CN116725980A - 一种负载瑞香素的靶向脂质纳米囊及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种负载瑞香素的靶向脂质纳米囊及其制备方法和应用，涉及生物医药技术领域。本发明制备得到的靶向脂质纳米囊具有稳定性及生物安全性，并且在体内、体外两个方面，验证了所述靶向脂质纳米囊的靶向性。同时，分别从宏观和微观角度验证相对于单纯瑞香素治疗，本发明所述靶向脂质纳米囊治疗效果更为明显。瑞香素通过靶向脂质纳米囊可以更好地富集在损伤脊髓周围，以提高药物生物利用度。本发明负载瑞香素的靶向脂质纳米囊可为脊髓损伤的治疗提供新的方案。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种负载瑞香素的靶向脂质纳米囊及其制备方法和应用。
背景技术
脊髓损伤(Spinal Cord Injury，SCI)是一种近年发病率高，症状严重的中枢神经系统创伤性疾病。根据来源于美国的流行病学资料显示，脊髓损伤的发病率大约为每100万人53-54例。由于缺乏有效的临床治疗手段缓解脊髓损伤引起的截瘫和排泄功能障碍，该疾病严重影响患者的身体状况和生活质量。尽管神经生物学、材料科学、药理学和其他相关学科领域的发展在治疗脊髓损伤方面取得了一定的进展，但在临床医学上有效的治疗方法仍很缺乏。脊髓损伤的病理变化分为原发性和继发性损伤两个阶段，当继发性损伤时，大量的神经元、轴突和神经胶质细胞发生病理性死亡，脊髓组织进一步损伤，进而对感觉和运动功能产生影响。这种损伤性病理环境改变在很大程度上决定了最终损伤的严重程度，同时也极大影响着干预措施发挥修复功能，但目前尚无系统而完整的机理学说。而神经炎症在脊髓损伤中起着关键作用，研究表明，级联反应的炎症，加上血-脊髓屏障的破坏，血液中的分子和细胞很容易穿过血-脊髓屏障渗透到损伤的实质中，加重脊髓肿胀和损伤。
前期研究发现，传统中药单体瑞香素可以促进小鼠脊髓损伤后运动功能的恢复。但它的生物利用度很低，通过肠道被动扩散吸收，与甲基、葡糖醛酸化物和磺酸盐结合形成代谢物，较低的生物利用度往往导致其发挥作用需要较高的剂量，影响临床转化。目前并没有构建可特异性靶向巨噬细胞负载瑞香素的纳米脂质载体材料来提高瑞香素的生物利用度，达到治疗脊髓损伤的相关报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种负载瑞香素的靶向脂质纳米囊及其制备方法和应用，相对于单纯瑞香素治疗，本发明所述靶向脂质纳米囊在治疗脊髓损伤方面，能更好的提高瑞香素的生物利用度，改善其疗效。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种负载瑞香素的靶向脂质纳米囊的制备方法，包括：将磷脂、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-羧基和瑞香素混合，加入氯仿和甲醇混合溶液中，经旋转蒸发溶剂、超声水化后，得到负载瑞香素的脂质纳米囊；将靶向肽偶联到所述负载瑞香素的脂质纳米囊中，得到负载瑞香素的靶向脂质纳米囊；所述靶向肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
优选的，所述磷脂、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-羧基和瑞香素的摩尔比为0.6:0.3:0.1:0.1。
优选的，所述靶向肽偶联的步骤包括：将靶向肽与所述负载瑞香素的脂质纳米囊混合后，经孵育、离心后得到的溶液为负载瑞香素的靶向脂质纳米囊；所述孵育的温度为4℃，时间为24h。
本发明还提供了上述制备方法得到负载瑞香素的靶向脂质纳米囊。
优选的，所述靶向脂质纳米囊的粒径为100～200nm。
本发明还提供了上述制备方法得到的靶向脂质纳米囊或上述靶向脂质纳米囊在制备治疗脊髓损伤药物中的应用。
优选的，所述药物的剂型为注射剂。
优选的，所述靶向脂质纳米囊能靶向脊髓损伤区域的巨噬细胞。
优选的，所述靶向脂质纳米囊可以将脊髓损伤区域的M1巨噬细胞极化成M2巨噬细胞。
优选的，所述靶向脂质纳米囊能抑制脊髓损伤后Caspase-4和GSDMD的激活，减少细胞焦亡的发生。
相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明提供了一种负载瑞香素的靶向脂质纳米囊及其制备方法和应用，通过实验证明，本发明所述靶向脂质纳米囊具有稳定性及生物安全性，并且验证了其靶向脊髓损伤区域巨噬细胞的能力。同时，相对于单纯瑞香素治疗，本发明所述靶向脂质纳米囊治疗效果更为明显。本发明所述靶向脂质纳米囊的给药方式为尾静脉注射，更接近平时临床治疗，而且可以尽可能避免局部注射时对损伤脊髓造成的医源性损伤以及操作可能导致的感染。瑞香素通过靶向脂质纳米囊可以更好地富集在损伤脊髓周围，更好提高药物生物利用度。本发明负载瑞香素的靶向脂质纳米囊可为脊髓损伤的治疗提供新的方案。
附图说明
图1为实施例1-3制备得到的靶向脂质纳米囊的理化性质；A为Zeta电位变化，B为粒径结果；
图2为实施例1Da@Lip-CRV透射电镜图；
图3为Da@Lip-CRV的体外生物安全性：CCK8检测，*：P<0.05；
图4为Da@Lip-CRV的体内生物安全性：小鼠给药后体重变化；
图5为脂质纳米囊的体内生物安全性：血细胞和血生化指标，*：P<0.05；**：P<0.01；
图6为脂质纳米囊的体内生物安全性：不同组小鼠主要器官HE染色(标尺：500μm)；
图7为Da@Lip-CRV-FITC和Da@Lip-Ctrl-FITC分别与巨噬细胞共培养4小时后的共聚焦激光扫描显微成像；
图8为Da@Lip-CRV-Cy5和Da@Lip-Ctrl-Cy5靶向小鼠脊髓的活体成像；上图为活体成像下Cy5信号强度，下图为定量分析；***：P<0.001；****：P<0.0001；
图9为Da@Lip-CRV-Cy5和Da@Lip-Ctrl-Cy5靶向小鼠脊髓的免疫荧光检测结果；上图为共聚焦激光扫描显微成像(标尺：50μm)，下图为定量分析；***：P<0.001；
图10为假手术组、脊髓损伤组、瑞香素治疗组和Da@Lip-CRV组小鼠BMS评分结果；
图11为假手术组、脊髓损伤组、瑞香素治疗组和Da@Lip-CRV组小鼠Catwalk步态分析结果；
图12为假手术组、脊髓损伤组、瑞香素治疗组和Da@Lip-CRV组小鼠电生理检测：运动诱发电位(MEP)及定量分析，**：P<0.01；***：P<0.001；****：P<0.0001；
图13为假手术组、脊髓损伤组、瑞香素治疗组和Da@Lip-CRV组小鼠膀胱功能检测：HE染色及膀胱壁厚度定量分析；***：P<0.001；****：P<0.0001。(标尺：500μm)；
图14为假手术组、脊髓损伤组、瑞香素治疗组和Da@Lip-CRV组小鼠神经元免疫荧光检测及定量分析(标尺：100μm)；***：P<0.001；****：P<0.0001；
图15为假手术组、脊髓损伤组、瑞香素治疗组和Da@Lip-CRV组小鼠胶质纤维酸性蛋白免疫荧光检测及定量分析(标尺：50μm)；*：P<0.05；***：P<0.001；****：P<0.0001；
图16为假手术组、脊髓损伤组、瑞香素治疗组和Da@Lip-CRV组脊髓组织中巨噬细胞免疫荧光检测(标尺：50μm)；A为Iba1标记巨噬细胞，iNOS标记M1型巨噬细胞；B为Arg-1标记M2型巨噬细胞；
图17为假手术组、脊髓损伤组、瑞香素治疗组和Da@Lip-CRV组M1标志物的RT-PCR检测结果；*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001；****：P<0.0001；
图18为假手术组、脊髓损伤组、瑞香素治疗组和Da@Lip-CRV组M2标志物的RT-PCR检测结果；*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001；****：P<0.0001；
图19为假手术组、脊髓损伤组、瑞香素治疗组和Da@Lip-CRV组western blot检测焦亡及NF-κB通路中关键蛋白的表达结果；**：P<0.01；***：P<0.001；****：P<0.0001；
图20为假手术组、脊髓损伤组、瑞香素治疗组和Da@Lip-CRV组脊髓组织中IL-1β、IL-18的含量；**：P<0.01；***：P<0.001；****：P<0.0001。
具体实施方式
本发明提供了一种负载瑞香素的靶向脂质纳米囊的制备方法，包括：将磷脂、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-羧基和瑞香素混合，加入氯仿和甲醇混合溶液中，经旋转蒸发溶剂、超声水化后，得到负载瑞香素的脂质纳米囊；将靶向肽偶联到所述负载瑞香素的脂质纳米囊中，得到负载瑞香素的靶向脂质纳米囊；所述靶向肽的氨基酸序列为TGNYKALHPHNGGGGGCRVLRSGSC，如SEQ ID No.1所示。
本发明所述靶向肽氨基酸序列中片段TGNYKALHPHNG为血脊髓屏障穿透肽，片段CRVLRSGSC为巨噬细胞结合肽。
本发明所述磷脂、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-羧基和瑞香素的摩尔比优选为0.6:0.3:0.1:0.1。
本发明所述靶向肽偶联的步骤优选包括：将靶向肽与所述负载瑞香素的脂质纳米囊混合后，经孵育、离心后得到的溶液为负载瑞香素的靶向脂质纳米囊；所述孵育的温度为4℃，时间为24h；所述靶向肽与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000的摩尔比优选为1:1；在所述偶联前还优选包括所述负载瑞香素的脂质纳米囊的活化步骤，优选包括：将所述负载瑞香素的脂质纳米囊与N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)混合后，室温活化30min。
本发明还提供了上述制备方法得到负载瑞香素的靶向脂质纳米囊。
本发明所述靶向脂质纳米囊的粒径优选为100～200nm。
本发明还提供了上述制备方法得到的靶向脂质纳米囊或上述靶向脂质纳米囊在制备治疗脊髓损伤药物中的应用。
本发明所述药物的剂型优选为注射剂。本发明所述靶向脂质纳米囊的给药方式为尾静脉注射，更接近平时临床治疗，而且可以尽可能避免局部注射时对损伤脊髓造成的医源性损伤以及操作可能导致的感染。
本发明所述靶向脂质纳米囊能靶向脊髓损伤区域的巨噬细胞。
本发明体外激光共聚焦显微镜观察实验结果表明：用Da@Lip-CRV孵育的巨噬细胞荧光强度明显高于用Da@Lip-Ctrl孵育的细胞，证实了本发明所述靶向脂质纳米囊能够靶向巨噬细胞。
本发明体内活体成像、组织免疫荧光染色实验结果表明：本发明的靶向脂质纳米囊成功靶向巨噬细胞而且其靶向性明显优于对照组。
本发明所述靶向脂质纳米囊可以将脊髓损伤区域的M1巨噬细胞极化成M2巨噬细胞。
本发明所述靶向脂质纳米囊能抑制脊髓损伤后Caspase-4和GSDMD的激活，减少细胞焦亡的发生。
本发明体外实验中，流式细胞学和免疫荧光结果均证实本发明所述靶向脂质纳米囊可促进LPS诱导的巨噬细胞由M1型向M2型极化；Westernblot结果显示本发明所述靶向脂质纳米囊干预后可降低LPS诱导巨噬细胞焦亡过程中Caspase-4、GSDMD蛋白的表达；ELISA检测结果发现细胞上清液中IL-1β和IL-18的含量也出现下降。
本发明体内实验中，qRT-PCR和免疫荧光结果显示，本发明所述靶向脂质纳米囊可促进损伤脊髓中巨噬细胞由M1型向M2型极化，保护神经元；Western blot结果显示通过本发明所述靶向脂质纳米囊干预后可抑制损伤组织中细胞焦亡相关的Caspase-4和GSDMD蛋白表达；酶联免疫吸附试验结果显示瑞香素干预治疗后损伤组织中IL-1β和IL-18的含量下降，而抗炎因子表达增加。
本发明对所涉及原料的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
本发明以下实施例选用北京维通利华公司提供的8周龄C57BL/6小鼠，大小约25g左右，雌雄各半。相关伦理协议审查由天津医科大学伦理委员会批准，于本单位动物中心进行饲养。实验小鼠饲养期间严格遵守安全卫生标准，具备恒温恒湿环境，且保持早七点、晚七点十二小时白/昼交替节律，喂养充足的食物及饮用水。术后按照规定，每只小鼠单独放置于鼠笼内，术后三天给予止疼药及抗生素，防止血尿、感染等并发症发生。
以下实施例所涉及的图像数据采用Image-J软件处理分析。通过GraphPadPrism6软件统计分析实验结果并绘制图表。两组间比较采用t检验，单因素多组间比较采用单因素方差分析，两个因素多组间比较采用双因素方差分析，以平均值±标准差形式表示实验结果。当P＜0.05时被认为具有统计学意义。
实施例1
制备负载瑞香素的靶向脂质纳米囊
(1)瑞香素脂质纳米囊的制备
将12.5μmol磷脂、6.25μmol胆固醇、2.08μmol二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-羧基(DSPE-PEG2000-COOH)和2.08μmol瑞香素加入0.4mL氯仿和0.1mL甲醇混合溶液中，在55℃的旋转蒸发仪中旋蒸4.5h，茄形烧瓶底部形成了一层薄膜，加入1mL超纯水，放入水浴超声仪中，室温超声1h后，转移至探头超声仪中，20％功率，2号探头，开5s关5s，超声1min，用孔径为0.22μm的滤膜对溶液进行三次挤压，得到瑞香素脂质纳米囊溶液(Da@Lip)。
(2)靶向肽偶联
将步骤(1)中得到的Da@Lip溶液中加入1mgN-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和0.3mg N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，室温活化30min，得到活化后的Da@Lip；
将2.08μmol靶向肽(如SEQ ID No.1所示)加入1mL上述活化后的Da@Lip溶液中，4℃反应24h，加入截留分子量(MWCO)为30,000Da的超滤管中，5000r/min，10min/次，离心3次，收集超滤管内管中的溶液，得到靶向脊髓损伤区域M1型巨噬细胞的负载瑞香素脂质纳米囊(Da@Lip-CRV)。
实施例2
制备红色荧光成像检测的脂质纳米囊Da@Lip-CRV-Cy5
(1)将实施例1步骤(1)中得到的Da@Lip溶液中加入1mgN-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和0.3mgN-羟基丁二酰亚胺(NHS)中，室温活化30min，得到活化后的Da@Lip；
将2.08μmol Cy5红色荧光染料标记的靶向肽(Cy5-TGNYKALHPHN-GGGGG-CRVLRSGSC)加入1mL活化后的Da@Lip溶液中，4℃反应24h。
(2)将上述材料加入截留分子量(MWCO)为30,000Da的超滤管中，5000r/min，10min/次，离心3次，收集超滤管内管中的溶液，得到红色荧光成像检测的脂质纳米囊(Da@Lip-CRV-Cy5)。
实施例3
制备绿色荧光成像检测的脂质纳米囊Da@Lip-CRV-FITC
具体实施方式与实施例2相同，不同的是将“Cy5红色荧光染料标记的靶向肽(Cy5-TGNYKALHPHN-GGGGG-CRVLRSGSC)”替换为“FITC绿色荧光染料标记的靶向肽(FITC-TGNYKALHPHNG-GGGG-CRVLRSGSC)”，制备得到绿色荧光成像检测的脂质纳米囊(Da@Lip-CRV-FITC)。
对比例1
制备绿色荧光成像检测的脂质纳米囊Da@Lip-Ctrl-FITC
具体实施方式与实施例3相同，不同的是靶向肽的氨基酸序列为TGNYKALHPHNG-GGGG-GGSGGSKG(如SEQ ID No.2所示)。
对比例2
制备红色荧光成像检测的脂质纳米囊Da@Lip-Ctrl-Cy5
具体实施方式与实施例2相同，不同的是靶向肽的氨基酸序列为TGNYKALHPHNG-GGGG-GGSGGSKG(如SEQ ID No.2所示)。
实施例4
靶向脂质纳米囊的理化性质和形状
(1)理化性质的测定
使用动态光散射法(DLS)测量粒径，用紫外光谱法测定载药量。掺入效率以药物回收的百分比与初始装载量的比来确定。取10μLDa@Lip-CRV溶液稀释至1mL在90度散射角下测量10次，以获得平均粒径。
采用方法来检测Da@Lip-CRV、Da@Lip-CRV-Cy5和Da@Lip-CRV-FITC的ζ电位变化。
通过粒径和点位评估其物理稳定性，具体结果见图1。
由图1可知，Da@Lip-CRV、Da@Lip-CRV-Cy5和Da@Lip-CRV-FITC的电位变化稳定且位于-30mV至-40mV之间。然后继续进行粒径检测，发现各种脂质纳米囊直径主要集中在100nm-200nm之间，说明本发明制备得到的Da@Lip-CRV、Da@Lip-CRV-Cy5和Da@Lip-CRV-FITC性能稳定。
(2)透射电镜下观察脂质纳米囊形状
将Da@Lip-CRV稀释100倍，吸取10μL样品滴于带膜铜网上，静止放置5min，用吸水纸将多余液体吸除，然后用磷钨酸负染液染色1～2min用吸水纸吸去负染液，放置干燥后于透射电镜下拍摄图像，具体结果见图2。
由图2可知，证明本发明Da@Lip-CRV成功合成。
实施例5
负载瑞香素的靶向脂质纳米囊的安全性
(1)体外验证靶向脂质纳米囊生物安全性
采用CCK-8法进行测定，取处于生长期的HT22细胞和RAW264.7细胞接种于96孔板中，每孔接种约4000个细胞，培养箱中孵育过夜。将制备的Da@Lip-CRV用对应的培养基稀释为0.125、0.25、0.5、1.0μmol/L浓度，对照组每孔加入DMEM培养基100uL，其余各组依次弃掉原培养基，加入不同浓度的Da@Lip-CRV溶液，每组设置3重复，放入CO2细胞培养箱24小时。配制CCK-8混合液(90％培养基+10％CCK-8液)，孵育结束后每孔依次加入100μL，继续孵育1小时(全程避光，37℃)，使用酶标仪测定450nm处的吸光值，具体结果见图3。
由图3可知，在所选择浓度范围内，细胞的存活率并没有出现明显的差异，说明靶向脂质纳米囊对神经细胞和巨噬细胞的毒性作用小，具有一定的生物安全性。
(2)体内验证靶向脂质纳米囊生物安全性
1)小鼠一般情况
为了明确靶向脂质纳米囊在体内的生物安全性，取正常小鼠(雌性)随机分为3组，给药方式为分别尾静脉注射200μLPBS，腹腔注射200μL Daph(60mg/kg)和尾静脉注射200μLDa@Lip-CRV(5mg/kg)，每天一次，连续给药7天。每日称重，观察小鼠的精神、活动度、毛发、进食水等一般情况，以及死亡情况。小鼠体重情况见图4。
由图4可知，将靶向脂质纳米囊以尾静脉注射的方式给药7天，小鼠的精神、活动度、毛发、进食水、大小便情况均无明显异常。对照组与干预组相比无明显差异，而且体重持续增长。
2)血液学指标检查
在小鼠末次给药后的第二天，采取摘眼球取血的方式取血，分别于血细胞分析仪和血生化分析仪上进行测定，具体情况见图5。
由图5可知，与对照组相比，靶向脂质纳米囊组的血细胞指标和血生化指标未见明显异常，靶向脂质纳米囊对血液系统和肝肾功能影响较小，本发明给药剂量对小鼠身体无明显损害。
3)主要器官病理学评价
小鼠处死后取主要器官(心、肝、脾、肾)进行HE染色，显微镜进行观察具体结果见图6。
由图6可知，比较两组病理切片，相比于对照组，注射靶向脂质纳米囊后，各器官并未出现组织坏死，组织内的细胞也没有观察到显著损伤，说明构建的靶向脂质纳米囊对组织损伤较小，对器官组织影响小。
实施例6
体外验证靶向脂质纳米囊靶向性
在避光条件下，分别将异硫氰酸荧光素(FITC)标记脂质纳米囊Da@Lip-CRV-FITC(50μmol/L)和Da@Lip-Ctrl-FITC(50μmol/L)，加入DMED培养基，配制终浓度(0.5μmol/L)，然后与RAW264.7共培养4h，然后PBS缓冲液小心润洗，4％多聚甲醛固定15min，DAPI染色5min，然后再次用PBS缓冲液润洗，用激光共聚焦显微镜观察Da@Lip-CRV-FITC对RAW264.7的靶向性，具体结果见图7。
由图7可知，共聚焦显微镜下可见Da@Lip-CRV-FITC和RAW264.7细胞核共定位，说明Da@Lip-CRV-FITC成功靶向巨噬细胞；用Da@Lip-CRV孵育的巨噬细胞荧光强度明显高于用Da@Lip-Ctrl孵育的细胞。证实了本发明Da@Lip-CRV具有靶向巨噬细胞的效果。
实施例7
体内验证靶向脂质纳米囊靶向性
1、小鼠脊髓损伤模型建立
(1)麻醉
小鼠进行称重。打开气麻系统，取足量异氟烷倒入配套的麻醉注射器内，并将气体麻醉系统设置完成。根据小鼠体重结果设置系统内体重，转动三通使其朝向诱导麻醉盒，选择系统中诱导麻醉，设置流量为2.5，然后预充诱导麻醉盒。设置系统，并回吸诱导麻醉盒内的多余异氟烷。打开诱导麻醉盒盒盖并取出小鼠，俯卧位放置于加热毯上，并将其鼻子固定在气体输送鼻罩处。同时将三通转向鼻罩方向，设置系统为经鼻罩维持麻醉选项，将流量设置为1.5，并判断小鼠呼吸状态，注意随时调整麻醉流量。如果小鼠出现呼吸深、慢，需将流量调小，如若小鼠呼吸浅、快，需将流量调大，直至呼吸规则且平稳。右手拇指、食指指尖用力捏小鼠尾部，如无反射，说明麻醉成功，可以进一步进行手术操作。
(2)建立脊髓损伤模型
将ImpactorModel III提前设置好打击参数，其中打击重量为5g，高度为12.5mm。造模前用湿巾将小鼠眼部盖住，防止造成眼部感染。术者穿戴好一次性手术衣，手术帽、口罩及无菌手套。电动理发器进行备皮之后再用脱毛膏脱毛，备皮范围：由颈部延伸至下背部，中线左右两侧各1cm。然后用碘伏消毒，铺无菌洞巾。根据解剖学定位，小鼠最后一根肋骨平行对应第十三胸椎(T13)。往上数五个节段，手术中心部位于第八胸椎(T8)。以T8棘突为中心，用手术刀沿身体纵轴方向逐层切开皮肤(约1cm长)，使用无菌棉球止血。一手使用齿形镊固定小鼠脊柱，另一手使用手术刀沿脊柱两侧切开并尽量分离肌肉，然后用眼科剪剪开两侧T8椎板并打开椎管使脊髓暴露。
暴露完成后将小鼠转移至操作台，将沾有异氟烷纱布的EP管放在小鼠口鼻处暂时维持麻醉，注意调整EP管与鼻子之间的距离，防止苏醒或者呼吸抑制情况的发生。
借助操作台的机械臂固定小鼠损伤区域的脊柱两端。然后降低打击头至尖端接触脊髓但无任何压力。这时逆向旋转位置适配器以使打击头尖端抬起。按压打击按钮，对小鼠进行打击挫伤，同时记录打击力，位移和速度等值。操作成功的表现是双后肢痉挛。局部碘伏消毒后根据解剖层次逐层缝合损伤部位并注意充分止血，同时在肌肉上外用抗生素软膏。应用缝线缝合皮肤后，在皮肤上擦涂抗生素软膏。术后独笼喂养小鼠直至处死。
(3)术后喂养及护理
术后小鼠送回动物房喂养，每只鼠位于独自笼位。由于术后小鼠出现厌食鼠粮、饮水，应给予高蛋白液体，并适当腹腔给予补液。小鼠脊髓损伤后会引起尿潴留，术后需人工辅助排尿，每天三次，间隔8小时，直至小鼠恢复自主排尿功能。如若辅助排尿过程中发现血尿，应考虑存在泌尿系感染的可能，需要给予青霉素抗感染治疗。
2、体内验证靶向脂质纳米囊靶向性
(1)活体成像
将转基因鼠(Lyz2-e(Kozak-CreERT2-IRES-EGFP)1，巨噬细胞表达绿色荧光蛋白)分为实验组和对照组两组，实验组尾静脉注射Da@Lip-CRV-Cy5，浓度1mg/mL，200μL/次，对照组尾静脉注射Da@Lip-Ctrl-Cy5，浓度1mg/mL，200μL/次。然后放入诱导麻醉盒，分别于给药1h、2h、4h、8h、24h后进行活体成像，具体结果见图8。
由图8可知，不同时间段实验组的Cy5信号强度均明显强于对照组，说明本发明的靶向脂质纳米囊的靶向性明显优于对照组。
(2)组织切片制备
在气麻系统中使用异氟烷对转基因鼠进行麻醉，当成功麻醉后，固定剑突，使用组织剪暴露胸腔，20mL注射器搭配5mL注射器针头抽取提前预冷的PBS缓冲液，自左心室刺入，选择恰当方向插入主动脉，同时剪开右心耳然后均匀速度灌注，然后取另一20mL注射器抽取提前预冷4％PFA，沿同一针眼同一方向刺入并均匀速度灌注。待灌注完成后取材，铝箔纸维持脊髓组织笔直形态后置于装满4％PFA的离心管中固定24小时。待固定充分后，依次按照5％、10％、15％、20％、25％、30％的浓度梯度蔗糖溶液的顺序进行充分脱水。充分脱水完毕后进行OCT包埋。然后将包埋盒放置在液氮上进行快速降温。随后将脊髓组织于-80℃冰箱保存，准备冰冻切片前一天可放置在-20℃冰箱。使用冰冻切片机将包埋组织块以10μm厚度进行切片。操作过程中全程注意避光。
(3)免疫荧光染色
将需染的组织用组化笔圈出，随后放入底部含有PBS缓冲液的盒子内，将TBS缓冲液滴加到组织切片上润洗切片，15min后吸除。然后在组织上滴加含DAPI的封片剂然后盖上盖玻片，注意避免产生气泡，全程注意避光。然后将切片放入纸质切片夹中保存，表面用铝箔纸包裹，4℃冰箱避光保存。待切片相对干燥后使用Confocol显微镜系统进行成像，观察脂质纳米囊材料与脊髓组织中巨噬细胞共定位情况，具体结果见图9。负载瑞香素的靶向脂质纳米囊体内促进脊髓损伤修复有效性实验方法学同上。
由图9可知，转基因鼠的巨噬细胞呈绿色荧光，脂质纳米囊呈现红色荧光，可见实验组出现明显的脂质纳米囊和巨噬细胞的共定位，说明本发明的Da@Lip-CRV成功靶向巨噬细胞而且其靶向性明显优于对照组。
实施例8
Da@Lip-CRV对脊髓损伤小鼠脊髓损伤后功能的恢复
随机将24只脊髓损伤后C57小鼠分为4组，分别是假手术组(Sham)、脊髓损伤组(SCI)、瑞香素治疗组(Daph)和Da@Lip-CRV组(Da@Lip-CRV)。
假手术组(Sham)：只打开T8椎板，并不损伤脊髓；
脊髓损伤组(SCI)：打开椎板，选用重量为5g的小鼠打击头，设置打击高度为12.5mm，撞击T8节段脊髓，干预手段为腹腔注射生理盐水，1次/日，连续注射7日；
瑞香素治疗组(Daph)：打开椎板，选用重量为5g的小鼠打击头，设置打击高度为12.5mm撞击T8节段脊髓，干预手段为将瑞香素粉末、DMSO和生理盐水按一定比例稀释成混合溶剂，腹腔注射瑞香素溶剂(60mg/kg)，1次/日，连续注射7日；
脂质纳米囊(Da@Lip-CRV)治疗组：打开椎板，选用重量为5g的小鼠打击头，设置打击高度为12.5mm撞击T8节段脊髓，干预手段为尾静脉注射Da@Lip-CRV(5mg/kg)，1次/日，连续注射7日。
1、BMS运动功能评分和Catwalk步态分析
1)在造模后六周，通过BMS运动功能评分，对不同时段脊髓损伤小鼠进行记录评价，从而评估其后肢运动功能恢复情况。
脊髓损伤后一天观察，Sham组双下肢活动正常，其他组均下肢无法活动，后肢肌肉无自主收缩能力，肌力评分为0级，证明成功构建小鼠的脊髓损伤模型。各组BMS运动功能评分结果见图10。
由图10可知，随着时间进展，sham的评分始终保持在9分，而脊髓损伤组、瑞香素治疗组和Da@Lip-CRV治疗组的评分均逐渐上升，相比于脊髓损伤组，损伤后第2周开始，Da@Lip-CRV治疗组评分具有一定程度的提高，而且Da@Lip-CRV治疗组相对于瑞香素治疗组升高更为明显，这种差异出现统计学差异。
2)Catwalk步态分析
通过Catwalk步态分析对各组小鼠进行下肢功能分析，评价其恢复情况。各组Catwalk步态分析结果见图11。
由图11可知，与sham组相比较，脊髓损伤组行走时后肢拖拽，运动不协调，步幅也明显减小；相对而言，Da@Lip-CRV治疗的老鼠脚掌可支撑着地，步幅也较之增大，协调性改善。相比于瑞香素组，负载瑞香素的靶向脂质纳米囊组老鼠步幅较之增大，协调性更好。
2、电生理检测
脊髓损伤后6周对小鼠开展电生理检测，具体结果见图12。
由图12可知，相比于瑞香素组，Da@Lip-CRV组潜伏期缩短，波幅增大，说明负载瑞香素的脂质纳米囊组可以更有效促进其传导通路恢复，从而有助于小鼠运动功能的恢复。
3、HE染色
脊髓损伤后6周，对四组小鼠膀胱组织进行HE染色，具体结果见图13。
由图13可知，相比于瑞香素组，Da@Lip-CRV组膀胱组织体积变小，而且膀胱内壁组织变薄破坏的情况明显改善。进一步证实了Da@Lip-CRV组对脊髓损伤神经的修复效果更好。
4、免疫荧光染色
小鼠脊髓损伤后6周脊髓取材，将取材脊髓用铝箔纸维持笔直形态后置于装满4％PFA的离心管中固定24小时。待固定充分后，依次按照5％、10％、15％、20％、25％、30％的浓度梯度蔗糖溶液的顺序进行充分脱水。充分脱水后使用OCT进行包埋，随后使用冰冻切片机切片，然后使用NeuN(神经元特异性标记物)和GFAP(星胶的特异性标记物)进行免疫荧光染色，具体结果见图14和图15。
由图14和图15可知，相对于瑞香素组相比，Da@Lip-CRV组的NeuN的荧光强度明显较高，而GFAP的荧光强度较低，说明Da@Lip-CRV的神经保护作用更强，可以更强有力地抑制星形胶质细胞的激活，而从达到抑制胶质疤痕生成的作用，进而为神经元存活提供良好环境。
实施例9
Da@Lip-CRV对靶向递送调控巨噬细胞极化和焦亡的影响
1、免疫荧光染色
小鼠脊髓损伤后6周脊髓取材，使用iNOS和Arg-1进行免疫荧光染色，验证巨噬细胞极化情况，具体结果见图16。
由图16可知，相比于瑞香素治疗组，Da@Lip-CRV组iNOS荧光强度较低，Arg-1荧光强度较高，说明Da@Lip-CRV可以更好地促进巨噬细胞向M2型极化。
2、标志物表达水平
通过实时定量PCR技术分别检测脊髓损伤组织中细胞因子IL-1β、IL-10和M1标志物CD86、M2标志物CD206表达水平，具体结果见图17和图18。
由图17和图18可知，相比于瑞香素治疗组，Da@Lip-CRV组促炎细胞因子IL-1β和M1型巨噬细胞标记物CD86的表达降低。同时，负载瑞香素的脂质纳米囊组抗炎细胞因子IL-10和M2型巨噬细胞标记物CD206表达升高。以上结果同样证明Da@Lip-CRV可以更好地促进巨噬细胞向M2型极化。
3、westernblot检测
采用westernblot分别检测四组焦亡及NF-κB通路中关键蛋白的表达，具体结果见图19和图20。
由图19和图20可知，相对于瑞香素干预组，Da@Lip-CRV组中Caspase-4、GSDMD、p-IκB和p-P65蛋白表达下降。与此同时，用ELISA试剂盒检测各组细胞因子，发现与瑞香素治疗组相比，Da@Lip-CRV组IL-18、IL-1β含量降低。并且，瑞香素治疗组给药量60mg/kg，Da@Lip-CRV组给药量5mg/kg，且后者疗效更好，这间接证明本发明Da@Lip-CRV提高了生物利用度。
以上说明，Da@Lip-CRV可以更显著抑制脊髓损伤后Caspase-4和GSDMD激活，减少细胞焦亡的发生，而且该抑制作用很可能是通过NF-κB信号通路实现。
综上可知，负载瑞香素的靶向脂质纳米囊可通过抑制巨噬细胞焦亡和促进巨噬细胞向M2型极化发挥神经保护作用，NF-κB信号通路在其中发挥了重要作用。负载瑞香素的靶向脂质纳米囊可穿过血脊髓屏障靶向脊髓损伤后活化的巨噬细胞，从而引起促炎因子的表达下降，抗炎因子的表达增加，显著改善脊髓组织中的免疫炎性微环境，促进脊髓损伤后小鼠运动功能和神经功能的恢复，进而达到治疗脊髓损伤的效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种负载瑞香素的靶向脂质纳米囊的制备方法，其特征在于，包括：将磷脂、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-羧基和瑞香素混合，加入氯仿和甲醇混合溶液中，经旋转蒸发溶剂、超声水化后，得到负载瑞香素的脂质纳米囊；将靶向肽偶联到所述负载瑞香素的脂质纳米囊中，得到负载瑞香素的靶向脂质纳米囊；所述靶向肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述磷脂、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-羧基和瑞香素的摩尔比为0.6:0.3:0.1:0.1。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述靶向肽偶联的步骤包括：将靶向肽与所述负载瑞香素的脂质纳米囊混合后，经孵育、离心后得到的溶液为负载瑞香素的靶向脂质纳米囊；所述孵育的温度为4℃，时间为24h。
4.权利要求1～3任意一项所述制备方法得到负载瑞香素的靶向脂质纳米囊。
5.根据权利要求4所述的负载瑞香素的靶向脂质纳米囊，其特征在于，所述靶向脂质纳米囊的粒径为100～200nm。
6.权利要求1～3任意一项所述制备方法得到的靶向脂质纳米囊或权利要求4～5任意一项所述靶向脂质纳米囊在制备治疗脊髓损伤药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为注射剂。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述靶向脂质纳米囊能靶向脊髓损伤区域的巨噬细胞。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述靶向脂质纳米囊可以将脊髓损伤区域的M1巨噬细胞极化成M2巨噬细胞。
10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述靶向脂质纳米囊能抑制脊髓损伤后Caspase-4和GSDMD的激活，减少细胞焦亡的发生。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |
Application publication date: 20230912 |
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| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |