CN111876377A - 一种基于自噬的干细胞心肌细胞诱导分化方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于自噬的干细胞心肌细胞诱导分化方法及其应用，该方法包括以下步骤：步骤1、自噬诱导剂的配制：自噬诱导剂溶于DMSO中，配制成为母液，保存于‑20℃，以浓度为0.1‰溶剂DMSO作为对照，在每次换液时加入；步骤2、干细胞培养；步骤3、干细胞诱导的第一阶段：添加心肌分化诱导剂，所述心肌分化诱导剂包括步骤1配制的自噬诱导剂和维生素C；步骤4、干细胞诱导的第二阶段：悬浮培养形成较好的拟胚体后，将这些拟胚体转移至细胞培养板中贴壁培养，诱导培养液同第一阶段，视细胞生长情况每天或者隔天换液；随着时间推移，观察到拟胚体出现自发的节律性跳动。本发明提高了诱导分化效率，适合推广应用。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，涉及一种基于自噬的干细胞心肌细胞诱导分化方法及其应用。
背景技术
胚胎干细胞（embryonic stem cell，简称ES或ESC细胞）：是早期胚胎（原肠胚期之前）或原始性腺中分离出来的一类细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。无论在体外还是体内环境，ES细胞都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。
诱导多能干细胞（induced pluripotent stem Cells, 简称IPS或IPSC细胞）：通过外源转录调控因子的诱导及其他方法，使成体细胞重编程为胚胎干细胞 (ES细胞) 样的多能细胞，称之为诱导多能干细胞。诱导多能干细胞为类似于胚胎干细胞的细胞，具有强大的自我更新能力和多向分化潜能。
通过干细胞移植修复心肌梗死病灶是再生医学研究的热点和前沿，具有广阔的临床应用前景。但是，目前对干细胞向心肌细胞定向分化的细胞和分子机制仍知之甚少，造成干细胞诱导效率低下、细胞类型混杂和分化状态不稳定等缺陷，限制了临床应用。目前有不同的干细胞诱导分化策略，包括添加外源性生长因子或细胞因子，外源添加小分子信号通路抑制剂或诱导剂，与心肌细胞、内胚层细胞、内皮细胞共培养，心肌细胞条件培养基等不同技术路线。
心肌的分化受到BMP、Wnt、Notch、FGF与Hedgehog等信号通路的调控。 体外诱导心肌分化，面临着诱导效率不高的问题。虽然有报道在诱导过程中通过阶段性组合添加BMP2、BMP4、Activin A、bFGF、FGF10与Wnt3a 等实验方案可以获得较高的诱导效率，然而受限于上述诱导剂昂贵的价格，这些方案几乎不可能大规模的应用。因此，研究者试图通过小分子药物激动或抑制相关信号通路以及其它效应，提高心肌细胞诱导分化的效率。小分子相对廉价、实验方案简便，这就为在科研或临床实践领域 大规模的应用提供了可能性。
值得注意的是，干细胞的心肌诱导分化是一个连续但分阶段的过程。体外胚胎干（ES）细胞向心肌分化，模拟了心脏的胚胎发育，是一个按既定次序推进的程序性分化过程，具有的典型的分化阶段性。外源诱导剂的效应，取决于细胞所处分化状态，展现了明显的阶段特异性。如果细胞发育阶段不同步，将对外源诱导剂应答不一，降低心肌分化效率。选择恰当的发育阶段诱导是提高分化效率的重要策略。
总的来说，寻找廉价、低毒、应用方案简便的小分子药物，优化诱导策略，用于提高体内、体外干细胞向心肌细胞诱导分化效率，具有重要的理论和应用价值。
现有技术中存在以下方法：
比如：维生素C添加诱导法：以小鼠胚胎干细胞为例，可扩展至诱导多能干细胞。
干细胞培养：小鼠胚胎干细胞接种于用0.1% Gelatin处理的培养皿，含15%胎牛血清、2 mM非必需氨基酸、0.1mM β-巯基乙醇、104 U/ml小鼠LIF Medium、100 U/ml青链霉素的DMEM 高糖培养基中，于37℃，体积分数为5% CO2的细胞培养箱中培养。
细胞诱导（第一阶段）：取对数生长期的胚胎干细胞，用0.25% 胰酶消化，消化并吹打成单个细胞后。重悬于诱导培养液，含20%胎牛血清、2 mM 非必需氨基酸、0.1 mM β-巯基乙醇、10-4M 维生素C、100 U/ml 青链霉素的DMEM高糖培养基。核心诱导剂为维生素C。采用悬浮法或悬滴法诱导，诱导拟胚体形成。拟胚体形成三胚层结构，胚层之间的相互作用使胚胎干细胞发生了分化。
悬浮诱导法：按2.8 ×104 个细胞/cm3 的密度接种于国产细菌培养皿中，加入，悬浮培养，每2天换液，共诱导4-5天。
悬滴诱导法：将单细胞悬液接种于培养皿盖子上，在培养皿中加入一定量的无菌PBS，然后倒扣皿盖以形成许多小悬滴，20微升悬滴中约800个细胞。37℃、5% CO2、95% 湿度培养箱中，每2天换液，共诱导4-5天。
干细胞诱导（第二阶段）：悬浮培养形成较好的拟胚体后，将这些拟胚体转移至细胞培养板中贴壁培养，诱导培养液同上，视细胞生长情况每天或者隔天换液。细胞在诱导的第7~9 天即可观察到少数拟胚体出现自发的节律性跳动。随着时间推移，跳动的拟胚体增多。
该技术存在的缺陷为：最终细胞分化效率约30%-50%，即最终的细胞池中有30%-50%为表达心肌细胞标志物的分化细胞。心肌细胞起搏时间相对较晚。
再如：现有技术中的方法有：内脏内胚层END-2细胞共培养诱导法
干细胞培养：胚胎干细胞接种于用0.1% Gelatin处理的培养皿，培养基为15%胎牛血清、2 mM非必需氨基酸、0.1mM β-巯基乙醇、104 U/ml小鼠LIF Medium、100 U/ml青链霉素的DMEM 高糖培养基中，于37℃，体积分数为5% CO2的细胞培养箱中培养。
干细胞诱导（第一阶段）：胚胎干细胞克隆用200 U /ml 胶原酶Ⅳ, 在37 ℃恒温下消化10 min，轻轻吹打成单个细胞悬液，转移至培养皿中在37 ℃、5 %CO2 条件下悬浮培养，每天更换去LIF的胚胎干细胞培养液，2-3天形成拟胚体。
END-2细胞条件培养液、饲养层的制备：收到的END-2细胞进行半量换液，置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养，END-2细胞长至融合时，用PBS冲洗3次，加入END-2细胞培养液培养3天，收集培养液，离心取上清，用0. 22 μm的滤膜过滤，现用或- 70℃保存备用。END-2细胞长至融合，以含10 μg /ml丝裂霉素C的END-2细胞培养基处理23 h，弃丝裂霉素C后以PBS洗5次以上，加入END-2细胞培养基即成饲养层，于1 周内使用。END-2细胞培养液为：DMEM /F12培养基，7. 5 %胎牛血清，1 %非必需氨基酸，100 U /ml青霉素、链霉素。
干细胞诱导（第二阶段）：拟胚体种植到已经铺有END-2 细胞饲养层的24孔板中进行诱导，或加入条件培养液。9-12天出现拟胚体自发的节律性跳动。
该技术的不足之处体现在：操作复杂繁琐，花费时间和经费较多。分化效率不稳定，受到END-2细胞状态等因素影响。最终细胞分化效率约20%-30%。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种基于自噬的干细胞心肌细胞诱导分化方法及其应用，在既往干细胞向心肌细胞分化的体外诱导模型基础上，建立一个更加高效的诱导体系，提高诱导分化效率。
其技术方案如下：
一种基于自噬的干细胞心肌细胞诱导分化方法，包括以下步骤：
步骤1、自噬诱导剂的配制：
自噬诱导剂溶于DMSO或其他细胞培养有机溶剂中，配制成为母液，保存于-20℃，以溶剂DMSO 0.1‰ 作为对照，在每次换液时加入。
步骤2、干细胞培养：小鼠胚胎干细胞接种于用0.1% Gelatin处理的培养皿，含15%胎牛血清、2 mM非必需氨基酸、0.1mM β-巯基乙醇、104 U/ml小鼠LIF Medium、100 U/ml青链霉素的DMEM 高糖培养基中，于37℃，体积分数为5% CO2的细胞培养箱中培养。
步骤3、干细胞诱导（第一阶段）：取对数生长期的胚胎干细胞，用0.25% 胰酶消化，消化并吹打成单个细胞后。重悬于诱导培养液，含20%胎牛血清、2 mM 非必需氨基酸、0.1mM β-巯基乙醇、10-4M 维生素C（心肌分化主要诱导剂）、100 U/ml 青链霉素的DMEM高糖培养基，采用悬浮诱导法或悬滴诱导法，诱导拟胚体形成。拟胚体形成三胚层结构，胚层之间的相互作用使胚胎干细胞发生了分化。在此过程中，添加心肌分化诱导剂，所述心肌分化诱导剂包括步骤1配制的自噬诱导剂和维生素C。维生素C作为主要诱导剂，自噬诱导剂可增强心肌诱导分化效率。除维生素C之外，其他如GSK3β抑制剂（如CHIR99021）、Wnt激动剂或BMP4等也可以作为心肌分化主要诱导剂，发挥启动干细胞分化作用。
步骤4、干细胞诱导（第二阶段）：悬浮培养形成较好的拟胚体后，将这些拟胚体转移至细胞培养板中贴壁培养，诱导培养液同第一阶段，视细胞生长情况每天或者隔天换液。随着时间推移，观察到拟胚体出现自发的节律性跳动。
进一步，步骤1中的自噬诱导剂为雷帕霉素（Rapamycin），雷帕霉素溶于DMSO或其他细胞培养有机溶剂中，配制成为200µM或其他浓度的母液，保存于-20℃。雷帕霉素处理细胞时加入到培养液使其终浓度为20-100 nM，以溶剂DMSO（0.1‰）作为对照，每次换液时加入。
进一步，步骤1中的自噬诱导剂为KU0063794，KU0063794溶于DMSO或其他细胞培养有机溶剂中，配制成为10mM或其他浓度的母液，保存于-20℃。KU0063794处理细胞时加入到培养液使其终浓度为0.1-2 µM，以溶剂DMSO（0.1‰）作为对照，每次换液时加入。
进一步，步骤3中，所述悬浮诱导法为：按2-5×104 个细胞/cm3 的密度接种于国产细菌培养皿中，加入，悬浮培养，每2天换液，共诱导4-5天。
进一步，步骤3中，所述悬滴诱导法：将单细胞悬液接种于培养皿盖子上，在培养皿中加入一定量的无菌PBS，然后倒扣皿盖以形成许多小悬滴，20微升悬滴中约500-1200个细胞。37℃、5% CO2、95% 湿度培养箱中，每2天换液，共诱导4-5天。
一种本发明所述基于自噬的干细胞心肌细胞诱导分化方法在促进心肌诱导分化的小分子药物制备过程中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明的技术方案能提高多潜能干细胞向心肌细胞分化的效率，缩短了诱导时间。本发明的方法可用于筛选促进心肌诱导分化的药物。基于自噬诱导的原理，首先筛选可以促进自噬的药物，然后检测药物对干细胞心肌分化的影响。本发明在既往干细胞向心肌细胞分化的体外诱导模型基础上，建立一个更加高效的诱导体系，提高了诱导分化效率，适合推广应用。
附图说明
图1是本发明基于自噬的干细胞心肌细胞诱导分化方法的流程示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
实施例1
参照图1，一种基于自噬的干细胞心肌细胞诱导分化方法，包括以下步骤：
步骤1、自噬诱导剂的配制：
雷帕霉素溶于DMSO中，配制成为200µM母液，保存于-20℃。雷帕霉素处理细胞时加入到培养液使其终浓度为20nM，以溶剂DMSO（0.1‰）作为对照，每次换液时加入。
步骤2、干细胞培养：小鼠胚胎干细胞接种于用0.1% Gelatin处理的培养皿，含15%胎牛血清、2 mM非必需氨基酸、0.1mM β-巯基乙醇、104 U/ml小鼠LIF Medium、100 U/ml青链霉素的DMEM 高糖培养基中，于37℃，体积分数为5% CO2的细胞培养箱中培养。
步骤3、干细胞诱导（第一阶段）：取对数生长期的胚胎干细胞，用0.25% 胰酶消化，消化并吹打成单个细胞后。重悬于诱导培养液，含20%胎牛血清、2 mM 非必需氨基酸、0.1mM β-巯基乙醇、10-4M 维生素C、100 U/ml 青链霉素的DMEM高糖培养基，添加步骤1配制的雷帕霉素和维生素C。采用悬浮诱导法或悬滴诱导法，诱导拟胚体形成。拟胚体形成三胚层结构，胚层之间的相互作用使胚胎干细胞发生了分化。
所述悬浮诱导法为：按2.8 ×104 个细胞/cm3 的密度接种于国产细菌培养皿中，加入，悬浮培养，每2天换液，共诱导4-5天。
所述悬滴诱导法：将单细胞悬液接种于培养皿盖子上，在培养皿中加入一定量的无菌PBS，然后倒扣皿盖以形成许多小悬滴，20微升悬滴中约800个细胞。37℃、5% CO2、95%湿度培养箱中，每2天换液，共诱导4-5天。
步骤4、干细胞诱导（第二阶段）：悬浮培养形成较好的拟胚体后，将这些拟胚体转移至细胞培养板中贴壁培养，诱导培养液同第一阶段，视细胞生长情况每天或者隔天换液。随着时间推移，观察到拟胚体出现自发的节律性跳动。
实施例2
参照图1，一种基于自噬的干细胞心肌细胞诱导分化方法，包括以下步骤：
步骤1、自噬诱导剂的配制：
KU0063794溶于DMSO中，配制成为10mM母液，保存于-20℃。KU0063794处理细胞时加入到培养液使其终浓度为1µM，以溶剂DMSO（0.1‰）作为对照，每次换液时加入。
步骤2、干细胞培养：小鼠胚胎干细胞接种于用0.1% Gelatin处理的培养皿，含15%胎牛血清、2 mM非必需氨基酸、0.1mM β-巯基乙醇、104 U/ml小鼠LIF Medium、100 U/ml青链霉素的DMEM 高糖培养基中，于37℃，体积分数为5% CO2的细胞培养箱中培养。
步骤3、干细胞诱导（第一阶段）：取对数生长期的胚胎干细胞，用0.25% 胰酶消化，消化并吹打成单个细胞后。重悬于诱导培养液，含20%胎牛血清、2 mM 非必需氨基酸、0.1mM β-巯基乙醇、10-4M 维生素C、100 U/ml 青链霉素的DMEM高糖培养基，添加步骤1配制的KU0063794和维生素C。采用悬浮诱导法或悬滴诱导法，诱导拟胚体形成。拟胚体形成三胚层结构，胚层之间的相互作用使胚胎干细胞发生了分化。
所述悬浮诱导法为：按2.8 ×104 个细胞/cm3 的密度接种于国产细菌培养皿中，加入，悬浮培养，每2天换液，共诱导4-5天。
所述悬滴诱导法：将单细胞悬液接种于培养皿盖子上，在培养皿中加入一定量的无菌PBS，然后倒扣皿盖以形成许多小悬滴，20微升悬滴中约800个细胞。37℃、5% CO2、95%湿度培养箱中，每2天换液，共诱导4-5天。
步骤4、干细胞诱导（第二阶段）：悬浮培养形成较好的拟胚体后，将这些拟胚体转移至细胞培养板中贴壁培养，诱导培养液同第一阶段，视细胞生长情况每天或者隔天换液。随着时间推移，观察到拟胚体出现自发的节律性跳动。
经过实验证明，干细胞诱导分化培养液中，通过添加自噬诱导剂（例如雷帕霉素和KU0063794），提高心肌细胞的分化效率。添加自噬诱导剂的干细胞诱导培养液（心肌细胞分化方向），基于自噬诱导原理的干细胞心肌诱导分化药物的筛选：即基于自噬诱导的原理，首先筛选可以促进自噬的药物，然后检测药物对干细胞心肌分化的影响。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，对于干细胞心肌诱导分化，存在很多不同的诱导策略，可通过包括添加外源性生长因子或细胞因子，外源添加小分子信号通路抑制剂或诱导剂，与心肌细胞、内胚层细胞、内皮细胞共培养，心肌细胞条件培养基等不同技术路线，来促进干细胞的诱导分化效率。本发明在干细胞诱导体系中，通过添加自噬诱导剂，促进细胞自噬，辅助增强细胞向心肌细胞方向的分化效率。对添加其他试剂、药物、细胞因子、生长因子等，提高干细胞心肌细胞诱导分化效率，以及对添加自噬诱导剂，提高干细胞向其他细胞的分化效率，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
Claims (6)
1.一种基于自噬的干细胞心肌细胞诱导分化方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1、自噬诱导剂的配制：
自噬诱导剂溶于DMSO中，配制成为母液，保存于-20℃，以浓度为0.1‰溶剂DMSO作为对照，在每次换液时加入；
步骤2、干细胞培养：小鼠胚胎干细胞接种于用0.1% Gelatin处理的培养皿，含15%胎牛血清、2 mM非必需氨基酸、0.1mM β-巯基乙醇、104 U/ml小鼠LIF Medium、100 U/ml青链霉素的DMEM 高糖培养基中，于37℃，体积分数为5% CO2的细胞培养箱中培养；
步骤3、干细胞诱导的第一阶段：取对数生长期的胚胎干细胞，用0.25% 胰酶消化，消化并吹打成单个细胞后；重悬于诱导培养液，含20%胎牛血清、2 mM 非必需氨基酸、0.1 mM β-巯基乙醇、10-4M 维生素C、100 U/ml 青链霉素的DMEM高糖培养基，添加心肌分化诱导剂，所述心肌分化诱导剂包括步骤1配制的自噬诱导剂和维生素C；采用悬浮诱导法或悬滴诱导法，诱导拟胚体形成；拟胚体形成三胚层结构，胚层之间的相互作用使胚胎干细胞发生了分化；
步骤4、干细胞诱导的第二阶段：悬浮培养形成拟胚体后，将这些拟胚体转移至细胞培养板中贴壁培养，诱导培养液同第一阶段，视细胞生长情况每天或者隔天换液；随着时间推移，观察到拟胚体出现自发的节律性跳动。
2.根据权利要求1所述基于自噬的干细胞心肌细胞诱导分化方法，其特征在于：步骤1中的自噬诱导剂为雷帕霉素，雷帕霉素溶于DMSO中，配制成为200µM母液，保存于-20℃；雷帕霉素处理细胞时加入到培养液使其终浓度为20nM，以浓度为0.1‰溶剂DMSO作为对照，每次换液时加入。
3.根据权利要求1所述基于自噬的干细胞心肌细胞诱导分化方法，其特征在于：步骤1中的自噬诱导剂为KU0063794，KU0063794溶于DMSO中，配制成为10mM母液，保存于-20℃；KU0063794处理细胞时加入到培养液使其终浓度为1µM，以浓度为0.1‰溶剂DMSO作为对照，每次换液时加入。
4.根据权利要求1所述基于自噬的干细胞心肌细胞诱导分化方法，其特征在于：步骤3中，所述悬浮诱导法为：按2.8 ×104 个细胞/cm3 的密度接种于国产细菌培养皿中，加入，悬浮培养，每2天换液，共诱导4-5天。
5.根据权利要求1所述基于自噬的干细胞心肌细胞诱导分化方法，其特征在于：步骤3中，所述悬滴诱导法：将单细胞悬液接种于培养皿盖子上，在培养皿中加入一定量的无菌PBS，然后倒扣皿盖以形成许多小悬滴，20微升悬滴中含有800个细胞；37℃、5% CO2、95% 湿度培养箱中，每2天换液，共诱导4-5天。
6.一种权利要求1所述基于自噬的干细胞心肌细胞诱导分化方法在促进心肌诱导分化的小分子药物制备过程中的应用。
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