CN101370829A - 嵌合和人源化的抗-人il-13抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及免疫球蛋白，尤其是特异结合人白介素13(hIL－13)的抗体。本发明的抗体可以用于治疗多种对调节hIL－13和人IL－13受体间的相互作用有反应的疾病或病症。这类疾病包括重症哮喘、异位性皮炎、COPD和多种纤维化疾病。还公开了包含所述抗体的药物组合物和制备方法。

Description

嵌合和人源化的抗-人IL-13抗体
发明领域
本发明涉及特异结合白介素13(IL-13)、特别是人IL-13(hIL-13)的免疫球蛋白。本发明的一个实施方案涉及特异结合hIL-13的抗体。本发明还涉及以所述免疫球蛋白治疗疾病或病症的方法、包含所述免疫球蛋白的药物组合物及其制备方法。本发明的其它方面由以下说明而显而易见。
背景技术
白细胞介素-13(IL-13)
IL-13是一种12kDa的分泌的细胞因子，最初被描述为抑制炎性细胞因子产生的T细胞来源的细胞因子。结构学研究表明它有由两个二硫键维持在一起的四螺旋束状排列。虽然IL-13有四个潜在的糖基化位点，但对大鼠肺部天然IL-13的分析表明它在产生时是未糖基化的分子。从NSO和COS-7细胞表达人IL-13证实了这一观察结果(Eisenmesser等，J.Mol.Biol.2001 310(1)：231-241；Moy等，J.Mol.Biol.2001 310(1)：219-230；Cannon-Carlson等，Protein Expression and Purification 1998 12(2)：239-248)。
IL-13是由包括激活的Th2细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、树枝状细胞、角质形成细胞和NKT细胞在内的多种细胞类型所产生的多效性细胞因子。它还可以由Th0、Th1、CD8和未经刺激的(naive)CD45RA+T细胞产生。IL-13具有的免疫调节活性与IL4的有部分重叠，这一冗余现象可以由IL4和IL-13的受体共有一些组份得到解释。IL-13通过II型IL4受体来进行信号转导，该受体是由IL4Rα和IL-13Rα1链组成的异二聚体。IL-13Rα1结合IL-13的亲和力较低(Kd＝2-10nM)，但是结合了IL4Rα时它以高亲和力结合(Kd＝400pM)，并形成能转导信号的功能性IL-13受体(人受体在本文中成为“hIL-13R”)，从而导致JAK/STAT和IRS-1/IRS-2途径的激活。另外的IL-13受体链(IL-13Rα2)也已被表征，它与IL-13高亲和力结合(Kd＝250pM)。IL-13Rα2被认为是用作诱骗受体(decoy receptor)调节IL-13活性。IL-13也通过IL-13Rα2链传递信号(Fichter-Feigl 2006 Nature Medicine 12：99-106)来诱导TGFβ1，这样可能促进与哮喘病理学相关的纤维化。IL-13的功能性受体在多种细胞上都有表达，包括呼吸道上皮细胞、平滑肌、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、B细胞、成纤维细胞、单核细胞和巨噬细胞。T细胞没有IL-13的功能性受体(Hilton等，PNAS 1996 93(1)：497-501；Caput等，J.Bio1.Chem 1996 271(28)：16921-16926；Hershey GK，J.Allergy Clin.Immnol 2003 111(4)：677-690)。
IL-13和IL-4都通过促进与炎症相关的变应性和抑制细菌、病毒和胞内病原体引起的炎症而对免疫和炎症反应进行调节。IL-13主要的生物学效应包括：诱导B细胞增殖和调节同种型转化为IgE；诱导MHC II和CD23在B细胞和单核细胞上的表达；上调内皮细胞上的VCAM-1；调节趋化因子的产生；激活肥大细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞的功能，以及抑制单核细胞和巨噬细胞群中的促炎基因表达。IL-13对T细胞没有任何增殖作用。因此不同于IL4，IL-13在CD4T细胞到Th2型细胞的初始分化阶段中显得并不重要，而似乎对于变应性炎症的效应阶段很重要(McKenzie等，PNAS 1993 90(8)：3735-3739；Wynn TA，Annu.Rev.Immunol.2003 21：425-456)。
IL-13 与哮喘
哮喘是一种由下呼吸道炎症引起的慢性肺病，特征在于反复出现的呼吸问题。患者的呼吸道敏感，并且即使没有症状时也一直处于某种程度的肿胀或发炎。发炎导致呼吸道变窄，减少了进出肺部的气流，使得呼吸困难，导致气喘、胸部紧迫和咳嗽。哮喘的发生是由于对变应原(例如尘螨、花粉、霉菌)、刺激物(例如烟、气、强烈气味)、呼吸道感染、锻炼和干燥气候高敏感(super-sensitivity)引起的。这些促发因素刺激呼吸道和呼吸道壁肿起使炎症加重，然后粘液就会堵住呼吸道，呼吸道周围的肌肉收紧直至呼吸变得困难、紧张，出现哮喘症状。
来自动物模型和患者的有力证据表明，哮喘炎症和其它病理是由失调的Th2对大气变应原以及其它刺激物的反应造成的(Busse等，Am.J.Resp.Crit.Care Med.1995 152(1)：388-393)。尤其是，IL-13被认为是引起肺部中多种细胞性反应的主要效应细胞团子，包括呼吸道高敏感、嗜酸粒细胞增多、杯形细胞组织转化(metaplasia)和粘液分泌过多。
IL-13 在哮喘中的作用的临床证据
IL-13编码基因位于染色体5q31。该区域还含有编码IL-3、IL-4、IL-5、IL-9和GM-CSF的基因，并已经与哮喘联系起来了。与哮喘和特应性有关的IL-13基因变异在启动子和编码区都有发现(Vercelli D，Curr.Opin.Allergy CIin.Immunol.20022(5)：389-393)。可获得编码变体Q130IL-13(本文中称为“Q130 IL-13”)的功能性研究数据。在第四个外显子中发现的+2044G到A的单核甘酸多态性(SNP)导致130位上的精氨酸被谷氨酰胺所代替。还注意到，在SEQ.ID.NO：9中这等同于位点110，该序列中成熟的人IL-13氨基酸序列的起始处的第一个“G”氨基酸残基是位点1。已经发现这种变体在日本和欧洲群体中与哮喘、IgE水平上升以及异位性(atopic)皮炎相关。Q130 IL-13被认为比野生型IL-13的稳定性提高了。它对IL-13Rα2诱骗受体的亲和力略低，与这些观察结果一致的是，发现纯合Q130IL-13变体的患者中的中值血清IL-13水平比非纯合的患者高。这些结果表明Q130 IL-13可影响IL-13的局部和系统浓度(Kazuhiko等，J.Allergy Clin.Immunol 2002109(6)：980-987)。
在异位性和非异位性哮喘中都检测到IL-13水平升高。一项研究中检测到的哮喘患者的平均血清IL-13水平是50pg/ml，而在正常的对照患者中是8pg/ml(Lee等，J.Asthma 2001 38(8)：665-671)。在血浆、支气管-肺泡冲洗液、肺活检样品和痰中也都测到IL-13水平升高(Berr等，J.Allergy Clin.Immunol 2004 114(5)：1106-1109；Kroegel等，Eur Respir.J.19969(5)：899-904；Huang等，J.Immunol 1995 155(5)：2688-2694；Humbert等，J.Allergy Clin.Immunol 1997 99(5)：657-665)。
IL-13 与哮喘相关的体内证据
许多研究已经确定IL-13是推动变应性哮喘的急性和慢性小鼠模型中病理学的关键效应子。高亲和力IL-13受体(IL-13Rα2)或者抗IL-13的多克隆抗体已经被用于在这些模型中中和小鼠IL-13的生物活性。在变应原攻击时阻断IL-13彻底抑制了OVA诱导的呼吸道高反应、嗜酸粒细胞增多和杯形细胞组织转化。相反，在致敏之后和变应原攻击阶段给予IL-4的抗体只能部分减轻哮喘表型。因此虽然外源IL-4和IL-13都能诱导哮喘样表型，但是IL-13的效应子活性似乎高于IL-4。这些数据提示IL-4的首要作用是在免疫诱导过程中(特别是Th2细胞发育和募集到呼吸道，以及IgE产生)，而IL-13被认为主要参与各种效应子后果，包括呼吸道高反应、粘液过多和细胞炎症(Wills-Karp等，Science 1998282：2258-2261；Grunig等，Science 1998 282：2261-2263；Taube等，J.Immunol 2002 169：6482-6489；Blease等，J.Immunol 2001 166(8)：5219-5224)。
在补充性实验中，通过在转基因小鼠中过表达IL-13或者在野生型小鼠气管中滴注IL-13使肺部IL-13水平升高。两种情况都诱导出哮喘样特征：对胆碱能刺激的非特异性呼吸道高反应、肺嗜酸粒细胞增多、上皮细胞增生、粘液细胞组织转化、上皮下纤维化、呼吸道阻塞和Charcot-Leyden样晶体。另外，IL-13被发现是肺中基质金属蛋白酶和组织蛋白酶的强力刺激物，导致气肿性变化和粘液组织转化。因此IL-13可能是哮喘和COPD病表型的重要效应子分子(Zhu等，J.Clin.Invest.1999103(6)：779-788；Zheng等，J.Clin.Invest.2000 106(9)：1081-1093)。
这些资料表明IL-13活性是在成熟动物模型中产生变应性哮喘的一些主要临床和病理学特征所必要的和充分的。
慢性阻塞性肺病(COPD)
COPD是统称，涵盖了几种临床综合征，包括肺气肿和慢性支气管炎。COPD的症状与哮喘类似，可以用同样的药物来治疗。COPD的特征在于慢性、渐进和一般来说不可逆的呼吸道阻塞。个体因素对疾病进程的影响还是未知的，但认为吸烟引起90％的病例。其症状包括咳嗽、慢性支气管炎、无法呼吸以及呼吸道感染。最终该病会造成严重的功能障碍和死亡。在没有其它解释的情况下，患者在2年时间的至少3个月内多数时候都有咳嗽或者生痰就诊断为慢性支气管炎。肺气肿的特征是异常的充气容积永久性扩张和肺泡壁破坏。
IL-13可能在COPD的发展中起作用。出现COPD的吸烟者的肺实质中有许多炎症细胞类型(嗜中性粒细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞)。IL-13是促炎Th2细胞因子，因此为了模拟肺气肿进展，Zheng等在IL-13转基因小鼠中在呼吸道上皮定向过表达了IL-13。这些动物出现呼吸道和肺实质炎症和肺气肿。它们还发展成让人想到慢性支气管炎的粘液组织转化(J.Clin.Invest 2000 106(9)：1081-1093)。
还据报道，与变应性哮喘相关的IL-13启动子多态性(-1055C到T)在COPD患者中的频率比健康对照中高。这暗示着IL-13启动子多态性在更高风险出现COPD中起作用(Kraan等，Genes and Immunity 20023：436-439)。此外，与无症状吸烟者相比，在患有慢性支气管炎的吸烟者中还观察到IL-13和IL-4阳性细胞数量的增加(Miotto等，Eur.Resp.J.2003 22：602-608)。但是最近一项评估肺气肿重症患者肺中IL-13表达水平的研究没有发现IL-13水平与该病相关(Boutten等，Thorax 200459：850-854)。
变应性疾病，包括异位性皮炎和变应性鼻炎
IL-13还参与了异位性病症，如异位性鼻炎和异位性皮炎。在美国变应性鼻炎是最普遍的异位性疾病，据估计该病影响到多达25％的成人和超过40％的儿童。变应性鼻炎和哮喘有密切关系。两种状况有相同的免疫病理学和病理生理学；它们有类似的免疫学过程，在该过程中鼻和支气管组织中的嗜酸性粒细胞和Th2淋巴细胞起到一定作用。Th2细胞因子，特别是IL-4和IL-5的过量产生被认为是变应性疾病的致病原因基础。IL-13与IL-4共有一些特性和效应子功能，结合IL-4和IL-13在受体使用、胞内信号转导组分和基因构成上的功能重叠，这一点提供了有力(虽然是间接)证据证明IL-13在促进或者维持人体内速发型超敏反应中的作用。这已经由Li等证实(Li等，J.Immunol 1998；161：7007)，他们证明患有季节性变应性鼻炎的异位性个体在应答依赖于Ag而非多克隆激活时，表现出显著更强的IL-13应答。
异位性皮炎是一种常见的慢性、复发性、非常痒的炎性皮肤病。异位性皮炎患者的病变皮肤在组织学上的特征是炎性T细胞渗透，这一点在急性发病期与IL-4、IL-5以及IL-13的优势表达相关(Simon等，JAllergy Clin Immunol 2004；114：887；Hamid等.J Allergy Clin Immunol1996；98：225)。此外，Tazawa等证实异位性皮炎患者的亚急性和慢性皮肤病变中IL-13(而非IL-4)mRNA显著上调(Tazawa等，Arch Derm Res2004；296：459)。这些患者中表达IL-13的循环CD4+和CD8+T细胞频率也有显著提高(Aleksza等，British J Dermatol 2002；147；1135)。这种IL-13活性升高被认为会导致血清IgE水平升高，从而促进异位性皮炎的病理发生。而且，新生儿CD4+T细胞的IL-13产生增加是有用标志，用于鉴定那些随后出现变应性疾病，尤其是异位性皮炎的高风险新生儿(Ohshima等，Pediatr Res 2002；51：195)。Simon等(Simon等，J Allergy ClinImmunol 2004；114：887)提供了其它证据表明IL-13对于异位性皮炎的病原学重要性；局部使用他克莫司软膏(一种免疫抑制药物，抑制用于细胞因子产生的胞内信号转导途径)使得异位性皮肤病变在临床和组织学方面得到显著的改善，并且伴有Th2细胞因子(包括IL-13)的局部表达明显减少。此外，已证实异位性皮炎患者的皮肤中基底上层角质细胞上过表达IL-13Rα1(一种细胞表面蛋白，它与IL-4Rα一起形成IL-13的功能性受体)的过表达，并且IL-13能够在体外上调IL-13 Rα1 mRNA(Wongpiyabovorn等，J Dermatol Science 2003；33：31)。
这些资料合起来表明IL-13靶向介入，包括使用IL-13单克隆抗体，可能提供治疗人变应性疾病的有效方法。
食管嗜酸粒细胞增多
在患有不同疾病的患者中，食管中嗜酸粒细胞聚集是一个常见医学问题，这些疾病包括胃食管反流病、嗜酸性食道炎、嗜酸粒细胞性胃肠炎和寄生虫感染。食管嗜酸粒细胞增多和变态反应有关，反复用空气变应原攻击小鼠建立了变应性呼吸道炎症和食管嗜酸粒细胞增多的联系。Th2细胞被认为能够通过分泌包括IL-4和IL-13在内的一系列细胞因子来诱导嗜酸粒细胞相关炎症，这些细胞因子直接或者间接地激活炎性和效应子途径。IL-13似乎尤其重要，因为它由Th2细胞大量产生，并调节变应性疾病的多种特性(例如，IgE生成、粘液过多、嗜酸粒细胞募集和存活以及呼吸道超敏反应)。在体外、离体、和体内的条件下接触GM-CSF和/或IL-5之后，嗜酸粒细胞在嗜酸粒细胞性炎症反应中可生成功能上有活性的IL-13。(Schmid-Grendelmeier.J Immunology 2002，169：1021-1027)。将IL-13通过气管内给药递送到野生型、STAT-6、嗜酸粒细胞激活趋化因子(eotaxin)-1或IL-5缺陷小鼠的肺部，确认了IL-13引发的肺部炎症是和食管嗜酸粒细胞增多症的发病联系在一起的(Mishra等，Gastroenterol 2003；125：1419)。这些资料合在一起证明了IL-13在食管嗜酸粒细胞增多症中的作用。
肿瘤学指征
另外一个重要的兴趣所在是针对IL-13或IL-13受体来抑制一些类型肿瘤的生长。l型T细胞介导的宿主防御被认为能够介导体内最有力的肿瘤排斥，而偏离到Th2型反应就可能导致肿瘤排斥被阻断和/或促进肿瘤的复发(Kobayashi M等，J Immunology 1998；160：5869)。一些利用可移植的肿瘤细胞系进行的动物研究，通过证明Stat6、IL-4和IL-13(部分由NKT细胞产生)能够抑制肿瘤排斥支持了这一论点(Terabe等，Nat.Immunol.2000 1：515；Kacha等，J Immunol 2000；165：6024-28；Ostrand-Rosenberg等，J Immunol 2000；165：6015)。在缺少Stat-6情况下的强抗肿瘤活性被认为是由于肿瘤特异性IFNg的产生以及CTL活性的增强。此外，已显示NKT细胞减少会使IL-13产生下降，同时肿瘤复发率上升，表明IL-13(其部分由NKT细胞产生)对于免疫监督是重要的(Terabe等，Nat.Immunol 2000；1：515)。因此，这些发现提示IL-13抑制物或者新的IL-13拮抗剂(包括IL-13单抗)通过干扰IL-13的负调节作用，即下调对肿瘤细胞的免疫反应，可能成为有效的癌症免疫治疗剂。
除了促进Th-l型相关的抗肿瘤防御，IL-13抑制物还可能能够更直接地阻断肿瘤细胞生长。例如，在B-细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)和何杰金病中，IL-13阻断细胞凋亡或者促进肿瘤细胞增殖(Chaouchi等，Blood 1996；87：1022；Kapp等，J.Exp.Med.1999；189：1939)。B-CLL是起源于B淋巴细胞的临床上异质性疾病，该病涉及白血病细胞的细胞凋亡缺陷。IL-13不被认为是一个直接的生长因子，而认为是防止肿瘤细胞的体外自发凋亡，并且可能通过使赘生性细胞免于死亡有助于B-CLL。
霍奇金病在美国是一类主要影响年轻人的淋巴癌，在美国每年导致约7500病例。这种癌症的特点是存在大量的多核化霍奇金/Reed-Stemberg细胞(H/RS)。绝大多数病例中，恶性细胞群从B细胞出现。几种来源于霍奇金病的细胞系，以及从霍奇金淋巴癌患者取得的淋巴结组织都过表达IL-13和/或IL-13受体(Kapp等，J.Exp.Med.1999；189：1939，Billard等，Eur Cytokine Netw 1997；8：19；Skinnider等，Blood2001；97：250；Oshima等，Cell Immunol 2001；211：37)。已证实中和抗IL-13单抗或者IL-13拮抗剂以剂量依赖性的方式抑制了H/RS细胞的增殖(Kapp等，J.Exp.Med.1999；189：1939；Oshima等，Cell Immunol 2001；211：37)。类似地，将可溶性IL-13Rα2诱骗受体递送给植入了来源于霍奇金病的细胞系的NOD/SCID小鼠，使得肿瘤发生和生长被延迟，存活率提高，这一结果表明中和IL-13在体外和体内都可抑制霍奇金淋巴癌的生长(Trieu等，Cancer Research 2004；64：3271)。这些研究结合在一起说明了IL-13是以自分泌的方式刺激H/RS细胞的增殖(Kapp等，J.Exp.Med.1999；189：1939；Ohshima等，Histopathology 2001；38：368)。
因此，中和IL-13可能代表了有吸引力的有效的治疗霍奇金病和其它B细胞相关的癌症的方法，其抑制肿瘤细胞生长，同时强化抗肿瘤防御。
炎性肠病
IL-13可能在炎性肠病(IBD)发病机制中起作用。炎性肠病包括几种疾病，在临床上分为溃疡性结肠炎、克罗恩氏病(Crohn’s disease)和原因未定型结肠炎(indeterminate colitis)。其主要表现是由过度免疫反应和肠粘膜中TH1和Th2淋巴细胞激活失衡所致的慢性肠炎。这在克罗恩氏病(Bamias，Gastroenterol 2005；128：657)和溃疡性结肠炎(Heller等，Immunity 2002；17：629)动物模型中已证实。通过给予13Rα2-Fc中和IL-13，在人溃疡性结肠炎的Th2小鼠模型中预防了结肠炎(Heller等，Immunity 2002；17：629)。此外，该模型中IL-13的产量迅速超过IL-4的产量，并且IL-13的产生可以通过刺激NKT细胞来诱导，这提示组织损伤可能是由于IL-13对上皮细胞的毒性造成的。有一些人体数据可以支持这些发现：来自溃疡性结肠炎患者的直肠活检样品的IL-13阳性几率明显高于炎性和非炎性对照研究对象，并观察到与非急性溃疡性结肠炎相比IL-4和IL-3表达率在急性溃疡性结肠炎中更高(Inoue等，Am JGastroenterol 1999；94：2441)。另外，Akido等研究了来自克罗恩氏病患者肠段的外肌层的免疫活性，发现IL-4和IL-13通过STAT-6途径介导肠平滑肌细胞的超收缩性。作者总结说该途径可能促成克罗恩氏病患者的肠肌超收缩(Akiho等，Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2005；288：619)。
因此，IL-13单抗，或许与针对其它细胞因子的分子结合起来，可以提供终止或者延缓IBD进展的方法。
银屑病和银屑病性关节炎
银屑病是一种慢性皮肤病，特征在于角质细胞过度增殖和免疫细胞(包括活化的T细胞)渗透，产生各种会影响皮肤角质细胞表型的细胞因子。CDw60是带有碳水化合物的分子，它在银屑病皮肤的银屑基部和基部上层角质细胞表面被上调。源自银屑病损伤的T细胞所分泌的IL-4和IL-13被证实强烈地上调CDw60在角质细胞上的表达(Skov等，Am JPathol 1997；15：675)，而γ干扰素阻断由IL-4/IL-13介导的对培养的角质细胞上CDw60的诱导(Huang等，J Invest Dermatol 2001；116：305)。因此，CDw60在银屑皮肤角质细胞上的表达被认为至少部分受到病变内活化T细胞所分泌的IL-13的诱导。此外，一起构成IL-13受体复合物的细胞表面蛋白IL-13Rα1和IL-4Ra在有和没有银屑病的患者的皮肤活检样品中是差异表达的(Cancino-Diaz等，J Invest Dermatol 2002；119：1114；Wongpiyabovorn等，J Dermatol Science 2003；33：31)，体外实验显示IL-13(而非IL-4)可上调IL-13Rα1的表达(Wongpiyabovorn等，J DermatolScience 2003；33：31)。由于IL-13能够作用于许多细胞类型，这些研究提示IL-13受体可能在银屑病的早期炎症过程中发挥作用。
银屑病性关节炎的特点是由促炎和抗炎细胞因子介导的滑膜炎。IL-13在不同形式的关节炎中的作用越来越受关注。Spadaro等观察到银屑病性关节炎和类风湿关节炎患者滑膜液中IL-13浓度显著高于骨关节炎患者的。此外，银屑病性关节炎患者滑膜液中IL-13水平显著高于血清中的，IL-13的滑膜液/血清比率在银屑病性关节炎组中明显高于类风湿关节炎组，提示局部产生的IL-13可能在银屑病性关节炎患者的滑膜组织中发挥作用(Spadaro等，Ann Rheum Dis 2002；61：174)。
IL-13在其它状况中的可能作用
急性移植物抗宿主病是在干细胞移植之后致残和致死的重要原因，该病与供体和受体之间的人白细胞抗原(HLA)不相容程度直接相关。Jordan等首次认定IL-13是典型的Th2细胞因子，它在不相关、不匹配MLR(混合淋巴细胞反应；一种体外检测法，用于初步HLA分型之后的供体细选)情况中会大量产生(Jordan等，J Immunol Methods 2002；260：1)。该相同小组随后证实，在无关供体干细胞移植之后，供体T细胞的IL-13产生预示着急性移植物抗宿主病(aGVHD)(Jordan等，Blood2004；103：717)。所有在干细胞移植后发生严重的III级aGVHD的患者，其供体都产生非常高的移植前IL-13反应，这一点表明IL-13水平和aGVHD之间显著相关，加大了IL-13直接引起一些aGVHD相关的病理机制的可能性。因此，基于特异性阻断IL-13的治疗方法可能可用来治疗干细胞移植后aGVHD。
糖尿病性肾病是西方国家晚期肾病的主要原因之一。虽然1型糖尿病导致的肾病发病率在下降，但现在2型糖尿病在美国、日本和欧洲是引起肾衰竭最常见的单一因素。此外，由于心血管事件导致的极高死亡率，这个患者群的维持性透析预后极差。目前越来越清楚的是，血流动力学、代谢以及结构变化是交织在一起的，也鉴定到了在该病发病机理中发挥作用的各种酶、转录因子和生长因子。特别是，TGF-β对肾肿大的出现和胞外基质组分的累积非常重要，被认为是介导肾脏中胶原形成的关键性细胞团子(Cooper，Diabetologia 2001；44：1957；Wolf，Eur JClin Invest 2004；34(12)：785)。在实验性和人糖尿病性肾病中，TGF-1生物活性提高，将TGF-β1抗体给予糖尿病小鼠改善了肾功能，并减少细胞外的基质累积。最近在肺纤维化转基因小鼠模型中，IL-13被证实至少部分地通过调节TGF-β1的产生和激活以及胶原累积来发挥其作用(Lee等，J.Exp.Med.2001；194：809；Zhu等，J.Clin.Invest.1999；103：779)，这样就在IL-13和TGF-β之间建立起直接的功能联系。因此我们可预见到IL-13在糖尿病性肾脏中有类似的调节TGF-b1活性的作用，IL-13靶向介入可能在处理糖尿病性肾病时发挥作用。
纤维变性状况
肺纤维化是肺部不当和有害的生疤痕状况，会致残，甚至经常导致死亡。该术语涵盖了多种不同状况，它们的病因、发病机理以及对治疗的反应各有不同。在一些病例中纤维化的起因被鉴定。这些病因包括(1)吸入促纤维化物质，比如石棉或硅，或者硬金属粉尘(2)吸入患者对其有特异体质免疫反应的有机物，导致纤维化(例如农民肺)(3)药物，例如硝基呋喃托英、乙胺碘呋酮和氨甲蝶吟(4)与系统性炎症有关，比如系统性硬化病或者类风湿性关节炎。
但是在许多情况中病因或者潜在的症状不明。许多这样的患者就诊断为自发性肺纤维化(IPF)。这相对少见的状况(发病率为20/100000)。这是在没有鉴定的病因的基础上，结合一些放射学和病理学特征，尤其是CT上的蜂窝影象或肺活检做出的诊断。该病一般见于老年患者(>50)，经常跟在不断发展的渐进性肺损伤之后，导致死亡，所引证的中值存活期为2-5年。而且，患者在几个月或几年的病情发展过程中会经历非常痛苦的无法呼吸。该病最初会限制体力活动，但在末期(可能持续几个月)患者即便是休息时也无法呼吸，愈加依赖氧气。
目前该病还没有令人满意的治疗方法。现在一般采用皮质类固醇和免疫抑制剂(比如硫唑嘌呤)来治疗。但是皮质类固醇对许多患者可能无效，它们的副作用也许使病情加重。目前正在研究的许多可能的治疗方法包括使用干扰素γ和吡非尼酮，其中前者在最近一个大型研究中显示出有提高存活率的倾向。
有证据表明IL-13以及Th2表型相关的细胞因子参与了组织修复中的纤维化过程(Wynn TA，Nat.Rev.Immunol.2004 4：583-594；Jakubzick等，Am.J.Pathol.2004 164(6)：1989-2001；Jakubzick等，Immunol.Res.200430(3)：339-349；Jakubzick等，J.Clin.Pathol.2004 57：477-486)。IL-13和IL-4参与到许多纤维变性状况中。血吸虫诱导的肝纤维化表现出IL-13依赖性，很少有证据表明硬皮病的致病机理涉及到IL-13(Hasegawa等，J.Rheumatol.1997 24：328-332；Riccieri等，Clin.Rheumatol.200322：102-106)。
就肺纤维化而言，体外研究已经显示IL-13促进纤维发生表型。动物研究表明在人为诱导的纤维化模型中IL-13的表达水平上升，而消除IL-13可减轻纤维化。
IL-13能促进促纤维化表型。在细胞水平上有多种机制是IL-13可能借以促进纤维化的。这些机制的信号途径及其重要性还没有很好地确定。
有证据表明，IL-13作用于成纤维细胞可促进胶原产生并抑制其降解，从而有利于纤维化表型。皮肤成纤维细胞具有IL-13受体(＝II型IL-4受体)，培养的皮肤成纤维细胞暴露于IL-13导致胶原生成增加(Oriente等，J.Pharmacol.Exp.Ther.2000 292：988-994)。IL-4也有类似但更短暂的效果。人肺成纤维细胞系(ICIG7)表达II型IL-4受体(Jinnin等，J.Biol.Chem 2004 279：41783-41791)。将这些细胞暴露于IL-13可促进多种炎症介质和促纤维化介质的分泌：GM-CSF、G-CSF、VCAM β1整联蛋白(Doucet等，Int.Immunol.1998 10(10)：1421-1433)。
IL-13抑制皮肤成纤维细胞在IL-1a的诱导下产生基质金属蛋白酶1和3，上这样会使EC基质的分解趋于减少(Oriente等，J.Pharmacol.Exp.Ther.2000292:988-994)。IL-13与TGF-β协同作用于由哮喘呼吸道组织活检得到的人成纤维细胞，从而促进金属蛋白酶1(TIMP-1)的组织抑制剂的表达。胞外基质的分解是基质金属蛋白酶实现的，而基质金属蛋白酶被TIMP-1所抑制。因此IL-13的这一作用趋于减少基质的降解(Zhou等，Am.J.Physiol.Cell Physiol.2005288：C435-C442)。
转基因小鼠过表达IL-13导致了上皮下纤维化、上皮细胞肥大、杯形细胞增生、晶体沉积(酸性哺乳动物几丁质酶)、呼吸道高反应、间质纤维化、2型细胞肥大和表面活性剂累积(Zhu等，J.Clin.Invest.1999103(6):779-788)。
不同品系的小鼠对博莱霉素诱导的肺纤维化的易感性不同。C57B1/6J小鼠对博莱霉素敏感，迅速显示出IL-13、IL-13Rα和IL-4(以及TGFβ、TNFRα和IL1Rs)的上调。不敏感的BALB/c小鼠不表现IL-13的上调。
Belperio等(Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.200227：419-427)在小鼠博莱霉素纤维化模型中研究了IL-13、IL-4和CC趋化因子C10的表达和作用。应答博莱霉素，肺组织的IL-13和IL-4水平都升高了。如通过检测肺羟脯氨酸浓度所评估的，用多克隆抗IL-13抗体预先将IL-13中和能够显著地降低博莱霉素诱导的肺纤维化。虽然在同一模型中IL-4表达也上升了，但是中和IL-4对肺纤维化没有影响。
另一个用FITC诱导BALB/c小鼠的急性肺纤维化模型中，在没有IL-13(基因敲除)但有IL-4的情况下，抗肺纤维化。在IL-13基因敲除后再敲除IL-4没有增加的保护作用(Kolodsick等，J Immunol2004172:4068-4076)。缺少IL-13情况下的保护作用不是由于细胞募集到肺部有差异：在所有的基因敲除株和BALB/c中，募集的细胞总数是类似的，所以起始炎症成分似乎没有受到影响。与BALA/c相比，IL-4和IL-13敲除株的嗜酸粒细胞募集要低，但是因为IL-4-/-没有免于纤维化，这一点不能解释纤维化差异。可能今人惊讶的是，IL-13+/+和-/-的细胞因子(包括IL10、MCP-lγ干扰素、)水平没有差别。此外，FITC处理后从不同动物肺中分离的成纤维细胞数量相同，但是在IL-13-/-小鼠中胶原蛋白I的产量减少。这表明失去IL-13不是简单地防止炎症反应，而是具有更特异的抗纤维化作用。IL-13曾经被认为可能是通过TGF-i发挥其成纤维化作用的(Lee等，J.Exp.Med.2001 194：809-821)。但是在这个FITC模型中，IL-13敲除小鼠的
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的表达没有下降。
白介素4因为和IL-13借助相同的受体起作用，其被预期发挥与IL-13类似的效果。博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠的肺中，IL-4被显著上调(Gharaee-Kermani等，Cytokine 2001 15：138-147)。但是在C57BL6/J小鼠(过表达IL-4)、IL-4敲除和野生型中比较博莱霉素诱导的肺纤维化时，Izbicki等(Am.J.Physiol.Lung Cell Mol.Physiol 2002283(5)：L1110-L1116)没有发现证据支持IL-4参与了肺纤维化。IL-4敲除株的纤维化没有下降，而IL-4过表达小鼠纤维化水平上升。
BAL IL-13细胞因子水平在多种形式的肺纤维化患者中显著提高，尽管有相当大的差异。从肺纤维化患者获得的肺泡巨噬细胞中IL-13的表达明显被上调。
最有力的临床证据来自于在密歇根大学进行的研究。Jakubzick及其同事研究了肺纤维化患者手术肺活检样品中IL-13、IL-4以及它们的受体的基因表达。来自IPF感染肺的样品中IL-13基因表达比来自正常肺或者其它肺纤维化状况的样品的明显更高。和有正常肺或者其它形式肺纤维化的患者活检获得的组织和成纤维细胞相比，从IPF/UIP患者培养得到的成纤维细胞显示了升高的IL-13和IL-4受体表达。特别是，被认为是疾病活动中心的成纤维细胞病灶针对这些受体的染色非常强(Jakubzick等，J Immunol 2003 171：2684-2693；Jakubzick等，Am.J.Pathol.2003 162：1475-1486；Jakubzick等，Am.J.Pathol.2004 164(6)：1989-2001；Jakubzick等，Immunol.Res.2004 30(3)：339-349；Jakubzick等，J.Clin.Pathol.2004 57：477-486)。
有很好的体外证据表明Th2细胞因子总体来说、尤其是IL-13能够促进促纤维化表型。至少已有两种动物模型显示可以通过去除IL-13(在基因敲除中或使用抗IL-13抗体)来降低化学物诱导的纤维化。一些证据表明就促进肺纤维化而言，IL-13比IL-4更重要。关于IL-13在肺纤维化中的作用的临床证据提示IL-13及其受体在IPF患者的肺中被上调。
越来越多的资料显示了基于IL-13的疗法在治疗多种纤维化状况中的重要作用，这些状况包括血吸虫病诱导的肝纤维化和各种形式的肺纤维化(例如IPF[在别处讨论过]、硬皮病)。
在多个模型中进行的将IL-4和IL-13分别抑制的实验证实了IL-13是主要的纤维化效应细胞因子(Chiaramonte等，J.Clin.Invest.1999；104：777-785；Blesae等，J Immunol 2001；166：5219；Kumar等，Clin.Exp.Allergy 2002；32：1104)。在血吸虫病中，虽然IL-13阻断不影响卵诱发的炎症反应，但是在IL-4持续不断地产生的情况下，慢性感染的动物胶原蓄积还是下降了85％以上(Chiaramonte等，J.Clin.Invest.1999；104：777；Chiaramonte et al Hepatology 2001；34：273)。
hIL-13的氨基酸序列显示在SEQ.ID.NO：9中。(这是成熟蛋白的序列，即不存在信号序列)。
编码hIL-13的多核苷酸显示在SEQ.ID.NO：10中。(这是用于成熟蛋白的序列，即不存在信号序列)。
本说明书中公开的所有专利和参考文献(包括被本申请要求优先权的任何专利申请)都通过参考明确完整地引入本文。
最近，描述了提高抗IL-13的免疫应答来治疗哮喘的疫苗(WO02/070711)。也有人阐述了IL-13在使皮肤对环境变应原敏感中的作用(Herrick等，J Immunology 2003，170：2488-2495)。
本发明提供了结合hIL-13并抑制hIL-13与hIL-13R双链即hIL-13Rα1和hIL-13Rα2结合的抗体。
发明概述
本发明因此提供了特异结合hIL-13并中和hIL-13活性的抗体或其抗原结合片段。本发明提供了抗体或其抗原结合片段，其特异结合hIL-13并包含CDRH3，该CDRH3为SEQ.I.D.NO：3中所示序列的变体或者为这样的变体，其中所述变体的所述CDRH3内一个或两个氨基酸残基与SEQ.I.D.NO：3内对应位置中的氨基酸残基不同。在本发明的一个实施方案中，这些氨基酸残基差异为保守替换。
贯穿本说明书，关于本发明的抗体或其抗原结合片段使用的术语“特异结合”指该抗体结合hIL-13，但是不与其它人蛋白、尤其是人IL-4结合或显著结合。但是该术语不排除这样的事实，即本发明的抗体也可以与食蟹猴IL-13交叉反应。
贯穿本说明书，关于本发明的抗体或其抗原结合片段使用的术语“中和”指，在本发明的抗体和抗原结合片段存在下，IL-13的生物学活性与不存在这类抗体和其抗原结合片段下IL-13的活性相比减弱了。中和水平可以多种方式衡量，例如通过使用下文实施例中说明的测定法，例如TF-1细胞增殖测定法，其可以例如按实施例3.3-3.5中所述进行。这种测定法中的IL-13中和是通过评估在中和抗体存在下降低的TF-1细胞增殖来衡量的。
如果抗体或其抗原结合片段能够中和，则这表明抑制了hIL-13与其受体间的相互作用。
被认为对人IL-13具有中和活性的抗体会在按实施例3.3、3.4或3.5所述的TF-1细胞增殖测定法中具有小于100μg/ml或小于80μg/ml的ND50。
在本发明的另一方面，提供了与这里举例说明的抗体具有相同的中和活性的抗体或其抗原结合片段，例如在按实施例3.3、3.4或3.5所述的TF-1细胞增殖测定法中保留了H2L1中和活性的抗体。
用作本文时，术语“调节”指抑制IL-13与其受体的结合，和/或阻断IL-13与其受体的相互作用，由此断开了hIL-13/hIL-13R信号途径。这可以是抑制和/或阻断IL-13Rα1和IL-13Rα2之一或二者。用在本文时，hIL-13指这些受体之一或二者。可以多种方式衡量对IL-13与其受体的结合的抑制，例如通过使用在下文实施例中说明的测定法，例如ELISA方法，如在实施例6.5和6.6中所描述的。
本发明的抗体和其抗原结合片段可以为治疗性抗体和其抗原结合片段，即适用于治疗。
一方面，提供了这样的抗体或其抗原结合片段，其特异结合hIL-13并且包含含有SEQ.I.D.NO：3中所示序列的CDRH3。
在一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段中和人IL-13。
在另一实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段调节人IL-13与其受体的结合。
在本发明的另一方面，提供了这样的抗体或其抗原结合片段，其特异结合hIL-13并调节hIL-13和hIL-13R之间的相互作用。
在某些实施方案中，本发明的抗体至少抑制hIL-13和hIL-13R之间的相互作用，但是也可能阻断hIL-13和hIL-13R之间的相互作用，由此断开hIL-13/hIL-13R信号途径。
在另一实施方案中，本发明提供了抗体或抗原结合片段，其中CDRH3包含SEQ ID NO：3的序列。在另一实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段还包含下列序列的一个或多个：CDRH2：SEQ.I.D.NO：2，CDRH1：SEQ.I.D.NO：1，CDRL1：SEQ.I.D.NO：4，CDRL2：SEQ.I.D.NO：5和CDRL3：SEQ.I.D.NO：6。在另一实施方案中，本发明还在人框架情形下包括这些CDR序列，例如作为人源化抗体或其片段。
在本发明的另一方面，提供了这样的抗体或其抗原结合片段，其特异结合hIL-13并包含以下CDR：
CDRH1：     SEQ.I.D.NO：1
CDRH2：     SEQ.I.D.NO：2
CDRH3：     SEQ.I.D.NO：3
CDRL1：     SEQ.I.D.NO：4
CDRL2：     SEQ.I.D.NO：5
CDRL3：     SEQ.I.D.NO：6
在本发明的一个实施方案中，该抗体或抗原结合片段的一个或多个CDR可以包含上文列出的序列所定义的CDR的变体。每个变体CDR包含一个或两个氨基酸残基不用于上文列出的序列内对应位置中氨基酸残基。氨基酸残基的这种替换可以是保守替换，例如以一个疏水氨基酸替换另一疏水氨基酸，例如以缬氨酸或异亮氨酸替换亮氨酸。
遍及本说明书，抗体序列内的氨基酸残基是根据Kabat方案编号。类似地，术语“CDR”、“CDRL1”、“CDRL2”、“CDRL3”、“CDRH1”、“CDRH2”、“CDRH3”遵循Kabat编号系统，如Kabat等Sequences ofproteins of Immunological Interest NIH，1987中所述，作为例外的是重链的30位被认为是CDR的一部分。
用在本文时，术语“包含”包括“由......组成”。
在本发明的另一方面，提供了包含VH结构域和VL结构域的抗体或其抗原结合片段，其中该VH结构域包含SEQ.I.D.NO：7中所示的序列，该VL结构域包含SEQ.I.D.NO：8中所述的序列。
在本发明的另一方面，提供了分离的抗体的VH结构域，其包含选自SEQ.I.D.NO：7、11、12、13和14的序列。在一个实施方案中，该分离的抗体的VH结构域由选自SEQ.I.D.NO：7、11、12、13和14的分离的抗体的VH结构域组成或基本上由其组成。
在本发明的另一方面，提供了包含选自SEQ.I.D.NO：7、11、12、13和14的VH结构域的抗体或其抗原结合片段。
在本发明的另一方面，提供了特异结合hIL-13并至少抑制hIL-13和hIL-13R之间相互作用的抗体，该抗体包含SEQ.I.D.NO：18的重链和选自SEQ.I.D.NO：22、23和24的轻链。
在本发明的另一方面，提供了特异结合hIL-13并至少抑制hIL-13和hIL-13R之间相互作用的抗体，该抗体包含SEQ.I.D.NO：19的重链和选自SEQ.I.D.NO：22、23和24的轻链。
在本发明的另一方面，提供了特异结合hIL-13并至少抑制hIL-13和hIL-13R之间相互作用的抗体，该抗体包含SEQ.I.D.NO：20的重链和选自SEQ.I.D.NO：22、23和24的轻链。
在本发明的另一方面，提供了特异结合hIL-13并至少抑制hIL-13和hIL-13R之间相互作用的抗体，该抗体包含SEQ.I.D.NO：21的重链和选自SEQ.I.D.NO：22、23和24的轻链。
在本发明的另一方面，提供了这样的抗体或其抗原结合片段，其抑制包含SEQ.I.D.NO：18的重链和SEQ.I.D.NO：22的轻链的抗体与hIL-13的结合。
根据本发明，提供了这样的人源化抗体，该抗体包含SEQ.I.D.NO：11的VH结构域和选自SEQ.I.D.NO：15、16和17的VL结构域。
根据本发明，提供了这样的人源化抗体，该抗体包含SEQ.I.D.NO：12的VH结构域和选自SEQ.I.D.NO：15、16和17的VL结构域。
根据本发明，提供了这样的人源化抗体，该抗体包含SEQ.I.D.NO：13的VH结构域和选自SEQ.I.D.NO：15、16和17的VL结构域。
根据本发明，提供了这样的人源化抗体，该抗体包含SEQ.I.D.NO：14的VH结构域和选自SEQ.I.D.NO：15、16和17的VL结构域。
根据本发明，提供了这样的抗体或其抗原结合片段，其结合SEQ IDNO：90、99、102、103、105、106、107、108、109、110、111、112和114中所示的肽，但是不结合SEQ ID NO：100、101、104和113中所示的肽，其中结合被定义为与这里举例说明的抗体具有相同结合活性，例如在按实施例6.4中所述的ELISA测定法中保留了类似于3G4结合人IL-13的结合活性。
在另一方面，提供了治疗患有对调节hIL-13和hIL-13R之间相互作用有反应的疾病或病症(例如哮喘、COPD、变应性鼻炎、异位性皮炎)的人类患者的方法，该方法包括向所述患者给予治疗有效量的本发明所述抗体或其抗原结合片段的步骤。
还提供了本发明的抗体在制备治疗对调节hIL-13和hIL-13R之间相互作用有反应的疾病或病症的药物中的用途。
另一方面，本发明提供了选择适用于治疗的抗IL13抗体的方法，该方法包括i)提供特异结合IL-13Rα1的抗体，ii)确定该抗体是否特异结合IL-13Rα2，并选择在步骤ii)中结合的抗体用于进一步的开发。
发明详述
本发明的抗体可以为完整抗体或其片段；人、嵌合或人源化抗体；以及单特异性或双特异性的。
1.抗体结构
1.1 完整抗体
完整抗体包括至少包含两重链和两轻链的异多聚体糖蛋白。除了IgM，完整抗体通常是大约150Kda的异四聚体糖蛋白，由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)组成。一般来说，每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链之间二硫键数目有所不同。每条重链和轻链也有链内二硫键。每条重链在一端是可变区(VH)，接着是数个恒定区。每条轻链有可变区(VL)，在其另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区排列在一起，而轻链可变结构域与重链可变结构域排列在一起。来自大多数脊椎动物物种的抗体轻链可根据恒定区的氨基酸序列归类为κ和λ这两种类型之一。根据其重链恒定区的氨基酸序列，人抗体可以分成5个不同种类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。IgG和IgA可以进一步划分到亚类：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4；以及IgA1和IgA2。小鼠和大鼠中至少存在物种变体IgG2a和IgG2b。抗体的可变结构域赋予抗体结合特异性，其中某些显示出特定可变性的区域被称为互补决定区(CDR)。可变区中较保守的部分被称为框架区(FR)。完整重链和轻链的可变结构域各包含4个通过3个CDR相连的FR。每条链中CDR借助FR区被紧密维系在一起，并与其它链的CDR共同形成抗体的抗原结合位点。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但显示出多种效应子功能，例如参与抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)、借助于与Fcγ受体结合的吞噬作用、借助新生儿Fc受体(FcRn)的半衰期/清除率以及经由补体级联的C1q成分实现的补体依赖性细胞毒性。
因此，在本发明的一个实施方案中，我们提供了特异结合hIL-13的完整抗体，该抗体调节hIL-13和hIL-13R之间的相互作用，例如该抗体抑制hIL-13和其受体之间的相互作用。该完整抗体可以包含前文所述任何同种型或其亚类的恒定区。在一个实施方案中，该抗体是IgG同种型，特别是IgG1。该抗体可以来自大鼠、小鼠、兔、灵长类或人。在一个典型的实施方案中，该抗体来自灵长类(比如食蟹报、旧大陆猴或者大猩猩，参见例如WO99/55369、WO93/02108)或人。
在另一个实施方案中，提供了包含SEQ.ID.NO：3的CDRH3的分离的完整抗体。在另一个实施方案，提供了包含含有SEQ.I.D.NO：1、2、3、4、5和6的CDR的可变区的完整抗体。
在另一个实施方案中，提供了分离的鼠完整抗体或其抗原结合片段，它们包含含有SEQ.I.D.NO：7序列的VH结构域和SEQ.I.D.NO：8序列的VL结构域。
1.1.2 人抗体
人抗体可以通过本领域技术人员已知的多种方法来制备。人抗体可以利用人骨髓瘤或小鼠-人异源骨髓瘤细胞系(参见Kozbor J.Immunol133，3001，(1984)和Brodeur，Monoclonal Antibody Production Techniquesand Applications p51-63，(Marcel Dekker Inc，1987))通过杂交瘤的方法制备。替代方法包括利用噬菌体文库或转基因小鼠，它们都用到人V区所有组成成分(参见Wnter G，(1994)，Annu.Rev.Immunol 12，433-455；Green LL(1999)，J.Immunol.Methods 231，11-23)。
现在有多个转基因小鼠品系可供利用，其中它们的小鼠免疫球蛋白基因座已被人免疫球蛋白基因片段取代(参见Tomizuka K，(2000)PNAS97：722-727；Fishwild D.M(1996)Nature Biotechno1.14，845-851；MendezMJ，1997，Nature Genetics 15，146-156)。抗原进行攻击时，这些小鼠能够产人抗体的所有组成成分，从中可选择出感兴趣的抗体。值得一提的是TrimeraTM系统(参见Eren R等，(1998)Immunology 93：154-161)，其中将人淋巴细胞移植到被辐射过的小鼠；选定的淋巴细胞抗体系统(SelectedLymphocyte Antibody System)(SLAM，参见Babcook等，PNAS(1996)93：7843-7848)，该系统使人(或其它物种)的淋巴细胞有效地经历大量收集的体外抗体产生步骤，然后经历deconvulated有限稀释和选择过程；以及Xenomouse IITM(Abgenix Inc.)。Morphotek公司提供使用MorphodomaTM技术的替代方法。
噬菌体展示技术可以用于制备人抗体(及其片段)，参见McCafferty；Nature 348，552-553(1990)和Griffiths AD等，(1994)EMBO13：3245-3260。按照该技术，抗体V结构域基因被同框克隆到丝状噬菌体(如M13或fd)的主要或次要外壳蛋白基因中，然后在噬菌体颗粒表面展示为(通常需借助于辅助噬菌体)功能性的抗体片段。基于抗体功能特征进行的筛选可以选出显示出这些特性的抗体的编码基因。噬菌体展示技术可用于从文库中挑选抗原特异性抗体，所述文库是由人B细胞制备来，所述B细胞取自患有上述疾病或病症的个体，或者取自未经免疫的人供体(参见Marks；J.Mol.Bio.222，581-597，1991)。当需要包含Fc结构域的完整人抗体时，必需将通过噬菌体展示得到的片段再克隆至包含所需恒定区的哺乳动物表达载体，并建立起稳定的表达细胞系。
可以采用亲和力成熟技术(Marks；Bio/technol 10，779-783(1992))来提高结合亲和力，该技术通过依次将H和L链的V区用其天然产生的变体来代替，然后基于结合亲和力提高进行筛选，从而使初级人抗体的亲和力得到提高。此技术经变化后的形式例如“表位印迹”现在也有，参见WO93/06213。还可参见Waterhouse，Nucl.Acids Res 21，2265-2266(1993)。
因此，本发明的另一个实施方案提供了分离的人完整抗体或其抗原结合片段，其特异结合hIL-13并调节hIL-13和hIL-13R之间的相互作用，例如如果其抑制hIL-13与其受体的相互作用。
另一方面，提供了包含SEQ.I.D.NO：3的CDRH3的分离的人完整抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段特异结合hIL-13并调节hIL-13和hIL-13R之间的相互作用，例如如果其抑制hIL-13与其受体的相互作用。再一方面，提供了分离的人完整抗体或其抗原结合片段，其包含含有如上文定义的SEQ.I.D.NO：1、2、3、4、5和6的CDR的可变区。
1.2 嵌合和人源化抗体
将完整的非人抗体用于治疗人类疾病或病症带有潜在的目前已被证实的免疫原性问题，即患者的免疫系统可以将该非人完整抗体识别为异己而发起中和反应。这在将非人抗体多次给予人类患者的情况中尤其明显。多年来发展了多种技术来克服这些问题，这些技术一般涉及到减少完整抗体中的非人氨基酸序列组成，但保留从经免疫动物(例如小鼠、大鼠或兔)获得非人抗体的相对简单性。概括地说已有两种方法被用于实现这个目的。第一种方法是嵌合抗体，其一般包含与人恒定区融合的非人(例如啮齿类，如小鼠)可变结构域。因为抗体的抗原结合位点位于可变区内，所以嵌合抗体保留了其对抗原的结合亲和力，但获得了人恒定区的效应子功能，因此能够发挥上文描述过的效应子功能。嵌合抗体一般利用重组DNA方法产生。分离出编码抗体的DNA(例如cDNA)并用常规方法进行测序(例如通过使用寡核苷酸探针，其能与编码本发明抗体的H和L链的基因，例如编码上述SEQ.I.D.NO：1、2、3、4、5和6的DNA特异结合)。将杂交瘤细胞用作这类DNA的一般来源。一经分离，DNA即被插入表达载体，后者随后转染本身不会产生免疫球蛋白的宿主细胞(比如大肠杆菌、COS细胞、CHO细胞或骨髓瘤细胞)来合成抗体。这些DNA可以通过以编码人L和H链的序列替代相应的非人(例如鼠)H和L链恒定区来进行修饰。参见例如Morrison，PNAS 81，6851(1984)。
第二种方法涉及产生人源化抗体，其中该抗体的非人类组分通过人源化可变区而减少了。有两种人源化技术受欢迎。第一种是通过CDR移植实现人源化。CDR在接近抗体N末端形成环状，在这里形成处于由框架区提供的支架内的表面。抗体的抗原结合特异性主要是由其CDR表面的拓扑学和化学特性决定的。这些特征又是由各个CDR的构象、CDR的相对配置以及构成CDR的残基的侧链的特性和配置决定的。通过只将非人类(例如鼠)抗体(供体抗体)的CDR移植到人框架区(受体框架)和恒定区上可以大大降低免疫原性(参见Jones等，(1986)Nature321：522-525和Verhoeyen M等(1988)Science 239：1534-1536)。但是CDR移植本身可能不会导致抗原结合特性的完全保留，经常会发现：想要恢复有效的抗原结合亲和力的话，必须在人源化分子中保留供体抗体中的某些框架残基(有时称为“回复突变”)(参见Queen C等(1989)PNAS 86：10，029-10，033，Co，M等(1991)Nature 351，501-502)。这种情况下，从数据库中选择与非人类供体抗体序列同源性最高的人V区，以提供人框架区(FR)。人FR可从人共有序列或者各个人抗体中选择。必要时供体抗体的关键残基可被取代进人受体框架区内，以便保留CDR构象。抗体的计算机模拟可被用于协助鉴定这些在结构上重要的残基，参见WO99/48523。
或者，人源化还可以通过“表面修饰(veneering)”的过程实现。对人和鼠独特的免疫球蛋白重链和轻链可变区进行的统计学分析揭示出人和鼠抗体中暴露残基的精确模式是不同的，多数个体表面位置强烈倾向于少量不同残基(参见Padlan E.A.等，(1991)Mol.Immunol.28，489-498和Pedersen J.T.等(1994)J.Mol.Biol.235；959-973)。这样就有可能通过将其框架区中的与通常在人抗体中发现的残基不同的暴露残基替换掉，从而降低非人Fv的免疫原性。因为蛋白质的抗原性可能与其表面可接近性相关，表面残基的替换可能足以使得小鼠可变区为人免疫系统所“看不见”的(还参见Mark G.E.等，(1994)Handbook of ExperimentalPharmacology vol.113：The pharmacology of monoclonal Antibodies，Springer-Verlag，105-134页)。这种人源化过程被称为“表面修饰”，因为只改变了抗体的表面，而没有动支持性残基。
技术人员可意识到，存在其它的抗体人源化方法并可从文献获得。
因此，本发明另一实施方案提供了嵌合抗体，其包含融合至人恒定区(可能是IgG同种型，例如IgG1)的非人类(例如啮齿类)可变结构域，该抗体特异结合hIL-13，并调节hIL-13和hIL-13R之间的相互作用，例如如果其抑制hIL-13与其受体的相互作用。
在另一个实施方案中，提供了包含非人类(例如啮齿类)可变区和人恒定区(可能是IgG同种型，例如IgG1)的嵌合抗体，该抗体特异结合hIL-13，并进一步包含SEQ.ID.NO：3的CDRH3。这种抗体可以再包含lgG同种型(例如IgG1)的人恒定区。
在另一个实施方案中，提供了包含非人类(例如啮齿类)可变区和人恒定区(可能是IgG同种型，例如IgG1)的嵌合抗体，该抗体特异结合hIL-13，并包含SEQ.ID.NO：1、2、3、4、5和6的CDR。
在另一个实施方案中，提供了嵌合抗体，其包含SEQ.ID.NO：7的VH结构域和SEQ.ID.NO：8的VL结构域，以及IgG同种型如IgG1的人恒定区，该抗体持异结合hIL-13并调节hIL-13和hIL-13R之间的相互作用，例如如果其抑制hIL-13与其受体的相互作用。
在另一个实施方案中，提供了人源化抗体或其抗原结合片段，其特异结合hIL-13并调节hIL-13和hIL-13R之间的相互作用，例如如果其抑制hIL-13与其受体的相互作用。
在另一个实施方案中，提供了人源化抗体或其抗原结合片段，其特异结合hIL-13并包含SEQ.ID.NO：3的CDRH3。这类抗体可以包含IgG同种型如IgG1的人恒定区。
在另一个实施方案中，提供了人源化抗体或其抗原结合片段，其特异结合hIL-13并包含SEQ.ID.NO：1、2、3、4、5和6的CDR。这类抗体可以包含1gG同种型如IgG1的人恒定区。
根据本发明，提供了人源化抗体，该抗体包含选自SEQ.ID.NO：11的VH结构域和选自SEQ.ID.NO：15、16、17的VL结构域。这类抗体可以包含IgG同种型如1gG1的人恒定区。
根据本发明，提供了人源化抗体，该抗体包含选自SEQ.ID.NO：12的VH结构域和选自SEQ.ID.NO：15、16、17的VL结构域。这类抗体可以包含IgG同种型如lgG1的人恒定区。
根据本发明，提供了人源化抗体，该抗体包含选自SEQ.ID.NO：13的VH结构域和选自SEQ.ID.NO：15、16、17的VL结构域。这类抗体可以包含IgG同种型如lgG1的人恒定区。
根据本发明，提供了人源化抗体，该抗体包含选自SEQ.ID.NO：14的VH结构域和选自SEQ.ID.NO：15、16、17的VL结构域。这类抗体可以包含IgG同种型如lgG1的人恒定区。
在另一个实施方案中，提供了人源化抗体，该抗体包含SEQ.ID.NO：11的VH结构域和SEQ.ID.NO：15的VL结构域。
在另一个实施方案中，提供了人源化抗体，该抗体包含SEQ.ID.NO：12的VH结构域和SEQ.ID.NO：15的VL结构域。
在另一个实施方案中，提供了人源化抗体，该抗体包含SEQ.ID.NO：13的VH结构域和SEQ.ID.NO：15的VL结构域。
在另一个实施方案中，提供了人源化抗体，该抗体包含SEQ.ID.NO：14的VH结构域和SEQ.ID.NO：15的VL结构域。
在另一个实施方案中，提供了人源化抗体，该抗体包含SEQ.ID.NO：11的VH结构域和SEQ.ID.NO：16的VL结构域。
在另一个实施方案中，提供了人源化抗体，该抗体包含SEQ.ID.NO：12的VH结构域和SEQ.ID.NO：16的VL结构域。
在另一个实施方案中，提供了人源化抗体，该抗体包含SEQ.ID.NO：13的VH结构域和SEQ.ID.NO：16的VL结构域。
在另一个实施方案中，提供了人源化抗体，该抗体包含SEQ.ID.NO：14的VH结构域和SEQ.ID.NO：16的VL结构域。
在另一个实施方案中，提供了人源化抗体，该抗体包含SEQ.ID.NO：11的VH结构域和SEQ.ID.NO：17的VL结构域。
在另一个实施方案中，提供了人源化抗体，该抗体包含SEQ.ID.NO：12的VH结构域和SEQ.ID.NO：17的VL结构域。
在另一个实施方案中，提供了人源化抗体，该抗体包含SEQ.ID.NO：13的VH结构域和SEQ.ID.NO：17的VL结构域。
在另一个实施方案中，提供了人源化抗体，该抗体包含SEQ.ID.NO：14的VH结构域和SEQ.ID.NO：17的VL结构域。
在另一个实施方案中，提供了特异结合hIL-13的人源化抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其片段包含SEQ.I.D.NO：3的CDRH3，任选进一步包含一个或多个SEQ.I.D.NO：1、2、4、5和6的CDR，其中一个或多个选自人受体重链框架的10、30、67、69、71、73和93的残基以及人受体轻链框架的76和98位的一个或两个残基被CDRH3的来源供体抗体框架中存在的对应残基所替换。
在另一个实施方案中，提供了特异结合hIL-13的人源化抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其片段包含SEQ.I.D.NO：3的CDRH3，任选进一步包含一个或多个SEQ.I.D.NO：1、2、4、5和6的CDR，其中人重链框架包含一个或多个(例如全部)下列残基(或其保守替换)：
位点         残基
10           D
30           I
67           A
69           L
71           A
73           K
93           T
以及人轻链框架包含下列残基(或其保守替换)的一个或两个：
76         N
98         L
对本领域技术人员显而易见的是，术语“来源于”不仅是用来定义材料就其物理起源意义上的来源，还定义了与所述材料结构相同(就一级氨基酸序列而言)但不是来源于参照源的材料。因此“在CDRH3的来源供体抗体中存在的残基”不需要是已经从供体抗体中纯化过。
本领域公知，某些氨基酸替换被认为是“保守的”。氨基酸按照共同侧链特性分为几组，保留了本发明抗体或其抗原结合片段的全部或基本上全部结合亲和力的组内替换被认为是保守替换，见表1：
表1
 
侧链 成员
疏水性 met、ala、val、leu、ile
中性亲水性 cys、ser、thr
酸性 asp、glu
碱性 asn、gln、his、lys、arg
影响链方向的残基 gly、pro
芳香族 trp、tyr、phe
根据本发明，提供了人源化抗体，其包含选自SEQ.I.D.NO：18、19、20、21的重链和选自SEQ.I.D.NO：22、23、24的轻链。
在本发明的一个实施方案中，提供了特异结合hIL-13的人源化抗体，其包含SEQ.ID.NO：18的重链和SEQ.ID.NO：22的轻链。
在本发明的一个实施方案中，提供了特异结合hIL-13的人源化抗体，其包含SEQ.ID.NO：19的重链和SEQ.ID.NO：22的轻链。
在本发明的一个实施方案中，提供了特异结合hIL-13的人源化抗体，其包含SEQ.ID.NO：20的重链和SEQ.ID.NO：22的轻链。
在本发明的一个实施方案中，提供了特异结合hIL-13的人源化抗体，其包含SEQ.ID.NO：21的重链和SEQ.ID.NO：22的轻链。
在本发明的一个实施方案中，提供了特异结合hIL-13的人源化抗体，其包含SEQ.ID.NO：18的重链和SEQ.ID.NO：23的轻链。
在本发明的一个实施方案中，提供了特异结合hIL-13的人源化抗体，其包含SEQ.ID.NO：19的重链和SEQ.ID.NO：23的轻链。
在本发明的一个实施方案中，提供了特异结合hIL-13的人源化抗体，其包含SEQ.ID.NO：20的重链和SEQ.ID.NO：23的轻链。
在本发明的一个实施方案中，提供了特异结合hIL-13的人源化抗体，其包含SEQ.ID.NO：21的重链和SEQ.ID.NO：23的轻链。
在本发明的一个实施方案中，提供了特异结合hIL-13的人源化抗体，其包含SEQ.ID.NO：18的重链和SEQ.ID.NO：24的轻链。
在本发明的一个实施方案中，提供了特异结合hIL-13的人源化抗体，其包含SEQ.ID.NO：19的重链和SEQ.ID.NO：24的轻链。
在本发明的一个实施方案中，提供了特异结合hIL-13的人源化抗体，其包含SEQ.ID.NO：20的重链和SEQ.ID.NO：24的轻链。
在本发明的一个实施方案中，提供了特异结合hIL-13的人源化抗体，其包含SEQ.ID.NO：21的重链和SEQ.ID.NO：24的轻链。
在本发明的一个实施方案中，提供了人或人源化重链可变区，其包含SEQ ID NO 1-3中所列的每一个CDR。在本发明的一个实施方案中，提供了在人重链可变区的较大序列内包含SEQ ID NO 1-3中所列的CDR的人源化重链可变区。在另一实施方案中，该人源化重链可变区在受体抗体框架内包含SEQ ID NO 1-3中所列的CDR，该受体抗体框架在框架区与鼠3G4个体抗体重链可变区(SEQ ID NO.7)有高于40％的一致性，或高于50％、或高于60％或高于65％的一致性。
在本发明的另一方面，该抗体包含含有SEQ ID NO.44的氨基酸序列的重链可变区，还包含在一个或多个位置10、30、67、69、71、73、93(Kabat编号系统)的多个替换；其中每个被替换的氨基酸残基被SEQID NO.7(供体抗体3G4的重链可变区)中相同位置的氨基酸残基所替代，替换数量为0至7。在其它实施方案中，替换数量为0、或1、或2、或3、或4、或5、或6、或7。
在本发明的一个实施方案中，提供了包含SEQ ID NO 4-6中所列的每个CDR的人或人源化轻链可变区。在本发明的另一实施方案中，提供了在人轻链可变区的较大序列内包含SEQ ID NO 4-6中所列的CDR的人源化轻链可变区。在另一实施方案中，该人源化轻链可变区在受体抗体框架内包含SEQ ID NO 4-6中所列的CDR，该受体抗体框架在框架区与鼠3G4个体抗体重链可变区(SEQ ID NO.8)有高于40％的一致性，或高于50％、或高于60％或高于65％的一致性。
在本发明的一个方面，该抗体包含含有SEQ ID NO.45的氨基酸序列的轻链可变区，还包含一个或多个位置76、98(Kabat编号系统)的数个替换；其中每个被替换的氨基酸残基被SEQ ID NO.8(供体抗体3G4的轻链可变区)中相同位置的氨基酸残基替代，替换的数量为0至2。在另一实施方案中，替换的数量为0或1或2。
1.3 双特异性抗体
双特异性抗体是指对至少两种不同表位有结合特异性的抗体。本领域已知制备这类抗体的方法。传统地，双特异性抗体的重组制备是基于共表达两种免疫球蛋白H链-L链对，而其中两个H链具有不同的结合特异性。参见Millstein等，Nature 305：537-539(1983)，WO93/08829和Traunecker等，EMBO，10(1991)：3655-3659。因为随机组合H和L链，可能产生10种不同抗体结构的混合物，而其中只有一种具备所需的结合特异性。一种替代方法涉及将具有所需结合特异性的可变结构域与重链恒定区融合在一起，其中恒定区包含至少部分的铰链区、CH2和CH3区域。优选使含有轻链结合所需位点的CH1区存在于至少一个融合体中。将编码这些融合体以及L链(如果需要的话)的DNA插入分开的表达载体，然后共转染到合适的宿主生物中。当然也可以将两条或全部三条链的编码序列插入一个表达载体中。在一种优选的方法中，双特异性抗体由一个臂中具有第一结合特异性的H链和另一个臂中提供第二结合特异性的H-L链对组成，参见WO94/04690。还参见Suresh等，Methodsin Enzymology 121，210，1986。
在本发明的一个实施方案中，提供了双特异性抗体，其中所述抗体的至少一种结合特异性是针对hIL-13的，其中所述抗体调节IL-13和Hil-13R之间的相互作用，例如如果其抑制hIL-13与其受体之间的相互作用。种类抗体还可以包含IgG同种型如IgG1的人恒定区。在一些实施方案中，该双特异性治疗用抗体具有对hIL-13的第一结合特异性，能调节hIL-13和hIL-13R之间的相互作用，例如其抑制hIL-13与其受体之间的相互作用，以及对hIL-4的第二结合特异性，能调节hlL-4和hlL-4受体之间的相互作用，例如如果其抑制hIL-4与其受体之间的相互作用。
在本发明的一个实施方案中，提供了双特异性抗体，其中所述抗体的至少一种结合特异性是针对hIL-13的，其中所述抗体包含SEQ.I.D.NO：3的CDRH3。这些抗体还可以包含IgG同种型如IG1的人恒定区。
在本发明的一个实施方案中，提供了双特异性抗体，其中所述抗体的至少一种结合特异性是针对hIL-13的，其中所述抗体包含至少SEQ.I.D.NO：1、2、3、4、5和6的CDR。这些抗体可以进一步包含IgG同种型如IgG1的人恒定区。
1.4 抗体片段
在本发明的某些实施方案中，提供了调节hIL-13和hIL-13R之间的相互作用的抗体片段，例如如果该片段抑制hIL-13与其受体之间的相互作用。这类片段可以是完整和/或人源化和/或嵌合抗体的功能性抗原结合片段，例如上文所述抗体的Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、ScFv片段。传统上这类片段是完整抗体经蛋白水解消化产生的，例如木瓜蛋白酶消化(参见例如WO94/29348)，但是也可以从重组转化的宿主细胞直接产生。对于产生ScFv，参见Bird等，(1988)Science，242，423-426。此外，还可以利用下文描述的多种基因工程技术来产生抗体片段。
与Fab片段相比，Fv片段两条链似乎具有较低的相互作用能量。为了稳定VH和VL结构域之间的结合，它们曾经以肽连接(Bird等，(1988)Science 242，423-426；Huston等，PNAS85，5879-5883)、二硫键连接(Glockshuber等，(1990)Biochemistry 29，1362-1367)和“洞中圆球(knob inhole)”突变连接(Zhu等(1997)，Protein Sci.，6，781-788)。ScFV片段可经本领域技术人员熟知的方法来制备(参见Whitlow等(1991)，Methodscompanion Methods Enzymol，2：97-105和Huston(1993)Int.Rev.Immunol 10：195-217)。可以在细菌细胞(比如大肠杆菌)中产生ScFV，但优选在真核细胞中产生。ScFV的一个缺点是产物的单价性，这样使得抗体亲合力(avidity)不可能借助多价结合得到提高，并且它们的半衰期短。为了克服这些问题所进行的尝试包括，由通过化学偶联而含有添加的C末端半胱氨酸的ScFV来制备双价(ScFV’)2(Adams等(1993)Can.Res 53，4026-4034和McCartney等(1995)Protein Eng.8，301-314)，或者使含有未配对C末端半胱氨酸残基的ScFv自发位点特异二聚化(参见Kipriyanov等(1995)Cell.Biophys 26，187-204)。或者，可通过将肽接头缩短到3到12个残基来形成“双抗体(diabodies)”，来强迫ScFv形成多聚体，参见Holliger等，PNAS(1993)，90，6444-6448。进一步减少接头可得到ScFV三聚体(“三抗体”，参见Kortt等(1997)Protein Eng.10，423-433)和四聚体(“四抗体”，参见Le Gall等(1999)FEBS Lett 453，164-168)。构建二价ScFv分子还可通过与蛋白质二聚体化基序(motif)的基因融合以形成“微抗体(miniantibody)”(参见Pack等(1992)Biochemistry 31，1579-1584)和“微体(minibody)”(参见Hu等(1996)，Can.Res 56，3055-3061)来实现。还可以通过将两个ScFv通过第三个肽接头相连来制备ScFV-Sc-FV串联((ScFV)2，参见Kurucz等(1995)JImmunol 154，4576-4582。双特异性双抗体可通过将两个单链融合产物非共价结合来制备，所述融合产物由一个抗体的VH结构域通过短接头与另一抗体的VL结构域连接组成，参见Kipriyanov等(1998)，Int.J.Can77，763-772。提高这些双特异性双抗体的稳定性可以通过引入二硫键或上文描述的“洞中圆球”突变，或者是通过形成单链双抗体(ScDb)实现，该ScDb中两个杂合ScFV片段经肽接头相连，参见Kontermann等(1999)JImmunol.Methods 226，179-188。已有的四价双特异性分子是例如将ScFV片段经铰链区与IgG分子的CH3区或者与Fab片段融合，参见Coloma等(1997)Nature Biotechnol 15，159-163。或者，四价双特异性分子可以通过融合双特异性单链双抗体来产生(参见Alt等，(999)FEBSLett 454，90-94)。较小的四价双特异性分子也可通过使ScFV-ScFV串联与含有螺旋-环-螺旋基序的接头二聚化来形成(DiBi微抗体，参见Muller等(1998)FEBS Lett 432，45-49)，或者通过使包含四个抗体可变结构域(VH和VL)的单链分子二聚化形成，所述四个可变结构域的方向防止分子内配对(串联双抗体，参见Kipriyanov等，(1999)J.Mol.Biol.293，41-56)。双特异性F(ab’)2片段可通过Fab’片段的化学偶联或者借助亮氨酸拉链异源二聚体化形成(参见Shalaby等(1992)J.Exp.Med.175，217-225和Kostelny等(1992)，J Immunol 148，1547-1553)。分离的VH和VL区也已存在(Domantis plc)，参见美国专利US 6,248,516；US6,291，158；US 6,172,197。
在一个实施方案中，提供了抗体片段(例如ScFV，Fab，Fab’，F(ab’)2)或者上文描述的工程化抗体片段，这类片段特异结合hIL-13并调节hIL-13和hIL-13R之间的相互作用，例如如果这类片段抑制hIL-13与其受体的相互作用。该抗体片段可以包含含有SEQ.ID.NO：3序列的CDRH3，以及任选含有一个或多个SEQ.I.D.NO：1、2、4、5和6中所示序列的其它CDR。
ScFv可以被制成包含本发明抗体的VH和VL区。例如，ScFv可以包含SEQ.I.D.NO：12和15，或者例如可以包括SEQ.I.D.NO：13和15。这可通过本发明的多核苷酸来制备，例如SEQ.I.D.NO：93和94中所示的序列，或者例如通过SEQ.I.D.NO：28和31中所示的序列来制备。在本发明的一个实施方案中，提供了包含由SEQ.I.D.NO：93和94中所示序列编码的蛋白的ScFv。
1.5 异源偶联抗体
异源偶联抗体也构成了本发明的一个实施方案。异源偶联抗体由利用任何方便的交联方法形成的两种共价连接的抗体组成。参见例如专利US4,676,980。
1.6 其它修饰
抗体的Fc区和多种Fc受体(FcγR)之间的相互作用被认为介导了抗体的效应子功能，包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、补体的固定、细胞吞噬作用和抗体的半衰期/消除。可以根据需要的特性对本发明抗体的Fc区进行各种修饰。例如EP0629 240B1和EP0307 434B2中详细描述的，在Fc区进行特定突变以使本来裂解性的抗体成为非裂解性的；或者可以在抗体中引入补救受体结合表位来提高其血清半衰期，参见US 5,739,277。目前识别到的5种人Fcγ受体是FcγR(I)、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa和新生儿FcRn。Shields等((2001)J.Biol.Chem 276，6591-6604)证明一组公用IgG1残基参与和所有FcγR的结合，而FcγRII和FcγRIII利用这组公用残基之外的一些独特位点。一组IgG1残基(Pro-238、Asp-265、Asp-270、Asn-297和Pro-239)被改变成丙氨酸时对所有FcγR的结合减弱。它们全部位于IgG的CH2结构域，簇集在连接CH1和CH2的铰链附近。FcγRI只使用共同IgG1残基组进行结合，而FcγRll和FcγRII除了共同残基组外还与一些独特残基相互作用。改变一些残基例如(Arg-292)只减弱对FcγRII的结合或(例如Glu-293)减弱对FcγRIII的结合。一些变体显示出对FcγRII或FcγRIII的结合力提高，但不影响对其它受体的结合(例如Ser-267Ala会提高对FcγRII的结合但不影响和FcγRIII的结合)。另外一些变体显示出对FcγRII或FcγRIII的结合增强，而与其它受体的结合减弱(例如Ser-298Ala增强了对FcγRIII的结合，但对FcγRII的结合减弱)。对FcγRIIIa来说，结合最好的IgG1变体具有组合的Ser-298、Glu-333和Lys-334位丙氨酸替换。新生儿FcRn受体被认为参与了抗体清除和跨组织的胞吞转运作用(参见JunghansRP(1997)Immunol.Res16，29-57和Ghetie等(2000)Annu.Rev.Immunol.18，739-766)。已知的与人FcRn有直接相互作用的人IgG1残基包括Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434和His435。本实例中描述的这些位点发生任何改变可能会延长本发明抗体的血清半衰期和/或改变它们的效应子特性。
其它修饰包括本发明抗体的糖基化变体。已知抗体恒定区保守位点发生糖基化对抗体功能有深刻的影响，尤其是例如上文描述的那些效应子功能，参见例如Boyd等，(1996)，Mol.Immunol.32，1311-1318。还考虑了本发明抗体或其抗原结合片段的糖基化变体，其中增加、取代、删除或者修饰了一或多个碳水化合物部分。引入天冬酰胺-X-丝氨酸或者天冬酰胺-X-苏氨酸基序产生碳水化合物部分酶促连接的潜在位点，因此可用于操纵抗体的糖基化。在Raju等(2001)Biochemistry 40，8868-8876中，利用β-1，4-半乳糖基转移酶和/或α-2，3-唾液酸转移酶进行再半乳糖糖基化和/或再唾液酸化，可提高TNFR-IgG免疫粘附素的末端唾液酸化。提高免疫球蛋白的末端唾液酸化被认为能够延长其半衰期。与多数糖蛋白一样，抗体通常是以糖型混合物的形式产生的。当在真核，尤其是哺乳动物细胞中产生抗体时，这种混合物尤其明显。已经开发出多种方法来制备指定的糖型，参见Zhang等，Science(2004)，303：371；Sears等，Science(2001)291：2344；Wacker等(2002)Science 298：1790；Davis等(2002)Chem.Rev.102：579；Hang等(2001)Acc.Chem.Res 34：727。因此本发明考虑了多种如本文所述的(单克隆)抗体(可以是IgG同种型，例如IgG1)，这些抗体包含指定量(例如7或以下，例如5或以下，比如2或1个)的糖型的所述抗体或其抗原结合片段。
本发明另外的实施方案包括偶联了非蛋白性多聚体(例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯)的本发明抗体或其抗原结合片段。将蛋白质偶联至PEG是成熟技术，可用于延长蛋白质半衰期，以及降低蛋白质的抗原性和免疫原性。已用不同分子量和形式(线形或分支)的PEG研究了与完整抗体以及Fab’片段的PEG化作用，参见Koumenis I.L.等(2000)，Int.J.Pharmaceut.198：83-95。
2.生产方法
本发明的抗体可以作为多克隆群体生产，但是更优选作为单克隆群体(即针对特异抗原结合位点的相同抗体的基本匀质群体)生产。当然对本领域技术人员来说很显然的是，群体意味着不止一种抗体。本发明抗体可以在转基因生物中产生，所述生物例如为山羊(参见Pollock等(1999)，J.Immunol.Methods 231：147-157)、鸡(参见Morrow KJJ(2000)Genet.Eng.News 20：1-55)、小鼠(参见Pollock等)或植物(参见Doran PM(2000)Curr.Opinion Biotechnol.11，199-204；Ma JK-C(1998)，Nat.Med.4：601-606；Baez J等，BioPharm(2000)13：50-54；Stoger E等(2000)Plant Mol.Biol42：583-590)。也可以通过化学合成来产生抗体。但是本发明的抗体通常是利用本领域技术人员熟知的重组细胞培养技术制备的。分离出编码抗体的多核苷酸，将其插入可复制载体(如质粒)以便进一步克隆(扩增)或表达。一个有用的表达系统是谷氨酸合成酶系统(如Lonza Biologics出售的)，尤其是当宿主细胞是CHO或NS0时候(见下文)。很容易地分离出编码抗体的多核苷酸，并利用常规操作(例如寡核苷酸探针)将其测序。可以使用的载体包括质粒、病毒、噬菌体、转座子、微染色体，其中质粒是典型的实施方案。一般来说，这些载体还可包括信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列，它们与轻链和/或重链多核苷酸可操作地连接以促进表达。编码轻链和重链的多核苷酸可以被插入分开的载体并转染到同一宿主细胞，或者如果需要，重链和轻链两者可以被插入相同的载体来转染宿主细胞。因此根据本发明的一个方面，提供了构建编码本发明抗体或其抗原结合片段的轻和/或重链的载体的方法，该方法包括向载体中插入编码本发明抗体的轻链和/或重链的多核苷酸。
在本发明的另一方面，提供了编码鼠VH结构域的多核苷酸，其包含SEQ.ID.NO：25所示序列。
在本发明的另一方面，提供了编码鼠VL结构域的多核苷酸，其包含SEQ.ID.NO：26所示序列。
在另一个实施方案中，提供了编码VH结构域的多核苷酸，其包含选自SEQ.ID.NO：27、28、29、30的序列。
在另一个实施方案中，提供了编码VL结构域的多核苷酸，其包含选自SEQ.I.D.NO：31、32、33的序列。
根据本发明，提供了编码本发明重链的多核苷酸，该多核苷酸选自SEQ.I.D.NO：34、35、36、37。
根据本发明，提供了编码本发明轻链的多核苷酸，该多核苷酸选自SEQ.I.D.NO：38、39、40。
对本领域技术人员显而易见的是由于遗传密码的冗余性，本文中公开的多核苷酸的替代多核苷酸序列也是可获得的，其可编码本发明的多肽。
3.1 信号序列
本发明的抗体可以作为与异源信号序列的融合蛋白产生，该信号序列在成熟蛋白的N末端有特异切割位点。该信号序列应能够被宿主细胞识别和加工。对原核宿主细胞来说，信号序列可以是碱性磷酸酶、青霉素酶或者热稳定肠毒素II引导肽。对应酵母菌分泌，信号序列可以是酵母转化酶引导肽、α因子引导肽或酸性磷酸酶引导肽，参见例如WO90/13646)。在哺乳动物细胞体系中，有病毒分泌引导肽比如单纯疱疹病毒gD信号和天然免疫球蛋白信号序列。通常，所述信号序列与编码本发明抗体的DNA连接在同一阅读框内。
3.2 复制起点
复制起点是本领域所熟知的，其中pBR322适合多数革兰氏阴性细菌，2μ质粒适合多数酵母菌以及多种病毒复制起点如SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV适合多数哺乳动物细胞。通常哺乳动物表达载体不需要复制起点成分，但是SV40含有早期启动子，可以使用。
3.3 选择标记
通常的选择基因编码这样的蛋白质，它们(a)赋予对抗生素(例如氨苄青霉素、新霉素、氨甲蝶呤或四环素)或其它毒素的抗性，或者(b)互补营养缺陷型或提供复合培养基中没有的营养物。选择的原理可涉及使宿主细胞停止生长。那些被编码本发明抗体的基因成功转化的细胞，因为选择标记所赋予的例如药物抗性而存活。另外一个例子是被称为DHFR的选择标记，其中转化子在有氨甲蝶呤的情况下培养。在代表性实施方案中，在有逐渐增量的氨甲蝶呤的情况下培养细胞来增加目的外源基因的拷贝数。CHO细胞是特别适用于DHFR选择的细胞系。另外一个例子是谷氨酸合成酶表达系统(Lonza Biologics)。适用于酵母菌的选择基因是trp1基因，参见Stinchcomb等，Nature 282，38，1979。
3.4 启动子
适用于表达本发明抗体的启动子与编码该抗体的DNA/多核苷酸可操作地连接在一起。用于原核宿主的启动子包括phoA启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸和杂合启动子，如Tac。适用于在酵母细胞中进行表达的启动子包括3-磷酸甘油激酶或者其它糖酵解酶，例如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油变位酶和葡萄糖激酶。可诱导的酵母启动子包括醇脱氢酶2、同型细胞色素C、酸性磷酸酶、金属硫蛋白和负责氮代谢或者麦芽糖/半乳糖利用的酶。用于在哺乳动物细胞系统中表达的启动子包括病毒启动子，比如多瘤病毒、禽痘病毒和腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒(特别是中早期基因启动子)、逆转录病毒、乙型肝炎病毒、肌动蛋白、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子和早期或晚期猴病毒40。当然启动子的选择是基于与用于表达的宿主细胞的相容性。因此在一个实施方案中，提供了第一质粒，它包含RSV和/或SV40和/或CMV启动子、编码本发明轻链V区(VL)的DNA、κC区连同新霉素和氨苄青霉素抗性选择标记；还提供了第二质粒，包含RSV或SV40启动子、编码本发明重链V区(VH)的DNA、编码γ1恒定区的DNA、DHFR和氨苄青霉素抗性标记。
3.5 增强子元件
情况适合时(例如在高等真核细胞中进行表达时)，可以使用与载体中启动子元件可操作地连接的增强子元件。适合的哺乳动物增强子序列包括来自球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、胎蛋白和胰岛素的增强子元件。或者，可以使用来自真核细胞病毒的增强子元件，比如SV40增强子(在碱基100-270处)、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒增强子、杆状病毒增强子或者小鼠IgG2a位点(参见WO04/009823)。优选所述增强子在载体上位于启动子上游的位置。
3.5.5-多腺苷酸化信号
在真核系统中，使多腺苷酸化信号与编码本发明抗体的DNA/多核苷酸可操作地连接。这类信号通常被置于开放阅读框的3’。在哺乳动物系统中，非限定性实例包括来自生长激素、延长因子-1α和病毒(例如SV40)基因或逆转录病毒长末端重复的信号。在酵母系统中，多腺苷酸化/终止信号的非限定性实例包括来自磷酸甘油酸酯激酶(PGK)和醇脱氢酶1(ADH)基因的那些。在原核系统中，多腺苷酸化信号通常是不需要的，替代的是其通常采用较短和更明确的终止序列。当然，对多腺苷酸化/终止序列的选择是基于与用于表达的宿主细胞的适当相容性的。
3.6 宿主细胞
适合编码本发明抗体的克隆载体或表达载体的宿主细胞是原核、酵母或高等真核细胞。合适的原核细胞包括真细菌，例如肠杆菌科，比如埃希氏菌属(Escherichia)，例如E.coli(例如ATCC31，446；31，537；27，325))，肠杆菌属(Enterobacter)，欧文氏菌属(Erwinia)，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，变形菌属(Proteus)，沙门氏菌属(Salmonella)，例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，沙雷氏菌属(Serratia)，例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)，和志贺氏菌属(Shigella)以及芽孢杆菌(Bacilli)属(如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(参见DD266710))，假单胞杆菌(Pseudomonas)(如铜绿假单胞杆菌(P.aeruginosa))和链霉菌(Stsptomyces)。酵母宿主细胞有酿酒酵母(Saccharomyces cervisiae)、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomyces pombe)、克鲁维酵母(Kluyveromyces)(例如ATCC 16，045；12，424；24178；56，500)、耶氏酵母(yarrowia)(EP402,226)、巴斯德毕赤酵母(Pichia Pastoris)(EP183,070；还参见Peng等，J.Biotechnol.108(2004)185-192)、念珠菌(Candida)、Trichoderma reesia(EP244,234)、青霉菌(Penicillin)、弯颈霉(Tolypocladium)和曲霉(Aspergillus)(比如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger))。
本发明虽然特别考虑了原核和酵母宿主细胞，但是本发明宿主细胞优选是高等真核细胞。合适的高等真核宿主细胞包括哺乳动物细胞(如COS-1(ATCC NO.CRL1650)、COS-7(ATCC CRL 1651))、人胚胎肾细胞系293、幼仓鼠肾细胞(BHK)(ATCC CRL.1632)、BHK570(ATCC NO：CRL 10314)、293(ATCC NO.CRL 1573)、中国仓鼠卵巢细胞CHO(例如CHO-K1，ATCC NO：CCL 61、DHFR-CHO细胞系(如DG44(参见Urlaub等(1986)Somatic Cell Mol.Genet.12，555-556))，尤其是那些适应于悬浮培养的CHO细胞、小鼠sertoli细胞、猴肾细胞、非洲绿猴肾细胞(ATCCCRL-1587)、HELA细胞、犬肾细胞(ATCC CCL 34)、人肺细胞(ATCC CCL75)、Hep G2和骨髓瘤或者淋巴瘤细胞，例如NS0(参见US 5,807,715)、Sp2/0、Y0。
因此在本发明一个实施方案中，提供了稳定转化的宿主细胞，其包含编码文中所述抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链的载体。优选这些宿主细胞包含编码所述轻链的第一载体和编码所述重链的第二载体。
细菌发酵
细菌体系尤其适用于抗体片段的表达。这些片段位于胞内和/或周间质。不溶的周间质蛋白可以按照本领域技术人员已知的方法提取并重新折叠成活性蛋白，参见Sanchez等(1999)J.Biotechnol.72，13-20和Cu pitPM等(1999)Lett Appl Microbiol 29，273-277。
3.7 细胞培养方法
被编码本发明抗体或其抗原结合片段的载体转化了的宿主细胞可以通过本领域技术人员已知的任何方法来培养。可以将宿主细胞培养在旋转烧瓶、转瓶或中空纤维系统中，但是对于大规模生产，优选搅拌罐反应器来进行悬浮培养。优选该搅拌罐利用例如分散器、挡板或低剪切搅拌翼改造成适应通气。对于鼓泡塔和气升式反应器，可以用空气或氧气泡来直接通气。对于宿主细胞培养在无血清培养基的情况中，优选培养基补充了细胞保护剂如Pluronic F-68来防止通气过程对细胞造成的损伤。根据宿生细胞的特点，对于贴壁依赖性细胞系可以用微载体作为生长基质，或者使用适应悬浮培养的细胞(通常是这样)。宿主细胞的培养，特别是无脊椎动物宿主细胞的培养可以运用多种操作模式，比如补料分批、重复分批培养(参见Drapeau等(1994)Cytotechnology 15：103-109)、持续单批培养或者灌流培养。虽然可以将重组转化的哺乳动物宿主细胞培养在含有血清的培养基中，比如胎牛血清(FCS)，但是优选将这些宿主细胞培养在诸如Keen等(1995)Cytotechnology 17：153-163中公开的合成无血清培养基中，或者可购得的培养基如ProCHO-CDM或UltraCHOTM(Cambre NJ，USA)中，需要时补充能量来源(如葡萄糖)和合成的生长因子(如重组胰岛素)。宿主细胞的无血清培养可能要求这些细胞能够适应在无血清的情况下生长。一种适应方法是将这些宿主细胞培养在含有血清的培养基中，然后重复将80％的培养基换成无血清培养基，以便宿主细胞逐渐适应无血清条件(参见例如Scharfenberg K等(1995)Animal Cell technology：Developments towards the 21st century(Beuvery E.C.等编辑)，619-623页，Kluwer Academic publishers)。
分泌到培养基中的本发明抗体可以利用多种技术回收和纯化，得到适合所需用途的纯度。例如，对于本发明抗体治疗人类患者的用途，通常要求至少95％的纯度，更通常是98％或99％或更高的纯度(相比粗培养基)。第一个例子中，通常经离心去除培养基中的细胞残片，随后是利用例如微滤、超滤和/或深层过滤来净化上清的步骤。还有多种其它技术可以使用，例如透析、凝胶电泳以及层析技术，如羟基磷灰石层析(HA)、亲和层析(任选地包含亲和标签体系，如多组氨酸)和/或疏水相互作用层析(HIC，参见US5,429,746)。一个实施方案中，在各种净化步骤之后，利用蛋白A或G亲和层析捕获本发明抗体，随后进行进一步层析如离子交换和/或HA层析、阴离子或阳离子交换、大小排阻层析，以及硫酸铵沉淀。通常，还要采用多种去除病毒的步骤(例如纳米过滤，采用例如DV-20滤膜。在这些步骤之后，得到纯化的(优选单克隆的)制剂，其包含至少75mg/ml或更多(例如100mg/ml或更多)本发明抗体或其抗原结合片段，因此这构成了发明的实施方案。适合的是，这类制品基本上没有聚集形式的本发明抗体。
4.药物组合物
上文描述的本发明抗体的纯化制剂(特别是单克隆制剂)可被配制在药物组合物中，用于治疗人类疾病和病症，如异位性疾病，例如哮喘、变应性鼻炎、COPD。通常这类组合物包含已知且为药物学实践所接受的可药用载体，参见例如Remingtons Pharmaceutical Science，第16版(1980)Mack出版公司。这类载体的例子包括用适宜缓冲液缓冲到pH5-8之间的经灭菌载体，如盐水、林格氏液或葡萄糖溶液。用于(例如通过静脉内、腹腔内、皮内、皮下、肌肉内或门静脉内)注射或持续输注的药物组合物最好无肉眼可见的颗粒，可以包含0.1ng-100mg抗体，优选5mg至25mg抗体。制备这类药物组合物的方法是本领域技术人员熟知的。在一个实施方案中，药物组合物在每单位用量形式中包含0.1ng至100mg的本发明抗体，任选和使用说明一起。本发明药物组合物可以被冻干(冷冻干燥)，以便在给药前根据本领域技术人员熟知的方法重建。在那些包含具有IgG1同种型的本发明抗体的本发明实施方案中，可以向药物组合物中加入铜螯合剂，如柠檬酸盐(例如柠檬酸钠)或者EDTA或组氨酸，以便降低铜介导的对这类同种型抗体降解的程度，参见EP0612251。抗hIL-13治疗可以经过口服、吸入或局部(例如，眼内、鼻内、经直肠到皮肤上的伤口)给药。
以本发明抗体给药的有效剂量和治疗方案一般是根据经验决定的，并且依赖于患者的年龄、体重和健康状况等因素以及待治疗的疾病或病症。这些影响因素在主治医生的考虑内。在例如Smith等(1977)：Antibodies in human diagnosis and therapy(Raven出版社，纽约)可以找到指导选择合适用量的内容，但一般是在1mg到1000mg。
取决于待治疗的疾病或病症(但是尤其是哮喘)，包含治疗有效量的本发明抗体的药物组合物可以与有效量的另一种药剂同时、分别或顺序使用，所述药剂例如为抗炎剂(例如皮质类固醇或NSAID)、抗胆碱能药(尤其是M1/M2/M3受体拮抗剂)、β2肾上腺素受体激动剂、抗感染药(例如抗生素、抗病毒剂)、抗组胺剂、PDE4抑制剂。β2肾上腺素受体激动剂的例子包括沙米特罗(salmeterol)、沙丁胺醇(salbutamol)、福莫特罗(formoterol)、沙甲胺醇(salmefamol)、非诺特罗(fenoterol)和叔丁喘宁(terbutaline)。优选的长效β2肾上腺素受体激动剂包括WO 02/66422A、WO02/270490、WO02/076933、WO03/024439和WO03/072539中公开的那些。适合的皮质类固醇包括甲基强的松龙、强的松龙、地塞米松、丙酸氟替卡松(fluticasone propionate)、6α，9α-二氟-17α-[(2-呋喃羰基)氧]-11β-羟基-16α-甲基-3-氧代-雄甾-1，4-双烯-17β-羧硫代酸S-氟甲基酯、6α，9α-二氟-11β-羟基-16α-甲基-3-氧代-17α-丙酰氧基-雄甾-1，4-二烯-17β-羧硫代酸S-(2-氧代-四氢呋喃-3S-基)酯、倍氯米松酯(例如其17-丙酸酯或17，21-二丙酸酯)、布地奈德、氟尼缩松(flunisolide)、莫米他松酯(例如糠酸酯)、去炎舒松、罗氟奈德、环索奈德(16α，17-[[(R)-环己基亚甲基]双氧基]-11β，21-二羟基-孕烷-1，4-二烯-3，20-二酮)、丙酸布替可特、RPR-106541以及ST-126。优选的皮质类固醇包括丙酸氟替卡松、6α，9α-二氟-11β-羟基-16α-甲基-17α-[(4-甲基-1，3-噻唑-5-羰基)氧基]-3-氧代-雄甾-1，4-二烯-17β-羧硫代酸S-氟甲基酯和6α，9α-二氟-17α-[(2-呋喃羰基)氧基]-11β-羟基-16α-甲基-3-氧代-雄甾-1，4-二烯-17β-羧硫代酸S-氟甲基酯，更优选6α，9α-二氟-17α-[(2-呋喃羰基)氧基]-11β-羟基-16α-甲基-3-氧代-雄甾-1，4-二烯-17β-羧硫代酸S-氟甲基酯。
以下专利涵盖了这类具有糖皮质激素激动作用的非固醇类化合物，它们可能具备在反式抑制作用和反式激活作用之间对前者的选择性，并可用于联合治疗：WO03/082827、WO01/10143、WO98/54159、WO04/005229、WO04/009016、WO04/009017、WO04/018429、WO03/104195、WO03/082787、WO03/082280、WO03/059899、WO03/101932、WO02/02565、WO01/16128、WO00/66590、WO03/086294、WO04/026248、WO03/061651和WO03/08277。
适合的抗炎剂包括非固醇类抗炎药物(NSAID)。
适合的NSAID包括色甘酸钠、奈多罗米钠(nedocromil sodium)、磷酸二酯酶(PDE)抑制剂(例如茶碱、PDE4抑制剂或混合的PDE3/PDE4抑制剂)、白三烯拮抗剂、白三烯合成的抑制剂(例如孟鲁斯特(montelukast))、iNOS抑制剂、类胰蛋白酶和弹性蛋白酶抑制剂、β-2整联蛋白拮抗剂和腺苷受体激动剂或拮抗剂(例如腺苷2a激动剂)、细胞因子拮抗剂(例如趋化因子拮抗剂，如CCR3拮抗剂)或者细胞因子合成的抑制剂、或者5-脂肪氧化酶抑制剂。适宜的其它β2肾上腺素受体激动剂包括沙米特罗(例如作为昔萘酸盐(xinafoate))、沙丁胺醇(例如作为硫酸盐或自由碱基)、福莫特罗(例如作为延胡索酸盐)、非诺特罗或叔丁喘宁及其盐。iNOS(诱导型一氧化氮合成酶抑制剂)优选经口腔给药。合适的iNOS抑制剂包括在WO93/13055、WO98/30537、WO02/50021、WO95/34534和WO99/62875中公开的那些。适合的CCR3抑制剂包括WO02/26722中所公开的那些。
特别感兴趣的是将本发明的抗体与磷酸二酯酶4(PDE4)抑制剂联用。适用于本发明这个方面的PDE4-特异性抑制剂可以是任何已知能够抑制PDE4酶或者被发现具有PDE4抑制剂作用的化合物，但所述化合物只是PDE4的抑制剂，而不包括那些在PDE4之外还抑制PDE家族其它成员(例如PDE3和PDE5)的化合物。
感兴趣的化合物包括顺式-4-氰基-4-(3-环戊氧基-4-甲氧基苯基)环己烷-1-羧酸、2-甲酯基-4-氰基-4-(3-环丙基甲氧基-4-二氟甲氧基苯基)环己烷-1-酮和顺式-[4-氰基-4-(3-环丙基甲氧基-4-二氟甲氧基苯基)环已烷-1-醇]。还有1996年9月3日授权的美国专利5,552,438中所描述的顺式-4-氰基-4-[3-(环戊氧基)-4-甲氧基苯基]环己烷-1-羧酸(又称为西洛司特(cilomilast))及其盐类、酯类、前药或物理形式，通过参考将该专利和它公开的化合物全部引入本文。
来自Elbion的AWD-12-281(Hofgen，N.等，15 th EFMD Int SympMed Chem(Sept 6-10，Edinburgh)1998，Abst P.98；CAS文献号247584020-9)；命名为NCS-613的9-苯基腺苷衍生物(INSERM)；来自Chiroscience和Scbering-Plough的D-4418；辉瑞的名为CI-1018的苯并二氮杂卓PDE4抑制剂(PD-168787)；Kyowa Hakko在WO99/16766中公开的苯并间二氧五环衍生物；Kyowa Hakko的K-34；来自Napp的V-11294A(Landells，L.J.等，Eur Resp J[欧洲呼吸学会年会(9月19-23，日内瓦)1998]1998，12(Suppl.28)：Abst P2393)；来自Byk-Gulden的罗氟司特(CAS编号162401-32-3)和pthalazinone(WO99/47505，通过参考将其公开内容并入本文)；普马芬群，(-)-p-[4aR*，10bS*]-9-乙氧基-1，2，3，4，4a，10b-六氢-8-甲氧基-2-甲基苯并[c][1，6]萘啶-6-基]-N，N-二异丙基苯甲酰胺是混合的PDE3/PDW4抑制剂，该产品已由Byk-Gulden(现在是Altana)制备和发布；由Almirall-Prodesfarma正开发的阿罗茶碱(arofylline)；来自Vernalis的VM554/UM565；或者T-440(Tanabe Seiyaku；Fuji，K.等，J Pharmacol Exp Ther，1998，284(1)：162)和T2585。
其它感兴趣的化合物在公开的国际专利申请WO04/024728(GlaxoGroup Ltd)、PCT/EP2003/014867(Glaxo Group Ltd)和PCT/EP2004/005494(Glaxo Group Ltd)中有公开。
适合的抗胆碱能药物是那些在毒蕈碱受体上用作拮抗剂的化合物，尤其是M1或M3受体的拮抗剂、M1/M3或M2/M3受体的双重拮抗剂、或者M1/M2/M3受体的广效拮抗剂。经吸入法给药的示例性化合物包括异丙托铵(ipratropium)(例如作为溴化物，CAS 22254-24-6，以Atrovent的商品名出售)；氧托品(oxitropium)(例如作为溴化物，CAS 30286-75-0)和塞托品(tiotropium)(例如作为溴化物，CAS 136310-93-5，以Spiriva的商品名出售)。同样令人感兴趣的是瑞伐托酯(revatropate)(例如作为氢溴酸盐，CAS 262586-79-8)和WO01/04118中公开的LAS-34273。用于口服的示例性化合物包括哌仑西平(CAS 28797-61-7)、达非那新(CAS133099-04-4；或其氢溴酸盐CAS 133099-07-7，以商品名Enablex销售)、奥昔布宁(CAS 5633-20-5，以商品名Ditropan销售)、特罗地林(CAS15793-40-5)、托特罗定(CAS 124937-51-5；或其酒石酸盐CAS124937-52-6，以商品名Detrol销售)、奥替铵(otilonium，例如作为溴化物，CAS 26095-59-0，以商品名Spasmomen销售)、曲司氯胺(trospiumchloride，CAS 10405-02-4)和素立芬新(solifenacin，CAS 242478-37-1；或其琥珀酸盐CAS 242478-38-2，又称为YM-905，以商品名Vesicare销售)。
其它合适的抗胆碱能试剂包括美国专利申请60/487981中公开的式(XXI)中的化合物：
Figure A200780002297D00471
其中连接在托烷环上的烷基链的方向优选是内型(endo)；
R31和R32独立地选自优选具有l至6个碳原子的直链或支链低级烷基、具有5至6个碳原子的环烷基、具有6至10个碳原子的环烷基-烷基、2-噻吩基、2-吡啶基、苯基、被不超过4个碳原子的烷基取代的苯基和被不超过4个碳原子的烷氧基取代的苯基；
X-代表与N原子的正电荷结合的阴离子。X-可以是但不限于氯离子、溴离子、碘离子、硫酸根、苯磺酸根和甲苯磺酸根，
包括，例如：
溴化(3-内型)-3-(2，2-二-2-噻吩基乙烯基)-8，8-二甲基-8-氮阳离子双环[3.2.1]辛烷；
溴化(3-内型)-3-(2，2-二苯基乙烯基)-8，8-二甲基-8-氮阳离子双环[3.2.1]辛烷；
(3-内型)-3-(2，2-二苯基乙烯基)-8，8-二甲基-8-氮阳离子双环[3.2.1]辛烷4-甲基苯磺盐酸；
溴化(3-内型)-8，8-二甲基-3-[2-苯基-2-(2-噻吩基)乙烯基]-8-氮阳离子双环[3.2.1]辛烷；和/或
溴化(3-内型)-8，8-二甲基-3-[2-苯基-2-(2-吡啶基)乙烯基]-8-氮阳离子双环[3.2.1]辛烷。
其它适合的抗胆碱能剂包括在US专利申请60/511009中公开的式(XXII)或(XXIII)的化合物：
Figure A200780002297D00481
其中：
标注的H原子在外部位置(exo position)；
R41-代表与N原子的正电荷结合的阴离子。R1-可以是但不限于氯离子、溴离子、碘离子、硫酸根、苯磺酸根和甲苯磺酸根；
R42和R43独立地选自直链或支链低级烷基(具有1至6个碳原子)、环烷基(具有5至6个碳原子)、环烷基-烷基(具有6至10个碳原子)、杂环烷基(具有5至6个碳原子)且N或O作为杂原子、杂环烷基-烷基(具有6至10个碳原子)且N或O作为杂原子、芳基、任选取代的芳基、杂芳基和任选取代的杂芳基；
R44选自(C1-C6)烷基、(C3-C12)环烷基、(C3-C7)杂环烷基、(C1-C6)烷基(C3-C12)环烷基、(C1-C6)烷基(C3-C7)杂环烷基、芳基、杂芳基、(C1-C6)烷基-芳基、(C1-C6)烷基-杂芳基、-OR45、-CH2OH45、-CN2OH、-CN、-CF3、-CH2O(CO)R46、-CO2R47、-CH2NH2、-CH2N(R47)SO2R45、-SO2N(R47)(R48)、-CON(R47)(R48)、-CH2N(R48)CO(R46)、-CH2N(R48)SO2(R46)、-CH2N(R48)CO2(R45)、-CH2N(R48)CONH(R47)；
R45选自(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷基(C3-C12)环烷基、(C1-C6)烷基(C3-C7)杂环烷基、(C1-C6)烷基-芳基、(C1-C6)烷基-杂芳基；
R46选自(C1-C6)烷基、(C3-C12)环烷基、(C3-C7)杂环烷基、(C1-C6)烷基(C3-C12)环烷基、(C1-C6)烷基(C3-C7)杂环烷基、芳基、杂芳基、(C1-C6)烷基-芳基、(C1-C5)烷基-杂芳基；
R47和R48独立地选自H、(C1-C6)烷基、(C3-C12)环烷基、(C3-C7)杂环烷基、(C1-C6)烷基(C3-C12)环烷基、(C1-C6)烷基(C3-C7)杂环烷基、(C1-C6)烷基-芳基、和(C1-C6)烷基-杂芳基，包括，例如：
碘化(内型)-3-(2-甲氧基-2，2-二-噻吩-2-基-乙基)-8，8-二甲基-8-氮阳离子-双环[3.2.1]辛烷；
3-((内型)-8-甲基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基)-2，2-二苯基-丙腈；
(内型)-8-甲基-3-(2，2，2-三苯基-乙基)-8-氮杂-双环[3.2.1]辛烷；
3-((内型)-8-甲基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基)-2，2-二苯基-丙酰胺；
3-((内型)-8-甲基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基)-2，2-二苯基-丙酸；
碘化(内型)-3-(2-氰基-2，2-二苯基-乙基)-8，8-二甲基-8-氮阳离子-双环[3.2.1]辛烷；
溴化(内型)-3-(2-氰基-2，2-二苯基-乙基)-8，8-二甲基-8-氮阳离子-双环[3.2.1]辛烷；
3-((内型)-8-甲基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基)-2，2-二苯基-丙-1-醇；
N-苄基-3-((内型)-8-甲基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基)-2，2-二苯基丙酰胺；
碘化(内型)-3-(2-氨基甲酰基-2，2-二苯基-乙基)-8，8-二甲基-8-氮阳离子-双环[3.2.1]辛烷；
1-苄基-3-[3-((内型)-8-甲基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基)-2，2-二苯基-丙基]-脲；
1-乙基-3-[3-((内型)-8-甲基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基)-2，2-二苯基-丙基]-脲；
N-[3-((内型)-8-甲基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基)-2，2-二苯基-丙基]-乙酰胺；
N-[3-((内型)-8-甲基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基)-2，2-二苯基-丙基]-苯甲酰胺；
3-((内型)-8-甲基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基)-2，2-二-噻吩-2-基-丙腈；
碘化(内型)-3-(2-氰基-2，2-二-噻吩-2-基-乙基)-8，8-二甲基-8-氮阳离子-双环[3.2.1]辛烷；
N-[3-((内型)-8-甲基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基)-2，2-二苯基-丙基]-苯磺酰胺；
[3-((内型)-8-甲基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基)-2，2-二苯基-丙基]-脲；
N-[3-((内型)-8-甲基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基)-2，2-二苯基-丙基]-甲磺酰胺；和/或
溴化(内型)-3-{2，2-二苯基-3-[(1-苯基-甲酰基)-氨基]-丙基}-8，8-二甲-8-氮阳离子-双环[3.2.1]辛烷。
对于本发明更优选的化合物包括：
碘化(内型)-3-(2-甲氧基-2，2-二-噻吩-2-基-乙基)-8，8-二甲基-8-氮阳离子双环[3.2.1]辛烷；
碘化(内型)-3-(2-氰基-2，2-二苯基-乙基)-8，8-二甲基-8-氮阳离子双环[3.2.1]辛烷；
溴化(内型)-3-(2-氰基-2，2-二苯基-乙基)-8，8-二甲基-8-氮阳离子-双环[3.2.1]辛烷；
碘化(内型)-3-(2-氨基甲酰基-2，2-二苯基-乙基)-8，8-二甲基-8-氮阳离子-双环[3.2.1]辛烷；
碘化(内型)-3-(2-氰基-2，2-二-噻吩-2-基-乙基)-8，8-二甲基-8-氮阳离子-双环[3.2.1]辛烷；和/或
溴化(内型)-3-{2，2-二苯基-3-[(1-苯基-甲酰基)-氨基]-丙基}-8，8-二甲基-8-氮阳离子-双环[3.2.1]辛烷。
合适的抗组胺药(又称为H1-受体拮抗剂)包括大量已知抑制H1-受体，而且人体使用安全的拮抗剂中的一种或多种。第一代拮抗药，包括乙醇胺、乙二胺和烷胺的衍生物，例如二苯羟基胺、吡拉明(pyrilamine)、氯马斯汀(clemastine)、氯非尼拉敏(chlropheniramine)。第二代拮抗药没有镇静作用，包括氯雷他啶(loratidine)、地氯雷他啶(desloratidine)、特非那丁(terfenadine)、阿司咪唑(astemizole)、阿伐斯汀(acrivastine)、氮卓斯汀(azelastine)、左旋西替利嗪(levocetirizine)、非索非那定(fexofenadine)和西替利嗪(cetirzine)。
优选的抗组胺药的例子包括氯雷他啶、地氯雷他啶、非索非那定和西替利嗪。
其它考虑的组合包括将本发明抗体与抗IL-4试剂(例如抗IL-4抗体如帕考珠单抗(帕考珠单抗))，和/或抗IL-5试剂(例如抗IL-5抗体，如mepolizumab)，和/或抗IgE试剂(例如抗IgE抗体，如奥马佐单抗(omalizumab，XolairTM)或那他珠单抗(talizumab)联合使用。
方便地，本发明还考虑了一种药物组合物，其连同这类其它的药物，任选地与使用说明书一起构成本发明抗体或其抗原结合片段的试剂盒(kit of parts)。
此外，本发明还考虑一种药物组合物，其包合治疗有效量的本文所述治疗用单克隆抗体或其抗原结合片段，用于治疗那些对调节hIL-13和hIL-13R之间的相互作用有反应的疾病。
根据本发明，提供了包含治疗有效量的单克隆人源化治疗用抗体的药物组合物，该抗体包含选自SEQ.I.D.NO：11、12、13、14的VH结构域和选自SEQ.I.D.NO：15、16、17的VL结构域。
根据本发明，提供了包含单克隆抗体的药物组合物，该抗体包含选自SEQ.I.D.NO：18、19、20、21的重链和选自SEQ.I.D.NO：22、23、24的轻链。
根据本发明，提供了包含单克隆抗体和药物上可接受的载体的药物组合物，该抗体包含SEQ.I.D.NO：18的重链和SEQ.I.D.NO：22的轻链。
根据本发明，提供了包含单克隆抗体和药物上可接受的载体的药物组合物，该抗体包含SEQ.I.D.NO：18的重链和SEQ.I.D.NO：22的轻链，或基本由SEQ.I.D.NO：18的重链和SEQ.I.D.NO：22的轻链组成。
根据本发明，提供了包含药物上可接受的载体和治疗有效量的单克隆抗体群的药物组合物，该抗体包含SEQ.I.D.NO：18的重链和SEQ.I.D.NO：22的轻链。
根据本发明，提供了包含药物上可接受的载体和治疗有效量的单克隆抗体群的药物组合物，该抗体包含SEQ.I.D.NO：18的重链和SEQ.I.D.NO：23的轻链。
根据本发明，提供了包含药物上可接受的载体和治疗有效量的单克隆抗体群的药物组合物，该抗体包含SEQ.I.D.NO：18的重链和SEQ.I.D.NO：24的轻链。
根据本发明，提供了包含药物上可接受的载体和治疗有效量的单克隆抗体群的药物组合物，该抗体包含SEQ.I.D.NO：19的重链和SEQ.I.D.NO：22的轻链。
根据本发明，提供了包含药物上可接受的载体和治疗有效量的单克隆抗体群的药物组合物，该抗体包含SEQ.I.D.NO：19的重链和SEQ.I.D.NO：23的轻链。
根据本发明，提供了包含药物上可接受的载体和治疗有效量的单克隆抗体群的药物组合物，该抗体包含SEQ.I.D.NO：19的重链和SEQ.I.D.NO：24的轻链。
根据本发明，提供了包含药物上可接受的载体和治疗有效量的单克隆抗体群的药物组合物，该抗体包含SEQ.I.D.NO：20的重链和SEQ.I.D.NO：22的轻链。
根据本发明，提供了包含药物上可接受的载体和治疗有效量的单克隆抗体群的药物组合物，该抗体包含SEQ.I.D.NO：20的重链和SEQ.I.D.NO：23的轻链。
根据本发明，提供了包含药物上可接受的载体和治疗有效量的单克隆抗体群的药物组合物，该抗体包含SEQ.I.D.NO：20的重链和SEQ.I.D.NO：24的轻链。
根据本发明，提供了包含药物上可接受的载体和治疗有效量的单克隆抗体群的药物组合物，该抗体包含SEQ.I.D.NO：21的重链和SEQ.I.D.NO：22的轻链。
根据本发明，提供了包含药物上可接受的载体和治疗有效量的单克隆抗体群的药物组合物，该抗体包含SEQ.I.D.NO：21的重链和SEQ.I.D.NO：23的轻链。
根据本发明，提供了包含药物上可接受的载体和治疗有效量的单克隆抗体群的药物组合物，该抗体包含SEQ.I.D.NO：21的重链和SEQ.I.D.NO：24的轻链。
5.临床应用
本发明抗体可以用于治疗异位性疾病/病症和慢性炎性疾病/病症。我们特别感兴趣的是用它们治疗哮喘，如变应性哮喘，特别是重症哮喘(这种哮喘对现有的治疗方法(包括系统给予皮质类固醇)没有反应；参见Busse WW等，J Allergy Clin.Immunol 2000，106：1033-1042)、难治型哮喘(其表型特征为即便使用最高推荐剂量的规定吸入型类固醇，病情仍得不到控制，参见Barnes PJ(1998)，Eur Respir J 12：1208-1218)、不稳定型哮喘(定义为患有严重、不稳定哮喘的患者群，即便给他们使用高剂量吸入型类固醇，仍维持变动较大的呼气流量峰值(PEF)，参见Ayres JG等(1998)Thorax 58：315-321)、夜发哮喘、经前期哮喘、类固醇抗性哮喘(参见Woodcock AJ(1993)Eur Respir J 6：743-747)、类固醇依赖型哮喘(定义为仅有高剂量口服类固醇可以控制的哮喘)、阿司匹林诱导型哮喘、成人哮喘、小儿哮喘。本发明抗体可以用于预防急性哮喘发作(statusasthmaticus)、降低发作频率或者减轻其后果。本发明抗体可以用于减少哮喘治疗中使用的其它药品的需要剂量(就给药量或给药频率而言)。例如本发明抗体可以用于减少类固醇治疗哮喘(比如皮质类固醇疗法)所需的剂量(“节约类固醇”)。可以用本发明抗体治疗的其它疾病或病症包括异位性皮炎、变应性鼻炎、克罗恩氏病、慢性阻塞性肺病(COPD)、嗜酸性粒细胞性食道炎、诸如特发性肺纤维化的纤维化疾病或病症、进行性全身硬化症(硬皮病)、肝纤维化、肝肉芽肿、血吸虫病、利什曼病，以及细胞周期调节性疾病例如霍奇金病、B细胞慢性淋巴细胞白血病。上文发明背景部分详述了可用本发明抗体治疗的其它疾病或病症。
在本发明的一个实施方案中，提供了治疗患有对皮质类固醇治疗无反应的哮喘状况的人类患者的方法，该方法包括向所述患者给予治疗有效量的本发明抗体的步骤。
在另一实施方案中，提供了防止人类患者急性哮喘发作的方法，该方法包括向所述患者给予治疗有效量的本发明抗体的步骤。
在另一实施方案中，提供了减少人类患者急性哮喘发作频率和/或减轻发作后果的方法，该方法包括向所述患者给予治疗有效量的本发明抗体的步骤。
在本发明另一实施方案中，提供了在人类患者受到炎性和/或变应性攻击后，使T辅助细胞应答偏向Th1型应答的方法，该方法包含向所述患者给予治疗有效量的本发明抗体或其抗原结合片段的步骤。
在本发明另一实施方案中，提供了治疗携带Q130hIL-13变体的人类患者的方法，所述患者患有哮喘(如重症哮喘)，所述方法包括向所述患者给予治疗有效量的本发明抗体或其抗原结合片段的步骤。
虽然本发明主要就治疗人类疾病或病症进行了描述，但是本发明也可能应用于治疗非人哺乳动物的类似疾病或病症。
以下仅以实施例的方式对本发明进行描述。
附图简要说明
图1
夹心ELISA，显示浓度不断增加的小鼠单克隆抗体3G4与大肠杆菌表达的重组人IL-13的结合。
图2a
中和测定，显示浓度不断增加的小鼠单克隆抗体3G4在TF-1细胞增殖测定中抑制大肠杆菌表达的重组人IL-13的生物活性的能力。
图2b
中和测定，显示浓度不断增加的嵌合3G4在TF-1细胞增殖测定中抑制大肠杆菌表达的重组人IL-13的生物活性的能力。
图3
中和测定，显示浓度不断增加的小鼠单克隆抗体3G4(和嵌合抗体3G4)在TF-1细胞增殖测定中抑制大肠杆菌表达的重组食蟹猴IL-13的生物活性的能力。以‘Campath’标记的曲线是采用抗CD52人源化抗体alemtuzumab所获得的，其被用作本实验中的无关抗体对照。以‘anti-hIL13poly’标记的曲线是采用中和多克隆抗IL13制剂(R&DSystems，目录编号AF-213-NA)获得的，其被用作阳性对照。
图4
中和测定，显示浓度不断增加的小鼠单克隆抗体3G4(和嵌合3G4)在TF-1细胞增殖测定中抑制哺乳动物表达(CHO细胞)的人IL-13的生物活性的能力。Campath和anti-hIL13为对照试剂，如上文所述。
图5
中和测定，显示浓度不断增加的小鼠单克隆抗体3G4和(嵌合3G4)在TF-1细胞增殖测定中抑制大肠杆菌表达的重组Q130人IL-13的生物活性的能力。Campath和anti-hIL13为对照试剂，如上文所述。
图6
表位定位ELISA，确定人和食蟹猴IL-13上小鼠单克隆抗体的结合表位。
图7a
表位定位ELISA，鉴定小鼠单克隆抗体3G4在人IL-13上的精细结合特异性。
图7b
表位定位ELISA，鉴定小鼠单克隆抗体3G4在食蟹猴IL-13上的精细结合特异性。
图8
表位定位ELISA，确定小鼠单克隆抗体3G4与人IL-13结合所需的关键氨基酸残基。
图9.
表位定位ELISA，确定小鼠单克隆抗体3G4与人IL-13结合所需的关键氨基酸残基。
图10
夹心ELISA，显示浓度不断增加的小鼠单克隆抗体3G4、3G4嵌合和人源化单抗H2L1、H3L1与大肠杆菌表达的重组人IL-13的结合
图11
中和测定，显示浓度不断增加的小鼠单克隆抗体3G4、3G4嵌合和人源化单抗H2L1、H3L1在TF-1细胞增殖测定中抑制大肠杆菌表达的重组人IL-13的生物活性的能力。
图12
中和测定，显示浓度不断增加的小鼠单克隆抗体3G4、3G4嵌合和人源化单抗H2L1、H3L1在TF-1细胞增殖测定中抑制大肠杆菌表达的重组食蟹猴IL-13的生物活性的能力。
图13
中和测定，显示浓度不断增加的小鼠单克隆抗体3G4、3G4嵌合和人源化单抗H2L1、H3L1在TF-1细胞增殖测定中抑制哺乳动物表达(CHO细胞)的人IL-13的生物活性的能力。
图14
中和测定，显示浓度不断增加的小鼠单克隆抗体3G4、3G4嵌合和人源化单抗H2L1、H3L1在TF-1细胞增殖测定中抑制大肠杆菌表达的Q130人IL-13的生物活性的能力。
图15
夹心ELISA，证实小鼠单克隆抗体3G4、3G4嵌合和人源化单抗H2L1、H3L1不与大肠杆菌表达的重组人IL-4结合。
图16
夹心ELISA，证实小鼠单克隆抗体3G4、3G4嵌合和人源化单抗H2L1、H3L1不与大肠杆菌表达的重组人IL-5结合。
图17
直接结合ELISA，证实小鼠单克隆抗体3G4、3G4嵌合和人源化单抗H2L1、H3L1不与人GM-CSF结合。
图18
夹心ELISA，显示浓度不断增加的小鼠单克隆抗体3G4、3G4嵌合和人源化单抗H2L1、H3L1与天然人IL-13的结合。
图19
ELISA，显示浓度不断增加的小鼠单克隆抗体3G4、3G4嵌合和人源化单抗H2L1、H3L1抑制大肠杆菌表达的重组人IL-13与人IL-13受体α1链结合的能力。
图20
ELISA，显示浓度不断增加的小鼠单克隆抗体3G4、3G4嵌合和人源化单抗H2L1、H3L1抑制大肠杆菌表达的重组人IL-13与人IL-13受体α2链结合的能力。
实施例
1.单克隆抗体的产生和小鼠单克隆抗体3G4的表征
5只SJL小鼠通过腹膜内各注射2μg大肠杆菌产生的重组人IL-13(Cambridge Bioscience，目录编号CH-013)被免疫。取出小鼠脾细胞，采用PEG1500(Boehringer)将B淋巴细胞与源自P3X细胞的小鼠骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤。通过有限稀释克隆单个杂交瘤细胞系(E Harlowand D Lane)。通过显微镜鉴别含有单个克隆的孔并测试上清活性。来自最有活性的克隆的细胞被扩增，用于冷藏保存、抗体生产等。
首先，在夹心测定方式中筛选杂交瘤上清对大肠杆菌表达的det-1标记的重组人IL-13蛋白(自制的)的结合活性。对这些阳性克隆的二次筛选采用BIAcoreTM方法完成，检测与det-1标记的人IL-13蛋白的结合。随后在TF-1细胞生物测定法中检测来自这些杂交瘤的样品中和大肠杆菌表达的重组人IL-13(Cambridge Bioscience，cat.no CH-013)的生物活性的能力。
由人IL-13中和生物测定法鉴定的阳性克隆通过有限稀释进行亚克隆，以产生稳定的单克隆抗体细胞系。无血清条件下在细胞工厂生长的这些杂交瘤产生的免疫球蛋白采用固定化蛋白A柱进行纯化。随后，这些经纯化的单抗在相同的三个测定系统中再次筛选。
单克隆抗体3G4被鉴定为中和人IL-13生物活性的有效抗体。
3G4抗体具有如SEQ.I.D.NO：7中显示的VH区氨基酸序列。
3G4抗体具有如SEQ.I.D.NO：8中显示的VL区氨基酸序列。
通过从3G4鼠单克隆抗体获得可变区并将它们移植到人IgG1/k野生型C区而构建嵌合抗体。人信号序列(如SEQ.I.D.NO：43中所示)被用在这些构建体的构建中。这种嵌合抗体被称为3G4C。
1.1 与大肠杆菌表达的重组人IL-13的结合
3G4在夹心ELISA中结合大肠杆菌表达的重组人IL-13，该方法按实施例6.1所述进行(参见图1)。
1.2 在TF-1细胞增殖生物测定法中中和大肠杆菌表达的重组人IL-13 和食蟹猴IL-13
应答人IL-13和食蟹猴IL-13时，TF-1细胞增殖。开发了生物测定法来评估抗IL-13单抗中和人和食蟹猴IL-13诱导的TF-1细胞增殖的能力。该方法按实施例6.2中所述进行。
食蟹猴IL-13(不包括信号序列)氨基酸序列和cDNA序列分别显示在SEQ.I.D.NO：41和SEQ.I.D.NO：42中。
3G4在TF-1细胞生物测定法中中和重组人IL-13的生物活性(参见图2a)。
3G4中和食蟹猴IL-13生物活性的能力不如中和人IL-13(参见图3)。
在TF-1细胞生物测定法中，单克隆抗体3G4中和约10ng/ml大肠杆菌表达的重组人IL-13生物活性所计算的平均ND50值为0.13μg/ml。
在TF-1细胞生物测定法中，单克隆抗体3G4中和约10ng/ml大肠杆菌表达的重组食蟹猴IL-13生物活性所计算的ND50值为29μg/ml。[ND50(中和剂量)值为TF-1细胞应答固定IL-13浓度时，其增殖降低50％所需的单克隆抗体浓度]。
1.3 在TF-1细胞增殖生物测定法中中和哺乳动物表达(CHO细胞)的人 IL-13
在TF-1细胞增殖测定法中评估了单克隆抗体中和CHO细胞表达的人IL-13的能力。该方法按实施例6.2所述进行。3G4中和哺乳动物表达的人IL-13比可购得的抗人IL-13多克隆试剂更有效。在TF-1细胞生物测定法中，单克隆抗体3G4中和～20ng/ml哺乳动物表达的人IL-13所计算的ND50值为0.31μg/ml。
1.4 在TF-1细胞增殖生物测定法中中和重组Q130人IL-13变体
在TF-1细胞增殖测定法中评估了单克隆抗体3G4对大肠杆菌表达的重组Q130人IL-13(Peprotech，Cat.No.200-13A)的中和能力。该方法按实施例6.2中所述进行。3G4中和Q130人IL-13比可购得的抗人IL-13多克隆试剂更有效。在TF-1细胞生物测定法中，单克隆抗体3G4中和～60ng/ml Q130人IL-13生物活性所计算的ND50值为0.025μg/ml。参见图5。
1.5 BIAcore TM 分析
通过BIAcoreTM(表面等离子共振)分析评估3G4小鼠单抗与重组人和食蟹猴IL-13的亲和力。参见表2。
采用抗小鼠IgG俘获进行BIAcoreTM分析。根据制造商的建议，通过伯胺偶联将抗小鼠IgG抗体偶联至CM5芯片。然后将3G4母本小鼠单抗俘获至该表面并让人或食蟹猴IL-13以指定浓度穿过。采用温和的酸稀释条件将表面再生回抗小鼠IgG表面，这不显著影响俘获抗体用于随后的IL-13结合事件的能力。这项工作在Biacore3000上进行并采用该仪器附带的评估软件分析，数据采用1：1结合模型进行分析。用于人IL-13结合的数据采用大肠杆菌表达的Det-1标记的重组人IL-13以及可购得的大肠杆菌表达的未标记的重组人IL-13试剂(Peprotech提供)产生。大肠杆菌表达的重组食蟹猴IL-13由GSK生产。所有的Biacore操作都在25度进行。
表2.母本3G4小鼠单抗结合人和食蟹猴IL-13的Biacore 3000数据
 
3G4小鼠单抗结合至 ka Kd KD(nM)
Det-1标记的人IL-13 5.61e6(1.49e6) 1.68e-4(7.07e-7) 0.031(0.009)
人IL-13(Peprotech) 2.25e6 1.37e-4 0.061
食蟹猴IL-13 4.11e5 1.3e-3 3.15
对于Det-1标记的人IL-13，数据是从两个独立的试验产生，二者的操作都双份进行。数据表示为这些结果的均值和标准偏差(括号内)。
对于人IL-13(Peprotech提供)和食蟹猴IL-13(GSK生产)，这些数据为双份进行的一次实验的结果。
对于上述数据，对双份一起分析，产生一个操作结果。
这些数据表明3G4小鼠单抗对人IL-13有非常高的亲和力，相比而言，3G4小鼠单抗对食蟹猴IL-13的结合亲和力稍差。
2.克隆3G4的人源化
2.1 序列分析
将3G4可变区序列与其它鼠和人免疫球蛋白序列进行了比较。这是采用FASTA和BLAST程序并通过观察来完成的。
以下的3G4中框架残基被鉴定为在设计CDR-移植的(人源化的)抗体形式中可能是重要的。
位置      3G4 VH
10        D
30        I
93        T
位置是根据Kabat等的标号系统。
位置      3G4 VL
98        L
适用于3G4VH的人受体框架鉴定为：SEQ.I.D.NO：44。
适用于3G4VL的人受体框架鉴定为：SEQ.I.D.NO：45。
在SEQ.I.D.NO：44中CRDH1和H2都存在，CDRH3表示为XXXXXXXXXX。SEQ.I.D.NO：45中CRDL1和L2都存在，CDRL3表示为XXXXXXXXX。
CDR移植中，通常需要一个或多个来自供体抗体的框架残基被包括进来替换受体框架中它们的直系同原物(orthologue)，以获得令人满意的结合。除了以上所列出的这些，以下的鼠框架残基也在人源化抗体设计中被考虑用于可能的固位：
位置(Kabat#)    3G4VH     人VH
10              D         E
30              I         T
67              A         V
69              L         M
71              A         R
73              K         T
93              T         A
位置(Kabat#)  小鼠3G4VL   人VL
76              N         S
98              L         F
设计了4种人源化的具有不同回复突变的VH构建体，以获得具有令人满意活性的人源化抗体。它们被编号为H1至H4。
H1由3G4 VH CDR移植进特异受体序列的CDR移植构成。另外，H1在位置30(异亮氨酸)含有鼠残基。这在Kabat的CDR定义之外，但是在Chothia的CDR H1定义内。这种情况下，这种残基被认为是CDR的一部分，而不是真正的框架恢复突变。
除了回复突变，H2与H1相同，其中93位氨基酸为苏氨酸而不是丙氨酸。
除了另外的回复突变，H3与H2相同，其中10位氨基酸为天门冬氨酸而不是谷氨酸。
除了在67位(丙氨酸替换缬氨酸)、69位(亮氨酸替换甲硫氨酸)、71位(丙氨酸替换精氨酸)和73位(赖氨酸替苏氨酸)含有四个另外的回复突变外，H4与H3相同。
设计了3个人源化的具有不同回复突变的VL构建体，以获得具有令人满意活性的人源化抗体。它们被编号为L1至L3。
L1由3G4 VL CDR移植进特异受体系列的CDR移植构成，采用CDR的Kabat定义。
除了具有回复突变之外，L2与L1相同，其中在98位的氨基酸为亮氨酸，其替换了苯丙氨酸。
除了具有另外的回复突变之外，L3与L2相同，其中位置76为的氨基酸为天门冬酰胺，其替换了丝氨酸。
人源化的V H 构建体H1：
SEQ.I.D.NO：11
人源化的V H 构建体H2：
SEQ.I.D.NO：12
人源化的V H 构建体H3：
SEQ.I.D.NO：13
人源化的V H 构建体H4：
SEQ.I.D.NO：14
人源化的V L 构建体L1：
SEQ.I.D.NO：15
人源化的V L 构建体L2：
SEQ.I.D.NO：16
人源化的V L 构建体L3：
SEQ.I.D.NO：17
2.23G4的人源化
通过从头构建重叠寡核苷酸来制备人源化的VH和VL构建体，该重叠寡核苷酸包括用于克隆进Rld和Rln哺乳动物表达载体的限制性位点以及人信号序列。引入Hind III和Spe I限制性位点以形成含有人信号序列(SEQ.I.D.NO：43)的VH结构域框架，用于克隆进含有人γ1野生型恒定区的Rld。引入Hind III和BsiW I限制性位点以形成含有人信号序列的VL结构域框架，用于克隆进含有人κ恒定区的R1n。这基本上如WO2004/014953中所述。
3.表达和表征人源化抗体
在Rld hCγ1wt和Rln hCK哺乳动物表达载体中制备了人源化的VH构建体(H1、H2、H3和H4)和两人源化的VL构建体(L1和L2)。质粒重链和轻链组合(H1L1、H1L2、H2L1、H2L2、H3L1、H3L2、H4L1、H4L2)被瞬时共转染进CHO细胞，并小规模表达以产生8种不同的人源化抗体。
在人IL-13结合ELISA中、在人IL-13中和生物测定法中分析了CHO细胞上清中产生的抗体以及随后各批次经纯化的抗体的活性，并通过BIAcoreTM分析了与人IL-13的结合。在这些测定法的每种中，所有8种人源化的单抗都显示了对人IL-13的结合和/中和。由于在人IL-13中和生物测定法中以及通过BIAcoreTM测定的与人IL-13的结合中的更好表现，H2L1和H3L1被选择用于进一步的分析，尽管它们仅提供了有限数量的回复突变。
3.1 与大肠杆菌表达的重组人IL-13的结合
3G4C、H2L1和H3L1在夹心ELISA中以类似的曲线结合大肠杆菌表达的重组人IL13。该方法按实施例6.1A所述进行。表3显示了平均ED50值(还参见图10)。[The ED50(有效剂量)为在这种ELISA中与IL-13半数最大结合时所需的抗体浓度]
表3
 
单抗 ED50(μg/ml) 标准差
嵌合3G4 0.04 0.021
H2L1 0.04 0.001
H3L1 0.05 0.007
3G4、3G4C、H2L1、以及H3L1还通过ELISA被证实抑制人IL-13与人IL-13受体链(IL13R1和IL13R2)结合。这种方法按实施例6.5和6.6所述进行。
图19显示了证实抑制与IL13R1结合的数据。
表4显示了抑制与IL13R2结合的平均IC50值。[IC50是抑制固定量的人IL-13与IL13R2结合的50％时所需的单抗浓度]。
表4
Figure A200780002297D00631
图19显示3G4、3G4、H2L1和H3L1以类似的能力抑制人IL-13与IL13R1的结合。
图20显示3G4、3G4C、H2L1和H3L1以类似的能力抑制人IL-13与IL13R的结合。
3.2 与天然人IL-13的结合
HDLM-2细胞系(Reed-Steinberg样细胞系，最初从骨髓获得)产生人IL-13并在自分泌方式中使用它用于生长。这种天然人IL-13被分泌至HDLM-2细胞上清。这被用于采用实施例6.1B中所述的方法评估3G4、3G4C、H2L1和H3L1对天然人IL-13的结合。通过ELISA，所有四种抗体都以非常类似于母本3G4单抗的性能结合HDLM2细胞上清中的天然人IL-13。参见图18。
3.3 TF-1 细胞增殖生物测定法中中和大肠杆菌表达的重组人和食蟹猴 IL-13
3G4、3G4C、H2L1和H3L1中和大肠杆菌表达的重组人和食蟹猴IL-13的生物活性。该方法按实施例6.2A中所述进行。
3G4、3G4C、H2L1和H3L1中和大肠杆菌表达的重组食蟹猴IL-13的生物活性不如中和人IL-13有效。[ND50(中和剂量)为TF-1细胞应答固定IL-13浓度时，其增殖降低50％所需的单抗浓度]。
参见以下表5和图11和12。
表5
Figure A200780002297D00641
对于3G4，在TF-1测定中中和约10ng/ml大肠杆菌表达的人IL-13生物活性所计算的ND50值为0.049μg/ml。表5中的结果为四次独立重复的均值。所获得的值与之前获得的ND50值(参见实施例1.2)相比尽管大约低两倍，但还是类似的。
母本3G4小鼠单抗所获得的中和大肠杆菌表达的人IL13的水平与嵌合3G4所获得的水平类似。与母本3G4小鼠单抗和嵌合3G4相比，H2L1和H3L1的能力减弱。
对3G4母本的平均ND50值为34μg/ml。这是TF-1测定中针对中和约10ng/ml大肠杆菌表达的重组食蟹猴IL-13生物活性所计算的。该值类似于之前对母本3G4所报道的值(参见实施例1.2)。H2L1和H3L1也显示了与3G4类似的针对食蟹猴IL13的能力。
3.4 TF-1 细胞增殖生物测定法中中和哺乳动物表达的(CHO细胞)人 IL-13
按照实施例6.2A中所列的方法，在TF-1细胞增殖测定法中评估单克隆抗体3G4、3G4C、H2L1、以及H3L1对CHO细胞表达的人IL-13的中和能力。
3G4、3G4C、H2L1、以及H3L1中和CHO表达的重组人IL13的生物活性(参见表6和图13)。[ND50(中和剂量)为TF-1细胞应答固定IL-13浓度时，其增殖降低50％所需的单抗浓度]。
表6
Figure A200780002297D00651
对于3G4母本平均ND50值为0.05μg/ml。这是在TF-1细胞测定法中对中和～10ng/ml哺乳动物表达的人IL-13所计算的。该值与之前获得的值(参见实施例1.3)不同。但是，在这些实验中用于刺激TF-1细胞增殖的人IL13的量低于之前所使用的(10ng/ml)。
通过母本3G4单抗获得的中和CHO表达的人IL-13的水平稍好于3G4C所获得的水平。与母本3G4单抗和嵌合3G4相比，H2L1和H3L1的能力减弱了。
3.5TF-1 细胞增殖生物测定法中中和重组Q130人IL-13变体
在TF-1细胞增殖测定法中评估了3G4、3G4C、H2L1和H3L1中和大肠杆菌表达的重组Q130人IL-13的能力。该方法按实施例6.2A中所述进行。
获得了0.274μg/ml的ND50值。这不同与之前获得的ND50值(参见实施例1.4)。这种测定被重复数次以证实这些ND50值。用在两套实验(在不同时间进行的)中的商业来源的Q130人IL-13制剂的质量可能解释在这两数据组中所观察到的差异。
表7示出了3G4C、H2L1和H3L1的能力，它们都类似。还参见图14。
表7
Figure A200780002297D00661
3.6 BIAcore TM 分析
通过BIAcoreTM分析评估了3G4C、H2L1和H3L1对重组人和食蟹猴IL-13的亲和力。参见表8、9和10。
采用蛋白A俘获进行分析。简言之，根据生产商的建议，通过伯胺偶联将蛋白A偶联至CM5芯片。然后让嵌合抗体或人源化抗体被俘获在其表面，并使人或食蟹猴IL-13以指定浓度穿过。采用温和酸稀释条件将表面再生回至蛋白A表面，这不显著影响俘获抗体用于随后IL-13结合事件的能力。这项工作在Biacore 3000和T100 Biacore仪器上进行，数据采用仪器附带的评价软件分析并拟合至1:1结合模型。两仪器获得的数据间稍有差异，尽管在嵌合和人源化抗体结合人IL-13的动力学之间看到的差异对于两仪器是类似的。所有构建体对人IL-13的结合数据很好地拟合至1:1模型，对结合食蟹猴IL-13的拟合较差，增加了这样的可能性：由于这种较差的拟合和分析困难，实际值可能比所报道的稍差(例如，2-3倍差异)。这些数据是采用未标记的重组人或食蟹猴IL-13(在GSK生长)产生的。所有的Biacore操作都在25度进行。
表8：关于嵌合和人源化抗体结合人IL-13的Biacore 3000数据
 
抗体 ka kd KD(nM)
嵌合3G4 3.29e6(6.31e5) 1.92e-4(3.68e-5) 0.060(0.00)
H2L1 2.77e6(1.43e5) 3.30e-4(9.19e-5) 0.120(0.03)
H3L1 2.84e6(9.11e4) 3.77e-4(1.94e-5) 0.130(0.01)
对于嵌合3G4，数据是从4个独立试验(其中两个试验双份重复进行，对每个双份重复单独分析)产生。对于H2L1和H3L1人源化单抗，数据从双份重复进行的两个独立实验(对每个双份重复单独分析)产生。数据显示为这些结果的均值和标准偏差(括号内)
表9：嵌合和人源化抗体结合人IL-13的T100数据
 
抗体 ka kd KD(nM)
嵌合3G4 1.12e7(7.07e4) 2.5e-4(2.4e-5) 0.023(0.002)
H2L1 1.07e7(7.76e6) 5.68e-4(1.38e-4) 0.066(0.035)
H3L1 7.21e6(2.09e6) 5.31e-4(3.25e-5) 0.077(0.018)
数据从两个独立实验产生，这些结果表示为均值和标准偏差(括号内)。
3G4嵌合抗体和人源化单抗H2L1和H3L1以高亲和力结合人IL-13，这些数据类似于母本3G4小鼠单抗对人IL-13的结合亲和力。
表10：嵌合和人源化抗体结合食蟹猴IL-13的T100数据
 
抗体 ka kd KD(nM)
嵌合3G4 1.97e6 1.77e-3 0.899
H2L1 3.18e5 1.12e-3 3.5
H3L1 3.65e5 1.04e-3 2.9
这些数据从单个实验产生。
3G4嵌合抗体和人源化单抗H2L1和H3L1以比它们对人IL-13的结合亲和力低的亲和力结合食蟹猴IL-13。
3.73G4C、H2L1和H3L1结合人IL-13的特异性
通过在结合ELISA中分析对人IL-4、人IL-5和人GM-CSF的交叉反应性评估了3G4C、H2L1和H3L1对人IL-13的特异性。
这些方法分别按部分6.7、6.8和6.9中所述进行。参见图15、16和17。发现这些单抗对结合IL-13是特异的，在单抗浓度高达30μg/ml时对人IL-4、人IL-5或人GM-CSF没有交叉反应性。3G4嵌合抗体看起来在30μg/ml时对人IL-5有一定程度的结合，这可能是由吸液误差导致的，因为在类似浓度时对于人源化单抗H2L1和H3L1就没有这种观察结果。
4.采用生物素化的肽对3G4表位定位
进行了一系列的表位定位实验以确定IL-13中哪些氨基酸残基为3G4小鼠单抗结合所需。
4.1 对人和食蟹猴IL-13上3G4小鼠单抗结合表位的粗定位
合成了偏移值为4的生物素化16聚体肽以定位人和食蟹猴IL-13上被小鼠单抗3G4识别的结合表位。将实施例6.3中所述的ELISA方法用于检测固定的生物素化肽对母本小鼠单抗3G4的结合。
按用户要求定制的16聚体肽的细节：88 x 16聚体，偏移值4(由Mimotopes，Australia提供)。
形式：肽25 & 44＝生物素-SGSG-肽-酸
      肽2-24 & 27-43＝生物素-SGSG-肽-酰胺
#   疏水性   分子量     N末端     序列             C末端
2   0.42     2,311.66   生物素-   SEQ.I.D.NO：46   -NH2
3   0.27     2,453.82   生物素-   SEQ.I.D.NO：47   -NH2
4   0.38     2,326.70   生物素-   SEQ.I.D.NO：48   -NH2
5   0.31     2,231.58   生物素-   SEQ.I.D.NO：49   -NH2
6   0.43     2,289.66   生物素-   SEQ.I.D.NO：50   -NH2
7   0.59     2,190.57   生物素-   SEQ.I.D.NO：51   -NH2
8   0.57     2,260.64   生物素-   SEQ.I.D.NO：52   -NH2
9   0.62*    2,255.64   生物素-   SEQ.I.D.NO：53   -NH2
10  0.51     2,197.56   生物素-   SEQ.I.D.NO：54   -NH2
11  0.56     2,144.52   生物素-   SEQ.I.D.NO：55   -NH2
12  0.46     2,090.38   生物素-   SEQ.I.D.NO：56   -NH2
13  0.29     2,219.54   生物素-   SEQ.I.D.NO：57   -NH2
14  0.29     2,180.53   生物素-   SEQ.I.D.NO：58   -NH2
15  0.36     2,318.70   生物素-   SEQ.I.D.NO：59   -NH2
16  0.32     2,303.73   生物素-   SEQ.I.D.NO：60   -NH2
17  0.47     2,209.57   生物素-   SEQ.I.D.NO：61   -NH2
18  0.48     2,257.60   生物素-   SEQ.I.D.NO：62   -NH2
19  0.17     2,273.57   生物素-   SEQ.I.D.NO：63   -NH2
20  0.27     2,300.60   生物素-   SEQ.I.D.NO：64   -NH2
21  0.29     2,383.77   生物素-   SEQ.I.D.NO：65   -NH2
22  0.35     2,401.83   生物素-   SEQ.I.D.NO：66   -NH2
23  0.45     2,407.92   生物素-   SEQ.I.D.NO：67   -NH2
24  0.42     2,541.08   生物素-   SEQ.I.D.NO：68   -NH2
25  0.33     2,513.97   生物素-   SEQ.I.D.NO：69   -OH
27  0.42     2,283.64   生物素-   SEQ.I.D.NO：70   -NH2
28  0.27     2,425.81   生物素-   SEQ.I.D.NO：71   -NH2
29  0.57     2,228.57   生物素-   SEQ.I.D.NO：72   -NH2
30  0.62*    2,223.57   生物素-   SEQ.I.D.NO：73   -NH2
31  0.51     2,165.49   生物素-   SEQ.I.D.NO：74   -NH2
32  0.56     2,112.45   生物素-   SEQ.I.D.NO：75   -NH2
33    0.27    2,207.56    生物素-    SEQ.I.D.NO：76    -NH2
34    0.33    2,345.73    生物素-    SEQ.I.D.NO：77    -NH2
35    0.29    2,330.76    生物素-    SEQ.I.D.NO：78    -NH2
36    0.45    2,236.60    生物素-    SEQ.I.D.NO：79    -NH2
37    0.43    2,276.64    生物素-    SEQ.I.D.NO：80    -NH2
38    0.12    2,292.62    生物素-    SEQ.I.D.NO：81    -NH2
39    0.22    2,319.64    生物素-    SEQ.I.D.NO：82    -NH2
40    0.24    2,402.82    生物素-    SEQ.I.D.NO：83    -NH2
41    0.33    2,387.80    生物素-    SEQ.I.D.NO：84    -NH2
42    0.43    2,393.90    生物素-    SEQ.I.D.NO：85    -NH2
43    0.39    2,527.05    生物素-    SEQ.I.D.NO：86    -NH2
44    0.35    2,471.88    生物素-    SEQ.I.D.NO：87    -OH
(*表示高疏水性值)
该结果表明3G4小鼠单抗结合至如下显示的两种肽(还参见图6)。
肽25：    DLLLHLKKLFREGRFN    (SEQ.I.D.NO：88)
肽44：    DLLVHLKKLFREGQFN    (SEQ.I.D.NO：89)
肽25来自人IL-13。
肽44来自食蟹猴IL-13。
NB：黑体表明人IL-13和食蟹猴IL-13直系同源物之间的残基差异。
4.2 采用生物素化的肽对人和食蟹猴IL-13上3G4小鼠单抗结合表位的 细定位
采用基于围绕肽序列QFVKDLLLHLKKLFREGRFN(SEQ.I.D.NO：90)的一组肽确定人IL-13上用于小鼠单抗3G4的最小结合表位。从这种母本肽序列的N或C末端顺序除去1氨基酸而获得这些肽，以便确定小鼠单抗3G4的精确线性结合表位。进行类似的方法以定位对食蟹猴IL-13的结合。ELISA方法(按实施例6.4所述进行)被用于检测固定的生物素化肽对母本小鼠单抗3G4的结合(图7a和7b)。
这些结果表明母本小鼠单抗3G4结合人IL-13C末端区域的最小氨基酸表位LLHLKKLFREG(SEQ.I.D.NO：91)。但是位置接近以上肽序列(人IL-13序列中)N末端的2氨基酸(D和L)也可能对于结合是重要的，由于当这些残基存在时，结合信号增强了。类似地，位置接近以上肽序列(人IL-13序列中)C末端的3氨基酸(R、F和N)也可能对于结合是重要的，由于当R和F残基存在时结合信号丧失而当N残基存在时结合信号恢复。
对于小鼠单抗3G4结合食蟹猴IL-13成组肽的结合，获得类似的结果。该结果表明，母本小鼠单抗3G4结合食蟹猴IL-13的C末端区中最小氨基酸表位LLVHLKKLFREG(SEQ.I.D.NO：98)。但是，位置接近以上肽序列(食蟹猴IL-13序列中)N末端的1氨基酸(D)也可能对于结合是重要的，因为当该残基存在时结合信号增强。类似地，位置接近以上肽序列(食蟹猴IL-13序列中)C末端的3氨基酸(Q、F、和N)也可能对于结合是重要的，由于当Q和F残基存在时结合信号丧失而N残基存在时结合信号恢复。
4.3 采用生物素化的肽丙氨酸扫描小鼠单抗3G4结合表位
为了鉴定参与人IL-13与小鼠单抗3G4相互作用的关键残基，采纳了采用母本肽序列QFVKDLLLHLKKLFREGRFN(SEQ.I.D.NO：90)的丙氨酸扫描方法。为了进行该分析，获得如表11中所列的肽，其中在母本QFVKDLLLHLKKLFREGRFN(SEQ.I.D.NO：90)表位的LKKLFRE(SEQ.I.D.NO：92)部分中每个氨基酸位置，一个氨基酸被丙氨酸残基顺序取代。
表11
 
SEQ.I.D.NO N末端 肽序列
SEQ.I.D.NO：90 生物素-SGSG QFVKDLLLHLKKLFREGRFN
SEQ.I.D.NO：99 生物素-SGSG QFVKDLLLHAKKLFREGRFN
SEQ.I.D.NO：100 生物素-SGSG QFVKDLLLHLAKLFREGRFN
SEQ.I.D.NO：101 生物素-SGSG QFVKDLLLHLKALFREGRFN
SEQ.I.D.NO：102 生物素-SGSG QFVKDLLLHLKKAFREGRFN
SEQ.I.D.NO：103 生物素-SGSG QFVKDLLLHLKKLAREGRFN
SEQ.I.D.NO：104 生物素-SGSG QFVKDLLLHLKKLFAEGRFN
SEQ.I.D.NO：105 生物素-SGSG QFVKDLLLHLKKLFRAGRFN
ELISA方法(类似于实施例6.4中所述的)被用于检测固定的生物素化肽对母本小鼠单抗3G4的结合(参见图8)。
这些数据证实参与了母本小鼠单抗3G4与人IL-13结合的关键氨基酸残基至少为107位精氨酸(R)、103位赖氨酸(K)和104位赖氨酸(K)。这些编号如之前WO2006/003407中所述。
由于上述分析仅扫描了最小结合表位的LKKLFRE(SEQ ID NO：92)部分，获得了表12中所列的另一套肽(Mimotopes)已将丙氨酸扫描研究扩展到该最小结合表位中的其它氨基酸残基。
表12：
 
SEQ.I.D.NO N末端 肽序列
SEQ.I.D.NO：90 生物素-SGSG QFVKDLLLHLKKLFREGRFN
SEQ.I.D.NO：104 生物素-SGSG QFVKDLLLHLKKLFAEGRFN
SEQ.I.D.NO：106 生物素-SGSG QFVKDLLLALKKLFREGRFN
SEQ.I.D.NO：107 生物素-SGSG QFVKDLLAHLKKLFREGRFN
SEQ.I.D.NO：108 生物素-SGSG QFVKDLALHLKKLFREGRFN
SEQ.I.D.NO：109 生物素-SGSG QFVKDALLHLKKLFREGRFN
SEQ.I.D.NO：110 生物素-SGSG QFVKALLLHLKKLFREGRFN
SEQ.ID.NO：111 生物素-SGSG QFVKDLLLHLKKLFREARFN
SEQ.I.D.NO：112 生物素-SGSG QFVKDLLLHLKKLFREGAFN
SEQ.I.D.NO：113 生物素-SGSG QFVKDLLLHLKKLFREGRAN
SEQ.I.D.NO：114 生物素-SGSG QFVKDLLLHLKKLFREGRFA
同样，将ELISA方法(类似于实施例6.4中所使用的)用于检测固定的生物素化肽对母本小鼠单抗3G4的结合。参见图9(该实验中，肽QFVKDLLLHLKKLFREGRFN(SEQ.I.D.NO：90)为表现最大结合的阳性对照，肽QFVKDLLLHLKKLFAEGRFN(SEQ ID No 104)为表现最小结合的阴性对照)。
这些数据提示，111位残基苯丙氨酸(F)残基对于母本小鼠单抗3G4与人IL-13的相互作用也是重要的。这些编号如之前WO2006/003407中所述
5.人源化抗IL-13单抗在食蟹猴哮喘模型中的有效性
本实施例是预言性的。
猪蛔虫诱导的(A.suum)食蟹猴(Macaca fascicularis)肺支气管狭窄模型是被广泛接受为与人哮喘最类似和相关的非临床模型(Patterson R等Trans.Assoc.Am.Physicians 1980 93：317-325；Patterson R等J.Lab.Clin.Med.1983 101：864-872)。
该模型中，让对A.suum先天肺敏感的动物暴露于雾化的A.suum，以诱导哮喘反应。这种哮喘反应可通过测量呼吸道高反应(AHR)、细胞渗透(如在支气管肺泡灌洗(BAL)液中测定的)和血清IgE水平来表征。实验方法类似于之前由Mauser P等人Am.J.Resp.Crit.Care Med.1995204：467-472和Evanoff H等人Immunologic Investigation 1992 21：39所描述的。
这项研究使用了30只动物，进入初选已证实对特定剂量的A.suum抗原有阳性支气管狭窄反应。对每只动物给予最佳反应剂量的A.suum。A.suum的预定剂量为通过气雾剂吸入产生RL(非阻力)增加至少40％和CDYN(动态顺应性)减少至少35％(对于单次剂量，采用雾化器给予超过15次呼吸)
这项研究以两阶段进行。在阶段1，在给予A.suum抗原(第9和10天，这时通过气溶胶吸入对每只动物给予最佳预订剂量的A.suum)之前(第1天的基线肺功能评估)和之后(第11天)，在应答静脉内(i/v)组胺攻击(组胺剂量足以诱导RL超出基线至少30％的增加(PC30))中评估AHR。
阶段2与阶段1相同，除了动物接受抗体治疗(见下文)，每种抗体作为3次约30mg/kg的剂量在第1、5和9天通过i/v输注给药。
组1(n＝12)：人源化的抗IL-13单抗(30mg/kg)
组2(n＝12)：人源化的抗IL-13单抗(30mg/kg)和Pascolizumab(人源化的抗IL4单抗，30mg/kg)
组3(n＝6)：单独载体的阴性对照治疗
采用Buxco肺力学系统，通过读取应答组胺时的压力和气流值-肺阻力(RL)和动态顺应性(CDYN)-来计算阶段1和阶段2的AHR读数。对阶段1和阶段2(即有或没有抗体治疗)比较了A.suum抗原攻击后相对于基线的最大百分比变化(对于肺阻力(RL)和动态顺应性(CDYN))，这些数据被用于评估AHR表型。
另外，在阶段1和阶段2中在第1和第11天获得BAL样品，以测量细胞渗透，尤其是嗜酸性粒细胞增多。也获得血清样品用于监测IgE水平。
6.1 人或食蟹猴IL-13结合ELISA
这种测定描述了检测抗体与人或食蟹猴IL-13的结合的ELISA。其为夹心ELISA形式。
6.1.1 材料
1.Nunc Immunoplate 1 F96 Maxisorp(Life Technologies，4-39454A)
2.人IL-13(大肠杆菌表达的，来自Cambridge Biosciences，目录编号CH1-013)
3.食蟹猴IL-13(GlaxoSmithkline制备)
4.山羊抗人IL-13单克隆抗体(R+D Systems，目录编号AF-213-NA)
5.抗人IgG-HRP(Sigma，目录编号A-6029)
6.抗小鼠IgG-HRP(Sigma，目录编号A-9309)
7.碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(Sigma；目录编号C-3041)
8.TBST[Tris缓冲盐水(6.06g Tris+8.06g NaCl+0.2g KCl+H20至1L)+0.05％ Tween 20]
9.BSA(Sigma A-7030)
10.OPD(Sigma，目录编号P-9187)
11.硫酸
6.1.2 方法
1.封闭液为3％ BSA+TBST
2.洗涤液为TBST
3.用50ul的溶于碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(Sigma；目录编号C-3041，按制造商的说明配制)的5ug/ml山羊抗人IL-13多克隆抗体(R+DSystems，目录编号AF-213-NA。按制造商说明配制浓度500ug/ml的储备液，以等份保存在-20℃)包被′Nunc Maxisorp’ELISA板，盖上板密封件并在4℃孵育过夜。
4.用100ul of 3％ BSA/TBST封闭，rtp下孵育1小时。
5.在TBST中洗涤3次(每次洗涤每孔至少200ul洗涤溶液)。
6.向每孔(50ul体积中)添加溶于封闭液中的20ng的人IL-13(Cambridge Bioscience，目录编号CH1-013。按照制造商的说明配制100ng/ul储备液，保存在-20℃)或20ng的食蟹猴IL-13，并在室温下孵育1小时。
7.在TBST中洗涤3次。
8.加入溶于封闭液的50ul抗体样品(如果需要，进行滴定以获得终点滴定数据)，rtp下孵育1小时。
9.在TBST中洗涤3次。
10.对于3G4嵌合抗体或人源化抗体，每孔采用在封闭液中1/2000稀释的50ul抗人IgG-HRP(Sigma，目录编号A-6029)检测结合，rtp下进行1小时。对于3G4小鼠多克隆抗体，每孔采用在封闭液中1/1000稀释的50ul抗小鼠IgG-HRP(Sigma，目录编号A-9309)检测结合，rtp下进行1小时。
11.在TBST中洗涤3次。
12.以100ul OPD(Sigma，目录编号P-9187。按制造商的说明制备)显色，以50ul 3M H2SO4终止，在490nm处读取吸收值。显色时间为～12分钟。
6.1A 人IL-13结合ELISA
该测定描述了检测抗体与人IL-13结合的ELISA。其为夹心ELISA形式，仅与实施例6.1中描述的稍有区别。
6.1A.1 材料
1.Costar 96孔EIA板(Corning Costar，目录编号3369)
2.人IL-13(Peprotech，目录编号200-13)
3.山羊抗人IL-13多克隆抗体(R+D Systems，目录编号AF-213-NA)
4.抗人κ轻链-HRP(Sigma，目录编号A7164)
5.碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(Sigma，目录编号C-3041)
6.TBST[Tris缓冲盐水(6.06g Tris+8.06g NaCl+0.2g KCl+H20至1L)+0.05％ Tween 20]
7.BSA(Sigma A-7030)
8.OPD(Sigma，Cat.No.P-9187)
9.硫酸
6.1A.2 方法
1.封闭液为3％BSA+TBST
2.洗涤液为TBST
3.用50ul的溶于碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(Sigma；目录编号C-3041，按制造商的说明配制)的5ug/ml山羊抗人IL-13多克隆抗体(R+DSystems，目录编号AF-213-NA。按制造商说明配制浓度500ug/ml的储备液，以等份保存在-20℃)包被′Costar E1A/RIA’ELISA板，盖上板密封件并在4℃孵育过夜。
4.用100ul of 3％ BSA/TBST封闭，rtp下孵育1小时或最少4℃过夜。
5.在TBST中洗涤2次(每次洗涤每孔至少200ul洗涤溶液)。
6.向每孔(50ul体积中)添加溶于封闭液中的20ng的人IL-13(Cambridge Bioscience，目录编号CH1-013。按照制造商的说明配制100ng/ul储备液，以等份保存在-20℃)，并在室温下孵育1小时。
7.在TBST中洗涤2次。
8.加入溶于封闭液的50ul抗体样品(如果需要，进行滴定以获得终点滴定数据)，rtp下孵育1小时。
9.在TBST中洗涤2次。
10.对于3G4嵌合抗体或人源化抗体，每孔采用在封闭液中1/2000稀释的50ul抗人κ轻链-HRP(Sigma，目录编号A7164)检测结合，rtp下进行1小时。
11.在TBST中洗涤2次。
12.以100ul OPD(Sigma，目录编号P-9187。按制造商的说明制备)显色，以50ul 3M H2SO4终止，在490nm处读取吸收值。
6.1B 天然人IL-13结合ELISA
本测定描述了检测抗体与天然人IL-13结合的ELISA。其为夹心ELISA形式。
6.1B.1 材料
1.Nunc Immunoplate 1 F96 Maxisorp(Life Technologies，4-39454A)
2.天然人IL-13(HDLM-2细胞上清)
3.抗人IL13抗体(Pharmingen，目录编号554570)
4.生物素化的抗人IL13抗体(Pharmingen，目录编号555054)
5.链霉亲和素-HRP(Sigma，目录编号E2886)
6.碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(Sigma；目录编号C-3041)
7.RPMI+20％FBS+2mM谷氨酰胺
8.PBST(PBS+0.05％Tween 20)
9.BSA(Sigma A-7030)
10.OPD(Sigma，目录编号P-9187)
11.硫酸
6.1B.2 方法
1.封闭液为溶于PBST中的1％BSA
2.洗涤溶液为PBST
3.用50ul稀释在碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液中的5ug/ml 3G4嵌合或人源化抗体或2ug/ml抗人IL-13(Pharmingen，目录编号554570)包被‘NuncMaxisorp’ELISA板，盖上板密封件并在4℃孵育过夜。
4.用200ul的1％BSA/PBST封闭，室温下进行1小时。
5.在PBST中洗涤3次。
6.添加50ul的稀释在RPMI+20％FBS+2mM谷氨酰胺中的存在于HDLM2上清样品中的天然IL13，rtp下孵育1小时。
7.在PBST中洗涤3次。
8.每孔添加50ul的稀释在PBST+1％BSA中的生物素化抗人IL131μg/ml(Pharmingen，目录编号555054)，rtp下孵育1小时。
9.在PBST中洗涤3次。
10.向每孔添加50ul的稀释在PBST+1％BSA中的1/1000稀释的链霉亲和素-HRP偶联物。室温下孵育1小时。
11.在TBST中洗涤3次。
12.以每孔100ul OPD(Sigma，目录编号P-9187。按制造商的说明制备)显色，以每孔50ul 3M H2SO4终止，在490nm处读取吸收值。
6.2 IL-13中和测定(TF-1细胞增殖测定)
这是IL-13生物测定，其可被用于测定抗IL-13抗体的中和能力。下文描述的方法采用重组人或食蟹猴IL-13。哺乳动物表达的人IL-13或Q130人IL-13变体也可被用在这种测定中。
6.2.1 材料
1.TF-1细胞系(自制的TF-1细胞系，NB，ATCC版本是可得到的)
2.96孔组织培养板(Invitrogen)
3.人IL-13(Cambridge Bioscience，目录编号CH1-013)
4.CellTiter 96非放射性细胞增殖检测(Promega，目录编号G4000)
6.2.2 方法
1.该方法测量抗人IL-13单抗在TF-1细胞生物测定法中中和重组人或食蟹猴IL-13的生物活性的能力
2.这种测定在无菌条件下于无菌96孔组织培养板(Invitrogen)中进行。所有的试验都重复三次。
3.将10ng/ml人IL-13(Cambridge Bioscience，目录编号CH1-013。根据制造商的说明，采用无菌技术在2级组织培养通风橱中制备浓度100ng/ul储备液；以小等份保存在-20℃)或10ng/ml食蟹猴IL-13(在GSK产生)与不同稀释度的抗人IL-13单抗(从6ug/ml开始以3倍稀释度稀释到0.025ug/ml)在50ul的总体积中在37℃预孵育1小时。还包括存在IL-13但没有抗人IL-3单抗的阳性对照孔。此外，阴性对照孔既没有IL-13也没有抗人IL-13单抗。采用无菌、低蛋白质结合、圆底的96孔板进行该预孵育。(注意，在后期加入细胞时，IL-13和抗人IL-13单抗的浓度会减少一半)。
4.在无菌96孔组织培养板上以2×105细胞/ml接种50ul的TF-1细胞。1小时预孵温后，向细胞中加入IL-13和抗人IL-13单抗样品。在加湿的CO2培养箱中于37℃将最后含有不同抗人IL-13单抗稀释液、重组IL-13和TF-1细胞的100ul测定体积孵育约～70小时。
5.在～66小时，检查孔以证实它们是无菌的，没有发生细菌污染。
6.向每孔添加15ul无菌过滤的MTT底物(目录编号G4000，Promega。按制造商的说明配制)用于最后4小时的孵育。
7.以100ul终止溶液(提高在MTT试剂盒中)终止反应，以便溶出代谢产生的蓝甲臜产物。放置至少2小时，然后以移液器上下抽吸帮助晶体溶解。或者，盖上板密封件并在4℃放置过夜，然后在第二天以移液器上下抽吸(就移液器抽吸来说这更容易)。
8.在96孔板阅读仪中在570nm波长处读取每孔中的溶液吸收值。
9.抗人IL-13单抗中和人或食蟹猴IL-13生物活性的能力被表达为中和指定量的人或食蟹猴IL-13(5ng/ml)的生物活性50％所需的抗人IL-13单抗浓度(＝ND50)。所需的浓度越低，中和能力就越强。
6.2.A IL-13中和测定(TF-1细胞增殖测定)
这是IL-13生物测定，其可被用于测定抗IL-13抗体的中和能力。下文描述的方法采用重组人或食蟹猴IL-13。哺乳动物表达的人IL-13或Q130人IL-13变体也可被用在这种测定中。注意该方法仅与实施例6.2中描述的方法稍有不同。
6.2.A.1 材料
1.TF-1细胞系(自制的TF-1细胞系，NB，ATCC版本是可得到的)
2.96孔组织培养板(Corning costar，目录编号3596)
3.人IL-13(Peprotech，目录编号200-13)
4.在GSK产生的人IL-13(CHO细胞表达的)
5.人IL-13 Q130变体(Peprotech，目录编号200-13A)
6.食蟹猴IL-13(在GSK产生的)
7.多克隆抗体IL-13(R&D systems AF-213-NA)
8.96孔组织培养板(Corning costar，目录编号3790)
9.CellTiter96非放射性细胞增殖检测(Promega，目录编号G4000)
6.2.A.2 方法
1.该方法测量抗人IL-13单抗在TF-1细胞生物测定法中中和重组人或食蟹猴IL-13的生物活性的能力
2.这种测定在无菌条件下于无菌96孔组织培养板(Corning costar，目录编号3596)中进行。所有的试验都重复三次。
3.预孵育10ng/ml的人IL-13(Peprotech，目录编号200-13)、10ng/ml CHO表达的人IL-13(在GSK产生的)、60ng/m1人IL-13Q130变体(Peprotech，目录编号200-13A)或10ng/ml食蟹猴IL-13(在GSK产生)，根据制造商的说明采用无菌技术在2级组织培养通风厨中以储备液浓度制备商品化Ab，以小等份保存在-20℃。与不同稀释度的抗人IL-13单抗(从6ug/ml、2ug/ml或180ug/ml开始以3倍稀释度分别稀释到0.025ug/ml、0.008ug/ml或0.74ug/ml)在50ul的总体积中37℃ 1小时。还包括存在IL-13但没有抗人IL-3单抗的阳性对照孔。此外，阴性对照孔既没有IL-13也没有抗人IL-13单抗。采用无菌、低蛋白质结合、圆底的96孔板进行该预孵育(Corning costar，目录编号3790)。(注意，在后期加入细胞时，IL-13和抗人IL-13单抗的浓度会减少一半)。
4.在无菌96孔组织培养板(Corning costar，目录编号3596)上以2×105细胞/ml接种50ul的TF-1细胞。1小时预孵温后，向细胞中加入IL-13和抗人IL-13单抗样品。在加湿的CO2培养箱中于37℃将最后含有不同抗人IL-13单抗稀释液、重组IL-13和TF-1细胞的100ul测定体积孵育3天。
5.检查孔以证实它们是无菌的，没有发生细菌污染。
6.向每孔添加15ul的MTT底物(目录编号G4000)用于最后4小时的孵育。
7.以100ul终止溶液(提高在MTT试剂盒中)终止反应，以便溶出代谢产生的蓝甲臜产物。放置至少2小时，然后在板振荡器上震荡板～30分钟。或者，盖上板密封件并在4℃放置过夜，然后在板振荡器上震荡板～30分钟。在96孔板阅读仪中在570nm波长处读取每孔中的溶液吸收值。
8.抗人IL-13单抗中和人和食蟹猴IL-13生物活性的能力被表达为中和指定量的人或食蟹猴IL-13生物活性50％所需的抗人IL-13单抗浓度(＝ND50)。所需的浓度越低，中和能力就越强。
6.3.表位粗定位ELISA
本测定描述了检测小鼠单抗3G4对人或食蟹猴IL-13肽的结合的ELISA。
6.3.1 材料
1.Nunc Immunoplate 1 F96 Maxisorp(Life Technologies，4-39454A)
2.ImmunoPure
Figure A200780002297D0081162715QIETU
链霉亲和素(Pierce，目录编号21125)
3.PBST(磷酸盐缓冲盐水+0.05％ Tween 20)
4.BSA(Sigma A-7030)
5.人和食蟹猴IL-13 16聚体肽，偏移值＝4(Mimotopes客户订单)
6.阳性和阴性20聚体肽(通过Mimotopes客户订单提供)
7.3G4小鼠单抗
8.对照Ab(通过Mimotopes客户订单提供)
9.兔抗鼠Ig HRP偶联的(DAKO，目录编号P0260)
10.OPD(Sigma，目录编号P-9187)
11.3M 硫酸
6.3.2 方法
1.封闭液为3％ BSA+PBST。
2.洗涤液为PBST。
3.以100μl的5μg/ml ImmunoPure链霉亲和素(Pierce，目录编号21125，根据制造商的说明配制1mg/ml浓度的储备液，保存在+4℃)包被‘Nunc Maxisorp’ELISA板，将PBST用作稀释剂。37℃孵育过夜让溶液变干。
4.以200μl的3％ BSA/PBST封闭。盖上板密封件并在rtp下孵育1小时。
5.在PBST中洗涤3次(每次洗涤每孔至少200μl洗涤溶液)。
6.双份重复进行，将PBST用作稀释剂，向每孔(除了对照孔)添加100μl的1,000倍稀释的每种肽(按照制造商的说明，溶解在200μl40％乙腈60％水中，然后以10倍稀释等分在相同溶剂中并在-20℃保存)。
7.在对照孔中，双份重复进行，将PBST用作稀释剂，向每孔添加100μl的10倍稀释的对照肽(按照制造商的说明，溶解在1ml40％乙腈60％水中，在-20℃保存)。盖上板密封件并在rtp下于震荡台上孵育1小时。
8.在PBST中洗涤3次(每次洗涤每孔至少200μl洗涤液)。
9.向每孔(除了对照孔)添加100μl溶于PBST中的1.506μg/ml小鼠单抗。
10.仅向对照孔每孔添加4、16、和32倍稀释的对照抗体(按制造商提供的状态使用并保存在-20℃)，以PBST为稀释剂。盖上板密封件并在rtp(室内温度和压力)下于震荡台上孵育1小时。
11.在PBST中洗涤3次(每次洗涤每孔至少200μl洗涤液)。
12.向每孔添加100μl 2,000倍稀释的兔抗小鼠Ig HRP偶联的(DAKO，编号P0260，按提供时的状况使用，保存在+4℃)。盖上板密封件并在rtp下于震荡台上孵育1小时。
13.在PBST中洗涤3次(每次洗涤每孔至少200μl洗涤液)。
14.以100ul OPD(Sigma，目录编号P-9187。按制造商的说明配制)显色，以50ul3M H2SO4终止，在490nm处读取吸收值。显色时间为～10分钟。
6.4.表位细定位ELISA
本测定描述了检测单抗3G4结合人或食蟹猴IL-13肽的ELISA。
6.4.1 材料
1.Nunc Immunoplate 1 F96 Maxisorp(Life Technologies，4-39454A)
2.链霉(Pierce，cat.no.21125)
3.PBST(磷酸盐缓冲盐水+0.05％Tween 20)
4.BSA(Sigma A-7030)
5.人和食蟹猴IL-13部分移除(partial window net)肽(从N和C末端个一次截去1个氨基酸产生的14聚体；Mimotopes客户订单)
6.阳性对照16聚体肽(通过之前的Mimotopes客户订单提供)
7.3G4mAb(自制的)
8.山羊抗小鼠IgG(Fc特异的)HRP偶联抗体(Sigma A-9309)
9.OPD(Sigma，目录编号P-9187)
10.3M硫酸
6.4.2 方法
1.封闭液为3％ BSA+PBST。
2.洗涤液为PBST。
3.用100μl的5μg/ml 
Figure A200780002297D00831
链霉亲和素超纯水溶液(Pierce，目录编号21125，根据制造商的说明配制浓度1mg/ml的储备液，保存在+4℃)包被‘Nunc Maxisorp’ELISA板。37℃孵育过夜。
4.用200μl的PBST中3％ BSA封闭。盖上板密封件并在+4℃孵育过夜。
5.在PBST中洗涤3次(每次洗涤每孔至少200μl洗涤液)。
6.双份重复进行，将3％BSA的PBST溶液用作稀释剂，向每孔添加100μl的1,000倍稀释的每种肽(按照制造商的说明，溶解在200μl40％乙腈60％水中，并在-20℃保存)。盖上板密封件并在室温下在震荡台上孵育1小时。
7.在PBST中洗涤3次(每次洗涤每孔至少200μl洗涤液)。
8.向每孔添加100μl在含有3％ BSA的PBST中稀释的3μg/ml3G4。盖上板密封件并在室温下在震荡台上孵育1小时。
9.在PBST中洗涤3次(每次洗涤每孔至少200μl洗涤液)。
10.向每孔添加100μl的1,000倍稀释的山羊抗小鼠IgG HRP偶联抗体(Sigma A-9309，以提供时的状态使用，保存在+4℃)，将含有3％BSA的PBST用作稀释剂。盖上板密封，并在室温下在震荡台上孵育1小时。
11.在PBST中洗涤3次(每次洗涤每孔至少200μl洗涤液)。
12.以100ul OPD(Sigma，目录编号P-9187。按制造商的说明配制)显色，以50ul 3M H2SO4终止，在490nm处读取吸收值。显色时间为～10分钟。
6.5 人IL-13结合IL-13Rα1链ELISA
本ELISA测定抗体是否可抑制人IL-13结合人IL13Rα1链。
6.5.1 材料
1.Nunc Immunoplate 1 F96 Maxisorp(Life Technologies，4-39454A)
2.人IL13Rα1-Fc(R&D Systems，目录编号146-IR)
3.人IL-13(自制的)
4.生物素化的抗人IL-13(R&D Systems，目录编号BAF213)
5.链霉亲和素-HRP(Sigma，目录编号E2886)
6.碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(Sigma；目录编号C-3041)
7.TBST[Tris缓冲盐水(6.06g Tris+8.06g NaCl+0.2g KCl+H20至1L)+0.05％Tween 20]
8.BSA(Sigma A-7030)
9.OPD(Sigma，目录编号P-9187)
10.硫酸
6.5.2 方法
1.封闭液为3％ BSA+TBST
2.洗涤液为TBST
3.用50ul的碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液中5ng/ul人IL-13Rα1-Fc包被‘Nunc Maxisorp’ELISA板。盖上板密封件并在4℃孵育过夜。
4.用100ul的3％ BSA/TBST封闭，rtp下孵育1小时。
5.在PBST中洗涤3次(每次洗涤每孔至少200μl洗涤液)。
6.在50ul总体积中，在封闭液中预孵育0.4ng/ul人IL-13和抗体样品(滴定)30分钟。将预孵育的样品添加到受体包被的ELISA板并在室温下孵育1小时。
7.在TBST中洗涤3次。
8.每孔采用50ul的稀释为1ug/ml的生物素化的抗人IL-13检测任何结合的人IL-13。在室温下孵育1小时。
9.在TBST中洗涤3次。
10.向每孔添加50ul的1/1000稀释链霉亲和素-HRP偶联物。室温下孵育1小时。
11.在TBST中洗涤3次。
12.以每孔100ul OPD(Sigma，目录编号P-9187。按制造商的说明配制)显色，以每孔50ul3M H2SO4终止，在490nm处读取吸收值。
6.6 人IL-13结合人IL13Rα2链ELISA
本ELISA测定抗体是否可抑制人IL-13结合人IL13Rα2链。
6.6.1 材料
1.Nunc Immunoplate 1 F96 Maxisorp(Life Technologies，4-39454A)
2.人IL 13Rα2-Fc(R&D Systems，目录编号614-IR)
3.人IL-13(在GSK产生的)
4.生物素化的抗人IL-13(R&D Systems，目录编号BAF213)
5.链霉亲和素-HRP
6.碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(Sigma；目录编号C-3041)
7.TBST[Tris缓冲盐水(6.06g Tris+8.06g NaCl+0.2g KCl+H20至1L)+0.05％Tween 20]
8.BSA(Sigma A-7030)
9.OPD(Sigma，目录编号P-9187)
10.硫酸
6.6.2 方法
1.封闭液为3％ BSA+TBST
2.洗涤液为TBST
3.用50ul的碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液中5ng/ul人IL-13Rα2-Fc包被‘Nunc Maxisorp’ELISA板。盖上板密封件并在4℃孵育过夜。
4.用100ul的3％ BSA/TBST封闭，rtp下孵育1小时。
5.在PBST中洗涤3次(每次洗涤每孔至少200μl洗涤液)。
6.在50ul总体积中，在封闭液中预孵育0.01ng/ul人IL-13和抗体样品(滴定)。将预孵育的样品添加到受体包被的ELISA板并在室温下孵育1小时。
7.在TBST中洗涤3次。
8.每孔采用50ul的稀释为0.5ug/ml的生物素化的抗人IL-13检测任何结合的人IL-13。在室温下孵育1小时。
9.在TBST中洗涤3次。
10.向每孔添加50ul的1/1000稀释链霉亲和素-HRP偶联物。室温下孵育1小时。
11.在TBST中洗涤3次。
12.以每孔100ul OPD(Sigma，目录编号P-9187。按制造商的说明配制)显色，以每孔50ul3M H2SO4终止，在490nm处读取吸收值。显色时间为～2分钟。
6.7 人IL-4结合ELISA
本测定描述了检测抗体结合人IL-4的ELISA。其为夹心ELISA形式。
6.7.1 材料
12.Nunc Immunoplate 1 F96 Maxisorp(Life Technologies，4-39454A)
13.人IL-4(R+D Systems，目录编号204IL)
14.山羊抗人IL-4多克隆抗体(R+D Systems，目录编号AF-204-NA)
15.生物素化的大鼠抗人IL-4抗体(R & D systems，目录编号BAF204)
16.抗小鼠IgG-HRP(Dako，目录编号P0260)
17.抗人K轻链-HRP(Sigma A7164)
18.链霉亲和素-HRP(Sigma，目录编号E2886)
19.碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(Sigma，目录编号C-3041)
20.TBST[Tris缓冲盐水(6.06g Tris+8.06g NaCl+0.2g KCl+H20至1L)+0.05％Tween 20]
21.BSA(Sigma A-7030)
22.OPD(Sigma，目录编号P-9187)
23.硫酸
6.7.2 方法
13.封闭液为含3％BSA的TBST
14.洗涤液为TBST
15.用50ul的碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(Sigma，目录编号C-3041，按制造商的说明配制)中5ug/ml的山羊抗人IL-4多克隆抗体(R+DSystems，目录编号AF-204-NA。按制造商的说明配制浓度500ug/ml的储备液，以等份保存在-20℃)包被‘Nunc Maxisorp’ELISA板，盖上板密封件并在4℃孵育过夜。
16.用100ul 3％ BSA/TBST封闭，在室内温度和压力(rtp)下孵育1小时。
17.在TBST中洗涤3次(每次洗涤每孔至少200μl洗涤液)。
18.添加溶于封闭液中的1ng/ml(50ul体积中)人IL-4，在室温下孵育1小时。
19.在TBST中洗涤3次。
20.添加50ul溶于封闭液中的抗体样品(如果需要，进行滴定以获得终点滴定数据)，rtp下孵育1小时。作为结合人IL-4的阳性对照，采用生物素化的抗人IL-4单克隆抗体(滴定)。
21.在TBST中洗涤3次。
22.对于3G4小鼠单克隆抗体，每孔采用50ul的在封闭液中1/2000稀释的抗小鼠IgG-HRP(Dako，目录编号P0260)检测结合，rtp下进行1小时。对于3G4嵌合抗体或人源化的抗体，每孔采用50ul的在封闭液中1/2000稀释的抗人κ轻链-HRP(Sigma，目录编号Sigma A7164)检测结合，rtp下进行1小时。对于阳性对照生物素化的大鼠抗人IL-4单克隆抗体，采用在封闭液中1/1000稀释的链霉亲和素-HRP偶联抗体(Sigma，目录编号E2886)检测，rtp下进行1小时。
23.在TBST中洗涤3次。
24.以100ul OPD(Sigma，目录编号P-9187。按制造商的说明配制)显色，以50ul3M H2SO4终止，在490nm处读取吸收值。
6.8 人IL-5结合ELISA
本测定描述了检测抗体结合人IL-5的ELISA。其为夹心ELISA形式。
6.8.1 材料
24.Nunc Immunoplate 1 F96 Maxisorp(Life Technologies，4-39454A)
25.人IL-5(R+D Systems，目录编号205IL)
26.抗人IL-5多克隆抗体(R+D Systems，目录编号AF-205-NA)
27.抗人IL-5Mepolizumab(自制的，临床级)
28.抗小鼠IgG-HRP(Dako，目录编号P0260)
29.抗人K轻链-HRP(Sigma A7164)
30.碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(Sigma；目录编号C-3041)
31.TBST[Tris缓冲盐水(6.06g Tris+8.06g NaCl+0.2g KCl+H20至1L)+0.05％Tween 20]
32.BSA(Sigma A-7030)
33.OPD(Sigma，目录编号P-9187)
34硫酸
6.8.2 方法
25.封闭液为含3％BSA的TBST
26.洗涤液为TBST
27.用50ul的碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(Sigma，目录编号C-3041，按制造商的说明配制)中5ug/ml的山羊抗人IL-5多克隆抗体(R+DSystems，目录编号AF-205-NA。按制造商的说明配制浓度500ug/ml的储备液，以等份保存在-20℃)包被‘Nunc Maxisorp’ELISA板，盖上板密封件并在4℃孵育过夜。
28.用100ul 3％ BSA/TBST封闭，在室内温度和压力(rtp)下孵育1小时。
29.在TBST中洗涤3次(每次洗涤每孔至少200μl洗涤液)。
30.添加溶于封闭液中的100ng/ml(50ul体积中)人IL-5(R+DSystems，目录编号205IL)，在室温下孵育1小时。
31.在TBST中洗涤3次。
32.添加50ul溶于封闭液中的抗体样品(如果需要，进行滴定以获得终点滴定数据)，rtp下孵育1小时。作为结合人IL-5的阳性对照，采用抗人IL-5 Mepolizumab抗体(滴定)。
33.在TBST中洗涤3次。
34.对于3G4小鼠单克隆抗体，每孔采用50ul的在封闭液中1/2000稀释的抗小鼠IgG-HRP(Dako，目录编号P0260)检测结合，rtp下进行1小时。对于3G4嵌合抗体或人源化的抗体以及抗IL-5Mepolizumab，每孔采用50ul的在封闭液中1/2000稀释的抗人K轻链-HRP(Sigma，目录编号Sigma A7164)检测结合，rtp下进行1小时。
35.在TBST中洗涤3次。
36.以100ul OPD(Sigma，目录编号P-9187。按制造商的说明配制)显色，以50ul3M H2SO4终止，在490nm处读取吸收值。
6.9 人GM-CSF结合ELISA
本测定描述检测抗体结合人GM-CSF的ELISA。其为直接结合ELISA形式。
6.9.1 材料
35.Nunc Immunoplate 1 F96 Maxisorp(Life Technologies，4-39454A)
36.人GM-CSF(临床级，自制的)
37.抗人GM-CSF单克隆抗体(R+D Systems，目录编号MAB215)
38.抗小鼠IgG-HRP(Dako，目录编号P0260)
39.抗人κ轻链-HRP(Sigma A7164)
40.碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(Sigma，目录编号C-3041)
41.PBST(PBS+0.05％ Tween 20)
42.BSA(Sigma A-7030)
43.OPD(Sigma，目录编号P-9187)
44.硫酸
6.9.2 方法
37.封闭液为含3％BSA的TBST
38.洗涤液为TBST
39.用50ul的在PBS中稀释的2ug/ml人GM-CSF包被‘NuncMaxisorp’ELISA板，盖上板密封件并在4℃孵育过夜。
40.用200ul 3％ BSA/TBST封闭，在室内温度和压力(rtp)下孵育1小时。
41.在TBST中洗涤3次。
42.添加50ul溶于封闭液中的抗体样品(进行滴定以获得终点滴定数据)，rtp下孵育1小时。作为结合人IL-GM-CSF的阳性对照，采用抗人GM-CSF(R&D Systems，目录编号MAB215)抗体(滴定)。
43.在TBST中洗涤3次。
44.对于抗GM-CSF小鼠单克隆抗体，每孔采用50ul的在封闭液中1/2000稀释的抗小鼠IgG-HRP(Dako，目录编号P0260)检测结合，rtp下进行1小时。对于3G4嵌合抗体或人源化的抗体，每孔采用50ul的在封闭液中1/2000稀释的抗人κ轻链-HRP(Sigma，目录编号SigmaA7164)检测结合，rtp下进行1小时。
45.在TBST中洗涤3次。
46.以100ul OPD(Sigma，目录编号P-9187。按制造商的说明配制)显色，以50ul 3M H2SO4终止，在490nm处读取吸收值。
表13：
 
蛋白或多核苷酸说明 序列编号(SEQ.I.D.NO：)
3G4，CDRH1 1
3G4，CDRH2 2
3G4，CDRH3 3
3G4，CDRL1 4
3G4，CDRL2 5
3G4，CDRL3 6
3G4，VH(鼠) 7
3G4，VL(鼠) 8
hIL-13 9
编码hIL-13的多核苷酸 10
3G4，VH，人源化构建体H1 11
3G4，VH，人源化构建体H2 12
3G4，VH，人源化构建体H3 13
3G4，VH，人源化构建体H4 14
3G4，VL，人源化构建体L1 15
3G4，VL，人源化构建体L2 16
3G4，VL，人源化构建体L3 17
3G4，heavy chain，人源化构建体H1 18
3G4，heavy chain人源化构建体H2 19
3G4，heavy chain人源化构建体H3 20
3G4，heavy chain人源化构建体H4 21
3G4，light chain人源化构建体L1 22
3G4，light chain人源化构建体L2 23
3G4，light chain人源化构建体L3 24
编码3G4 VH(鼠)的多核苷酸(SEQ.I.D.NO：7) 25
编码3G4 VL(鼠)的多核苷酸(SEQ.I.D.NO：8) 26
编码3G4 VH人源化构建体H1的多核苷酸(SEQ.I.D.NO：11) 27
 
编码3G4 VH人源化构建体H2的多核苷酸(SEQ.I.D.NO：12) 28
编码3G4 VH人源化构建体H3的多核苷酸(SEQ.I.D.NO：13) 29
编码3G4 VH人源化构建体H4的多核苷酸(SEQ.I.D.NO：14) 30
编码3G4 VL人源化构建体L1的多核苷酸(SEQ.I.D.NO：15) 31
编码3G4 VL人源化构建体L2的多核苷酸(SEQ.I.D.NO：16) 32
编码3G4 VL人源化构建体L3的多核苷酸(SEQ.I.D.NO：17) 33
编码3G4重链人源化构建体H1的多核苷酸(SEQ.I.D.NO：18) 34
编码3G4重链人源化构建体H2的多核苷酸(SEQ.I.D.NO：19) 35
编码3G4重链人源化构建体H3的多核苷酸(SEQ.I.D.NO：20) 36
编码3G4重链人源化构建体H4的多核苷酸(SEQ.ID.NO：21) 37
编码3G4轻链人源化构建体L1的多核苷酸(SEQ.I.D.NO：22) 38
编码3G4轻链人源化构建体L2的多核苷酸(SEQ.I.D.NO：23) 39
编码3G4轻链人源化构建体L3的多核苷酸(SEQ.I.D.NO：24) 40
食蟹猴IL-13 41
食蟹猴IL-13(多核苷酸) 42
人信号序列 43
用于3G4VH的人受体框架系列 44
用于3G4VL的人受体框架系列 45
 
另一编码3G4VH人源化构建体H2的多核苷酸(SEQ.I.D.NO：12) 93
另一编码3G4VL人源化构建体L1的多核苷酸(SEQ.I.D.NO：15) 94
另一编码重链人源化构建体H2的多核苷酸(SEQ.I.D.NO：19) 95
另一编码重链人源化构建体H3的多核苷酸(SEQ.I.D.NO：20) 96
另一编码人源化构建体L1的多核苷酸(SEQ.I.D.NO：22) 97
注意：SEQ.ID编号从11至24和从27至40(包含)中的蛋白或DNA多核苷酸序列还包括信号序列。
SEQ.I.D.NO 1
DYEIH
SEQ.I.D.NO 2
AIDPETGGTAYNQKFKG
SEQ.I.D.NO 3
ILLYYYPMDY
SEQ.I.D.NO 4
RASQNISDYLH
SEQ.I.D.NO 5
YASQSIS
SEQ.I.D.NO 6
QNGHSFPLT
SEQ.I.D.NO 7
QVQLQQSGADLVRPGASVTLSCKASGYTFIDYEIHWMKQTPVHGLEWIGAIDPETGGTAYNQ
KFKGKAILTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRILLYYYPMDYWGQGTSVTVSS
SEQ.I.D.NO 8
DIVMTQSPATLSVTPGDRVSLSCRASQNISDYLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGIPSRF
SGSGSGSDFTLSINSVEPEDVGVYYCQNGHSFPLTLGAGTKLELK
SEQ.I.D.NO：9
GPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKT
QRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFN
SEQ.I.D.NO：10
GGCCCTGTGCCTCCCTCTACAGCCCTCAGGGAGCTCATTGAGGAGCTGGTCAACATCACCCA
GAACCAGAAGGCTCCGCTCTGCAATGGCAGCATGGTATGGAGCATCAACCTGACAGCTGGCA
TGTACTGTGCAGCCCTGGAATCCCTGATCAACGTGTCAGGCTGCAGTGCCATCGAGAAGACC
CAGAGGATGCTGAGCGGATTCTGCCCGCACAAGGTCTCAGCTGGGCAGTTTTCCAGCTTGCA
TGTCCGAGACACCAAAATCGAGGTGGCCCAGTTTGTAAAGGACCTGCTCTTACATTTAAAGA
AACTTTTTCGCGAGGGACGGTTCAACTGA
SEQ.I.D.NO 11
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFIDYEIHWVRQAPGQ
GLEWMGAIDPETGGTAYNQKFKGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARILLYYYP
MDYWGQGTLVTVSS
SEQ.I.D.NO 12
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFIDYEIHWVRQAPGQ
GLEWMGAIDPETGGTAYNQKFKGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTRILLYYYP
MDYWGQGTLVTVSS
SEQ.I.D.NO 13
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGADVKKPGASVKVSCKASGYTFIDYEIHWVRQAPGQ
GLEWMGAIDPETGGTAYNQKFKGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTRILLYYYP
MDYWGQGTLVTVSS
SEQ.I.D.NO 14
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGADVKKPGASVKVSCKASGYTFIDYEIHWVRQAPGQ
GLEWMGAIDPETGGTAYNQKFKGRATLTADKSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTRILLYYYP
MDYWGQGTLVTVSS
SEQ.I.D.NO 15
MGWSCIILFLVATATGVHSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQNISDYLHWYQQKPGQA
PRLLIYYASQSISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQNGHSFPLTFGGGTKVE
IK
SEQ.I.D.NO 16
MGWSCIILFLVATATGVHSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQNISDYLHWYQQKPGQA
PRLLIYYASQSISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQNGHSFPLTLGGGTKVE
IK
SEQ.I.D.NO 17
MGWSCIILFLVATATGVHSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQNISDYLHWYQQKPGQA
PRLLIYYASQSISGIPARFSGSGSGTDFTLTINSLEPEDFAVYYCQNGHSFPLTLGGGTKVE
IK
SEQ.I.D.NO 18
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFIDYEIHWVRQAPGQ
GLEWMGAIDPETGGTAYNQKFKGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARILLYYYP
MDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS
GVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCP
PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT
KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL
PPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD
KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ.I.D.NO 19
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFIDYEIHWVRQAPGQ
GLEWMGAIDPETGGTAYNQKFKGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTRILLYYYP
MDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS
GVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCP
PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT
KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL
PPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD
KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ.I.D.NO 20
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGADVKKPGASVKVSCKASGYTFIDYEIHWVRQAPGQ
GLEWMGAIDPETGGTAYNQKFKGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTRILLYYYP
MDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS
GVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCP
PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT
KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL
PPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD
KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ.I.D.NO 21
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGADVKKPGASVKVSCKASGYTFIDYEIHWVRQAPGQ
GLEWMGAIDPETGGTAYNQKFKGRATLTADKSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTRILLYYYP
MDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS
GVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCP
PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT
KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL
PPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD
KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ.I.D.NO 22
MGWSCIILFLVATATGVHSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQNISDYLHWYQQKPGQA
PRLLIYYASQSISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQNGHSFPLTFGGGTKVE
IKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD
SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ.I.D.NO 23
MGWSCIILFLVATATGVHSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQNISDYLHWYQQKPGQA
PRLLIYYASQSISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQNGHSFPLTLGGGTKVE
IKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD
SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ.I.D.NO 24
MGWSCIILFLVATATGVHSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQNISDYLHWYQQKPGQA
PRLLIYYASQSISGIPARFSGSGSGTDFTLTINSLEPEDFAVYYCQNGHSFPLTLGGGTKVE
IKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD
SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ.I.D.NO 25
CAGGTTCAACTGCAGCAGTCTGGGGCTGACCTGGTGAGGCCTGGGGCTTCAGTGACGCTGTC
CTGCAAGGCTTCGGGCTACACATTTATTGACTATGAAATACACTGGATGAAGCAGACACCTG
TGCATGGCCTGGAATGGATTGGAGCTATTGATCCTGAAACTGGTGGTACAGCCTATAATCAG
AAGTTCAAGGGCAAGGCCATTCTGACTGCAGACAAATCCTCCAGTACAGCCTACATGGAGCT
CCGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCCGTCTATTACTGTACAAGAATTCTCTTATATTACT
ATCCTATGGACTACTGGGGTCAAGGGACCTCAGTCACAGTCTCCTCA
SEQ.I.D.NO 26
GACATTGTGATGACTCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGACTCCAGGAGATAGAGTCTCTCT
TTCCTGCAGGGCCAGCCAGAATATTAGCGACTACTTACACTGGTATCAACAAAAATCACATG
AGTCTCCAAGGCTTCTCATCAAATATGCTTCCCAATCCATCTCTGGGATCCCCTCCAGGTTC
AGTGGCAGTGGATCAGGGTCAGATTTCACTCTCAGTATCAACAGTGTGGAACCTGAAGATGT
TGGAGTGTATTACTGTCAAAATGGTCACAGCTTTCCGCTCACGCTCGGTGCTGGGACCAAGC
TGGAGCTGAAA
SEQ.I.D.NO 27
ATGGGCTGGAGCTGCATCATCCTGTTCCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCCAGGT
GCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGGTGAGCTGCA
AGGCCAGCGGCTACACCTTCATCGACTACGAGATCCACTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGCCAG
GGCCTGGAGTGGATGGGCGCCATCGACCCCGAGACCGGCGGCACCGCCTACAACCAGAAGTT
CAAGGGCCGCGTGACCATGACCACCGACACCAGCACCAGCACCGCCTACATGGAGCTGCGCA
GCCTGCGCAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCATCCTGCTGTACTACTACCCC
ATGGACTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTCACAGTCTCCTCA
SEQ.I.D.NO 28
ATGGGCTGGAGCTGCATCATCCTGTTCCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCCAGGT
GCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGGTGAGCTGCA
AGGCCAGCGGCTACACCTTCATCGACTACGAGATCCACTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGCCAG
GGCCTGGAGTGGATGGGCGCCATCGACCCCGAGACCGGCGGCACCGCCTACAACCAGAAGTT
CAAGGGCCGCGTGACCATGACCACCGACACCAGCACCAGCACCGCCTACATGGAGCTGCGCA
GCCTGCGCAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCACCCGCATCCTGCTGTACTACTACCCC
ATGGACTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTCACAGTCTCCTCA
SEQ.I.D.NO 29
ATGGGCTGGAGCTGCATCATCCTGTTCCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCCAGGT
GCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGACGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGGTGAGCTGCA
AGGCCAGCGGCTACACCTTCATCGACTACGAGATCCACTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGCCAG
GGCCTGGAGTGGATGGGCGCCATCGACCCCGAGACCGGCGGCACCGCCTACAACCAGAAGTT
CAAGGGCCGCGTGACCATGACCACCGACACCAGCACCAGCACCGCCTACATGGAGCTGCGCA
GCCTGCGCAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCACCCGCATCCTGCTGTACTACTACCCC
ATGGACTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTCACAGTCTCCTCA
SEQ.I.D.NO 30
ATGGGCTGGAGCTGCATCATCCTGTTCCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCCAGGT
GCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGACGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGGTGAGCTGCA
AGGCCAGCGGCTACACCTTCATCGACTACGAGATCCACTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGCCAG
GGCCTGGAGTGGATGGGCGCCATCGACCCCGAGACCGGCGGCACCGCCTACAACCAGAAGTT
CAAGGGCCGCGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAGCTGCGCA
GCCTGCGCAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCACCCGCATCCTGCTGTACTACTACCCC
ATGGACTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTCACAGTCTCCTCA
SEQ.I.D.NO 31
ATGGGCTGGAGCTGCATCATCCTGTTCCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCGAGAT
CGTGCTGACCCAGAGCCCCGCCACCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGAGCGCGCCACCCTGAGCT
GCCGCGCCAGCCAGAACATCAGCGACTACCTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCC
CCCCGCCTGCTGATCTACTACGCCAGCCAGAGCATCAGCGGCATCCCCGCCCGCTTCAGCGG
CAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGGAGCCCGAGGACTTCGCCG
TGTACTACTGCCAGAACGGCCACAGCTTCCCCCTGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAG
ATCAAG
SEQ.I.D.NO 32
ATGGGCTGGAGCTGCATCATCCTGTTCCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCGAGAT
CGTGCTGACCCAGAGCCCCGCCACCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGAGCGCGCCACCCTGAGCT
GCCGCGCCAGCCAGAACATCAGCGACTACCTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCC
CCCCGCCTGCTGATCTACTACGCCAGCCAGAGCATCAGCGGCATCCCCGCCCGCTTCAGCGG
CAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGGAGCCCGAGGACTTCGCCG
TGTACTACTGCCAGAACGGCCACAGCTTCCCCCTGACCCTGGGCGGCGGCACCAAGGTGGAG
ATCAAG
SEQ.I.D.NO 33
ATGGGCTGGAGCTGCATCATCCTGTTCCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCGAGAT
CGTGCTGACCCAGAGCCCCGCCACCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGAGCGCGCCACCCTGAGCT
GCCGCGCCAGCCAGAACATCAGCGACTACCTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCC
CCCCGCCTGCTGATCTACTACGCCAGCCAGAGCATCAGCGGCATCCCCGCCCGCTTCAGCGG
CAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAACAGCCTGGAGCCCGAGGACTTCGCCG
TGTACTACTGCCAGAACGGCCACAGCTTCCCCCTGACCCTGGGCGGCGGCACCAAGGTGGAG
ATCAAG
SEQ.I.D.NO 34
ATGGGCTGGAGCTGCATCATCCTGTTCCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCCAGGT
GCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGGTGAGCTGCA
AGGCCAGCGGCTACACCTTCATCGACTACGAGATCCACTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGCCAG
GGCCTGGAGTGGATGGGCGCCATCGACCCCGAGACCGGCGGCACCGCCTACAACCAGAAGTT
CAAGGGCCGCGTGACCATGACCACCGACACCAGCACCAGCACCGCCTACATGGAGCTGCGCA
GCCTGCGCAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCATCCTGCTGTACTACTACCCC
ATGGACTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATC
GGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCC
TGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGC
GGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGT
GACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCA
GCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCA
CCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAA
GGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACG
AAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACA
AAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCA
CCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCC
CCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTG
CCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTT
CTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGA
CCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGAC
AAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAA
CCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
SEQ.I.D.NO 35
ATGGGCTGGAGCTGCATCATCCTGTTCCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCCAGGT
GCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGGTGAGCTGCA
AGGCCAGCGGCTACACCTTCATCGACTACGAGATCCACTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGCCAG
GGCCTGGAGTGGATGGGCGCCATCGACCCCGAGACCGGCGGCACCGCCTACAACCAGAAGTT
CAAGGGCCGCGTGACCATGACCACCGACACCAGCACCAGCACCGCCTACATGGAGCTGCGCA
GCCTGCGCAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCACCCGCATCCTGCTGTACTACTACCCC
ATGGACTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATC
GGTCTTCCCCCTCGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCC
TGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGC
GGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGT
GACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCA
GCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCA
CCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAA
GGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACG
AAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACA
AAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCA
CCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCC
CCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTG
CCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTT
CTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGA
CCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGAC
AAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAA
CCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
SEQ.I.D.NO 36
ATGGGCTGGAGCTGCATCATCCTGTTCCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCCAGGT
GCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGACGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGGTGAGCTGCA
AGGCCAGCGGCTACACCTTCATCGACTACGAGATCCACTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGCCAG
GGCCTGGAGTGGATGGGCGCCATCGACCCCGAGACCGGCGGCACCGCCTACAACCAGAAGTT
CAAGGGCCGCGTGACCATGACCACCGACACCAGCACCAGCACCGCCTACATGGAGCTGCGCA
GCCTGCGCAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCACCCGCATCCTGCTGTACTACTACCCC
ATGGACTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATC
GGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCC
TGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGC
GGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGT
GACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCA
GCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCA
CCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAA
GGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACG
AAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACA
AAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCA
CCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCC
CCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTG
CCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTT
CTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGACAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGA
CCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGAC
AAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAA
CCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
SEQ.I.D.NO 37
ATGGGCTGGAGCTGCATCATCCTGTTCCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCCAGGT
GCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGACGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGGTGAGCTGCA
AGGCCAGCGGCTACACCTTCATCGACTACGAGATCCACTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGCCAG
GGCCTGGAGTGGATGGGCGCCATCGACCCCGAGACCGGCGGCACCGCCTACAACCAGAAGTT
CAAGGGCCGCGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAGCTGCGCA
GCCTGCGCAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCACCCGCATCCTGCTGTACTACTACCCC
ATGGACTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATC
GGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCC
TGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGC
GGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGT
GACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCA
GCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCA
CCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAA
GGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACG
AAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACA
AAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCA
CCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCC
CCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTG
CCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTT
CTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGA
CCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGAC
AAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAA
CCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
SEQ.I.D.NO 38
ATGGGCTGGAGCTGCATCATCCTGTTCCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCGAGAT
CGTGCTGACCCAGAGCCCCGCCACCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGAGCGCGCCACCCTGAGCT
GCCGCGCCAGCCAGAACATCAGCGACTACCTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCC
CCCCGCCTGCTGATCTACTACGCCAGCCAGAGCATCAGCGGCATCCCCGCCCGCTTCAGCGG
CAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGGAGCCCGAGGACTTCGCCG
TGTACTACTGCCAGAACGGCCACAGCTTCCCCCTGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAG
ATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAA
ATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTAC
AGTGGAAGGTGGACAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGAC
AGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAA
ACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCT
TCAACAGGGGAGAGTGTTAG
SEQ.I.D.NO 39
ATGGGCTGGAGCTGCATCATCCTGTTCCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCGAGAT
CGTGCTGACCCAGAGCCCCGCCACCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGAGCGCGCCACCCTGAGCT
GCCGCGCCAGCCAGAACATCAGCGACTACCTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCC
CCCCGCCTGCTGATCTACTACGCCAGCCAGAGCATCAGCGGCATCCCCGCCCGCTTCAGCGG
CAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGGAGCCCGAGGACTTCGCCG
TGTACTACTGCCAGAACGGCCACAGCTTCCCCCTGACCCTGGGCGGCGGCACCAAGGTGGAG
ATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAA
ATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTAC
AGTGGAAGGTGGACAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGAC
AGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAA
ACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCT
TCAACAGGGGAGAGTGTTAG
SEQ.I.D.NO 40
ATGGGCTGGAGCTGCATCATCCTGTTCCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCGAGAT
CGTGCTGACCCAGAGCCCCGCCACCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGAGCGCGCCACCCTGAGCT
GCCGCGCCAGCCAGAACATCAGCGACTACCTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCC
CCCCGCCTGCTGATCTACTACGCCAGCCAGAGCATCAGCGGCATCCCCGCCCGCTTCAGCGG
CAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAACAGCCTGGAGCCCGAGGACTTCGCCG
TGTACTACTGCCAGAACGGCCACAGCTTCCCCCTGACCCTGGGCGGCGGCACCAAGGTGGAG
ATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAA
ATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTAC
AGTGGAAGGTGGACAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGAC
AGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAA
ACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCT
TCAACAGGGGAGAGTGTTAG
SEQ.I.D.NO：41
SPVPPSTALKELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGVYCAALESLINVSGCSAIEKT
QRMLNGFCPHKVSAGQFSSLRVRDTKIEVAQFVKDLLVHLKKLFREGQFN
SEQ.I.D.NO：42
AGCCCTGTGCCTCCCTCTACAGCCCTCAAGGAGCTCATTGAGGAGCTGGTCAACATCACCCA
GAACCAGAAGGCCCCGCTCTGCAATGGCAGCATGGTGTGGAGCATCAACCTGACAGCTGGCG
TGTACTGTGCAGCCCTGGAATCCCTGATCAACGTGTCAGGCTGCAGTGCCATCGAGAAGACC
CAGAGGATGCTGAACGGATTCTGCCCGCACAAGGTCTCAGCTGGGCAGTTTTCCAGCTTGCG
TGTCCGAGACACCAAAATCGAGGTGGCCCAGTTTGTAAAGGACCTGCTCGTACATTTAAAGA
AACTTTTTCGCGAGGGACAGTTCAACTGA
SEQ.I.D.NO：43
MGWSCIILFLVATATGVHS
SEQ.I.D.NO：44
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGNTNYAQ
KLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARXXXXXXXXXXWGQGTLVTVSS
SEQ.I.D.NO：45
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARF
SGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCXXXXXXXXXFGGGTKVEIK
SEQ.I.D.NO：46
SGSGPSTALRELIEELVNIT
SEQ.I.D.NO：47
SGSGLRELIEELVNITQNQK
SEQ.I.D.NO：48
SGSGIEELVNITQNQKAPLC
SEQ.I.D.NO：49
SGSGVNITQNQKAPLCNGSM
SEQ.I.D.NO：50
SGSGQNQKAPLCNGSMVWSI
SEQ.I.D.NO：51
SGSGAPLCNGSMVWSINLTA
SEQ.I.D.NO：52
SGSGNGSMVWSINLTAGMYC
SEQ.I.D.NO：53
SGSGVWSINLTAGMYCAALE
SEQ.I.D.NO：54
SGSGNLTAGMYCAALESLIN
SEQ.I.D.NO：55
SGSGGMYCAALESLINVSGC
SEQ.I.D.NO：56
SGSGAALESLINVSGCSAIE
SEQ.I.D.NO：57
SGSGSLINVSGCSAIEKTQR
SEQ.I.D.NO：58
SGSGVSGCSAIEKTQRMLSG
SEQ.I.D.NO：59
SGSGSAIEKTQRMLSGFCPH
SEQ.I.D.NO：60
SGSGKTQRMLSGFCPHKVSA
SEQ.I.D.NO：61
SGSGMLSGFCPHKVSAGQFS
SEQ.I.D.NO：62
SGSGFCPHKVSAGQFSSLHV
SEQ.I.D.NO：63
SGSGKVSAGQFSSLHVRDTK
SEQ.I.D.NO：64
SGSGGQFSSLHVRDTKIEVA
SEQ.I.D.NO：65
SGSGSLHVRDTKIEVAQFVK
SEQ.I.D.NO：66
SGSGRDTKIEVAQFVKDLLL
SEQ.I.D.NO：67
SGSGIEVAQFVKDLLLHLKK
SEQ.I.D.NO：68
SGSGQFVKDLLLHLKKLFRE
SEQ.I.D.NO：69
SGSGDLLLHLKKLFREGRFN
SEQ.I.D.NO：70
SGSGPSTALKELIEELVNIT
SEQ.I.D.NO：71
SGSGLKELIEELVNITQNQK
SEQ.I.D.NO：72
SGSGNGSMVWSINLTAGVYC
SEQ.I.D.NO：73
SGSGVWSINLTAGVYCAALE
SEQ.I.D.NO：74
SGSGNLTAGVYCAALESLIN
SEQ.I.D.NO：75
SGSGGVYCAALESLINVSGC
SEQ.I.D.NO：76
SGSGVSGCSAIEKTQRMLNG
SEQ.I.D.NO：77
SGSGSAIEKTQRMLNGFCPH
SEQ.I.D.NO：78
SGSGKTQRMLNGFCPHKVSA
SEQ.I.D.NO：79
SGSGMLNGFCPHKVSAGQFS
SEQ.I.D.NO：80
SGSGFCPHKVSAGQFSSLRV
SEQ.I.D.NO：81
SGSGKVSAGQFSSLRVRDTK
SEQ.I.D.NO：82
SGSGGQFSSLRVRDTKIEVA
SEQ.I.D.NO:83
SGSGSLRVRDTKIEVAQFVK
SEQ.I.D.NO：84
SGSGRDTKIEVAQFVKDLLV
SEQ.I.D.NO：85
SGSGIEVAQFVKDLLVHLKK
SEQ.I.D.NO：86
SGSGQFVKDLLVHLKKLFRE
SEQ.I.D.NO：87
SGSGDLLVHLKKLFREGQFN
SEQ.I.D.NO：88
DLLLHLKKLFREGRFN
SEQ.I.D.NO：89
DLLVHLKKLFREGQFN
SEQ.I.D.NO：90
QFVKDLLLHLKKLFREGRFN
SEQ.I.D.NO：91
LLHLKKLFREG
SEQ.I.D.NO：92
LKKLFRE
SEQ ID No.93
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCCAGCGTCAAGGTG
TCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCATCGACTACGAGATCCACTGGGTGCGGCAGGCT
CCTGGACAGGGCCTGGAATGGATGGGCGCCATCGACCCCGAGACAGGCGGCACCGCCTAC
AACCAGAAGTTCAAGGGCCGGGTCACCATGACCACCGACACCAGCACCAGCACCGCCTAT
ATGGAACTGCGGAGCCTGAGAAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCACCCGGATCCTG
CTGTACTACTACCCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTCACCGTGAGCAGC
SEQ ID No.94
GAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGCCACCCTGAGCCTGAGCCCTGGCGAGCGGGCCACC
CTGTCCTGCCGGGCCAGCCAGAACATCAGCGACTACCTGCACTGGTATCAGCAGAAGCCC
GGCCAGGCCCCCAGGCTGCTGATCTACTACGCCAGCCAGTCCATCTCCGGCATCCCCGCC
AGGTTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCTCTCTGGAACCC
GAGGACTTCGCCGTGTATTATTGCCAGAACGGCCACAGCTTCCCCCTGACCTTTGGCGGC
GGAACAAAGGTGGAGATCAAG
SEQ ID No.95
ATGGGATGGAGCTGCATCATCCTCTTCCTGGTGGCCACGGCTACCGGCGTGCATAGCCAGGT
GCAGCTCGTCCAGTCTGGGGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGAGCTTCTGTGAAGGTGTCCTGCA
AGGCCAGCGGCTATACCTTCATCGACTACGAGATCCATTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGGCAG
GGCCTGGAGTGGATGGGCGCCATCGACCCAGAGACCGGAGGCACGGCGTACAACCAGAAGTT
CAAGGGACGGGTCACCATGACAACCGATACCAGCACCTCCACCGCTTACATGGAGCTGCGCA
GCCTGAGAAGCGACGACACCGCGGTGTACTACTGTACGCGCATCCTGCTCTACTACTACCCC
ATGGATTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATC
GGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCC
TGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGC
GGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGT
GACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCA
GCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCA
CCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAA
GGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACG
AAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACA
AAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCA
CCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCC
CCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTG
CCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTT
CTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGA
CCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGAC
AAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAA
CCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
SEQ ID No.96
ATGGGATGGAGCTGCATCATCCTCTTCCTGGTGGCCACGGCTACCGGCGTGCATAGCCAGGT
GCAGCTCGTCCAGTCTGGGGCCGACGTGAAGAAGCCCGGAGCTTCTGTGAAGGTGTCCTGCA
AGGCCAGCGGCTATACCTTCATCGACTACGAGATCCATTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGGCAG
GGCCTGGAGTGGATGGGCGCCATCGACCCAGAGACCGGAGGCACGGCGTACAACCAGAAGTT
CAAGGGACGGGTCACCATGACAACCGATACCAGCACCTCCACCGCTTACATGGAGCTGCGCA
GCCTGAGAAGCGACGACACCGCGGTGTACTACTGTACGCGCATCCTGCTCTACTACTACCCC
ATGGATTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATC
GGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCC
TGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGC
GGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGT
GACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCA
GCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCA
CCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAA
GGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACG
AAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACA
AAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCA
CCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCC
CCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTG
CCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTT
CTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGA
CCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGAC
AAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAA
CCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
SEQ ID No.97
ATGGGATGGTCTTGTATCATCCTGTTCCTGGTGGCGACCGCCACCGGCGTGCACTCCGAGAT
CGTGCTGACCCAGAGTCCAGCCACCCTCAGCCTGAGCCCTGGGGAACGCGCCACCCTGTCCT
GCCGGGCGAGTCAGAACATCTCCGACTACCTGCATTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCC
CCTCGCCTGCTGATCTACTACGCCTCCCAGAGCATCAGCGGAATCCCCGCCCGGTTCTCCGG
AAGTGGGTCCGGAACCGACTTTACCCTGACCATCAGCTCTCTCGAGCCAGAGGACTTCGCGG
TGTACTACTGCCAGAACGGGCATAGTTTCCCACTGACCTTCGGAGGGGGCACAAAGGTGGAG
ATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAA
ATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTAC
AGTGGAAGGTGGACAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGAC
AGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAA
ACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCT
TCAACAGGGGAGAGTGTTAG
SEQ ID NO：98
LLVHLKKLFREG

Claims (46)

1.一种抗体或其抗原结合片段，其特异结合hIL-13并包含SEQ.I.D.NO：3中所定义的CDRH3或其变体，其中所述CDRH3内一个或两个氨基酸残基不同于SEQ ID NO：3中对应位置中的氨基酸残基。
2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段中和人IL-13。
3.如权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段调节人IL-13与其受体的结合。
4.如权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDRH3包含SEQ ID NO：3的序列。
5.如权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段还包含一个或多个以下序列CDRH2：SEQ.I.D.NO：2，CDRH1：SEQ.I.D.NO：1，CDRL1：SEQ.I.D.NO：4，CDRL2：SEQ.I.D.NO：5和CDRL3：SEQ.I.D.NO：6，或其变体，其中所述CDR内一个或两个氨基酸残基不同于所述SEQ ID NO内对应位置中的氨基酸残基。
6.如前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含以下CDR：
CDRH1：SEQ.I.D.NO：1
CDRH2：SEQ.I.D.NO：2
CDRH3：SEQ.I.D.NO：3
CDRL1：SEQ.I.D.NO：4
CDRL2：SEQ.I.D.NO：5
CDRL3：SEQ.I.D.NO：6。
7.一种抗体或其抗原结合片段，其结合SEQ ID NO：90、99、102、103、105、106、107、108、109、110、111、112和114中所示的肽，但是不结合SEQ ID NO：100、101、104和113中的肽。
8.如前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特异结合SEQ.I.D.NO：91中所示的表位。
9.前述权利要求中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为完整抗体。
10.权利要求9的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体来自大鼠、小鼠、灵长类(例如，食蟹猴、旧大陆猴或大猩猩)或人。
11.权利要求1至9中任一项的抗体，其中所述抗体是人源化或嵌合抗体。
12.权利要求9至11中任一项的抗体，其中所述抗体包含人恒定区。
13.权利要求9至12的抗体，其中所述抗体包含IgG同种型的恒定区。
14.权利要求13的抗体，其中所述抗体为IgG1、IgG2或IgG4。
15.权利要求6的抗体，包含SEQ.I.D.NO：7的VH结构域和SEQ.I.D.NO：8的VL结构域。
16.权利要求6的人源化抗体，包含SEQ.I.D.NO：12的VH结构域和SEQ.I.D.NO：15的VL结构域。
17.权利要求6的人源化抗体，包含SEQ.I.D.NO：13的VH结构域和SEQ.I.D.NO：15的VL结构域。
18.权利要求16或17的人源化抗体，还包含IgG同种型(例如IgG1或IgG4)的人恒定区。
19.一种包含SEQ.I.D.NO：19的重链和SEQ.I.D.NO：22的轻链的人源化抗体。
20.一种包含SEQ.I.D.NO：20的重链和SEQ.I.D.NO：22的轻链的人源化抗体。
21.权利要求1至8中任一项的抗原结合片段，其中所述片段为Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、双抗体、三抗体、四抗体、微抗体、微体、分离的VH、分离的VL。
22.如权利要求21所述的抗原结合片段，其中所述片段包含ScFv或由ScFv构成。
23.如权利要求1至20中任一项所述的抗体，其包含突变的Fc区，使得所述抗体具有减弱的ADCC和/或补体活化。
24.一种重组转化的或转染的宿主细胞，其包含第一和第二载体，所述第一载体包含编码前述权利要求任一项所述的抗体的重链的多核苷酸，所述第二载体包含编码前述权利要求任一项的轻链的多核苷酸。
25.权利要求24的宿主细胞，其中所述细胞为真核细胞。
26.权利要求25的宿主细胞，其中所述细胞为哺乳动物细胞。
27.权利要求26的宿主细胞，其中所述细胞为CHO细胞或NS0细胞。
28.一种产生权利要求1至20或权利要求23中任一项的抗体的方法，所述方法包括在无血清培养基中培养权利要求24至27中任一项的宿主细胞的步骤。
29.权利要求28的方法，其中所述抗体被所述宿主细胞分泌到所述培养基中。
30.权利要求29的方法，其中相对于含有所述抗体的培养基，所述抗体被进一步纯化至至少95％或更高(例如98％或更高)。
31.一种包含权利要求1至23中任一项的抗体或其抗原结合片段以及药物上可接受的载体的组合物。
32.一种包括权利要求31的组合物连同使用说明书的试剂盒。
33.一种治疗患有哮喘的人类患者的方法，所述方法包括以治疗有效量的权利要求1至23中任一项的抗体或抗原结合片段给药的步骤。
34.权利要求33的方法，其中所述患者患有的哮喘选自变应性哮喘、重症哮喘、难治型哮喘、不稳定型哮喘、夜发哮喘、经前期哮喘、类固醇抗性哮喘、类固醇依赖型哮喘、阿司匹林诱导型哮喘、成人哮喘、小儿哮喘。
35.一种治疗患有对皮质类固醇激素治疗无反应的哮喘状况的人类患者的方法，所述方法包括向所述患者给予治疗有效量的权利要求1至23中任一项的抗体或抗原结合片段的步骤。
36.一种防止人类患者急性哮喘发作的方法，所述方法包括向所述患者给予治疗有效量的权利要求1至23的抗体的步骤。
37.一种减少人类患者中急性哮喘发作的频率和/或减轻其后果的方法，所述方法包括向所述患者给予治疗有效量的权利要求1至23中任一项的抗体的步骤。
38.一种治疗患有选自异位性皮炎、变应性鼻炎、克罗恩氏病、COPD、诸如特发性肺纤维化的纤维化疾病或病症、进行性全身硬化症、肝纤维化、肝肉芽肿病、血吸虫病、利什曼病、诸如霍奇金病的细胞周期调节性疾病、B细胞慢性淋巴细胞白血病的疾病或病症的人类患者的方法，所述方法包括向人类患者给予治疗有效量的权利要求1至23中任一项的抗体。
39.权利要求1至23中任一项的抗体或其抗原结合片段在制备治疗疾病或病症的药物中的用途，所述疾病或病症选自：变应性哮喘、重症哮喘、难治型哮喘、不稳定型哮喘、夜发哮喘、经前期哮喘、类固醇抗性哮喘、类固醇依赖型哮喘、阿司匹林诱导型哮喘、成人哮喘、小儿哮喘、异位性皮炎、变应性鼻炎、克罗恩氏病、COPD、诸如特发性肺纤维化的纤维化疾病或病症、进行性全身硬化症、肝纤维化、肝肉芽肿病、血吸虫病、利什曼病、诸如霍奇金病的细胞周期调节性疾病、B细胞慢性淋巴细胞白血病。
40.一种治疗患有选自变应性哮喘、重症哮喘、难治型哮喘、不稳定型哮喘、夜发哮喘、经前期哮喘、类固醇抗性哮喘、类固醇依赖型哮喘、阿司匹林诱导型哮喘、成人哮喘、小儿哮喘、异位性皮炎、变应性鼻炎、克罗恩氏病、COPD、诸如特发性肺纤维化的纤维化疾病或病症、进行性全身硬化症、肝纤维化、肝肉芽肿病、血吸虫病、利什曼病、诸如霍奇金病的细胞周期调节性疾病、B细胞慢性淋巴细胞白血病的疾病或病症的人类患者的方法，所述方法包括以治疗有效量的权利要求1至23中任一项的抗体和治疗有效量的抗IL-4单克隆抗体给药。
41.权利要求40的方法，其中所述抗IL-4单克隆抗体与权利要求1至23中任一项的抗体同时、顺序或分别给药。
42.权利要求40或41的方法，其中所述抗IL-4抗体为帕考珠单抗。
43.权利要求1至23中任一项的抗体和诸如帕考珠单抗的抗IL-4单克隆抗体在制备治疗疾病或病症的药物中的用途，所述疾病或病症选自：变应性哮喘、重症哮喘、难治型哮喘、不稳定型哮喘、夜发哮喘、经前期哮喘、类固醇抗性哮喘、类固醇依赖型哮喘、阿司匹林诱导型哮喘、成人哮喘、小儿哮喘、异位性皮炎、变应性鼻炎、克罗恩氏病、COPD、诸如特发性肺纤维化的纤维化疾病或病症、进行性全身硬化症、肝纤维化、肝肉芽肿病、血吸虫病、利什曼病、诸如霍奇金病的细胞周期调节性疾病、B细胞慢性淋巴细胞白血病。
44.权利要求1至23中任一项的抗体和诸如帕考珠单抗的抗IL-4单克隆抗体在制备治疗疾病或病症的试剂盒中的用途，所述疾病或病症选自：变应性哮喘、重症哮喘、难治型哮喘、不稳定型哮喘、夜发哮喘、经前期哮喘、类固醇抗性哮喘、类固醇依赖型哮喘、阿司匹林诱导型哮喘、成人哮喘、小儿哮喘、异位性皮炎、变应性鼻炎、克罗恩氏病、COPD、诸如特发性肺纤维化的纤维化疾病或病症、进行性全身硬化症、肝纤维化、肝肉芽肿病、血吸虫病、利什曼病、诸如霍奇金病的细胞周期调节性疾病、B细胞慢性淋巴细胞白血病。
45.一种试剂盒，其包括第一药物组合物、第二药物组合物以及任选的使用说明书，其中所述第一药物组合物包含权利要求1至23中任一项的抗体和药物上可接受的载体，所述第二药物组合物包含诸如帕考珠单抗的抗IL-4单克隆抗体和药物上可接受的载体。
46.一种药物组合物，其包含权利要求1至23中任一项的第一抗体、第二抗体和药物上可接受的载体，其中所述第二抗体为诸如帕考珠单抗的抗IL-4抗体。
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