CN103725786A - microRNA-219试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

microRNA-219试剂盒及其应用，涉及microRNA-219。所述microRNA-219试剂盒包括用于扩增microRNA-129的特异性逆转录引物及real-time PCR引物对一套；用于扩增对照RNA（U6）的特异性逆转录引物及real-time PCR引物对一套及相关试剂。microRNA-219在诊断、预测癫痫和以痫性发作为特征的神经系统疾病中的用途。通过检测患者脑内的小分子核酸microRNA-219的表达水平即可快捷方便灵敏地用于诊断或评估癫痫和以痫性发作为特征的神经系统疾病。

Description

microRNA-219试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及microRNA-219，尤其是涉及microRNA-219试剂盒及其应用。
背景技术
癫痫是一种以大脑神经元异常同步化放电为特征的慢性反复性严重神经系统疾病，全球约5千万患者深受其扰。抗癫痫药物仅控制约三分之二患者的癫痫发作，且不能从根本上改善其病理生理状态。癫痫的发生涉及到离子通道改变，突触重塑，炎症，神经胶质增生和神经元死亡等。然而，迄今为止，针对这些过程的干预措施在临床上很少表现出足够的疗效，我们对癫痫发生的细胞和分子机制仍缺乏完整了解。
microRNA是一类长度为19～23个核苷酸的内源性非编码RNA，其被RNA诱导沉默复合体（RISC,由Dicer,Argonaute及其他蛋白质组成）载入后可以与靶mRNA的3’非翻译区(UTR)配对,引起靶mRNA的降解或抑制其翻译效率，进而调控基因表达（Vasudevan S,Tong Y,SteitzJ A.Switching from repression to activation:miRNAs can up-regulate translation.Science,2007;(5858):1931-1934；Lewis B P,Burge C B,Bartel D P.Conserved seed pairing,often flanked byadenosines,indicates that thousands of human genes are miRNA targets Cell2005(1):15-20）。miRNA以复杂网络调控的方式参与生物体生理过程，对在生理条件下神经系统中miRNA分布、表达和功能的研究表明，miRNA通过调节多种基因的表达，广泛参与对神经元发育、细胞成熟与迁移、髓鞘形成、突触发育成熟和可塑性、胶质疤痕形成、神经性疼痛、神经修复和再支配等多种生理病理过程，miRNA生成异常或其功能通路发生障碍在神经退行性疾病、精神病和脑肿瘤等的发生发展中发挥关键作用（Hebert S S,De Strooper B.Alterations of themiRNA network cause neurodegenerative disease.Trends Neurosci,2009;(4):199-206；SaugstadJA.MiRNAs as effectors of brain function with roles in ischemia and injury,neuroprotection,andneurodegeneration.J Cereb Blood Flow Metab.2010;30(9):1564-1576）。
MiRNA-219为人和啮齿类动物脑组织所特有的miRNA之一（Dostie J,Mourelatos Z,YangM,Sharma A,Dreyfuss G.Numerous microRNPs in neuronal cell containing novel miRNAs.RNA.2003;9(2):180-6），与脑组织的发育和高级神经功能密切相关（Okabe M,Imai T,Kurusu M,Hiromi Y,Okano H,Translational repression determines a neuronal potential in Drosophilaasymmetric cell divison.Nature.2001;411(6833):94-98；Miller S,Yasuda M,Coats JK,Jones Y,Martone ME,Mayford M.Disruption of dendritic translation of CaMKⅡalpha impairs stabilizationof synaptic plasticity and memory consolidation.Neuron.2002;36(3):507-19）。对其生理功能的深入研究逐步显示出miRNA-219与癫痫发生的潜在相关性。如最近Jannet Kocerha等发现N-甲基-D-天冬氨酸受体功能减退与miRNA-219表达下调相关，miRNA-219通过调节NMDAR信号下游效应蛋白CaMKⅡγ而参与NMDAR功能异常所致行为失常（Kocerha J,Faghihi MA,Lopez-Toledano MA,Huang J,Ramsey AJ,Caron MG,Sales N,Willoughby D,Elmen J,Hansen HF,Orum H,Kauppinen S,Kenny PJ,Wahlestedt C.MiRNA-219modulates NMDA receptor-mediatedneurobehavioral dysfunction.Proc Natl Acad Sci USA.2009;106(9):3507-12）；此外，研究发现，miRNA-219在海马神经元的胞体、树突区域高表达，在轴突区也有表达（Okado H,Ohtaka-Maruyama C,Sugitani Y,Fukuda Y,Ishida R,Hirai S,Miwa A,Takahashi A,Aoki K,Mawano H,Kasai M.The transcriptional repressor RP58is crucial for cell-division patterning andneuronal survival in the developing cortex.Dev Biol.2009;331(2):140-51），表明其在突触可塑性中发挥重要作用。以上研究提示，miRNA-219与癫痫的发生密切相关，其可能参与调控癫痫的发病过程。
发明内容
本发明的目的在于提供microRNA-219试剂盒及其应用。
所述microRNA-219试剂盒的组成包括：
Figure BDA0000455317140000021
Figure BDA0000455317140000031
上述含量可用于荧光定量PCR反应100次，在－20℃下保存。
以上试剂均由各来源公司提供，已经商品化。具体检测方法及相关参数参照实施例2。
本发明公开了microRNA-219在诊断、预测癫痫和以痫性发作为特征的神经系统疾病中的用途。通过大量的实验证实，在诱发癫痫发作的小鼠模型中，小鼠大脑海马组织中microRNA-219水平显著降低。给予小鼠侧脑室注射microRNA-219的拮抗剂（antagomir）能引起小鼠癫痫发作症状。而给予癫痫模型小鼠侧脑室注射microRNA-219的激动剂（agomir）则能显著改善其癫痫发作症状，意味着microRNA-219在癫痫的发病机制中起着关键性作用，其可作为一种早期诊断和预测癫痫类疾病的生物标志物。这一结果在癫痫细胞模型中进一步得到了证实。同时，收集了临床癫痫患者的脑脊液，检测其中microRNA-219水平，证实其与癫痫发病具有相关性。本发明旨在公开基于microRNA-219的生物诊断试剂盒的用途，用以诊断或者评估癫痫和以痫性发作为特征的神经系统疾病。
本发明的优点和技术方法：
癫痫是多种原因导致的脑部神经元高度同步化异常放电的临床综合征，临床表现具有发作性、短暂性，随机性的特点，这就为发作间期的诊断带来一定的困难。本发明的优点在于使用本试剂盒检测患者脑内的小分子核酸microRNA-219的表达水平即可快捷方便灵敏地用于诊断或评估癫痫和以痫性发作为特征的神经系统疾病。
诊断评估方法：收集患者切除的脑组织病灶标本或抽取患者的脑脊液，使用本试剂盒中的试剂，用荧光定量PCR的实验技术检测患者脑组织中或脑脊液中microRNA-219的表达变化情况，若检测出microRNA-219的表达水平低于正常值，则有助于诊断该患者患有癫痫或判断该患者患有癫痫或以痫性发作为特征的神经系统疾病的可能性和风险较大。
附图说明
图1为小鼠侧脑室注射1.5ug KA后小鼠脑电图波形。
图2为KA诱导癫痫模型小鼠海马内microRNA-219表达变化情况。
图3为癫痫患者脑脊液中microRNA-219表达情况。
图4为小鼠侧脑室注射0.2nmol antagomir-219后小鼠脑电图波形。
图5为小鼠侧脑室注射0.2nmol阴性对照剂antagomir-NC后小鼠脑电图波形。
图6为小鼠侧脑室注射0.2nmol antagomir-219后小鼠海马内microRNA-219表达变化情况。
图7为癫痫模型小鼠侧脑室注射0.2nmol agomir-219后小鼠脑电图波形。
图8为癫痫模型小鼠侧脑室注射0.2nmol阴性对照剂agomir-NC后小鼠脑电图波形。
图9为小鼠侧脑室注射0.2nmol agomir-219后小鼠脑电图波形。
图10为癫痫模型小鼠侧脑室注射0.2nmol agomir-219后小鼠海马内microRNA-219表达变化情况。
图11为癫痫细胞模型（原代培养小鼠海马神经元）中加入0.8nmol agomir-219（终浓度为400nM）后microRNA-219表达变化情况。
图12为癫痫细胞模型（原代培养小鼠海马神经元）中加入0.8nmol antagomir-219（终浓度为400nM）后microRNA-219表达变化情况。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，所有实施例仅用于例证本发明，决不限制本发明的保护范围。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
用成年雄性ICR小鼠（30～35g），侧脑室注射经典致痫剂海人酸（Kainic acid，KA）1.5ug诱发小鼠癫痫发作，建立小鼠癫痫动物模型。注射海人酸后小鼠表现出双眼凝视、须动增加、呼吸急促、反复洗脸动作，伴有头面部抽搐，逐渐发展为伴有站立并摔倒的全身强直阵挛性发作的癫痫症状，发作等级达到Racine分级Ⅳ～Ⅴ级，小鼠脑电图显示为多量高幅棘波的癫痫发作波形，各导联见每秒5～6次，30～80μV的痫样放电持续发放（参见图1）。24h后，断头取脑，取出双侧海马，提取RNA，荧光定量PCR实验显示，KA组小鼠较正常对照组小鼠，海马内microRNA-219水平显著降低（降低70%）（参见图2）。收集临床癫痫患者的脑脊液标本，检测显示癫痫患者脑脊液中microRNA-219水平较非癫痫患者显著降低（参见图3）。这意味着microRNA-219可作为一种早期诊断和预测癫痫类疾病的生物标志物。
进一步给予成年雄性ICR小鼠侧脑室注射microRNA-219的特异性拮抗剂（antagomir-219），小鼠表现出癫痫发作症状，发作等级达到Racine分级Ⅳ级，脑电图显示为异常棘波波形，各导联见每秒1次，10～60μV的痫样放电持续发放（参见图4）。癫痫静止期，部分小鼠易激怒、暴躁，有攻击行为。荧光定量PCR实验显示，注射microRNA-219拮抗剂后，小鼠海马内microRNA-219水平显著降低（参见图6），意味着拮抗microRNA-219可诱发小鼠癫痫发作，microRNA-219在癫痫发病机制中发挥着重要作用。
同时，ICR小鼠KA诱发癫痫发作6h后，给予其侧脑室注射microRNA-219的激动剂（agomir-219），小鼠癫痫症状明显好转，发作潜伏期延长，发作持续时间大大缩短，只出现凝视，头面部抽搐，双前肢抬起阵挛等轻度发作。而后未见小鼠多次发作。小鼠脑电图显示皮层痫样放电明显受到抑制，基本波动为4～6Hz的θ节律，间隔5～7s出现一次低幅痫样放电（参见附图7）。荧光定量PCR实验显示，小鼠海马内microRNA-219水平恢复到正常水平，意味着microRNA-219为拮抗癫痫及其相关疾病发病的重要保护性小分子核酸（参见图10）。
通过大量的实验证实，小鼠癫痫模型大脑海马组织中microRNA-219水平显著降低。给予小鼠侧脑室注射microRNA-219的拮抗剂（antagomir）能诱发小鼠痫性发作。而给予癫痫模型小鼠侧脑室注射microRNA-219的激动剂（agomir）则能显著改善其癫痫发作症状，提示microRNA-219在癫痫的发病机制中起着关键性作用，其表达水平的变化与癫痫的发生发展密切相关。其可作为一种早期诊断和预测癫痫类疾病的生物标志物。这一结果在癫痫细胞模型中进一步得到了证实（参加图11、12）。同时，收集了临床癫痫患者的脑脊液，检测其中microRNA-219水平，证实其与癫痫发病具有相关性(参见图3)。
本发明是在大量动物和细胞实验的基础上，结合临床癫痫患者的脑脊液检查结果，旨在开发基于microRNA-219的癫痫诊断试剂盒。
实施例1.小鼠脑电图记录
采用美国Nicolet尼高力数字化脑电图仪进行描记，以头皮电极描记小鼠脑电图，采用4导联，在小鼠左右额（F3、F4），左右顶（P3、P4）相对的头皮上各放置一根针电极，参考电极置左耳并接地。灵敏度：10μV/mm，纸速：30mm/sec，高频滤波：70HZ，低频滤波：1.6Hz。
实施例2.癫痫模型小鼠海马中microRNA-219表达水平的检测
1、本实验采用6～8周龄雄性ICR小鼠，具体分为2组：癫痫模型小鼠组及对照组。癫痫模型小鼠组小鼠放置固定在小鼠脑立体定位仪上，给予侧脑室微量注射海人酸（KA）1.5ug（1ug/μL），诱发小鼠癫痫发作，制造小鼠癫痫模型。对照组小鼠给予同侧侧脑室微量注射生理盐水1.5μL。
2、24h后，常规提取小鼠双侧海马RNA：
每100mg组织中加入1mL TRIZOL试剂，电动匀浆器匀浆。室温下放置5min后，加入0.2mL氯仿，混匀后室温下放置5min，4℃12,000r离心15min。将上层水相液转移至新EP管中，加入等体积（0.5mL）异丙醇，混匀后室温下放置10min，4℃12,000r离心10min。弃上清，加入1mL75%乙醇，混匀后4℃9,000r离心5min。弃上清，空气干燥沉淀10min，加入20μL DEPC处理水，于55～60℃水浴10min溶解RNA。获得的RNA溶液保存于-80℃。
3、紫外吸收法测定RNA浓度及纯度：
按照酶标仪使用说明进行操作，测量前先用溶解RNA用的DEPC水调零。根据260nm处读值获得RNA浓度，以A260/A280的比值判定RNA纯度。
4、变性琼脂糖凝胶电泳：
1g琼脂糖溶于72mL水中，冷却至60℃，加入10mL的10×MOPS电泳缓冲液和18mL的37%甲醛溶液。取3ugRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10ug/mL。加热至70℃孵育5min使样品变性。上样于胶孔中，5～6V/cm电压下电泳至溴酚蓝指示剂进胶至少2～3cm，紫外透射光下观察并拍照。
5、采用TaKaRa公司PrimeScript miRNA qPCR检测试剂盒对has-miR-219的表达进行检测：
miRNAs逆转录：
逆转录反应体系（20μL）：
Figure BDA0000455317140000061
以上体系混匀后，瞬时离心，37℃孵育60min后，85℃孵育5sec（酶的失活反应）。停止后4℃备用，产物保存于-20℃。
MiRNAs real-time PCR：（PCR试剂来源于TaKaRa公司，miR-219,U6等引物由广州锐博
生物有限公司合成）
反应体系（20μL）：
Figure BDA0000455317140000062
反应程序：
95℃30sec--（95℃3sec--65℃30sec）×40cycles—Melting Curve
结果显示：小鼠癫痫造模成功（图1）。癫痫模型小鼠海马中microRNA-219含量较对照正常组小鼠有明显下降，说明在癫痫小鼠海马中，microRNA-219表达水平下降（图2）。
实施例3.癫痫患者脑脊液microRNA-219的表达情况
1、收集6例癫痫患者及6例正常对照者脑脊液样本（取自2013年厦门大学附属中山医院神经内科住院患者，每个病例均由两个或以上临床医师确诊分类）。按照实施例2所述方法提取RNA，并检测microRNA-219的表达。
2、结果显示：癫痫患者脑脊液中microRNA-219表达水平明显降低（图3）。提示microRNA-219可作为一种早期诊断和预测癫痫类疾病的生物标志物。
实施例4.microRNA-219的特异性拮抗剂（antagomir-219）能诱发小鼠癫痫发作
1、本实验采用6～8周龄雄性ICR小鼠，具体分为2组：antagomir-219处理干预小鼠组及阴性对照组。antagomir-219处理干预组小鼠放置固定在小鼠脑立体定位仪上，给予侧脑室微量注射microRNA-219的拮抗剂（antagomir-219）0.2nmol（0.2nmol/2.5μL）。对照组小鼠给予同侧侧脑室微量注射antagomir-219的阴性对照剂antagomir-NC0.2nmol。
2、观察小鼠的行为表现：antagomir-219处理干预组小鼠表现为明显的癫痫发作症状，Racine分级达到Ⅳ级。小鼠脑电图显示，干预组小鼠呈现出异常棘波波形，各导联见每s1次，10～60μV的痫样放电持续发放（图4）。对照组小鼠表现为正常行为，脑电图亦无异常痫性波形（图5）。
3、24h后，常规提取两组小鼠海马RNA，如实施例2的步骤分别检测两组小鼠海马内的microRNA-219表达水平。结果显示antagomir-219处理干预组小鼠海马内microRNA-219表达水平较对照组明显降低（图6）。
这些结果表明拮抗小鼠海马内的antagomir-219表达水平可诱发小鼠癫痫发作，说明microRNA-219在癫痫的发病机制中起着关键作用。
实施例5.microRNA-219及其激动剂（agomir-219）在小鼠癫痫中的治疗作用
1、本实验采用6～8周龄雄性ICR小鼠，具体分为4组：正常对照组（侧脑室注射生理盐水），癫痫模型小鼠agomir-219处理干预组（KA诱发小鼠癫痫6h后侧脑室注射agomir-2190.2nmol），癫痫模型小鼠agomir-219阴性对照剂（agomir-NC）处理干预组（KA诱发小鼠癫痫6h后侧脑室注射agomir-NC0.2nmol）,agomir-219处理干预组（侧脑室注射agomir-2190.2nmol）。
2、观察小鼠的行为表现：癫痫模型小鼠agomir-219处理干预组小鼠的癫痫症状有明显改善，其后未见多次痫性发作。做小鼠脑电图显示，癫痫小鼠注射agomir-219后小鼠皮层痫样放电明显受到抑制，基本波动为4～6HZ的θ节律，间隔5～7s出现一次低幅痫样放电（参见图7）。癫痫模型小鼠agomir-219阴性对照剂（agomir-NC）处理干预组小鼠癫痫症状无明显改善，小鼠Racine分级达到Ⅳ级，脑电图显示有异常棘波波形，各导联可见每s3～4次，30～60μV棘波持续发放（图8）。而agomir-219处理干预组小鼠表现正常，脑电图亦无异常波。说明agomir-219不影响小鼠的正常生理功能，对小鼠无损害（图9）。
3、24h后，常规提取四组小鼠海马RNA，如实施例2的步骤分别检测各组小鼠海马内的microRNA-219表达水平。结果显示癫痫模型小鼠agomir-219处理干预组小鼠海马内microRNA-219表达水平恢复到正常水平（图10）。
这些结果表明microRNA-219为拮抗癫痫及其相关疾病发病的重要保护性小分子核酸，脑内microRNA-219表达异常与癫痫的发生发展密切相关。
实施例6.癫痫细胞模型中加入microRNA-219的激动剂/拮抗剂后microRNA-219的表达变化情况
1、本实验采用怀孕18天小鼠的胚胎，取出其中海马神经元细胞原代培养7天后，分为如下组：正常对照组（加入生理盐水）；癫痫细胞模型组（加入KA，终浓度为50μM）；癫痫细胞模型agomir-219处理干预组（加入KA6h候，加入agomir-2190.8nmol使终浓度为400nM）；癫痫细胞模型agomir-219阴性对照剂（agomir-NC）处理干预组（处理方法同agomir-219处理组）；Agomir-219处理干预组（神经元中加入0.8nmol agomir-219使终浓度为400nM）；Antagomir-219处理干预组（神经元中加入0.8nmol Antagomir-219使终浓度为400nM）；Antagomir-NC处理干预组（处理方法同antagomir-219处理组）。
2、24h候后，常规提取各组细胞的RNA，如实施例2的步骤分别检测各组细胞的microRNA-219表达水平。结果如图11和12所示。
Figure IDA0000455317230000011

Claims (3)

1.microRNA-219试剂盒，其特征在于其组成包括：
Figure FDA0000455317130000011
2.如权利要求1所述microRNA-219试剂盒在诊断、预测癫痫中应用。
3.如权利要求1所述microRNA-219试剂盒在诊断、预测以痫性发作为特征的神经系统疾病中的应用。
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