG)融合ポリペプチドが得られたことを溶出液に対して抗FGFR3抗体(Cell Signaling Technology社)及び抗FLAG M2抗体(SIGMA−ALDRICH社)を用いたイムノブロッティングならびに銀染色を行い、確認した。
上記で精製したFGFR3−TACC3_v1(N−FLAG)融合ポリペプチド、FGFR3−TACC3_v2(N−FLAG)融合ポリペプチド及びFGFR3−TACC3_v3(N−FLAG)融合ポリペプチドのペプチド基質に対するリン酸化活性をキナーゼ活性検出キット(HTRF KinEASE−TK;Cisbio社)を用いて検討した。384ウェルのLow−volume Black plate(コーニング社)を用い、上記溶出液の1倍希釈溶液、3倍希釈溶液又は10倍希釈溶液の各1μLを酵素源として、キット同封の5×Kinase bufferにDTT及びMg2+をそれぞれ最終濃度1mM及び5mMとなるように添加し反応溶液とした。基質として、キット同封のTK Substrateを最終濃度が2.0μMとなるように、ATP未添加及びATPの最終濃度が100μMとなるように添加し、最終容量5.0μLとしてそれぞれ室温にて1時間反応させた。反応後、キット推奨の方法に従いSa−XL665及びTK Antibody−Eu(K)溶液を調製し、それぞれ2.5μL添加し、室温にて1時間反応後、HTRFのカウント(すなわちペプチド基質のリン酸化)を検出した。その結果、ATP未添加に対しATP添加では、HTRFのカウントが、上記FGFR3−TACC3_v1(N−FLAG)融合ポリペプチド、FGFR3−TACC3_v2(N−FLAG)融合ポリペプチド又はFGFR3−TACC3_v3(N−FLAG)融合ポリペプチドを含む各溶出液1倍希釈溶液1μLを添加した時は、それぞれ約38倍、約40倍及び約38倍増加、上記溶出液3倍希釈溶液1μLを添加した時は、それぞれ約27倍、34倍、31倍、上記溶出液10倍希釈溶液1μLを添加した時は、それぞれ5倍、18倍、11倍に増加していることが明らかとなった。
以上のように、キナーゼ活性検出キットを用いることにより、FGFR3−TACC3(N−FLAG)融合ポリペプチドのインビトロキナーゼ活性を検出することが可能であった。
FGFR3−TACC3_v1(N−FLAG)融合ポリペプチド、FGFR3−TACC3_v2(N−FLAG)融合ポリペプチド及びFGFR3−TACC3_v3(N−FLAG)融合ポリペプチドのインビトロキナーゼ活性に対する化合物Dovitinib、AZD4547、BGJ398及びLY2874455の阻害作用を上記キナーゼ活性検出キット及び同様の384ウェルプレートを用いて検討した。1.0μLの各化合物溶液を、DMSOの最終濃度が0.1%、化合物の最終濃度がDovitinibは1μM、100nM、10nM、AZD4547及びBGJ398はそれぞれ100nM、10nM、1nM、LY2874455は10nM、1nM、0.1nMになるように添加し、又はコントロールとしてDMSOを0.1%となるように添加して、FGFR3−TACC3_v1(N−FLAG)融合ポリペプチドについては上記溶出液2倍希釈溶液1μL、FGFR3−TACC3_v2(N−FLAG)融合ポリペプチドについては上記溶出液3倍希釈溶液1μL、及びFGFR3−TACC3_v3(N−FLAG)融合ポリペプチドについては上記溶出液3倍希釈溶液1μLを添加した。ついで、基質として、キット同封のTK Substrateを最終濃度が2.0μMとなるように添加し、室温にて15分間反応させた。次に、ATP未添加及びATPの最終濃度が100μMとなるように添加し、、最終容量5.0μLとしてそれぞれ室温にて一時間反応させた。その他は、上述の(3)の方法と同様に調製したSa−XL665及びTK Antibody−Eu(K)溶液をそれぞれ2.5μL添加し、室温にて1時間反応後、HTRFのカウントを検出した。化合物非存在下(DMSOを化合物添加時と同濃度である0.1%)でのATP未添加及び添加時のリン酸化のカウントをそれぞれ100%阻害、0%阻害として、化合物によるFGFR3−TACC3_v1(N−FLAG)融合ポリペプチド、FGFR3−TACC3_v2(N−FLAG)融合ポリペプチド及びFGFR3−TACC3_v3(N−FLAG)融合ポリペプチドのキナーゼ活性の阻害%を以下の式より算出した。
[化合物によるキナーゼ活性阻害(%)]=(1−[化合物添加ATP添加時のリン酸化のカウント−化合物未添加ATP未添加時のリン酸化のカウント]/[化合物未添加ATP添加時のリン酸化のカウント−化合物未添加ATP未添加時のリン酸化のカウント])×100
その結果、精製FGFR3−TACC3_v1(N−FLAG)融合ポリペプチド、FGFR3−TACC3_v2(N−FLAG)融合ポリペプチド及びFGFR3−TACC3_v3(N−FLAG)融合ポリペプチドのペプチド基質に対するリン酸化活性を化合物Dovitinib、AZD4547、BGJ398及びLY2874455が阻害すること見出した。各化合物の各々の最終濃度でのペプチド基質に対する阻害割合(%)を表1に示す。
LY2874455化合物の最終濃度が10nMとなるようにした以外は、実施例9と同様の方法を用いてFGFR3−TACC3_v1発現/NIH3T3細胞、FGFR3−TACC3_v2発現/NIH3T3細胞及びFGFR3−TACC3_v3発現/NIH3T3細胞増殖阻害作用の評価を行った。その結果、LY2874455の阻害%はそれぞれ88%、90%、89%であった。
以上の結果は、FGFR3−TACC3_v1、FGFR3−TACC3_v2及びFGFR3−TACC3_v3を発現する癌細胞や腫瘍の増殖をFGFR3−TACC3融合ポリペプチド阻害剤であるLY2874455が阻害できることを示している。
ヒト浸潤性膀胱癌検体(英国ティッシュソリューション社)に対して、逆転写酵素キット(スーパースクリプIIIファーストストランドシンセテーススーパーミックス;ライフテクノロジーズ社)のプロトコールにしたがい、オリゴdTプライマーを用いて逆転写反応を行い、cDNAを合成した。
次に、FGFR3_F002プライマー(配列番号23)及びTACC3_R002プライマー(配列番号24)を用いて、上記で得たcDNAを鋳型として、DNAポリメラーゼ(PrimeSTAR;タカラバイオ式会社)を用いてPCR(94℃2分の後、98℃10秒、68℃3.5分を40サイクル)を行った。
これらのプライマーはそれぞれFGFR3遺伝子の5’UTRおよびTACC3の3’UTRに該当するので、FGFR3とTACC3との融合遺伝子が存在すれば、バリアントを問わず全ての融合遺伝子を検出することができる。
得られたPCR産物をクローニングベクター(Zero blunt TOPO PCR Kit ;ライフテクノロジーズ社)にクローニングし、インサートをダイデオキシシーケンス法(BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit;ライフテクノロジーズ社)により配列を決定した。その結果、NCBIに登録されているFGFR3遺伝子(NM_001163213.1)のCDSの5’からエキソン18の途中まで(257番目から2498番目)が、TACC3遺伝子(NM_006342.1)のCDSのエキソン7の途中(1771番目から2672番目)と融合している転写産物(FGFR3−TACC3_v5a)と一塩基を除いて同一であることが明らかになった(配列番号25)。その一塩基はNCBIに登録されているFGFR3遺伝子(NM_001163213.1)の1980番目にあり、登録ではCであるが決定した配列はGであった。また、同時に、FGFR3遺伝子(NM_001163213.1)のエキソン4の3’側の配列(690番目から701番目)が欠失し、また、エキソン10とエキソン11の間にCAG配列が挿入された配列を持つ転写産物(FGFR3−TACC3_v5b)(配列番号27)も存在することが明らかとなった。配列番号25によりコードされるポリペプチドを配列番号26に、配列番号27によりコードされるポリペプチドを配列番号28に示す。
FGFR3−TACC3_v5a及びFGFR3−TACC3_v5bのORF全長を蛋白質として発現するため、レトロウイルス溶液作製用発現プラスミドを以下の通り構築した。実施例23で作製した、クローニングしたベクターをそれぞれ鋳型として用いて、配列番号7で示されるFGFR3_TACC3_cloning_BamHI_F及び配列番号8で示されるFGFR3_TACC3_cloning_EcoRI_Fのプライマー、並びにDNAポリメラーゼ(KOD −plus− Ver.2;東洋紡績株式会社)を用いてPCR(98℃15秒、55℃15秒、68℃3分30秒を15サイクル)を行った。PCR反応後、電気泳動したところ、それぞれ目的サイズののPCR産物が得られた。PCR産物をクローニングベクター(TOPO XL PCR Cloning Kit;ライフテクノロジーズ社)にクローニングした。インサートはダイデオキシシーケンス法により配列を決定した(BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit;ライフテクノロジーズ社)。この結果、PCR産物は、それぞれ、配列番号25又は配列番号27を含むことを確認した。FGFR3−TACC3_v5a及びFGFR3−TACC3_v5bのORF全長を蛋白質として発現するため、上記クローニングベクターを制限酵素BamHIで37℃、3時間の酵素反応を行い制限酵素処理したDNA断片を精製し、さらにEcoRIで37℃、3時間の酵素反応を行い制限酵素処理したDNA断片を精製した。このORFを含むDNA断片を発現ベクター(pMXs−puro;コスモバイオ社)のマルチクローニングサイトに存在するBamHI及びEcoRIサイトにクローニングし発現プラスミド(FGFR3−TACC3_v5a/pMXs−puro及びFGFR3−TACC3_v5b/pMXs−puro)を構築した。
これらの構築ベクターを用いて実施例7の方法に従いレトロウイルス溶液を作製した。
実施例24においてFGFR3−TACC3_v5a/pMXs−puro及びFGFR3−TACC3_v5b/pMXs−puroを用いて作製したウイルス溶液を用いて、実施例8の方法に従いFGFR3−TACC3_v5a及び及びFGFR3−TACC3_v5bを安定発現するNIH3T3細胞を取得した。(それぞれFGFR3−TACC3_v5a発現/NIH3T3細胞及びFGFR3−TACC3_v5b発現/NIH3T3細胞と命名した。)
FGFR3−TACC3_v5a発現/NIH3T3細胞及びFGFR3−TACC3_v5b発現/NIH3T3細胞の足場非依存的増殖亢進能を検討するため、実施例8と同様の方法で検討した。Mock/NIH3T3細胞はDay1からDay4までで細胞数のカウントは増加しなかったのに対して、FGFR3−TACC3_v5a発現/NIH3T3細胞はDay1からDay4までで約2.6倍の細胞数のカウントの増加が確認された。また、FGFR3−TACC3_v5b発現/NIH3T3細胞はDay1からDay4までで約2.7倍の細胞数のカウントの増加が確認された。以上のことから、FGFR3−TACC3_v5a発現/NIH3T3細胞及びFGFR3−TACC3_v5b発現/NIH3T3細胞は足場非依存的細胞増殖亢進作用を示すことが明らかとなった。
(1)サンプル調製
実施例8で作製されたFGFR3−TACC3_v1発現/NIH3T3細胞及びNIH3T3細胞をカバーグラス上で一晩培養した。翌日培養液を除いた後、3.7%ホルムアルデヒドで室温10分間反応させて細胞を固定した。PBSで洗浄後、0.2%Triton X−100(ナカライ社)にて室温10分間反応させた後、0.5%SDSにて室温25分間反応させた。PBSで洗浄後、Blocking solution(Olink社)でブロッキングした。
(2)目的融合ポリペプチドの検出
上記(1)で調製したサンプルを、Can Get Signal immunostain SolutionA(東洋紡株式会社)で希釈したFGFR3抗体(宿主:マウス Santacruz社)とTACC3抗体(宿主:ヤギ R&D社)で、4℃、一晩インキュベートした。
翌日Wash buffer A(Olink社)で洗浄後、Can Get Signal immunostain SolutionAで希釈をしたDuolink InSitu PLA probe anti−Mouse MINUSとDuolink InSitu PLA probe anti−Goat PLUS(いずれもOlink社)でカバーグラスを室温、1時間浸した。Wash buffer Aで洗浄した後、Duolink II試薬キットのLigation−Ligase溶液(Olink社)に浸し、37℃、30分間インキュベートした。この工程により十分近接した位置にある2種類のInSitu PLA probe抗体の間に環状オリゴヌクレオチドが形成される。Wash buffer Aで洗浄した後、同キットのAmplification−Polymerase溶液(Olink社)を添加し、37℃で100分間インキュベートした。この工程により環状オリゴヌクレオチドを鋳型として核酸が伸長し、且つその伸長した核酸に蛍光標識されたオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする。Wash buffer B(Olink社)で2回、Wash buffer Bを水で100倍希釈した溶液で1回洗浄した後、Duolink Mounting Medium with DAPI(Olink社)で封入し、共焦点レーザー顕微鏡(LSM700;Carl Zeiss社)を用いて蛍光観察した。FGFR3−TACC3_v1発現/NIH3T3細胞では多数の蛍光ドットが存在する細胞が観察されるのに対して、NIH3T3細胞においては蛍光ドットはほとんど観察されなかった。この蛍光ドットは環状オリゴヌクレオチドを鋳型として伸長した核酸にハイブリダイズした蛍光標識オリゴヌクレオチドに由来し、2種類の抗原すなわちFGFR3とTACC3が十分近接した状態すなわち同一分子内に存在していることに由来する。従って本実施例の方法で、蛍光ドットの有無を観察することによって、FGFR3−TACC3融合ポリペプチドの存在の有無が判定(検出)できることが示された。
(1)サンプル調製
実施例19で作製した、FGFR3−TACC3_v1を発現するRT−112細胞と発現しないHSC−39細胞のFFPE標本をキシレンとエタノールにそれぞれ3回、各8分間浸すことでパラフィンを除き、イムノセーバー(日新EM株式会社)に浸して煮沸した。PBSで切片を洗浄した後、0.2%Triton X−100で室温10分間反応させた。PBSで洗浄後Protein Block Serum−Free(Dako社)でブロッキングした。
(2)目的融合ポリぺプチドの検出
実施例26(2)と同様の手順で免疫染色法による検出を行い、蛍光観察した。FGFR3−TACC3_v1を発現するRT−112細胞では多数の蛍光ドットが観測されたのに対して、FGFR3−TACC3_v1を発現していないHSG−39細胞でにはそのような蛍光ドットはほとんど観測されなかった。これにより、FGFR3−TACC3融合遺伝子を内在的に発現する細胞を含むFFPE切片において蛍光ドットを観察することにより、FGFR3−TACC3融合ポリペプチドの存在の有無を判定(検出)できることが示された。
(1)サンプル調製
英国ティッシュソリューションズ社から購入した膀胱肺癌臨床検体のFFPE切片をキシレンとエタノールにそれぞれ3回、各8分間浸すことでパラフィンを除き、イムノセーバー(日新EM株式会社)に浸して煮沸した。Milli−Q水でFFPE切片を洗浄した後、3%過酸化水素水で30分室温でインキュベートした。PBSで洗浄後、0.2%Triton X−100で室温10分間反応させた後、0.5%SDS溶液で20分反応させた。PBSで洗浄後Protein Block Serum−Free(Dako社)でブロッキングした。
(2)目的融合ポリペプチドの検出
Can Get Signal immunostain SolutionA(東洋紡)で希釈したFGFR3抗体(宿主:マウス Santacruz社)とTACC3抗体(宿主:ヤギ R&D社)でFFPE切片を4℃一晩インキュベートした。
翌日のWash buffer A(Olink社)で洗浄後、Can Get Signal immunostain SolutionAで希釈をしたDuolink InSitu PLA probe anti−Mouse MINUSとDuolink InSitu PLA probe anti−Goat PLUS(いずれもOlink社)でFFPE切片を室温で1時間浸した。Wash buffer Aで洗浄した後、Duolink II Bright field試薬キットのLigation−Ligase溶液(Olink社)に浸し、37℃で30分間インキュベートした。この工程で実施例26、27と同様に環状オリゴヌクレオチドが形成される。Wash buffer Aで洗浄後、同キットのAmplification−Polymerase溶液(Olink社)で37℃で120分間インキュベートした。この工程により環状オリゴヌクレオチドを鋳型として核酸が伸長する。Wash buffer Aで洗浄後同キットのDetection Bright Field solutionに浸して室温で1時間浸した。この工程により、先の工程で伸長した核酸にHorseradish peroxidase(HRP)標識されたオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする。Wash buffer Aで洗浄後、同キットのSubstrate solutionを添加し、室温で10分から15分反応させた。Milli−Q水で洗浄した後、同キットのNuclear stain solutionを添加し、室温で2分反応させた後、水道水で洗浄した。その後エタノールとキシレンを用いて脱水と透徹をした後、封入した。
顕微鏡(BZ−9000;KEYENCE社)で明視野観察すると、FGFR3−TACC3_v1を発現することが実施例23の方法で確認されている膀胱癌患者組織由来FFPE切片では赤い染色が観察されているのに対して、実施例23の方法でFGFR3とTACC3との融合遺伝子の発現が確認されていない患者組織由来切片では赤い染色が観察されなかった。この赤い染色は環状オリゴヌクレオチドを鋳型として伸長した核酸にハイブリダイズしたHRP標識オリゴヌクレオチドに由来し、実施例26及び27と同様にFGFR3とTACC3が同一分子内に存在していることに由来する。従って赤い染色が観察された切片においてFGFR3とTACC3が融合した状態で存在することが示された。これにより、本実施例の方法で、膀胱癌患者組織由来FFPE切片においても、赤い染色を観察することにより、FGFR3−TACC3融合ポリペプチドの存在の有無を判定(検出)できることが示された。
実施例21(4)の方法に従い、化合物A、B、C、D及びEのFGFR3−TACC3_v1(N−FLAG)融合ポリペプチド、FGFR3−TACC3_v2(N−FLAG)融合ポリペプチド及びFGFR3−TACC3_v3(N−FLAG)融合ポリペプチドのインビトロキナーゼ活性に対する阻害作用を検討した。ただし、各化合物の最終濃度は100nM、10nM、1nMとなるように添加した。
その結果、精製FGFR3−TACC3_v1(N−FLAG)融合ポリペプチド、FGFR3−TACC3_v2(N−FLAG)融合ポリペプチド及びFGFR3−TACC3_v3(N−FLAG)融合ポリペプチドのペプチド基質に対するリン酸化活性を化合物A、B、C、D及びEが阻害すること見出した。各化合物の各々の最終濃度でのペプチド基質に対する阻害割合(%)を表2に示す。
FGFR3−TACC3_v1発現/NIH3T3細胞、FGFR3−TACC3_v2発現/NIH3T3細胞及びFGFR3−TACC3_v3発現/NIH3T3細胞については、実施例9と同様の培地を用いて、膀胱癌患者由来細胞株RT−112については、1ウェル当り1×103個となるように10%牛胎児血清及び2mM L−glutamineを含むRPMI1640培地で播種した。また、各化合物の最終濃度は100nM、10nM、1nMとなるように添加した。そのほかの条件は実施例9と同様の方法を用いて、化合物A、B、C、D及びEのFGFR3−TACC3_v1発現/NIH3T3細胞、FGFR3−TACC3_v2発現/NIH3T3細胞、FGFR3−TACC3_v3発現/NIH3T3細胞及び膀胱癌患者由来細胞株RT−112の増殖阻害作用の評価を行った。その結果、化合物A、B、C、D及びEは、FGFR3−TACC3_v1発現/NIH3T3細胞、FGFR3−TACC3_v2発現/NIH3T3細胞、FGFR3−TACC3_v3発現/NIH3T3細胞及び膀胱癌患者由来細胞株RT−112の足場非依存的増殖亢進作用を阻害することを見出した。各化合物の各々の最終濃度での細胞増殖に対する阻害割合(%)を表3に示す。
以上の結果により、FGFR3−TACC3_v1、FGFR3−TACC3_v2及びFGFR3−TACC3_v3を発現する癌細胞や腫瘍の増殖が、化合物A、B、C、D、E及びFにより阻害できることが明らかとなった。
Claims (33)
- 被験者から得た試料中の、下記に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は該ポリペプチドの存在を検出する工程を含むことを特徴とする、ファイブロブラストグロースファクターレセプター3(FGFR3)遺伝子とトランスフォーミング アシディック コイルド−コイル コンテイニングプロテイン3(TACC3)遺伝子との融合遺伝子又はFGFR3とTACC3との融合蛋白質の検出方法:
配列番号2のアミノ酸番号461〜947、配列番号4のアミノ酸番号461〜982、配列番号6のアミノ酸番号461〜996、配列番号26のアミノ酸番号461〜1043又は配列番号28のアミノ酸番号461〜1040に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。 - 前記ポリペプチドが、配列番号2のアミノ酸番号461〜947、配列番号4のアミノ酸番号461〜982、配列番号6のアミノ酸番号461〜996、配列番号26のアミノ酸番号461〜1043又は配列番号28のアミノ酸番号461〜1040に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号2のアミノ酸番号461〜947、配列番号4のアミノ酸番号461〜982、配列番号6のアミノ酸番号461〜996、配列番号26のアミノ酸番号461〜1043又は配列番号28のアミノ酸番号461〜1040に示されるアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチドである、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号26又は配列番号28に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチドである、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号26又は配列番号28に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号26又は配列番号28に示されるアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチドである、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号26又は配列番号28に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項1に記載の方法。
- 下記に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、FGFR3遺伝子とTACC3遺伝子との融合遺伝子の検出用キット:
配列番号2のアミノ酸番号461〜947、配列番号4のアミノ酸番号461〜982、配列番号6のアミノ酸番号461〜996、配列番号26のアミノ酸番号461〜1043又は配列番号28のアミノ酸番号461〜1040に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。 - 前記ポリペプチドが、配列番号2のアミノ酸番号461〜947、配列番号4のアミノ酸番号461〜982、配列番号6のアミノ酸番号461〜996配列番号26のアミノ酸番号461〜1043又は配列番号28のアミノ酸番号461〜1040に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号2のアミノ酸番号461〜947、配列番号4のアミノ酸番号461〜982、配列番号6のアミノ酸番号461〜996、配列番号26のアミノ酸番号461〜1043又は配列番号28のアミノ酸番号461〜1040に示されるアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチドである、請求項6に記載のキット。
- 前記ポリペプチドが、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号26又は配列番号28に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチドである、請求項6に記載のキット。
- 前記ポリペプチドが、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号26又は配列番号28に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号26又は配列番号28に示されるアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチドである、請求項6に記載のキット。
- 前記ポリペプチドが、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号26又は配列番号28に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項6に記載のキット。
- FGFR3遺伝子とTACC3遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、下記a)〜e)からなる群より選択されるプライマーセット:
a)配列番号1に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット、
b)配列番号3に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット、
c)配列番号5に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット、及び
d)配列番号25に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット、
e)配列番号27に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット。 - 配列番号1の塩基番号1〜2280の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号1の塩基番号2281〜2856の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
- 配列番号3の塩基番号1〜2280の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号3の塩基番号2281〜2961の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
- 配列番号5の塩基番号1〜2368の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号5の塩基番号2369〜3003の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
- 配列番号25の塩基番号1〜2242の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号25の塩基番号2243〜3144の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
- 配列番号27の塩基番号1〜2233の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号27の塩基番号2234〜3135の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
- FGFR3遺伝子とTACC3遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプローブセットであって、下記a)〜c)からなる群より選択されるプローブセット:
a)配列番号1の塩基番号1〜2280の任意の連続する少なくとも16塩基に対して相補的なオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアからなる複数種のプローブセット、及び、配列番号1の塩基番号2281〜2856の任意の連続する少なくとも16塩基に対して相補的なオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアからなる複数種のプローブセットを含むプローブセット、
b)配列番号3の塩基番号1〜2280の任意の連続する少なくとも16塩基に対して相補的なオリゴヌクレオチドを含む複数種の隣接したプローブペアからなるプローブセット、及び、配列番号3の塩基番号2281〜2961の任意の連続する少なくとも16塩基に対して相補的なオリゴヌクレオチドを含む複数種の隣接したプローブペアからなるプローブセットを含むプローブセット、
c)配列番号5の塩基番号1〜2368の任意の連続する少なくとも16塩基に対して相補的なオリゴヌクレオチドを含む複数種の隣接したプローブペアからなるプローブセット、及び、配列番号5の塩基番号2369〜3003の任意の連続する少なくとも16塩基に対して相補的なオリゴヌクレオチドを含む複数種の隣接したプローブペアからなるプローブセットを含むプローブセット。 - 前記ポリヌクレオチドの存在を検出する工程が、被験者から得た試料及び請求項17記載のプローブセットを用いてインサイチュハイブリダイゼーションを行う工程、ハイブリダイゼーションのシグナルを増幅する工程、並びに前記のシグナルの重なりを検出する工程を含むことを特徴とする、請求項1〜請求項5のいずれかに記載のFGFR3遺伝子とTACC3遺伝子との融合遺伝子の検出方法。
- FGFR3遺伝子とTACC3遺伝子との融合遺伝子を検出するための請求項17に記載のプローブセット及びハイブリダイズしたシグナルを増幅する試薬を含む、FGFR3遺伝子とTACC3遺伝子との融合遺伝子の検出用キット。
- 前記ポリペプチドの存在を検出する工程が、i)被験者から得た試料に該ポリペプチドのFGFR3遺伝子由来部分を認識する抗体(一次抗体)及び該ポリペプチドのTACC3遺伝子由来部分を認識する抗体(一次抗体)を接触させる工程、ii)該一次抗体にそれぞれ結合する、オリゴヌクレオチドを連結したそれぞれの二次抗体を添加する工程、iii)該二次抗体が連結した該オリゴヌクレオチドと部分的に相補的な二種類のオリゴヌクレオチド及びそれらが近接した際にライゲーションさせて該二次抗体間に環状構造を形成することができるライゲースを含有するライゲーション溶液を添加し、ライゲーション反応させる工程、iv)形成された環状構造に沿って核酸を伸長させる工程、v)伸長した核酸にハイブリダイズすることのできる標識されたオリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせる工程、及び、vi)該標識シグナルを検出する工程を含むことを特徴とする、請求項1〜請求項5のいずれかに記載のFGFR3とTACC3との融合蛋白質の検出方法。
- 請求項1〜5のいずれかに記載のFGFR3とTACC3との融合蛋白質の検出方法で使用するための、前記融合ポリペプチドのFGFR3遺伝子由来部分を認識する抗体(一次抗体)及び前記融合ポリペプチドのTACC3遺伝子由来部分を認識する抗体(一次抗体)、該一次抗体にそれぞれ結合する、オリゴヌクレオチドを連結した二次抗体、該二次抗体に連結した該オリゴヌクレオチドと部分的に相補的な二種類のオリゴヌクレオチド、それらが近接した際にライゲーションさせて該二次抗体間に環状構造を形成することのできるライゲース、及び標識されたオリゴヌクレオチドプローブを含む、FGFR3とTACC3との融合蛋白質の検出用キット。
- 下記に記載のポリペプチドを阻害する物質を含有する、FGFR3遺伝子とTACC3遺伝子との融合遺伝子陽性又はFGFR3とTACC3との融合蛋白質陽性の癌治療用医薬組成物:
配列番号2のアミノ酸番号461〜947、配列番号4のアミノ酸番号461〜982又は配列番号6のアミノ酸番号461〜996に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。 - 前記ポリペプチドが、配列番号2のアミノ酸番号461〜947 、配列番号4のアミノ酸番号461〜982又は配列番号6のアミノ酸番号461〜996に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号2のアミノ酸番号461〜947、配列番号4のアミノ酸番号461〜982又は配列番号6のアミノ酸番号461〜996に示されるアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチドである、請求項22に記載の医薬組成物。
- 前記ポリペプチドが、配列番号2のアミノ酸番号461〜947、配列番号4のアミノ酸番号461〜982又は配列番号6のアミノ酸番号461〜996に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである請求項22に記載の医薬組成物。
- 前記ポリペプチドが、配列番号2、配列番号4又は配列番号6に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチドである、請求項22に記載の医薬組成物。
- 前記ポリペプチドが、配列番号2、配列番号4又は配列番号6に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号2、配列番号4又は配列番号6に示されるアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチドである、請求項22に記載の医薬組成物。
- 前記ポリペプチドが、配列番号2、配列番号4又は配列番号6に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項22に記載の医薬組成物。
- 前記ポリペプチドを阻害する物質が、Dovitinib、AZD4547、BGJ398又はLY2874455である、請求項22〜請求項27のいずれかに記載の癌治療用医薬組成物。
- 前記癌が、肺癌又は膀胱癌である、請求項22〜請求項27のいずれかに記載の癌治療用医薬組成物。
- FGFR3遺伝子とTACC3遺伝子との融合遺伝子陽性又はFGFR3とTACC3との融合蛋白質陽性の癌治療用医薬組成物の製造のための、下記に記載のポリペプチドを阻害する物質の使用:
配列番号2のアミノ酸番号461〜947、配列番号4のアミノ酸番号461〜982又は配列番号6のアミノ酸番号461〜996に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。 - FGFR3遺伝子とTACC3遺伝子との融合遺伝子陽性又はFGFR3とTACC3との融合蛋白質陽性の癌の治療のための、下記に記載のポリペプチドを阻害する物質の使用:
配列番号2のアミノ酸番号461〜947、配列番号4のアミノ酸番号461〜982又は配列番号6のアミノ酸番号461〜996に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。 - FGFR3遺伝子とTACC3遺伝子との融合遺伝子陽性又はFGFR3とTACC3との融合蛋白質陽性の癌の治療のための、下記に記載のポリペプチドを阻害する物質:
配列番号2のアミノ酸番号461〜947、配列番号4のアミノ酸番号461〜982又は配列番号6のアミノ酸番号461〜996に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。 - 下記に記載のポリペプチドを阻害する物質の有効量を対象に投与することからなる、FGFR3遺伝子とTACC3遺伝子との融合遺伝子陽性又はFGFR3とTACC3との融合蛋白質陽性の癌の治療方法:
配列番号2のアミノ酸番号461〜947、配列番号4のアミノ酸番号461〜982又は配列番号6のアミノ酸番号461〜996に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
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