JPH09508264A

JPH09508264A - 哺乳類単球化学誘引物質タンパク質レセプター

Info

Publication number: JPH09508264A
Application number: JP7519133A
Authority: JP
Inventors: チャロ、イスラエル; コフリン、シャァム
Original assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Current assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Priority date: 1994-01-13
Filing date: 1995-01-11
Publication date: 1997-08-26
Anticipated expiration: 2019-05-31
Also published as: US6132987A; US20040223968A1; JP3532570B2; AU1679395A; WO1995019436A1; US5707815A; US7803560B2; US20090123938A1; DE69535327D1; US20040219644A1; EP0740701B1; EP0740701A1; US7105641B2; ATE347594T1; DE69535327T2; EP0740701A4; US6730301B1

Abstract

(57)【要約】ヒトケモカインレセプターＭＣＰ−１Ｒ及びＭＣＰ−１ＲＢをコードするＤＮＡと、これらの発現方法が開示される。ＭＣＰ−１Ｒ遺伝子のオータネイティブスプライシング型産物であるレセプタータンパク質をアッセイに使用して、ＭＣＰ−１のアンタゴニストを同定することができる。このアンタゴニストは、単球の浸潤によって特徴付けられるアテローム硬化と他の疾患に治療的に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】哺乳類単球化学誘引物質タンパク質レセプター本発明は、単球の走化性及び活性化を仲介する新規のサイトカインレセプターと、このレセプターをコードするＤＮＡ配列と、組み換え遺伝子工学技術によってこのレセプターを得、作製する方法に関する。これらの新規のレセプターは、ＤＮＡ配列のオータネイティブスプライシング（alternative splicing）によって生じると思われる。本発明は政府の支援のもとに、米国国立衛生研究所より授与されたグラント番号ＲＯ１−ＨＬ４２６６２及びＲＯ１−ＨＬ４３３２２を受けて行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。発明の背景免疫系の細胞間にシグナルを送る調節タンパク質のファミリーが次々と同定されている。サイトカインと称されるこのタンパク質は、造血系及び免疫系細胞の成育、発達及び生物活性を制御することが見出されている。サイトカインは、骨髄、末梢血液、胎児の肝臓及び他のリンパ器官又は造血器官由来の標的細胞に対して広範囲の生物活性を示す。このファミリーの例示的なメンバーとしては、コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、インターロイキン−３）、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−１１）、インターフェロン（α、β及びγ）、腫瘍壊死因子（α及びβ）及びエリスロポエチンが含まれる。このタンパク質のファミリーの中には、ケモカイン又はインタークリンとも称される走化性サイトカインの発現グループが同定されている。これらのケモカインは、前期炎症性活性及び回復活性を有する塩基性ヘパリン結合タンパク質である。ケモカインは、その特徴的な保存単一オープンリーディングフレーム、Ｎ末端領域の典型的なシグナル配列、Ｃ末端未翻訳領域のＡＴ豊富配列及び迅速誘導性ｍＲＮＡの発現によって、前期炎症性活性及び回復活性を有する他のサイトカイン（ＩＬ−１、血小板由来の成長因子など）と区別される。例えば Wolpe，FA SEB J．3:2565-73（1989）及び Oppenheim，Ann．Rev．Immunol．9:617-48(1991 )を参照のこと。通常、ケモカインは８〜１０ｋＤ分子質量の範囲であり、ヒトでは染色体４及び１７上に位置(cluster)する独特な遺伝子の産物である。全てのケモカインは４つのシステイン残基を有し、２つのジスルフィド架橋を形成する。染色体位置とシステイン残基の構造に基づき、２つのサブファミリーのケモカインが認識されている。α、即ちＣ−Ｘ−Ｃサブファミリーメンバーに対するヒト遺伝子は、ヒト染色体４に位置する。このサブファミリーでは、第１の２つのシステインが１つのアミノ酸によって離されている。このサブファミリーのメンバーであるヒトタンパク質ＩＬ−８（インターロイキン−８）、βＴＧ（βトロンボグロブリン）、ＰＦ−４（血小板因子４）、ＩＰ−１０、ＧＲＯ（成長刺激因子、ＭＧＳＦとしても知られる黒色腫成長刺激因子）及びネズミのＭＩＰ−２（マクロファージ阻害タンパク質−２）は、第１の２つのシステイン残基がＣ− Ｘ−Ｃ構造を有する他に、アミノ酸配列において３０〜５０％の範囲のホモロジーを示す。 βサブファミリーでは、第１の２つのシステイン残基は互いに隣接してＣ−Ｃ構造で位置する。このβサブファミリータンパク質をコードするヒト遺伝子は、染色体１７に位置する（マウスの等価物は、ヒト染色体１７の等価物であるマウス染色体１１に位置する）。βサブファミリーのホモロジーは種内では２８〜４５％、種外では２５〜５５％の範囲である。例示的なメンバーには、ヒトタンパク質ＭＣＰ−１（単球化学誘引物質タンパク質−１）、ＬＤ−７８α及びβ、ＡＣＴ−２、ＲＡＮＴＥＳ、マウスタンパク質ＪＥ因子（ＭＣＰ−１のマウス相同物）、ＭＩＰ−１α及びβ（マクロファージ阻害タンパク質−１）ならびにＴＣＡ−３が含まれる。ヒトＭＣＰ−１とマウスＪＥ因子は、とりわけ単球にいくつかの影響を及ぼす。双方のタンパク質は in vitro でヒト単球に対する潜在的な化学誘引物質であり、サイトゾルでの遊離カルシウムの増加を刺激したり、単球においてレスピラトリーバーストを引き起こすことができる。ＭＣＰ−１は、殺腫瘍性活性を誘発すると共に、単球仲介腫瘍停止活性を活性化することが報告されている。例えば、Rollins，Mol．and Cell．Biol．11:3125-31（1991）及びWa lter，Int．J．Cancer 49:431-35(1991)を参照のこと。ＭＣＰ−１は、慢性関節リウマチ及び肺胞炎などの組織炎症過程の単球浸潤を仲介する点で重要な因子として関係している。例えば Koch、J．Clin．Invest．90:772-79（1992）及びJon es、J．Immunol．149:2147-54(1992)を参照のこと。また、この因子は、単球− マクロファージを漸増させアテローム硬化病変を発達させるのに重要な役割を果たしうる。例えば Nelken，J．Clin．Invest．88:1121-27（1991）、Yla-Herttu ala，Proc．Nat'l．Acad．Sci．USA 88:525256（1991）及びCushing，Proc．Nat l．Acad．Sci．USA 87: 5134-38（1990）を参照のこと。これらのケモカインの多くは分子的にクローン化され、異種で発現されて均質に精製されている。このうちのいくつかは、そのレセプターがクローン化されている。Ｃ−Ｘ−ＣケモカインＩＬ−８の非常に相同的な２つのレセプターがクローン化されており、これらが７つの膜貫通スパニングドメインを含むＧタンパク質結合レセプターのスーパーファミリーに属することが示された。Holmes，Scie nce 253:1278-80(1991)及び Murphy，Science 253:1280-83（1991）を参照のこと。より最近になって、Ｃ−ＣケモカインＭＩＰ−１αとＲＡＮＴＥＳのレセプターの分子がクローン化され、これが同一の７つの膜貫通スパニングレセプタースーパーファミリーに属することが示されている。Gao，J．Exp．Med．177:1421 -27(1993)及び Neote，Cell 72:415-25（1993）を参照のこと。白血球の活性化と走化性に関与すると考えられるこのレセプターは、リガンドに依存した様々な親和性とシグナル化の有効性を示す。このレセプターは、最も高い親和性と最良のシグナル化有効性でヒトＭＩＰ−１αと結合する。ＭＣＰ−１に対しては、このレセプターはＲＡＮＴＥＳ及びヒトＭＩＰ−１βと比較して高い親和性を示すが、より低い有効性でシグナルを送る。Neote,上掲書、421-22を参照のこと。薬理学研究によって特異的ＭＣＰ−１レセプターの存在が予想されたが、既にクローン化されたケモカインレセプターはＭＣＰ−１に対して単球の強力な反応を示すことができず、今日までにＭＣＰ−１に対して特異的なレセプターは報告されていない。Wang，J．Exp．Med．177:699-705（1993）及び Van Riper，J．Exp． Med．177:851-856(1993)を参照のこと。これが困難なのは、少なくともひとつには、ケモカインファミリーの個々のレセプターは複数のリガンドに結合したりしなかったりできるため、機能的な選別、追跡及び同定を行えないという事実による。今日までＭＣＰ−１レセプターが研究者の目を逃れている理由の説明として、このファミリーのレセプターメンバーが構造特性を共有し得ないということも考えられている。Edgington，Bio/Technology II:676-81(1993)を参照のこと。これらのケモカインに対する更なるレセプターが、当分野において未だ必要である。また、Ｃ−Ｃタンパク質の各々に対して特異的なレセプター、特にＭＣＰ −１に対する特異的なレセプターが、当分野において未だ必要である。ＭＣＰ− １に対する特異的なレセプターがないと、そのレセプターに対するＭＣＰ−１の結合アッセイを確立させる実用的な方法がない。このようなアッセイが利用可能になれば、ＭＣＰ−１／ＭＣＰ−１レセプターの相互作用のアンタゴニストを発見する強力な手段を提供できる。このようなアンタゴニストは、腫瘍の成長の抑制におけるアテローム硬化と、慢性関節リウマチ及び肺胞炎などの単球浸潤によって特徴付けられる他の疾患とを治療する療法の優れた候補となるであろう。発明の概要１つの態様において、本発明は新規のヒトケモカイン受容タンパク質ＭＣＰ− １ＲＡ及びＭＣＰ−１ＲＢを提供し、これらは天然の状態で通常、一緒に見出される他の哺乳類タンパク質を実質的に含まない。ＭＣＰ−１ＲＡ及びＭＣＰ−１ＲＢのアミノ酸配列は、５′未翻訳領域から推定第７膜貫通ドメインまで同一である（配列番号：２及び配列番号：４）が、これらは異なる細胞質尾部を有する。従って、これらはＭＣＰ−１遺伝子のオータネイティブスプライシング型を表すと思われる。これらのタンパク質は、組み換え遺伝子工学技術によって作製できる。これらは更に、この因子を本質的又は他の因子による誘発で産生する細胞源から精製できる。また、これらのタンパク質は化学的技術によっても合成できる。当業者は、上記の方法を組み合わせて適用することができる。活性成熟ＭＣＰ−１ＲＡは、成熟タンパク質の予想分子量が約４２，０００ダルトンとなるおよそ３７４アミノ酸のタンパク質である。このオータネイティブスプライス型であるＭＣＰ−１ＲＢは、約４１，０００ダルトンの分子量を有するおよそ３６０アミノ酸のタンパク質である。本発明のＭＣＰ−１Ｒタンパク質は、アフリカツメガエル(Xenopus)の卵母細胞中で発現させた場合ＭＣＰ−１に対して高い特異性を示す。本発明の別の態様は、ＭＣＰ−１ＲＡ及びＭＣＰ−１ＲＢタンパク質の発現をコードするＤＮＡ配列である（配列番号：１及び配列番号：３）。これらのＤＮＡ配列は、上述のＭＣＰ−１Ｒタンパク質の発現をコードする単離ＤＮＡ配列を含み得る。本明細書中に使用される場合、「単離した」とは、対象ＤＮＡ又はタンパク質配列が天然の、即ち内因性の状態で通常、一緒に見出される他の哺乳類ＤＮＡ又はタンパク質配列を実質的に含まない、という意味である。活性ＭＣＰ −１ＲＡ及び１ＲＢをコードするＤＮＡ配列は、各々図１及び図２（配列番号：１及び３）にあるように同一の又は実質的に同一のヌクレオチド配列あるいはその活性フラグメントを含むことで特徴付けられる。これらのＤＮＡ配列は、コード配列に隣接する５′及び３′非コード配列を含み得る。これらのＤＮＡ配列は、アミノ末端シグナルペプチドをコードしてもよい。図１及び図２は、ヒト単球細胞株ＭｏｎｏＭａｃ６から単離し、アフリカツメガエルの卵母細胞中で発現させた各々ＭＣＰ−１ＲＡ及び１ＲＢ配列の非コード５′及び３′フランキング配列とシグナル配列をそれぞれ示す。本発明のＤＮＡ配列が、これらのシグナル及び／又はフランキング配列のいくつか又は全てを排除し得ることは理解される。更に、生物学的に活性なヒトＭＣＰ−１Ｒタンパク質をコードする本発明のＤＮＡ配列は、図１又は図２の単離ＤＮＡ配列（配列番号：１及び３）に対して、適当に厳格な条件下でハイブリダイズ可能な、あるいはそのような条件下であるが遺伝暗号の縮重のためにハイブリダイズ可能なＤＮＡを含み得る。従って本発明のＤＮＡ配列は、対立遺伝子変異、種変異又は故意の修飾に基づいて非コード配列、シグナル配列又はコード配列における修飾を含み得る。更に、ＭＣＰ−１Ｒの類似体（アナログ）が提供され、この類似体は切断ポリペプチド、例えば、下記のように生物活性を維持したアミノ酸配列の変更を有する変異体を含み、これは、好ましくは図１又は図２のＭＣＰ−１Ｒ配列（配列番号：２及び４）の対応領域と少なくとも８０％、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％のホモロジーを有する。例としては、図１及び図２のＭＣＰ−１Ｒの天然アミノ酸配列（配列番号：２及び４）に対して微小のアミノ酸変更を有するポリペプチド、特に保守的アミノ酸置換物が含まれる。保守的置換物とは、側鎖において関連しているアミノ酸のファミリー内で行われるものをいう。遺伝学的にコードされたアミノ酸は、一般に４つのファミリーに分類される：（１）酸性＝アスパルテート、グルタメート；（２）塩基性＝リシン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；及び（４）非帯電極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、シスチン、セリン、トレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは、時として芳香族アミノ酸として共に分類される。例えば、ロイシンをイソロイシン又はバリンで、アスパラギン酸をグルタミン酸で、トレオニンをセリンで単離置換すること、あるいは構造的に関連したアミノ酸によるアミノ酸の同様の保守的置換は、活性又は機能性にさほど影響を与えない。図１及び図２の配列（配列番号：１、２、３及び４）とＭＣＰ−１Ｒレセプター分子の一般的に示される特性を使用して、当分野の技術範囲内でＭＣＰ−１Ｒをコードする他のポリペプチド又は他のＤＮＡ配列を得ることができる。例えば、構造遺伝子は、正しいアミノ酸を保持しながら個々のヌクレオチドを変えることによって、あるいは活性を損失させずにアミノ酸を修飾するようにヌクレオチドを変えることによって操作可能である。ヌクレオチドは、例えば in vitro 突然変異誘発及びプライマー修復を含む既知の技術によって、置換、挿入又は欠失され得る。構造遺伝子は、活性を保持しながら３′末端及び／又は５′末端で切断され得る。例えば、図１及び図２（配列番号：１及び２；配列番号：３及び４）にそれぞれコードされるＭＣＰ−１ＲＡ及びＭＣＰ−１ＲＢは、欠失が所望され得るＮ末端領域を含む。シグナル配列をコードする領域を除去し、及び／又はこの配列を異種配列で置換することも望ましい。ＭＣＰ−１Ｒ配列（配列番号：１及び３）の一部分、特にアミノ末端ドメインを含む部分を異種コード配列に連結し、従ってＭＣＰ−１ＲＡ又はＭＣＰ−１ＲＢのレセプター／リガンド特異性を有する融合ペプチドを作ることも望ましい。このような修飾を設計する際、ＭＣＰ−１Ｒ配列（配列番号：１、２、３及び４）の非保存領域に対する変化は活性に比較的小さな影響を及ぼすが、これに対し、保存領域での変化、特にアミノ末端ドメイン内又はその近傍の変化はより大きな影響を及ぼすと予想される。図４に示されるように、ＭＣＰ−１ＲＡ及び１ＲＢ（配列番号：２及び４）、ＭＩＰ−１α／ＲＡＮＴＥＳレセプター（配列番号：５）、オーファンレセプターＨＵＭＳＴＳＲ（配列番号：６）及び２つのＩＬ−８レセプター（配列番号：７及び８）のアミノ酸配列の対比により、レセプター活性に適合するアミノ酸置換への方向性が提供される。ＭＣＰ−１Ｒ配列（配列番号：２及び４）と他の配列（配列番号：５、６、７及び８）のうち少なくとも２つとに保存されるアミノ酸残基は、置換の候補であるとは予期されない。ＭＣＰ−１Ｒ配列と他の配列のうちの少なくとも２つとにおいて保守的変形を示す残基は、ＭＣＰ−１Ｒ配列と同様の保守的置換が可能であると予期される。同様に、ＭＣＰ−１Ｒ配列と他の配列のうちの少なくとも３つとにおいて非保守的に変形する残基は、保守的又は非保守的置換のいずれかが可能であると予期される。ＭＣＰ−１Ｒ配列に対する置換を設計する際、他の配列のうち１つの対比整列位置に見出されるアミノ酸によって置換されることが特に好ましい。本発明の実施は、他が示されない限り、当分野の技術範囲内である分子生物学、微生物学、組み換えＤＮＡ及び免疫学の慣用技術を用いるであろう。これらの技術は、文献中に十分に説明される。例えば、Sambrook，Molecular Cloning; A Laboratory Manual，Second Edition(1989); DNA Cloning，Volumes I and II( D．N．Glover，Ed．1985); Oligonucleotide Synthesis(M．J．Gait，Ed．1984) ; Nucleic Acid Hybridization(B．D．Hames 及び S．J．Higgins，Eds．1984); Transcription and Translation(B．D．Hames及び S．J．Higgins，Eds．1984) ; Animal Cell Culture(R．I．Freshney，Ed．1986); Immobilized Cell sand Enzymes(IRL Press，1986); B．Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning(1984); the series，Methods in Enzymology(Academic Press，Inc．) ; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J．H．Miller 及びM．P．Calos ，Eds．1987，Cold Spring Harbor Laboratory)，Methods in Enzymology，Volu mes 154 and 155(それぞれ Wu 及び Grossman，Wu，Eds.),(Mayer 及び Walker ，Eds.)(1987); Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology(Acad emic Press，London)，Scopes，(1987); Protein Purification: Principles an d Practice，Second Edition(Springer-Verlag，N．Y.); 及び Handbook of Exp erimental Immunology，Volumes I-IV（D．M．Weir及び C．C．Blackwell，Eds 1986）を参照のこと。本明細書の前述及び後述双方に記載の全ての特許、特許出願及び出版物は、本明細書中に援用される。本発明は更に、ベクターＤＮＡと、哺乳類ＭＣＰ−１ＲポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（配列番号：１及び３）とを含む組み換えＤＮＡベクターを提供する。このベクターは、選択された宿主細胞中でＭＣＰ−１Ｒの複製及び発現を指示可能な調節配列と機能的に会合したＭＣＰ−１ＲＤＮＡを提供する。組み換えＭＣＰ−１Ｒタンパク質の発現において使用されるこのようなベクターでトランスフォームされた宿主細胞も、本発明によって提供される。また、組み換えＭＣＰ−１Ｒタンパク質又はその活性フラグメントを生成する新規の方法が提供される。この方法では、ＭＣＰ−１Ｒタンパク質の複製及び発現を指示可能な適切な調節配列と機能的に会合したＭＣＰ−１Ｒタンパク質の発現をコードするＤＮＡ配列（配列番号：１及び３）を含む上述のベクターでトランスフォームされた宿主細胞株を、組み換えＤＮＡの発現を可能にする適当な条件下で培養する。次に、適切な慣用手段を用いて、発現タンパク質を宿主細胞又は培養培地から回収する。この新規の方法は、タンパク質の発現のための宿主細胞株として種々の既知の細胞を用いることができる。現在、好適な細胞株は、哺乳類細胞株と細菌細胞株である。本発明はまた、治療、診断、ＭＣＰ−１Ｒのアッセイ又はＭＣＰ−１Ｒに対する抗体作製に使用する組成物をも提供し、この組成物は上記の方法に従って調製された有効量のＭＣＰ−１Ｒタンパク質を含む。本発明の別の態様は、ＭＣＰ− １レセプターの特定のアンタゴニストをスクリーニングするのに有用な、ＭＣＰ −１結合を評価するアッセイを提供する。このようなアッセイは、組み換えＭＣＰ−１レセプター及び／又はその細胞外ドメインの発現及び単離工程と、ＭＣＰ −１結合の固相アッセイの確立を含む。以前では利用可能でなかったこのようなアッセイの有効性によって、アテローム硬化と、単球の浸潤によって特徴付けられる他の病気の治療に有用な治療アンタゴニストの確立が可能になる。従って、本発明の更なる態様は、本発明のアッセイを使用して同定された治療的に有効な量のＭＣＰ−１アンタゴニストを含む医薬組成物である。このようなＭＣＰ−１アンタゴニスト組成物は、アテローム硬化、癌及び単球の浸潤によって特徴付けられる他の疾患の治療に用いられ得る。従って、更なる態様として、本発明は、適切な医薬的キャリア中の治療的有効量のＭＣＰ−１アンタゴニスト又はその活性フラグメントを患者に投与することにより、これらの及び／又は他の疾患及び病理状態を治療する方法を含む。本発明の他の態様及び利点は、以下の詳細な説明に述べられる。図面の簡単な説明図１は、単離ＭＣＰ−１レセプタークローンであるＭＣＰ−１ＲＡのヒトｃＤＮＡ及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号：１及び配列番号：２）を示す。図２は、単離ＭＣＰ−１レセプタークローンであるＭＣＰ−１ＲＢのヒトｃＤＮＡ及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号：３及び配列番号：４）を示す。図３は、ＭＣＰ−１ＲＡ及びＭＣＰ−１ＲＢのｍＤＮＡについてプローブ処理 (probe)された造血細胞株のノザンブロット解析の結果を示す。図４は、ＭＩＰ−１α／ＲＡＮＴＥＳレセプター配列（配列番号：５）、オーファンレセプター配列ＨＵＭＳＴＳＲ（配列番号：６）及び２つのＩＬ−８レセプター配列（配列番号：７及び８）と整列されたＭＣＰ−１レセプターＡ（ＭＣＰ−１ＲＡ）の予想アミノ酸配列（配列番号：２）を示す。同一の残基は囲ってある。７つの推定膜貫通ドメインは、水平線で示している。整列を適正化するのに挿入したギャップは、ダッシュで示している。各配列のアミノ酸数は、配列の右側に配置してある。図５は、ＭＣＰ−１の存在下でのカルシウム流動化を測定することによってアッセイされたアフリカツメガエルの卵母細胞におけるＭＣＰ−１Ｒタンパク質の機能的発現をグラフで示したものである。図６は、遺伝子の発現とＭＣＰ−１に対する反応性を確認するために用いられた実施例４に記載のカルシウム流出アッセイの結果をグラフで示したものである。図７は、実施例５に詳しく記載する組み換えＭＣＰ−１ＲＢレセプターに対する¹²⁵１-ＭＣＰ−１の結合をグラフで示したものである。図８は、実施例５に詳しく記載するＭＣＰ−１ＲＢレセプター仲介カルシウム流動化実験の結果をグラフで示したものである。８Ａは、細胞内のカルシウム流動をＭＣＰ−１濃度（ｎＭ）の関数で示す。カルシウム一過性ピークは、ＭＣＰ −１の添加後４〜８秒でおこり、活性化から９０秒以内でベースラインに戻った。８Ｂは、ＭＣＰ−１で刺激したカルシウム流動化（ＥＣ₅₀＝３．４ｎＭ）と、他のサイトカインで刺激したカルシウム流動化の欠如を示す。８Ｃは、ＭＣＰ− １がＭＣＰ−１の二次添加に対する細胞を無反応化させたことを示す。詳細な説明Ｉ．序説本発明は、生物学的に活性であるヒトケモカインレセプターＭＣＰ−１ＲＡ及び１ＲＢを提供する。これらのレセプターは、天然の状態では通常会合している他の哺乳類タンパク質及びタンパク様物質を実質的に含まない。ＭＣＰ−１Ｒタンパク質は組み換え技術によって作製でき、潜在的なアンタゴニストをアッセイするのに有用な大量作製が可能となり、アテローム硬化及び癌、慢性関節リウマチなどの単球に関連する疾患を治療する療法の候補を同定できる。あるいは、ＭＣＰ−１Ｒタンパク質は、それを分泌又は発現する哺乳類細胞株から精製された同種タンパク質として得てもよいし、又は化学的に合成してもよい。ヒトＭＣＰ−１ＲＡを、ヒト単球白血病細胞株であるＭｏｎｏＭａｃ６（ＭＭ６）の誘導体から単離した。単球は大量に単離することが困難であり、１細胞あたり２０００未満の高親和性結合部位を発現するため、ＭＣＰ−１に対して十分に反応する細胞株を必要とした。反応が一様であることから、ＭＭ６細胞株を選択した。これは、DSM ジャーマン・コレクション・オブ・マイクロオーガニズム・アンド・セル・カルチャーズ（Masheroder Weg 1b，3300 Braunshweig，Germa ny）から入手できる。Ziegler-Heitbrock，Int．J．Cancer 41: 456(1988)も参照のこと。細胞を適当な培地で成育させ、次にＭＣＰ−１及び他のケモカインに対する反応における細胞内カルシウム変化についてテストした。前記の方法に従って、ＭｏｎｏＭａｃ６のｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製した。Vu， Cell 64: 1057-68（1991）を参照のこと。他のケモカインレセプターの第２及び第３の膜貫通ドメインとＨＵＭＳＴＳＲオーファンレセプターとの保存配列に対応する変性オリゴヌクレオチドプライマーを使用するポリメラーゼ鎖伸長反応（ＰＣＲ）ベースの方法を用いた（配列番号：５、６、７及び８を参照）。このプライマーを使用してＭＭ６細胞由来のｃＤＮＡを増幅して、７膜貫通レセプターと予期されるものにサイズが対応する多数のＰＣＲ産物を得た。サブクローン化したＰＣＲ産物の解析により、新規のレセプターをコードすると思われる１つのｃＤＮＡと共に、プライマーの設計に用いたレセプターの予想構造をコードするｃＤＮＡが明らかになった。このクローンの全長型を得るためにＭＭ６のｃＤＮＡライブラリーを構築(con struct)し、ＰＣＲ産物でプローブ処理した。２．１ｋｂの単離クローンを得、これをＭＣＰ−１ＲＡと称した。図１は、このクローンのｃＤＮＡ配列（配列番号：１）と予想アミノ酸配列（配列番号：２）を示す。このヌクレオチド配列（配列番号：１）は２２３２塩基対を含み、３９塩基対の５′非コード配列と１０７１塩基対の３′非コード配列を含む。ＭＣＰ−１ＲＡ配列は、２３位の開始メチオニンに続く３７４のアミノ酸をコードする単一の長いオープンリーディングフレームによって特徴付けられる。ＭＣＰ−１ＲＡのｃＤＮＡのヌクレオチド配列を、Genbank に記録されたヌクレオチド配列と比較した。ＭＣＰ−１α／ＲＡＮＴＥＳのレセプター、ＨＵＭＳＴＳＲオーファンレセプター及びＩＬ−８のコード配列（それぞれ配列番号：５、６、７及び８）にはホモロジーが見出された。ＭＣＰ−１ＲＡのコード配列とあらゆる他の公表ポリペプチド配列との間には、有意なホモロジーは認められなかった。ＭＣＰ−１ＲＡの予想アミノ酸配列（配列番号：２）は、７つの推定膜貫通ドメインと、４０残基の細胞外アミノ末端とを明らかにしている。ＭＣＰ−１ＲＡアミノ酸配列の更なる解析は、いくつかの興味深い特徴を示した。関連性のあるＭＩＰ−１α／ＲＡＮＴＥＳレセプターとＩＬ−８レセプターとのホモロジーにもかかわらず、ＭＣＰ−１ＲＡはアミノ末端とカルボキシル末端において有意なディバージェンス(divergence)を示している。図４（配列番号：２、５、６、７及び８）を参照のこと。更に、第３膜貫通ドメインの末端に区画されたＩＦＦＩＩＬＬで始まる３１のアミノ酸配列において、ＭＣＰ−１ＲＡとＭＣＰ−１α／ＲＡＮＴＥＳレセプターとの間に顕著な同一性が生じている。事前の生物学的特徴付けにより、ＭＣＰ−１ＲＡはナノモル濃度のＭＣＰ−１に対して強力で顕著な特異的反応を示すことが示されている。驚くことに、５００ナノモルの濃度でさえもＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ又はＩＬ −８によって反応は生じなかった。ＭＭ６のｃＤＮＡライブラリーの更なるクローンの解析により、５′未翻訳領域から推定第７膜貫通ドメインまでのＭＣＰ−１ＲＡ配列と同一であるが異なる細胞質尾部を含む第２の配列が明らかになった。ＭＣＰ−１ＲＢと称するこの第２の配列（配列番号：３及び４）は、ＭＣＰ−１ＲＡのオータネイティブスプライシング型であるように思われる。ＭＣＰ−１ＲＢを以下で更に特徴付ける。本明細書中で提供されるＭＣＰ−１Ｒポリペプチドは、図１及び図２のＭＣＰ −１ＲＡ及び１ＲＢ（配列番号：１、２、３及び４）のものと同様の配列でコードされるポリペプチドも含むが、修飾はこれらに自然に提供されるか又は故意に操作される。本発明はまた、ＭＣＰ−１レセプターに対して特異性を有するＭＣＰ−１Ｒポリペプチドの発現をコードする新規のＤＮＡ配列を含む。これらのＤＮＡ配列は、図１及び図２のＤＮＡ配列（配列番号：１及び３）と実質的に同一の配列及びその生物学的活性フラグメントと、図１及び図２のＤＮＡ配列（配列番号：１及び３）に対する厳格なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするような配列とを含む。Maniatis，Molecular Cloning(A Laboratory Manua l)，Cold Spring Harbor Laboratory(1982)，387-389を参照のこと。このような厳格な条件の一例は、４×ＳＳＣ、６５℃でのハイブリダイゼーション、次いで０．１×ＳＳＣ、６５℃、１時間での洗浄である。別の厳格なハイブリダイゼーション方式の例は、４×ＳＳＣ、４２℃で５０％のホルムアミドを使用する。ＭＣＰ−１Ｒポリペプチドをコードするが、遺伝暗号固有の縮重によりコドン配列が異なるＤＮＡ配列もまた本発明に含まれる。ＭＣＰ−１Ｒ活性（例えば、ＭＣＰ−１レセプターに対する特異性）を有するＭＣＰ−１Ｒポリペプチドをコードする図１及び図２のＭＣＰ−１ＲＤＮＡ配列（配列番号：１及び３）における対立遺伝子変異、即ち自然に生じる種間の塩基変化であり、アミノ酸の変化を生じたり生じなかったりするものもまた、本発明に含まれる。ＩＩ．本発明の実施の形態所望の成熟ポリペプチドを作製する方法は、次の技術を含むことができる。まず、ＭＣＰ−１Ｒポリペプチドをコードするベクターを宿主細胞に挿入し、ポリペプチドの生成可能な適切な培養条件下で宿主細胞を培養することができる。ＭＣＰ−１Ｒ遺伝子又はそのフラグメントは、哺乳類、昆虫又は微生物宿主中で発現できる。ＭＣＰ−１Ｒ遺伝子をコードするポリヌクレオチドを、用いられる宿主細胞のタイプに適合する適切な発現ベクターに挿入し、このベクター内の制御エレメントに操作可能に連結させる。ベクターの構築には、当分野に既知の技術を用いる。このような構築に関与する部位特異的ＤＮＡの切断は、市販の酵素製造者によって一般に特定される条件下において、適切な制限酵素で処理することにより行われる。適切な発現ベクターは、所望の機能（例えば、一過性発現、長期発現、組み込み(integration)、複製、増幅）に適合し、制御エレメントが宿主細胞に適合するものである。Ａ．哺乳類細胞における発現哺乳類細胞中での複製に適切なベクターは当分野で既知であり、ウイルス性レプリコン、即ちＭＣＰ−１Ｒをコードする配列の宿主ゲノムへの組み込みを確実にする配列、を含みうる。例示的なベクターには、サルウイルスＳＶ４０、レトロウイルス、ウシパピローマウイルス、ワクシニアウイルス及びアデノウイルス由来のものが含まれる。当分野で既知のように、異種ＤＮＡ、この場合にはＭＣＰ−１ＲＤＮＡは、例えば相同組み換え(homologous recombination)技術を使用してウイルスゲノムへ挿入される。この挿入は一般に、本来必須ではない、例えばチミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ）へ行われる。この遺伝子は選択可能マーカーをも提供する。組み換えウイルスの構築を大幅に容易にするプラスミドシャトルベクターが記載されている。（例えば、Mackett ら(1984); Chakrabartiら(1985); Moss（1987）を参照。）次に、異種ポリペプチドの発現が生きた組み換えウイルスで免疫した細胞又は個体中で生じる。このような適切な哺乳類発現ベクターは通常、外来のＤＮＡ配列の転写を仲介するプロモーターと、必要に応じてエンハンサーを含む。哺乳類細胞に適切なプロモーターは当分野で既知であり、これらには、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、アデノウイルス（ＡＤＶ）及びウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）由来のものなどのウイルス性プロンプターが含まれる。前述のプロモーターと合わせてエンハンサーを必要に応じて使用すると、普通発現レベルが増大する。エンハンサーは、内因性又は異種プロモーターに連結すると１０００倍までも転写を刺激して、通常のｍＲＮＡ開始部位からの合成を行うことができるあらゆる調節ＤＮＡ配列である。エンハンサーはまた、転写開始部位の上流又は下流に配置されても、向きが通常でも逆さでも、あるいはプロモーターから１０００ヌクレオチドを越えて離れていても活性である。Maniatis， Science 236:1237(1987)，Alberts，Molecular Biology of the Cell，2nd Ed． (1989)を参照のこと。ウイルス由来のエンハンサーエレメントは、通常広い宿主範囲を有するため、特に有用である。哺乳類細胞において有用な例としては、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー（Dijkema，EMBO J．4:761（1985）を参照）と、ＲＳＶの長末端反復（ＬＴＲ）由来（Gorman，Proc．Natl．Acad．Sci．79:6777 (1982b)を参照）及びヒトサイトメガロウイルス由来（Boshart，Cell 41:521(19 85)を参照）のエンハンサー／プロモーターが含まれる。更に、いくつかのエンハンサーはホルモン又は金属イオンなどの誘導因子の存在下でのみ調節可能であり活性になる（Sassone-Corsi 及びBorelli，Trends Genet．2:215(1986); Mani atis，Science 236:1237(1987)を参照）。更に発現ベクターは、ＭＣＰ−１Ｒコード配列に操作可能に連結される終止配列と、ポリ（Ａ）付加配列とを普通含みうる。選択可能マーカーをコードする配列と同様に、遺伝子の増幅を生じる配列もまた、発現ベクター、又はＭＣＰ−１ＲのＤＮＡ配列を含む発現ベクターと同時翻訳される別のベクターに含んでもよい。哺乳類細胞の選択可能マーカーは当分野で既知であり、例えばチミジンキナーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（メトトレキサートと共にＤＨＦＲ増幅体として）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、アスパラギンシンセターゼ、アデノシンデアミナーゼ、メタロチオネイン、及び抗生物質例えばネオマイシン耐性遺伝子が含まれる。ＭＣＰ−１Ｒポリペプチドをコードするベクターは、適切な哺乳類宿主細胞のトランスフォーメーションに使用できる。トランスフォーメーションは、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するあらゆる既知の方法によって可能であり、例えばウイルスへのポリヌクレオチドのパッケージング、このウイルスによる宿主細胞の導入が含まれる。使用するトランスフォーメーションの手順は、トランスフォームされる宿主に依存する。異種ポリヌクレオチドの哺乳類細胞への導入方法は当分野で既知であり、デキストラン仲介横断、カルシウムリン酸塩沈降、ポリブレン仲介横断、プロトプラスト融合法、電気穿孔法、リポソームによるポリヌクレオチドの被包、及び核へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションを含む。発現用の宿主として利用可能な哺乳類細胞株は当分野で既知であり、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から利用可能な多くの不死化細胞株を含み、これらの不死化細胞株には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えばＨｅｐＧ２）及び多数の他の細胞系が含まれるがこれらに限定されない。Ｂ．昆虫細胞における発現昆虫細胞における発現の場合、概して発現系の構成要素は、転移ベクター、通常バクテリアプラスミドを含み、これは、バキュロウイルスゲノムのフラグメントと発現すべき異種遺伝子の挿入のための簡便な制限部位との双方；転移ベクター中に、バキュロウイルス特異的フラグメントに対して相同な配列を有する野生型バキュロウイルス（これにより、バキュロウイルスゲノムへの異種遺伝子の相同組み換えが可能になる）；ならびに適切な昆虫宿主細胞及び増殖媒体を含む。外来遺伝子を昆虫細胞へ導入する例示的な転移ベクターは、ｐＡｃ３７３とｐＶＬ９８５を含む。Luckow及びSummers，Virology 17:31(1989)を参照のこと。また、プラスミドは通常、多角体ポリアデニル化シグナルと、原核性アンピシリン耐性遺伝子（ａｍｐ）と、E．Coli での選択及び増殖のための複製開始点とを含む。Miller，Ann．Rev．Microbiol．42:177(1988)を参照のこと。バキュロウイルス転移ベクターは通常、バキュロウイルスプロモーター、即ちバキュロウイルスＲＮＡポリメラーゼが結合して、コード配列（例えば、構造遺伝子）の下流（５′から３′）への転写を開始してｍＲＮＡとすることができるＤＮＡ配列を含む。プロモーターは通常、コード配列の５′末端付近に位置する転写開始領域を有する。この転写開始領域は通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位と転写開始部位とを含む。バキュロウイルスはエンハンサーを有することもでき、存在する場合、エンハンサーは構造遺伝子から通常遠く離れている。発現は調節したものでもよいし、あるいは本質的でもよい。Ｃ．微生物における発現−酵母及び細菌真菌発現系は、酵母及びフィラメント状真菌宿主の双方を使用できる。フィラメント状真菌発現系の例には、ＥＰ特許公開番号 357 127（１９９０年３月７日公開）に記載の Aspergillusと、ＥＰ特許公開番号 376 266（１９９０年７月４日公開）に記載の Acremonium Chrysogenum がある。酵母発現系は通常、次のうちの１以上を含みうる：プロモーター配列、融合パートナー配列、リーダー配列、転写終止配列。酵母ＲＮＡポリメラーゼを結合して、コード配列（例えば、構造遺伝子）の下流（３′）への転写を開始してｍＲＮＡにすることができる酵母プロモーターは、通常、コード配列の５′末端付近に位置した転写開始領域を有する。この転写開始領域は普通、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位（ＴＡＴＡボックス）と転写開始部位とを含む。酵母プロモーターは通常、構造遺伝子から遠く離れている上流アクチベーター配列を有することもできる。アクチベーター配列は、所望の異種ＤＮＡ配列の誘導発現を可能にする。本質的な発現は、アクチベーター配列の非存在下で生じる。調節発現は正調節又は負調節のいずれでもよく、従って転写を促進又は減少させることができる。特に有用な酵母プロモーター配列は、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）（ＥＰ特許公開番号 284 044）、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース−６ −リン酸イソメラーゼ、グリセロアルデヒド−３−リン酸−デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ又はＧＡＰＤＨ）、ヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ及びピルビン酸キナーゼ(ＰｙＫ)(ＥＰ特許公開番号 32 9 203)を含む。酸性ホスファターゼをコードする酵母ＰＨＯ５遺伝子もまた、有用なプロモーター配列を提供する。Myanohara，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 80 :1（1983）を参照のこと。ＭＣＰ−１Ｒ遺伝子又はその活性フラグメントは、酵母の細胞内で発現させることができる。プロモーター配列はＭＣＰ−１Ｒ遺伝子又はフラグメントと直接連結でき、この場合、組み換えタンパク質のＮ末端の最初のアミノ酸は常にメチオニンであり、これはＡＴＧ開始コドンによってコードされる。所望するなら、シアノゲンブロマイドと共にin vitroでインキュベートすることにより、Ｎ末端でメチオニンをタンパク質から切断することができる。細胞内発現した融合タンパク質は、ＭＣＰ−１Ｒ配列の直接発現の代わりとなるものを提供する。通常、安定性タンパク質のＮ末端部分、即ち融合パートナーをコードするＤＮＡ配列は、所望のポリペプチドをコードする異種ＤＮＡの５′ 末端に融合される。発現の際に、この構築物はこれらの２つのアミノ酸配列の融合物を提供する。例えば、酵母又はヒトのスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）遺伝子はＭＣＰ−１Ｒ配列の５′末端で連結でき、酵母中で発現できる。これらの２つのアミノ酸配列の接合部のＤＮＡ配列は、切断可能部位をコードしてもしなくてもよい。例えば、ＥＰ特許公開番号 196 056を参照のこと。あるいは、酵母又は細菌のＭＣＰ−１Ｒポリペプチドの分泌を提供するリーダー配列フラグメントを含む融合タンパク質を作ることによって、ＭＣＰ−１Ｒポリペプチドを細胞から増殖媒体内に分泌させることもできる。好ましくは、リーダーフラグメントとＭＣＰ−１Ｒ配列（配列番号：１及び３）との間にコードされ、in viv o 又は in vitro のいずれかで切断されることができるプロセシング部位が存在する。リーダー配列フラグメントは普通、細胞からのタンパク質の分泌を指示する疎水性アミノ酸を含むシグナルペプチドをコードする。適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは分泌酵母タンパク質の遺伝子由来とすることができ、例えば酵母インベルターゼ遺伝子(ＥＰ特許公開番号 12 873)及びＡ−因子遺伝子（米国特許第 4,588,684号）である。あるいは、非酵母起源のリーダー、例えばインターフェロンリーダーを使用して酵母における分泌を提供することができる（ＥＰ特許公開番号 60057）。酵母によって認識される転写終止配列は、翻訳停止コドンの３′側に位置する調節領域である。この領域は、プロモーターと共に所望の異種コード配列に隣接する。これらのフランキング配列はｍＲＮＡの転写を指示し、ＭＣＰ−１ＲＤＮＡによってコードされたＭＣＰ−１Ｒに翻訳され得る。通常、プロモーター、リーダー（所望される場合）、対象コード配列及び転写終止配列を含む前述の成分は、宿主例えば酵母又は細菌において安定的に維持可能なプラスミドに共に配置される。プラスミドは２つの複製系を有することができ、シャトルベクターとして、例えば発現には酵母中で、クローニング及び増幅には原核宿主中で維持されることが可能である。このような酵母−細菌シャトルベクターの例として、ＹＥｐ２４（Botstein，Gene 8:17-24（1979）を参照）、ｐＣ１／１（Brake，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81:4642-4646（1984）を参照）及びＹＲｐ１７（Stinchcomb，J．Mol．Biol．158:157(1982)を参照）が含まれる。更に、プラスミドは高及び低コピー数プラスミドのいずれかであり得る。高コピー数プラスミドは一般に約５〜約２００、普通約１０〜約１５０の範囲のコピー数を有する。高コピー数プラスミドを含む宿主は、好ましくは少なくとも約１０、より好ましくは少なくとも約２０を有する。ベクター及びＭＣＰ−１Ｒポリペプチドの宿主に対する影響によって、高及び低コピー数ベクターのいずれかを選択できる。例えば、Brake ら、上掲書を参照のこと。あるいは、組み込みベクターを用いて発現構築物を酵母ゲノムに組み込むことができる。組み込みベクターは普通、ベクターの組み込みを可能にする酵母染色体に対して相同な少なくとも１つの配列を含み、好ましくは発現構築物に隣接する２つの相同配列を含む。Orr-Weaver，Methods In Enzymol．101:228-245(1983 )及び Rine，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 80:6750(1983)を参照のこと。普通、染色体外及び組み込み発現ベクターは、トランスフォームされた酵母株を選択できるように選択可能マーカーを含むことができる。選択可能マーカーは、酵母宿主中で発現され得る生合成遺伝子を含むことができ、例えばＡＤＥ２、ＨＩＳ４、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＡＬＧ７及びＧ４１８耐性遺伝子であり、これらはツニカマイシン及びＧ４１８へのそれぞれの耐性を酵母細胞に与える。更に、適切な選択可能マーカーは、金属などの有毒化合物の存在下で成育する能力を酵母に提供することもできる。例えば、ＣＵＰ１の存在によって酵母が銅イオンの存在下で成育可能となる。Butt，Microbiol．Rev．51:351（1987）を参照のこと。あるいは、前記の成分のいくつかをトランスフォーメーションベクターに配置することができる。トランスフォーメーションベクターは普通選択可能マーカーを含み、選択可能マーカーは、前述のようにレプリコン中に維持されるか又は発展して組み込みベクターになるかのいずれかである。染色体外及び組み込みのいずれかである発現ベクター及びトランスフォーメーションベクターを発達させ、多くの酵母へのトランスフォーメーションを起こしている。例示的な酵母細胞株は、Candida albicans（Kurtz，Mol．Cell．Biol． 6:142(1986)）、Candida maltosa(Kunze，J．Basic Microbiol．25:141(1985)) 、Hansenula polymorpha（Gleeson，J．Gen．Microbiol．132:3459(1986)及び R oggenkamp，Mol．Gen．Genet．202:302(1986)）、Kluyveromyces fragilis（Das ，J．Bacteriol．158:1165(1984)）、Kluyveromyces lactis(De Louvencourt，J ．Bacteriol．154:737(1983)及びVan den Berg，Bio/Technology 8:135(1990)) 、Pichia guillerimondii(Kunze，J．Basic Microbiol．25:141(1985))、Pichia pastoris（Cregg，Mol．Cell．Biol．5:3376(1985)）、Saccharomyces cerevis iae(Hinnen，PROC．NATL．ACAD．SCI．USA 75:1929（1978）及びIto，J．Bacter iol．153:163(1983))、Schizosaccharomyces pombe（Beach及びNurse，Nature 3 00:706(1981)）及び Yarrowia lipolytica（Davidow，Curr．Genet．10:380471( 1985)及び Gaillardin，Curr．Genet．10:49(1985)）である。外因性ＤＮＡを酵母宿主に導入する方法は当分野で周知であり、これらの方法は普通、スフェロプラストのトランスフォーメーション及びアルカリカチオンで処理した無傷(intact)の酵母細胞のトランスフォーメーションのいずれかを含む。トランスフォーメーションの手順は通常、トランスフォームされるべき酵母種によって異なる。適切なトランスフォーメーション技術については、先の段落に記載の出版物を参照のこと。更に、ＭＣＰ−１Ｒ遺伝子又はそのフラグメントは細菌系において発現できる。このような系では、細菌プロモーターは、細菌ＲＮＡポリメラーゼに結合してコード配列（例えば、所望の異種遺伝子）の下流（３′）転写を開始してｍＲＮＡにすることができるあらゆるＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常コード配列の５′末端付近に位置する転写開始領域を有する。この転写開始領域は通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位と転写開始部位とを含む。細菌プロモーターはオペレーターと称する第２のドメインを有することもでき、これはＲＮＡ合成が開始する隣接ＲＮＡポリメラーゼ結合部位と重複することができる。遺伝子リプレッサータンパク質がオペレーターと結合でき、これにより特定遺伝子の転写を阻害するので、オペレーターは負調節（誘導）転写を可能にする。本質的発現は、オペレーターなどの負調節エレメントの非存在下で生じることができる。更に、正調節は遺伝子アクチベータータンパク質結合配列によって達成され得、この配列は、存在するならば、通常ＲＮＡポリメラーゼ結合配列付近（５′）に存在する。遺伝子アクチベータータンパク質の一例はカタボライトアクチベータータンパク質（ＣＡＰ）であり、これは Escherichia coli（E．coli）中の lacオペロンの転写開始を助成する。Raibaud，Ann．Rev．Genet．18:173（1984）を参照のこと。）従って、調節発現は正及び負のいずれでもよく、従って転写を促進又は減少させることができる。代謝経路酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、糖代謝酵素由来のプロモーター配列、例えばガラクトース、ラクトース(lac)(Chang，Nature 198:1056(1977)を参照)及びマルトースが含まれる。更なる例としては、生合成酵素由来のプロモーター配列、例えばトリプトファン (trp)(Goeddel，NUC．ACIDS RES．8:4057(1981)，Yelverton，Nuc．Acids Res． 9:731(1981)，米国特許第 4,738,921号、ＥＰ特許公開番号 36 776 及び121 775 を参照）が含まれる。■−ラクトマーゼ(bla)プロモーター系（Weissmann，Int erferon 3(ed．I．Gresser)を参照）、バクテリオファージλＰＬプロモーター系（Shimatake，Nature 292:128（128）を参照）及びＴ５プロモーター系（米国特許第 4,689,406号）も有用なプロモーター配列を提供する。更に、自然界では生じない合成プロモーターも細菌プロモーターとして機能する。例えば、ある細菌又はバクテリオファージプロモーターの転写活性化配列を別の細菌又はバクテリオファージプロモーターと結合させ、例えば tacプロモーターのような合成ハイブリッドプロモーターを作ることができる（米国特許第 4 ,551,433 号、Amann，Gene 25:167（1983）及び de Boer，Proc．Natl．Acad．S ci．80:21（1983）を参照）。細菌プロモーターは、細菌ＲＮＡポリメラーゼと結合して転写を開始する能力を有する非細菌起源の自然発生プロモーターを含むことができる。非細菌起源の自然発生プロモーターを、適合ＲＮＡポリメラーゼに結合させて、原核生物においていくつかの遺伝子の高レベル発現を生成することができる。例として、バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ／プロモーター系がある。（Studier，J．Mol．Biol．189:113（1986）及び Tabor，Proc． Natl．Acad．Sci．82:1074（1985）を参照。）機能的なプロモーター配列に加え、有効なリボソーム結合部位も、原核生物におけるＭＣＰ−１Ｒ又はそのフラグメントの発現に有用である。E．coli ではリボソーム結合部位はシャイン・ダルガーノ（ＳＤ）配列と称され、開始コドン（ＡＴＧ）と、開始コドンから３〜１１ヌクレオチド上流の長さ３〜９ヌクレオチドの配列を含む（Shine，Nature 254:34（1975）を参照）。ＳＤ配列は、ＳＤ配列及び３′末端の間の塩基とE．coli１６ＳｒＲＮＡのものとの対合によってｍＲＮＡのリボソームへの結合を促進させると考えられている（Steitz，Biolog ical Regulation and Development: Gene Expression(ed．R．F．Goldberger)(1 979)を参照）。ＭＣＰ−１Ｒタンパク質は、細胞内で発現できる。プロモーター配列はＭＣＰ −１Ｒ遺伝子又はそのフラグメントと直接連結することができ、この場合Ｎ末端の最初のアミノ酸は常にメチオニンであり、これはＡＴＧ開始コドンによってコードされる。所望ならば、シアノゲンブロマイドと共にin vitroでインキュベートするか、あるいは細菌メチオニンＮ末端ペプチダーゼと共にin vivo 又はin v itroのいずれかでインキュベートすることで、Ｎ末端でメチオニンをタンパク質から切断できる。ＥＰ特許公開番号 219 237を参照のこと。融合タンパク質は、直接発現の代わりとなるものを提供する。普通、外因性細菌タンパク質又は他の安定性タンパク質のＮ末端部分をコードするＤＮＡ配列は、異種ＭＣＰ−１Ｒコード配列の５′末端に融合される。発現の際に、この構築物はこれらの２つのアミノ酸配列の融合物を提供する。例えば、バクテリオファージλ細胞遺伝子はＭＣＰ−１Ｒ遺伝子又はそのフラグメントの５′末端で連結して、細菌中で発現できる。得られた融合タンパク質は、好ましくはプロセシング酵素（因子Ｘａ）のための部位を保持し、ＭＣＰ−１Ｒ遺伝子又はそのフラグメントからバクテリオファージタンパク質を切断する（Nagai,Nature 309:810（ 19 84）を参照）。融合タンパク質は、lac Ｚ遺伝子(Jia，Gene 60:197(1987))、tr p Ｅ遺伝子(Allen，J．Biotechnol．5:93（1987）及び Makoff，J．Gen．Microb iol．135:11(1989))及び Chey 遺伝子(ＥＰ特許公開番号324 647)由来の配列を用いて作製することもできる。これらの２つのアミノ酸配列の接合部のＤＮＡ配列は、切断可能部位をコードしてもしなくてもよい。他の例は、ユビキチン融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、好ましくはプロセシング酵素（例えば、ユビキチン特異的プロセシングプロテアーゼ）のための部位を保持してＭＣＰ−１Ｒポリペプチドからユビキチンを切断させるユビキチン領域を用いて作製される。この方法により、成熟ＭＣＰ−１Ｒポリペプチドを単離できる。 Miller，Bio/Technology 7:698（1989）を参照のこと。あるいは、細菌にＭＣＰ−１Ｒポリペプチドの分泌をもたらすシグナルペプチド配列フラグメントを含む融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を作るることによって、ＭＣＰ−１Ｒポリペプチドを細胞から分泌させることもできる。（例えば、米国特許第 4,336,336号を参照。）このシグナル配列フラグメントは通常、細胞からのタンパク質の分泌を指示する疎水性アミノ酸を含むシグナルペプチドをコードする。このタンパク質は、増殖媒体（グラム陽性細菌）と、あるいは細胞の内膜と外膜との間に位置するピロプラズマ種（グラム陰性細菌）とのいずれかに分泌される。好ましくは、シグナルペプチドフラグメントとＭＣＰ −１Ｒポリペプチドとの間にコードされ、in vivo 又は in vitro のいずれかで切断可能であるプロセシング部位が存在する。適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは分泌細菌タンパク質の遺伝子から派生させることができ、例えば E．coli外膜タンパク質遺伝子(omp Ａ)(Masui，Ex perimental Manipulation of Gene Expression(1983)及び Ghrayeb，EMBO J．3: 2437(1984))及び E．coliアルカリホスファターゼシグナル配列(pho Ａ)(Oka，P roc．Natl．Acad．Sci．82:7212(1985)を参照)がある。種々の Bacillus株由来のα−アミラーゼ遺伝子のシグナル配列は、B．subtilisからの異種タンパク質の分泌に使用できる（Palva，Proc．Natl．Acad．Sci．79:5582(1982)及びＥＰ特許公開番号 244 042を参照）。細菌によって認識される転写終止配列は、翻訳停止コドンの３′側に位置する調節領域である。これらの領域は、プロモーターと共にコード配列に隣接する。これらの配列は、ＭＣＰ−１ＲＤＮＡ配列（配列番号：１及び３）によってコードされるＭＣＰ−１Ｒポリペプチドに翻訳され得るｍＲＮＡの転写を指示する。転写終止配列はしばしば、転写の終止を助成するステムループ構造を形成することができる約５０ヌクレオチドのＤＮＡ配列を含む。例としては、E．coli におけるtrp 遺伝子及び他の生合成遺伝子のような強力なプロモーターを有する遺伝子から派生する転写終止配列が含まれる。普通、プロモーター、シグナル配列（所望される場合）、対象コード配列及び転写終止配列は、細菌宿主において安定的に維持することができる染色体外エレメント（例えばプラスミド）に維持される。プラスミドは複製系を有し、このため発現用あるいはクローニング及び増幅用の細菌宿主において維持可能となる。更に、プラスミドは高及び低コピー数プラスミドのいずれかとし得る。高コピー数プラスミドは一般に約５〜約２００、典型的には約１０〜約１５０の範囲のコピー数を有する。高コピー数プラスミドを含む宿主は、好ましくは少なくとも約１０、より好ましくは少なくとも約２０のプラスミドを含む。あるいは、組み込みベクターを用いて発現構築物を細菌ゲノムに組み込むことができる。組み込みベクターは通常、ベクターを組み込み可能にする細菌染色体に対して相同的な少なくとも１つの配列を含む。組み込みは、ベクター中の相同ＤＮＡと細菌染色体との間での組み換えにより生じると思われる。例えば、ＥＰ特許公開番号 127 328を参照のこと。通常、染色体外及び組み込み発現構築物は選択可能マーカーを含み、トランスフォームされた細菌株を選択可能にすることができる。選択可能マーカーは細菌宿主において発現され得、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリトロマイシン、カナマイシン（ネオマイシン）及びテトラサイクリンのような薬剤に対して細菌を耐性にする遺伝子を含むことができる（Davies，Ann．Rev．Microbiol ．32:469(1978)を参照）。選択可能マーカーは、生合成遺伝子例えばヒスチジン、トリプトファン及びロイシン生合成経路におけるものを含むこともできる。あるいは、上述の成分のいくつかをトランスフォーメーションベクターにおくことができる。トランスフォーメーションベクターは普通選択可能マーカーを含み、これは上述のように染色体外ベクター又は組み込みベクターに維持される。染色体外及び組み込みのいずれかである発現ベクター及びトランスフォーメーションベクターを発達させ、多くの細菌にトランスフォーム０００る。例示的なものは、Palva，Proc，Natl．Acad．Sci．79:5582(1982)、ＥＰ特許公開番号 03 6 259及び 063 953、ならびにＰＣＴ特許発行ＷＯ84/04541(B．subtilis に関して); Shimatake，Nature 292:128(1981)，Amann，Gene 40:183(1985)，Studier ，J．Mol．Biol．189:113（1986）及びＥＰ特許発行番号 036 776、136 829及び 136 907(E．coliに関して); Powell，Appl．Environ．Microbiol．54:655(1988) 及び米国特許第 4,745,056号（Streptococcus に関して）に開示される発現ベクターである。外因性ＤＮＡを細菌宿主に導入する方法は当分野で周知であり、これらの方法は通常、ＣａＣｌ₂、又は他の試薬、例えば二価カチオン及びＤＭＳＯで処理された細菌のトランスフォーメーションを含む。ＤＮＡは電気泳動により細菌細胞に導入することもできる。例示的な方法は、Bacillus トランスフォーメーションに関しては Masson，FEMS Microbiol．Let．60:273(1989)，Palva，Proc．Nat l．Acad．Sci．79:5582(1982),ＥＰ特許公開番号 032 259及び 063 953、ならびにＰＣＴ特許公開ＷＯ 84/04541 において見出すことができる。Campylobacter トランスフォーメーションに関しては、例えばMiller，Proc．Natl．Acad．Sci ．85:856（1988）及び Wang，J．Bateriol．172:949(1990)を参照のこと。E．co liに関しては、例えばCohen，Proc．Natl．Acad．Sci．69:2110(1973)，Dower， Nuc．Acids Res．16:6127(1988)，Kushner，Genetic Engineering: Proceedings of the International Symposium on Genetic Engineering(eds．H．W．Boyer 及び S．Nicosia)，Mandel，J．Mol．Biol．53:159（1970）及び Taketo，Bioch em．Biophys．Acta 949:318(1988)を参照のこと。Lactobacillus 及び Pseudomo nasに関しては、例えば Chassy，FEMS Microbiol．Let．44:173（1987）及びFie dler，Anal．Biochem．170:38（1988）をそれぞれ参照のこと。Streptococcu s に関しては、例えば Augustin，FEMS Microbiol．Let．66:203(1990)，Barany ，J．Bacteriol．144:698(1980)，Harlander，Streptococcal Genetics(ed．J． Ferretti 及び R.Curtiss III)(1987)，Perry，Infec．Immun．32:1295(1981)， Powell，Appl．Environ．Microbiol．54:655(1988)及び Somkuti，Proc．4th Ev r．Cong．Biotechnology 1:412（1987）を参照のこと。ＩＩＩ．発現ＭＣＰ−１Ｒタンパク質の発現及び検出ＭＣＰ−１Ｒ発現を得るため、ＭＣＰ−１Ｒコード配列（配列番号：１及び３）の発現を可能とする条件下で、トランスフォーマント由来の組み換え宿主細胞をインキュベートする。これらの条件は、選択する宿主細胞によって異なる。しかし、これらの条件は当分野で既知であるものに基づいて当業者が容易に認識できるものである。トランスフォームした宿主細胞において発現されたＭＣＰ−１Ｒタンパク質の検出を、いくつかの方法で達成できる。例えば、ＭＣＰ−１Ｒタンパク質が特異性を示す２塩基切断部位を含む蛍光遺伝子基質を使用する酵素活性（又は増加した酵素活性又は酵素活性の延長した寿命）によって検出を行うことができる。ＭＣＰ−１Ｒタンパク質は、抗ＭＣＰ−１Ｒ抗体との免疫反応性によっても検出可能である。ＩＶ．ＭＣＰ−１レセプターアンタゴニストの同定細胞レセプターの異なるリガンドは、生物的反応を誘発する能力に基づいて分類される。レセプターへの結合と反応の誘発(triggering)の双方が可能な物質はアゴニストと分類される。反対に、レセプターと結合できるが反応を誘発できないリガンドはアンタゴニストと分類される。アンタゴニストは、時折非常に有効に天然リガンド又はそのアゴニストと競合し、これにより機能的なレセプターの不活性化（レセプター拮抗作用）が生じる。アンタゴニストのような、ＭＣＰ−１レセプターのリガンドを同定する方法が提供される。この方法は、ＭＣＰ−１レセプターのＮ末端ドメインをコードする核酸配列（配列番号：１及び３を参照）を含む発現ベクターを用いて、哺乳類細胞株をトランスフェクトすることを含む。ＭＣＰ−１レセプターのＮ末端ドメインは、単独で又はＭＣＰ−１レセプターの他のドメインと組み合わせて発現され得る。他のドメインは、細胞外、細胞内又は膜貫通ドメインとし得る。更に、他のドメインが図４のもの（配列番号：５、６、７及び８）のような関連タンパク質からの対応ドメインである場合、キメラタンパク質が発現され得る。Ｎ末端ドメインはまた、天然ＭＣＰ−１レセプターの一部としても発現できる。固相アッセイ用の可溶性タンパク質が必要な場合、細胞外ドメインの発現が好ましい。アンタゴニストは、ＭＣＰ−１レセプターのＮ末端ドメインを発現する細胞を増殖させるために使用する培養培地に有効量の有機化合物を添加することによって同定される。有効量は、レセプタードメインに対するＭＣＰ−１の結合を遮断するのに十分な濃度である。レセプターに対するＭＣＰ−１の結合の損失は、種々の技術又は無傷細胞を使用して、あるいは固相アッセイにおいてアッセイが可能である。例えば、米国特許第 5,194,375号でＩＬ−７について記載されたものと同様の結合アッセイを使用し得る。このタイプのアッセイは、ＭＣＰ−１の標識化と、テストされている化合物の存在下又は非存在下におけるＭＣＰ−１レセプターと結合した標識量の定量とを含む。使用される標識は、例えば放射標識、例えば¹² ⁵ Ｉ又は蛍光遺伝子標識とすることができる。あるいはイムノアッセイを用いて、テストされている化合物の存在下又は非存在下における抗ＭＣＰ−１抗体を用いたＭＣＰ−１の免疫反応性の検出により、ＭＣＰ−１のレセプターに対するＭＣＰ−１の結合を検出し得る。イムノアッセイは、例えば抗体サンドイッチアッセイ又は酵素結合イムノアッセイを含みうる。このような方法は当分野で周知であり、Methods in Enzymology，Volumes 154 及び155(それぞれ、Wu及び Grossman,ならびに Wu，Eds.)(1987); Immunochemic al Methods in Cell and Molecular Biology（Academic Press，London）に記載されている。ＭＣＰ−１レセプターアンタゴニストを含む医薬組成物は、慢性関節リウマチ及び肺胞炎のような単球浸潤によって特徴付けられる疾患の治療に用いられ得る。アンタゴニストは、治療的に有効量のアンタゴニストと、医薬的に許容可能なビヒクルとを含む医薬組成物として投与される。このような医薬組成物は、医薬的に許容可能なキャリア、希釈液、充填剤、塩、緩衝液、安定剤及び／又は当分野で周知の他の物質を含むこともできる。「医薬的に許容可能な」という用語は、活性成分の生物活性の有効性を妨害せず、それが投与される宿主に対して毒性ではない物質を意味する。キャリア又は他の物質の特徴は、投与経路に依存する。投与は、様々な慣用方法で行うことができる。非経口投与が目下好適である。この場合、アンタゴニスト組成物は非発熱性、無菌で非経口的に許容可能な水溶液の形態とし得る。ｐＨ、等張性、安定性などに適切に関連する非経口的に許容可能な溶液の調製は、当分野の技術範囲内にある。しかし、活性アンタゴニスト組成物は慢性的状態を治療するのに長期間使用されることが予期されるため、長期的には経口投与が有利である。活性成分の量は状態の厳しさ、投与経路、アンタゴニストの活性に依存し、最終的には担当医師によって決定される。しかし、種々の医薬組成物はアンタゴニスト１ｍｌあたり約１０μｇ〜約１ｍｇを含むべきであると現在考えられている。本発明の治療方法を実施する際に、治療的に有効な量のアンタゴニスト組成物は、単球浸潤によって特徴付けられる状態を有するために、このような治療を必要とするヒト患者に投与される。「治療的に有効な量」という用語は、患者に有意な利益、即ち慢性的状態の治癒又は治癒速度の増大を示すのに十分な方法又は組成物の活性成分の総量を意味する。本発明のアンタゴニスト組成物の治療的に有効な用量は、投与される用量につき１ｍｌあたり約１０μｇ〜約１ｍｇの範囲が考えられる。投与される用量の数は、それぞれの患者及び状態の厳しさによって異なりうる。本発明は、その範囲を限定することなく、例示することを意図する次の実施例において更に説明される。Ｖ．実施例ＤＮＡの単離及び操作の標準的手順は、Sambrookら(1989)に基づく。プラスミドＤＮＡは、E．coli 株であるＨＢ１０１、Ｄ１２１０又はＸＬ−１ブルー（St ratagene）中で増殖させた。ＤＮＡ配列決定は、Ｍ１３プライマー及び特定の内部プライマーを使用してジデオキシ連鎖終結法（Sanger，1977）によって行った。実施例１ｃＤＮＡクローンのＰＣＲ同定ケモカインレセプター遺伝子ファミリーの新規メンバーを同定してクローン化するため、ＭＩＰ−１α／ＲＡＮＴＥＳレセプター、ＩＬ−８レセプター及びＨＵＭＳＴＳＲオーファンレセプターの第２膜貫通ドメインの保存配列ＮＬＡＩＳＤＬ（配列番号：１１）と第３膜貫通ドメインの保存配列ＤＲＹＬＡＩＶ（配列番号：１２）に対応する変性オリゴヌクレオチドプライマーを設計し、合成した (GenBank受託番号Ｍ９９２９３)。これらのプライマーを有するＭＭ６細胞由来のｃＤＮＡの増幅により、７膜貫通レセプターと予期されるものにサイズが対応する多数のＰＣＲ産物を得た。サブクローン化ＰＣＲ産物の解析により、プライマーの設計に用いたレセプターの予想フラグメントをコードするｃＤＮＡと、新規のタンパク質をコードすると思われる１つのｃＤＮＡとが明らかになった。このクローンの全長型を得るために、ｐＦＲＯＧにＭＭ６のｃＤＮＡライブラリーを構築し、ＰＣＲ産物を用いたハイブリダイゼーションによりプローブ処理した。２．１ｋｂのｃＤＮＡクローンを得た。ＭＭ６のｃＤＮＡライブラリーにおける追加クローンの解析により、５′未翻訳領域から推定第７膜貫通ドメインまで最初に得た２．１ｋｂのｃＤＮＡ配列と同一であるが、最初に得た２．１ｋｂのｃＤＮＡ配列とは異なる細胞質尾部を含む第２の配列が明らかになった。ライブラリーの２つの独立したクローンは２つの配列を含むことがわかり、これはＭＣＰ−１Ｒタンパク質のカルボキシル末端尾部のオータネイティブスプライシングを表すと思われる。この２つの配列はＭＣＰ−１ＲＡ及びＭＣＰ−１ＲＢ、即ち単球化学誘引物質タンパク質−１レセプターＡ及びＢと示され、単離した第１及び第２の配列をそれぞれ表す（配列番号：１、２、３及び４）。使用した物質及び方法の詳細を次に説明する。１．オリゴヌクレオチドの合成オリゴヌクレオチドアダプター、プローブ及びプライマーを、アプライド・バイオシステムズ社(Applied Biosystems，Foster City，CA)装置において製造者の指示に従って合成した。上記の第２及び第３膜貫通ドメインにおける保存配列に対応し、ＭＣＰ−１Ｒの同定に使用した５′末端のＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ制限部位を組み込む変性オリゴヌクレオチドプライマーは、27−mer，５′CGC TCG AGA CCT(G又はA)(G又はT)C(C又はA)(A,T又はG)T(T又はG)(T又はG)C(T又はC)GA CCT3′（配列番号：９）及び 31-mer ５′GC GAA TTC TGG AC(G又はA)ATG GCC A GG TA(C,A又はG)C(T又はG)G TC 3′（配列番号：１０）であった。２．ポリメラーゼ鎖伸長反応（ＰＣＲ）ヒト単球白血病由来のＭＭ６細胞（Weber，Eur．J．Immunol．23:852-59(1993 )を参照）を、DSM ジャーマン・コレクション・オブ・マイクロオーガニズム・アンド・セル・カルチャーズ(Masheroder Weg 1b，3300 Braunschweig，Germany )から得た。この細胞を１０％の胎児ウシ血清、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ及び抗生物質で補充したＲＰＭＩ−１６４０(GIBCO BRL，Grand Island，N.Y.)中で成育させた。Chomczynski 及び Sacchi の方法により、全ＲＮＡをＭＭ６細胞から単離した。Chomczynski，Anal．Biochem．162:156-59（1987）を参照のこと。オリゴｄＴセルロースカラム(ファルマシア社、Piscataway，N.J.)におけるアフィニティークロマトグラフィーにより、ポリＡ⁺ＲＮＡを得た。製造者の指示（ファルマシア社）に従って、５μｇのＭＭ６ポリＡ⁺ＲＮＡを用いて開始し第１鎖のｃＤＮＡ合成を行った。ＰＣＲ反応を最終濃度１μＭで上述のＰＣＲプライマー（配列番号：９及び１０）と約１０ｎｇ／ｍｌでＭＭ６のｃＤＮＡとを使用して９４℃、１分間でインキュベーションし、次に５０℃で２分、７２℃で１．５分で開始して、７２℃で４分間の最終延長工程で３０サイクル行った。１．５％のアガロースゲル上で２００〜３００の間の塩基対を移動するＰＣＲ産物を切り出してpBluescript（sk^- ）にサブクローン化し、Sanger，Proc Natl Acad Sci USA74:5463-67（1977）に記載されたように、蛍光標識付けしたジデオキシリボヌクレオチドを使用して配列決定した。配列解析により、プライマーの設計に用いたレセプターの予想フラグメントをコードするｃＤＮＡと、新規のタンパク質をコードすると思われる１つのｃＤＮＡとが明らかになった。以下のサブセクション３及び４で詳細を説明するように、このクローンの全長型を得るために適切な細胞株を選択し、ｃＤＮＡライブラリーをｐＦＲＯＧに構築し、このＰＣＲ産物を用いてプローブ処理した。３．ＭＭ６細胞株の同定単球は使用可能量で単離することが困難であり、１細胞あたり２０００未満の高親和性ＭＣＰ−１結合部位を発現するため、ＭＣＰ−１に対して優れた反応を示す培養細胞株を同定する必要があった。Vu，Cell 64:1057-68(1991)に記載されたカルシウム流出アッセイを使用して、種々の細胞株のＭＣＰ−１誘発カルシウム流動を測定した。未分化のヒトＨＬ−６０細胞及びヒト赤白血病（ＨＥＬ）細胞では、カルシウム流動は検出されなかった。これに対して、ＭＭ６細胞中では用量依存性カルシウム流動が検出され、４ｎＭのＭＣＰ−１で最大刺激の半分を示した。ＲＡＮＴＥＳに対する前接触によってＭＭ６細胞のＭＣＰ−１に対する反応を除去することはできなかったが、ＲＡＮＴＥＳに対する反応はＭＣＰ− １に対する前接触によって部分的に遮断された。ＲＡＮＴＥＳの代わりにＭＩＰ −１αを使用した場合にも同様の結果を得た。４．ＭＣＰ−１レセプターの発現クローニングＭＣＰ−１レセプターをクローン化するための全体的な手法は、レセプターをコードするＲＮＡをマイクロインジェクトしたアフリカツメガエルの卵母細胞に対するＭＣＰ−１反応性を与えることであった。この方法は、５−ＨＴ、トロンビン、ＩＬ８ＲＡ及びＭＩＰ−１α／ＲＡＮＴＥＳレセプターのクローン化にうまく用いられている。卵母細胞は妊娠したカエルから採取し、小胞細胞を取り除くためにコラゲナーゼで処理する。ｃＤＮＡライブラリーを細菌宿主細胞へ電気穿孔し、次に細菌宿主細胞は５，０００〜５０，０００コロニー／ペトリ皿のプールに分裂する。細菌の各プールからＤＮＡを調製し、直線状にする。採取１日後に、直線状ｃＤＮＡから転写したポリＡ⁺ＲＮＡ又はｃＲＮＡを卵母細胞にマイクロインジェクトし、２日間インキュベートしてタンパク質の発現をさせる。実験の日、卵母細胞に⁴⁵Ｃａを添加し、洗浄して取り込まれなかった⁴⁵Ｃａを除去し、次に潜在的なリガンドと共にインキュベートした。適切なリガンドの存在下で、⁴⁵Ｃａの有意な集注(afflux)が検出される。未注入の卵母細胞はコントロールとして使用される。最小１，０００，０００のコロニーをスクリーニングし（即ち、２０〜２００のプール）、陽性プールがある場合はそれを更に小さなプールに分け（同胞化し）、次にこれらのプールを個々にスクリーニングする。単一のクローンを得るまでこの方法を繰り返す。この非常に労力を有するアプローチに着手する準備として、ＴＨＰ−１及びＭＭ６細胞の大規模調製物由来のポリＡ⁺ＲＮＡを卵母細胞に注入したが、ＭＣＰ −１依存性シグナル化を与えることはできなかった。更に、個々のフラクションを卵母細胞に注入する前に、スクロース濃度勾配上での２００〜３００μｇのポリＡ⁺ＴＨＰ−１及びＭＭ６のＲＮＡのサイズ分画によって、より大きなｍＲＮＡ種を豊富化した。再び、卵母細胞におけるＭＣＰ−１依存性シグナル化は示されなかった。更に、ライブラリープールから転写された限定数のｃＲＮＡを注入しても、シグナル化を提供できなかった。これらの実験は、ＭＣＰ−１レセプターのメッセージは少ないことが最も予期され、実行可能な同胞選択によって発現クローニングさせるのに十分大きなプールサイズでは検出不可能であることを示唆した。このため、ポリメラーゼ鎖伸長反応（ＰＣＲ）主体の手法を行った。５．ＭＭ６ｃＤＮＡライブラリーの構築及びスクリーニング Vu，Cell 64:1057-68(1991)に記載されたように、ｃＤＮＡライブラリーをＳＰ６プロモーターのすぐ３′側にある約１００塩基の５′未翻訳アフリカツメガエルグロビン配列を含むｐＣＤＭ６の変形であるベクターｐＦＲＯＧに構築した。ＭＭ６のポリＡ⁺ＲＮＡからの第１鎖及び第２鎖の合成を行った後（上記サブセクション２を参照）、アガロースゲル電気泳動によって２ｋｂ又はそれより大きいｃＤＮＡをサイズ選択した。ｐＦＲＯＧベクターへの挿入のため、ＢｓｔＸＩリンカーを添加した。連結後、ｐＦＲＯＧをコンピテントＭＣ１０６１ｐ３細胞へ電気穿孔した。前記サブセクション２に記述したように単離した新規のＰＣＲ産物を使用して、Sambrook，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Seco nd Edition（1989）に記載されたように、非常に厳格な条件下で（５０％のホルムアミド、６×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、４２℃、１６時間）ハイブリダイゼーションによって総量１，０００，０００のコロニーをスクリーニングした。Sa nger，Proc．Natl．Acad．Sci．74:5463（1977）に記載されたように、蛍光標識付けしたジデオキシリボヌクレオチドを使用して、スクリーニングでの陽性物を配列決定した。Ａ形のレセプターを含む２つのｃＤＮＡクローンと、Ｂ形を含む２つのクローンを単離した。実施例２ｃＤＮＡ配列から推定されるＭＣＰ−１Ｒの構造ＭＣＰ−１ＲＡのｃＤＮＡの全配列（配列番号：１）とコード化アミノ酸配列（配列番号：２）を図１に示す。コード化タンパク質配列はｃＤＮＡ配列の下に示されている。ＭＣＰ−１ＲＢのｃＤＮＡ配列（配列番号：３）とコード化アミノ酸配列（配列番号：４）を図２に示す。慣用の順番付けを使用する。双方のＭＣＰ−１ＲＤＮＡの翻訳は、ＡＴＧ開始コドンで開始されると最も考えられる。これは、ｃＤＮＡの５′領域における唯一のインフレームＭＥＴコドンである。開始メチオニン（ＭＥＴ）に続いて、約４２，０００ダルトンの予想分子量を有する３７４のアミノ酸のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームがある。ＭＩＰ−１α／ＲＡＮＴＥＳレセプター、オーファンレセプターＨＵＭＳＴＳＲならびにＩＬ−８レセプター８ＲＡ及び８ＲＢの既知の膜貫通ドメインとの直接対比により、４８残基の細胞外アミノ末端が示される。膜貫通ドメインは、アミノ酸４９〜７０、８０〜７００、１１５〜１３６、１５４〜１７８、２０４〜２３１、２４４〜２６８及び２９５〜３１３に位置することが最もあり得る。これらは図４で、配列グループ物（配列番号：２、５、６、７及び８）の上の水平線によって示される。６１アミノ酸のカルボキシル尾部は、３１４位のセリンで開始する（図４を参照）。ＭＣＰ−１ＲＢのｃＤＮＡは、１位のＭＥＴから３１３位のアルギニンまでＭＣＰ−１ＲＡと同一のアミノ酸配列をコードし、開始ＭＥＴのすぐ５′側に３０の未翻訳ヌクレオチドを含む。しかし、ＭＣＰ−１ＲＢの推定アミノ酸配列（配列番号：４）は、ＭＣＰ−１ＲＡ（配列番号：２）の６１アミノ酸の細胞質尾部とは完全に異なる細胞質尾部を示す。ＭＣＰ−１ＲＢは、３１４アミノ酸位のアルギニンで始まり３６０位のロイシンで終わる４７のアミノ酸の細胞質尾部を有する。３１３位で生じるオータネイティブスプライシングは、５′未翻訳配列を含む２つのクローンの配列同一性と、３１３及び３１４アミノ酸位の間の推定ドナー接合部に位置する特徴的なＡＧ配列から推定できる。更に、ＭＣＰ−１ＲのＡ及びＢ両方に共通するｃＤＮＡが、非常に厳格な条件下において、ヒトゲノムＤＮＡのサザンブロット上で単一バンドにハイブリダイズし、ＭＣＰ−１ＲＡ及び１ＲＢにみられる双方のカルボキシル末端細胞質尾部をタンデムで含むＭＭ６ライブラリー由来の１つのｃＤＮＡクローンを得た。これは不完全に処理された (processed)ＲＮＡからの誘導を示唆する。ＭＣＰ−１のレセプターであるＭＣＰ−１Ｒは、７膜貫通レセプターファミリーにおけるレセプターのカルボキシル尾部のオータネイティブスプライシングの第２の既知の例にすぎない。Namba，N ature 365:166-70（1993）は、プロスタグランジン（ＰＧ）Ｅ２レセプターはオータネイティブにスプライシングされた４つのカルボキシル末端尾部を有し、これらの４つの間では配列ホモロジーが殆どないことを報告している。関連するＭＩＰ−１α／ＲＡＮＴＥＳ及びＩＬ−８レセプターは、イントロンが存在しないと考えられている。Holmes，Science 253:1278-80(1991); Murphy，Science 253 :1280-83(1991)及び Neote，Cell 72:415-25（1993）を参照のこと。ＭＣＰ−１ＲＡ及び１ＲＢの細胞質尾部を他のケモカインレセプターと共に整列させると、これらのレセプターのうちの１つ、即ちＭＣＰ−１ＲＢはＭＩＰ−１α／ＲＡＮＴＥＳレセプターの対応領域に対して相同することが明らかになった。ＭＣＰ− １ＲＡのカルボキシル尾部は、他の既知のタンパク質とは有意な同一性を示さなかった。造血細胞株のノザンブロットをSambrook，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Second Edition(1989)に記載されたように行い、ＭＣＰ−１Ｒクローンに対して各々をプローブ処理したところ、両ｍＲＮＡ種は単一の３．５ｋｂバンドとして移動した。図３を参照のこと。両ｍＲＮＡは、ＭＣＰ−１反応性細胞株ＭＭ６及びＴＨＰ−１細胞においておよそ同等のレベルで発現した。これらは共に、非反応性細胞株ＨＥＬ及びＨＬ−６０において発現しなかった。各々のｍＲＮＡの発現は、逆転写ＰＣＲによって新しく単離したヒト単球においても検出された。実施例３ＭＣＰ−１ＲＡ及び１ＲＢと他の７メンバー膜貫通レセプターとの類似性ＭＣＰ−１ＲＡ（配列番号：２）と、ＩＬ−８レセプターＲＡ及びＲＢ、ＭＩＰ−１α／ＲＡＮＴＥＳレセプターならびにオーファンレセプターＨＵＭＳＴＳＲ（それぞれ配列番号：７、８、５及び６）の配列の対比を図４に示す。新規のＭＣＰ−ＩＡレセプターの推定アミノ酸配列と他の７膜貫通タンパク質との対比により、このレセプターはＭＩＰ−１α／ＲＡＮＴＥＳレセプターと最も密接に関連しており、アミノ酸レベルで５１％の同一性を有することが明らかになった。ＩＬ−８レセプターＲＡ及びＲＢはアミノ酸レベルで３０％の同一性を示し、ＨＵＭＳＴＳＲオーファンレセプターはアミノ酸レベルで３１％の同一性を示した。この解折により、ＭＣＰ−１レセプターはアミノ末端及びカルボキシル末端ドメインにおいて、関連するＭＩＰ−１α／ＲＡＮＴＥＳレセプター及びＩＬ− ８レセプターから派生していることが明らかになった。ＭＣＰ−１ＡレセプターとＭＩＰ−１α／ＲＡＮＴＥＳレセプターとの間の顕著な同一性は、配列 IFFII LLTIDRYLAIV HAVFAL(K/R)ARTVTFGV（配列番号：１３及び１４）に認められ、これは第３膜貫通ドメインの末端で生じる（図４を参照）。ロドプシンの対応領域はＧ −タンパク質結合に関係することが知られており（Frankeら、Science 250:123( 1990)）、このドメインがＣ−Ｃケモカインのレセプターに共通するＧ−タンパク質活性化の態様を仲介しうることを示唆している。実施例４レセプター活性の確認機能的ＭＣＰ−１Ｒタンパク質の発現を確認し、ＭＣＰ−１レセプターＡ及びＢがＭＣＰ−１又は他のケモカインに反応性を示すかどうかを決定するために、カルシウム流出アッセイを行った。このアッセイでは、ＭＣＰ−１ＲＡ及び１ＲＢのｃＲＮＡをアフリカツメガエルの卵母細胞にマイクロインジェクトし、アゴニスト誘発カルシウム流動化の検出によってレセプターのシグナル化活性を測定した。ＭＩＰ−１α／ＲＡＮＴＥＳレセプター及びＩＬ−８レセプターＲＡによるシグナル化活性を同時に検査した。 Vu，Cell 64:1057-68(1991)に記載されたように、ｃＲＮＡをＳＰ６のＲＮＡポリメラーゼ転写によってＮｏｔＩ直鎖ベクターから調製し、アガロースゲル上に流して、予期されるサイズの単一バンドを確認した。採取から１日後、２０ｎｇのｃＲＮＡを１卵母細胞あたり総量５０ｎｌで卵母細胞に注入した。改変Bart h 緩衝液中で２日間１６℃でインキュベートした後、卵母細胞にＣａ⁴⁵(５０ｕＣｉ／ｍｌ、Amersham，Arlington Heights，Virginia)を３時間添加し、１時間洗浄し、７つのグループで２４ウェル皿の各ウェルに０．５ｍｌ容量で入れ、１０分間隔で培地を集めて液体シンチレーションカウンターのβ放射を計算することによってＣａ⁴⁵流出を測定した。安定したベースラインを得た後に、サイトカインアゴニストであるＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−８及びＭＣＰ−１を Barth培地中の卵母細胞に対して１０分間添加した。未注入の卵母細胞は、コントロールとして使用した。サイトカイン、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ −１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−８及びＭＣＰ−１はＲ＆Ｄ Inc.，Minneapolis， Minnesota から入手した。結果を図６に示す。ＭＣＰ−１ＲＡ及び１ＲＢは共に、ナノモル濃度のＭＣＰ−１に対して強力で著しく特異的な反応を示した。ケモカインであるＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ又はＩＬ−８は、これらのリガンドが５００ｎＭで存在する場合でさえも反応を示さなかった。これに対して、ＭＩＰ−１α／ＲＡＮＴＥＳレセプターは、公表された結果と一致して、ＭＣＰ−１にではなくＭＩＰ−１α及びＲＡＮＴＥＳに反応してシグナルを示した。ＭＣＰ−１のＥＣ₅₀は１５ｎＭであった。実施例５ＭＣＰ−１Ｒリガンドの特異性及びシグナル伝達Ａ．リガンドの特異性ＭＣＰ−１ＲＢのｃＤＮＡをＨＥＫ−２９３細胞へトランスフェクトさせることによって、ＭＣＰ−１Ｒを安定発現させる細胞株を作製した。ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）−２９３（ＣＲＬ１５７３）細胞をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection，Bethesda，M D)から入手し、１０％の胎児ウシ血清(ＦＣＳ)(Hyclone Laboratories Inc.，Lo gan，UT)と１％のペニシリン／ストレプトマイシンを補充したアールズ・バランスト・ソルト・ソリューション添加最小必須培地（Minimal Essential Media wi th Earle's Balanced Salt Solution，ＭＥＭ−ＥＢＳＳ；ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ，Grand Island，N.Y.）中で３７℃の湿気のある５％ＣＯ₂雰囲気中で成育させた。ＭＣＰ−１レセプターであるＭＣＰ−１ＲＢとＭＩＰ−１α／ＲＡＮＴＥＳレセプターとのｃＤＮＡは哺乳類細胞発現ベクターｐｃＤＮＡ３(Invitrogen In c.，San Diego，CA)のポリリンカーにクローン化され、製造者の指示に従ってＤＮＡ／リポフェクタミン（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）混合物を用いて２９３細胞（５０〜８０％集密化）へトランスフェクトした。Ｇ４１８(０．８ｍｇ／ｍｌ)(ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ)の存在下において２〜３週間選択した後、コロニーを採取し、レセプター発現に対するノザンブロット解析によって安定した細胞株をスクリーニングした。概して、ノザンブロット解析で判断したレセプター発現のレベルと、下記の機能的アッセイで得られるレセプターシグナルの強度との間には、強い相関関係が存在した。ノザンブロットにおいてレセプターを発現しなかったトランスフェクト細胞は、結合及びシグナル化実験における陰性コントロールとして使用した。次に、Ernst，J．Immunol．152:3541-49（1994）の方法を使用して平衡結合アッセイを行った。異なる量の¹²⁵Ｉ標識ＭＣＰ−１(デュポン−NEN，Boston，MA) を、結合緩衝液（５０ｍＭの Hepes、ｐＨ７．２、１ｍＭのＣａＣｌ₂、５ｍＭのＭｇＣｌ₂、０．５％のＢＳＡ(ウシ血清アルブミン、フラクションＶ、Sigma) ）中で再懸濁した６×１０⁶のＭＣＰ−１ＲＢ発現ＨＥＫ−２９３細胞と共に、１００倍過剰量の未標識Ｃ−ＣケモカインＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β及びＲＡＮＴＥＳ、Ｃ−Ｘ−ＣケモカインＩＬ−８（ケモカインは R & D Systems，Inc. ，Minneapolis，MN から入手）の存在又は非存在下でインキュベートした。図７に示されるような５００ｐＭの¹²⁵Ｉ標識ＭＣＰ−１と濃縮未標識ケモカインを使用して競合実験を行った。マッキントッシュコンピュータでプログラム「ＬＩＧＡＮＤ」(Biosoft，Ferg uson，MO)を使用し、Scatchardの方法に従って平衡結合データを解析した。(Mun son，Anal．Biochem．107:220-39（1980）を参照。)Ｃ−Ｘ−ＣケモカインＩＬ −８と同様、密接に関連したＣ−ＣケモカインＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β及びＲＡＮＴＥＳは、結合について競合しなかった。ノザンブロット法でＭＣＰ−１ＲＢを殆ど又は全く発現しなかったトランスフェクタントにおいても特異的結合は検出されなかった。図７に示される平衡結合データの解析は、２６０ｐＭの解離定数（Ｋ_d）を示す（図７Ｂ）。このＫ_dは、ＭＣＰ−１の単球との結合(Yoshi mura，J．Immunol．145:292-97(1990); Zhang，J．Biol．Chem．269:15918-24(1 994))及びＴＨＰ−１細胞との結合(Van Riper，J．Exp．Med．177:851-56(1933) )に関して報告されているものとかなり一致する。これらのデータにより、¹²⁵Ｉ −ＭＣＰ−１が２９３細胞において発現したＭＣＰ−１ＲＢレセプターと特異的に及び高親和性で結合したことが示される。Ｂ．シグナル伝達次に、２９３細胞におけるカルシウム流動化を調べた。トランスフェクトしたＨＥＫ−２９３細胞を集密化まで成育させ、手短にトリプシン処理し、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含むリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ−ＢＳＡ）で洗浄し、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳ補充無血清ＭＥＭ−ＥＢＳＳ（ｐＨ７．０）に２×１０⁷細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。これらの細胞を、５〜１０μｇ／ｍｌの indo-１ＡＭ（Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR）の存在下において３７℃で２０分間暗所でインキュベートした。９容量のＰＢＳ−ＢＳＡを添加し、細胞を３７℃で更に１０分間インキュベートし、遠心分離によって沈殿させ、５０ｍｌのＰＢＳ−ＢＳＡ溶液で２回洗浄した。次に、洗浄 indo-１添加細胞を、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを補充したハンクス調製塩溶液(１．３ｍＭのＣａ²⁺)(ＨＢＳ−ＢＳＡ)におよそ０．５×１０⁶細胞／ｍｌの濃度で室温で再懸濁した。細胞内カルシウム（[Ｃａ²⁺]_i）の測定のため、０．５ｍｌの細胞懸濁液をヒタチＦ−２０００蛍光分光光度計内の石英キュベットに入れた。ＨＢＳ− ＢＳＡ中に溶解したケモカイン（ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、Ｇｒｏ−α及びＩＬ−８）を５μｌ容量でキュベットに直接注入した。細胞内カルシウムは、３５０ｎｍの励起と、４９０ｎｍ（Ｆ１）及び４１０ｎｍ（Ｆ２）の波長の蛍光放射検出によって測定した。［Ｃａ²⁺］_iは、下記の式に従って、アゴニスト注入後の４９０／４１０蛍光比（Ｒ）を各実施の終わりに測定した較正比と比較することで評価した：［Ｃａ²⁺］_i＝Ｋ_d×[(Ｒ−Ｒ_min)/(Ｒ_max−Ｒ)]×（Ｓｆ２／Ｓｂ２）式中、Ｒ_max及びＲ_minは飽和（１．３ｍＭのＣａ²⁺）時と名目上カルシウム無しの条件（１０ｍＭのＥＧＴＡ、Sigma Chemical Co.）での蛍光比、Ｋ_dはindo− １に対するカルシウムの解離定数、Ｒは蛍光比、そしてＳｆ２／Ｓｂ２は４１０ｎｍにおける遊離及び結合indo-１色素の蛍光比である。Thomas，AP及び Delavi lle，Ｆ(1991)，Cellular Calcium，a Practical Approach，Oxford Univ．Pres s，pp．1-54を参照のこと。カルシウム反応を定量するため、各実験でＭＣＰ−１の用量反応曲線を作成し、各実験で測定した最大カルシウムシグナル（３００ｎＭＭＣＰ−１）のパーセントとして結果を表した。アゴニストの各濃度に反応した[Ｃａ²⁺]_iレベルの変化は、ピーク[Ｃａ²⁺]_iレベルからベースラインを差し引くことで決定し、ベースラインとピーク[Ｃａ²⁺]_iレベルは、各々アゴニストの添加前５秒間のデータと、ピーク反応付近との平均をとって決定した。細胞外カルシウムの役割を決定するために行った実験では、ＭＣＰ−１の添加前６０〜９０秒に３ｍＭのＥＧＴＡを添加した。続いて細胞を Triton Ｘ−１００(Sigma)で溶解したがindo−１蛍光に変化はなく、これはＥＧＴＡが細胞内ベースレベル（およそ７０〜１００ｎＭ）の濃度を下回るように細胞外カルシウム濃度を減少させたことを示す。全ての実験は室温で行われた。ＭＣＰ−１は、安定的にトランスフェクトしたＭＣＰ−１ＲＢ／２９３細胞中で強力なカルシウム流動化を特異的かつ用量依存的に刺激した。１００ｐＭほどの少ないＭＣＰ−１によっても、小さいが再発可能なシグナルがみられ、ＭＣＰ −１に対する４つ全ての用量反応曲線の平均ＥＣ₅₀は３．４ｎＭであった（２．７〜４．４ｎＭ；図８Ａ及びＢ）。ＭＣＰ−１ＲＢレセプターを、ＭＣＰ−１によって選択的に活性化した。ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、Ｇｒｏ−α及びＩＬ−８は、高濃度で存在する場合でさえも、これら同一細胞中で有意なカルシウムシグナルを刺激しなかった（図８Ｂ）。更に、これらのケモカインはＭＣＰ−１による細胞の刺激を遮断することができず、これはＭＣＰ−１ＲＢレセプターの内因性アンタゴニストとして作用しないらしいことを示す。ＭＣＰ−１依存型細胞内カルシウム流動は、短い時間の遅れと、これに[Ｃａ²⁺]_iの急激な上昇が続き、ＭＣＰ−１の添加後８０〜９０秒以内にベースレベル付近に戻る、ということで特徴付けられた（図８Ａ）。これらの細胞は、ＭＣＰ−１の第２の試みによる活性化に反応しないという点で、相同無反応化を示した（図８Ｃ）。細胞内カルシウム流動の原因を決定するため、細胞外カルシウムの存在又は非存在下でＭＣＰ−１ＲＢ／２９３細胞に対してＭＣＰ−１を試みた。細胞質カルシウムの上昇は、３ｍＭのＥＧＴＡによる細胞外カルシウムのキレート化によっても殆ど変わらなかった。同様の結果は、細胞を洗浄し１ｍＭのＥＧＴＡ補充カルシウム非含有ＰＢＳに再懸濁した場合、又は５ｍＭのＮｉ²⁺を添加して細胞外カルシウムの流入を遮断した場合に認められた。Sozani，J．Immunol．147:2215 -21(1991); Saga，J．Biol．Chem．262:16364-69(1987)。細胞質カルシウムのベースラインへの下降は細胞外カルシウムの存在下でわずかに延長され、これは、カルシウム流入が、細胞内の貯蔵物が枯渇した後もＭＣＰ−１の反応を維持することに貢献しうることを示唆している。これらのデータは、これらのトランスフェクト２９３細胞におけるカルシウム流動化の主要手段が細胞内カルシウムの放出によることを示唆している。イノシトール（１，４，５）−トリホスフェート（ＩＰ₃）は、多くの７膜貫通ドメインレセプターを含む広範囲のレセプターの活性化に反応して細胞内カルシウムを流動させる。Hung，J．Cell．Biol．116:827-32(1992); Putney，Trend s Endocrinol．Metab．5:256-60(1994)。この流動化を調べるため、Hung，J．Ce ll．Biol．116:827-32（1992）に記載されているように、イノシトールホスフェートの全蓄積量を測定した。ＨＥＫ−２９３細胞を２４ウェル組織培養皿に集密化まで成育させ、１０％透析済ＦＣＳ補充イノシトール非含有ＭＥＭ−ＥＢＳＳに２μＣｉ／ｍｌ[³Ｈ]ミオ−イノシトール(２３Ｃｉ／ｍｍｏｌ)(New England Nuclear，Boston，MA)によって一晩標識付けした。標識付けに続いて培地を除去し、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ及び１０ｍＭのＬｉＣｌ補充無血清ＭＥＭ−ＥＢＳＳ培地０．５ｍｌ中で細胞を５〜１０分間室温でインキュベートした。次に、洗浄した細胞を１０ｍＭのＬｉＣｌの存在下でケモカインＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−８及びＧｒｏ− αと共に１〜３０分間室温でインキュベートした。インキュベーション培地を除去し、氷冷した２０ｍＭのギ酸１ｍｌを添加してインキュベーションを停止した。プレートを４℃で３０分間インキュベートし、これらの上澄を１ｍｌＤｏｗｅｘＡＧ１−Ｘ８(１００〜２００メッシュ、ギ酸塩形、Sigma)クロマトグラフィーカラムに注入（アプライ）した。カラムを８ｍｌの水で洗浄し、続いて４０ｍＭのギ酸ナトリウム５ｍｌで洗浄した。[³Ｈ]イノシトールホスフェートの総量を２Ｍのギ酸アンモニウム／０．１Ｍのギ酸５ｍｌで溶離し、液体シンチレーションスペクトロスコピーによって定量した。トランスフェクトした２９３細胞におけるＭＣＰ−１レセプターの活性化は、ホスファチジルイノシトールの加水分解を殆ど又は全く誘導しなかった。コントロール実験では、同一の２９３細胞に同時トランスフェクトしたムスカリンレセプター(Lameh，J．Biol．Che m．267:13406-412(1993))又はオキシトシンレセプター(Kimura，Nature 356:526 -29(1992))の活性化によって５〜９倍増大したＰＩ代謝が引き起こされた。アデニリルシクラーゼの阻害を調べるため、ＭＣＰ−１ＲＢレセプター及びＭＩＰ−１α／ＲＡＮＴＥＳレセプターにより安定的にトランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞を２４ウェル組織培養皿で集密化まで成育させ、１０％ＦＣＳ補充ＭＥＭ−ＥＢＳＳ中で２μＣｉ／ｍｌの[³Ｈ]アデニン(２５〜３０Ｃｉ／ｍｍｏｌ)(New England Nuclear，Boston，MA)によって一晩標識付けした。翌日、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ及び１０ｍＭのＩＢＭＸ（３−イソブチル−１−メチルキサンチン）補充無血清ＭＥＭ−ＥＢＳＳ培地０．５ｍｌで５分間室温でインキュベートすることにより、細胞を洗浄した。洗浄培地を除去した後、ケモカイン（ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−８及びＧｒｏ−α）のみ、フォルスコリンのみ(１０μＭ、Sigma Che mical Co.，St．Louis，MO)又はケモカイン及びフォルスコリンを含む新しい培地を、１ｍＭのＩＢＭＸの存在下で２０分間室温で添加することによって細胞を刺激した。培地を、１ｍｌの氷冷した５％のＴＣＡ（トリクロロ酢酸）、１ｍＭのｃＡＭＰ及び１ｍＭのＡＴＰ(Sigma)と取り替えることによってインキュベーションを停止した。４℃、３０分間のインキュベーションに続き、Hung，J．Bio l．Chem．267:20831-34(1992)及び Wong，Nature 351:63-65(1991)に記載されたように、標識付けした[³Ｈ]ＡＴＰ及び[³Ｈ]ｃＡＭＰプールをＤｏｗｅｘ５０Ｗ (２００〜４００メッシュ、水素形、Sigma)及びニュートラルアルミナカラム(Si gma)上でクロマトグラフィーによって分離し、定量した。１ｍｌの酸性上澄を１ｍｌＤｏｗｅｘ５０Ｗカラムに添加し、ＡＴＰプールを３ｍｌのＨ₂Ｏで溶出した。次に、Ｄｏｗｅｘ５０Ｗカラムを１ｍｌアルミナカラムの上に配置し、１０ｍｌのＨ₂ＯをＤｏｗｅｘ樹脂に添加し、溶出物がニュートラルアルミナ上に直接落ちるようにした。次に、５ｍｌの０．１Ｍイミダゾール／０．０１ｍＭアジ化ナトリウムを用いてｃＡＭＰプールをアルミナから直接溶出した。[³Ｈ] ＡＴＰ及び[³Ｈ]ｃＡＭＰフラクションを、液体シンチレーションスペクトロスコピーによって計算した。各サンプルのｃＡＭＰプールを独自のＡＴＰプールに対して標準化し、式(ｃＡＭＰ cpms/ＡＴＰ cpms)×１００による比として表した。各実験で全用量反応曲線を作成し、フォルスコリンコントロールのパーセントとして表した。ＭＣＰ−１レセプターの活性化は、アデニリルシクラーゼ活性の潜在的及び用量依存的阻害を生じた。ＭＣＰ−１は、これらの細胞中の基底ｃＡＭＰ蓄積を５５％有意に減少させた（ｐ＜０．０１、スチューデントｔテスト）。アデニリルシクラーゼのフォルスコリン活性化はｃＡＭＰレベルを１６倍増大させ、ＭＣＰ −１の同時添加はこの増大を７８％遮断し、９０ｍＭのＩＣ₅₀（７０〜１４０ｐＭ）であった。アデニリルシクラーゼ活性のＭＣＰ−１阻害の規模及び潜在的能力は、フォルスコリン濃度（３〜３０μＭ）とは無関係であった。トランスフェクトしていない又はｐｃＤＮＡ３をトランスフェクトした２９３細胞コントロールでは、ＭＣＰ−１はｃＡＭＰ形成を刺激も阻害もしなかった。これらの結果は、アデニリルシクラーゼ活性の阻害が、２９３細胞におけるＭＣＰ−１ＲＢレセプターの活性化の鋭敏なかつ定量的アッセイを提供することを示している。大体は、このアッセイにおいて高濃度のＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１ α、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−８又はＧｒｏ−αに反応するＭＣＰ−１レセプターの活性化は検出できず、これはカルシウム蛍光定量アッセイ及びアフリカツメガエル卵母細胞における我々の観察と一致する（実施例５）。同様の実験においてＭＩＰ−１α／ＲＡＮＴＥＳレセプターを２９３細胞に安定的にトランスフェクトしたが、これもまたアデニリルシクラーゼ活性の潜在的及び用量依存的阻害を仲介することがわかった。しかし、ＭＣＰ−１ＲＢレセプターとは異なり、ＭＩＰ−１α／ＲＡＮＴＥＳレセプターは様々な度合の潜在的能力で複数のケモカインによって活性化された。ＭＩＰ−１α及びＲＡＮＴＥＳはアデニリルシクラーゼ活性を阻害することに関しては大体効力が等しく、それぞれ１１０ｐＭ及び１４０ｐＭのＩＣ₅₀を有した。ＭＩＰ−１β（ＩＣ₅₀＝８２０ｎＭ）もアデニリルシクラーゼ活性を阻害したが、大幅に高い濃度においてのみであり、ＭＩＰ−１α及びＲＡＮＴＥＳと同程度にはｃＡＭＰ蓄積を遮断しなかった。Ｃ−Ｘ−ＣケモカインであるＩＬ−８及びＧｒｏ−αは、１μＭになるまでＭＩＰ−１α／ＲＡＮＴＥＳレセプターを活性化しなかった。下記の表Ｉは、種々のケモカインによってＭＣＰ−１レセプターとＭＩＰ−１ α／ＲＡＮＴＥＳレセプターの活性化の比較をしており、ＭＣＰ−１ＲＢレセプターのＭＣＰ−１に対する特異性と、ＭＩＰ−１α／ＲＡＮＴＥＳレセプターのＭＩＰ−１α及びＲＡＮＴＥＳに対する特異性を示している。Ｃ−Ｘ−Ｃケモカインは全て、２つのクローン化したＣ−Ｃケモカインレセプターのいずれに対しても不活性であった。全ての実験において、ＭＣＰ−１ＲＢ又はＭＩＰ−１α／ＲＡＮＴＥＳレセプターにより仲介されるアデニリルシクラーゼ活性の最大阻害はそれぞれ〜８０％及び〜５５％であった。細胞質カルシウムの急速な上昇とアデニリルシクラーゼの潜在的阻害によって示される定性的に同様のシグナル化は、ＭＣＰ−１ＲＡレセプターを発現する２９３細胞において観察された。Ｃ．ＭＣＰ−ＩＲ活性化の阻害百日咳菌毒素によるＭＣＰ−１ＲＢレセプター活性化の阻害を調べた。百日咳菌毒素（List Biological Labs，Inc.，Campbell，CA）を０．０１Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）及び０．０５Ｍの塩化ナトリウム中に溶解し、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度で正常血清含有培地に希釈して、細胞と共に３７℃で一晩（１４〜１６時間）インキュベートした。２９３細胞の百日咳菌毒素処理の条件は、カルシウム蛍光定量実験及びアデニリルシクラーゼ実験と同一であった。アデニリルシクラーゼ実験では、[³Ｈ]アデニンと同時に百日咳菌毒素を添加した。アデニリルシクラーゼの阻害と同様に、細胞内カルシウムのＭＣＰ−１誘発流動化は、百日咳毒素で細胞を前処理することによって実質的に遮断された。用量反応研究によって、百日咳毒素によるこれらの２つの経路の同様の程度の阻害と共に、１００ｎｇ／ｍｌまでのＰＴによる阻害に耐性である成分（≒２０％）が示された。百日咳毒素処理の効果は、ＭＣＰ−１のＩＣ₅₀を実質的に変えることなくｃＡＭＰ蓄積のＭＣＰ−１阻害の規模を減少させることであり、この結果は、百日咳処理がＧαｉからＭＣＰ−１ＲＢレセプターを機能的に分離（uncouple ）するという仮説と一致する。これらの結果はまた、アデニリルシクラーゼ活性の阻害及び細胞内カルシウムの流動化の双方が２９３細胞中の同一のＧ−タンパク質の活性化によって仲介されうることも示唆している。Ｄ．結果の論述ＭＣＰ−１は、ＭＣＰ−１ＲＢで安定的にトランスフェクトされたindo−１添加２９３細胞において細胞内カルシウムの急速な上昇を誘発した。安定細胞株はまた、ＭＣＰ−１に反応するカルシウム流動化の用量依存的相同無反応化を示した。このカルシウム流動に対する細胞外及び細胞内カルシウム貯蔵物の相対的な寄与は議論を呼んでいる。上記の結果は、２９３細胞におけるＭＣＰ−１レセプターの活性化後の細胞質カルシウムの初期の上昇が、殆ど独占的に細胞内カルシウム貯蔵物の放出によるものである、という結論を支持している。第１に、ＥＧＴＡ（２ｍＭ〜１０ｍＭ）による細胞外カルシウムのキレート化はカルシウム一過性の上昇及びピークレベルに殆ど影響を及ぼさなかったが、ベースラインのカルシウムレベルへの下降を早めた。第２に、トランスフェクト細胞を１ｍＭのＥＧＴＡを補充したカルシウム非存在培地中でインキュベートした場合、同じ結果が得られた。最後に、細胞外カルシウムの流入を遮断する５ｍＭのＮｉ²⁺の存在下で殆ど同一の結果が得られた。ＭＣＰ−１ＲＢレセプターの活性化はアデニリルシクラーゼをかなりの程度で阻害し、これはＧαｉのアイソフォームの１つを介するカップリングを示唆している。クローン化したＭＩＰ−１α／ＲＡＮＴＥＳレセプターを使用しても同様の結果が得られ、これはＣ−Ｃケモカインのレセプターのうち少なくとも２つがＧαｉを活性化することを示している。更に、百日咳毒素はカルシウム流動化と、ＭＣＰ−１により誘発されたアデニリルシクラーゼの阻害とを遮断した。カルシウム流動化とアデニリルシクラーゼ阻害に対する百日咳毒素の用量反応曲線における類似性は、双方がＧαｉとのカップリングから得られる結果でありうることを示唆している。これらの研究はケモカインレセプターによるアデニリルシクラーゼの阻害を初めて示したものであり、ＩＬ−８、ｆＭＬＰ及びＭＣＰ−１に対する白血球走化性は百日咳毒素による阻害に敏感であるという報告と一致している。Oppenheim，Ann．Rev．Immunol．9:617-48(1991); Spangrude，J．Immuno l．135:4135-43(1985); Sozzini，J．Immunol．147:2215-21(1991)。アデニリルシクラーゼの阻害は白血球中のＧαｉの活性化を最も徹底的に特徴付けた下流効果であるが、Ｇαｉはまた、ｆＭＬＰ刺激好中球におけるカリウムチャネルの活性化、有糸分裂の誘発、ならびにＲａｓ及び微小管会合タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼの活性化とも関係がある。Yatani，Nature 336:680-82(1988 ); Seuwan，J．Biol．Chem．265:22292-99(1990); Worthen，J．Clin．Invest． 94:815-23(1994)。従って、Ｇαiの活性化は最終的に白血球の活性化及び走化性を引き起こす細胞内シグナルの複合アレイを活性化し得る。Ｇαｉと結合して放出されるβγダイマーがホスホリパーゼＣのβ₂アイソフォーム（ＰＬＣβ₂）を活性化してＩＰ₃を生成する百日咳毒性感受性シグナル伝達経路が記載されている。Wu，Science 261:101-031。この経路を介する細胞活性化により、細胞内カルシウムの百日咳毒性感受性流動化が生じると予期される。しかし、組み換えＭＣＰ−１レセプターを安定的に発現する２９３細胞は、ＭＣＰ−１で実施した場合、ＰＩ（ホスファチジルイノシトール）が存在したとしても殆ど加水分解をしない。コントロール実験では、この細胞株に同時トランスフェクトしたＧｑ結合レセプターは、活比化の際にイノシトールホスフェートの総量を５〜９倍増大させた。ＭＣＰ−１ＲＢトランスフェクト細胞においてＰＩ代謝を検出できなかったことは、ＭＣＰ−１レセプターがＩＰ₃とは無関係の新規な機構を介して細胞内カルシウムを流動させることを示唆している。ＭＣＰ−１ＲＢは、ＭＣＰ−１に対して著しく特異的であった。シクラーゼアッセイにおいて、ＭＣＰ−１による阻害のＩＣ₅₀は９０ｐＭであったが、関連するケモカインは１μＭまで効力を示さなかった。これに対して、ＭＩＰ−１α／ＲＡＮＴＥＳレセプターはＭＩＰ−１α及びＲＡＮＴＥＳに対しておよそ１００ｐＭ、ＭＩＰ−１β及びＭＣＰ−１に対してはそれぞれ１０ｎＭ、８２０ｎＭのＩＣ₅₀を有する。従って、ＭＣＰ−１はＭＣＰ−１レセプターに対して少なくとも９０００倍の選択性を有し、一方ＭＩＰ−１α及びＲＡＮＴＥＳはＭＣＰ−１ＲＢと比較してＭＩＰ−１α／ＲＡＮＴＥＳレセプターに対して同様の選択性を示した。従って、生理学的条件下では、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α及びＲＡＮＴＥＳはそれぞれＭＣＰ−１ＲＢ及びＭＩＰ−１α／ＲＡＮＴＥＳレセプターの特異的アゴニストとして作用することが考えられる。アデニリルシクラーゼのＭＣＰ−１仲介阻害のＩＣ₅₀はおよそ９０ｐＭであり、結合のための解離定数（Ｋ_d＝２６０ｐＭ）を十分下回るため、Ｇαｉに対する有効なカップリングには比較的少数のレセプターが占有されなければならないことを示唆している。反対に、細胞内カルシウムのピーク流動（ＥＣ₅₀＝２〜４ｎＭ）を引き出すには非常に多くのレセプター占有が必要とされた。この点において、ＭＣＰ−１に対する単球走化性のＥＣ₅₀がサブナノモルであることは、記すに興味深いことである。Yoshimura，J．Immunol．145:292-97(1990)。従って、ＭＣＰ−１の特徴的な機能である走化性の誘発は、Ｇαｉを介する有効なカップリング／シグナル化を提供するが最大の細胞内カルシウム流動とこれに続くレセプターの無反応化を生じるには不十分であるようなＭＣＰ−１濃度で最適であり、これは細胞内カルシウムの適度な増大が単球の走化性を開始し維持するのに十分であることを示唆している。ナノモル濃度のＭＣＰ−１で検出された高レベルの細胞内カルシウムは、レセプターを無反応化し付着分子を調節しないことによって単球の移動を止める機能を果たしうる。ＭＣＰ−１は、種々の異なるサイトカイン又は酸化によって改変したリポタンパク質に反応して多数の異なる細胞によって in vitro で合成され分泌される。ＭＣＰ−１に対するクローン化レセプターの特異性は、単球、好塩基球及びＴリンパ球のサブセットのみがＭＣＰ−１に反応するという事実と結びつき、ＭＣＰ −１が豊富なエリアにおいて浸潤白血球の範囲を制限する有効な手段を提供する。初期のアテローム硬化性病変は主に単球の浸潤を有し、ＭＣＰ−１はこれらの疾患において豊富である。反対に、ＭＩＰ−１α／ＲＡＮＴＥＳレセプターは複数のケモカインに反応して結合及びシグナル化をし、より複雑な炎症反応を仲介するよう作用しうる。しかし、一度活性化すると、ＭＣＰ−１及びＭＣＰ−１α ／ＲＡＮＴＥＳレセプターは同様のシグナル導入経路を使用するようである。非線形最小２乗プログラムにより、カルシウム蛍光定量アッセイ及びアデニリルシクラーゼ阻害アッセイで作成した用量反応曲線を論理学的式にあてはめた：効果＝最大効果／［１＋（ＥＣ₅₀／（アゴニスト）ⁿ］式中、ｎ及びＥＣ₅₀は半最大反応を引き出したヒル係数とアゴニスト濃度をそれぞれ表しており、これらは適合曲線から派生した。曲線の適合は、コンピュータプログラム「プリズム」(Graph Pad，San Diego，CA)によって行われた。結果は平均値±ＳＥを表す。ＥＣ₅₀及びＩＣ₅₀値が与えられると、これらの９５％の確信間隔（ＣＩ）は対数ＥＣ₅₀及びＩＣ₅₀値からそれぞれ計算された。本明細書中に記載の全ての出版物及び特許出願は、各々の個々の出版物又は特許出願が特定に個々に援用されるのと同程度で本明細書に援用される。本発明を十分に記載したが、請求の範囲の趣旨又は範囲から逸脱せずに多くの変更を本発明に対して行うことが可能であることは当業者には明白であろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｐ 21/02 0276−2ＪＧ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/566 8615−4ＣＡ６１Ｋ 45/00 // Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＢＧ 9282−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 ＢＡＢＸ 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/02 ＡＤＵＡＣＤＡＢＸＡＤＵＡＣＤＡＥＤＡＢＧ 45/00 ＡＥＤ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者コフリン、シャァムアメリカ合衆国 94920 カリフォルニア州ティバロンタートルロックコート２

Claims

【特許請求の範囲】１．ＭＣＰ−１Ｒの発現をコードする、単離ＤＮＡ配列。２．他のポリペプチドと会合せず、かつ図１（配列番号：２）又は図２（配列番号：４）の成熟アミノ酸配列を含む、ポリペプチド。３．他のポリペプチドと会合していないポリペプチドであって、ｉ）図１（配列番号：１）又は図２（配列番号：３）のＤＮＡ配列、ｉｉ）厳格な条件下でｉ）のＤＮＡにハイブリダイズ可能なＤＮＡ、及びｉｉｉ）遺伝暗号の縮重によってコード配列がｉ）及びｉｉ）のＤＮＡとは異なるＤＮＡ、から成る群から選択されるＤＮＡ配列でコードされる、ポリペプチド。４．前記単離ＤＮＡがｃＤＮＡを含む、請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ。５．請求の範囲第１項のＤＮＡ配列を含む発現ベクター。６．前記ＤＮＡ配列が該ＤＮＡ配列の複製及び発現を指示可能な発現制御配列と機能的に会合して構成される、請求の範囲第１項のＤＮＡ配列を用いてトランスフォームされた細胞。７．前記細胞が哺乳類又は細菌細胞である、請求の範囲第６項に記載の細胞。８．適切な培養培地中で請求の範囲第６項の細胞を培養し、ＭＣＰ−１Ｒタンパク質を前記細胞から単離することを含む、ＭＣＰ−１Ｒタンパク質の作製方法。９．ＭＣＰ−１レセプターのアンタゴニストを同定する方法であって、ａ）ＭＣＰ−１レセプターのＮ末端ドメインをコードする核酸配列を含む発現ベクターを用いて哺乳類細胞株をトランスフェクトするステップと、ｂ）前記細胞株を培養培地で培養し、これにより前記レセプタードメインが安定的に発現されるステップと、ｃ）前記レセプタードメインに対するＭＣＰ−１の結合を遮断するのに十分な、有効量の有機化合物を前記培養培地に添加するステップと、ｄ）結合における前記損失を検出するステップと、を含む、アンタゴニスト同定方法。１０．前記Ｎ末端ドメインが、他のＭＣＰ−１レセプター細胞外ドメインと結合して発現される、請求の範囲第９項に記載の方法。１１．前記Ｎ末端ドメインが、天然ＭＣＰ−１レセプターの一部として発現される、請求の範囲第９項に記載の方法。１２．前記検出がイムノアッセイによる、請求の範囲第９項に記載の方法。１３．前記ＭＣＰ−１が標識付けされる、請求の範囲第９項に記載の方法。１４．医薬的に許容可能なビヒクル中で請求の範囲９の方法を使用して同定されたＭＣＰ−１レセプターアンタゴニストの治療的有効量を含む、単球の浸潤によって特徴付けられる疾患の治療に有用な医薬組成物。