ES2272329T3 - Quimioquinina humana phc-1 procesada. - Google Patents
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Abstract
Un compuesto que presenta más de un 95% de identidad de secuencia con la SEC. DE ID. Nº 1, o sus derivados amidados, acetilados, fosforilados y/o glicosilados, o fragmentos o partes de los mismos, en los que el compuesto, derivados, fragmentos o partes activan los receptores de la quimioquina CCR3 y CCR5, tal como se determina mediante un ensayo de Aecuorina.
Description
Quimioquinina humana PHC-1
procesada.
La presente invención se refiere a compuestos
identificados nuevos, a las secuencias de polinucleótidos que
codifican las secuencias de aminoácidos de dichos compuestos, así
como a los antagonistas o inhibidores derivados de dichos
compuestos para los receptores de la quimioquina, y a su uso en el
campo del diagnóstico y la terapéutica que implica dichos
receptores de la quimioquina.
Las quimioquinas son secuencias pequeñas que se
sabe que juegan un papel fundamental en la fisiología de los
procesos de la inflamación crónica y aguda, así como en la
desregulación patológica de estos procesos.
Más aún, se sabe que algunos receptores de la
quimioquina, en especial los receptores de la quimioquina
identificados como CCR5, CXCR4 y CCR3 están implicados en la
infección de pacientes por virus VIH.
Las quimioquinas conocidas
MIP-1\alpha, MIP-1\beta, RANTES
y MCP-2 y los compuestos sintéticos derivados de
estas quimioquinas (AOP-RANTES) se han descrito
como factores principales en la inhibición de VIH.
Más aún, se ha realizado una intensa
investigación acerca de la selección de nuevos compuestos (por lo
general, derivados sintéticos de quimioquinas naturales y
compuestos químicos sintéticos derivados de la selección de
bibliotecas) que tengan características mejoradas como antagonistas
víricos o antagonistas de los receptores de la quimio-
quina.
quina.
La presente invención desea proporcionar nuevos
compuestos naturales, así como derivados sintéticos o naturales de
los mismos, que sean antagonistas o inhibidores de varios receptores
de la quimioquina, y de los correceptores de VIH-1
y VIH-2, especialmente para los receptores
CCR-1 y CCR5, y que encuentran aplicación en el
tratamiento y/o prevención de varias enfermedades.
La presente invención se refiere a un nuevo
compuesto, un compuesto de quimioquina que muestra una homología de
más del 95% (o identidad de secuencia) con la SEC. DE ID. Nº 1
(GPYHPSECCFTYTTYKIPRQRIMDYYETNS
QCSKPGIVFITKRGHSVCTNPSDKWVQDYIKDMKEN), dicho compuesto no se corresponde con las secuencias de aminoácidos con SEC. DE ID. Nº: 3 (MKISVAAIPFFLLITIALGTKTESSSRGPYHPSECCFTYTTYKY PRQ
RIMDYYETNSQCSKPGIVFITKRGHSVCTNPSDKWVQDYIKDMKEN) o la SEC. DE ID. Nº 4 (TKTESSSR
GPYHPSECCFTYTTYKI PRQRIMDYYETNSQCSKPGIVFITKRGHSVCTNPSDKWVQDYIKDMKEN) (péptido
HCC-1), que es un polipéptido PHC-1 no truncado ya descrito en los documentos P4344397.4 y P4427395.9, y en P. Schulz-Knappe y col., (J. Exp. Med., Vol. 183, pp. 295-299 (1999)).
QCSKPGIVFITKRGHSVCTNPSDKWVQDYIKDMKEN), dicho compuesto no se corresponde con las secuencias de aminoácidos con SEC. DE ID. Nº: 3 (MKISVAAIPFFLLITIALGTKTESSSRGPYHPSECCFTYTTYKY PRQ
RIMDYYETNSQCSKPGIVFITKRGHSVCTNPSDKWVQDYIKDMKEN) o la SEC. DE ID. Nº 4 (TKTESSSR
GPYHPSECCFTYTTYKI PRQRIMDYYETNSQCSKPGIVFITKRGHSVCTNPSDKWVQDYIKDMKEN) (péptido
HCC-1), que es un polipéptido PHC-1 no truncado ya descrito en los documentos P4344397.4 y P4427395.9, y en P. Schulz-Knappe y col., (J. Exp. Med., Vol. 183, pp. 295-299 (1999)).
El nuevo compuesto es de manera preferible un
antagonista de los virus VIH respecto de los receptores de la
quimioquina, especialmente respecto de los receptores de la
quimioquina CCR-1, CCR-3 y CCR5.
El polipéptido de acuerdo con la invención es la
quimioquina PHC-1 que tiene la secuencia de
aminoácidos de la SEC. DE ID. Nº 1 o fragmentos activos o porciones
de los mismos biológicamente activos, en donde dichos fragmentos o
porciones activan los receptores de la quimioquina
CCR-3 y CCR5 tal como se mide mediante un ensayo de
Aecuorina.
Dichos fragmentos activos o porciones de los
mismos son de manera ventajosa secuencias de aminoácidos
NH_{2}-terminal de al menos 10, 15, 20, 25, 30
aminoácidos, de manera preferible de al menos 40 aminoácidos, de
manera más preferible de al menos 50 ó 55 aminoácidos, de la
secuencia original completa descrita más arriba SEC. DE ID. Nº 1,
que puede incluir la delección de uno o más aminoácidos; así como
sus derivados, de manera particular compuestos que tengan 10, 15,
20, 25, 30, 40, 50 ó 55 aminoácidos de la secuencia completa de
aminoácidos de la SEC. DE ID. Nº 1, con uno o más residuo(s)
de aminoácido adicional(es) en la secuencia, posiblemente
enlazada con o modificada mediante (sustitución de uno o más átomos
de carbono o uno o más alquilo) amida, acetilo, fosforilo y/o
glicosilo u otros grupos sustituyentes.
La modificación de la secuencia original de
aminoácidos SEC. DE ID. Nº 1 se obtiene de manera preferible a
partir del extremo C-terminal mediante la fusión con
otras secuencias de aminoácidos "etiqueta", o la incorporación
de los grupos anteriormente identificados entre los que se incluyen
grupos fluorescentes en una o ambas extremidades de la secuencia
original SEC. DE ID. Nº 1 con el fin de conseguir un sustrato para
la selección de actividad proteolítica. Entre dicho polipéptido y
sus derivados (análogos) se excluyen los compuestos que tengan la
secuencia de aminoácidos SEC. DE ID. Nº 3 o la SEC. DE ID. Nº 4, y
sus derivados activos amidados, acetilados, fosforilados y/o
glicosilados, que representa el compuesto que no presenta la
actividad del compuesto de acuerdo con la invención, que no es
capaz de enlazarse con los siguientes receptores de la quimioquina
CCR-1, CCR-3, CXR-4
y/o CCR5.
De manera preferible, los residuos de aminoácido
adicionales a partir de la porción N-terminal o
C-terminal de la SEC. DE ID. Nº 1 son cadenas de 2
a 10 aminoácidos.
De acuerdo con una forma de realización
preferida de la presente invención, los derivados o análogos del
compuesto de acuerdo con la invención son la secuencia de
aminoácidos SEC. DE ID. Nº 1, que comprende un acoplamiento con un
grupo químico a partir del extremo N-terminal.
En la siguiente descripción, los péptidos de
acuerdo con la invención se identifican como quimioquinas PHC o
derivados de PHC o análogos, que se corresponden con péptidos PHC en
los que una porción, de manera preferible la porción
N-terminal, está modificada mediante su acoplamiento
o su sustitución con un grupo químico, de manera preferible de
acuerdo con el procedimiento descrito por H. Gaertner y col., (J.
Bio. Chem., Vol 217, pp, 2591-2603 (1996) y por G.
Simmons y col. (Science, Vol 276, pp. 276-279
(1997)).
De manera preferible, dichos derivados o
análogos de PHC tienen una de las siguientes estructuras:
- [Glioxiloil^{1}] PHC
1-pentano oxima,
- [Glioxiloil^{1}] PHC caproil oxima,
- D-met-[Gli^{1}] PHC,
- L-pirrolidona
carboxoil-[Gli^{1}] PHC,
- [Glioxiloil^{1}] PHC,
- [Glioxiloil^{1}] PHC
1-acetil-etilamina-2-oxima,
- [Glioxiloil^{1}] PHC S-metil
1-tiopropano-3-oxima,
- [Glioxiloil^{1}] PHC
2-penteno oxima,
- [Glioxiloil^{1}] PHC metano oxima,
- Hexanoil-[Gli^{1}] PHC,
- [Glioxiloil^{1}] PHC fenilmetano oxima,
- [Glioxiloil^{1}] PHC
1-propano oxima,
- [Glioxiloil^{1}] PHC
1-butano oxima,
- [Glioxiloil^{1}] PHC
2-butano oxima,
- Hexanil-[Gli^{1}] PHC,
- [Glioxiloil^{1}] PHC
2-propano oxima,
- [Glioxiloil^{1}] PHC pentano oxima,
- nonanil-PHC,
- [Glioxiloil^{1}] PHC
2-heptano oxima,
- [Glioxiloil^{1}] PHC etano oxima,
- [Glioxiloil^{1}] PHC
1-heptano oxima,
- [Glioxiloil^{1}] PHC
1-hexano oxima,
- [Glioxiloil^{1}] PHC
1-penteno oxima,
- nonanoil - PHC,
\newpage
o es un compuesto que tiene una de las
siguientes fórmulas:
- \quad
- - CH_{3} - (CH_{2})_{4} - CO - NH - CH_{2} - CO - PHC,
- \quad
- - CH_{3} - (CH_{2})_{5} - H - CH_{2} - CO - PHC,
- \quad
- - CH_{3} - (CH_{2})_{7} - CO - PHC,
- \quad
- - CH_{3} - (CH_{2})_{8} - PHC,
- \quad
- - HCOOH - (CH_{2})_{5} - O - N = CH - CO - PHC,
Los análogos de dichos compuestos son también
moléculas tales como anticuerpos u otros productos obtenidos a
partir de la química recombinante o selección de bibliotecas que
puedan imitar y de manera preferible incrementar las interacciones
entre dichos compuestos y sus receptores.
De acuerdo con otra forma de realización
preferida de la presente invención, uno o más aminoácidos, de manera
preferible residuos de lisina, histidina, glutamato, aspartato o
cisteína de los péptidos PHC se modifican mediante acoplamiento con
un grupo químico que tenga la estructura del polietilénglicol. Dicha
modificación permite el incremento del tiempo de semivida del
plasma de la molécula PHC original.
Más aún, el compuesto de acuerdo con la
invención a efectos de diagnóstico comprende una marca en una o más
de sus extremidades, de manera preferible una marca seleccionada
entre el grupo constituido por marcas radioactivas, moléculas de
biotina o estreptavidina, enzimas y/o moléculas fluorescentes.
Los compuestos preferidos de quimioquina PHC de
acuerdo con la invención son de origen humano, y se pueden obtener
a partir de un procedimiento de aislamiento iniciado con un
ultrafiltrado de sangre humana (hemofiltrado) y mediante el uso de
sistemas biológicos de ensayo para determinar su actividad
biológica.
Como se muestra en la Fig. 1, con el fin de
conseguir la purificación del compuesto de acuerdo con la invención,
los péptidos se preparan a partir de hemofiltrado humano tal como
se describe en Schulz-Knapp y col., (J. Chrom. A.,
Vol. 776, pp. 125-132 (1997)). A continuación, las
fracciones de hemofiltrado obtenidas se seleccionaron respecto de
su actividad estimulante de los receptores de la quimioquina, tras
lo cual las fracciones biológicamente activas se purificaron de
forma adicional mediante procedimientos cromatográficos usando
distintas etapas de cromatografía en columna de fase reversa, tal
como se describe en el Ejemplo 1.
Los péptidos biológicamente activos obtenidos a
partir de la separación cromatográfica se sometieron a determinación
de la estructura, incluyendo espectrometría de masa, y análisis de
la secuencia de péptidos.
Sin embargo, se podrían obtener también dichos
compuestos mediante tecnologías de recombinación genética, o por
síntesis, dichos procedimientos comprenden posiblemente también
etapas de purificación que se pueden llevar a cabo por una persona
experta en la técnica.
Un segundo aspecto de la presente invención se
refiere a un polinucleótido que comprende al menos una secuencia
que codifica el compuesto de acuerdo con la invención, de manera
preferible una secuencia de polinucleótido que codifica el
compuesto o sus porciones activas que tengan la secuencia de
aminoácidos SEC. DE ID. Nº 1, o fragmentos biológicamente activos o
partes de los mismos que muestren la actividad de la secuencia
completa.
Tal como se ha mencionado más arriba, la
presente invención está relacionada también con el polinucleótido
que codifica la secuencia de aminoácidos del compuesto de acuerdo
con la invención (tal como una molécula de ADNc, molécula de ADN
genómico, o molécula de ADN).
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a un vector que comprende dicho polinucleótido, de manera
preferible un vector adaptado para la expresión en una célula, y que
comprende el elemento de regulación necesario para la expresión de
dicho polinucleótido en una célula (de manera preferible, una célula
seleccionada entre el grupo constituido por una célula bacteriana,
una célula de levadura, una célula de insecto o una célula de
mamífero.
Dicho vector puede ser un plásmido o un virus,
de manera preferible un baculovirus, un adenovirus, un retrovirus o
un virus Semliki forest.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a la célula transformada (de acuerdo con técnicas conocidas por una
persona experta en la técnica) mediante el vector de acuerdo con la
invención, de manera preferible una célula de mamífero (tal como
una célula seleccionada entre el grupo constituido por una célula
COS-7, una célula CHO-K1, una
célula LM(tk-), una célula NIH-3T3, una
célula HEK-293, o una célula
K-562.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a una composición farmacéutica (vacuna) que comprende una cantidad
efectiva de uno o más compuestos de acuerdo con la invención así
como de los polinucleótidos que codifican dichos compuestos, y un
vehículo o diluyente farmacéuticamente adecuado, para uso como un
medicamento.
De manera ventajosa, otro aspecto está
relacionado con el uso de uno o más de dichos compuestos y
polinucleótidos para la fabricación de un medicamento para el
tratamiento y/o prevención de diferentes enfermedades (en las que
están implicados los CCR-1, CCR-3 y
CCR5), en especial las infecciones víricas, en particular las
enfermedades (SIDA) inducidas por el virus de la inmunodeficiencia
humana 1 y/o 2 (VIH-1 y/o VIH-2), o
el resto de los virus descritos más arriba; así como para la
preparación de un medicamento para el tratamiento y o prevención de
los trastornos de la migración celular, enfermedades o
perturbaciones del sistema inmunitario, entre los que se incluyen
cánceres, desarrollo de tumores y metástasis tumorales y linfoma de
Hodgkins, artritis reumatoide, psoriasis, dermatitis crónica por
contacto, enfermedad del intestino inflamatorio, esclerosis múltiple
(EM), apoplejía, sarcoidosis, rechazo del órgano transplantado,
procesos inflamatorios y neoplásicos, infecciones virales,
bacterianas y fúngicas, para la curación de heridas y huesos y
disfunciones de las funciones reguladoras del crecimiento, dolor,
diabetes, obesidad, anorexia, bulimia, enfermedad de Parkinson,
fallo agudo del corazón, hipotensión, hipertensión, retención
urinaria, osteoporosis, angina de pecho, infarto de miocardio,
estenosis, ateroesclerosis, enfermedades caracterizadas por la
proliferación excesiva de células de la musculatura lisa,
aneurismas, curación de heridas, enfermedades caracterizadas por la
pérdida de células de la musculatura lisa o proliferación reducida
de células de la musculatura lisa, apoplejía, isquemia, úlceras,
alergias (incluyendo asma) hipertrofia benigna de próstata,
migraña, vómito, trastornos psicóticos y neurológicos, incluyendo
ansiedad, esquizofrenia, depresión maníaca, depresión, delirio,
demencia y retraso mental severo, enfermedades degenerativas,
enfermedades neurovegetativas tales como la enfermedad de Alzheimer,
y disquinasias tales como la enfermedad de Huntington o el síndrome
de Gilles de la Tourett, entre otros.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a un kit o dispositivo de diagnóstico que comprende el compuesto
(posiblemente marcado) y los polinucleótidos de acuerdo con la
invención.
Una forma preferida de realización preferida de
dicho kit o dispositivo de diagnóstico es un kit o dispositivo para
la monitorización de la actividad de dichos compuestos frente a
diferentes receptores de la quimioquina, especialmente la
monitorización de su actividad con una correlación respecto de su
acción terapéutica o profiláctica frente a una o más de las
enfermedades mencionadas más arriba, o los síntomas de dichas
enfermedades.
De acuerdo con otra forma de realización
preferida de la presente invención, dicho kit o dispositivo es un
dispositivo de diagnóstico y/o dosificación de alto rendimiento de
selección, entendiendo por elevado rendimiento la identificación,
recuperación y/o dosificación de dichos compuestos, análogos,
antagonistas o inhibidores, que permitan la identificación de
grandes cantidades de compuestos conocidos o desconocidos, que
actúan como antagonistas o inhibidores de los compuestos de acuerdo
con la invención.
De manera preferible, dicho dispositivo de
diagnóstico y/o dosificación de alto rendimiento de selección, está
basado en el procedimiento descrito en la Solicitud de Patente
Internacional WO 00/02045.
Dicha tecnología de alto rendimiento de
selección se puede llevar a cabo en diferentes soportes sólidos,
tales como placas de microvaloración o biochips de acuerdo con las
técnicas conocidas por una persona experta en la técnica.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
al uso de moléculas recombinantes de acuerdo con la invención para
la preparación de un medicamento que se pretende para la prevención
y/o tratamiento de las enfermedades mencionadas más arriba, o a los
síntomas de dichas enfermedades, incluyendo el uso de una secuencia
de nucleótidos que codifican dichas moléculas recombinantes, y que
se incluyen posiblemente en un vector o se expresan en una célula
que se administrará tanto in vivo como ex vivo
mediante técnicas conocidas por una persona experta en la
técnica.
técnica.
La presente invención está relacionada también
con el uso de variantes de dichas moléculas con el fin de mejorar
la prevención y/o procedimiento terapéutico de acuerdo con la
invención o para reducir los posibles efectos secundarios inducidos
por dicho procedimiento en el paciente. Dicha modificación puede
incluir la delección o la adición de uno o más nucleótidos,
aminoácidos o grupos químicos a dichas moléculas o secuencia de
nucleótidos que codifican dichas moléculas.
La presente invención se describirá a partir de
ahora en referencia a las figuras incluidas.
La Figura 1 representa la purificación del
compuesto PHC-1 a partir del hemofiltrado
humano.
La Figura 2 representa el enlace de la actividad
funcional del pH del compuesto sobre los receptores recombinantes
humanos que se expresan en las células CHO-K1.
La Figura 3 representa la movilización del
calcio y la quimiotaxis inducida por el compuesto
PHC-1 en poblaciones primarias de células.
La Figura 4 representa la inhibición de la
infección por VIH-1.
La Figura 5 representa la selección de líneas
celulares humanes respecto de la activación proteolítica del
PHC-1.
La Figura 6 representa la inhibición de la
generación proteolítica de PHC-1 bajo diferentes
inhibidores de la serina proteasa.
De manera sorprendente, se ha demostrado que las
quimioquinas PHC-1 y PHC-2
procesadas de manera particular se pueden aislar a partir de
hemofiltrado humano, y representan agonistas muy activos de los
diferentes receptores de la quimioquina. La quimioquina
PHC-2 procesada es una forma truncada en el
N-terminal de la PHC-1 y ambos
polipéptidos se encuentran en el hemofiltrado humano, y pueden
representar las formas de procesado natural y altamente activas de
la secuencia conocida del precursor de las quimioquinas
HCC-1 (Schulz-Knappe y col. 1996,
Journ. Exp. Med. 183, pp. 295-299; Nº de acceso.
Q16627) o HCC-3 (Nº de acceso. Q13954).
Las quimioquinas PHC-1 y
PHC-2 nuevas identificadas pertenecen a la familia
de las beta-quimioquinas. Estas betaquimioquinas
tienen numerosas funciones relacionadas con la inflamación o la
curación de heridas, inmunoregulación, cáncer, enfermedades
infecciosas, y otros numerosos estados de enfermedad. El péptido
PHC-1 de acuerdo con la invención muestra una
afinidad de enlace muy elevada y se observa una actividad
estimulante muy potente con los receptores de la quimioquina, CCR2,
CCR4, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CXCR1 y CXCR4. El péptido
PHC-1 de acuerdo con la invención afecta a la
quimiotaxis/migración de los eosinófilos, linfocitos T, monocitos y
células dendríticas, y puede por tanto estar implicado en estados
inflamatorios en seres humanos, o se puede usar como agente
terapéutico o de diagnóstico en enfermedades inflamatorias,
inmunológicas o cáncer, y en infecciones tales como infecciones
víricas, bacterianas, fúngicas y protozoicas, en particular las
infecciones causadas por VIH-1 o
VIH-2.
Debido a la afinidad de enlace tan elevada con
el receptor de la quimioquina CCR5, que representa el
co-receptor más importante del
VIH-1, el polipéptido PHC-1 se
relaciona con una inhibición muy potente de la infección por VIH y
a la replicación del VIH en células humanas.
Las quimioquinas procesadas
PHC-1 y PHC-2 son de origen humano,
y se pueden obtener mediante un procedimiento de aislado a partir
de ultrafiltrado de sangre humana (hemofiltrado), y mediante el uso
de sistemas de ensayo biológico para determinar su actividad
biológica. Para conseguir la purificación de PHC-1 y
PHC-2, los péptidos se preparan a partir de
hemofiltrado humano, tal como se describe recientemente en la
bibliografía (Schulz-Knappe y col. 1997, J. Chrom.
A, 776, 125-132). Las fracciones del hemofiltrado
obtenidas se sometieron a selección respecto de sus actividad
estimulante del receptor de la quimioquina. A continuación, las
fracciones biológicamente activas se purificaron de forma adicional
mediante procedimientos cromatográficos usando diferentes etapas de
cromatografía en columna de fase reversa.
Los péptidos biológicamente activos obtenidos
mediante purificación cromatográfica se sometieron a determinación
estructural, incluyendo espectrometría de masas y análisis de la
secuencia de péptidos.
Además de la producción recombinante de
PHC-1 y PHC-2, también es posible
una síntesis total por etapas en fases sólidas habituales en los
términos de la síntesis de Merrifield.
Los péptidos del hemofiltrado humano se
prepararon tal como se ha descrito recientemente en la bibliografía
(Schulz-Knappe, P. y col. 1997, J. Chrom. A, 776,
125-132). Brevemente, los péptidos se extrajeron a
partir de 10.000 l de hemofiltrado humano obtenidos en un centro
nefrológico local. El hemofiltrado recogido se había obtenido a
partir de 40 pacientes adultos con enfermedad renal crónica.
Inmediatamente tras la filtración de la sangre usando ultrafiltros
con un corte específico de 20 kDa, el filtrado se refrigeró de
manera rutinaria a 4ºC, y se ajustó el pH a 3 para evitar el
crecimiento bacteriano y la proteolisis. Tras dilución con agua
desionizada hasta una conductividad inferior a 8 mS/cm, los lotes de
hemofiltrado de 800 - 1000 litros se acondicionaron exactamente a
pH 2,7 usando ácido clorhídrico. Los lotes se aplicaron a un fuerte
intercambiador catiónico (2 L de Fractogel TSK SP 650(M) de
Merck), y los péptidos se eluyeron en tandas con 10 L de acetato de
amonio 0,5 M a pH 7,0. Estos eluatos se almacenaron a -20ºC. Para
eliminar las cantidades residuales de albúmina de plasma en el
hemofiltrado concentrado, se llevó a cabo una etapa adicional de
ultrafiltración con los eluatos combinados correspondiente a 10,000
L equivalentes de hemofiltrado. La ultrafiltración se llevó a cabo
en un ultrafiltro sartocon-mini (0,1 m^{2},
membrana ps) con un corte específico Mr de 30 kDa. La filtración se
impulsó con un gradiente de presión transmembrana de 1 bar (10^{5}
N/m^{2}) a una temperatura de 5ºC y un caudal de
5-6 L/h.
Para la primera etapa de purificación de
PHC-1 y PHC-2, el ultrafiltrado se
diluyó con agua desionizada hasta una conductividad inferior a 6,7
mS/cm, y se ajustó exactamente a pH 2,7 usando ácido clorhídrico, y
se aplicó a una segunda columna de intercambio catiónico Fractogel
de 10 L. La columna se lavó con HCl 0,01 M hasta que la
conductividad fue inferior a 1 mS/cm. Se llevó a cabo la elución por
lotes de los péptidos enlazados usando los siguientes ocho
tampones: I : ácido cítrico 0,1 M pH 3,6; II : ácido acético 0,1 M +
acetato de sodio 0,1 M, pH 4,5; III : ácido málico 0,1 M, pH 5,0;
IV; ácido succínico 0,1, pH 5,6; V: dihidrógeno fosfato de sodio
0,1 M, pH 6,6; VI: hidrogeno fosfato de disodio 0,1 M, pH 7,4; VII:
carbonato de amonio 0,1 M, pH 9,0; VIII: agua, pH 7,0 (etapa de
desalado). Las fracciones de pH resultantes se combinaron (15 a 25
L), se acidificaron a pH 2-3, y se sometieron
inmediatamente a la segunda etapa de separación.
Para la segunda etapa de purificación de
PHC-1 y PHC-2, el eluato de la
fracción combinada de pH nº 5 se llevó a una columna Source RPC (15
\mum, 10 x 12,5 cm, Pharmacia), se lavó con dos volúmenes de
columna de solvente A (HCl 10 mM) y se llevó a cabo la separación
con un caudal de 200 ml/min con 8 L de un gradiente desde 100% de A
(agua, HCl 10 mM) hasta 60% de B (acetonitrilo al 80% (v/v), HCl 10
mM). Se recogieron fracciones de 200 ml, y se monitorizó la
absorbancia a 280 nm. Se liofilizaron alícuotas de estas fracciones
de péptido, y se ensayaron respecto de su bioactividad como se
describe más adelante.
La fracción 21 contenía los péptidos
biológicamente activos de acuerdo con esta invención (Figura
1A).
Para la tercera etapa de purificación de
PHC-1 y PHC-2, la fracción bioactiva
21 se llevó a una columna RP-C18
(15-20 \mum, 300 \ring{A}, 47 x 300 mm; Vydac,
Hesperia, USA) y la separación se llevó a cabo con un caudal de 40
ml/min usando los siguientes gradientes y tampones: desde un 90% de
A (agua, HCl 10 mM) hasta un 50% de B (80% de acetonitrilo, HCl 10
mM) en 48 min. Se recogieron fracciones individuales de 1 min, y se
midió la absorbancia a 214, y se ensayaron respecto de su
bioactividad como se describe más adelante. La fracción 12 contenía
los péptidos biológicamente activos de acuerdo con esta
invención.
Para la cuarta etapa de purificación de
PHC-1 y PHC-2, la fracción bioactiva
12 se llevó a una columna RP-C4 (5 \mum, 100
\ring{A}, 20 x 250 mm; Biotek Silica, Östringen, Alemania) y se
llevó a cabo la separación con un caudal de 7 ml/min usando los
siguientes gradientes y tampones: desde un 67% de A (agua, ácido
trifluoroacético al 0,1%) hasta un 58% de B (acetonitrilo al 80%,
ácido trifluoroacético al 0,1%) en 60 min. Se recogieron fracciones
individuales de 1 min, y se midió la absorbancia a 214 nm, y se
ensayaron respecto de su bioactividad como se describe más
adelante. Las fracciones 13 + 14 contenían los péptidos
biológicamente activos de acuerdo con esta invención.
Para la quinta etapa de purificación de
PHC-1 y PHC-2, las fracciones
bioactivas 13 + 14 se separaron de manera adicional en una columna
analítica RP-C18 (5 \mum, 30 nm, 1,0 x 25 cm;
Vydac; caudal ml/min) usando los siguientes gradientes y tampones:
desde un 70% de A (agua, ácido trifluoroacético al 0,1%) hasta un
45% de B (80% de acetonitrilo, ácido trifluoroacético al 0,1%) en
45 min. Se recogieron fracciones individuales de 1 min, se midió la
absorbancia a 214 nm, y se ensayaron respecto de su bioactividad
como se describe más adelante. Las fracciones 19 + 20 contenían los
péptidos biológicamente activos de acuerdo con esta invención.
Para la sexta etapa de purificación de
PHC-1 y PHC-2, las fracciones
bioactivas 19 + 20 se llevaron a una columna analítica
RP-C18 (5 \mum, 30 nm, 0,46 x 25 cm; YMC,
Schernbeck, Alemania; caudal: 0,6 ml/min) usando los siguientes
gradientes y tampones: desde un 77% de A (agua, ácido
trifluoroacético al 0,1%) hasta un 38% de B (80% acetonitrilo,
ácido trifluoroacético al 0,1%) en 45 min. Se recogieron fracciones
individuales de 1 min, se midió la absorbancia a 214 nm, y se
ensayaron respecto de su bioactividad como se describe más adelante.
La fracción 20 contenía los péptidos biológicamente activos de
acuerdo con esta invención.
Para la séptima etapa de purificación de
PHC-1 y PHC-2, la fracción bioactiva
20 obtenida se llevó a una columna analítica
lRP-C18AQ (3 \mum, 0,1 x 25 cm;
Reprosil-pur, Fa. Maisch, Ammerbuch 3, Alemania;
caudal: 0,02 ml/min) usando los siguientes gradientes y tampones:
desde un 77% de A (agua, ácido trifluoroacético al 0,1%) hasta un
38% de B (80% de acetonitrilo, ácido trifluoroacético al 0,1%) en 45
min. Se recogieron fracciones individuales de 0,5 min, se midió la
absorbancia a 214 nm, y se ensayaron respecto de su bioactividad
como se describe más adelante. Los péptidos biológicamente activos
PHC-1 y PHC-2 se encontraron en las
fracciones bioactivas 45 y 46
(Figura 1B).
(Figura 1B).
Una fracción resultante de la cromatografía de
intercambio catiónico se aplicó a un HPLC de fase reversa (columna
C18) y se ensayó la actividad biológica de las fracciones sobre la
CCR5 humana (línea rayada). Las etapas de purificación quinta y
final del material activo mediante HPLC de fase reversa (columna
C4). El pico activo (línea rayada) se analizó mediante
espectrometría de masas y degradación Edman, identificando
PHC-1 (Mr 7795) y HCC-1 de tamaño
completo (Mr 8673) como los compuestos principales de esta fracción.
El curso temporal de la actividad estimulante de la CCR5 generada
por la digestión tríptica de HCC-1, el cromatograma
RP-HPLC de la HCC-1 digerida con
tripsina (incubación de 1 h), mostró la generación de
PHC-1 bioactivo (sombreado) (Mr 7795) como uno de
los principales productos de degradación. La secuencia de
aminoácidos de la parte N-terminal de los
HCC-1, PHC-1, HCC-3
de tamaño completo y otras quimioquinas activas para CCR1, CCR3 o
CCR5. Los asteriscos marcan las primeras dos cisteínas
conservadas.
Los péptidos biológicamente activos obtenidos en
la séptima etapa de separación cromatográfica (ejemplo 1) se
sometieron a determinación de estructura. La determinación de la
masa de los péptidos purificados se llevó a cabo en un
espectrómetro de masas cuadripolar Sciex API III (Sciex,
Perkin-Elmer) con una interfase de electrospray
(ESI-MS). Se determinó que la masa molecular del
péptido PHC-1 nuevo identificado era de 7795 +/- 0,9
Da. Se determinó que la masa molecular del péptido
PHC-2 nuevo identificado era de 7479 +/- 1 Da
(Figura 1E).
Los péptidos biológicamente activos
identificados nuevos se secuenciaron en un secuenciador de fase gas
en un 473 A (Applied Biosystems) mediante degradación de Edman con
detección en línea de los aminoácidos de feniltiohidantoina, usando
el protocolo convencional recomendado por el fabricante:
Se determinó la siguiente secuencia
N-terminal para PHC-1:
- GPYHPSEXXFTYTTYKIPRQRIMDYYETNSQ...
X: no se detectó señal de aminoácido
Se determinó la siguiente secuencia
N-terminal para PHC-2:
- HPSEXXFTYTTYKIPRQRIMDYYETNSQ...
X: no se detectó señal de aminoácido
Se llevó a cabo una comparación de banco de
datos con las bases de datos Swiss-Prot y EMBL. Se
estableció una homología de secuencia, y se demostró la identidad
de secuencia tanto de PHC-1 como de
PHC-2 con la secuencia del precursor de la
quimioquina humana HCC-1 (Nº de acceso Q16627) o la
quimioquina humana HCC-3 (Nº de acceso).
PHC-1 y PHC-2 podrían representar
las formas naturalmente procesadas y biológicamente activas de la
quimioquina humana HCC-1 y/o de la quimioquina
humana HCC-3.
La masa molecular de PHC-1 (7795
Da) estaba exactamente de acuerdo con la masa teórica de un péptido
que comprendía los residuos de aminoácido
C-terminal 9-74 de la secuencia del
precursor de la quimioquina humana HCC-1, que se
calculó de 7795 Da. La masa molecular de PHC-2 (7479
Da) estaba exactamente de acuerdo con la masa teórica de un péptido
que comprendía los residuos de aminoácido C-terminal
12-74 de la secuencia del precursor de la
quimioquina humana HCC-1, que se calculó de 7479
Da.
La quimioquina PHC-1 procesada
fue un fuerte competidor del 125I-Rantes enlazante
de la CCR1 con una Ki de 0,023 \pm 0,007 nM (Ki \pm SEM).
PHC-1 fue un fuerte competidor del
125I-Eotaxin enlazante de la CCR3 con una Ki de
0,04 \pm 0,01 nM (Ki \pm SEM). PHC-1 fue un
fuerte competidor de 125I-MIP 1-alfa
enlazante de CCR5 con una Ki de 0,04 \pm 0,01 nM (Ki \pm
SEM).
Para conseguir la purificación de
PHC-1 y PHC-2, se usó un ensayo
biológico midiendo la activación del receptor de la quimioquina
CCR5. Así, cada una de las fracciones generadas durante el
procedimiento de purificación cromatográfica, que se ha descrito
más arriba, se ensayó sobre células CHO-K1 que se
habían transfectado de forma estable con el receptor de la
quimioquina 5 (CCR5; AC P51681). Se midió la activación de las
células mediante el receptor CCR5 mediante el siguiente ensayo de
la Aecuorina: la medida del incremento del calcio celular se llevó
a cabo como está descrito (Stables J y col. 1997, Anal. Biochem.
252,115-126). Las diferentes células
CHO-K1 que expresan de manera estable CCR5,
apoaecuorina mitocondrial y G\alpha16 se recogieron a partir de
placas con solución salina fosfatada libre de Ca^{2+}/Mg^{2+}
(Life Technologies, Gaithersburg, MD) suplementada con EDTA 5 mM,
se fragmentaron durante 2 min a 1000 x g y se resuspendieron en
D-MEM-F12 (Life Technologies,
Bethesda) hasta una densidad de 5 x 10^{6} células/ml. La
aecuorina activa se reconstituyó por incubación de las células
durante 4 horas a temperatura ambiente con coelenterazina h 5 \muM
(Molecular Probes, Eugene, OR) en medio
D-MEM-F12 que contenía 0,1 mg/ml de
albúmina de suero bovino. Tras esta incubación, las células se
diluyeron 10 veces en el mismo tampón y se agitaron durante 30
minutos antes de la medida. Se inyectaron a continuación 50 \mum
de la suspensión celular en placas de 96 pocillos que contenían las
muestras a ensayar. Se registró la emisión integrada de luz durante
30 s con un luminómetro Microbeta Jet (Wallac) o a Microlumat (EG
& G Berthold). Los resultados finales se representaron
gráficamente en forma de porcentaje de la respuesta obtenida con
ATP 1 \muM. El péptido purificado PHC-1 (que
corresponde a la secuencia del péptido HCC-1,
residuos 9-74) mostró una potente activación de las
células transfectadas con CCR5 (EC50 \pm SEM: 4,8 \pm 1,2 nM).
En comparación, las beta-quimioquinas conocidas
Rantes y MIP 1-alfa se usaron como controles
positivos (EC50 \pm SEM de 2,4 \pm 0,5 nM ó 3,3 \pm 0,8 nM,
de manera respectiva). En comparación, los péptidos
HCC-1, residuos 1-74 y
HCC-1, residuos 6-74 no mostraron
efecto sobre las células transfectadas
con CCR5.
con CCR5.
Los resultados se expresan en forma de Unidades
Relativas de Luz (RLU). Los símbolos representan las mismas
quimioquinas que para los paneles de enlace. Los resultados de los
ensayos de enlace y funcional son representativos de al menos 3
experimentos independientes.
Se enlazó la quimioquina procesada
PHC-1 con enlace por afinidad con diferentes
receptores de la quimioquina.
Para la determinación de sus propiedades de
enlace, se usaron células CHO-K1 que se habían
transfectado de forma estable con los receptores de la quimioquina
CCR1, CCR3, CCR5. Así, se usaron los extractos de membrana cruda
preparados a partir de las líneas celulares CHO-K1
que expresaban los diferentes GPCR en ensayos de enlace con
radioligandos. Los ensayos de enlace por competición se llevaron a
cabo en tubos Minisorp (Nunc, Roskilde, Dinamarca) en un volumen
total de 100 \muL que contenían ligando yodado 0,1 nM como
trazador, concentraciones variables de competidores, y cantidades
definidas de membranas. Se midió el enlace total en ausencia de
competidor, y se midió el enlace no específico con un exceso de 100
veces de ligando no marcado. Se incubaron las muestras durante 90
minutos a 25ºC, a continuación se filtraron a través de filtros GF/B
prehumedecidos en polietilenenimina al 0,3%. Los filtros se
contaron en un contador de centelleo gamma (Packard). Se
determinaron los parámetros de enlace con el software PRISM
(Graphpad software, San Diego, CA) usando regresión no lineal
aplicada a un modelo de competición de emplazamiento único.
La quimioquina procesada PHC-1
resultó un fuerte competidor de 125I-Rantes
enlazando con CCR1 con una concentración inhibitoria
semi-máxima de 2,3 \pm 0,7nM. (Ki \pm SEM).
PHC-1 resultó un fuerte competidor de
125I-Eotaxin enlazando con CCR3 con una
concentración inhibitoria semi-máxima de 78 \pm 14
nM (Ki \pm SEM). PHC-1 resultó un fuerte
competidor de 125I-MIP 1 1-alfa
enlazando con CCR5 con una concentración inhibitoria
semi-máxima de 0,04 \pm 0,01 nM (Ki \pm
SEM).
Se ensayó la actividad de PHC-1
sobre CCR1 y CCR3. PHC-1 fue más activa que RANTES
sobre CCR1 (EC50 \pm SEM: 2,8 \pm 0,8 nM comparado con 6,3
\pm 1,1 nM) y un antagonista razonablemente bueno de CCR3
(EC_{50} : 78 \pm 14 nM), mientras que fue inactivo sobre CCR2,
CCR4, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CXCR1 y CX3CR1.
La Figura 2 representa el compuesto
PHC-1, el HCC-1 de tamaño completo y
las quimioquinas de referencia ensayadas sobre CCR1, CCR3 y CCR5.
Los ensayos de enlace por competición se realizaron con
[^{125}I]-RANTES para CCR1,
[^{125}I]-Eotaxin para CCR3 y
[^{125}I]-MIP-1 para CCR5. Se
usaron como competidores PHC-1, HCC1,
MIP-1, RANTES, Eotaxin y MCP-4.
Los resultados se normalizaron para el enlace en
ausencia de competidor (100%), y el enlace no específico (0%). Se
llevaron a cabo ensayos funcionales basados en Aecuorina (paneles de
la derecha) usando células CHO-K1 que expresaban el
receptor de la quimioquina, apoaecuorina y G.
Se evaluó la migración de las células mediante
una técnica de microquimiotaxis en cámara (Neuroprobe, Gaithersburg
MD). El compartimiento inferior de la cámara se rellenó con
alícuotas de medio BSA al 0,1% o de cada una de las diferentes
concentraciones de quimioquinas (diluidas en medio BSA al 0,1%). El
compartimiento superior de la cámara se rellenó con una suspensión
celular de 55 \muL (5,10^{5} células/ml en medio BSA) de células
que, con anterioridad, se habían aislado y lavado tres veces en
medio BSA. Los dos compartimentos se separaron con un filtro de
policarbonato PVPF con tamaño de poro de 5 \mum u 8 \mum de
acuerdo con el tipo de célula ensayado, recubierto de colágeno
humano tipo IV a 20 \mug/ml durante 2 h a 37ºC. Se incubó la
cámara entre 30 y 180 minutos a 37ºC en aire humidificado con
CO_{2} al 5%. Al final del periodo de incubación, se retiró el
filtro, se fijó y tiño con un kit Diff-Quik.
Para cada una de las concentraciones de
quimioquina ensayada, se contaron las células emigrantes a través
del lado inferior del filtro en tres campos de aumento elevado (500)
mediante microscopía óptica (tras codificar las muestras) por
triplicado. Puesto que los resultados de varios experimentos se
combinan con el fin de evaluar la respuesta migratoria, y puesto
que se observó variación en la potencia de la migración entre los
diferentes experimentos, la respuesta a cada una de las
concentraciones de quimioquina se muestra en forma de un índice de
quimiotaxis. El índice de quimiotaxis en cada experimento se evaluó
calculando la siguiente relación: índice de quimiotaxis = el
promedio del número de células que emigran a una concentración
específica de quimioquina/el promedio del número de células que
emigran a medio BSA (= 0 ng/ml de quimioquina).
Los datos se presentan como la media y
desviación estándar (S.E.) de los índices de quimiotaxis de 3 - 4
experimentos. El nivel de línea base del número de células
transfectadas que migran fue de rango similar para todas las
células ensayadas (1-5), con un promedio de 6,7,
comprendido entre 2 y 18 células por campo de aumento. Debido al
gran tamaño de las células y a las limitaciones en el tamaño del
campo de aumento, se limitó la respuesta máxima a
70-80 células por campo de aumento. Los valores p de
emigración en respuesta a cada una de las concentraciones de
quimioquina en comparación con la emigración en respuesta a medio
BSA se calcularon basadas en el número real de células emigrantes
usando el ensayo de Student.
Para las medidas de calcio intracelular, las
células se cargaron durante 30 min a temperatura ambiente con
Fura2AM. Los estados transitorios del calcio se controlaron mediante
un espectrofluorímetro LS 50B (Perkin Elmer) tal como se describe
en G. Grynkiewicz, M. Poenie, R. Y. Tsien, J. Biol. Chem. 260, 3440
(1985).
En monocitos, la PHC-1 indujo
caudales de calcio firmes, comparables con los que despertaba RANTES
(Fig. 3A). PHC-1 50 nM insensibilizó estas células
para estimulación posterior por el mismo ligando (datos no
mostrados), y abrogó una respuesta adicional a RANTES 50 nM,
igualmente, mientras que la PHC-1 siguió siendo
capaz de movilizar el calcio a niveles reducidos tras una primera
estimulación con RANTES (Fig. 3A). Una estimulación anterior con
HCC-1 de tamaño completo, MIP-1b o
mayores concentraciones de RANTES no pudieron abolir completamente
la respuesta a PHC-1. Se obtuvieron resultados
similares con la línea celular monocítica THP-1.
Estos resultados sugieren que CCR1 y CCR5 tienen parte en la
respuesta funcional de los monocitos frente a PHC-1.
En los ensayos de quimiotaxis con monocitos, PHC-1
fue un tan potente (emigración máxima observada a 10 nm) y eficiente
como RANTES. Fue 100 veces más potente que el HCC-1
de tamaño completo, que aparece como un quimioatractor débil pero
eficiente (C. L. Tsou y col. (1998) J. Exp. Med. 188, 603).
PHC-1 movilizó el calcio de manera menos eficiente
que eotaxin en los eosinófilos (Fig. 3B). La respuesta al eotaxin se
redujo ligeramente tras la exposición anterior al
PHC-1, mientras que la actividad del
PHC-1 no se alteró tras la estimulación con eotaxin
(Fig. 3B) y se inhibió fuertemente tras la estimulación con
MIP-1a. Estos resultados apoyan el papel de la
PHC-1 como un antagonista débil de CCR3, y apoyan la
implicación de CCR1 en la respuesta funcional de los eosinófilos a
PHC-1. En los ensayos de quimiotaxis, la
PHC-1 fue menos potente pero casi tan eficaz como
eotaxin sobre los eosinófilos procedentes de la mayor parte de los
donantes. Sin embargo, para uno de los donantes, la
HCC-1 resultó ser débilmente quimiotáctica
únicamente a concentraciones elevadas, lo que se atribuyó a la baja
expresión de CCR1 observada sobre los eosinófilos procedentes de
algunos individuos (I. Sabroe y col. (1999) J. Immunol. 162,
2946). PHC-1, pero no la HCC-1 de
tamaño completo, movilizó el calcio en linfoblastos condicionados
con interleuquina-2. Se observó una
insensibilización cruzada completa entre las respuestas a
PHC-1 y MIP-1b, indicando que el
CCR5 es el receptor principal que usa PHC-1 en estas
células. La emigración de los linfoblastos se estimuló mediante
PHC-1 y MIP-1a, pero no mediante
HCC-1 de tamaño completo (Fig. 3C).
PHC-1 también indujo un pequeño flujo de calcio en
neutrófilos y la insensibilización de esta respuesta por RANTES,
pero no mediante MIP-1b implicado en CCR1. No se
observó quimiotaxis en neutrófilos con HCC-1 de
longitud completa o PHC-1.
Como se muestra en la Figura 3, los monocitos,
eosinófilos, y los linfoblastos condicionados con
IL-2 se ensayaron respecto de su respuesta
funcional a PHC-1, HCC-1 de tamaño
completo y las quimioquinas de referencia. Los experimentos de
estimulación de la movilización del calcio y de insensibilización
cruzada de la Figura 3 se llevaron a cabo con concentraciones de
quimioquina 50 nM. Las células se cargaron con
Fura-2AM y se monitorizó la concentración
intracelular de calcio ([Ca^{++}]_{i}) mediante medidas
de fluorescencia ratiométricas (R_{340/380}). Los ensayos de
quimiotaxis se llevaron a cabo en cámaras de 48 pocillos usando
membranas de filtro de policarbonato. La emigración celular en
respuesta a PHC-1, HCC-1, RANTES,
Eotaxin o MIP-1 se incluye en forma de índice de
emigración.
La quimioquina procesada PHC-1
es un potente inhibidor de la replicación del HIV. El enlace
peptídico con los cofactores de la entrada del
HIV-1 y bloquea de manera eficiente la replicación
vírica en cultivos celulares. La actividad antivírica de la
PHC-1 se investigó en un ensayo de infección por
inhibición. Se hicieron crecer células P4-CCR5 (NIH
AIDS Research and Reference Reagent program) (P. Charneau y col.
(1994) J. Mol. Biol. 241, 651) en DMEM, suplementado con FCS
al 10% y 1 \mug/mL de puromicina. Las células se sembraron en
placas de 96 pocillos de fondo plano, se cultivaron durante toda la
noche, y se incubaron con las quimioquinas durante dos horas antes
de la infección con virus que contenían 20 ng del antígeno p24 en un
volumen total de medio de 50 \muL. Tras incubación durante toda
la noche, las células se lavaron dos veces y se cultivaron en DMEM
fresco sin quimioquinas. Tres días después de la infección, las
células se lisaron y se midió la actividad de la
\beta-galactosidasa. Se aisló PBMC usando medio de
separación de linfocitos (Organon Teknika Corporation). Las células
se cultivaron en medio RPMI 1640 con FCS al 20% y 50 U/ml de
IL-2, y se midió la produccion de virus mediante
ensayo de transcriptasa inversa como se ha descrito (B. J. Potts, en
Techniques in VIH Research, A. Aldovini, B. D. Walker, Eds.
(Stockton, Nueva York, 1990), pp 103-106). Tanto
HCC-1 [9-74] como RANTES inhibieron
la infección por la cepa macrófago - trópica YU2 (Fig. 4a). RANTES
redujo la infección por YU2 en células P4-CCR5 en
más de un 95% a 3,2 \muM y en un 50% a 1,3 \muM.
HCC-1[9-74] fue ligeramente
más eficiente, bloqueando la infección por YU2 en un 50% a 0,5
\muM. Se obtuvieron resultados similares usando la cepa macrófago
- trópica JR-CSF. No se observó efecto inhibitorio
sobre la infección por YU2 mediante HCC-1 de
longitud completa. Ninguna de las tres quimioquinas inhibió la cepa
T - tópica NL4-3 (Fig. 4b). De acuerdo con los
resultados anteriormente publicados^{8}, RANTES mejoró la
infectividad de NL4-3 en aproximadamente un 50% a
concentraciones superiores a 0,6 \muM. En contraste, no se
observó efecto mejorador de la infectividad con
HCC-1[9-74] (Fig. 4b). Se
ensayó también si HCC-1[9-74]
pudiera inhibir también la replicación del HIV-1 en
células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Como se muestra
en las Fig. c y d, la replicación de la cepa macrófago - trópica
JR-CSF se bloqueó de manera significativa por
HCC-1 [9-74] y RANTES a
concentraciones de 125 nM, mientras que se necesitaban
concentraciones de 625 nm para la cepa YU2. No se observó inhibición
de la replicación de NL4-3, y la
HCC-1 resultó inefectiva para todas las cepas.
Como se muestra en la Figura 4, se infectaron
células que expresaban ambos co-receptores CCR5 y
CXCR4 con la cepa YU2, que usa CCR5 y con la cepa
NL4-3 que usa CXCR4, en presencia de
HCC-1, PHC-1 o RANTES. Los datos
representan la media y SEM de los puntos, realizados por triplicado.
Se infectaron PBMC C, D humanas con YU2 y JRCSF en presencia de
HCC-1, PHC-1 o RANTES. Los datos
representan la actividad de la transcriptasa inversa medida en
sobrenadantes de cultivo celular cosechados 14 días tras la
infección. Los resultados se expresan en forma de unidades de
luminiscencia fotoestimulada (PSL).
La secuencia de aminoácidos de ambos péptidos
nuevos identificados corresponde a la secuencia
C-terminal de la quimioquina humana
HCC-1, que comprendían originalmente 74 residuos de
aminoácido, y que se ha descrito formalmente su presencia en
cantidades nanomolares en el plasma humano
(Schulz-Knappe y col. 1996, Journ. Exp. Med. 183,
295-299). Puesto que los 74 residuos de aminoácido
que comprenden la quimioquina HCC-1 con una masa
molecular de 8673 Da resultaron completamente inactivos sobre el
receptor CCR1 (Ki 100nM), se usaron los 74 residuos de aminoácido
que comprenden la quimioquina HCC-1 como educto de
una digestión con el enzima tripsina para obtener cantidades
suficientes del péptido PHC-1 de 65 residuos de
aminoácido para ensayo biológico. Tras una hora de incubación
(relación ponderal (p/p) enzima/sustrato 1/100), el péptido de 74
residuos se rompió en parte en fragmentos más pequeños. Como
producto de rotura se obtuvo el péptido biológicamente activo
PHC-1 identificado nuevo, que comprendía los
residuos 9-74 de la secuencia del precursor
HCC-1, con la masa molecular de 7795 Da. El péptido
de esta invención se purificó de manera adicional hasta homogeneidad
(pureza > 99%) mediante dos etapas de cromatografía analítica en
fase reversa. El péptido PHC-1 obtenido a partir de
la digestión con tríptico del HCC-1 biológicamente
inactivo, 1-74, fue ensayado en los ensayos
biológicos que se han descrito más arriba, y mostró actividad
biológica completa (Fig. 2). Por el contrario, los péptidos
HCC-1, residuos 1-74 y
HCC-1, residuos 6-74 no mostraron
efectos en los ensayos que se han descrito más arriba.
Se seleccionaron algunas líneas celulares
humanas con el fin de identificar una fuente natural de la proteasa
que genera PHC-1. Se añadió 1 \muL de
HCC-1 de tamaño completo al medio de cultivo de 8
líneas de células tumorales: PC-3 (línea celular
del carcinoma de próstata, ATCC# CRL-1435, crecida
en medio nutriente de Ham F12 con suero fetal de ternero al 10%,
piruvato de sodio 1 mM, glutamato 1 mM, 100 U/ml de penicilina y 100
\mug/ml de estreptomicina; Du-146 o 52, (línea
celular del adenocarcinoma (ATCC HTB-81), crecida en
medio DMEM con suero fetal de ternero al 10%, piruvato de sodio 1
\muM, glutamato 1 \muM, 100 U/ml de penicilina y 100 \mug/ml
de estreptomicina, 143-B (línea celular del
osteosarcoma, ATCC# CRL-8303, crecida en medio DMEM
con suero fetal de ternero al 10%, piruvato de sodio 1 mM,
glutamato 1 mM, 100 U/ml de penicilina y 100 \mug/ml de
estreptomicina; Mel-22 y MeWo (líneas celulares del
melanoma, crecidas en medio DMEM con suero fetal de ternero al 10%,
piruvato de sodio 1 mM, glutamato 1 mM, 100 U/ml de penicilina y
100 \mug/ml de estreptomicina, MCF-7 (línea
celular del adenocarcinoma ATCC# HTB-22, crecida en
medio RPMI1640 con suero fetal de ternero al 10%, piruvato de sodio
1 mM, glutamato 1 mM, 100 U/ml de penicilina y 100 \mug/ml de
estreptomicina, y CRL-1555 (línea celular del
carcinoma epidermoide, ATCC# A431, crecida en medio RPMI1640 con
suero fetal de ternero al 10%, piruvato de sodio 1 mM, glutamato 1
mM, 100 U/ml de penicilina y 100 \mug/ml de estreptomicina. Tras
una incubación de 48 horas a 37ºC, el medio de cultivo se
centrifugó y ensayó en un ensayo de aecuorina usando células que
expresan CCR5, tal como se describe en el Ejemplo 3. La Figura 5
muestra que PC-3, DU-146 y
143-B activan la HCC-1 de tamaño
completo. El medio condicionado libre de suero obtenido a partir de
estas diferentes líneas celulares fue también capaz de activar la
HCC-1 de tamaño completo, indicando que la proteasa
generadora de PHC-1 era soluble. A medida que
PC-3 secreta elevadas cantidades de uroquinasa, una
serina proteasa, se ensayaron varios inhibidores de la serina
proteasa en medio condicionado PC-3 incubado con 500
nM de HCC-1 de tamaño completo durante 6 horas a
37ºC. Como se muestra en la Figura 6, todos los inhibidores de la
proteasa disminuyeron la activación de la HCC-1 de
tamaño completo. 3 \mug/ml de PAI-1, un inhibidor
específico de la uroquinasa, fue más eficiente que Pefabloc 4 mM; 2
\mug/ml de aprotinina fue inactiva. Más aún, un anticuerpo
inhibidor específico de la uroquinasa (anticuerpo monoclonal
neutralizante 394 frente a la \beta-cadena humana
uPA, American Diagnostica, USA) también inhibió la activación de la
HCC-1 de tamaño completo. La uroquinasa purificada
CHOAY (Sanofi Wintrop) se incubó a continuación a 37ºC durante 40
min con HCC-1 de tamaño completo 500 nM. El producto
de reacción se purificó en HPLC de fase reversa, y las fracciones
se analizaron a continuación mediante espectrometría de masas y
degradación de Edman, identificando PHC-1 y
HCC-1 de tamaño completo como los componentes
principales de estas fracciones. Como se ha especificado más
arriba, la PHC-1 generada con tripsina degrada a
continuación la PHC-1 en fragmentos inactivos
cuando se aumenta el tiempo de incubación. Se incubó
PHC-1 50 nM con 10 ó 100 IU de uroquinasa
purificada. No se observó variación en la actividad tras incubación
de 90 min a 37ºC, indicando que la uroquinasa no degrada la
PHC-1.
<110> FORSSMANN,
Wolf-Georg y col.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> QUIMIOQUINAS HUMANAS PROCESADAS
PHC-1 Y PHC-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P.SCRE.08/WO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> 00870140.1
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
22-06-2000
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<161> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: compuesto de quimioquina.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: compuesto de quimioquina.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 93
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: compuesto de quimioquina.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: compuesto de quimioquina.
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
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<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia N-terminal
PHC-1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Pro Tyr His Pro Ser Glu Xaa Xaa Phe Thr
Tyr Thr Thr Tyr Lys}
\sac{Ile Pro Arg Gln Arg Ile Met Asp Tyr Tyr
Glu Thr Asn Ser Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia N-terminal
PHC-2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Pro Ser Glu Xaa Xaa Phe Thr Tyr Thr Thr
Tyr Lys Ile Pro Arg}
\sac{Gln Arg Ile Met Asp Tyr Tyr Glu Thr Asn
Ser Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Pro Tyr His Pro Ser Glu Cys Cys Phe
Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Lys Thr Glu Ser Ser Ser Arg Gly Pro Tyr
His Pro Ser Glu Cys}
\sac{Cys Phe Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Lys Thr Glu Ser Ser Ser Gl Thr Gly Gly
Lys Pro Lys Val Val}
\sac{Lys Ile Gln Leu Lys Leu Val Gly Gly Pro
Tyr His Pro Ser Glu Cys}
\sac{Cys Phe Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Ser Leu Ala Ala Asp Thr Pro Thr Ala Cys
Cys Phe Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Pro Met Gly Ser Asp Pro Pro Thr Ala Cys
Cys Phe Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro Cys Cys
Phe Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Pro Asp Ser Val Ser Ile Pro Ile Thr Cys
Cys Phe Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Pro Ala Ser Val Pro Thr Thr Cys Cys Phe
Asn}
Claims (11)
1. Un compuesto que presenta más de un 95%
de identidad de secuencia con la SEC. DE ID. Nº 1, o sus derivados
amidados, acetilados, fosforilados y/o glicosilados, o fragmentos o
partes de los mismos, en los que el compuesto, derivados,
fragmentos o partes activan los receptores de la quimioquina CCR3 y
CCR5, tal como se determina mediante un ensayo de Aecuorina.
2. El compuesto de quimioquina,
caracterizado en que tiene la secuencia de aminoácidos de la
SEC. DE ID. Nº 1.
3. El compuesto de quimioquina de la
reivindicación 2, modificado o enlazado a uno o más grupos amida,
acetilo, fosforilo, y/o glicosilo.
4. El compuesto de quimioquina de acuerdo
con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 3 que se
enlaza con el receptor de la quimioquina CCR-1.
5. Un polinucleótido que codifica la
secuencia de aminoácidos del compuesto de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones anteriores.
6. Un vector que comprende el
polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 5.
7. Una célula transformada por el vector
de acuerdo con la reivindicación 6.
8. Una composición farmacéutica que
comprende un vehículo farmacéutico adecuado y el compuesto de
acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4, o el polinucleótido de
acuerdo con la reivindicación 5.
9. El uso de la composición farmacéutica
de acuerdo con la reivindicación 8 para la fabricación de un
medicamento para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad
inducida por infecciones víricas, en particular las enfermedades
inducidas por los virus de la inmunodeficiencia 1 y/o 2
(VIH-1 y VIH-2), o virus
seleccionados entre el grupo constituido por virus del herpes
simple, virus varicela zoster, virus de la hepatitis A, virus de la
hepatitis B, citomegalovirus, virus de la gripe, virus de la polio,
rinovirus, virus del sarampión, virus de la rubeola, virus de la
rabia, virus del sarcoma de Rous, virus de
Epstein-Barr, virus de varicela, un agente
bacteriano o una protosea.
10. El uso de la composición farmacéutica de
acuerdo con la reivindicación 9 para la fabricación de un
medicamento para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad
seleccionada entre el grupo constituido por inflamación (incluyendo
artritis reumatoide), cánceres (incluyendo los linfomas de
Hodgkins), restenosis, ateroesclerosis, alergias (incluyendo asma),
psoriasis, dermatitis de contacto crónica, enfermedad del intestino
inflamable, esclerosis múltiple, apoplejía, sarcoidosis, rechazo del
órgano trasplantado, infección inducida por agentes patógenos
incluyendo infecciones víricas por VIH-1 y
VIH-2 (SIDA).
11. El kit o dispositivo de diagnóstico que
comprende el compuesto de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4, o
el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 5.
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| DE19951336 | 1999-10-25 | ||
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