CN115737913A - 一种可控释放h2s的心脏补片及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种可控释放H₂S的心脏补片及其制备方法与应用。该心脏补片不需要缝合或粘附性材料即可牢固粘附在心脏等病灶处，在给予一定的机械支持的同时，还能可控释放H₂S，可以舒张血管、清除病灶中大量活性氧，从而达到对心肌细胞的保护作用，为种植细胞提供了一个良好的微环境，能有效改善心肌梗死的预后；并且该心脏补片无细胞毒性，安全性高，体内外实验也进一步证明该心脏补片可有效抑制心梗部位早期的炎症反应，减缓心室重构，改善心功能。

Description

一种可控释放H2S的心脏补片及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及一种可控释放H₂S的心脏补片及其制备方法与应用。

背景技术

急性心肌梗死的死亡率一直居高不下，虽然现有的溶栓治疗、介入手术等治疗策略使其预后有了较大改观，但是心肌梗死后的炎症反应会产生大量的活性氧，使得心肌细胞发生大量坏死，最终导致心功能衰竭。可见，促进心肌梗死灶的血管重构以及减少活性氧的产生对于改善心肌梗死的预后有着非常重要的意义。

硫化氢(H₂S)是一种气体信号分子，在组织细胞中可快速扩散，具有明显的心血管保护作用，近年来逐渐被人们所关注。但是如何实现H₂S安全、可控释放成为其应用于疾病治疗的最大挑战。其中，心脏补片被认为是重建梗死心脏的一种很有前途的方法。心脏细胞被植入三维(3D)生物材料支架，支架提供了一个物理、结构和生化支持的微环境，促进细胞-细胞和细胞-基质相互作用，从而形成功能性组织。目前，各种可生物降解聚合物，如聚己内酯(PCL)、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)和聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)已被应用于制备组织工程支架。但是上述合成材料的机械性能与天然组织不匹配，并且缺乏与细胞相互作用的生物活性分子，生物相容性较差，可能存在一定的生物毒性。

为了达到硫化氢在组织内可控释放，并减少降解聚合物的不适配性，中国专利申请CN109666151A公开了一种释放硫化氢的可注射水凝胶，该水凝胶将海藻酸钠(ALG)上的羟基氧化成醛基，其醛基与可释放硫化氢的APTA的氨基反应，接枝到海藻酸钠上，进一步与明胶共混即得，但是在实际应用中发现，水凝胶并不能长时间在心脏等病灶处停留，作用时间较短；且若通过心肌原位注射的方式将这种水凝胶用于梗死心肌的治疗，还会对心肌组织造成二次损伤，添加的明胶也可能会进一步影响心肌的修复。此外，一般的心脏补片一般是通过缝合使其贴在心脏表面，这将会对正常心肌组织造成损伤和引起感染；虽然加入强粘附性的材料可增加其粘附性，但这可能会增加材料的毒性，同时强烈的粘附会导致一个机械性能僵硬的区域，与心肌的弹性特性不匹配，妨碍适当的收缩功能还可能引发炎症。

因此，迫切需要提供一种不需要缝合或粘附性材料即可牢固粘附在心脏等病灶处的可控释放H₂S的心脏补片。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有心脏补片材料需要缝合或粘附性材料才能粘附在心脏等病灶上，容易引起损伤、感染、不匹配、炎症等的缺陷和不足，提供一种不需要缝合或粘附性材料即可牢固粘附在心脏等病灶处的可控释放H₂S的心脏补片。

本发明的目的是提供所述心脏补片的制备方法。

本发明另一目的是提供所述心脏补片的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种可控释放H₂S的心脏补片，血清白蛋白纤维支架上分别负载改性海藻酸盐和黑磷晶体，负载有改性海藻酸盐的血清白蛋白纤维支架面积小于负载有黑磷晶体的血清白蛋白纤维支架，并且前者通过血清白蛋白纤维的亲水性贴合在后者中间；

其中，所述改性海藻酸盐为海藻酸盐氧化后负载上2-氨基吡啶-5-硫代甲酰胺。

另外的，本发明还提供了所述可控释放H₂S的心脏补片的制备方法，具体包括以下步骤：

S1、血清白蛋白纤维支架的制备：将血清白蛋白与三氟乙醇(TFE)混合制成静电纺丝液，加入β-巯基乙醇反应完全，进行静电纺丝，得到血清白蛋白纤维支架(BSAscaffold)；

S2、改性海藻酸盐的制备：用高碘酸盐充分氧化海藻酸盐，透析，干燥，所得氧化海藻酸盐在惰性气体环境，50～60℃条件下与2-氨基吡啶-5-硫代甲酰胺充分反应完全，后处理，得到可释放H₂S的前体药物改性海藻酸盐(APTC-ALG，缩写为AA)；

S3、负载有改性海藻酸盐的血清白蛋白支架的制备：将步骤S2所得改性海藻酸盐制成改性海藻酸盐水溶液杀菌消毒，步骤S1所得血清白蛋白纤维支架杀菌消毒加入改性海藻酸盐水溶液中，充分负载，得负载有改性海藻酸盐的血清白蛋白纤维支架(APTC-ALG-BSAscaffold，缩写为AAB)；

S4、负载有黑磷晶体的血清白蛋白纤维支架的制备：在惰性气体氛围、0～-4℃条件下，将黑磷晶体制成黑磷晶体水溶液，加入步骤S1所得血清白蛋白纤维支架，充分负载，得负载有黑磷晶体的血清白蛋白纤维支架(BPB)；

S5、心脏补片的制备：将步骤S3所得负载有改性海藻酸盐的血清白蛋白纤维支架贴合在步骤S4所得负载有黑磷晶体的血清白蛋白纤维支架中间，即得心脏补片(AAB/BPB)。

本发明的可控释放H₂S的心脏补片，以血清白蛋白纤维支架为基础，利用其可吸附黑磷晶体纳米薄片(BPNSs)的能力制备得到一种复合纳米支架(BPB)，其可在NIR照射下产热，使得蛋白发生变性，粘稠度增加，从而紧密地粘附在心脏等病灶表面；并且，BPNSs的加入也使得该贴片具有一定的导电性，促进心肌细胞的电信号传导。同时，本发明将具有巯基响应性释放H₂S的H₂S供体(2-氨基吡啶-5-硫代甲酰胺，APTC)与海藻酸盐聚合物相结合制备出可释放H₂S的前体药物改性海藻酸盐(APTC-ALG，缩写为AA)，利用血清白蛋白纤维支架对小分子物质的吸附能力和其上的氨基官能团可AA聚合物上残留的醛基发生席夫碱反应，将AA和血清白蛋白纤维支架相结合制备出功能性支架AAB。最后将AAB贴合在BPB中间，形成具有“创可贴”结构的心脏贴片(AAB/BPB)，在NIR照射下BPB即可牢固的粘附在心脏表面而无需通过外科缝合或者添加化学粘附剂，并在含巯基物的刺激下AAB逐步释放出H₂S进行治疗。另一方面，AAB/BPB具有仿细胞外基质结构，并且其降解产物可作为机体的营养物质，经过实验证明其无细胞毒性，安全性高；体内外实验也进一步证明该心脏补片可有效抑制心梗部位早期的炎症反应，减缓心室重构，改善心功能。

进一步地，步骤S1中，所述静电纺丝液中，血清白蛋白的含量为10～15％(w/v)，三氟乙醇的含量为85～95％(v/v)。

更进一步地，步骤S1中，所述血清白蛋白纤维支架的厚度为60～70μm。

优选地，步骤S1中，所述β-巯基乙醇为过量。

优选地，步骤S1中，所述进行静电纺丝的步骤为：在30～40％湿度和20～30℃条件下，使用静电纺丝机器(纺丝喷射头为0.3～0.5mm，铝板放置在距离喷头15～18cm处)，在11～13kV电压、液体流速1.5～2.5mL/h的条件下对所得电纺丝液进行电纺，得到血清白蛋白纤维支架(BSA scaffold)。

进一步地，步骤S2中，所述充分反应完全的时间3～5h。

更进一步地，步骤S2中，所述后处理包括沉淀、离心、重复沉淀、干燥。

优选地，步骤S2中，所述用高碘酸盐充分氧化海藻酸盐的步骤为：将海藻酸盐(ALG)分散于无水乙醇中，得到海藻酸盐乙醇溶液(海藻酸盐的浓度为40～50mg/mL)；将高碘酸钠(NaIO₄)溶解于水中得到高碘酸钠水溶液(高碘酸钠的浓度为30～40mg/mL)；将高碘酸钠水溶液缓慢加入到海藻酸盐乙醇溶液中(高碘酸钠与海藻酸盐的单体单元的摩尔比为50～80％)，室温避光条件下，在搅拌反应10～14h；加入与NaIO₄等摩尔的乙二醇，搅拌反应30～50min。

优选地，步骤S2中，所述透析的透析袋分子量为1500～3000kDa，置于装有去离子水的烧杯中透析，每隔4～6h换水一次，持续透析5～7天；所述干燥为真空冷冻干燥。

优选地，步骤S2中，所述后处理具体包括以下步骤：将反应液倒入冷乙醇中沉淀，离心后去掉上清，再次用冷乙醇进行沉淀，重复沉淀操作4～5次，收集沉淀进行真空干燥，即可。

进一步地，步骤S3中，所述改性海藻酸盐与血清白蛋白纤维支架的的质量按照血清白蛋白纤维支架的面积计为8～10mg/mm²。

更进一步地，步骤S3中，所述充分负载的温度为室温。

优选地，步骤S3中，所述杀菌消毒的方法为紫外光照射。

优选地，步骤S3中，所述充分负载为在摇床上65～75r/min反应10～14h。

进一步地，步骤S4中，所述黑磷晶体与血清白蛋白纤维支架的的质量按照血清白蛋白纤维支架的面积计为2～4μg/cm²。

优选地，步骤S4中，所述将黑磷晶体制成黑磷晶体水溶液时，可结合超声处理，超声设置为40～45kHz，超声时间为8～10h。

优选地，步骤S4中，所述充分负载为室温条件下静置4～5h。

另外的，本发明还要求保护所述可控释放H₂S的心脏补片或所述制备方法在制备治疗心血管疾病药物中的应用。

进一步地，所述可控释放H₂S的心脏补片在使用时，需要采用1.4～1.6W/cm²功率、750～850nm波长的近红外激发光照射60～90s。心脏补片中的BPNSs经红外光照射后发生变性，粘附性进一步加强，达到不用缝合便可粘附在心脏或其他病灶表面，能给予一定的机械支持。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供的可控释放H₂S的心脏补片不需要缝合或粘附性材料即可牢固粘附在心脏等病灶处，在给予一定的机械支持的同时，还能可控释放H₂S，可以舒张血管、清除病灶中大量活性氧，从而达到对心肌细胞的保护作用，为种植细胞提供了一个良好的微环境，能有效改善心肌梗死的预后；并且该心脏补片无细胞毒性，安全性高，体内外实验也进一步证明该心脏补片可有效抑制心梗部位早期的炎症反应，减缓心室重构，改善心功能。

附图说明

图1为白蛋白纤维支架的扫描电镜图，比例尺由左往右分别为50μm和5μm。

图2为前体药物AA的核磁共振氢谱和结构示意图(左)及其紫外-可见吸收光谱(右)。

图3为白蛋白纤维支架(A)和功能性支架AAB(B)的SEM图，比例尺为50μm和5μm(放大情况)；C为亚甲基蓝测定法在体外检测AAB的H₂S的释放数据统计图，(n＝3)；D为心脏补片的各组分的红外光谱分析图。

图4为黑磷纳米薄片的透射电镜图，比例尺为100～200nm(左)；和BPB在不同激光功率下(0.5W/cm²、1.0W/cm²、1.5W/cm²)的光热转换升温曲线图(右)。

图5为在猪心肌表面进行BPB的粘附性试验相关图：A为在Llyod拉伸仪器上进行拉伸试验以评估BPB的粘附性的实物图；B为相同照射时间(90s)下，不同功率的近红外激光照射对粘附性的影响相关数据统计图；C为相同近红外激光功率下(1.5W/cm²)，不同照射时间对粘附性的影响相关数据统计图；D为在1.5W/cm²下，照射90s，不同厚度的BPB的粘附性相关数据统计图；其中，两两比较进行统计分析，*p<0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，提示差异有统计学意义，n＝5。

图6为BPNSs和功能性支架AAB可促进人脐静脉内皮细胞的迁移实验相关图片及数据：A为划痕实验结果图，比例尺为200μm，D为相应的定量分析数据统计图；B为Transwell试验结果图，比例尺为150μm，C为相应的定量分析数据统计图；分别和对照组对比作统计分析，*p<0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，提示差异有统计学意义，n＝5。

图7为生长在蛋白纤维支架上的原代心肌细胞给予不同的干预后进行死活染色实验：A为用钙黄绿素AM和碘化丙啶对活细胞和死细胞染色后拍的荧光照片，比例尺为400μm；B为心肌细胞存活率的定量分析；与白蛋白纤维支架组相比，*P<0.05，n＝3。

图8为死活染色分析AAB对心肌细胞的影响实验：A为死活染色的荧光图，比例尺为150μm；B为心肌细胞存活率的定量分析数据统计图；与空白组相比，*P<0.05，n＝3。

图9为体外实验评价AAB对Raw 264.7巨噬细胞表型极化的影响实验：A为AAB干预24小时后M2巨噬细胞蛋白标记物CD206(红色)的免疫荧光染色图，比例为50μm(a～c)和25μm(ⅰ-ⅲ)；B为对不同干预条件下巨噬细胞中CD206的表达量进行定量分析数据统计图；*p<0.05提示差异有统计学意义，n＝3。

图10为评价AAB对给予LPS刺激的巨噬细胞的活性氧(ROS)产生的影响：A为利用荧光探针DCFH-DA对巨噬细胞胞内产生的ROS进行检测的荧光图，比例尺为100μm；B为不同干预下，胞内ROS的定量分析数据统计图；*p<0.05，**p<0.01，提示差异有统计意义，n＝3。

图11为术后对大鼠心脏功能进行检测评估：A为不同组的大鼠心肌梗死后第28天的心脏超声采集图(ⅰ，对照组；ⅱ，心肌梗死组；ⅲ，BPB组；ⅳ，AAB/BPB组)；B～E分别为术后第7天、第14天、第21天和第28天各组的EF、FS、ESV和EDV值；*p<0.05，**p＜0.01提示差异有统计学意义，n＝3。

图12为心肌梗死术后第28天收集心脏进行Masson染色和心室重构分析：A为心脏组织Masson染色横断面图片，比例尺分别为2mm和150μm；B为心肌纤维化程度数据统计图；C是左室壁厚度的定量分析数据统计图；**p<0.01，***p<0.001，提示差异有统计学意义，n＝3。

图13为AAB对梗死灶里的巨噬细胞的调节作用：A为术后第四天，对心肌梗死灶中细胞的蛋白标记物(CD206和iNOS)进行免疫荧光染色图，比例尺为25μm；B为iNOS在组织中的表达量的定量分析数据统计图；C为CD206在组织中的表达量的定量分析数据统计图；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，提示差异有统计学意义，n＝3。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1 血清白蛋白支架的制备

所述血清白蛋白支架的制备具体包括以下步骤：

S1、配置三氟乙醇(TFE)和去离子水(DI)的混合液(W_TFE:W_DI＝9:1)，将血清白蛋白完全溶于混合液中，得到15％(w/v)的白蛋白静电纺丝液，加入过量的β-巯基乙醇过夜反应；

S2、恒温恒湿(20～30℃，30～40％湿度)条件下，使用静电纺丝机器(纺丝喷射头为0.4mm，铝板放置在距离喷头15cm处)，以12kV电压、液体流速2mL/h的条件对步骤S1中所得的电纺丝液进行电纺，得到白蛋白纤维支架(BSA scaffold)，厚度为60～70μm。

对白蛋白纤维支架进行电镜扫描，结果参见图1。由图可见，白蛋白纤维呈白色带状，宽度约为4μm，且支架中的白蛋白纤维呈无序排列。

实施例2 一种可控释放H₂S的心脏补片的制备

1、所述可控释放H₂S的心脏补片的制备方法具体包括以下步骤：

当高碘酸钠与海藻酸盐的单体单元的摩尔比为80％时，海藻酸盐的氧化程度已接近最大值，醛基(将APTC和ALG结合起来的关键基团)生成量接近饱和，并且随着高碘酸钠量的增加，获得的海藻酸盐产物的分子量越小，越容易降解，且不易被白蛋白纤维所吸附，因此下面将以高碘酸钠与海藻酸盐的单体单元的摩尔比为80％为例，说明可控释放H₂S的心脏补片的制备。

S1、将1g的海藻酸盐(ALG)分散于20mL的无水乙醇中，得到海藻酸盐乙醇溶液；将0.86g高碘酸钠(NaIO₄)用20mL去离子水溶解后得到高碘酸钠水溶液；将高碘酸钠水溶液缓慢加入到海藻酸盐乙醇溶液中，室温避光条件下，在搅拌器上搅拌反应12h；加入与NaIO₄等摩尔的乙二醇，搅拌反应30min后，将混合物吸入到分子量1500kDa的透析袋中，放在装有去离子水的烧杯中透析，每隔4h换水一次，持续透析5天；将透析液放入真空冷冻干燥机中冷冻干燥，得到部分氧化(氧化后得到醛基)的海藻酸盐(ALG-CHO)固体粉末。

S2、取步骤S1所得固体粉末100mg，置于50mL双口烧瓶中，加入5mL去离子水充分搅拌混匀，双口烧瓶一端连接带有充满N₂的气球的三通阀，另一端连接装有2-氨基吡啶-5-硫代甲酰胺(APTC)溶液的注射器，用真空泵将烧瓶中的空气(包括溶液中的氧气)尽量排走后，充入N₂，震荡，重复多次至反应体系处于无氧环境中，在50℃条件下，缓慢逐滴加入APTC溶液，保温搅拌反应4h；反应液倒入冷乙醇中沉淀，离心后去掉上清再次用冷乙醇进行沉淀，重复沉淀操作4次，收集沉淀于真空干燥箱中干燥，得到可释放H₂S的前体药物AA固体粉末。选用的APTC投料比为20％，一般的，在海藻酸钠氧化度不变的情况下，在一定范围内提高APTC的投料比，可提高APTC在AA中的接枝率，实际应用中可根据需要的硫化氢浓度，对APTC的接枝率进行调整。

S3、称取步骤S2所得固体粉末200mg，溶于1mL超纯水中得AA溶液，过滤除菌后和实施例1所得白蛋白纤维支架一起置于紫外光下照射4h进行消毒杀菌；将杀菌后的白蛋白纤维支架裁成5mm×5mm加入到杀菌后的AA溶液中，室温条件下，在摇床上(70r/min)反应12h，得到巯基响应性释放出H₂S的功能性支架(APTC-ALG-BSA scaffold，缩写为AAB)。调节白蛋白纤维支架的大小可制备出不同H₂S释放量的功能性补片；本发明中AA和白蛋白纤维支架的反应时间是12h，室温条件下，支架大小为5mm×5mm，实际应用中可根据H₂S的需要治疗量进行调节。

S4、在烧瓶中加入100mL无菌去离子水，数十次真空负压抽吸-充N₂-真空负压抽吸的循环后得到去氧的去离子水，将50mg黑磷晶体粉末(BPNSs)加入去氧的去离子水中，搅拌使其充分溶解，将烧瓶置于冰水混合物中，低温超声8h(40kHz)，2000rpm转速下离心10min，得到BPNSs母液(500μg/mL)；将实施例1所得白蛋白纤维支架裁成10mm×10mm置于浓度为200μg/mL(用上述500μg/mL的BPNSs母液稀释)的BPNSs溶液中静置4h，得到纳米复合支架(缩写为BPB)。值得注意的是，为更高效地将BPNSs吸附到白蛋白纤维支架上和利用白蛋白纤维支架具有高亲水性并利于粘附在组织上的特点，本发明活体实验中将在BPNSs滴加到白蛋白纤维支架后，便移植到大鼠心脏表面进行治疗，BPNSs的加入量可根据实际应用中，所研究对象对BPNSs的耐受性和所需要的粘附强度进行调节。

S5、将步骤S3所得的功能性支架AAB置于步骤S4所得的复合支架BPB中间，通过血清白蛋白纤维的亲水性结合在一起的，构成“创可贴”式支架结构，得到功能性复合可控释放H₂S的心脏补片(AAB/BPB)。

2、固体粉末AA的表征：

对步骤S2所制备得到的固体粉末AA进行核磁共振氢谱和紫外-可见吸收光谱测定，结果参见图2。由核磁共振氢谱图可见，在8.38ppm位移处可发现一个单峰，与海藻酸盐的核磁共振氢谱数据结果对比，可知这一单峰是由APTC吡啶环上与氮原子相邻的氢原子产生的，表明AA成功合成，结构如图2中的A左上角插图所示。图2中的B紫外-可见吸收光谱图吸收特征峰的结果进一步的证明了AA的合成。

3、功能性支架AAB的表征

对步骤S3所制备得到功能性支架AAB进行SEM电镜扫描、红外吸收光谱和体外H₂S释放测定，结果参见图3。由图3中的A(白蛋白纤维支架)和B(AAB)可见，镜下白蛋白纤维呈带状；制备扫描电镜样本时，由于纤维膜必须是干燥的，因此镜下可看到AAB在经历一个干燥过程后形貌也发生改变，部分蛋白纤维融合成一小片；同时，我们从图3中的B的右上角插图中可观察到白蛋白纤维上覆盖有一层薄薄的棉絮状物，这与海藻酸盐溶液冻干后的产物形状相符合，提示APTC-ALG与白蛋白纤维的成功结合。由图3中的C可见，AAB在含巯基化学物的刺激下，可释放出H₂S气体，提示APTC的化学性质并没有受到破坏，并进一步说明APTC成功结合在白蛋白纤维支架上；由图3中的D可见，APTC的N-H在3350cm^-1处的吸收峰消失，表明APTC上的氨基和氧化的海藻酸盐上的醛基发生席夫碱反应，证明AA可有效结合到白蛋白纤维支架上。

4、BPB的光热转换升温曲线

首先通过液相剥落的方法得到黑磷纳米薄块(BPNSs)，其形态呈片状，尺寸在100～200nm之间，如图4中(左)的电镜图所示。接着，测定步骤S4所得BPB(10mm×10mm，60～70μm)在不同激光功率(0.5W/cm²，1.0W/cm²、1.5W/cm²)下的光热转换升温曲线(200μg/mLBPNSs，20μL)，结果参见图4(右)。

5、BPB组织粘附性检测

实验方法：将白蛋白纤维支架置于猪心肌切片的表面，在支架和心肌的重叠部分加入BPNSs溶液(200μg/mL，20μL)，添加完毕后用近红外激发光(808nm)照射，使BPB粘附在心肌表面，再利用Lloyd拉伸仪器进行拉伸试验评估BPB对心肌组织的粘附性(50N，5mm/min)；其中在拉伸过程中，仪器一端夹着猪心肌组织，另一端夹着蛋白纤维支架。

实验结果：结果参见图5，由图可见，其他条件一定时(1.5W/cm²，厚度为60～70μm)，随着照射时间的延长，BPB的粘附性也随之增强，照射时间延长至90s时虽然粘附性进一步增强，但是这增强的幅度不大；而且结合图4可知，当照射时间超过65s时，温度可发生爆发式的增长，这也许与BPB上的含水量有关，但这显然会对细胞造成杀伤作用。

6、划痕实验检测细胞迁移能力

实验方法：将人脐静脉内皮细胞(HUVECs)消化下来后，通过细胞计数仪可以计算出细胞悬浮液中的细胞总数，接种在6孔板中进行培养，每个孔的细胞数约为5×10⁵；显微镜下观察内皮细胞的生长情况，待孔中的细胞生长密度达到80％时用200μL的枪头在6孔板中划痕，然后用PBS把悬浮起来的内皮细胞清洗掉，更换新的DMEM培养基，同时给予不同的干预治疗(分为白蛋白纤维支架组(BSA)、BPB组(BPNSs的浓度为200ng/mL)和AAB组)；在划痕干预后第0h、第6h、第12h和第24h，在倒置相差显微镜下观察内皮细胞的迁移情况并计算相应的迁移面积。其中，迁移面积(％)＝(A₀–A_n)/A₀×100％，A₀表示划痕后的间隙面积，A_n表示各组干预后某个时间点测定的间隙面积。

实验结果参见图6，由图6中的A、D可见，与BSA组对比，BPB组和AAB组的内皮细胞的迁移速率显著提高。

7、Transwell检测细胞迁移能力

实验方法：将HUVECs用胰酶消化下来后，离心去掉旧培养基和胰酶，用低浓度的血清(1％FBS)重悬内皮细胞，并进行计数；将Transwell小室放在6孔板中，然后分别在Transwell小室中种植内皮细胞，密度约为3×10⁴，同时往6孔板中的每个孔底部加入700μL的DMEM(20％FBS)；分成空白组(不加任何处理)、BPNSs组(去掉旧培养基，加入含有BPNSs的培养基溶液(400ng/mL)进行干预)和AAB组(将AAB直接放在培养基中，与细胞共培养)分别对其进行干预；干预24h后，将6孔板中的旧培养基吸掉，用PBS清洗一次，接着用棉签轻轻的将Transwell小室中的内皮细胞擦拭掉，用PBS清洗3次后，用0.1％结晶紫对Transwell小室外部的内细胞进行染色，在倒置相差显微镜下观察并进行细胞计数。

实验结果参见图6，由图6中的B、C可见，BPNSs和AAB都可促进内皮细胞的迁移，而且BPNSs的促进作用要更明显一点；表明BPNSs和ABA可促进内皮细胞的迁移，在血管生成的过程中起着重要作用。

实施例3 BPB和AAB的体外毒性检测

1、新生SD大鼠心肌细胞(NRCM)的提取和培养

(1)用75％酒精对SD乳鼠(刚出生1～3天)进行浸泡消毒15s，接着用手指固定乳鼠的头部和四肢，在胸前区做“十字形”切口，然后以用眼科剪将左侧胸部的第2～5肋骨剪断，用手指挤压可使心脏从胸腔内跳出，再用弯镊夹取心脏的左室部分并置于预冷的PBS缓冲液(4℃)中，清洗两次以去掉多余的血液；用镊子将心脏组织分离成小块组织，各小块之间不能断离，接着将心肌组织块放入血清瓶中，并用胰酶没过组织，置于4℃下消化过夜(10h)；

(2)吸掉胰酶后，往心肌组织块中加入含10％FBS的DMEM培养基，并在37℃条件下将它放在摇床上缓慢摇晃5min，接着将心肌组织转移到Ⅰ型胶原酶中，以200rpm磁力搅拌15min，静置5min后将细胞悬液转移至离心管中离心5min，去掉含有胶原酶的培基，往细胞沉淀中加入含10％FBS的DMEM培养基，轻轻吹打均匀后可得到细胞悬浮液，将细胞悬液加入到培养皿中，在5％CO₂培养箱，37℃恒温条件下进行差速贴壁培养2h；将培养皿中的上清液转移到另外一个培养皿中继续培养2h，得到的细胞悬液可转移到离心管中备用。

2、BPB对心肌细胞的影响

将NRCM接种到白蛋白纤维支架上，利用Calcein AM/PI染色分析BPNSs和近红外光照射后BPNSs产生的热量对NRCM细胞伸展性和存活率的影响，分为BSA组、BPB组和BPB+NIR组(给予近红外光照射)，具体方法如下：

(1)将20mm×20mm的白蛋白纤维支架置于在6孔板底部，用PBS清洗3次后，并用紫外光照射4h进行消毒杀菌；

(2)将提取的NRCM细胞种植到白蛋白纤维支架中，在37℃、5％CO₂培养箱中培养3天，期间每隔一天就换一次培养基，去除旧培养基后，其中一组白蛋白纤维支架中加入BPNSs(200μg/mL，40μL)，为BPB组，然后加入培养基继续培养24h；

(3)配置死活染色工作液：用PBS将Calcein AM和PI母液分别稀释至0.5μmol/L和0.8μmol/L，向每个孔中加入700μL染色工作液进行染色；用近红外激发光(808nm，1.5W/cm²)照射90s，在37℃条件下染色15min后，将染色工作液吸掉，然后在荧光显微镜下以绿光通道和红光通道观察。

实验结果参见图7，由图7中的A可见，BSA组和BPB+NIR组中的心肌细胞形态相仿，而BPB组中的心肌细胞在BPNSs干预24h后展现出较好的细胞伸展性，提示在BPNSs可促进心肌细胞之间的相互作用。在近红外光照射下，BPB产生的热量不会对心肌细胞造成明显的伤害。此外，从图7中的B中也可知BPB对心肌细胞的生长可能还有促进作用。

3、AAB对心肌细胞的影响

这部分实验的心肌细胞将不种在纤维支架上，分为空白组(不给任何处理)、BSA组和AAB组；具体方法及操作如下：

将提取的NRCM细胞在培养皿上培养3天，等NRCM细胞生长稳定后，往培养基中分别加入白蛋白纤维支架和AAB，共孵育24h后，去掉旧培养基并加入死活染色工作液进行染色，在荧光显微镜下观察。

结果参见图8，由图可见，细胞形态和存活率在空白组、BSA组和AAB功能性支架组之间没有明显差异。

以上结果提示AAB/BPB心脏补片无细胞毒性，适合应用在动物活体研究中。

实施例4 AAB对Raw264.7巨噬细胞M2表型的影响

实验分为空白组、BSA组和AAB组。将六孔板中的培养基吸走，用PBS洗三次后，加入新的培养基；AAB组往孔中加入AAB，BSA组加入白蛋白纤维支架，而空白组则不做任何干预，将细胞置于37℃，5％CO₂培养箱中共孵育24h；在显微镜下观察巨噬细胞的形态变化。。接着，采用免疫荧光染色对各组中巨噬细胞的特定标记物(CD206，M2型巨噬细胞的蛋白标记物)进行检测分析，具体方法如下：

(1)细胞(Raw264.7巨噬细胞)样品固定：首先将共聚焦皿中的细胞培养基吸走，用PBS对皿中的细胞进行洗涤3次，每次洗5min，室温条件下，往每个皿中加入200μL 4％多聚甲醛，静置20min进行细胞固定，将4％多聚甲醛吸走，再用PBS洗涤3次，每次洗5min。

(2)细胞透膜：每个皿加入200μL 0.1％Triton X100(用PBS稀释)，室温下放置20min，用PBS洗涤3次，每次5min；

(3)封闭：每个皿加入200μL免疫荧光封闭液，室温封闭1h；

(4)孵育一抗：封闭结束后，用PBS洗涤细胞2次，每次5min；兔多克隆CD206抗体用一抗稀释液进行稀释，稀释比例为1:200，每个共聚焦皿加入100μL稀释后的一抗，放在4℃下过夜反应；

(5)室温条件下，将共聚焦皿放在摇床上缓慢摇动复温1h，用PBS洗涤3次，每次5min；将山羊抗兔Cy3二抗用二抗稀释液稀释，稀释比例为1:500，加入到共聚焦皿中，常温条件下，避光孵育2h；

(6)细胞核染色及封片：弃掉二抗后用PBS洗涤细胞3次，每次5min，加入DAPI染色工作液对细胞核进行染色，每个共聚焦皿加入50μL工作液，室温放置3min；用PBS洗涤3次，每次5min，每个共聚焦皿滴加抗荧光猝灭剂100μL封片，在共聚焦显微镜下观察并拍照。

结果如图9所示，AAB组中可见细长形态的巨噬细胞，对CD206的荧光强度进行定量分析，发现AAB组具有较高的CD206/DAPI比值，说明AAB的干预可增强CD206的表达，而且进一步说明细长的巨噬细胞倾向于M2巨噬细胞的极化。

实施例5 AAB对Raw264.7巨噬细胞M1表型的影响

利用脂多糖(LPS)诱导Raw 264.7巨噬细胞的表型极化，实验分为三组：LPS组、LPS+BSA组和LPS+AAB组。具体步骤如下：

(1)在六孔板中种植Raw264.7巨噬细胞，细胞密度为1.5×10⁶/孔，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养；

(2)配制500ng/mL的LPS诱导液：用含10％FBS的RPMI-1640培养基稀释LPS母液(100μg/mL，用PBS溶解配制)，涡旋10min使其充分混匀；当细胞生长密度达到80％左右时，弃掉旧培养基，加入含有LPS的RPMI-1640培养基，同时分别给予不同的干预(LPS组，不给于其他干预；BSA+LPS组，将白蛋白纤维支架加入到孔共培养；而AAB组，则是给予AAB进行干预)。干预24h后，收集细胞样本，利用荧光探针DCFH-DA对巨噬细胞胞内产生的ROS进行检测。

结果如图10所示，给予LPS干预24小时后，相比于单纯LPS组和白蛋白纤维支架+LPS组，AAB+LPS组中的绿色荧光强度明显减弱；定量分析发现AAB+LPS组的ROS/DAPI比值较低，说明AAB可减少细胞活性氧的产生。

实施例6 AAB/BPB补片对急性心肌梗死(AMI)后改善心功能的作用影响

(1)大鼠心肌梗死模型的建立及AAB/BPB的移植：以2％戊巴比妥钠(0.3mL/100g的剂量)对大鼠行腹腔注射麻醉，待大鼠麻醉后，用剃毛刀和脱毛膏将其右侧胸部的毛发脱去，然后将头和四肢固定在手术台上；以镊子夹起大鼠的舌头，并充分暴露其会厌结构，将静脉留置针轻轻插入到气管中，拔出针芯后用胶带固定好留置针，另一端与呼吸机相连接。打开呼吸机，设置大鼠的呼吸参数，通气后应观察大鼠的胸廓起伏情况并判断留置针的软管是否已成功插入气管内。大鼠气管插管成功后，取右侧卧位。在侧胸第3，4肋间剪开皮肤，肌肉逐层分离后，开胸暴露出心脏。通过结扎左前降支冠状动脉建立心梗模型，结扎点在左心耳下2-3mm处，用8/0缝合线在此处穿入后迅速打结。当观察到结扎线以下的左心室前壁全部变苍白时，可判定心肌梗死造模建立成功。AAB/BPB组：将5mm×5mm的AAB置于10mm×10mm的白蛋白纤维支架中间，然后往白蛋白纤维支架中加入BPNSs溶液(200μg/mL，20μL)，即可构建出类似于创口贴的心脏补片(AAB/BPB)。将心脏补片移植到心脏表面后，用808nm近红外光线照射60s，功率1.5W/cm²，即可将补片粘附在心脏表面；BPB组：只需将加有BPNSs的白蛋白纤维支架移植到心脏表面，并给予近红外光照射；MI组只需结扎左前降支冠状动脉建立心梗模型，不给于任何干预，而只开胸，不进行冠脉结扎，则作为假手术组(Sham)。然后逐层缝合组织，关闭胸腔，打上耳标作标记。待大鼠自主呼吸恢复后拔掉留置针，关闭呼吸机，将它们置于合适的温度的理疗灯下等待麻药失效。大鼠可正常活动时将它们转到常规动物饲养室中观察。

(2)大鼠心脏功能评估：在大鼠心肌梗死造模后第7天、第14天、第21天和第28天行心脏超声检查对术后大鼠的心脏功能进行评估。以戊巴比妥钠麻醉后将大鼠四肢固定在超声操作台上，并将大鼠胸前的毛发剃掉，利于小动物超声探头的检测。以二维超声模式检测心室短轴，以M型超声模式观察室壁运动。处理数据，每种指标来自3个连续心动周期的平均值。左室射血分数(LVEF)＝(LVEDV-LVESV)/LVEDV×100％。左室缩短分数(LVFS)＝(LVDd-LVDs)/LVDd×100％。结果参见图11。

由图11中的B和C可知，术后第28天，与Sham组相比，其他组的LVEF和LVFS均明显下降。由图11中的D和E可知，MI和BPB组的大鼠心梗造模四周后，和Sham组的大鼠对比，EDV和ESV均明显增大(依次为sham组：206.606±23.915μL和49.997±14.165μL；MI组：408.082±20.705μL和256.311±21.523μL；BPB组：426.331±37.301μL和272.922±56.791μL)。虽然AAB/BPB组的大鼠的EDV和ESV值比Sham组的要高，但与MI组和BPB组对比，可发现AAB可在一定程度上减缓心梗发生后心室的不良适应性重构(AAB/BPB组：300.562±13.243μL和112.534±28.166μL)，P＜0.01。

实施例7 AAB/BPB补片对AMI后心脏室壁厚度及纤维化程度的影响

实验分组及对应的操作可参考实施例6(1)，为评估补片对AMI后心室重构及纤维化程度，在术后28天后，通过Masson染色观察和测量心肌梗死大鼠的左心室的室壁厚度及心肌的纤维化程度。首先用二甲苯对石蜡组织切片进行脱蜡，接着用梯度浓度的乙醇对组织切片进行脱水，吸干水分后，加入苏木素染料染色，并在用双蒸水洗掉多余染料后，加入苯胺蓝溶液进行染色，最后加入中性树胶封片。

结果如图12所示，各组大鼠左心室均有不同程度的变薄和纤维组织沉积。与MI和BPB组相比，AAB/BPB组的室壁厚度明显升高(P<0.01)。以Image J软件对发生纤维化的心肌组织面积(Masson染色后呈蓝色)进行计算，纤维化面积统计结果显示：与MI组相比，AAB/BPB组明显降低心肌组织的纤维化程度(P<0.01)。以上结果表明AAB/BPB心脏补片的植入可减轻大鼠心梗后心室的纤维化和使左室壁的厚度得到很大程度上的保留，减缓心室的不良适应性重构。

实施例8 AAB/BPB补片对AMI后巨噬细胞极化程度的影响

有研究表明心肌梗死发生1天后，循环中的单核-巨噬细胞开始迁移到心肌组织，并分化成炎症型巨噬细胞。心梗后3-5天可由炎症期逐渐进入修复期。因此本实施例将在大鼠心梗造模后(Sham组，只开胸不造模也不做干预；MI组，只心梗造模不做干预；BPB组，心梗造模后移植BPB干预；AAB/BPB组，心梗造模后移植AAB/BPB进行治疗)第4天进行心脏取材，以免疫荧光染色观察梗死灶中的巨噬细胞表型极化(以iNOS标记M1巨噬细胞；以CD206标记M2巨噬细胞)。首先是组织切片的制备：对各组心脏用4％多聚甲醛固定，双蒸水漂洗后进行梯度浓度的乙醇脱水，及浸泡在二甲苯中进行组织透明化，最后对组织进行石蜡包埋及切片，室温条件下保存备用。接着是对组织切片进行免疫荧光染色，以二甲苯对心脏石蜡切片进行脱蜡，三次，每次10min。接着将切片置于不同浓度的乙醇中分别浸泡5min(100％，95％，85％和75％)，进行梯度复水。最后切片放入双蒸水中浸泡5min。最后进行免疫荧光染色，步骤可参考上述。

结果如图13所示，与其他手术组相比，Sham组未见iNOS+细胞和CD206+细胞的分布。结扎左前降支冠脉引起心肌梗死后，MI和BPB组可见iNOS+细胞明显增多；在给予AAB/BPB补片干预后，iNOS+细胞明显减少和CD206+细胞表达增大。这些结果提示AAB可在心肌梗死早期抑制M1炎症型巨噬细胞的产生和增强M2修复型巨噬细胞的表达。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种可控释放H₂S的心脏补片，其特征在于，血清白蛋白纤维支架上分别负载改性海藻酸盐和黑磷晶体，负载有改性海藻酸盐的血清白蛋白纤维支架面积小于负载有黑磷晶体的血清白蛋白纤维支架，并且前者贴合在后者中间；

其中，所述改性海藻酸盐为海藻酸盐氧化后负载上2-氨基吡啶-5-硫代甲酰胺。

2.权利要求1所述可控释放H₂S的心脏补片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、血清白蛋白纤维支架的制备：将血清白蛋白与三氟乙醇混合制成静电纺丝液，加入β-巯基乙醇反应完全，进行静电纺丝，得到血清白蛋白纤维支架；

S2、改性海藻酸盐的制备：用高碘酸盐充分氧化海藻酸盐，透析，干燥，所得氧化海藻酸盐在惰性气体环境，55555℃条件下与2-氨基吡啶-5-硫代甲酰胺充分反应完全，后处理，得到可释放H₂S的前体药物改性海藻酸盐；

S3、负载有改性海藻酸盐的血清白蛋白支架的制备：将步骤S2所得改性海藻酸盐制成改性海藻酸盐水溶液杀菌消毒，步骤S1所得血清白蛋白纤维支架杀菌消毒加入改性海藻酸盐水溶液中，充分负载，得负载有改性海藻酸盐的血清白蛋白纤维支架；

S4、负载有黑磷晶体的血清白蛋白纤维支架的制备：在惰性气体氛围、5 5-4℃条件下，将黑磷晶体制成黑磷晶体水溶液，加入步骤S1所得血清白蛋白纤维支架，充分负载，得负载有黑磷晶体的血清白蛋白纤维支架；

S5、心脏补片的制备：将步骤S3所得负载有改性海藻酸盐的血清白蛋白纤维支架贴合在步骤S4所得负载有黑磷晶体的血清白蛋白纤维支架中间，即得。

3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述静电纺丝液中，血清白蛋白的含量为15515％(w/v)，三氟乙醇的含量为85595％(v/v)。

4.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述血清白蛋白纤维支架的厚度为55575μm。

5.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述充分反应完全的时间为355h。

6.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述后处理包括沉淀、离心、重复沉淀、干燥。

7.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述改性海藻酸盐的质量按照血清白蛋白纤维支架的面积计为8515mg/mm²。

8.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述充分负载的温度为室温。

9.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤S4中，所述黑磷晶体的质量按照血清白蛋白纤维支架的面积计为254μg/cm²。

10.权利要求1所述可控释放H₂S的心脏补片或权利要求259任一所述制备方法在制备治疗心血管疾病药物中的应用。

Images