JP2003512843A - 処理されたヒトケモカインのｐｈｃ−１とｐｈｃ−２ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、新しく同定された化合物、その化合物のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、およびケモカイン受容体に対する前記化合物のアゴニスト、アンタゴニスト又はインヒビター、特にＣＣＲ−５受容体ならびにそのケモカイン受容体に関連する診断と治療の分野でのそれらの使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明が属する技術分野 本発明は、新しく同定された化合物、その化合物のアミノ酸配列をコードする
ポリヌクレオチド配列、およびケモカイン受容体に対する前記化合物から誘導さ
れるアンタゴニスト又はインヒビター、ならびにそのケモカイン受容体に関連す
る診断と治療の分野での前記アンタゴニストまたはインヒビターの使用に関する
。

【０００２】従来の技術 ケモカインは、急性および慢性の炎症過程の生理およびこれら過程の病的発現
（pathological deregulation）で基本的役割を演じることが知られている小さ
い配列である。

【０００３】 更に、いくつものケモカイン受容体、特に、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４およびＣＣ
Ｒ３として同定されているケモカイン受容体は、患者のＨＩＶウイルス感染に関
連していることが知られている。

【０００４】 公知のケモカインのＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−２
およびこれらケモカインから誘導される合成化合物（ＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳ）は
、主要ＨＩＶ阻害因子であるといわれている。

【０００５】 さらに、ケモカイン受容体に対するウイルス、アンタゴニストまたはアゴニス
トとして改良された特性を有する新しい化合物（一般に、天然ケモカイン類の合
成誘導体およびライブラリースクリーニングから得た合成化学化合物）のスクリ
ーニングに強力な研究が行われている。

【０００６】発明が解決しようとする課題 本発明は、各種のケモカイン受容体およびＨＩＶ−１とＨＩＶ−２の補助受容
体、特にＣＣＲ−１とＣＣＲ−５の受容体に対するアンタゴニスト類又はインヒ
ビター類でありかつ各種の疾患の治療および／または予防に用途がある新しい天
然化合物およびその合成もしくは天然の誘導体を提供することを目的としている
。

【０００７】課題を解決するための手段 本発明は、配列番号：１：

【外１】 または配列番号：２：

【外２】 と６０％以上、好ましくは７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、
９０％以上または９５％以上の相同性（または配列相同性）を示すが、但し、ド
キュメントＰ ４３４４３９７．４とＰ ４４２７３９５．９およびP. Schulz-
Knappeら、J. Exp. Med. 183巻295-299頁1999年にすでに記載されている非切形
（untruncated）ＰＨＣ−１ポリペプチドであるアミノ酸配列の配列番号：３：

【外３】 または配列番号：４：

【外４】 （ＨＣＣ−１ペプチド） と一致しない新しい化合物、好ましくはケモカイン化合物に関する。

【０００８】 上記新しい化合物は、好ましくはケモカイン受容体、特にＣＣＲ−１、ＣＣＲ
−３およびＣＣＲ−５のケモカイン受容体に対するＨＩＶウイルスのアンタゴニ
ストである。

【０００９】 好ましくは、本発明のポリペプチドは、アミノ酸配列の配列番号：１、配列番
号：２またはその生理的に活性のフラグメントまた一部分を有するケモカインＰ
ＨＣ−１である。

【００１０】 前記活性フラグメントまたはその一部は、有利には、一つ以上のアミノ酸が欠
失していてもよい。元の上記完全配列の配列番号：１または配列番号２の少なく
とも１０，１５，２０，２５，３０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも４０個
のアミノ酸、より好ましくは少なくとも５０個もしくは５５個のアミノ酸からな
るＮＨ_２末端アミノ酸配列；ならびにそれら配列の誘導体、特に完全アミノ酸配
列の配列番号：１もしくは配列番号：２の少なくとも１０，１５，２０，２５，
３０，４０，５０もしくは５５個のアミノ酸を有しかつその配列中に一つ以上の
追加のアミノ酸残基を有する化合物であって、アミド、アセチル、ホスホリルお
よび／またはグリコシルまたは他の置換基が、場合によって、連結されているか
またはこれら置換基によって修飾されている（一つ以上の炭素原子または一つ以
上のアルキルの置換）化合物である。

【００１１】 元のアミノ酸配列の配列番号：１または配列番号：２の修飾は、好ましくはＣ
末端に、他のアミノ酸配列のタグを融合させることによって、またはタンパク質
分解活性をスクリーニングするための基体（substrate）を提供するため、元の
配列の配列番号：１の一方の末端または両方の末端に蛍光基を含む上記基を組み
込むことによって達成される。前記ポリペプチドおよびそれらの誘導体（類似体
）から、アミノ酸配列の配列番号：３または配列番号：４を有する化合物、なら
びにそれらのアミド化、アセチル化、ホスホリル化および／またはグリコシル化
された活性誘導体であって、本発明の化合物の活性を提供せず、以下のケモカイ
ン受容体類ＣＣＲ−１、ＣＣＲ−３、ＣＸＲ−４および／またはＣＣＲ−５に結
合できない化合物が除外される。

【００１２】 アミノ配列の配列番号：１または配列番号：２のＮ末端部分またはＣ末端部分
の追加のアミノ酸残基は、好ましくは、２−１０個のアミノ酸からなる連鎖であ
る。

【００１３】 本発明の好ましい実施態様によれば、本発明の化合物の誘導体または類似体は
、Ｎ末端に、化学基が連結しているアミノ酸配列の配列番号：１または配列番号
：２である。

【００１４】 後記説明で、本発明のペプチドは、部分好ましくはＮ末端の末端が、好ましく
はH. Gaertnerら、J. Biol. Chem. 271巻2591-2603頁1996年およびG. Simmonsら
、Science 276巻276-279頁1997年に記載の方法によって、化学基の結合または化
学基による置換で修飾されているＰＨＣペプチドに相当するＰＨＣケモカインま
たはＰＨＣ誘導体または類似体として固定される。

【００１５】 前記ＰＨＣ誘導体または類似体は、好ましくは下記構造のうちの一つで表され
： −［グリオキシロイル^１］ＰＨＣ １−ペンタンオキシム、 −［グリオキシロイル^１］ＰＨＣカプロイルオキシム、 −Ｄ−Ｍｅｔ−［Ｇｌｙ^１］ＰＨＣ、 −Ｌ−ピロリドンカルボクソイル−［Ｇｌｙ^１］ＰＨＣ、 −［グリオキシロイル^１］ＰＨＣ、 −［グリオキシロイル^１］ＰＨＣ １−アセチル−エチルアミン−２オキシム
、 −［グリオキシロイル^１］ＰＨＣ Ｓ−メチル１−チオプロパン−３−オキシ
ム、 −［グリオキシロイル^１］ＰＨＣ ２−ペンテンオキシム、 −［グリオキシロイル^１］ＰＨＣメタンオキシム、 −ヘキサノイル−［Ｇｌｙ^１］ＰＨＣ、 −［グリオキシロイル^１］ＰＨＣフェニルメタンオキシム、 −［グリオキシロイル^１］ＰＨＣ １−プロパンオキシム、 −［グリオキシロイル^１］ＰＨＣ １−ブタンオキシム、 −［グリオキシロイル^１］ＰＨＣ ２−ブタンオキシム、 −ヘキサニル−［Ｇｌｙ^１］ＰＨＣ、 −［グリオキシロイル^１］ＰＨＣ ２−プロパンオキシム、 −［グリオキシロイル^１］ＰＨＣペンタンオキシム、 −ノナニル−ＰＨＣ、 −［グリオキシロイル^１］ＰＨＣＰＨＣ ２−ヘプタンオキシム、 −［グリオキシロイル^１］ＰＨＣエタンオキシム、 −［グリオキシロイル^１］ＰＨＣ １−ヘプタンオキシム、 −［グリオキシロイル^１］ＰＨＣ １−ヘキサンオキシム、 −［グリオキシロイル^１］ＰＨＣ １−ペンテンオキシム、 −ノナノイル−ＰＨＣ、 または以下の式のうちの一つで表される化合物である。 −ＣＨ_３−（ＣＨ_２）_４−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＯ−ＰＨＣ、 −ＣＨ_３−（ＣＨ_２）_５−Ｈ−ＣＨ_２−ＣＯ−ＰＨＣ、 −ＣＨ_３−（ＣＨ_２）_７−ＣＯ−ＰＨＣ、 −ＣＨ_３−（ＣＨ_２）_８−ＰＨＣ、 −ＨＯＯＣ−（ＣＨ_２）_５−Ｏ−Ｎ＝ＣＨ−ＣＯ−ＰＨＣ。

【００１６】 前記化合物の類似体は、組み換え化学またはライブラリースクリーニングによ
って得られ、類似していて、好ましくは前記化合物のそれらの受容体に対する相
互作用を増大する抗体または他の産物などの分子である。

【００１７】 本発明の別の好ましい実施態様によれば、ＰＨＣペプチドの一つ以上のアミノ
酸、好ましくはリシン、ヒスチジン、グルタメート、アスパルテートまたはシス
テインの残基が、ポリエチレングリコールの構造を有する化学基との結合によっ
て修飾される。このような修飾によって、元のＰＨＣ分子の血漿半減期（plasma
half-life time）が増大する。

【００１８】 さらに、診断用の本発明の化合物は、その化合物の一つ以上の末端に、標識、
好ましくは放射性標識、ビオチンまたはストレプトアビジン分子、酵素および／
または蛍光の標識からなる群から選択される標識を有している。

【００１９】 本発明の好ましいＰＨＣケモカイン化合物は、ヒト起源の化合物であり、ヒト
血液の限外濾液（ultrafiltrate）［ヘモ濾液（hemofiltrate）］から分離する
分離法により、かつ該化合物の生理活性を確認する生物学的検定システムを使用
することによって得ることができる。

【００２０】 図１に示すように、本発明の化合物の精製を達成するため、ペプチド類は、Sc
hulz-Knaapら、J. Chrom. A. 776巻125-132頁1997年に記載されているようにし
てヒトのヘモ濾液から製造される。得られたヘモ濾液の画分は、その後、それら
画分のケモカイン受容体の刺激活性についてスクリーニングされ、次いで、その
生理的に活性の画分をさらに、実施例１に記載の多様な（diverse）逆相カラム
クロマトグラフィーのステップを利用するクロマトグラフィーの方法によって精
製した。

【００２１】 上記クロマトグラフィーによる精製で得た生理的に活性のペプチドを、質量分
析およびペプチドの配列分析などに付して構造を決定した。

【００２２】 しかしこのような化合物は、組み換え遺伝子法または合成法によって得ること
もでき、そしてこれらの方法は、場合によっては当業技術者が実施することがで
きる精製ステップを含んでいる。

【００２３】 本発明の第二の側面は、本発明の化合物をコードする少なくとも一つの配列を
有するポリヌクレオチド、好ましくは本発明の化合物をコードするポリヌクレオ
チド配列、またはアミノ酸配列の配列番号：１もしくは配列番号：２を有するそ
の活性部分、または完全配列の活性を示すその生理的に活性のフラグメントもし
くは部分に関する。

【００２４】 本発明の別の側面は、本発明の化合物の未知のアンタゴニスト類もしくはイン
ヒビター類、またはケモカイン受容体、好ましくはＣＣＲ−１、ＣＣＲ−３およ
びＣＣＲ−５受容体からなる群から選択される受容体、好ましくはＣＣＲ−５受
容体に対する前記化合物のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに関する
。

【００２５】 本発明の化合物のアンタゴニストは、前記受容体に結合して、本発明の化合物
が前記受容体に結合するのを阻害することができる分子または分子の基を意味す
る。前記未知のアンタゴニストは、また、細菌、原生動物、ウイルスまたはその
一部分（前記ケモカイン受容体に結合する）、特に、患者を冒している免疫不全
ウイルス１および／または２（ＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２）などのウ
イルスを含む公知の「天然」化合物に対するアンタゴニストである。好ましくは
、前記ウイルスは、単純ヘルペスウイルス、水痘・帯状疱疹ウイルス、Ａ型肝炎
ウイルス類、Ｂ型肝炎ウイルス類、ザイトメガロ（zytomegalo）ウイルス、イン
フルエンザウイルス、ポリオウイルス、リノウイルス、はしかウイルス、風疹ウ
イルス、狂犬病ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ポックスウイルスおよびエプス
タイン・バーウイルスからなる群から選択される。

【００２６】 前記公知の「天然」化合物は、前記ケモカイン受容体に結合できる前記ウイル
ス類の特定の部分でもよい。このような部分の例は、ＣＣＲ−５受容体と特異的
に相互作用を行うことが知られているＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２のＧ
Ｐ １２０／１６０の糖タンパク質である。

【００２７】 本発明の化合物のインヒビターは、本発明の受容体を含む他の分子に対する本
発明の化合物の結合および相互作用を場合によって阻害するため、本発明の化合
物またはこの化合物をコードするヌクレオチド配列を阻止する分子である。

【００２８】 前記インヒビターの例は、（場合によって標識化される）（モノクローナルま
たはポリクローナル）抗体またはこの抗体の高度可変部分である。前記抗体（モ
ノクローナルまたはポリクローナル）またはその高度可変部分（Ｆａｂ′，Ｆａ
ｂ２′など）、および前記抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、本発明の別の
側面であり、診断の分野で、特に、本発明の化合物の、ケモカイン受容体特にＣ
ＣＲ−１、ＣＣＲ−３および／またはＣＣＲ−５受容体に対する作用を監視する
特別の産業上の用途がある。

【００２９】 上記のように、本発明は、また、本発明の化合物のアミノ酸配列をコードする
ポリヌクレオチド（例えばｃＤＮＡ分子、ゲノムＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子）
に関する。

【００３０】 本発明の別の側面は、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、好ましくは、細
胞内で発現するように構成され、そして細胞（好ましくは、細菌細胞、酵母細胞
、昆虫細胞または哺乳類の細胞からなる群から選択される細胞）中で前記ポリヌ
クレオチドを発現させるのに必要な制御エレメントを含むベクターに関する。

【００３１】 前記ベクターは、プラスミド、またはウイルス好ましくはバキュロウイルス、
アデノウイルス、レトロウイルスもしくはセムリキ森林熱ウイルスであってもよ
い。

【００３２】 本発明の他の側面は、本発明のベクターによって形質転換された（当業技術者
が知っている方法によって）細胞、好ましくは哺乳類の細胞（例えばＣＯＳ−７
細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＬＭ（ｔｋ−）細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ＨＥＫ−
２９３細胞またはＫ−５６２細胞からなる群から選択される細胞）に関する。

【００３３】 本発明の化合物のインヒビターは、１５個、２０個、２５個または３０個を超
えるヌクレオチドからなる核酸プローブ、例えば本発明の化合物をコードするｍ
ＲＮＡ分子と特異的にハイブリッドを形成できて前記ｍＲＮＡ分子の翻訳を阻害
する配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド；または本発明の化合物をコ
ードするＤＮＡ分子と特異的にハイブリッドを形成できるアンチセンスオリゴヌ
クレオチドもしくはリボザイムでもよく、そして前記アンチセンスオリゴヌクレ
オチドは、場合によって、ヌクレオチドの化学的類似体を含有している。

【００３４】 また、本発明は、本発明のポリヌクレオチドの相同組み換え「ノックアウト」
を保有するトランスジェニック非ヒト哺乳類、または本発明のポリヌクレオチド
および化合物を、自然のレベルを超えて過剰発現するトランスジェニック非ヒト
哺乳類に関する。このような非ヒト哺乳類は、当業技術者に衆知の方法、例えば
好ましくはCarmelietら、Nature 380巻435-439頁1996年に記載されている方法に
よる胚性幹細胞のトランスフェクションに基づいた古典的方法を利用する国際特
許願公開第ＷＯ ９８／２０１１２号に記載の方法によって得ることができる。

【００３５】 本発明のポリヌクレオチドを過剰発現する前記トランスジェニック非ヒト哺乳
類は、好ましくは、本発明の化合物を過剰発現させる誘導プロモーター（induci
ble promoter）を有するＤＮＡ構造中に組み込まれた前記ポリヌクレオチドを含
有している。

【００３６】 前記核酸構造体は、場合によっては、組織と特定の制御エレメントを含有して
いる。

【００３７】 本発明の他の側面は、ケモカイン受容体より好ましくはＣＣＲ−５ケモカイン
受容体に対する本発明の新しい化合物のアゴニスト類、アンタゴニスト類または
インヒビター類であることが知られていない分子であって、前記単一もしくは複
数のケモカイン受容体に結合する未知の「天然」分子、特にＣＣＲ−５ケモカイ
ン受容体に対するＭＩＰ−１α、ＭＣＰ−２、ＭＩＰ−１βまたはＲＡＮＴＥＳ
ケモカイン類をスクリーニング（検出および場合によっては回収）する方法に関
する。

【００３８】 前記方法は、下記ステップ − 前記受容体をコードするポリヌクレオチドを発現するベクターでトランス
フェクトされた細胞またはその細胞からの細胞抽出物を接触させ、 − 場合によっては、本発明の化合物が前記受容体に結合できる条件下、場合
によって機能応答（functional response）を活性化することによって、本発明
の化合物を含有する細胞抽出物または完全細胞から膜画分を分離し、次いで − かような化合物の存在を、該化合物に対するアゴニスト、アンタゴニスト
またはインヒビターとして作用する分子の存在下、バイオアッセイ（例えば、修
飾、第二メッセンジャーの産生または受容体活性の増大）によって検出し、その
結果（場合によっては回収し次に）、その受容体に対する本発明の化合物のアゴ
ニスト、アンタゴニストまたはインヒビターとして前記分子が作用できるかどう
かを確認する、 ステップを含んでいる。

【００３９】 好ましくは、第二メッセンジャーアッセイは、細胞内ｃＡＭＰ、細胞内リン酸
イノシトール、細胞内ジアシルグリセロールの濃度、アラキドン酸の濃度、ＭＡ
Ｐキナーゼもしくはチロシンキナーゼの経路、または細胞内カルシウムの可動性
の測定を行う。

【００４０】 本発明の別の側面は、薬剤として使用するために、一種以上の本発明の化合物
、その類似体、アンタゴニストまたはインヒビター（前記化合物に対する）およ
び前記化合物をコードするポリヌクレオチドの有効量、ならびに医薬として適切
な担体または希釈剤を含んでなる医薬組成物（ワクチン）に関する。

【００４１】 本発明の他の側面は、有利に、各種疾患（ＣＣＲ−１、ＣＣＲ−３およびＣＣ
Ｒ−５が関連する）特にウイルス感染症、特にヒト免疫不全ウイルス１および／
または２（ＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２）または他の上記ウイルスによ
って誘発される疾患（ＡＩＤＳ）を治療しおよび／または予防する際の薬剤を製
造するため；ならびに以下の諸疾患、すなわち、細胞遊走の障害、癌を含む免疫
系の疾患と混乱、腫瘍の発生と腫瘍の転移とホジキンリンパ腫、リウマチ様関節
炎、乾癬、慢性接触皮膚炎、炎症性腸疾患、多発性硬化症（ＭＳ）、卒中、類肉
腫症、移植臓器の拒絶、炎症および新生物の過程、ウイルス、細菌および真菌の
感染症、創傷と骨の治癒と調節成長機能の機能不全、痛み、糖尿病、肥満症、食
欲不振、過食症、パーキンソン症、急性心不全、低血圧症、高血圧症、尿閉、骨
粗しょう症、狭心症、心筋梗塞、再狭窄、じゅく状硬化症、平滑筋細胞の過剰増
殖を特徴とする疾患、動脈瘤、創傷の治癒、平滑筋細胞の損失または平滑筋細胞
増殖の低下を特徴とする疾患、卒中、虚血、腫瘍、アレルギー（喘息を含む）、
良性前立腺肥大、偏頭痛、嘔吐、精神病と神経病（とりわけ恐怖症、精神分裂症
、躁うつ病、うつ病、うわごと、重篤の精神発達障害、変性疾患、アルツハイマ
ー病などの神経変性疾患およびハンチントン病もしくはジル・ド・ラ・トウレッ
ト症候群などの運動機能障害を含む）を治療しおよび／または予防するための薬
剤を製造するための一種以上の前記化合物、類似体、アンタゴニスト、またはイ
ンヒビターおよびポリヌクレオチドの使用に関する。

【００４２】 本発明の他の側面は、本発明の（場合によって標識化される）化合物、類似体
、アンタゴニストおよび／またはインヒビターおよびポリヌクレオチドが入って
いる診断用のキットまたは装置に関する。

【００４３】 前記診断用のキットまたは装置の好ましい実施態様は、前記化合物の、各種ケ
モカイン受容体に対する活性、特に、前記化合物の、一種以上の上記疾患または
その疾患の症状に対する治療作用または予防作用に関連する前記化合物の活性を
監視するためのキットまたは装置である。

【００４４】 本発明の別の好ましい実施態様による前記診断用のキットまたは装置は、高処
理量スクリーニングを行う診断および／または投与用の装置であり、この装置は
、本発明の化合物のアンタゴニストまたはインヒビターとして作用する、多量の
化合物（既知または未知）を同定できる化合物、類似体、アンタゴニストまたは
インヒビターの高処理量の同定、回収および／または投与を目的とするものであ
る。

【００４５】 好ましくは、前記高処理量スクリーニングを行う診断および／または投与用の
装置は、国際特許願公開第ＷＯ ００／０２０４５号に記載の方法に基づいてい
る。

【００４６】 前記高処理量スクリーニング法は、当業技術者にとって公知の方法によって、
微量滴定プレートまたはバイオチップなどの各種の固体支持体上で実施すること
ができる。

【００４７】 また、本発明は、前記方法を特徴としかつ場合によって前記方法で発見される
分子、前記方法で同定される分子、および前記分子および医薬として許容される
担体または希釈剤を含有する医薬組成物（ワクチン）に関する。

【００４８】 本発明の別の側面は、ＰＨＣ−１およびＰＨＣ−２の化合物（配列番号：３ま
たは配列番号：４から天然でまたは人工的に生成する配列番号：１および配列番
号：２として同定されている）の生成に関与している分子、場合によっては、組
み換え分子、好ましくはウロキナーゼまたはスタフィロキナーゼなどの組み換え
プロテアーゼを含むプロテアーゼ；ならびに関連する疾患、特に上記疾患を有利
に治療または予防するための前記分子のインヒビターまたは活性化物質に関する
。場合によって、酵素活性が増大された組み換え分子（公知のスクリーニング法
によって得られ定義される）を含むかような分子は、配列番号：３または配列番
号：４の分子を分解して本発明の特定の化合物ＰＨＣ−１とＰＨＣ−２にし、そ
して場合によって、それら化合物を修飾して改良された誘導体とするため、当業
技術者に知られている方法で、患者に、有利に投与される。上記疾患またはその
疾患に関連する症状の治療方法は、配列番号：３または配列番号：４に相当する
化合物を本発明の化合物へと分解させるかまたはその分解反応を増大（促進）す
るため、十分な量の前記分子好ましくは前記プロテアーゼを使用して、上記疾患
または症状にかかっている患者に投与することによって達成される。

【００４９】 また、好ましくは、本発明の医薬組成物は、生体内治療にまたは半ビボ治療の
ための細胞による治療に使用する上記組み換えプロテアーゼをコードするヌクレ
オチド配列である。前記細胞は、患者に再投与されて、前記疾患にかかっている
患者の遺伝子治療または遺伝子予防が達成される。

【００５０】 本発明の別の側面は、前記組み換え分子をコードして、場合によっては、ベク
ター中に含まれているかまたは細胞内で発現されるヌクレオチド配列を使用して
、当業技術者に知られている方法で生体内または半ビボで投与することを含む、
上記疾患またはその疾患の症状の予防および／または治療を目的とする薬剤を製
造するための本発明の組み換え分子の使用に関する。

【００５１】 また、本発明は、本発明の予防法および／または治療法を改善するためまたは
前記方法によって患者に誘発される可能性がある副作用を減らすための前記分子
およびプロテアーゼの変異体の使用に関する。前記修飾には、前記分子またはそ
の分子をコードするヌクレオチド配列の一つ以上のヌクレオチド、アミノ酸また
は化学基の欠失、または前記分子またはその分子をコードするヌクレオチド配列
に対する一つ以上のヌクレオチド、アミノ酸または化学基の付加が含まれる。

【００５２】 本発明を添付図面を参照して以下に示す。

【００５３】 図１は化合物ＰＨＣ−１の、ヒトヘモ濾液からの精製を示す。

【００５４】 図２は機能的活性のｐＨ化合物の、ＣＨＯ−Ｋ１細胞内で発現されたヒト組み
換え受容体に対する結合を示す。

【００５５】 図３は一次細胞集団中のＰＨＣ−１化合物によって誘発されるカルシウムの可
動性と走化性を示す。

【００５６】 図４はＨＩＶ−１の感染の阻害を示す。

【００５７】 図５はＰＨＣ−１のタンパク質分解活性化のためのヒト細胞系の選別を示す。

【００５８】 図６は各種のセリンプロテアーゼインヒビターによる、ＰＨＣ−１のタンパク
質分解による生成の阻害を示す。

【００５９】発明の実施の形態 驚くべきことには、特別に処理されたケモカインのＰＨＣ−１およびＰＨＣ−
２が、ヒトヘモ濾液から単離することができ、かつ各種ケモカイン受容体の高度
の活性アゴニストであることが分かったのである。処理されたケモカインＰＨＣ
−２はＮ末端の切形のＰＨＣ−１であり、そして両者のポリペプチドはヒトヘモ
濾液中に存在し、かつケモカインＨＣＣ−１（Schulz-Knappeら、Journ. Exp. M
ed. 183巻295-299頁1996年、受託番号Q16627）またはＨＣＣ−３（受託番号Q139
54）の既知のケモカイン前駆体の配列の天然に処理された生理活性の高い形態で
ある。

【００６０】 新たに同定されたケモカインのＰＨＣ−１とＰＨＣ−２は、β−ケモカインの
ファミリーに属している。これらのβ−ケモカインは、炎症もしくは創傷の治癒
、免疫調節、癌、感染症および多数のさらなる疾患の症状に関連する多くの機能
をもっている。

【００６１】 本発明のペプチドＰＨＣ−１は、ケモカイン受容体ＣＣＲ１、ＣＣＲ３および
ＣＣＲ５に対し非常に高い結合親和性と非常に強力な刺激活性を有している。ケ
モカイン受容体：ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ
９、ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ４に対するＰＨＣ−１の作用は全く観察されなか
った。本発明のペプチドＰＨＣ−１は、好酸球、Ｔ−リンパ球、単球および樹枝
状細胞の走化性／移動に影響するので、ヒトの炎症症状に関連があり、または炎
症疾患；免疫疾患；癌疾患；ウイルス、細菌、真菌および原生動物による感染症
、特にＨＩＶ−１もしくはＨＩＶ−２によって起こる感染症の治療薬および／ま
たは診断薬として使用できる。

【００６２】 ＰＨＣ−１ペプチドは、最も重要なＨＩＶ−１共受容体であるケモカイン受容
体ＣＣＲ５に対する結合親和性が非常に高いため、ヒト細胞のＨＩＶ感染とヒト
細胞におけるＨＩＶの複製を非常に強く阻害する。

【００６３】 処理されたケモカインのＰＨＣ−１とＰＨＣ−２は、ヒトが起源であり、ヒト
血液の限外濾液（ヘモ濾液）とは異なる分離法によってかつそれらの生物活性を
測定する生物学的検定システムを用いることによって得ることができる。ＰＨＣ
−１とＰＨＣ−２の精製を達成するため、ペプチドは、文献（Schulz-Knappeら
、J. Chrom. A, 776巻125-132頁1997年）に最近報告されたようにしてヒトのヘ
モ濾液から製造される。得られたヘモ濾液画分を、それらのケモカイン受容体刺
激活性についてスクリーニングした。次に、生理的に活性の画分を、多様な逆相
カラムクロマトグラフィーのステップを使用するクロマトグラフィーの方法によ
ってさらに精製しなければならない。

【００６４】 クロマトグラフィーによる精製によって得た生理的に活性のペプチドは、質量
分析およびペプチド配列分析を含む構造決定法に付した。

【００６５】 ＰＨＣ−１とＰＨＣ−２の組み換え産生に加えて、メリフールド合成法で通常
の固相に段階的な全合成を行うこともできる。

【００６６】 実施例実施例１：ヒトケモカインＰＨＣ−１およびＰＨＣ−２のヘモ濾液からの単離 ヒトのヘモ濾液のペプチドを、文献（Schulz-Knappe, P.ら、J. Chrom. A, 77
6巻125-132頁1997年）に最近記載されているようにして製造した。簡単に述べる
と、前記ペプチドを、地方の腎臓病センターから入手したヒトのヘモ濾液１００
００Ｌから抽出した。収集されたヘモ濾液は、慢性腎臓疾患が見られる４０名の
成人患者から得た。２０ｋＤａの指定カットオフを有する限外濾液を使用して血
液濾過を行った直後、その濾液を規定どおりに４℃に冷却し、ｐＨ３に調節して
細菌の増殖とタンパク質分解を防止した。８００−１０００Ｌのヘモ濾液のバッ
チを、脱イオン水で希釈して伝導度を＜８ｍＳ／ｃｍにした後、塩酸を使用して
ｐＨ２．７に正確に調節した。これらのバッチを強力なカチオン交換体［２ｌの
Fractogel TSK SP 650(M), Merck］に加え、次にペプチド類を１０ｌの０．５Ｍ
酢酸アンモニウム（ｐＨ７．０）でバッチ溶出を行った。これら溶出液を−２０
℃で貯蔵した。前記濃縮ヘモ濾液中の血清アルブミンの残留量をなくすために、
追加の限外濾過ステップを、ヘモ濾液の１００００Ｌ当量に相当するプールされ
た溶出液に対して実施した。限外濾過は、指定のＭｒカットオフが３０ｋＤａの
sartocon-mini（０．１ｍ^２、ｐｓ−膜）限外濾過器で実施した。濾過は、温度
５℃および流量５−６Ｌ／ｈで、膜貫通圧勾配１バールによって駆動した。

【００６７】 ＰＨＣ−１とＰＨＣ−２の第一精製ステップでは、限外濾液を、伝導度が６．
７ｍＳ／ｃｍになるまで脱イオン水で希釈し、ＨＣｌでｐＨを２．７に調節し、
次いで第二の１０ｌ Fractogelカチオン交換カラムに加えた。そのカラムを、伝
導度が１ｍＳ／ｃｍ未満になるまで、０．０１Ｍ ＨＣＬで洗浄した。捕捉され
たペプチドの段階的バッチ溶出を、以下の８種類の緩衝液すなわちＩ：０．１Ｍ
クエン酸ｐＨ３．６；II：０．１Ｍ酢酸＋０．１Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ４．５；
III：０．１Ｍリンゴ酸ｐＨ５．０；IV：０．１Ｍコハク酸ｐＨ５．６；Ｖ：０
．１Ｍリン酸二水素ナトリウムｐＨ６．６；VI：０．１Ｍリン酸水素二ナトリウ
ムｐＨ７．４；VII：０．１Ｍ炭酸アンモニウムｐＨ９．０；VIII：水ｐＨ７．
０（脱塩ステップ）を使用して実施した。得られたプール画分（１５−２５Ｌ）
を集め、ｐＨ２−３まで酸性にして直ちに第二の分離ステップに付した。

【００６８】 ＰＨＣ−１とＰＨＣ−２の第二精製システムでは、ｐＨプール画分Ｎｏ．５の
溶出液を、Source ＲＰＣカラム（１５μｍ、１０×１２．５ｃｍ、Pharmacia
）中に注入し、２カラム容積の溶媒Ａ（１０ｍＭ ＨＣｌ）で洗浄し、次いで１
００％Ａ（水、１０ｍＭ ＨＣｌ）から６０％Ｂ（８０％アセトニトリル（ｖ／
ｖ）、１０ｍＭ ＨＣｌ）までの勾配液８ｌによって、２００ｍｌ／ｍｉｎの流
量で分離を行った。２００ｍｌずつの画分を集めて、２８０ｎｍの吸光度を監視
した。これらペプチドの画分の一部を、凍結乾燥し、次いで生理活性について以
下のようにして検査した。

【００６９】 画分２１が、本発明の生理活性ペプチドを含有していた（図１Ａ）。

【００７０】 ＰＨＣ−１とＰＨＣ−２の第三精製で、上記生理活性画分２１を、ＲＰ−Ｃ１
８カラム（１５−２０μｍ、３００Å、４７×３００ｍｍ；Vydac，米国ヘスペ
リア）に注入し、次いで次の勾配緩衝液：９０％Ａ（水、１０ｍＭ ＨＣｌ）か
ら５０％Ｂ（８０％アセトニトリル、１０ｍＭ ＨＣｌ）までを、４８分間で４
０ｍｌ／ｍｉｎの流量で使用して分離を行った。１分間ずつの単一画分を集め、
２１４ｎｍの吸光度を監視し、次に下記のようにして生理活性を検査した。フラ
クション１２が、本発明の生理的に活性のペプチドを含有していた。

【００７１】 ＰＨＣ−１とＰＨＣ−２の第四精製ステップで、上記生理活性画分１２を、Ｒ
Ｐ−Ｃ４カラム（５μｍ、１００Å、２０×２５０ｍｍ；Biotek Silica, Oestr
ingen ドイツ）に注入し、次に、勾配緩衝液：６７％Ａ（水、０．１％トリフ
ロオロ酢酸）から５８％Ｂ（８０％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸
）までを、６０分間に７ｍｌ／ｍｉｎの流量で使用して分離を実施した。１分間
ずつの単一画分を集め、２１４ｎｍの吸光度を監視し、次に下記のようにして生
理活性を検査した。画分１３＋１４が本発明の生理的に活性のペプチドを含有し
ていた。

【００７２】 ＰＨＣ−１とＰＨＣ−２の第五精製ステップで、上記ステップで得られた生理
活性画分１３＋１４を、分析用ＲＰ−Ｃ１８カラム（５μｍ、３０ｎｍ、１．０
×２５ｃｍ；Vydac）に注入し、勾配緩衝液：７０％Ａ（水、０．１％トリフル
オロ酢酸）から４５％Ｂ（８０％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸）
までを、４５分間に１．８ｍｌ／ｍｉｎの流量で使用して分離を行った。１分間
ずつの単一画分を集めて、２１４ｎｍの吸光度を監視し次に、下記のようにして
生理活性を検査した。画分１９＋２０が本発明の生理的に活性のペプチドを含有
していた。

【００７３】 ＰＨＣ−１とＰＨＣ−２の第六精製ステップで、上記ステップで得た生理活性
画分１９＋２０を、分析用ＲＰ−Ｃ１８カラム（５μｍ、３０ｎｍ、０．４６×
２５ｃｍ；YMC, Schernbeck, ドイツ）に注入し、勾配緩衝液：７７％Ａ（水、
０．１％トリフルオロ酢酸）から３８％Ｂ（８０％アセトニトリル、０．１％ト
リフルオロ酢酸）までを、４５分間に、流量０．６ｍｌ／ｍｉｎで使用して分離
を行った。１分間ずつの単一画分を集め、２１４ｎｍの吸光度を監視し、次に下
記のようにして生理活性を検査した。画分２０が本発明の生理的に活性のペプチ
ドを含有していた。

【００７４】 ＰＨＣ−１とＰＨＣ−２の第七精製ステップで、上記ステップで得た生理活性
画分２０を、分析用ＲＰ−Ｃ１８ＡＱカラム（３μｍ、０．１×２５ｃｍ；Repr
osil-pur, Fa. Maisch, Ammerbuch 3, ドイツ）に注入し、勾配緩衝液：７７％
Ａ（水、０．１％トリフルオロ酢酸）から３８％Ｂ（８０％アセトニトリル、０
．１％トリフルオロ酢酸）までを４５分間に流量０．０２ｍｌ／ｍｉｎで使用し
て分離を実施した。０．５分ずつの単一画分を集め、２１４ｎｍの吸光度を監視
し、次に下記のようにして生理活性を検査した。精製した、生理的に活性のペプ
チドＰＨＣ−１とＰＨＣ−２が、生理的に活性の画分４５と４６に見出された（
図１Ｂ）。

【００７５】 カチオン交換クロマトグラフィーで得た画分を逆相−ＨＰＬＣ（Ｃ１８カラム
）にかけ、次に諸画分の、ヒトＣＣＲ５に対する生理活性を検定した（破線）。
逆相ＨＰＬＣ（Ｃ４カラム）による活性物質の第五と最終ステップ。その活性ピ
ーク（破線）を、質量分析法とエドマン分解法で分析して、ＰＨＣ−１（Ｍｒ７
７９５）とフルサイズのＨＣＣ−１（Ｍｒ８６７３）を、この画分の主要化合物
として同定した。ＨＣＣ−１をトリプシンで消化することによって、時間の経過
とともによって、ＣＣＲ５の刺激活性が生成した。トリプシンで消化したＨＣＣ
−１（１時間培養）のＲＰ−ＨＰＬＣのクロマトグラムは、主要な分解生成物の
一つとして生理活性ＰＨＣ−１（Ｍｒ７７９５）（かげをつけた）が生成したこ
とを示した。フルサイズのＨＣＣ−１、ＰＨＣ−１、ＨＣＣ−３および他のケモ
カインのＮ末端の部分のアミノ酸配列はＣＣＲ１、ＣＣＲ３またはＣＣＲ５に対
して活性である。星印は、最初の二つの保存システイン（first two conserved
cysteines）を示す。

【００７６】実施例２：ペプチドの解析 実施例１の第七クロマトグラフィーステップで得た生理活性ペプチドの構造決
定を行った。精製したペプチドの質量分析を、エレクトロスプレー・インタフェ
ースを有するSciex API III 四重極質量分析計（Sciex, Perkin-Elmer）（ESI-
MS）で実施した。新しく同定したペプチドＰＨＣ−１の分子量が、７７９５±０
．９Ｄａであることが確認された。新しく同定されたペプチドＰＨＣ−２の分子
量が７４７９±１Ｄａであることが確認された（図１ｅ）。

【００７７】 新しく同定された生理活性ペプチドの配列を、４７３Ａ気相配列決定器（Appl
ied Biosystems）を利用し、メーカーが推奨する標準プロトコルを使用してエド
マン分析法でフェニルチオヒダントイン−アミノ酸をオンライン検出することに
よって決定した。

【００７８】 下記のＮ末端配列が、ＰＨＣ−１について得られた。

【外５】 Ｘ：アミノ酸の信号を検出できない。

【００７９】 下記のＮ末端配列が、ＰＨＣ−２について得られた。

【外６】 Ｘ：アミノ酸の信号を検出できない。

【００８０】 データバンクの比較を、Swiss-ProtとＥＭＢＬとデータベースとについて行っ
た。配列相同性が、確認されて、ＰＨＣ−１とＰＨＣ−２両者の、ヒトケモカイ
ンＨＣＣ−１（受託番号Q16627）またはヒトケモカインＨＣＣ−３（受託番号Q1
3954）の前駆体配列との配列同一性を示した。ＰＨＣ−１とＰＨＣ−２は、ヒト
ケモカインＨＣＣ−１および／またはヒトケモカインＨＣＣ−３の自然に処理さ
れた生理活性型である。

【００８１】 ＰＣＨ−１の分子量（７７９５Ｄａ）は、ヒトのケモカインＨＣＣ−１の前駆
体配列のＣ末端アミノ酸残基９−７４を含有するペプチドの理論分子量の計算値
７７９５Ｄａと正確に一致した。ＰＨＣ−２の分子量（７４７９Ｄａ）は、ヒト
ケモカインＨＣＣ−１の前駆体配列のＣ末端アミノ酸残基１２−７４を含有する
ペプチドの理論分子量の計算値７４７９Ｄａと正確に一致した。

【００８２】 その処理されたケモカインＰＨＣ−１は、ＣＣＲ１に結合する^１２５Ｉ−Rant
esの強力な競合体であり、Ｋｉは０．０２３±０．００７ｎＭ（Ｋｉ±ＳＥＭ）
であった。ＰＨＣ−１はＣＣＲ３に結合する^１２５Ｉエオタキシンの強力な競合
体であり、Ｋｉは２．７±０．８ｎＭ（Ｋｉ±ＳＥＭ）であった。ＰＨＣ−１は
、ＣＣＲ５に結合する^１２５Ｉ−ＭＩＰ １−αの強力な競合体であり、Ｋｉは
０．０４±０．０１ｎＭ（Ｋｉ±ＳＥＭ）であった。

【００８３】実施例３：ＰＨＣ−１とＰＨＣ−２を精製するのに使用した生物検定法（エクオ リン検定法） ＰＨＣ−１とＰＨＣ−２の精製を達成するために生物検定法を利用してケモカ
イン受容体ＣＣＲ５の活性化を測定した。したがって、上記のようにクロマトグ
ラフィーによって精製している間に生成した画分各々は、ケモカイン受容体５（
ＣＣＲ５；ＡＣ Ｐ５１６８１）を安定してトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ
１細胞類上で検査した。これら細胞のＣＣＲ５受容体による活性化は下記のエク
オリン検定法で測定した。すなわち、細胞内カルシウムの増加を、Stables J.
ら、Anal. Biochem. 252巻115-126頁1997年に記載されているようにして測定し
た。ＣＣＲ５、ミトコンドリアのアポエクオリンおよびＧα１６を安定して発現
する各種ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、５ｍＭ ＥＤＴＡを補充したＣａ^２＋／Ｍｇ^２＋ なしのリン酸塩緩衝食塩水（Life Technologies, 米国メリーランド州ガイザー
スバーグ）を有するプレートから集め、１０００×ｇにて２分間遠心分離してペ
レット化し、次に、Ｄ−ＭＥＭ−Ｆ１２（Life Technologies,ベセスダ）中に、
密度：５×１０^６細胞／ｍｌで再び懸濁させた。０．１ｍｇ／ｍｌのウシ血清ア
ルブミンを含有するＤ−ＭＥＭ−Ｆ１２培地中、５μＭシレンテトラジンｈ（co
elenterazine h）（Molecular Probes, 米国オレゴン州ユージーン）とともに、
細胞を４時間室温でインキュベートすることによって、活性エクオリンを再構成
した。このインキュベーションの後、細胞を同じ緩衝液で１０倍希釈し、次に３
０分間撹拌してから測定した。次に、細胞懸濁液５０μｌを、検査される試料が
入っている９６ウェルのプレートに注入した。集積発光（integrated light emi
ssion）を３０ｓ間にわたってMicrobeta Jet（Wallac）またはMicrolumat lumin
ometer（ＥＧ＆Ｇ Berthold）で記録した。最終結果を、１μＭ ＡＴＰで得た
反応の百分率としてプロットした。精製されたペプチドＰＨＣ−１（ペプチドＨ
ＣＣ−１、残基９−７４の配列に相当する）は、ＣＣＲ５でトランスフェクトさ
れた細胞を強く活性化した（ＥＣ５０±ＳＥＭ：４．８±１．２ｎＭ）。比較す
る際、公知のβケモカインであるRantesとＭＩＰ１−αを陽性対照（positive c
ontrol）として使用した（それぞれＥＣ５０±ＳＥＭが２．４±０．５ｎＭまた
は３．３±０．８ｎＭであった）。比較したところ、ペプチドＨＣＣ−１、残基
１−７４とＨＣＣ−１、残基６−７４はＣＣＲ５でトランスフェクトされた細胞
に対し作用を全く示さなかった。

【００８４】 試験結果は、相対光単位（Relative Light Unit）（ＲＬＵ）で表す。記号は
結合パネルに対する同じケモカインを示す。結合と機能の検定結果は、少なくと
も三つの独立した実験を表している。

【００８５】実施例４：異なるケモカイン受容体に関するＰＨＣ−１の結合（結合検定とエク オリン検定） 処理されたケモカインＰＨＣ−１はアフィニティ結合で多様なケモカイン受容
体に結合した。

【００８６】 その結合特性を確認するため、ケモカイン受容体ＣＣＲ１、ＣＣＲ３、ＣＣＲ
５を安定してトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞を使用した。したがって
、各種ＧＰＣＲを発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞系から調製した粗製膜抽出物を放射
性リガンド結合検定法に使用した。競合結合検定を、Minisorpチューブ（Nunc,
Roskilde, デンマーク）中、トレーサーとしての０．１ｎＭヨウ素化リガンド、
各種濃度の競合体および規定量の膜を含有する全容積１００μｌ内で実施した。
全結合を競合体なしで測定し、非特異的結合を、１００倍過剰の非標識化リガン
ドで測定した。試料を２５℃で９０分間インキュベートし、次に０．３％ポリエ
チレンイミンに予め浸漬したＧＦ／Ｂフィルターで濾過した、フィルターは、γ
シンチレーションカウンター（Packard）で計数した。結合パラメータは、１サ
イト競合モデルに適用される非線形回帰分析を使用して、ＰＲＩＳＭソフトウエ
ア（Graphpad software, 米国カリフォルニア州サンディエゴ）で確認した。

【００８７】 処理されたケモカインＰＨＣ−１は、ＣＣＲ１に結合する^１２５Ｉ−Ｒａｎｔ
ｅｓの強力な競合体であり、ハーフマキシマル阻害濃度（half-maximal inhibit
ory concentration）が２．３±０．７ｎＭ（Ｋｉ±ＳＥＭ）であった。ＰＨＣ
−１は、ＣＣＲ３に結合する^１２５Ｉ−エオタキシンの強力な競合体であり、ハ
ーフマキシマル阻害濃度が７８±１４ｎＭ（Ｋｉ±ＳＥＭ）であった。ＰＨＣ−
１は、ＣＣＲ５に結合する^１２５Ｉ−ＭＩＰ １−αの強力な競合体であり、ハ
ーフマキシマル阻害濃度が０．０４±０．０１ｎＭ（Ｋｉ±ＳＥＭ）であった。

【００８８】 ＰＨＣ−１の、ＣＣＲ１とＣＣＲ３に対する活性を検査した。ＰＨＣ−１は、
ＣＣＲ１に対してＲＡＮＴＥＳより活性が大きく（ＥＣ_５０±ＳＥＭ：６．３±
１．１ｎＭに比べて２．８±０．８ｎＭ）、かつＣＣＲ３に対して適度に優れた
アゴニストであったが（ＥＣ_５０：７８±１４ｎＭ）、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、Ｃ
ＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＸＣＲ１およびＣＸ３ＣＲ１に対し
ては不活性であった。

【００８９】 図２は、ＣＣＲ１、ＣＣＲ３およびＣＣＲ５に対して試験した化合物ＰＨＣ−
１、フルサイズのＨＣＣ−１および基準のケモカイン類を示す。競合結合検定を
、ＣＣＲ１に対し［^１２５Ｉ］−ＲＡＮＴＥＳで、ＣＣＲ３に対し［^１２５Ｉ］
−エオタキシンで、およびＣＣＲ５に対し［^１２５Ｉ］−ＭＩＰ−１で行った。
ＰＨＣ−１、ＨＣＣ１、ＭＩＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、エオタキシンおよびＭＣＰ
−４を競合体として使用した。

【００９０】 試験結果を、競合者（１００％）および非特異的結合（０％）なしでの結合に
ついて平均化した（normalize）。機能的エクオリンベース検定（右のパネル）
を、ケモカイン受容体、アポエクオリンおよびＧを発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を
使用して行った。

【００９１】実施例５：ＰＨＣ−１のカルシウム可動性と走化性の特性についての天然細胞集 団に対するＰＨＣ−１の生理活性 細胞の移動を、４８ウェルのマイクロ走化チャンバー法（microchemotaxis ch
amber technique）（Neuroprobe, 米国メリーランド州ガイサーズバーグ）で評
価した。そのチャンバーの下部コンパートメントに、０．１％ＢＳＡ培地のアリ
コート、または各種ケモカイン濃度（０．１％ＢＳＡ培地で希釈）各々のアリコ
ートを注入した。チャンバーの上部コンパートメントに、前に単離して、ＢＳＡ
培地で３回洗浄した細胞の５５μｌの細胞懸濁液（ＢＳＡ培地中５×１０^５細胞
／ｍｌ）を注入した。上記二つのコンパートメントは、ポリカーボネートＰＶＰ
Ｆフィルター（細孔径が被検細胞のタイプによって５μｍまたは８μｍであり、
３７℃にて２時間、２０μｇ／ｍｌのヒトコラーゲンタイプIVでコートされた）
で分離した。そのチャンバーを、５％ＣＯ_２含有湿潤空気中で３７℃にて３０−
１８０分間インキュベートした。インキュベーション期間が終了した後、フィル
ターを取り出し、固定し次いでDiff-Quikキットで染色した。

【００９２】 試験される各ケモカイン濃度について、前記フィルターを通過して下側に移動
する細胞を、光学顕微鏡法（試料をコードした後）で３回、三つのハイパワーフ
ィールド（high power field）（５００）で計数した。いくつもの実験の結果を
、移動反応を評価するため組合せ、そして移動力の変化が異なる実験間に観察さ
れたので、ケモカインの各濃度に対する反応を走化性インデックスとして示して
ある。各実験における走化性インデックスを、以下の比率：走化性インデックス
＝特定のケモカイン濃度に移動する細胞の数の平均値／ＢＳＡ培地に移動する細
胞の数の平均値（＝０ｎｇ／ｍｌケモカイン）を計算することによって評価した
。

【００９３】 データは、３−４回の実験の走化性インデックスの平均値と標準誤差（Ｓ．Ｅ
．）で示してある。移動するトランスフェクトされた細胞の数のベースラインレ
ベルはすべての被検細胞について類似の範囲内（１−５）であり、ハイパワーフ
ィールド当たり２−１８個の細胞の範囲内で平均６．７であった。細胞の大きさ
が大きく、そしてハイパワーフィールドの大きさで限定されるので、最大の応答
は、ハイパワーフィールド当たり７０−８０細胞まで限定された。ＢＳＡ培地に
対して反応する移動に比較して、各ケモカイン濃度に反応する移動のｐ値を、ス
チューデント検定法を使用して、移動する細胞の実際の数に基づいて計算した。

【００９４】 細胞内のカルシウムを測定するため、細胞を、室温で３０分間、Fura-2AMで負
荷した。カルシウムトランジェント（calcium transient）を、ＬＳ ５０Ｂ蛍
光分光光度計（Perkin Elmer）によって、G. Grynkiewicz, M. Poenie, R.Y. Ts
ien, J. Biol. Chem. 260巻3440頁1985年に記載されているようにして監視した
。

【００９５】 単球内に、ＰＨＣ−１は、ＲＡＮＴＥＳが誘発したのに匹敵する強力なカルシ
ウムフラックスを誘発した（図３Ａ）。５０ｎＭのＰＨＣ−１は、これらの細胞
を、同じリガンドによるさらなる刺激に対して完全に脱感作させ（データは示し
ていない）そして５０ｎＭ ＲＡＮＴＥＳに対するさらなる反応も排除したが、
ＰＨＣ−１は、ＲＡＮＴＥＳによる最初の刺激の後、依然として、低いレベルで
カルシウムを移動できた（図３Ａ）。フルサイズのＨＣＣ−１で刺激する前に、
ＭＩＰ−１βまたは高濃度のＲＡＮＴＥＳは、ＰＨＣ−１に対する反応を完全に
は消すことができなかった。類似の結果が、単球細胞系ＴＨＰ−１で得られた。
これらの結果は、ＣＣＲ１とＣＣＲ５が、単球の、ＰＨＣ−１に対する機能的反
応の一部を仲介することを示唆している。単球による走化性検定で、ＰＨＣ−１
はＲＡＮＴＥＳと同程度に強力（１０ｎＭで最大の移動が観察された）でかつ有
効であった。ＰＨＣ−１はフルサイズのＨＣＣ−１の１００倍も強力であった。
フルサイズのＨＣＣ−１は弱いが有効な化学誘引物質のようである（C. L. Tsou
ら、J. Exp. Med. 188巻603頁1998年）。ＰＨＣ−１は、好酸球中で、カルシウ
ムを移動させるのにエオタキシンより有効性が低い（図３Ｂ）。エオタキシンの
反応は、ＰＨＣ−１に対する前の暴露の後、わずかに低下したが、ＰＨＣ−１の
活性は、エオタキシンの刺激の後、変化せず（図３Ｂ）そしてＭＩＰ−１αの刺
激の後、強く阻害された。これらの結果は、ＰＨＣ−１の、ＣＣＲ３の弱いアゴ
ニストとしての役割を立証し、好酸球のＰＨＣ−１に対する機能的反応に、ＣＣ
Ｒ１がかかわっていることを支持している。走化性検定で、ＰＨＣ−１は、大部
分のドナー由来の好酸球上のエオタキシンより強さは低いが、効力はほとんど同
じであった。しかし、ドナーの中の一人の場合、ＨＣＣ−１は高濃度の場合だけ
、走化性が弱かったが、このことは、幾人かの個体由来の好酸球に観察された低
いＣＣＲ１の発現が原因である（I. Sabroeら、J. Immunol. 162巻2946頁1999年
）。ＰＨＣ−１は、インターロイキン−２で調整されたリンパ芽球中のカルシウ
ムを移動させたがフルサイズのＨＣＣ−１は移動させなかった。完全なクロス脱
感作（cross-desensitization）がＰＨＣ−１に対する反応とＭＩＰ−１βに対
する反応の間に観察された。このことは、ＣＣＲ５が、これらの細胞内でＰＨＣ
−１によって使用される主な受容体であることを示している。リンパ芽球の移動
は、ＰＨＣ−１およびＭＩＰ−１αによって刺激されたが、フルサイズのＨＣＣ
−１によっては刺激されなかった（図３Ｃ）。またＰＨＣ−１は、好中球中の小
さなカルシウムフラックスおよびＲＡＮＴＥＳによるこの反応の脱感作を誘発し
たが、ＭＩＰ−１βはＣＣＲ１を必要としなかった。好中球の走化は、フルレン
グスのＨＣＣ−１またはＰＨＣ−１によって全く観察されなかった。

【００９６】 図３に示すように、単球、好酸球およびＩＬ−２で刺激されたリンパが球を、
ＰＨＣ−１、フルサイズのＨＣＣ−１および基準ケモカイン類に対するそれらの
機能的反応について検査した。図３に示すカルシウムの可動性とクロス脱感作を
刺激する実験を、５０ｎＭのケモカイン濃度で実施した。上記細胞をFura-2AMに
負荷し、次に細胞内カルシウム濃度（［Ｃａ^＋＋］_ｉ）を、放射蛍光測定法（Ｒ _{３４０／３８０} ）によって監視した。走化性検定を、ポリカーボネート製フィル
ター膜を使用して４８ウェルチャンバー内で実施した。ＰＨＣ−１、ＨＣＣ−１
、ＲＡＮＴＥＳ、エオタキシンまたはＭＩＰ−１に反応する細胞の移動を、移動
インデックスとして報告してある。

【００９７】実施例６：ヒト細胞中へのＨＩＶ−１の侵入／ヒト細胞中でのＨＩＶ−１の複製 のＰＨＣ−１による阻害 処理されたケモカインＰＨＣ−１は、ＨＩＶ複製の強力なインヒビターである
。該ペプチドは、ＨＩＶ−１侵入の補因子に結合して、細胞培養物中でのウイル
スの複製を有効に阻害した。ＰＨＣ−１の抗ウイルス活性は感染阻害検定法で研
究した。Ｐ４−ＣＣＲ５細胞（NIH AIDS Research and Reference Reagent prog
ram）（P. Charneauら、J. Mol. Biol. 241巻651頁1994年）を、１０％ＦＣＳと
１μｇ／ｍｌのプロマイシンを補充したＤＭＥＭ内で増殖させた。細胞を、平底
の９６ウェル皿に接種し、一夜培養し、次にケモカインと共に２時間インキュベ
ートしてから、５０μｌの培地の全容積中に２０ｎｇのｐ２４抗原を含有するウ
イルスを感染させた。一夜インキュベートした後、細胞を２回洗浄し、次にケモ
カインなしの新しいＤＭＥＭ内で培養した。感染させてから３日後、細胞を溶解
してβ−ガラクトシダーゼの活性を測定した。ＰＢＭＣを、リンパ球分離培地（
Organon Teknika Corporation）を使用して単離した。細胞を、２０％ＦＣＳと
５０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含有するＲＰＭＩ １６４０培地内で培養して、ウイ
ルス産生量を、A. AldoviniおよびB.D. Walker編「Techniques in HIV Research
」１９９０年米国ニューヨーク州ストックトン103-106頁のB.J. Pottsの論文に
記載されている逆転写酵素検定法で測定した。ＨＣＣ−１［９−７４］とＲＡＮ
ＴＥＳの両者は、マクロファージ刺激株ＹＵ２の感染を阻害した（図４ａ）。Ｒ
ＡＮＴＥＳは、Ｐ４−ＣＣＲ５細胞のＹＵ２感染を、３．２μＭで９５％を超え
て、および１．３μＭで５０％、減らした。ＨＣＣ−１［９−７４］は、わずか
により有効であり、０．５μＭでＹＵ２の感染を５０％阻害した。類似の試験結
果が、マクロファージ刺激株ＪＲ−ＣＳＦを使用して得られた。フルレングスの
ＨＣＣ−１によるＹＵ２感染に対する阻害作用は全く観察されなかった。前記３
種のケモカインはいずれも、Ｔ刺激株ＮＬ４−３を阻害しなかった（図４ｂ）。
以前に刊行された試験結果^８と一致して、ＲＡＮＴＥＳは、０．６μＭを超える
濃度で、ＮＬ４−３の感染力を約５０％高めた。対照的に、ＨＣＣ−１［９−７
４］による感染力を高める作用は全く観察されなかった（図４ｂ）。また、我々
は、ＨＣＣ−１［９−７４］が、ヒトの未梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中でＨＩＶ
−１が複製するのを阻害できるかどうかを検査した。図４ｃと４ｄに示すように
、マクロファージ刺激株ＪＲ−ＣＳＦの複製は、ＨＣＣ−１［９−７４］とＲＡ
ＮＴＥＳによって、１２５ｎＭの濃度で有意に阻止されたがＹＵ２株の場合は６
２５ｎＭの濃度が必要であった。ＮＬ４−３の複製の阻害は全く観察されず、そ
してＨＣＣ−１はすべての株に対して無効であった。

【００９８】 図４に示すように、共受容体のＣＣＲ５とＣＸＣＲ４の両者を発現する細胞は
、ＨＣＣ−１、ＰＨＣ−１またはＲＡＮＴＥＳの存在下、ＣＣＲ５を利用するＹ
Ｕ２株およびＣＸＣＲ４を利用するＮＬ４−３株に感染させた。そのデータは、
３回実施した場合の平均値とs.e.m.を示す。Ｃ，ＤのヒトＰＢＭＣは、ＨＣＣ−
１、ＰＨＣ−１またはＲＡＮＴＥＳの存在下、ＹＵ２とＪＲ−ＣＳＦに感染させ
た。そのデータは、感染させてから１４日後に収穫した培養細胞上澄み液中に測
定した逆転写酵素の活性を示す。試験結果は、光で刺激されたルミネッセンス（
ＰＳＬ）単位として表してある。

【００９９】実施例７：ヒトケモカインＨＣＣ−１、アミノ酸残基１−７４をトリプシンで消 化することによる生理活性ＰＨＣ−１の生成 両方の新しく同定された生理的に活性のペプチドのアミノ酸配列はヒトケモカ
インＨＣＣ−１のＣ末端配列に一致しており、ＨＣＣ−１は当初、７４個のアミ
ノ酸残基を含有し、ヒト血漿中にナノモルの量で存在することがすでに報告され
ている（Schulz-Knappeら、Journ. Exp. Med. 183巻295-299頁1996年）。７４個
のアミノ残基を含有し、分子量が８６７３ＤａのケモカインＨＣＣ−１は、ＣＣ
Ｒ５受容体の活性化と結合に対して完全に不活性であり、そしてＣＣＲ１受容体
に対する周辺結合（marginal binding）（Ｋｉ １００ｎＭ）だけを示したので
、我々は、７４個のアミノ残基を含有するヒトケモカインＨＣＣ−１を、酵素ト
リプシンによって消化する際の遊離体として使用して、生物学的試験を行うのに
十分な量の６５個の残基のペプチドのＰＨＣ−１を得た。１時間インキュベート
した後［酵素／基質−比（ｗ／ｗ）１／１００］、前記７４個の残基のペプチド
を一部分解してより小さいフラグメントにした。一つの分解生成物として、ＨＣ
Ｃ−１の前駆体配列の残基９−７４を含有し、分子量が７７９５Ｄａの新しく同
定された生理的に活性のペプチドＰＨＣ−１を得た。本発明のペプチドは、分析
用逆相クロマトグラフィーの２ステップによって、同一性になるまで生成した（
純度＞９９％）。生理的に不活性のＨＣＣ−１、１−７４をトリプシンで消化し
て得たペプチドＰＨＣ−１を上記のようにして生物学的検定によって試験したと
ころ、十分な生理活性を示した（図２）。対照的に、ペプチドＨＣＣ−１の残基
１−７４とＨＣＣ−１残基６−７４は上記検定法で作用を全く示さなかった。

【０１００】実施例８：フルサイズのＨＣＣ−１を分解してＰＨＣ−１にするプロテアーゼの 同定 ＰＨＣ−１を生成するプロテアーゼの天然のソースを同定するため、いくつも
のヒト細胞形を選別した。１μＭフルサイズＨＣＣ−１を以下の８種の腫瘍細胞
系の培養培地に添加した。すなわちＰＣ−３（前立腺癌細胞系、ＡＴＣＣ＃ＣＲ
Ｌ−１４３５、１０％ウシ胎仔血清、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１ｍＭグル
タナート、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシ
ンを含有する栄養培地Ham's F12で増殖させた）；Ｄｕ−１４６または５２［腺
癌細胞系（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−８１）、１０％ウシ胎仔血清、１ｍＭピルビン酸
ナトリウム、１ｍＭグルタメート、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、および１００μ
ｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ培地で増殖させた］；１４３−
Ｂ（骨肉腫細胞系、ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−８３０３、１０％ウシ胎仔血清、１ｍＭ
ピルビン酸ナトリウム、１ｍＭグルタメート、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび
１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ培地で増殖させた）；
Ｍｅｌ−２２とＭｅＷｏ（黒色腫細胞系、１０％ウシ胎仔血清、１ｍＭピルビン
酸ナトリウム、１ｍＭグルタメート、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μ
ｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ培地で増殖させた）；ＭＣＦ−
７（腺癌細胞系、ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−２２、１０％ウシ胎仔血清、１ｍＭピルビ
ン酸ナトリウム、１ｍＭグルタメート、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００
μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ １６４０培地で増殖させた
）；ならびにＣＲＬ−１５５５（扁平上皮癌細胞系、ＡＴＣＣ＃Ａ４３１、１０
％ウシ胎仔血清、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１ｍＭグルタメート、１００Ｕ
／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するＲＰＭ
Ｉ １６４０で増殖させた）である。３７℃で４８時間インキュベートした後、
培養培地を遠心分離し、次いで、実施例３に記載したようにしてＣＣＲ５を発現
する細胞を使ってエクリオン検定法で検査した。図５は、ＰＣ−３、ＤＵ−１４
６および１４３−ＢがフルサイズのＨＣＣ−１を活性化したことを示している。
非特異的反応は、唯一、ＣＲＬ−１５５５培養培地で、フルサイズＨＣＣ−１を
添加することなしで達成された。また、これら異なる細胞系から得た血清なしの
ならし培地はフルサイズのＨＣＣ−１を活性化することができたが、これはプロ
テアーゼを生成するＰＨＣ−１が可溶性であったことを示している。ＰＣ−３は
多量のウロキナーゼを分泌するので、セリンプロテアーゼ、いく種類ものセリン
プロテアーゼインヒビターを、５００ｎＭのフルサイズＨＣＣ−１とともに３７
℃で６時間インキュベートしたＰＣ−３ならし培地で検査した。図６に示すよう
に、プロテアーゼインヒビターがすべて、フルサイズのＨＣＣ−１の活性化を低
下させた。３μｇ／ｍｌのＰＡＩ−１（特異的なウロキナーゼインヒビター）は
４ｍＭ Pefablocより有効であった。２μｇ／ｍｌアプロチニンは不活性であっ
た。さらに特異的な阻止ウロキナーゼ抗体（ヒトｕＰＡ Ｂ−連鎖に対するモノ
クローナル中和抗体３９４、米国 American Diagnostica）も、フルサイズＨＣ
Ｃ−１の活性化を阻害した。次に、精製したＣＨＯＡＹウロキナーゼ（Sanofi W
introp）を、５００ｎＭフルサイズＨＣＣ−１とともに３７℃で４０分間インキ
ュベートした。反応生成物を逆相ＨＰＬＣで精製して、諸画分を、ＣＣＲ５を発
現する細胞を用いてエクオリン検定法で検査した。次に活性画分を質量分析法と
エドマン分解法で分析して、ＰＨＣ−１とフルサイズのＨＣＣ−１をこれら画分
の主要化合物として同定した。上記のように、トリプシンによって生成したＰＨ
Ｃ−１は、インキュベーション時間が増大すると、ＰＨＣ−１を分解して不活性
のフラグメントにする。５０ｎＭ ＰＨＣ−１を、１０ ＩＵまたは１００ Ｉ
Ｕの精製ウロキナーゼとともにインキュベートした。３７℃で９０分間インキュ
ベートした後、活性の変化は全く観察されなかった。これはウロキナーゼがＰＨ
Ｃ−１を分解しないことを示している。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 化合物ＰＨＣ−１の、ヒトヘモ濾液からの精製を示す。

【図２】 機能的活性のｐＨ化合物の、ＣＨＯ−Ｋ１細胞内で発現されたヒト組み換え受
容体に対する結合を示す。

【図３】 一次細胞集団中のＰＨＣ−１化合物によって誘発されるカルシウムの可動性と
走化性を示す。

【図４】 ＨＩＶ−１の感染の阻害を示す。

【図５】 ＰＨＣ−１のタンパク質分解活性化のためのヒト細胞系の選別を示す。

【図６】 各種のセリンプロテアーゼインヒビターによる、ＰＨＣ−１のタンパク質分解
による生成の阻害を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 17/00 ４Ｈ０４５ Ａ６１Ｐ 9/00 17/06 9/10 １０１ 19/02 11/06 29/00 17/00 １０１ 17/06 31/00 19/02 31/04 29/00 31/12 １０１ 31/14 31/00 31/16 31/04 31/18 31/12 31/20 31/14 31/22 31/16 35/00 31/18 37/06 31/20 37/08 31/22 Ｃ０７Ｋ 14/47 35/00 Ｃ１２Ｎ 1/15 37/06 1/19 37/08 1/21 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/19 33/50 Ｚ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 5/00 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 37/547 33/50 37/24 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ファルスマン， ヴォルフ−ゲオルグ ドイツ， デー−3075 ハノーヴァー， ブリュッヘルシュトラーセ ５ (72)発明者 キルヒホフ， フランク ドイツ， デー−91054 エルランゲン， シュロスガルテン， ４ (72)発明者 シュテンドカー， ルドガー ドイツ， デー−30655 ハノーヴァー， ドーマイヤー ヴェク， 25 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA12 DA13 DA14 DA36 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 BA80 CA01 FA20 GA11 HA12 HA15 HA17 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ02 QQ03 QQ53 QQ79 QQ96 QR32 QR48 QR55 QS12 QS33 QS34 QX01 4B065 AA93Y AB01 AC14 BA02 BD01 BD14 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA07 AA13 AA17 AA27 BA01 BA08 BA20 BA23 BA44 CA53 CA62 DA01 DC01 DC05 NA14 ZA361 ZA362 ZA451 ZA452 ZA591 ZA592 ZA681 ZA682 ZA891 ZA892 ZA961 ZA962 ZB081 ZB082 ZB111 ZB112 ZB131 ZB132 ZB151 ZB152 ZB211 ZB212 ZB261 ZB262 ZB321 ZB322 ZB331 ZB332 ZB351 ZB352 ZC551 ZC552 4H045 AA30 BA10 BA53 CA40 EA20 EA51 EA52 EA53 FA74

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号：１と６０％を超える相同性を示す化合物であって
   、アミノ酸配列の配列番号：３、配列番号：４またはそれらの生理的に活性の、
   アミド化、アセチル化、リン酸化および／またはグリコシル化された誘導体と一
   致しない化合物。
2. 【請求項２】 配列番号：１と７５％を超える相同性を示す化合物であって
   、アミノ酸配列の配列番号：３、配列番号：４またはそれらの生理的に活性の、
   アミド化、アセチル化、リン酸化および／またはグリコシル化された誘導体と一
   致しない化合物である請求項１に記載の化合物。
3. 【請求項３】 配列番号：１と８５％を超える相同性を示す化合物であって
   、アミノ酸配列の配列番号：３、配列番号：４またはそれらの生理的に活性の、
   アミド化、アセチル化、リン酸化および／またはグリコシル化された誘導体と一
   致しない化合物である請求項１または２に記載の化合物。
4. 【請求項４】 配列番号：１と９５％を超える相同性を示す化合物であって
   、アミノ酸配列の配列番号：３、配列番号：４またはそれらの生理的に活性のア
   ミド化、アセチル化、リン酸化および／またはグリコシル化された誘導体と一致
   しない化合物であることを特徴とする請求項１−３のいずれか一つに記載の化合
   物。
5. 【請求項５】 アミノ酸配列の配列番号：１、配列番号：２またはそれらの
   生理的に活性のフラグメントもしくは部分を有することを特徴とするケモカイン
   化合物。
6. 【請求項６】 アミノ酸配列の配列番号：１、配列番号：２、またはその生
   理的に活性のフラグメントまたは部分を含有し、それらが一つ以上のアミド基、
   アセチル基、リン酸基および／またはグリコシル基で修飾されているかまたはこ
   れらの基と結合しているケモカイン化合物。
7. 【請求項７】 ケモカイン受容体、好ましくは、ＣＣＲ−１、ＣＣＲ−３お
   よびＣＣＲ−５受容体からなる群から選択される一つ以上の受容体に結合する請
   求項１−６のいずれか一つに記載のケモカイン化合物。
8. 【請求項８】 請求項１−７のいずれか一つに記載の化合物のアミノ酸配列
   をコードするポリヌクレオチド。
9. 【請求項９】 ケモカイン受容体、好ましくは、ＣＣＲ−１、ＣＣＲ−３お
   よびＣＣＲ−５ケモカイン受容体からなる群から選択される受容体に対する前記
   請求項のいずれか一つに記載の化合物またはその化合物のアミノ酸配列をコード
   するポリヌクレオチドのアンタゴニストまたはインヒビターであって、天然で知
   られている化合物でないアンタゴニストまたはインヒビター。
10. 【請求項１０】 （場合によっては標識される）抗体または抗体の活性超可
    変部分であることを特徴とする請求項９に記載のインヒビター。
11. 【請求項１１】 本発明の化合物をコードするｍＲＮＡ分子の翻訳を阻止す
    るため、前記ｍＲＮＡ分子と特異的にハイブリッドを形成できる少なくとも１５
    個のヌクレオチドからなる配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは
    リボザイム；または本発明の化合物をコードするＤＮＡ分子と特異的にハイブリ
    ッドを形成できて、場合によってはヌクレオチドの化学的類似体を含有するアン
    チセンスオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項９に記載のインヒビ
    ター。
12. 【請求項１２】 請求項８に記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
13. 【請求項１３】 請求項１２に記載のベクターによって形質転換された細胞
    。
14. 【請求項１４】 ケモカイン受容体、特にＣＣＲ−５ケモカイン受容体に対
    する前記請求項１−７のいずれか一つに記載の化合物のアゴニスト、アンタゴニ
    ストまたはインヒビターであることが知られていない分子を選別する方法であっ
    て、 − 前記受容体をコードするポリヌクレオチドを発現するベクターでトランス
    フェクトされた細胞またはその細胞からの細胞抽出物を接触させ、 − 場合によっては、本発明の化合物が前記受容体に結合できる条件下、場合
    によって機能応答を活性化することによって、本発明の化合物を含有する細胞抽
    出物または完全細胞から膜画分を分離し、次いで、 − かような化合物の存在を、前記化合物に対するアゴニスト、アンタゴニス
    トまたはインヒビターとして作用する分子の存在下、バイオアッセイ（例えば、
    修飾、第二メッセンジャーの産生または受容体活性の増大）によって検出し、そ
    の結果（場合によっては回収し次に）、その受容体に対する本発明の化合物のア
    ゴニスト、アンタゴニストまたはインヒビターとして前記分子が作用できるかど
    うかを確認する、 ステップを含んでなる方法。
15. 【請求項１５】 メッセンジャーアッセイが、細胞内ｃＡＭＰ、細胞内リン
    酸イノシトール、細胞内ジアシルグリセロールの濃度、アラキドン酸の濃度、Ｍ
    ＡＰキナーゼもしくはチロシンキナーゼの経路または細胞内カルシウムの可動性
    の測定を含むことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
16. 【請求項１６】 請求項１４または１５に記載の方法によって同定されそし
    て場合によっては回収される、請求項１−７のいずれか一つに記載の化合物のア
    ンタゴニストまたはインヒビター。
17. 【請求項１７】 請求項１−７のいずれか一つに記載の化合物、好ましくは
    、アミノ酸配列の配列番号：３または配列番号：４を有する化合物を分解してア
    ミノ酸配列の配列番号：１または配列番号：２にすることができるプロテアーゼ
    の再生に関与している分子。
18. 【請求項１８】 （好ましくは）組み換えのウロキナーゼまたはストレプト
    キナーゼである請求項１７に記載の分子。
19. 【請求項１９】 請求項１−７のいずれか一つに記載の化合物の生体外また
    は生体内での生成を改善するための請求項１７または１８の分子のインヒビター
    または活性化物質。
20. 【請求項２０】 適切な医薬担体ならびに請求項１−７に記載の化合物、請
    求項８に記載のポリヌクレオチド、請求項９または１６に記載のアンタゴニスト
    またはインヒビター、請求項１７または１８に記載の分子および／または請求項
    １９に記載の前記分子のインヒビターまたは活性化物質を含んでなる医薬組成物
    。
21. 【請求項２１】 ウイルスの感染によって誘発される疾患、特に、免疫不全
    ウイルス１および／または２（ＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２）または単
    純ヘルペスウイルス、水痘・帯状疱疹ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス類、Ｂ型肝炎
    ウイルス類、ザイトメガロウイルス、インフルエンザウイルス、ポリオウイルス
    、リノウイルス、はしかウイルス、風疹ウイルス、狂犬病ウイルス、ラウス肉腫
    ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ポックスウイルスからなる群から選択
    されるウイルス、細菌作用または原生動物によって誘発される疾患を予防および
    ／または治療する際の薬剤を製造するための請求項２０に記載の医薬組成物の使
    用。
22. 【請求項２２】 炎症（リウマチ様関節炎を含む）、癌（ホジキンリンパ腫
    を含む）、再狭窄、じゅく状硬化症、アレルギー（喘息を含む）、乾癬、慢性接
    触皮膚炎、炎症性腸疾患、多発性硬化症、卒中、類肉腫症、移植臓器の拒絶、Ｈ
    ＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２によるウイルス感染症（ＡＩＤＳ）を含む病
    原作用によって誘発される感染症からなる群から選択される疾患を予防および／
    または治療する際の薬剤を製造するための請求項２０に記載の医薬組成物の使用
    。
23. 【請求項２３】 請求項１−７に記載の化合物、請求項８に記載のポリヌク
    レオチド、請求項９または１６に記載のアゴニスト、アンタゴニストまたはイン
    ヒビター、請求項１７または１８に記載の分子および／または請求項１９に記載
    の前記分子のインヒビターまたは活性化物質を含んでなる診断用キットまたは装
    置。