KR20080113201A - 키메라 및 인간화된 항-인간 ｉｌ-13 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인터루킨 13 (hIL-13)에 특이적으로 결합하는 면역글로불린, 특히 항체에 관한 것이다. 본 발명의 항체는 hIL-13과 인간 IL-13 수용체의 상호작용의 조정에 대해 반응하는 다양한 질환 또는 질병의 치료에 사용될 수 있다. 이러한 질환으로는 중증 천식, 아토피성 피부염, COPD, 및 다양한 섬유성 질환을 포함한다. 상기 항체를 포함하는 약제 조성물 및 이의 제조 방법이 또한 기술되어 있다.

Description

키메라 및 인간화된 항-인간 ＩＬ-13 항체 {CHIMERIC AND HUMANISED ANTI-HUMAN IL-13 ANTIBODIES}
본 발명은 인터루킨 13 (IL-13) 특히, 인간 IL-13 (hIL-13)에 특이적으로 결합하는 면역글로불린에 관한 것이다. 본 발명의 일 구체예는 hIL-13에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 상기 면역글로불린으로 질환 또는 질병을 치료하는 방법, 상기 면역글로불린을 포함하는 약제 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 기타 양태는 하기 기술로부터 자명해질 것이다.
인터루킨-13 (IL-13)
IL-13은 염증성 사이토킨 생성을 억제하는 T 세포-유래된 사이토킨으로서 원래 기술된 12kDa의 분비된 사이토킨이다. 구조적 연구에 의해 이는 2개의 이황화 결합에 의해 고정된 4-나선형 덩어리 배열을 갖는 것으로 나타났다. IL-13이 4개의 잠재적인 글리코실화 부위를 갖지만, 래트 폐로부터의 천연 IL-13을 분석하면 비글리코실화된 분자로서 생성되는 것으로 나타났다. NSO 및 COS-7 세포로부터의 인간 IL-13의 발현은 이러한 관찰을 확인시켜 준다 (Eisenmesser et al, J. MoI. Biol. 2001 310(1):231-241 ; Moy et al, J. MoI. Biol 2001 310(1):219-230; Cannon-Carlson et al, Protein Expression and Purification 1998 12(2):239- 248).
IL-13은 활성화된 Th2 세포, 비만 세포, 호염기성구, 수지상 세포, 케라티노사이트 및 NKT 세포를 포함하는 다양한 유형의 세포에 의해 생성되는 다면발현 사이토킨이다. 이는 또한, Th0, Th1, CD8 및 순수한 CD45RA+ T 세포에 의해 생성될 수 있다. IL-13은 IL4의 면역조절 활성과 부분적으로 중복되는 면역조절 활성을 가지며, 이러한 중복성은 IL4 및 IL-13에 대한 수용체에서 공통된 요소에 의해 설명될 수 있다. IL-13은 IL4Rα 및 IL-13Rα1 사슬로 이루어진 헤테로다이머인 타입 II IL4 수용체를 통해서 시그널링한다. IL-13Rα1은 낮은 친화도 (Kd = 2-10nM)로 IL-13에 결합하나, IL4Rα와 쌍을 이루는 경우, 이는 높은 친화도 (Kd = 400pM)로 결합하며, 작용성 IL-13 수용체를 형성하며 (인간 수용체는 본원에서 "hIL-13R"로서 칭함), 이는 시그널링하여 JAK/STAT 및 IRS-1/IRS-2 경로를 활성화시킨다. 추가적인 IL-13 수용체 사슬은 높은 친화도 (Kd = 250pM)로 IL-13에 결합함을 특징으로 한다 (IL-13Rα2). IL-13Rα2는 IL-13 활성을 조절하는 미끼 수용체로서 작용하는 것으로 여겨진다. IL-13은 또한, IL13Rα2 사슬을 통해 시그널링하여 (Fichter- Feigl 2006 Nature Medicine 12:99-106), TGF베타1을 유도할 수 있으며, 이렇게 해서, 천식 병리와 관련된 섬유증에 기여할 수 있다. IL-13에 대한 작용성 수용체는 기도 상피세포, 연근육, 비만 세포, 호산구, 호염기성구, B 세포, 섬유아세포, 단핵구 및 대식세포를 포함하는 넓은 범위의 세포에서 발현된다. T 세포는 IL-13에 대한 작용성 수용체를 갖지 않는다 (Hilton et al, PNAS 1996 93(1):497-501 ; Caput et al, J. Biol. Chem. 1996 271 (28): 16921 -16926; Hershey GK, J.AIIergy Clin. Immunol. 2003 111 (4):677-690).
IL-13 및 IL-4 둘 모두는 알레르기 관련 염증을 조장하고, 박테리아, 바이러스 및 세포내 병원체로 인한 염증을 억제함으로써 면역 및 염증 반응을 변형시키는 작용을 한다. IL-13의 주요 생물학적 효과는 하기를 포함한다; B 세포 증식의 유도 및 IgE로 스위칭되는 이소타입의 조절; B 세포 및 단핵구에서 MHC II 및 CD23 발현의 유도; 내피세포상에서의 VCAM-1의 상향 조절; 케모킨 생성의 상향 조절; 비만 세포, 호산구 및 호중구 작용의 활성화 및 단핵구 및 대식세포 군집에서 염증전구 유전자 발현의 억제. IL-13은 T 세포에 대한 증식 효과를 갖지 않는다. IL4와 달리, IL-13은 Th2-타입 세포로의 CD4 T 세포의 초기 분화에 중요하지 않으나, 알레르기 염증의 이펙터 단계에서는 중요한 것으로 보여진다 (McKenzie et al, PNAS 1993 90(8):3735-3739; Wynn TA, Annu. Rev. Immunol. 2003 21 :425-456).
IL-13 및 천식
천식은 하부기도의 염증에 의해 초래되는 만성 폐 질환이며, 회귀성 호흡기 문제를 특징으로 한다. 환자의 기도는 민감하며, 심지어 증상이 없을 때에도 항상 일정 정도로 부어 있거나 염증이 있다. 염증은 기도의 협소화를 초래하여, 폐로 유입되고 유출되는 공기의 흐름을 저하시켜, 호흡 곤란을 일으키고, 쌕쌕거리고, 가슴이 갑갑하고 기침을 하게 된다. 천식은 알레르겐 (예를 들어, 먼지 진드기, 꽃가루, 곰팡이), 자극물 (예를 들어, 연기, 증기, 강한 향), 호흡성 감염물, 운동 및 건조한 기후에 의해 촉발된다. 촉발물은 기도를 자극하고, 기도의 내부가 부풀 어 올라 심지어 염증을 일으키고, 점액이 생겨 기도를 막히게하고, 기도 주위의 근육이 단단해져 호흡이 어렵고, 힘들며 천식 증상이 나타나게 된다.
천식 염증 및 기타 병리가 공기알레르겐 및 기타 자극물에 대한 Th2 반응을 하향 조절함으로써 유도된다는 것이 동물 모델 및 환자로부터 입증되었다 (Busse et al, Am. J. Resp. Crit. Care Med.1995 152(1):388-393). 특히, IL-13은 기도 과민성, 호산구증가증, 배상세포 이형성 및 점액 과다분비를 포함하는 폐에서의 다양한 세포 반응을 유도하는 주요 이펙터 사이토킨인 것으로 여겨진다.
천식에서 IL-13의 역할에 대한 임상적 증거
IL-13을 엔코딩하는 유전자는 크로모좀 5q31에 위치한다. 이러한 영역은 또한, IL-3, IL-4, IL-5, IL-9 및 GM-CSF를 엔코딩하는 유전자를 함유하며, 천식과 관련되어 있다. 천식 및 아토피와 관련된 IL-13의 유전적 변이체는 프로모터 및 코딩 영역 둘 모두에서 발견되었다 (Vercelli D, Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 2002 2(5):389-393). 코딩 변이체인 Q130 IL-13 (본원에서는 "Q130 IL-13"로 칭함)에 대한 작용성 연구 데이타가 이용가능하다. 제 4 엑손에서 발견된 +2044 G 내지 A 단일 누클레오티드 다형성 (SNP)은 130번 위치에서 아르기닌의 글루타민으로의 치환을 유도한다 (Q130 IL-13). 또한, 이는 SEQ. ID. NO: 9에서 위치 110번에 동일하며, 여기서 성숙한 인간 IL-13 아미노산 서열의 시작시 처음의 'G' 아미노산 잔기는 위치 1번이다. 이러한 변이체는 일본 및 유럽 개체군에서 천식, 증가된 IgE 수준 및 아토피 피부염과 관련있는 것으로 밝혀졌다. Q130 IL-13은 야생형 IL-13과 비교하여 증가된 안정도를 갖는 것으로 여겨진다. 또한, IL- 13RαR 미끼 수용체에 대해 다소 낮은 친화도를 가지며, 이는 이들 관찰과 일관되며, 더 높은 평균 혈청 IL-13 수준이 Q130 IL-13 변이체에 대한 비동형 환자보다 동형 환자에서 발견되었다. 이들 결과는 Q130 IL-13이 IL-13의 국소적 및 전신적 농도에 영향을 끼칠 수 있음을 시사한다(Kazuhiko et al, J. Allergy Clin. Immunol. 2002 109(6):980-987).
증가된 IL-13 수준을 아토피성 및 비아토피성 천식에서 측정하였다. 한 연구에서, 정상 대조군환자에서의 8pg/ml와 비교하여 50pg/ml의 평균 혈청 IL-13 수준이 천식 환자에서 측정되었다 (Lee et al, J. Asthma 2001 38(8):665-671 ). 증가된 IL-13 수준이 혈장, 기관지폐포 세척액, 폐생검 샘플 및 가래에서 측정되었다 (Berry et al, J Allergy Clin. Immunol 2004 114(5):1106-1109; Kroegel et al, Eur Respir. J. 1996 9(5):899- 904; Huang et al, J. Immunol. 1995 155(5):2688-2694; Humbert et al, J. Allergy Clin. Immunol. 1997 99(5):657-665).
천식에서 IL-13의 관련성에 대한 생체내 증거
많은 연구에 의해 알레르기 천식의 급성 및 만성 마우스 모델에서의 병리 유도에 있어서 IL-13의 중요한 이펙터 역할을 규정하였다. 고친화도 IL-13 수용체 (IL-13Rα2) 또는 항-IL-13 폴리클로날 항체가 이들 모델에서 마우스 IL-13 생활성을 중화시키는데 이용되었다. 알레르겐 자극 시 IL-13의 차단은 OVA-유도된 기도 과민성, 호산구증가증 및 배상세포 이형성을 완전히 억제하였다. 반대로, 감작 후 및 알레르겐 자극 단계 동안 IL-4에 대한 항체의 투여는 단지 부분적으로 천식 표현형을 저하시켰다. 따라서, 외인성 IL-4 및 IL-13이 모두 천식-유사 표현형을 유 도할 수 있지만, IL-13에 대한 이펙터 활성이 IL-4에 대한 것보다 더욱 우수한 것으로 보여진다. 이들 데이타는 면역 유도에서 IL-4의 일차 역할을 시사하는 반면 (특히, Th2 세포 발달 및 기도로의 보충, 및 IgE 생성), IL-13은 기도 과민반응, 점액 다과생성 및 세포 염증을 포함하는 다양한 이펙터 결과에 주로 관련이 있는 것으로 여겨진다 (Wills-Karp et al, Science 1998 282:2258-2261 ; Grunig et al, Science 1998 282:2261-2263; Taube et al, J. Immunol. 2002 169:6482-6489; Blease at al, J. Immunol 2001 166(8):5219-5224).
상보적 실험에서, 폐 IL-13 수준이 유전자 도입 마우스에서의 과다 발현 또는 IL-13 단백질의 야생형 마우스의 호흡관으로의 주입에 의해 증가되었다. 두 세팅에서, 천식 유사 특징이 유도되었다: 콜린성 자극에 대한 비특이적 기도 과민성, 폐 호산구증가증, 상피 증식증, 점액 세포 화생, 상피하 섬유증, 기도 폐색 및 샤르코-라이덴 결정. 또한, IL-13은 폐에서 매트릭스 금속단백분해효소 및 카텝신 단백질분해효소의 잠재적인 자극제로서 공기증 변화 및 점액 회생을 유도하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, IL-13은 천식 및 COPD 질환 표현형 둘 모두에서 중요한 이펙터 분자일 수 있다 (Zhu et al, J. Clin. Invest. 1999 103(6):779-788; Zheng et al, J. Clin. Invest. 2000 106(9):1081-1093).
이들 데이타는 IL-13 활성이 매우 유효한 동물 모델에서 알레르기 천식의 여러 주요 임상적 및 병리학적 특징을 유도하는데 필수적이며 충분하다는 것을 나타낸다.
만성 폐색성 폐 질환 (COPD)
COPD는 폐기종 및 만성 기관지염을 포함하는 중증의 임상 증상을 내포하는 포괄적인 용어이다. 증상은 천식과 유사하며, COPD는 동일한 약물로 치료될 수 있다. COPD는 만성, 진행성 및 큰 비가역적 기류 폐색을 특징으로 한다. 질환 과정에 대한 개체의 기여도는 공지되어 있지 않으나, 흡연이 원인의 90%를 초래하는 것으로 여겨진다. 증상은 기침, 만성 기관지염, 숨가쁨 및 호흡기 감염을 포함한다. 최종적으로, 질환은 중증 불구 및 치사를 초래할 것이다. 만성 기관지염은 다른 이유 없이 2년에 걸쳐 3개월 이상 동안 대부분 기침 또는 가래 생성 병력을 갖는 환자에서 진단된다. 폐기종은 공기 공간의 비정상적인 영구적 비대화 및 폐포 벽 파괴를 특징으로 한다.
IL-13은 COPD의 발병에 기여할 수 있다. COPD가 발병한 인간 흡연자는 폐 선세포 조직에서 많은 염증 세포 타입 (호중구, 대식세포, 호산구)을 가질 수 있다. IL-13은 전구염증 Th2 사이토킨이며, 따라서 폐기종의 진행을 모델링한다; 젱 (Zheng) 등은 IL-13 유전자 도입 마우스에서 기도 상피로의 IL-13 과다 발현을 표적으로 하였다. 이들 동물은 기도 및 폐 선세포조직 염증 및 폐기종을 발생시켰다. 이들은 또한, 만성 기관지염의 회상 점액 화생 (mucus metaplasia reminiscent)을 발생시켰다 (J. Clin. Invest. 2000 106(9):1081-1093).
알레르기 천식과 관련된 IL-13 프로모터 다형성 (-1055 C 내지 T)은 건강한 대조군과 비교하여 COPD 환자에서 증가된 빈도를 갖는 것으로 보고되었다. 이는 증가된 COPE 발병 위험성에 있어서 IL-13 프로모터 다형성의 작용성 역할을 내포한다 (Kraan et al, Genes and Immunity 2002 3:436-439). 또한, 증가된 수의 IL-13 및 IL-4 파지티브 세포가 무증상 흡연자와 비교하여 만성 기관지염을 갖는 흡연자에게서 관찰되었다 (Miotto et al, Eur. Resp. J. 2003 22:602-608). 그러나, 중증 폐기종 환자의 폐에서 IL-13 발현 수준을 평가하는 최근 연구는 IL-13 수준과 질환과의 관계를 발견해내지 못하였다 (Boutten et al, Thorax 2004 59:850-854).
아토피성 피부염 및 알레르기 비염을 포함하는 알레르기 질환
IL-13은 또한, 아토피성 비염과 아토피성 피부염과 같은 아토피성 질환에 관여한다. 알레르기 비염은 미국에서 가장 흔한 아토피 질환에 속하며, 성인의 25% 및 아동의 40% 초과에 영향을 끼치는 것으로 추정된다. 알레르기 비염과 천식간에는 밀접한 관계가 있다. 두 질환은 공통된 면역병리 및 이상생리를 공유한다; 이들은 유사한 면역학적 과정을 가지며, 여기서 비 및 기관지 조직에서 호산구 및 Th2 림프구가 역할을 수행한다. Th2 사이토킨 특히, IL-4 및 IL-5의 과도한 생성은 알레르기 질환의 병리에 근본적인 것으로 여겨진다. IL-13은 IL-4와 수개의 특징 및 이펙터 작용을 공유하며, 이는 IL-4 및 IL-13 수용체 사용, 세포내 시그널링 성분 및 유전자 구성에서 기능적 중복과 관련되어, 생체내에서 인간의 즉각적 과민반응을 증진하거나 유지시키는데 있어서 IL-13의 역할을 (비록 간접적이긴 하지만) 강력하게 입증한다. 이는 계절성 알레르기 비염을 갖는 아토피 피검체가 Ag-의존적이나 폴리클로날 비활성화에 대한 반응에서 현저하게 강한 IL-13 반응을 나타냄을 입증한 리 (Li) (Li et al. J Immunol 1998;161:7007) 등에 의해 확인되었다.
아토피성 피부염은 일반적이고, 만성이며, 재발성인 고도의 소양증 염증 피부 질환이다. 아토피 피부염 환자의 국소 피부는 조직학적으로 염증성 T-세포 침 투를 특징으로 하며, 이는 급성 단계 동안 IL-4, IL-5 및 IL-13 발현의 우세성과 관련있다 (Simon et al, J Allergy Clin Immunol 2004;114:887; Hamid et al. J Allergy Clin Immunol 1996; 98: 225). 또한, 타자와 (Tazawa) 등은 IL-13 mRNA (그러나, IL-4는 아님)가 아토피 피부염 환자의 아급성 및 만성 피부 병변에서 현저하게 상향조절됨을 입증하였다 (Tazawa et al, Arch Derm Res 2004;296:459). 순환 CD4+ 및 CD8+ T-세포를 발현하는 IL-13의 빈도는 또한, 이들 환자에서 현저하게 증가하였다 (Aleksza et al British J Dermatol 2002;147;1135). 이러한 증가된 IL-13 활성은 증가된 수준의 혈청 IgE를 유도하여, 아토피 피부염의 병인에 기여하는 것으로 여겨진다. 게다가, 신생아 CD4+ T 세포에 의한 IL-13의 증가된 생성은 알레르기 질환, 특히 아토피 피부염의 후속 발병에 대한 높은 위험도를 갖는 신생아를 식별하기 위한 유용한 마커이다 (Ohshima et al. PediatrRes 2002; 51:195). 아토피 피부염의 병인학에서 IL-13의 중요성에 대한 추가적인 증거는 사이몬 등에 의해 제공되며 (Simon et al, J Allergy CHn Immunol 2004; 114:887); 타크로리무스 (tacrolimus) 연고로의 국소 치료 (사이토킨 생성에 대한 세포내 시그널 경로를 억제하는 면역억제 약물)은 IL-13을 포함하는 Th2 사이토킨의 국소 발현에서 현저한 저하에 수반된 아토피 피부 병변의 현저한 임상적 및 조직학적 개선을 유도한다. 게다가, IL-13Rα1 (IL-4Rα와 함께 IL-13에 대한 작용성 수용체를 형성하는 세포 표면 단백질)은 아토피 피부염 환자의 피부에서 상부 케라티노사이트에 대한 과다 발현되는 것으로 입증되었으며, IL-13은 실험관내에서 IL-13 Rα1 mRNA를 상향조절할 수 있었다 (Wongpiyabovom et al., J Dermatol Science 2003;33:31 ).
이들 데이타는 IL-13 모노클로날 항체를 포함하는 IL-13 타겟팅된 중재는 인간 알레르기 질환의 치료에 효과적인 접근법을 제공할 수 있음을 나타낸다.
식도 호산구증가증
식도에서 호산구의 축적은 위식도역류병, 호산구성 식도염, 호산성 위장병 및 기생충 감염을 포함하는 다양한 질환을 갖는 환자에서 공통된 의학적 문제점이다. 식도 호산구증가증은 공기알레르겐으로의 마우스의 반복된 자극과 관련이 있으며, 이는 알레르기 반응, 및 알레르기 기도 염증과 식도 호산구증가증과의 연계를 확립하였다. Th2 세포는 간접적으로 및 직접적으로 이펙터 경로 및 염증을 활성화시키는 IL-4 및 IL-13을 포함하는 사이토킨 어레이의 분비를 통해 호산구-관련 염증을 유도하는 것으로 여겨진다. IL-13은 특히 중요한 것으로 보여지는데, 그 이유는 이는 Th2-세포에 의해 높은 적량으로 생성되며, 알레르기 질환의 다수 특징 (예를 들어, IgE 생성, 점액 과다 생성, 호산구 회생 및 생존, 및 기도 과민성)을 조절하기 때문이다. 호산구는 호산구 염증 반응에서 실험관내, 생체외 및 생체내 조건에서 GM-CSF 및/또는 IL-5로의 노출 후 작용적으로 활성 IL-13을 생성시킬 수 있다 (Schmid-Grendelmeier J Immunology, 2002, 169: 1021- 1027). IL-13은 기관내 투여에 의해 야생형, STAT-6, 에오탁신-1 또는 IL-5 결핍 마우스의 폐로 이동시켰으며, IL-13에 의해 촉발된 폐 염증은 식도 호산구증가증의 발병과 관련이 있음이 확립되었다 (Mishra et al. Gastroenterol 2003; 125: 1419). 종합하면, 이들 데이타는 식도 호산구증가증에서 IL-13의 역할에 대한 증거를 제공한다.
종양학적 표시
흥미로운 또 다른 중요한 분야는 IL-13 또는 IL-13 수용체를 타겟팅하여 특정 유형의 종양의 성장을 억제시키는 것이다. 타입 1 T 세포-매개된 숙주 방어는 생체내에서 최적의 종양 거부를 매개하는 것으로 여겨지며, Th2-타입 반응으로의 편향은 종양 거부 차단 및/또는 종양 재발의 증진에 기여할 수 있다 (Kobayashi M et al. J. Immunol. 1998; 160:5869). 이식가능한 종양 세포주를 이용한 여러 동물 연구는, Stat6, IL-4, 및 IL-13 (NKT 세포에 의해 부분적으로 생성됨)이 종양 거부를 억제할 수 있음을 입증함으로써 이러한 개념을 지지한다 (Terabe et al. Nat. Immunol. 2000/1 :515; Kacha et al. J. Immunol. 2000; 165:6024- 28; Ostrand-Rosenberg et al. J. Immunol. 2000,165:6015). Stat-6의 부재시 잠재적인 항-종양 활성은 종양-특이적 IFNg 생성 및 CTL 활성의 향상으로 인한 것으로 여겨졌다. 또한, NKT 세포의 손실은 종양 재발에서 동시에 발생하는 IL-13 생성을 저하시키는 것으로 나타났으며, 이는 NKT 세포에 의해 부분적으로 생성된 IL-13이 면역감시에 중요함을 나타낸다 (Terabe et al. Nat. Immunol. 2000; 1:515). 이와 같이, 이들 발견은, 네거티브 조절성 IL-13이 종양 세포에 대한 면역 반응을 하향조절하는 것을 방해함으로써 IL-13 mAb를 포함하는 신규한 IL-13 안타고니스트 또는 IL-13 억제제가 암 면역치료제로서 유효할 수 있음을 시사한다.
Th-타입-1-관련 항-종양 방어를 부스팅하는 것 이외에, IL-13 억제제는 또한, 종양 세포 성장을 더욱 직접적으로 차단할 수 있다. 예를 들어, B-세포 만성 림프구 백혈병 (B-CLL) 및 홉지킨병에서, IL-13은 아폽토시스를 차단하거나, 종양 세포 증식을 증진시킨다 (Chaouchi et al. Blood 1996; 87:1022; Kapp et al. J. Exp Med. 1999; 189:1939). B-CLL은 백혈병 세포에서 아포톱시스 결함과 관련된 B 림프구로부터 기원한 임상적으로 이종성인 질환이다. IL-13은 직접 성장 인자로서 작용하는 것으로 여겨지지 않으나, 실험관내 자연적 아폽토시스로부터 종양 세포를 보호하며 (Chaouchi et al. Blood 1996; 87:1022; Lai et al. J. Immunol.1999; 162:78), 신생물 세포 치사를 억제함으로써 B-CLL에 기여할 수 있다.
호키진병은 주로 청년층에 영향을 미치며, 미국에서 연간 약 7,500 케이스에 달하는 림프종 타입이다. 암은 큰 다중-핵화된 홉킨/리드-스텝베르그 세포 (H/RS)의 존재를 특징으로 한다. 대부분의 경우, 악성 세포 군집은 B 세포로부터 발생한다. 수개의 호지킨 질환 유래된 세포주 및 호지킨 림프종 환자로부터 채취한 림프절 조직은 IL-13 및/도는 IL-13 수용체를 과다발현한다 (Kapp et al. J. Exp Med. 1999:189:1939, Billard et al. Eur Cytokine Netw 1997;8:19; Skinnider et al. Blood 2001 ; 97:250; Oshima et al, Cell Immunol 2001, 211 :37). 항-IL-13 mAb 또는 IL-13 안타고니스트 중화는 용량 의존 방식으로 H/RS 세포 증식을 억제하는 것으로 나타났다 (Kapp et al. J. Exp Med. 1999; 189:1939; Oshima et al, Cell Immunol 2001; 211:37). 유사하게는, 이식된 호지킨 질환-유래된 세포주를 갖는 NOD/SCID 마우스로 가용성 IL-13Ra2 미끼 수용체의 전달은 종양 발생 및 성장을 지연시키고, 생존을 증대시키며, 이는 IL-13 중화가 실험관내 및 생체내에서 호지킨 림프종 성장을 억제할 수 있음을 입증한다 (Trieu et al. Cancer Research 2004;64:3271). 종합적으로, 이들 연구는 IL-13이 오토크린 방식으로 H/RS 세포의 증식을 자극한다는 것을 나타낸다 (Kapp et al. J. Exp Med. 1999; 189:1939; Ohshima et al. Histopathology 2001; 38:368). 따라서, IL-13의 중화는 종양 세포 성장을 억제하면서 동시에, 항-종양 방어를 증강시킴으로써 호지킨병 및 기타 B 세포-관련 암에 대한 매력적이고 효과적인 치료법을 나타낸다.
염증성 장 질환
IL-13은 염증성 장 질환 (IBD)의 병인에서 역할을 수행한다. 염증성 장 질환은 궤양성 대장염, 크론병 및 불확정 대장염으로서 임상적으로 분류된 많은 질환을 포함한다. 이의 주요 표명은 장 점막내에서 Th1 및 Th2 림프구의 활성화에서 불균형을 이루는 과장된 면역 반응으로 인한 만성 장 염증이다. 이는 크론병 (Bamias et al. Gastroenterol 2005; 128:657) 및 궤양성 대장염 (Heller et al, Immunity 2002; 17:629)의 동물 모델에서 입증되었다. IL-13Rα2-Fc 투여에 의한 IL-13의 중화는 인간 궤양성 대장염의 뮤린 Th2 모델에서 대장염을 억제한다 (Heller et al, Immunity 2002; 17:629). 게다가, IL-13 생성은 이 모델에서 IL-4을 신속하게 대신하며, IL-13 생성은 NKT 세포의 자극에 의해 유도될 수 있으며, 이는 조직 손상이 상피 세포상에서 IL-13의 독성 활성으로부터 초래될 수 있음을 나타낸다. 이러한 발견을 지지하는 일부 인간 데이타가 존재한다: 궤양성 대장염을 갖는 환자로부터 IL-13 포지티브 직장 생검 표본의 발생 빈도는 염증 및 비염증 대조군 피검체에서의 빈도보다 현저하게 높으며, 비급성 궤양성 대장염에서보다 급성 궤양성 대장염에서 더 높은 IL-4 및 IL-13 발현율이 관찰되었다 (Inoue et al. Am J Gastroenterol 1999;94:2441). 또한, 아키도 (Akido) 등은 크론병 환자의 장 세그먼트로부터의 외근육층에서의 면역 활성을 특성 결정하였으며, IL-4 및 IL-13이 STAT-6 경로를 통해 장내 연근 세포의 과도수축성을 매개한다는 것을 발견하였다. 저자는 이러한 경로가 크론병에서 장근육의 과도수축성에 기여할 수 있다고 결론내렸다 (Akiho et al., Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2005; 288:619).
따라서, 가능하게는 다른 사이토킨에서 유도된 분자와 조합된 IL-13 mAb는 IBD의 진행을 중단하거나 느리게하는 접근법을 제공할 수 있다.
건선 및 건선성 관절염
건선은 표피 케라티노사이트의 표현형에 영향을 끼칠 수 있는 다양한 사이토킨을 생성하는 활성화된 T 세포를 포함하는, 면역원성 세포 침윤물 및 케라티노사이트의 과도-증식을 특징으로 하는 만성 피부 질환이다. CDw60은 건선 피부의 건선 기저 및 초기저 케라티노사이트의 표면상에서 상향조절되는 탄수화물 함유 분자이다. 건선 병변으로부터 유래된 T 세포로부터 분비된 IL-4 및 IL-13은 케라티노사이트에서 CDw60의 발현을 강하게 상향조절하는 것으로 입증된 반면 (Skov et al., Am J Pathol 1997;15:675), 인터페론-감마 차단된 IL-4/IL-13은 배양된 케라티노사이트에서 CDw60의 유발을 매개한다 (Huang et al., J Invest Dermatol 2001 ;116:305). 이와 같이, 건선 외피 케라티노사이트상의 CDw60 발현은 병변내의 활성화된 T 세포에 의해 적어도 부분적으로 유도되는 것으로 여겨진다. 또한, 함께 IL-13에 대한 수용체 복합체를 형성하는 세포 표면 단백질인 IL-13 Rα1 및 IL-4Rα는 건선을 갖거나 갖지 않는 환자로부터의 피부 생검에서 상이하게 발현되 며 (Cancino-디az et al., J Invest Dermatol 2002; 119:1114; Wongpiyabovorn et al., J Dermatol Science 2003;33:31), 실험관내 실험에서는, IL-13 (IL-4는 아님)은 IL-13Rα1의 발현을 상향조절할 수 있음이 입증되었다 (Wongpiyabovorn et al., J Dermatol Science 2003,33:31). IL-13는 다양한 세포 유형에 영향을 끼치기 때문에, 이들 연구는 IL-13 수용체가 건선의 초기 염증 과정에서 일부 역할을 수행할 수 있음을 시사한다.
건선 관절염은 전구염증 및 항-염증 사이토킨에 의해 매개된 활액막염을 특징으로 한다. 다양한 형태의 관절염에서 IL-13의 역할은 점점 더 관심을 받아왔다. 스파다로 (Spadaro) 등은 골관절염을 갖는 환자에서 보다 건선 관절염 및 류마티스 관절염을 갖는 환자의 활액 유체에서 현저하게 더 높은 수준의 IL-13을 관찰하였다. 또한, 활액 유체중 IL-13의 수준은 건선 관절염을 갖는 환자의 혈청에서보다 현저하게 높았으며, IL-13 활액/혈정 비는 류마티스 관절염 군에서 보다 건선 관절염 군에서 현저하게 높았으며, 이는 건선 관절염을 갖는 환자의 활액 조직에서 국소적으로 생성된 IL-13의 가능한 역할을 시사한다 (Spadaro et al., Ann Rheum Dis 2002; 61 :174).
기타 질병에서 IL-13의 잠재적 역할
급성 이식편대 숙주 질환은 줄기 세포 이식 후 사망의 중요 원인이며, 제공자와 수용자간의 인간 백혈구 항원 (HLA) 불양립성의 정도에 직접적으로 관련된다. 조단 (Jordan) 등은 먼저, 비관련되고 비매칭되는 MLR (혼합된 백혈구 반응; 초기 HLA 타입핑 후 공여체 선택을 미조정하기 위한 실험관내 검정) 동안 풍부하게 생성 되는 전형적인 Th2 사이토킨으로서 IL-13을 확인하였다 (Jordan et al. J Immunol Methods; 2002;260:1). 이어서, 공여체 T-세포에 의한 IL-13 생성이 비관련된 공여체 줄기 세포 이식 후 급성 이식편대 숙주 질환 (aGVHD)을 예견한다는 것을 입증하였다 (Jordan et al. Blood 2004; 103:717). 줄기 세포 이식 후 중증의 III 등급의 aGVHD를 갖는 모든 환자가 매우 높은 사전이식 IL-13 반응을 유도하는 제공자를 가지며, 이는 IL-13과 aGVHD간의 중요한 연결성을 입증하며, IL-13이 aGVHD 관련 병리의 일부에 대해 직접적인 원인이 될 수 있는 가능성을 제기한다. 결론적으로, IL-13의 특이적 차단에 기초한 치료법이 줄기세포 이식 후 aGVHD의 치료에 유용할 수 있다.
당뇨병 콩팥병은 서구에서 말기신질환의 주요 원인중 하나이다. 타입 1 당뇨병으로 인한 콩밭병의 발병은 줄어들고 있지만, 당뇨병 타입 2는 현재 미국, 일본 및 유럽에서 신기능장애의 가장 공통된 단일의 원인이다. 게다가, 이러한 그룹의 환자는 심혈관 사고로 인해 초래된 극도로 높은 치사율로 인해 지속적 투석에 대한 매우 빈약한 예후를 갖는다. 현재, 혈역학, 신진대사 및 구조 변화가 혼교되었음이 더욱 분명해지고 있으며, 이런 질환의 병인에 역할을 수행하는 다양한 효소, 전사 인자 및 성장 인자가 확인되었다. 특히, TGF-β는 직장 비대의 발병 및 세포외 매트릭스 성분의 축적에 중요하며, 신장에서의 콜라겐 형성을 매개하는데 있어서 중요한 사이토킨인 것으로 간주된다 (Cooper. Diabetologia 2001 ; 44:1957; Wolf. Eur J CHn Invest 2004; 34 (12): 785). 실험 및 인간 당뇨병 콩팥병에서, TGF-1 생활성이 증가되고, TGF-β1 항체의 당뇨병 마우스로의 투여는 직 장 작용에서 개선을 유도하며, 세포외 매트릭스 축적을 감소시켰다. IL-13은 최근 폐 섬유증의 유전자이식 마우스 모델에서 관찰되어 TGF-β의 생성 및 활성화 및 콜라겐 침착을 조절함으로써 이의 효과를 적어도 부분적으로 매개하며 (Lee et al. J. Exp. Med. 2001 ; 194:809; Zhu et al. J. Clin. Invest. 1999; 103:779), 따라서, IL-13과 TGF-β간의 직접적인 작용 고리를 확립한다. 결론적으로, 당뇨병 콩팥병에서 TGF-b1 활성을 조절하는데 있어서 IL-13에 대한 유사한 역할이 계획될 수 있으며, IL-13 타겟팅된 중재는 잠재적으로 당뇨병 콩팥병을 조종하는 역할을 할 수 있다.
섬유증
폐 섬유증은 폐의 부적합하고 해로운 상처를 갖는 상태로서, 불구 및 때로는 사망을 초래한다. 이러한 용어는 별개의 병인학, 병리 및 처치에 대한 반응을 갖는 다양한 상이한 질환을 내포한다. 일부 경우에, 섬유증의 원인이 확인되었다. 원인으로는 하기를 포함한다: (1) 흡입된 섬유화 물질 예컨대, 아스베스토 또는 실리콘, 또는 경질 금속 분진, (2) 흡입된 유기 물질로서, 환자는 이에 대한 특유한 면역학적 반응을 가져 섬유증을 유발함 (예를 들어, 농부폐) (3) 약물 예컨대, 니트로푸란토인 (nitrofurantoin), 아미오다론 (amiodarone) 및 메토트렉세이트 (methotrexate), (4) 전신 염증 질환 예컨대, 전신적 경화증 또는 류마티스 관절염.
그러나, 많은 예에서, 원인 또는 기초가 되는 조건이 확인되지 않았다. 많은 이러한 환자는 특발성 폐 섬유증 (IPF)을 갖는 것으로 진단된다. 이는 비교적 희귀성 질환이다 (유병률 20/100000). 진단은 특정 방사선학적 및 병리학적 특징, 특히 CT에 대한 허니컴바이닝 (honeycombing) 또는 폐 생검과 조합하여 확인된 원인의 부재에 기초한다. 이러한 질환은 일반적으로 노년층 (>50)에서 관찰되며, 종종 진행성 폐 손상이 사망으로까지 가는 경로로 진행되며, 평균 생존 기간은 2-5년이다. 게다가, 환자는 달 또는 해가 지남에 따라 진행되는 가장 불쾌한 숨가뿜을 경험하게 된다. 이는 초기에는 물리적 활동을 제안하지만, 마지막 수개월의 종국에는 환자는 휴식시에도 숨이 가쁘게 되고, 게다가 산소 의존적이 된다.
현재에는, 이러한 질환에 대한 만족할만한 치료법이 없다. 최근 치료법은 일반적으로, 아자티오프린과 같은 코르티코스테로이드 및 면역억제제의 형태를 취할 수 있다. 그러나, 코르티코스테로이드는 많은 환자에서 비효과적일 수 있으며, 이의 부작용은 상황을 더욱 악화시킬 수 있다. 연구시 인터페론 감마 및 퍼페니돈을 포함하는 많은 잠재적 치료법이 존재하였으며, 상기 인터페론 감마는 최근 더 많은 연구에서 개선된 생존율을 나타내었다.
Th2 표현형과 관련된 IL-13 및 사이토카인은 조직 복구에서 섬유 형성 과정과 관련된다 (Wynn TA, Nat. Rev. Immunol. 20044:583-594; Jakubzick et al, Am. J. Pathol. 2004 164(6): 1989-2001 ; Jakubzick et al, Immunol. Res. 2004 30(3):339-349; Jakubzick et al, J. Clin. Pathol. 2004 57:477- 486). IL-13 및 IL-4는 다양한 섬유증에 연루되어 있다. 스치스토소모 (Schistosoma)에 의해 초래된 간섬유증은 IL-13에 의존적인 것으로 나타나며, IL-13이 공피증의 발병기전과 관련있음이 제한되게 입증되었다 (Hasegawa et al, J. Rheumatol. 1997 24:328- 332; Riccieri et al, Clin. Rheumatol. 2003 22:102-106)
폐섬유증에 있어서, 실험관내 연구에 의해 IL-13이 섬유조직 발생 표현형을 증대시킴을 발견하였다. 동물 연구에 의해 인공 유도된 섬유증 모델에서 IL-13 발현의 증가된 수준을 나타냈으며, 섬유증이 IL-13의 제거에 의해 저하될 수 있음이 입증되었다.
IL-13은 섬유화 표현형을 증진시킨다. 세포 수준에서, IL-13이 섬유증을 증진시킨다는 수개의 메카니즘이 존재한다. 시그널 경로 및 이들 다양한 메카니즘의 중요성은 잘 규정되어 있지 않다.
IL-13이 섬유아세포에 작용하여 콜라겐의 생성을 증진시키고 이의 파괴를 억제시켜, 섬유조직 표현형에 유리하다는 것이 입증되었다. 피부 섬유아세포는 IL-13 수용체 (= 타입 II IL-4 수용체)를 가지며, 배양된 피부 섬유아세포의 IL-13으로의 노출은 콜라겐 생성을 상향조절시킨다 (Oriente et al, J. Pharmacol. Exp. Ther. 2000 292:988-994). IL-4 또한 유사하나, 더욱 일시적 효과를 나타낸다. 인간 폐 섬유아세포주 (ICIG7)는 타입 II IL-4 수용체를 발현한다 (Jinnin et al, J. Biol. Chem 2004 279:41783-41791). 이들 세포의 IL-13으로의 노출은 다양한 염증 및 섬유화 매개체의 분비를 촉진한다: GM-CSF, G-CSF, VCAM 베타 1 인테그린 (Doucet et al, Int. Immunol. 1998 10(10):1421-1433).
IL-13은 피부 섬유아세포에 의해 IL-1a-유도된 매트릭스 금속단백분해효소 1 및 3 단백질을 억제하며, 이는 EC 매트릭스의 파괴를 감소시키는 경향을 가질 것이다 (Oriente et al, J. Pharmacol. Exp. Ther. 2000 292:988-994). IL-13은 천식 기도의 생검에 의해 수득된 인간 섬유아세포에 대해 TGF-β와 공동상승 작용을 하여 금속단백분해효소 1의 조직 억제제 (TIMP-1)의 발현을 증진시킨다. 세포외 매트릭스의 파괴는 TIMP-1에 의해 억제되는 매트릭스 금속단백분해효소에 의해 수행된다. 따라서, IL-13의 이러한 작용은 매트릭스 분해를 감소시키는 경향을 가질 것이다 (Zhou et al, Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2005 288:C435-C442)
유전자 도입 마우스에서의 IL-13의 과다발현은 상피하 섬유증, 상피세포 비대증, 배상세포 증식, 결정 침착 (산성 포유류 키티나아제), 기도 과민반응성, 간질성 섬유증, 타입 2 세포 비대증 및 계면활성제 축적 (Zhu et al, J. Clin. Invest. 1999 103(6):779-788)을 유도한다.
상이한 종의 마우스는 블레오마이신 유도된 폐 섬유증에 대해 상이한 민감도를 갖는다. 민감한 C57B1/6J 마우스는 블레오마이신에 대한 반응에서 IL-13, IL-13Rα 및 IL-4 (및 TGFβ, TNFRα 및 IL1Rs)를 신속하게 상향조절하며, 민감하지 않은 마우스는 IL-13의 상향조절을 나타내지 않는다.
벨페리오 (Belperio et al; Am. J. Respir. Cell MoI. Biol. 2002 27:419-427) 등은 마우스 블레오마이신 섬유증 모델에서 IL-13, IL-14 및 CC 케모킨 C10의 발현 및 역할을 연구하였다. IL-13 및 IL-4의 폐 조직내 수준은 블레오마이신에 대한 반응에서 증가되었다. 폴리클로날 항 IL-14 항체를 사용한 IL-13의 사전 중화는 폐 히드록시프롤린 수준에 의해 평가된 바와 같이 블레오마이신에 대한 반응에서 폐 섬유 형성을 현저하게 저하시켰다. 동일한 모델에서 IL-4의 증가된 발현에도 불구하고, IL-4의 중화는 폐 섬유형성에 영향을 끼치지 못하였다. BALB/c 마 우스에서 FITC에 의해 유도된 급성 폐 섬유증의 또 다른 모델에서, IL-4가 아니라 IL-13 (넉아웃에서)의 부재는 폐 섬유증에 대해 보호하였다. IL-13 넉아웃에서 IL-4의 넉아웃의 보호는 부가되지 않는다 (Kolodsick et al, J. Immunol. 2004 172:4068-4076). IL-13 부재의 보호성 효과는 폐로의 세포 보충에서의 차이로 인한 것은 아니며; 모든 녹아웃 및 BALB/c에서, 보충된 전체 세포수는 유사하여, 초기 염증 성분이 영향을 끼치지 않은 것으로 보인다. 호산구 보충은 BALB/c와 비교하여 IL-4 및 IL-13 넉아웃에서 더 낮았으며, IL-4 -/-는 섬유증에 대해 보호하지 않았기 때문에, 이는 섬유증에서의 차이를 설명할 수 없었다. 놀랍게도, IL-13 +/+와 IL-13 -/- 간에는 IL10, MCP-1, 감마 인터페론, TGF-i를 포함하는 사이토킨의 수준 차이가 나타나지 않았다. 또한, 동일한 수의 섬유아세포가 FITC 후 상이한 동물의 폐로부터 분리되었으나, IL-13 -/- 마우스에서는, 콜라겐 I의 생성이 저하되었다. 이는 IL-13의 감소가 단순히 염증 반응을 예방할 뿐만 아니라, 더욱 특이적인 항-섬유화 역할을 갖는다는 것을 나타낸다. 이는 IL-13이 TGF-i를 통해 섬유화 효과를 발휘할 수 있음을 시사한다 (Lee et al, J. Exp. Med. 2001 194:809-821). 그러나, 이러한 FITC 모델에서, TGF-i의 발현은 IL-13 넉아웃 마우스에서 저하되지 않았다.
인터루킨 4는 IL-13과 동일한 수용체를 통해 작용하기 때문에 IL-13과 유사한 효과를 발휘할 수 있을 것으로 예상될 수 있다. IL-4는 블레오마이신 유도된 폐 섬유증을 갖는 마우스의 폐에서 현저하게 상향조절된다 (Gharaee-Kermani et al, Cytokine 2001 15:138-147). 그러나, IL-4를 과다발현하는 C57BL6/J, IL-4 넉 아웃 및 야생형 마우스에서 블레오마이신 유도된 폐 섬유증을 비교하면, 이즈비키 등 (Izbicki et al; Am. J. Physiol. Lung Cell MoI. Physiol 2002 283(5):L1110-L1116)은 IL-4가 폐 섬유증과 관련되어 있다는 증거를 발견하지 못하였다. 섬유증은 IL-4 넉어웃에서 저하되지 않았으며, IL-4 과다 발현 마우스에서는 섬유증 수준이 증가되었다.
IL-13의 BAL 사이토킨 수준은 매우 다양하지만, 다양한 형태의 폐 섬유증을 갖는 환자에서 현저하게 증가되었다. IL-13의 발현은 폐 섬유증 환자로부터 수득된 폐포 대식세포에서 현저하게 상향조절된다.
가장 강한 임상 증거는 미시건 유니버시티의 연구소로부터 나왔다. 아쿠비츠 (Jakubzick)와 동료들은 폐 섬유증 환자로부터의 외과적 폐 생검에서 IL-13 및 IL-4의 유전자 표현형 및 이들의 수용체를 연구하였다. IL-13 유전자 발현은 정상적 또는 기타 폐 섬유화 상태의 폐보다 IPF 영향을 받은 폐로부터의 표본에서 현저하게 증가하였다. IPF/UIP를 갖는 환자로부터 배양된 섬유아세포는 정상적인 폐 또는 기타 형태의 폐 섬유증을 갖는 환자로부터 수득된 조직 및 섬유아세포 생검과 비교하여, IL-13 및 IL-4 수용체의 증가된 발현을 나타낸다. 특히, 질환 활성의 진원지인 것으로 추측되는 섬유아세포 포커스는 이들 수용체에 대해 특히 강하게 오손된다 (Jakubzick et al, J. Immunol 2003 171 :2684-2693; Jakubzick et al, Am. J. Pathol. 2003 162:1475-1486; Jakubzick et al, Am. J. Pathol. 2004 164(6): 1989-2001; Jakubzick et al, Immunol. Res. 2004 30(3):339-349; Jakubzick et al, J. Clin. Pathol. 2004 57:477-486).
일반적으로, Th2 사이토킨, 특히, IL-13은 특히 섬유화 표현형을 증진시킨다는 우수한 실험관내 증거가 있다. 2개 이상의 동물 모델에서, 화학적 유도된 섬유증이 IL-13의 제거에 의해 감소될 수 있음이 입증되었다 (넉아웃 유전자에서 또는 항-IL-13 항체에 의해). 일부 증거는 IL-13이 IL-4 보다 폐 섬유증에 더욱 중요함을 나타낸다. 폐 섬유증에서 IL-13 역할의 임상적 증거는 IL-14 및 이의 수용체가 IPF를 갖는 환자의 폐에서 비조절됨을 시사한다.
성장하는 신체 데이타는 주혈흡충증-유도된 간 섬유증 및 다양한 형태의 폐 섬유증 (예를 들어, IPF [다른 곳에서 논의됨], 경피증)을 포함한 다양한 섬유성 질환의 치료를 위한 IL-13 기재 치료법에 대한 중요한 역할을 시사한다.
IL-4 및 IL-13이 억제된 구체예는 독립적으로, 수개 모델에서 섬유증의 지배적인 이펙터 사이토킨으로서 IL-13을 독립적으로 식별하였다 (Chiaramonte et al J. Clin. Invest. 1999;104: 777-785; Blease et al. J. Immunol. 2001; 166:5219; Kumar et al. CHn. Exp. Allergy 2002; 32:1104). 주혈흡충증에서, 에그-유도된 염증성 반응이 IL-13 차단에 의해 영향을 받지 않지만, IL4의 계속되는 비감소된 생성에도 불구하고, 콜라겐 침착이 만성적으로 감염된 동물에서 85%가 넘게 감소하였다 (Chiaramonte et al J. CHn. Invest. 1999; 104: 777; Chiaramonte et al Hepatology 2001; 34:273).
hIL-13에 대한 아미노산 서열은 SEQ.ID.NO: 9에 해당한다. (이는 성숙 단백질 서열이며, 즉, 어떠한 시그널 서열도 존재하지 않는다).
hIL-13을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 SEQ.ID.NO:10에 해당한다. (이는 성숙 단백질 서열에 대한 DNA 서열이며, 즉, 어떠한 시그널 서열도 존재하지 않는다).
본 명세서에 기재된 모든 특허 및 참고문헌 (본 출원이 우선권을 청구항 특허 출원 포함)은 참고문헌으로 본원에 혼입되었다.
최근에는, 천식을 치료하기 위한 IL-13에 대한 면역 반응을 일으키는 백신이 기술되어 있다 (WO 02/070711). 환경적 알레르겐에 대한 피부의 민감성에서 IL-13의 역할이 최근 기술되었다 (Herrick et al., The Journal of Immunology, 2003, 170:2488-2495).
본 발명은 hIL-13R의 사슬 즉, IL-13Rα1 및 IL-13Rα2를 갖는 hIL-13의 결합을 억제하고 hIL-13에 결합하는 항체를 제공한다.
발명의 요약
따라서, 본 발명은 hIL-13에 특이적으로 결합하고, hIL-13의 활성을 중화시키는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 본 발명은 hIL-13에 특이적으로 결합하고, SEQ ID NO: 3 서열의 변이체인 CDRH3, 또는 이러한 CDRH3 변이체내의 1 또는 2개의 아미노산 서열 잔기가 SEQ ID NO: 3의 상응하는 위치에서의 아미노산 잔기와 상이한 변이체를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 본 발명의 일 구체예에서, 아미노산 잔기의 이러한 차이는 보존적 치환이다.
본 발명의 항체 및 이의 항원 결합 단편과 관련된 본 명세서에 걸쳐 사용된 용어 "특이적 결합"은 항체가 hIL-13에는 결합하나, 다른 인간 단백질 특히, 인간 IL-4에는 결합하지 않거나 무의미하게 결합함을 뜻한다. 그러나, 본 용어는 본 발 명의 항체가 사이노몰구스 IL-13과 교차 반응적일 수 있음을 배제하지 않는다.
본 발명의 항체 및 이의 항원 결합 단편과 관련된 본 명세서에 걸쳐 사용된 용어 "중화"는 IL-13의 생물학적 활성이, 이러한 항체 및 이의 항원 결합 단편의 부재하에 IL-13의 활성과 비교하여 본 발명의 항체 및 이의 항원 결합 단편의 존재하에 저하됨을 의미한다. 중화 수준은 여러 방식으로 예를 들어, 하기 실시예에 기술된 검정법에 의해, 예를 들어, 실시예 3.3-3.5에 기술된 바와 같은 실시예에 수행될 수 있는 TF-1 세포 증식 검정법으로 측정될 수 있다. 본 검정법에서 IL-13의 중화는 중화 항체의 존재하에 감소된 TF-1 세포 증식을 평가함으로써 측정된다.
항체 또는 이의 항원 결합 단편이 중화될 수 있는 경우, 이는 hIL-13과 이의 수용체간의 상호작용의 억제를 나타낸다. 인간 IL-13에 대한 중화 활성을 갖는 것으로 여겨지는 항체는 실시예 3.3, 3.4 또는 3.5에 기술된 TF-1 세포 증식 검정법에서 100 마이크로그램/ml 미만의 ND50, 또는 80 마이크로그램/ml 미만의 ND50를 가질 것이다.
본 발명의 대안적 양태에는, 본원에 예시된 항체 예를 들어, 실시예 3.3, 3.4 또는 3.5에 기술된 TF-1 세포 증식 검정법에서 H2L1의 중화 활성을 보유하는 항체에 대해 동등한 중화 활성을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "조절 (modulate)"은 IL-13의 이의 수용체로의 결합의 억제 및/또는 IL-13과 이의 수용체간의 상호작용의 차단, 및 이에 의한 hIL-13/hIL-13R 시그널링 경로의 해체를 의미한다. 이는 IL-13Rα1 및 IL-13Rα2 중 하나 또는 이 둘 모두의 억제 및/또는 차단일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 hIL-13 수용체는 이들 수용체중 하나 또는 둘 모두를 의미한다. 이의 수용체로의 IL-13의 결합 억제는 여러 방법 예를 들어, 하기 실시예에 기술된 검정법, 예를 들어, 실시예 6.5 및 6.6에 기술된 바와 같은 ELISA 방법으로 측정될 수 있다.
본 발명의 항체 및 이의 항원 결합 단편은 치료학적 항체 및 이의 항원 결합 단편일 수 있다. 즉, 치료에 적합할 수 있다.
일 양태에서, hIL-13에 특이적으로 결합하며, SEQ ID NO:3 서열을 포함하는 CDRH3을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
일 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 IL-13을 중화시킨다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 IL-13 또는 이의 수용체의 결합을 조절한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, hIL-13에 특이적으로 결합하고, hIL-13과 hIL-13r간의 상호작용을 조절하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공된다.
특정 구체예에서, 본 발명의 항체는 hIL-13과 hIL-13R의 상호작용을 적어도 억제시키며, 또한, hIL-13과 hIL-13R의 상호작용을 차단하여, hIL-13/hIL-13R 시그널 경로를 해체시킨다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 CDRH3이 SEQ ID NO:3의 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 추가의 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 추가로, 하기 서열중 하나 이상을 포함한다: CDRH2: SEQ ID NO:2, CDRH1: SEQ ID NO:1, CDRAL: SEQ ID NO:4, CDRL2: SEQ ID NO:5 및 CDRL3: SEQ ID NO:6. 추가의 구체예에서, 본 발명은 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간화된 항체 또는 이의 단편으로서 이들 CDR 서열을 추가로 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 하기를 포함하며, hIL-13에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다:
CDRAH1: SEQ ID NO: 1
CDRAH2: SEQ ID NO: 2
CDRAH3: SE ID NO: 3
CDRL1: SEQ ID NO: 4
CDRL2: SEQ ID NO: 5
CDRL3: SEQ ID NO: 6
본 발명의 일 구체예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편중 하나 이상은 상기 기술된 서열의 CDR의 변이체를 포함할 수 있다. 각각의 변이체 CDR은 상기 기술된 서열의 상응하는 위치에서의 아미노산 잔기와 상이한 1 또는 2개의 아미노산 잔기를 포함할 것이다. 아미노산 잔기에서 이러한 치환된 보존적 치환 예를 들어, 하나의 소수성 아미노산을 또 다른 소수성 아미노산으로의 치환 예를 들어, 류신의 발린 또는 이소류신으로의 치환일 수 있다.
본 명세서에 걸쳐, 항체 서열중의 아미노산 잔기는 Kabat 법에 따라 넘버링된다. 유사하게는, 용어 "CDR", "CDRL1", "CDRL2", "CDRL3", "CDRH1", "CDRH2", "CDRH3"는 중쇄의 30번 위치가 CDR의 일부로서 취해진다는 것을 제외하고는 문헌 [Kabat et al; Sequences of proteins of Immunological Interest NIH, 1987]에 기술된 Kabat 넘버링 시스템에 따른다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "포함하는" 및 "포함하여"는 "구성된" 및 "이루어지는"과 혼용되어 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, SEQ ID NO:7의 서열을 포함하는 VH 도메인 및 SEQ ID NO:8의 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, SEQ ID NO: 7, 11, 12, 13 및 14로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 항체의 분리된 VH 도메인이 제공된다. 일 구체예에서, 항체의 분리된 VH 도메인은 SEQ ID NO: 7, 11, 12, 13 및 14로 이루어진 군으로부터 선택된 항체의 분리된 VH 도메인으로 필수적으로 구성된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, SEQ ID NO: 7, 11, 12, 13 및 14로 구성된 군으로부터 선택된 VH 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, hIL-13과 hIL-13R의 상호작용을 적어도 억제하며, hIL-13에 특이적으로 결합하는 항체로서, SEQ ID NO:18의 중쇄 및 SEQ ID NO: 22, 23 및 24로 구성된 군으로부터 선택된 경쇄를 포함하는 항체가 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, hIL-13에 특이적으로 결합하고, hIL-13과 hIL-13R간의 상호작용을 적어도 억제하는 항체로서, SEQ ID NO: 19의 중쇄 및 SEQ ID NO: 22, 23 및 24로 구성된 군으로부터 선택된 경쇄를 포함하는 항체가 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, hIL-13에 특이적으로 결합하고, hIL-13과 hIL-13R간의 상호작용을 적어도 억제하는 항체로서, SEQ ID NO:20의 중쇄 및 SEQ ID NO: 22, 23 및 24로 구성된 군으로부터 선택된 경쇄를 포함하는 항체가 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, hIL-13에 특이적으로 결합하고, hIL-13과 hIL-13R간의 상호작용을 적어도 억제하는 항체로서, SEQ ID NO:21의 중쇄 및 SEQ ID NO: 22, 23 및 24로 구성된 군으로부터 선택된 경쇄를 포함하는 항체가 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, SEQ ID NO:18의 중쇄 및 SEQ ID NO:22의 경쇄를 포함하는 항체의 hIL-13의 결합을 억제하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명에 있어서, SEQ ID NO: 11의 VH 도메인 및 SEQ ID NO: 15, 16 및 17로 구성된 군으로부터 선택된 VL 도메인을 포함하는 인간화된 항체를 제공한다.
본 발명에 있어서, SEQ ID NO: 12의 VH 도메인 및 SEQ ID NO: 15, 16 및 17로 구성된 군으로부터 선택된 VL 도메인을 포함하는 인간화된 항체를 제공한다.
본 발명에 있어서, SEQ ID NO: 13의 VH 도메인 및 SEQ ID NO: 15, 16 및 17로 구성된 군으로부터 선택된 VL 도메인을 포함하는 인간화된 항체를 제공한다.
본 발명에 있어서, SEQ ID NO: 14의 VH 도메인 및 SEQ ID NO: 15, 16 및 17로 구성된 군으로부터 선택된 VL 도메인을 포함하는 인간화된 항체를 제공한다.
본 발명에 있어서, SEQ ID NO: 90, 99, 102, 103, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112 및 114의 펩티드에 결합하나, SEQ ID NO: 100, 101, 104 및 113의 펩티드에는 결합하지 않는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공되며, 여기서, 결 합은 본원에 예시된 항체 예를 들어, 실시예 6.4에 제시된 ELISA 검정법에서 인간 IL-13 펩티드로의 3G4 결합에 대한 유사한 결합 활성을 보유하는 항체와 동등한 결합 활성을 갖는 것으로 규정된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, hIL-13과 hIL-13R의 상호작용의 조절에 대해 반응적인 질환 또는 질병 (예컨대, 천식, COPD, 알레르기 비염, 아토피성 피부염)에 걸린 인간 환자를 치료하는 방법으로서, 상기 환자에 본원에 기술된 바와 같은 치료학적 유효량의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 투여하는 단계를 포함한다.
hIL-13과 hIL-13R의 상호작용의 완화에 대해 반응적인 질환 또는 질병을 치료하기 위한 의약의 제조시 항체의 용도가 또한, 제공된다.
추가의 양태에서, 본 발명은 치료시 사용하기에 적합한 항-IL13 항체를 선택하는 방법으로서, i) IL-13Rα1에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하고; ii) 항체가 IL-13Rα2에 특이적으로 결합하는지의 여부를 측정하고, 추가의 개발을 위해 단계 ii)에서 결합하는 항체를 선택하는 것을 포함하는 방법이 제공된다.
본 발명의 항체는 본래의 항체 또는 이의 단편; 인간, 키메라 또는 인간화된 항체; 및 단일특이적 또는 이중특이적 항체일 수 있다.
1. 항체 구조
1.1. 본래 항체
본래의 항체는 적어도 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 헤테로멀티머 글리코단백질을 포함한다. IgM을 제외하고, 본래의 항체는 일반적으로, 두개의 동일한 경쇄 (L) 및 두개의 동일한 중쇄 (H)로 구성된 약 150Kda의 헤테로테트라머 글리코단백질이다. 전형적으로, 각각의 경쇄는 하나의 공유 이황화 결합에 의해 중쇄에 연결되며, 상이한 면역글로불린 이소형의 중쇄간의 이황화 결합의 수는 다양하다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한, 주쇄 이황화 결합을 갖는다. 각각의 중쇄는 한 말단에 가변 도메인 (VH) 및 이어서, 다수의 불변 영역을 갖는다. 각각의 경쇄는 가변 도메인 (VL) 및 이의 양 말단에 불변 영역을 가지며; 경쇄의 불변 연역은 중쇄의 제 1 불변 영역과 정렬되며, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 대부분의 척추동물종으로부터의 항체의 경쇄는 불변 영역의 아미노산 서열에 기초한 카파 및 람다로 불리는 두개의 유형중 하나에 정렬될 수 있다. 이의 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 따라, 인간 항체는 5개의 상이한 부류 즉, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로 할당될 수 있다. IgG 및 IgA는 추가로 하위 부류 즉, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4; 및 IgA1 및 IgA2로 세분될 수 있다. 종 변이체는 적어도 IgG2a, IgG2b를 갖는 마우스 및 래트로 존재한다. 항체의 가변 도메인은, 특정 영역을 갖는 항체가 상보성 결정 부위 (CDR)로 불리는 특정 변이성을 나타내는 특정 영역을 가질 경우 결합 특이성에 기여한다. 가변 영역의 더욱 보존적인 부분은 프레임워크 영역 (FR)으로 불린다. 본래의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 3개의 CDR에 의해 연결된 4개의 FR을 포함한다. 각 사슬에서 CDR은 FR 영역에 근접하여 함께 고정되며, 다른 사슬로부터의 CDR은 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다. 불변 영역은 항체의 항원으로의 결합에 직접적으로 관련되나, 항체 의존적 세포-매개된 세포독성 (ADCC), Fcγ 수용체로의 결합을 통한 대식작용, 신생아 Fc 수용체 (FcRn)를 통한 반감기/제거 율 및 보체 경로의 C1q 성분을 통한 상보적 독립적 세포독성과 같은 다양한 이펙터 작용을 나타낸다.
따라서, 일 구체예에서, 본 발명자들은 hIL-13에 특이적으로 결합하는 본래의 항체를 제공하며, 항체는 hIL-13과 hIL-13R의 상호작용을 조절하며 예를 들어, 항체는 hIL-13과 이의 수용체간의 상호작용을 억제한다. 본래의 항체는 상기 기술된 이소형의 불변 영역 또는 이의 하위부를 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 항체는 IgG 이소형이며, 특히 IgG1이다. 항체는 래트, 마우스, 래빗, 영장류 또는 인간일 수 있다. 일 전형적 구체예에서, 항체는 영장류 (예를 들어, 사이노몰구스, 올드 월드 멍키 또는 유인원, 예를 들어, WO99/55369, WO93/02108 참조) 또는 인간이다.
또 다른 구체예에서, SEQ ID NO:3의 CDRH3을 포함하는 분리된 본래의 항체가 제공된다. 또 다른 구체예에서, SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 및 6의 CDR을 포함하는 가변 영역을 포함하는 본래의 항체가 제공된다.
또 다른 구체예에서, SEQ ID NO:7의 서열을 포함하는 VH 도메인 및 SEQ ID NO:8의 서열의 VL 도메인을 포함하는 분리된 뮤린 본래의 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공된다.
1.1.2 인간 항체
인간 항체는 당업자에게 공지된 많은 방법에 의해 생성될 수 있다. 인간 항체는 인간 골수종 또는 마우스-인간 이종골수종 세포주를 사용한 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있다 (Kozbor J.Immunol 133, 3001 , (1984) and Brodeu^ Monoclonal 항체 Production Techniques and Applications, pp51-63 (Marcel Dekker Inc, 1987). 대안적 방법은 인간 V 영역 레퍼토리를 사용하는 파아지 라이브러리 또는 유전자 도입 마우스의 사용을 포함한다 (Winter G, (1994), Annu.Rev.lmmunol 12,433-455, Green LL (1999), J. Immunol. methods 231 , 11-23).
마우스 면역글로불린 로커스는 인간 면역글로불린 유전자 세그먼트로 대체된 여러 계통의 유전자이식 마우스가 현재 입수가능하다 (Tomizuka K, (2000) PNAS 97,722-727; Fishwild D. M (1996) Nature Biotechnol. 14,845-851 , Mendez MJ, 1997, Nature Genetics, 15,146-156). 항원 자극시, 이러한 마우스는 인간 항체의 레퍼토리를 생성할 수 있으며, 이러한 항체로부터 대상 항체가 선택될 수 있다. 특히, 인간 림프구가 조사된 마우스로 이식된 트리메라 (TM) 시스템 (Eren R et al, (1998) Immunology 93:154-161), 인간 (또는 다른 종) 림프구가 대량의 풀링된 실험관내 항체 생성 공정을 통해 효과적으로 유입되고 분리되며, 제한 희석 및 선택 공정에 의해 선택된 림프구 항체 시스템 (the Selected Lymphocyte Antibody System) (SLAM, Babcook et a/, PNAS (1996) 93:7843-7848), 및 제노마우스 II (the Xenomouse II)(TM) (Abgenix Inc)를 주목하라. 대안적인 방법이 모르포도마 (MorphodomaTM) 기법을 사용하여 모르포테크 인크 (Morphotek Inc)로부터 이용가능하다.
파아지 디스플레이 기법은 인간 항체 (및 이의 단편)을 생성하는데 이용될 수 있다 (McCafferty; Nature, 348, 552-553 (1990) and Griffiths AD et al (1994) EMBO 13:3245-3260). 이러한 기법에 따라, 항체 V 도메인 유전자는 섬유성 박테리오파아지 예컨대, M13 또는 fd의 단백질 유전자의 주요 또는 부 코트내로 프레임에 클로닝되며, 파아지 입자의 표면상에 작용성 항체 단편으로서 (일반적으로, 헬퍼 파아지의 도움으로) 디스플레이된다.
항체의 작용성에 기초한 선택은 이들 특성을 나타내는 항체를 엔코딩하는 유전자의 선택을 유도한다. 파아지 디스플레이 기법은 상기 기술된 질환 또는 질병을 갖는 개체로부터 취해진 인간 B 세포로부터 제조된 라이브러리 또는 대안적으로, 면역화된 인간 공여체로부터의 항원 특이적 항체를 선택하는데 사용될 수 있다 (Marks; J. MoI. Bio. 222,581-597, 1991). Fc 도메인을 포함하는 본래의 인간 항체가 요망되는 경우, 디스플레이된 파아지 유래된 단편을 목적하는 불변 영역을 포함하고, 안정한 발현 세포주를 확립하는 포유류 발현 벡터로 재클로닝하는 것이 필요하다. 친화도 성숙 기법 (Marks; Bio/technol 10,779-783 (1992))은 결합 친화도를 증가시키는데 사용될 수 있으며, 여기서 일차 인간 항체의 친화도는, 연속적으로 H 및 L 사슬 V 영역을 천연 발생 변이부로 대체하고, 증가된 결합 친화도에 기초하여 선택함으로써 증가될 수 있다. 이러한 기법 예컨대, "에피토프 임프린팅 (epitope imprinting)"의 변이체는 현재 이용가능하다 (WO 93/06213). 또한, 문헌 [Waterhouse; Nucl.Acids Res 21 , 2265-2266 (1993)] 참조.
이와 같이, 또 다른 구체예에서, hIL-13에 특이적으로 결합하며, hIL-13과 hIL-13R의 상호작용을 조절하는 즉, hIL-13과 이의 수용체간의 상호작용을 억제하는 분리된 인간 본래의 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공된다.
이와 같이, 또 다른 구체예에서, hIL-13에 특이적으로 결합하며, hIL-13과 hIL-13R의 상호작용을 완화시키는 예를 들어, hIL-13과 이의 수용체간의 상호작용을 억제하는 SEQ ID NO:3의 CDRH3을 포함하는 분리된 인간 본래의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 또 다른 양태에서, 상기 규정된 바와 같은 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 및 6의 CDR을 포함하는 가변 영역을 포함하는 분리된 인간 본래의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
1.2 키메라 및 인간화된 항체
인간 질환 또는 질병의 치료에서 본래의 비인간 항체의 용도는 면역원성의 잘 성립된 문제점에 대한 가능성을 수반하며, 즉 환자의 면역계는 비자가 항체로서 비인간 본래의 항체를 인지할 수 있으며, 중화 반응을 준비할 수 있다. 이는 특히, 인간 환자에 대한 비인간 항체의 다중 투여시 입증된다. 다양한 기법이 이들 문제점을 극복하기 위해 수년에 걸쳐 개발되었으며, 일반적으로 본래 항체에서 비인간 아미노산 서열의 조성물을 감소시키면서 면역화된 동물 예를 들어, 마우스, 래트 또는 래빗으로부터 비인간 항체를 수득하는데 있어서 상대적 용이성을 보유하는 것을 포함한다. 넓게는, 이를 달성하기 위해 두 기법이 이용되었다. 첫번째는 일반적으로 인간 불변 영역에 융합된 비인간 (예를 들어, 설치류 예컨대, 마우스) 가변 도메인을 포함하는 키메라 항체이다. 항체의 항원-결합 부위가 가변 영역내에 위치하기 때문에, 키메라 항체는 항원에 대한 이의 결합 친화도를 보유하며, 인간 불변 영역의 이펙터 작용을 획득하여 상기 기술된 바와 같은 이펙터 작용을 수행할 수 있다. 키메라 항체는 전형적으로 재조합 DNA 방법을 이용하여 생성된다. 항체를 엔코딩하는 DNA (예를 들어, cDNA)가 통상적인 공정 (예를 들어, 본 발명의 항체의 H 및 L 사슬을 엔코딩하는 유전자 예를 들어, 상기 기술된 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 및 6을 엔코딩하는 DNA에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고누클레오티드 프로브를 사용함으로써) 분리되고 시퀀싱된다. 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 전형적인 공급원으로서 작용한다. 일단 분리되면, DNA는 발현 벡터에 위치하며, 이어서 항체의 합성을 달성하기 위한 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 숙주 세포 예컨대, E.Coli, COS 세포, CHO 세포 또는 골수종 세포로 트랜스펙션된다. DNA는 인간 L 및 H 사슬에 대한 코딩 서열을 반응하는 비인간 (예를 들어, 뮤린) H 및 L 불변 영역으로 치환함으로써 변형된다 (예를 들어, 문헌 [Morrison; PNAS 81 , 6851 (1984)] 참조).
제 2 방법은 인간화된 항체의 생성법을 포함하며, 여기서 항체의 비인간 내용물은 가변 영역을 인간화함으로써 감소된다. 인간화를 위한 두 기법은 대중성을 갖는다. 첫번째는 CDR 그래프팅에 의한 인간화이다. CDR은 항체의 N-말단에 밀접한 루프를 수립하며, 여기서 이들은 프레임워크 영역에 의해 제공된 골격에 끼워진 표면을 형성한다. 항체의 항원-결합 특이성은 이의 CDR 표면의 화학적 특성 및 토포그래피에 의해 주로 규정된다. 이어서, 이들 특징이 개별 CDR의 형태, CDR의 상대적 배치, 및 CDR을 포함하는 잔기의 측쇄의 특성 및 배치에 의해 결정된다. 면역원성의 큰 감소는, 단지 비인간 (예를 들어, 뮤린) 항체 ("공여체" 항체)의 CDR을 인간 프레임워크 ("수용체 프레임워크") 및 불변 영역으로 그래프팅시킴으로써 달성될 수 있다 (문헌 [Jones et al (1986) Nature 321 ,522-525 and Verhoeyen M et a/ (1988) Science 239, 1534-1536] 참조). 그러나, CDR 그래프팅 자체는 항원-결합 특성을 완전하게 유지시키지 못할 수 있으며, 현저한 항원 결합 친화도가 회복되는 경우, 공여체에 항체의 일부 프레임워크 잔기 (때때로 "복귀 돌연변이"로 불림)가 인간화된 분자중에 보존되어야 함이 종종 발견되었다 (문헌 [Queen C et al (1989) PNAS 86, 10,029-10,033, Co, M et al (1991) Nature 351, 501-502] 참조). 이러한 경우, 비인간 공여체 항체에 대한 가장 큰 서열 상동성을 나타내는 인간 V 영역은 인간 프레임워크 (FR)를 제공하기 위해 데이타베이스로부터 선택된다. 인간 FR의 선택은 인간 컨센서스 또는 개별 인간 항체로부터 이루어진다. 필요에 따라, 공여체 항체로부터의 필요한 주요 잔기가 인간 수용체 프레임워크로 치환되어 CDR 형태가 보존된다. 항체의 컴퓨터 모델링을 사용하여 이러한 구조적으로 중요한 잔기를 확인하는 것을 도울 수 있다 (WO99/48523 참조). 대안적으로, 인간화는 "베니어링 (veneering)" 공정에 의해 달성될 수 있다. 독특한 인간 및 뮤린 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 통계학적 분석에 의해, 노출된 잔기의 정확한 패턴이 인간 항체와 뮤린 항체에서 상이하며, 대부분의 개별적 표면 위치는 더 적은수의 상이한 잔기에 대한 강한 선호도를 갖는다 (예를 들어, 문헌 [Padlan E.A. et al; (1991) MoI. lmmunol.28, 489-498 and Pedersen JT. et al (1994) J. MoI. Biol. 235; 959- 973] 참조). 따라서, 인간 항체에서 일반적으로 발견되는 것과 상이한 프레임워크 영역내의 노출된 잔기를 대체함으로써 비인간 Fv의 면역원성을 저하시키는 것이 가능하다. 단백질 항원성이 표면 접근성과 관련있을 수 있기 때문에, 표면 잔기의 치환은 "내밀한 (invisible)" 마우스 가변 영역이 인간 면역 시스템을 띠게하는데 충분할 것이다 (문헌 [Mark G. E. et al (1994) in Handbook of Experimental Pharmacology vol.113: The pharmacology of monoclonal Antibodies, Springer-Verlag, pp105-134] 참조). 인간화의 이러한 공정은 단지 항체의 표면만 변경되고, 지지 잔기는 교란되지 않고 유지되기 때문에 "베니어링"으로 불린다.
당업자는 항체 인간화의 또 다른 방법이 존재하며 문헌으로부터 이용가능하다는 것을 인지하고 있을 것이다.
이와 같이, 본 발명의 또 다른 구체예는, hIL-13에 특이적으로 결합하며, hIL-13과 hIL-13R의 상호작용을 조절하는 예를 들어, hIL-13과 이의 수용체간의 상호작용을 억제하는 (아마도, IgG 이소형 예를 들어, IgG1의) 인간 불변 영역에 융합된 비인간 (예를 들어, 설치류) 가변 도메인을 포함하는 키메라 항체를 제공한다.
또 다른 구체예에서, hIL-13에 특이적으로 결합하는 비인간 (예를 들어, 설치류) 가변 영역 및 (아마도, IgG 이소형 예를 들어, IgG1의) 인간 불변 영역을 포함하는 키메라 항체로서, SEQ ID NO: 3의 CDRH3을 추가로 포함하는 항체를 제공한다. 이러한 항체는 추가로, IgG 이소형 예를 들어, IgG1의 인간 불변 영역을 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에서, SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 및 6의 CDR을 포함하는 hIL-13에 특이적으로 결합하는 (아마도, IgG 이소형 예를 들어, IgG1의) 인간 불변 영역 및 비인간 (예를 들어, 설치류) 가변 영역을 포함하는 키메라 항체이다.
또 다른 구체예에서, SEQ ID NO:7의 VH 도메인 및 SEQ ID NO:8의 VL 도메인, 및 hIL-13에 특이적으로 결합하며, hIL-13과 hIL-13R의 상호작용을 조절하는 예를 들어, hIL-13과 이의 수용체간의 상호작용을 억제하는 IgG 이소형 예를 들어, IgG1의 인간 불변 영역을 포함하는 키메라 항체가 제공된다.
또 다른 구체예에서, hIL-13에 특이적으로 결합하며, hIL-13과 hIL-13R의 상호작용을 조절하는 예를 들어, hIL-13과 이의 수용체간의 상호작용을 억제하는 인간화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공된다.
또 다른 구체예에서, hIL-13에 특이적으로 결합하며, SEQ ID NO:3의 CDRH3을 포함하는 인간화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공된다. 이러한 항체는 IgG 이소형 예를 들어, IgG1의 인간 불변 영역을 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에서, hIL-13에 특이적으로 결합하며, SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 및 6의 CDRH3을 포함하는 인간화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공된다. 이러한 항체는 IgG 이소형 예를 들어, IgG1의 인간 불변 영역을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, SEQ ID NO:11의 군으로부터 선택된 VH 도메인 및 SEQ ID NO: 15, 16, 17의 군으로부터 선택된 VL 도메인을 포함하는 인간화된 항체가 제공된다. 이러한 항체는 IgG 이소형 예를 들어, IgG1의 인간 불변 영역을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, SEQ ID NO:12의 군으로부터 선택된 VH 도메인 및 SEQ ID NO: 15, 16, 17의 군으로부터 선택된 VL 도메인을 포함하는 인간화딘 항체가 제공된다. 이러한 항체는 IgG 이소형 예를 들어, IgG1의 인간 불변 영역을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, SEQ ID NO:13의 군으로부터 선택된 VH 도메인 및 SEQ ID NO: 15, 16, 17의 군으로부터 선택된 VL 도메인을 포함하는 인간화딘 항체가 제공된다. 이러한 항체는 IgG 이소형 예를 들어, IgG1의 인간 불변 영역을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, SEQ ID NO:14의 군으로부터 선택된 VH 도메인 및 SEQ ID NO: 15, 16, 17의 군으로부터 선택된 VL 도메인을 포함하는 인간화딘 항체가 제공된다. 이러한 항체는 IgG 이소형 예를 들어, IgG1의 인간 불변 영역을 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에서, SEQ ID NO: 11의 VH 도메인 및 SEQ ID NO: 15의 VL 도메인을 포함하는 인간화된 항체가 제공된다.
또 다른 구체예에서, SEQ ID NO: 12의 VH 도메인 및 SEQ ID NO: 15의 VL 도메인을 포함하는 인간화된 항체가 제공된다.
또 다른 구체예에서, SEQ ID NO: 13의 VH 도메인 및 SEQ ID NO: 15의 VL 도메인을 포함하는 인간화된 항체가 제공된다.
또 다른 구체예에서, SEQ ID NO: 14의 VH 도메인 및 SEQ ID NO: 15의 VL 도메인을 포함하는 인간화된 항체가 제공된다.
또 다른 구체예에서, SEQ ID NO: 11의 VH 도메인 및 SEQ ID NO: 16의 VL 도메인을 포함하는 인간화된 항체가 제공된다.
또 다른 구체예에서, SEQ ID NO: 12의 VH 도메인 및 SEQ ID NO: 16의 VL 도메인을 포함하는 인간화된 항체가 제공된다.
또 다른 구체예에서, SEQ ID NO: 13의 VH 도메인 및 SEQ ID NO: 16의 VL 도메인을 포함하는 인간화된 항체가 제공된다.
또 다른 구체예에서, SEQ ID NO: 14의 VH 도메인 및 SEQ ID NO: 16의 VL 도메인을 포함하는 인간화된 항체가 제공된다.
또 다른 구체예에서, SEQ ID NO: 11의 VH 도메인 및 SEQ ID NO: 17의 VL 도메인을 포함하는 인간화된 항체가 제공된다.
또 다른 구체예에서, SEQ ID NO: 12의 VH 도메인 및 SEQ ID NO: 17의 VL 도메인을 포함하는 인간화된 항체가 제공된다.
또 다른 구체예에서, SEQ ID NO: 13의 VH 도메인 및 SEQ ID NO: 17의 VL 도메인을 포함하는 인간화된 항체가 제공된다.
또 다른 구체예에서, SEQ ID NO: 14의 VH 도메인 및 SEQ ID NO: 17의 VL 도메인을 포함하는 인간화된 항체가 제공된다.
또 다른 구체예에서, hIL-13에 특이적으로 결합하는 인간화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공되며, 상기 항체 또는 이의 단편은 SEQ ID NO:3의 CDRH3을 포함하며, 여기서, 인간 수용체 중쇄 프레임워크의 10, 30, 67, 69, 71, 73 및 93번 위치의 잔기로 이루어진 군으로부터 선태고딘 잔기중 하나 이상 및 인간 수용체 경쇄 프레임워크의 76 및 98번 위치의 잔기중 하나 또는 둘 모두는 CDRH3이 유래된 공여체 항체 프레임워크 (SEQ ID NO:7)에서 발견되었다.
또 다른 구체예에서, hIL-13에 특이적으로 결합하는 인간화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공되며, 상기 항체 또는 이의 단편은 SEQ ID NO:3의 CDRH3 및 선택적으로, SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5 및 6의 하나 이상의 CDR을 포함하며, 여기서, 인간 중쇄 프레임워크는 하기 잔기 (또는 이의 보존적 치환체)중 하나 이상을 포함하며;
위치 잔기
10 D
30 I
67 A
69 L
71 A
73 K
93 T
경쇄 프레임워크는 하기 잔기 (또는 이의 보존적 치환체)중 하나 또는 둘 모두를 포함한다:
76 N
98 L
용어 "유래된"은 물질에 대한 물리적 기원의 견지에서의 공급원 뿐만 아니라, 상기 물질과 (일차 아미노산 서열에 있어서) 구조적으로 동일하나, 기준 공급원으로부터 유래되지 않은 물질을 규정하는 것으로 의도됨이 당업자에게는 자명할 것이다. "CDRH3이 유래된 공여체 항체에서 발현된 잔기"는 공여체 항체로부터 반드시 정제될 필요가 없다.
특정 아미노산 치환은 "보존적"인 것으로 간주됨이 당업자에게 자명할 것이다. 아미노산은 공통된 측쇄 특성에 기초하여 군으로 나누어지며, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 결합 친화도를 모두 또는 실질적으로 모두 유지하는 군내의 치환은 보존적 치환으로서 간주된다. 하기 표 1 참조:
표 1
측쇄 구성원
소수성 met, ala, val, leu, ile
중성 친수성 cys, ser, thr
산성 asp, glu
염기성 asn, gln, his, lys, arg
사슬 배향에 영향을 끼치는 잔기 gly, pro
방향족 trp, tyr, phe
본 발명에 있어서, SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄 및 SEQ ID NO: 22, 23, 24로 구성된 군으로부터 선택된 경쇄를 포함하는 인간화된 항체가 제공된다.
본 발명의 일 구체예에서, SEQ ID NO:18의 중쇄 및 SEQ ID NO:22의 경쇄를 포함하는 hIL-13에 특이적으로 결합하는 인간화된 항체가 제공된다.
본 발명의 일 구체예에서, SEQ ID NO:19의 중쇄 및 SEQ ID NO:22의 경쇄를 포함하는 hIL-13에 특이적으로 결합하는 인간화된 항체가 제공된다.
본 발명의 일 구체예에서, SEQ ID NO:20의 중쇄 및 SEQ ID NO:22의 경쇄를 포함하는 hIL-13에 특이적으로 결합하는 인간화된 항체가 제공된다.
본 발명의 일 구체예에서, SEQ ID NO:21의 중쇄 및 SEQ ID NO:22의 경쇄를 포함하는 hIL-13에 특이적으로 결합하는 인간화된 항체가 제공된다.
본 발명의 일 구체예에서, SEQ ID NO:18의 중쇄 및 SEQ ID NO:23의 경쇄를 포함하는 hIL-13에 특이적으로 결합하는 인간화된 항체가 제공된다.
본 발명의 일 구체예에서, SEQ ID NO:19의 중쇄 및 SEQ ID NO:23의 경쇄를 포함하는 hIL-13에 특이적으로 결합하는 인간화된 항체가 제공된다.
본 발명의 일 구체예에서, SEQ ID NO:20의 중쇄 및 SEQ ID NO:23의 경쇄를 포함하는 hIL-13에 특이적으로 결합하는 인간화된 항체가 제공된다.
본 발명의 일 구체예에서, SEQ ID NO:21의 중쇄 및 SEQ ID NO:23의 경쇄를 포함하는 hIL-13에 특이적으로 결합하는 인간화된 항체가 제공된다.
본 발명의 일 구체예에서, SEQ ID NO:18의 중쇄 및 SEQ ID NO:24의 경쇄를 포함하는 hIL-13에 특이적으로 결합하는 인간화된 항체가 제공된다.
본 발명의 일 구체예에서, SEQ ID NO:19의 중쇄 및 SEQ ID NO:24의 경쇄를 포함하는 hIL-13에 특이적으로 결합하는 인간화된 항체가 제공된다.
본 발명의 일 구체예에서, SEQ ID NO:20의 중쇄 및 SEQ ID NO:24의 경쇄를 포함하는 hIL-13에 특이적으로 결합하는 인간화된 항체가 제공된다.
본 발명의 일 구체예에서, SEQ ID NO:21의 중쇄 및 SEQ ID NO:24의 경쇄를 포함하는 hIL-13에 특이적으로 결합하는 인간화된 항체가 제공된다.
본 발명의 일 구체예에서, SEQ ID NO: 1-3의 CDR 각각을 포함하는 인간 또는 인간화된 중쇄 가변 영역이 제공된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 인간 중쇄 가변 영역의 더 큰 서열내에 SEQ ID NO: 1-3의 CDR을 포함하는 인간화된 중쇄 가변 영역이 제공된다. 또 다른 구체예에서, 인간화된 중쇄 가변 영역은 뮤린 3G4 공여체 항체 중쇄 가변 영역 (SEQ ID NO: 7)과 프레임워크 영역에서 40% 초과, 또는 50% 초과, 또는 60% 초과, 또는 65% 초과의 동일성을 갖는 수용체 항체 프레임워크내에 SEQ ID NO: 1-3의 CDR을 포함한다.
본 발명의 일 양태에서, 항체는 위치 10, 30, 67, 69, 71, 73, 93번 (Kabat 넘버링 시스템)중 하나 이상에서 다수의 치환체를 추가로 포함하는 SEQ ID NO. 44의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하며; 여기서 각각의 치환된 아미노산 잔기는 SEQ ID NO.7 (공여체 항체 3G4의 중쇄 가변 영역)의 동일한 위치에서의 아미노산 잔기로 치환되며, 치환체의 수는 0 내지 7개이다. 또 다른 구체예에서, 치환체의 수는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7이다.
본 발명의 일 구체예에서, SEQ ID NO.4-6의 CDR 각각을 포함하는 인간 또는 인간화된 경쇄 가변 영역이 제공된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 인간 경쇄 가변 영역의 더 큰 서열내에 SEQ ID NO: 4-6의 CDR을 포함하는 인간화된 경쇄 가변 영역이 제공된다. 또 다른 구체예에서, 인간화된 경쇄 가변 영역은 뮤린 3G4 공여체 항체 중쇄 가변 영역 (SEQ ID NO.8)과 프레임워크에서 40% 초과, 50% 초과, 60% 초과, 또는 65% 초과의 동일성을 갖는 수용체 항체 프레임워크내에 SEQ ID NO: 4-5의 CDR을 포함한다.
본 발명의 일 양태에서, 항체는 위치 76, 98번 (Kabat 넘버링 시스템)중 하나 이상에서 다수의 치환체를 추가로 포함하는 SEQ ID NO. 45의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며; 여기서 각각의 치환된 아미노산 잔기는 SEQ ID NO. 8 (공여체 항체 3G4의 경쇄 가변 영역)의 동일한 위치에서의 아미노산 잔기로 치환되며, 치환체의 수는 0 내지 2개이다. 또 다른 구체예에서, 치환체의 수는 0, 1 또는 2이다.
1.3 이중특이적 항체
이중특이적 항체는 2개 이상의 상이한 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖는 항체이다. 이러한 항체를 제조하는 방법은 당해분야에 공지되어 있다. 전형적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생성법은 두개의 면역글로불린 H 사슬 - L 사슬 쌍의 상호발현에 기초하며, 여기서, 두개의 H 사슬은 상이한 결합 특이성을 갖는다 (문헌 [Millstein et al, Nature 305 537-539 (1983), WO93/08829 and Traunecker et al EMBO, 10, 1991, 3655-3659] 참조). H 및 L 사슬의 무작위 분류로 인해, 10개의 상이한 항체 구조의 잠재적 혼합이 생성되며, 이중 단지 하나만이 목적하는 결합 특이성을 갖는다. 대안적인 방법은 목적하는 결합 특이성을 갖는 가변 도메인을 힌지 영역, CH2 및 CH3 영역중 적어도 일부를 포함하는 중쇄 불변 영역에 융합시키는 것을 포함한다. 하나 이상의 융합에 존재하는 경쇄 결합에 요구되는 부위를 함유하는 CH1 영역을 갖는 것이 바람직하다. 이러한 작용부를 엔코딩하는 DNA, 및 필요에 따라, L 사슬이 별도의 발현 벡터로 삽입된 후, 적합한 숙주 유기체로 공동트랜스펙션된다. 2개 또는 모든 3개 사슬에 대한 코딩 서열을 하나의 발현 벡터로 삽입하는 것이 가능하다. 하나의 바람직한 방법에서, 이중특이적 항체는 하나의 암 (arm) 및 H-L 사슬 쌍에서 제 1 결합 특이성을 갖는 H 사슬로 이루어지며, 단 제 2 결합 특이성은 다른 암에 존재한다. WO94/04690 참조. 또한, 문헌 [Suresh et al Methods in Enzymology 121 , 210, 1986] 참조.
본 발명의 일 구체예에서, hIL-13에 대해 하나 이상의 결합 특이성을 갖는 이중특이적 항체가 제공되며, 상기 항체는 hIL-13과 IL-13R간의 상호작용을 조절하며 예를 들어, hIL-13과 이의 수용체간의 상호작용을 억제한다. 이러한 항체는 추가로, IgG 이소형 예를 들어, IgG1의 인간 불변 영역을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 이중특이적 치료학적 항체는 hIL-13에 대해 제 1 결합 특이성을 가지며, hIL-13과 hIL-13R간의 상호작용을 조절하며, 예를 들어, hIL-13과 이의 수용체간의 상호작용을 억제시키며, hIL-4에 대해 제 2 결합 특이성을 가지며, hIL-4와 hIL-4에 대한 수용체간의 상호작용을 조절하며, 예를 들어, hIL-4와 이의 수용체간의 상호작용을 억제시킨다.
본 발명의 일 구체예에서, hIL-13에 대해 하나 이상의 결합 특이성을 갖는 이중특이적 항체가 제공되며, 상기 항체는 SEQ ID NO:3의 CDRH3을 포함한다. 이러한 항체는 IgG 이소형 예를 들어, IgG1의 인간 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, hIL-13에 대해 하나 이상의 결합 특이성을 갖는 이중특이적 항체가 제공되며, 상기 항체는 적어도 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 및 6의 CDR을 포함한다. 이러한 항체는 IgG 이소형 예를 들어, IgG1의 인간 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다.
1.4 항체 단편
본 발명의 특정 구체예에서, hIL-13과 hIL-13R의 상호작용을 조절하는 항체 단편, 예를 들어, hIL-13과 이의 수용체간의 상호작용을 억제시키는 항체 단편이 제공된다. 이러한 단편은 본래의 및/또는 인간화된 및/또는 키메라 항체의 작용성 항원 결합 단편 예컨대, 상기 기술된 항체의 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, ScFv 단편일 수 있다. 전형적으로, 이러한 단편은 예를 들어, 파파인 분해에 의한 본래의 항체의 단백질 분해에 의해 생성되며, 재조합적으로 형질전환된 숙주 세포로부터 직접적으로 생성될 수 있다. ScFv의 생성에 있어서는 문헌 [Bird et al;(1988) Science, 242, 423-426] 참조. 또한, 항체 단편은 하기 기술된 바와 같이 다양한 엔지니어링 기법을 사용하여 생성될 수 있다.
Fv 단편은 Fab 단편 보다 이들의 두 사슬의 상호작용 에너지가 더 낮은것으로 보여진다. VH와 VL 도메인의 결합을 안정화시키기 위해, 이들은 펩티드 (Bird et al, (1988) Science 242, 423-426, Huston et al, PNAS, 85, 5879-5883), 이황화물 결합 (Glockshuber et al, (1990) Biochemistry, 29, 1362-1367) 및 "놉 인 홀 (knob in hole)" 변이 (Zhu et al (1997), Protein ScL, 6, 781-788)로 연결되었다. ScFv 단편은 당업자에게 널리 공지된 방법에 의해 생성될 수 있다 (문헌 [Whitlow et al (1991 ) Methods companion Methods Enzymol, 2, 97-105 and Huston et al (1993) Int.Rev.lmmunol 10, 195-217] 참조). ScFv는 박테리아 세포 예컨대, E. Coli에서 생성될 수 있으며, 더욱 바람직하게는, 진핵세포에서 생성될 수 있다. ScFv의 한 이점은 일가 생성물에 있으며, 이는 다가 결합으로 인한 증가된 화합력 및 이들의 짧은 반감기는 배제된다. 이들 문제점을 극복하기 위한 시도는 화학적 결합 (Adams et al (1993) Can. Res 53, 4026-4034 and McCartney et al (1995) Protein Eng. 8, 301-314) 또는 쌍을 이루지 않은 C 말단 시스테인 잔기를 함유하는 ScFv의 자발적인 부위 특이적 이원화에 의해 추가적인 C 말단 시스테인을 함유하는 ScFV로부터 생성된 이가 (ScFv')2를 포함한다 (문헌 [Kipriyanov et al (1995) Cell. Biophys 26, 187-204] 참조). 대안적으로, ScFv는 3 내지 12개 잔기로 펩티드 링커를 짧게 함으로써 멀티머를 형성하여 "디아바디 (diabodies)"를 형성하게 할 수 있다 (문헌 [Holliger et al PNAS (1993), 90, 6444- 6448] 참조). 링커를 감소시키는 것은 추가로 ScFV 트리머 ("트리아바디", 문헌 [Kortt et al (1997) Protein Eng, 10, 423-433] 참조) 및 테트라머 ("테트라라바디", 문헌 [Le Gall et al (1999) FEBS Lett, 453, 164-168] 참조)를 유도할 수 있다. 이가 ScFV 분자의 작제는 또한, 단백질 이량체화 모티프와의 유전적 융합에 의해 달성되어 "미니항체" (문헌 [Pack et al (1992) Biochemistry 31 , 1579-1584] 참조) 및 "미미바디" (문헌 [Hu et al (1996), Cancer Res. 56, 3055-3061] 참조)를 형성할 수 있다. ScFv-Sc-Fv 탄뎀 ((ScFV)2)은 또한, 제 3 펩티드 링커에 의해 두개의 ScFv 유닛을 연결함으로써 생성될 수 있다 (문헌 [Kurucz et al (1995) J.lmmol.154, 4576-4582] 참조). 이중특이적 디아바디는 한 항체의 VL 도메인에 짧은 링커에 의해 연결된 또 다른 항체의 VH 도메인으로 이루어진 두개의 단일 사슬 융합 생성물의 일가 결합을 통해 생성될 수 있다 (문헌 [Kipriyanov et al (1998), Int. J. Can 77,763-772] 참조). 이러한 이중특이적 디아바디의 안정도는 상기 기술된 바와 같은 이황화물 브릿지 또는 "놉 인 홀" 변이의 유입에 의해 또는 두개의 하이브리드 ScFv 단편이 펩티드 링커를 통해 연결된 단일 사슬 디아바디 (ScDb)의 형성에 의해 향상될 수 있다 (문헌 [Kontermann et al (1999) J. Immunol. Methods 226 179- 188] 참조). 삼가 이중특이적 분자는 예를 들어, ScFv 단편을 IgG 분자의 CH3 도메인 또는 Fab 단편에 힌지 영역을 통해 융합시킴으로써 이용가능하다 (문헌 [Coloma et al (1997) Nature Biotechnol. 15, 159-163] 참조). 대안적으로, 사가 이중특이적 분자는 이중특이적 단일 사슬 디아바디의 작용에 의해 생성되었다 (문헌 [Alt et al, (1999) FEBS Lett 454, 90-94] 참조). 더 작은 사가 이중특이적 분자는 또한, 헬릭스-루프-헬릭스 모티프를 함유하는 링커와의 ScFv-ScFv 탄뎀 (DiBi 미니항체, 문헌 [Muller et al (1998) FEBS Lett 432, 45-49] 참조) 또는 분자내 접합을 방지하는 방향으로 4개의 항체 가변 도메인 (VH 및 VL)을 포함하는 단일 사슬 분자 (탄뎀 디아바디, 문헌 [Kipriyanov et al, (1999) J. MoI. Biol. 293, 41-56] 참조)의 이량체화에 의해 형성될 수 있다. 이중특이적 F(ab')2 단편은 Fab' 단편의 화학 커플링 또는 류신 지퍼를 통한 헤테로다이머를 통해 생성될 수 있다 (문헌 [Shalaby et al, (1992) J. Exp. Med. 175, 217-225 and Kostelny et al (1992), J.Immunol. 148, 1547-1553] 참조). 또한, 분리된 VH 및 VL 도메인 (Domantis pic)이 이용가능하다 (US 6, 248,516; US 6,291 ,158; US 6, 172,197 참조).
일 구체예에서, hIL-13에 특이적으로 결합하며, hIL-13과 hIL-13R의 상호작용을 조절하는 조작된 항체 단편 또는 항체 단편 (예를 들어, ScFv, Fab, Fab', F(ab')2)이 제공되며, 여기서, 이러한 단편은 hIL-13과 이의 수용체간의 상호작용을 억제한다. 항체 단편은 SEQ ID NO:3의 서열을 포함하는 CDRH3와 선택적으로, SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5 및 6의 서열중 하나 이상을 포함하는 추가의 CDR을 포함할 수 있다.
본 발명의 항체의 VH 및 VL 영역을 포함하는 ScFv가 제조될 수 있다. 예를 들어, ScFv는 SEQ ID NO: 12 및 15를 포함할 수 있거나, 예를 들어, SEQ ID NO: 13 및 15를 포함할 수 있다. 이는 본 발명에 따른 폴리누클레오티드 예를 들어, SEQ ID NO: 93 및 94의 서열, 또는 예를 들어, SEQ ID NO: 28 및 31의 서열에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, SEQ ID NO: 93 및 94의 서열에 의해 엔코딩된 단백질을 포함하는 ScFv가 제공된다.
1.5 헤테로컨쥬게이트 항체
헤테로컨쥬게이트 항체는 또한, 본 발명의 구체예를 형성한다. 헤테로컨쥬게이트는 알맞은 가교 방법을 이용하여 형성된 두개의 공유적으로 결합된 항체로 이루어진다. 예를 들어, US 4,676,980 참조.
1.6 기타 변형
항체의 Fc 영역과 다양한 Fc 수용체 (FcγR)간의 상호작용은 항체-의존적 세포독성 (ADCC), 보체의 고정화, 식작용 및 반감기/항체의 제거를 포함하는 항체의 이펙터 작용을 매개하는 것으로 여겨진다. 본 발명의 항체의 Fc 영역에 대한 다양한 변형이 목적하는 특성에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 다른 세포용해 항체, 비세포용해 항체가 되게하는 Fc에서의 특이적 변형은 EP 0629 240B1 및 EP 0307 434B2에 기술되어 있거나, 혈청 반감기를 증가시키기 위해 샐비지 (salvage) 수용체 결합 에피토프를 항체로 혼입시킬 수 있다 (US 5,739,277 참조). 5개의 현재 인정된 인간 Fcγ 수용체, FcγR (I), FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa 및 신생아 FcRn가 있다. 쉴드 (Shields et al, (2001) J.Biol.Chem 276, 6591-6604) 등은 IgG1 잔기의 공통된 세트가 모든 FcγRs 결합에 관련되나, FcγRII 및 FcγRIII는 이러한 공통된 세트 이외의 별개의 부위를 이용함을 입증하였다. IgG1 잔기의 한 기가 알라닌으로 변경되는 경우 모든 FcγRs에 대한 결합을 저하시킨다: Pro-238, Asp-265, Asp-270, Asn-297 및 Pro-239. 모두 IgG CH2 도메인에 위치하며, CH1 및 CH2를 결합시키는 힌지 근처에서 덩어리를 이룬다. FcγRI이 단지 결합을 위한 IgG1 잔기의 공통된 세트를 이용하는 반면, FcγRII 및 FcγRIII는 공통된 세트 이외의 별개의 잔기와 상호작용한다. 일부 잔기의 변경은 단지 FcγRII (예를 들어, Arg-292) 또는 FcγRIII (예를 들어, Glu-293)로의 결합을 저하시켰다. 일부 변이체는 FcγRII 또는 FcγRIII에 대한 증가된 결합을 나타내지만, 다른 수용체로의 결합에는 영향을 끼치지 못하였다 (예를 들어, Ser-267Ala는 FcγRII로의 결합은 향상시키지만, FcγRIII로의 결합에는 영향을 끼치지 못하였다). 기타 변이체는 FcγRII 또는 FcγRIII로의 향상된 결합을 나타내며, 다른 수용체로의 결합은 저하된다 (예를 들어, Ser-298Ala는 FcγRIII로의 결합을 향상시키지만, FcγRII로의 결합은 저하시켰다). FcγRIIIa에 있어서, 가장 우수한 결합 IgG1 변이체는 Ser-298, Glu-333 및 Lys-334에서 알라닌 치환체와 혼합되었다. 신생아 FcRn 수용체는 항체 제거 및 조직에 걸친 트랜스사이토시스에 관련된 것으로 여겨진다 (문헌 [Junghans R.P (1997) Immunol. Res 16. 29-57 and Ghetie et al (2000) Annu.Rev.lmmunol. 18, 739-766] 참조). 인간 FcRn과 직접 상호작용하는 것으로 결정된 인간 IgG1 잔기는 Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 및 His435를 포함한다. 본 실시예에 기술된 이들 위치에서의 스위치는 증가된 혈청 반감기 및/또는 본 발명의 항체의 변형된 이펙터 특성을 가능하게 할 수 있다.
기타 변형은 본 발명의 항체의 글리코실화 변이를 포함한다. 이들의 불변 영역에서 보존된 위치에서의 항체의 글리코실화는 항체 작용 특히, 상기 기술된 바와 같은 이펙터 작용에 현저하게 영향을 끼치는 것으로 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Boyd et al (1996), MoI. Immunol. 32, 1311-1318] 참조). 하나 이상의 탄수화물 부분이 부가되거나, 치환되거나, 삭제되거나 변형된 본 발명의 항체 또는 이의 항체 결합 단편의 글리코실화 변이가 고려된다. 아스파라긴-X-세린 또는 아스파라긴-X-트레오닌 모티프의 유입은 탄수화물 부분의 효소 부착에 대해 잠재적인 부위를 생성시키며, 따라서, 항체의 글리코실화를 조작하는데 사용될 수 있다. 문헌 [Raju et al (2001) Biochemistry 40, 8868-8876]에서, TNFR-IgG 면역접착의 말단 시알릴화는 베타-1,4-갈락토실트랜스퍼라스 및/또는 알파, 2,3 시알릴트랜스퍼라스를 사용하여 재갈락토실화 및/또는 재시알릴화의 공정을 통해 증가되었다. 말단 시알릴화의 증가는 면역글로불린의 반감기를 증가시키는 것으로 여겨진다. 대부분의 글리코단백질과 함께 항체는 전형적으로, 당형의 혼합물로서 생성된다. 이러한 혼합물은 특히, 항체가 진핵생물 특히, 포유류 세포에서 생성되는 경우 명백해진다. 규정된 당형을 제조하기 위한 다양한 방법이 개발되었다 (문헌 [Zhang et al Science (2004), 303, 371 , Sears et al, Science, (2001) 291 , 2344, Wacker ef al (2002) Science, 298 1790, Davis et al (2002) Chem.Rev. 102, 579, Hang et al (2001) Acc.Chem. Res 34, 727] 참조). 이와 같이, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 (아마도, IgG 이소형 예를 들어, IgG1의) 다수의 (모노클로날) 항체로서, 규정된 수 (예를 들어, 7 이하, 예를 들어, 5 이하, 예컨대, 2개 또는 1개)의 당형의 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 항체가 고려된다.
본 발명의 추가의 구체예는 비단백질성 중합체 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌에 결합된 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. PEG로의 단백질 컨쥬게이션은 단백질의 반감기를 증가시키고, 단배질의 항원성 및 면역원성을 감소시키는 확립된 기법이다. 상이한 분자량 및 스타일 (선형 또는 분지형)로의 페길화의 이용이 본래의 항체 및 Fab' 단편으로 조사되었다 (문헌 [Koumenis I. L. et al (2000) Int.J.Pharmaceut. 198:83-95] 참조).
2. 생성 방법
본 발명의 항체는 폴리클로날 군집으로서 생성될 수 잇으나, 더욱 바람직하게는, 모노클로날 군집 (이는 특이적 항원성 결합 부위에 대한 유도된 동일한 항체의 실질적으로 상동 군집임)으로서 생성된다. 군집이 하나 초과의 항체를 포함한다는 것이 당업자에게는 자명할 것이다. 본 발명의 항체는 유전자 이식 유기체 예컨대, 염소 (문헌 [Pollock et al (1999), J. Immunol. Methods 231:147-157] 참조), 닭 (문헌 [Morrow KJJ (2000) Genet.Eng.News 20:1-55] 참조), 마우스 (문헌 [Pollock et al] 참조) 또는 식물 (문헌 [Doran PM, (2000) Curr.Opinion Biotechnol. 11, 199-204, Ma JK-C (1998), Nat.Med. 4; 601-606, Baez J et al, BioPharm (2000) 13: 50-54, Stoger E et al; (2000) Plant MoI. Biol. 42:583-590] 참조)에서 생성될 수 있다. 항체는 또한, 화학 합성에 의해 생성될 수 있다. 그러나, 본 발명의 항체는 전형적으로, 당업자에게 공지된 재조합 세포 배양을 이용하여 생성된다. 항체를 엔코딩하는 폴리누클레오티드가 분리되고 복제가능한 벡터 예컨대, 클로닝 (증폭) 또는 발현을 위한 플라스미드로 삽입된다. 하나의 유용한 발현 시스템은 글루타메이트 합성효소 시스템 (예컨대, 론자 바이올로지스 (Lonza Biologies)에 의해 판매되는 것과 같은)이며, 특히 여기서 숙주 세포는 CHO 또는 NSO이다 (하기 참조). 항체를 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 통상적인 공정 (예를 들어, 올리고누클레오티드 프로브)를 사용하여 용이하게 분리되고 시퀀싱된다. 사용될 수 있는 벡터는 플라스미드, 바이러스, 파아지, 트랜스포존, 미니크로모좀을 포함하며, 이의 플라스미드는 전형적인 구체예이다. 일반적으로, 이러한 벡터는 추가로, 발현을 조장하기 위해 경쇄 및/또는 중쇄 폴리누클레오티드에 작동적으로 연결된 전사 종결 서열, 프로모터, 인핸서 엘리먼트, 하나 이상의 마커 유전자, 복제 오리진, 및 단일 서열을 포함한다. 경쇄 및 중쇄를 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 별도의 벡터로 삽입되고, 동일한 숙주 세포로 트랜스펙션되거나, 필요에 따라, 중쇄 및 경쇄는 숙주 세포로 트랜스펙션시키기 위한 동일한 벡터내로 삽입될 수 있다. 본 발명의 일 양태에 있어서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄 및/또는 중쇄를 엔코딩하는 벡터를 작제하는 공정이 제공되며, 이러한 방법은 벡터로 본 발명의 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 삽입시키는 것을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, SEQ ID NO:25의 서열을 포함하는 뮤린 VH 도메인을 엔코딩하는 폴리누클레오티드가 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, SEQ ID NO:26의 서열을 포함하는 뮤린 VL 도메인을 엔코딩하는 폴리누클레오티드가 제공된다.
또 다른 구체예에서, SEQ ID NO: 27, 28, 29, 30으로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 VH 도메인을 엔코딩하는 폴리누클레오티드가 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, SEQ ID NO:31, 32, 33의 서열을 포함하는 뮤린 VL 도메인을 엔코딩하는 폴리누클레오티드가 제공된다.
본 발명에 있어서, 본 발명의 중쇄를 엔코딩하는 폴리누클레오티드로서, SEQ ID NO: 34, 35, 36, 37로 구성된 군으로부터 선택된 폴리누클레오티드가 제공된다.
본 발명에 있어서, 본 발명의 경쇄를 엔코딩하는 폴리누클레오티드로서, SEQ ID NO: 38, 39, 40으로 구성된 군으로부터 선택된 폴리누클레오티드가 제공된다.
유전자 코드의 중복으로 인해, 본원에 기술된 누클레오티드에 대해 대안적인, 본 발명의 폴리펩티드를 엔코딩할 폴리누클레오티드 (특히, 주어진 숙주 세포에서의 발현에 최적화된 코돈)가 또한 이용가능하다.
3.1 시그널 서열
본 발명의 항체는 성숙 단백질의 N 말단에서 특이적 절단 부위를 갖는 이종성 시그널 서열을 갖는 융합 단백질로서 생성될 수 있다. 시그널 서열은 숙주 세포에 의해 인지되고 프로세싱될 수 있어야 한다. 원핵 숙주 세포에 있어서, 시그널 서열은 알칼리성 포스파타아제, 페니실리나아제, 또는 열 안정성 엔테로톡신 II 리더일 수 있다. 효모 분비물에 있어서, 시그널 서열은 효모 전환효소 리더, α 팩터 리더 또는 산 포스파타아제 리더일 수 있다 (예를 들어, WOWO90/13646 참조). 포유동물 세포 시스템에서, 바이러스 분비 리더 예컨대, 헤르페스 단순 gD 시그널 및 천연 면역글로불린 시그널 서열이 이용가능하다. 전형적으로, 시그널 서열은 본 발명의 항체를 엔코딩하는 DNA로 리딩 프레임에서 결찰된다.
3.2 복제 오리진
복제 오리진은 대부분의 그람-네거티브 박테리아에 적합한 pBR322, 대부분의 효모에 대한 2μ 플라스미드, 및 대부분의 포유류 세포에 대한 다양한 바이러스 오리진 예컨대, SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV로 당해분야에 널리 공지되어 있다. 일반적으로, 복제 성분의 오리진은 포유류 발현 벡터에 필수적이지 않으나, SV40은 초기 프로모터를 함유하기 때문에 사용될 수 있다.
3.3 선택 마커
전형적 선택 유전자는 (a) 항생제 또는 기타 독소 예를 들어, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라시클린에 대한 내성을 부여하거나 (b) 영양요구 결필을 보완하거나 복합물 배지에서 이용불가능한 영양분을 제공하는 단백질을 엔코딩한다. 선택 계획은 숙주 세포의 성장을 저지하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 항체를 엔코딩하는 유전자로 형질전환된 세포는 예를 들어, 선택 마커에 의해 부여받은 약물 내성으로 인해 생존한다. 또 다른 예는 소위 DHFR 선택 마커이며, 여기서 형질전환체는 메토트렉세이트의 존재하에 배양된다. 전형적인 구체예에서, 세포는 증가하는 양의 메톡트렉세이트의 존재하에 배양되어 대상 외인성 유전자의 복사체 수를 증폭시킨다. CHO 세포는 DHFR 선택에 특히 유용한 세포주이다. 추가적인 예는 글루타메이트 합성효소 발현계이다 (Lonza Biologies). 효모에 사용하기에 적합한 선택 유전자는 trp1 유전자이다 (문헌 [Stinchcomb et al Nature 282, 38, 1979] 참조).
3.4 프로모터
본 발명의 항체를 발현하기에 적합한 프로모터는 항체를 엔코딩하는 DNA/폴리누클레오티드에 작동적으로 연결된다. 원핵 숙주용 프로모터는 phoA 프로모터, Beta-락타마아제 및 락토오스 프로모터 시스템, 알칼리성 포스파타아제, 트립토판 및 히드라이드 프로모터 예컨대, Tac를 포함한다. 효모 세포에서 발현에 적합한 프로모터는 3-포스포글리세레이트 키나아제 또는 기타 글리콜 효소 예를 들어, 에놀라아제, 글리세르알데히드 3 포스페이트 데히드로게나아제, 헥소키나아제, 피루베이트 데카르복실라아제, 포스포프룩토키나아제, 글루코오스 6 포스페이트 이소머라아제, 3-포스포글리세레이트 뮤타아제 및 글루코키나아제를 포함한다. 유도가능한 효모 프로모터는 알코올 데히드로게나아제 2, 이소사이토크롬 C, 산성 포스파타아제, 메탈로티오네인 및 질소 대사 또는 말토오스/갈락토오스 이용에 기여하는 효소를 포함한다. 포유동물 세포계에서 발현을 위한 프로모터는 바이러스 프로모터 예컨대, 폴리오마, 포울폭스 및 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 2), 소태 파필로마 바이러스, 아비안 사르코마 바이러스, 사이토메갈로바이러스 (특히, 즉각적 초기 유전자 프로모터), 레트로바이러스, B형 간염 바이러스, 악틴, 로우스 사르코마 바이러스 (RSV) 프로모터 및 초기 또는 후기 시미안 바이러스 40을 포함한다. 물론, 프로모터의 선택은 발현에 사용된 숙주 세포와의 적합한 양립성에 기초한다. 따라서, 일 구체예에서, RSV 및/또는 SV40 및/또는 CMV 프로모터, 본 발명의 경쇄 V 영역 (VL)을 엔코딩하는 DNA, κC 영역과 네오마이신 및 암피실린 내성 선택 마커를 포함하는 제 1 플라스미드 및 RSV 또는 SV40 프로모터, 본 발명의 중쇄 V 영역 (VH)을 엔코딩하는 DNA, γ1 불변 영역을 엔코딩하는 DNA, DHFR 및 암피실린 내성 마커를 포함하는 제 2 플라스미드가 제공된다.
3.5 인핸서 엘리먼트
적합하게는, 예를 들어, 고등 진핵생물에서의 발현을 위해, 베터내의 프로모터 엘리먼트에 작동적으로 연결된 인핸서 엘리먼트가 사용될 수 있다. 적합한 포유류 인핸서 서열은 글로빈, 엘라스타아제, 알부민, 페토프로테인 및 인슐린으로부터의 인핸서 엘리먼트를 포함한다. 대안적으로, 원핵세포 바이러스 예컨대, SV40 인핸서 (bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 폴리마 인핸서, 바쿨로바이러스 인핸서 또는 뮤린 IgG2a 로커스로부터의 인핸서 엘리먼트를 사용할 수 있다 (WO04/009823 참조). 인핸서는 바람직하게는, 프로모터의 업스트림 부위에서 벡터에 위치한다.
3.5.5 - 폴리아데닐화 시그널
진핵계에서, 폴리아데닐화 시그널은 본 발명의 항체를 엔코딩하는 DNA/폴리누클레오티드에 작동적으로 연결된다. 이러한 시그널은 전형적으로, 오픈 리딩 프레임의 3'에 위치한다. 포유류 시스템에서, 비제한적 예로는 성장 호르몬, 신장 인자-1 알파 및 바이러스 (예를 들어, SV40) 유전자 또는 레트로바이러스 장말단 반복부로부터 유래된 시그널을 포함한다. 효모 시스템에서, 폴리아데닐화/말단 시그널의 비제한적 예로는 포스포글리세라이트 키나아제 (PGK) 및 알코올 데히드로게나아제 1 (ADH) 유전자로부터 유래된 것을 포함한다. 원핵 시스템에서, 전형적으로 폴리아데닐화 시그널이 요구되지 않으며, 대신 더 짧고 더욱 규정된 말단 서열이 일반적이다. 물론, 폴리아데닐화/말단 서열의 선택은 발현을 위해 사용된 숙주 세포와의 적합한 양립성에 기초한다.
3.6 숙주 세포
본 발명의 항체를 엔코딩하는 벡터를 클로닝하거나 발현시키기 위한 적합한 숙주 세포로는 원핵, 효모 또는 고등 진핵 세포가 있다. 적합한 원핵 세포로는 진정세균 예를 들어, 엔테로박테리아세 예컨대, 에세리치아 (Escherichia) 예를 들어, E.Coli (예를 들어, ATCC 31,446; 31,537; 27,325), 엔테로박터 (Enterobacter), 에르위니아 (Erwinia), 클레시엘라 프로테우스 (Klebsiella Proteus), 살모넬라 (Salmonella) 예를 들어, 살모넬라 팁히뮤리움 (Salmonella typhimurium), 세라티아 (Serratia) 예를 들어, 세라티아 마르세스칸스 (Serratia marcescans) 및 쉬겔라 (Shigella) 및 바실리 예컨대, B. 서브틸리스 (B.subtilis) 및 B. 리체니포르미스 (B.licheniformis) (DD 266 710 참조), 슈도모나스 예컨대, P. 애루기노사 (P.aeruginosa) 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces)를 포함한다. 효모 숙주 세포중에서, 사카로마이세스 세레비시애 (Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마이세스 폼베 (schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) (예를 들어, ATCC 16,045; 12,424; 24178; 56,500), 야로이와 (yarrowia) (EP 402,226), 피치아 파스토리스 (Pichia Pastoris) (EP 183,070, 문헌 [Peng et al J.Biotechnol. 108 (2004) 185-192] 참조), 캔디다 (Candida), 트리코더마 레시아 (Trichoderma reesia) (EP244, 234), 페니실린 (Penicillin), 톨리포클라디움 (Tolypocladium) 및 아스퍼길루스 (Aspergillus) 숙주 예컨대, A.니둘란 (A. nidulans) 및 A. 니거 (A.niger)가 고려된다.
원핵세포 및 효모 숙주 세포가 본 발명에 특정하게 고려된다 하더라도, 바람직하게는, 본 발명의 숙주 세포는 고등의 진핵 세포이다. 적합한 고등의 진핵 숙주 세포로는 포유류 세포 예컨대, COS-1 (ATCC No.CRL 1650) COS-7 (ATCC CRL 1651), 인간 배아 신장 라인 293, 베이비 햄스터 신장 세포 (BHK) (ATCC CRL.1632), BHK570 (ATCC NO: CRL 10314), 293 (ATCC NO.CRL 1573), 차이니즈 햄스터 난소 세포 CHO (예를 들어, CHO-K1 , ATCC NO: CCL 61 , DHFR-CHO 세포주 예컨대, DG44 (문헌 [Urlaub et al, (1986) Somatic Cell Mol.Genet.12, 555-556] 참조)), 특히 부유 배양에 적합한 CHO 세포주, 마우스 세르톨리 세포, 원숭이 신장 세포, 아프리카 그린 원숭이 신장 세포 (ATCC CRL-1587), HELA 세포, 개속 신장 세포 (ATCC CCL 34), 인간 폐 세포 (ATCC CCL 75), Hep G2 및 골수종 또는 림프종 세포 예를 들어, NSO (US 5,807,715 참조), Sp2/0, YO를 포함한다.
이와 같이, 본 발명의 일 구체예에서,본원에 기술된 바와 같은 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 및/또는 경쇄를 엔코딩하는 벡터를 포함하는 안정하게 형질전환된 숙주 세포가 제공된다. 바람직하게는, 이러한 숙주 세포는 상기 경쇄를 엔코딩하는 제 1 벡터 및 상기 중쇄를 엔코딩하는 제 2 벡터를 포함한다.
박테리아 발효
박테리아 시스템은 특히, 항체 단편의 발현에 적합하다. 이러한 단편은 페리플라즈마 (periplasma)내에 또는 세포내에 위치한다. 불용성 페리플라즈마 단백질은 당업자에게 공지된 방법에 따라 절제되고 재폴딩되어 활성 단백질을 형성할 수 있다 (문헌 [Sanchez et al (1999) J.Biotechnol. 72, 13-20 and Cupit PM et al (1999) Lett Appl Microbiol, 29, 273-277] 참조).
3.7 세포 배양법
본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 엔코딩하는 벡터로 형질전환된 숙주 세포는 당업자에게 공지된 방법에 의해 배양될 수 있다. 숙주 세포는 스피너 플라스크 (spinner flask), 롤러 버틀 (roller bottle) 또는 할로우 피버 시스템 (hollow fibre system)에서 배양될 수 있으며, 대규모 생성이 바람직하며, 교반된 탱크 반응기가 특히 부유 배양에 사용된다. 바람직하게는, 교반된 탱크는 예를 들어, 살포기, 배플 (baffle) 또는 저전단 임펠러를 사용하여 공기를 공급하기에 적합하다. 버블 칼럼 및 에어리프트 반응기에 있어서, 공기 또는 산소 버블로의 직접 공기 주입이 이용될 수 있다. 숙주 세포가 혈청 비함유 배양 배지중에 배양되는 경우, 배지에는 세포 보호성 제제 예컨대, 플루논 F-68이 추가되어 공기 공급 과정으로 인한 세포 손상을 방지하는 것을 돕는다. 숙주 세포 특징에 따라, 마이크로담체가 부착 의존성 세포주에 대한 성장 기질로서 사용될 수 있거나, 세포는 부유 배양 (부유 배양이 전형적임)에 적합할 수 있다. 숙주 세포 특히, 무척추동물 숙주 세포의 배양은 다양한 작동 모드 예컨대, 유가 배양식 반복된 배치식 공정 (문헌 [Drapeau et al (1994) cytotechnology 15: 103-109] 참조), 연장된 배치식 공정 또는 관류 배양을 이용할 수 있다. 재조합적으로 형질전환된 포유류 숙주 세포가 혈청 함유 배지 예컨대, 소태 혈청 (FCS)중에서 배양될 수 있지만, 이러한 숙주 세포는 필요에 따라, 에너지 공급원 예컨대, 글루코오스 및 합성 성장 인자 예컨대, 재조합 인슐린이 보충된 예컨대, 문헌 [Keen ef al (1995) Cytotechnology 17:153-163]에 기재된 바와 같은 합성 혈청-비함유 배지중 또는 시중에서 입수가능한 배지 예컨대, ProCHO-CDM 또는 UltraCHOTM (Cambrex NJ, USA)에서 배양될 수 있다. 숙주 세포의 혈청 비함유 배양은 혈청 비함유 조건에서 성장하기에 적합하게 되어야 한다. 한 적합화 방법은 이러한 숙주 세포를 혈청 함유 배지중에서 혈청 비함유 배지용 배양 배지중 80%를 반복적으로 교체하면서 배양시켜, 숙주 세포를 혈청 비함유 조건에 적응시키는 것이다 (문헌 [Scharfenberg K et al (1995) in Animal Cell technology: Developments towards the 21st century (Beuvery E. C. et al eds), pp619- 623, Kluwer Academic publishers] 참조).
배지로 분비된 본 발명의 항체는 다양한 기법을 이용하여 회수되고 정제되어 의도된 용도에 적합한 정제 정도를 제공한다. 예를 들어, 인간 환자의 치료를 위한 본 발명의 항체 사용은 전형적으로, 95% 이상의 순도, 더욱 전형적으로는 98% 또는 99% 또는 그 초과의 순도 (미정제 배양 배지와 비교한 경우)이어야 한다. 제 1 예에서, 배양 배지로부터의 세포 부스러기는 전형적으로 원심분리에 이어서, 예를 들어, 미세여과, 초여과 및/또는 심층 여과를 사용하여 상청액 정화 단계에 의해 제거된다. 다양한 기타 기법 예컨대, 투석 및 겔 전기영도 및 크로마토그래피 기법 예컨대, 히드록시아파타이트 (HA), 친화도 크로마토그래피 (선택적으로, 폴리히스티딘과 같은 친화도 표지 시스템을 포함) 및/또는 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC, US 5,429,746 참조)가 이용가능하다. 일 구체예에서, 다양한 정화 단계 후, 본 발명의 항체는 단백질 A 또는 G 친화도 크로마토그래피 후, 추가의 크로마토그래피 단계 예컨대, 이온 교환 및/또는 HA 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환, 크비 배제 크로마토그래피 및 암모늄 설페이트 침전을 이용하여 포집된다. 전형적으로, 다양한 바이러스 제거 단계가 또한 사용된다 (예를 들어, DV-20 필터를 사용한 나노여과). 이러한 다양한 단계 후, 적어도 75mg/ml 또는 그 초과의 예를 들어, 100mg/ml 또는 그 초과의 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 정제된 (바람직하게는, 모노클로날) 제조물이 제공되며, 따라서, 이는 본 발명의 구체예를 형성한다. 적합하게는 이러한 제조물은 본 발명의 응집된 형태의 항체를 사실상 함유하지 않는다.
4. 약제 조성물
상기 기술된 바와 같은 본 발명의 항체의 정제된 제조물 (특히, 모노클로날 제조물)은 인간 질환 및 질병 예컨대, 아토피성 질환 예를 들어, 천식, 알레르기 비염, COPD의 치료에 사용하기위한 약제 조성물에 혼입될 수 있다. 전형적으로, 이러한 조성물은 공지되고, 인정된 약제 실시에 의해 요구되는 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Remingtons Pharmaceutical Sciences, 16th edition, (1980), Mack Publishing Co] 참조). 이러한 담체의 예로는 적합한 완충제에 의해 pH 5 내지 8로 완충된 멸균된 담체 예컨대, 염수, 링거액 또는 덱스트로스 용액을 포함한다. 주입용 (예를 들어, 정맥내, 복강내, 피부내, 피하내, 근내 또는 문맥내) 또는 연속 주입용 약제 조성물은 사실상 육안으로 확인되는 입자 물질은 존재하지 않으며, 0.1ng 내지 100mg의 항체, 바람직하게는, 5mg 내지 25mg의 항체를 포함할 수 있다. 이러한 약제 조성물의 제조 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 일 구체예에서, 약제 조성물은 선택적으로, 0.1ng 내지 100mg의 본 발명의 항체를 선택적으로, 사용 설명서와 함께 단위 투여 형태로 포함한다. 본 발명의 약제 조성물은 동결 건조 (냉동 건조)되어 당업자에게 널리 공지되거나 자명한 방법에 따라 투여 전에 재궁성될 수 있다. 본 발명의 구체예가 IgG1 이소형을 갖는 본 발명의 항체를 포함하는 경우, 구리의 킬레이터 예컨대, 시트레이트 (예를 들어, 나트륨 시트레이트) 또는 EDTA 또는 히스티딘이 약제 조성물에 첨가되어 이러한 이소형의 항체의 구리-매개된 분해 수준을 저하시킬 수 있다 (EP 0612251 참조). 항-hIL-13 처리는 흡입에 의해 국소적으로 경구로 제공될 수 있다 (예를 들어, 안내, 비내, 피부상의 환부).
본 발명의 항체를 투여하기에 유효한 용량 및 처리 요법은 일반적으로 실험에 의해 결정되며, 인자 예컨대, 연령, 체중 및 환자의 건강 상태, 및 치료할 질환 또는 질병에 의존적이다. 이러한 인자는 담당 주치의의 권한내에 있다. 적합한 투여량 선택에 대한 기준은 예를 들어, 문헌 [Smith et al (1977) Antibodies in human diagnosis and therapy, Raven Press, New York]에서 발견되며, 일반적으로 1mg 내지 1000mg일 것이다.
치료할 질환 또는 질병에 따라 (특히 천식은 제외), 치료학적 유효량의 본 발명의 항체를 포함하는 약제 조성물이 유효량의 또 다른 의약 예컨대, 항-염증제 (예를 들어, 코르티코스테로이드 또는 NSAID), 항콜린성 제제 (특히, M1/M2/M3 수용체 안타고니스트), β2 아드레노수용체 아고니스트, 항염증성 제제 (예를 들어, 항생제, 항바이러스제), 항히스타민, PDE4 억제제와 동시에, 별도로 또는 연속적으로 사용될 수 있다. β2 아드레노수용체 아고니스트의 예로는 살메테롤, 살부타몰, 포르모테롤, 살메파몰, 페노테롤, 테르부탈린을 포함한다. 바람직한 장기간 작용 β2 아드레노수용체 아고니스트는 WO02/66422A, WO02/270490, WO02/076933, WO03/024439 및 WO03/072539에 기술된 것을 포함한다. 적합한 코르티코스테로이드는 메틸 프레드니솔론, 프레드니솔론, 덱사메탄손, 플루티카손 프로피오네이트, 6α,9α-디플루오로-17α-[(2-푸라닐카르보닐)옥시]-11β-히드록시-16α-메틸-3-옥소-안드로스타-1,4-디엔-17β-카르보티오산 S-플루오로메틸 에스테르, 6α,9α-디플루오로-11β-히드록시-16α-메틸-3-옥소-17α-프로피오닐옥시-안드로스타-1,4-디엔-17β-카르보티오산 S-(2-옥소-테트라히드로-푸란-3S-일) 에스테르, 베클로메타손 에스테르 (예를 들어, 17-프로피오네이트 에스테르 또는 17,21-디프로피오네이트 에스테르), 부데소나이드, 플루니솔리드, 모메타손 에스테르 (예를 들어, 푸로에이트 에스테르), 트리암시놀론 아세토니드, 로플레포니드, 시슬레소니드 (16α,17-[[(R)-시클로헥실메틸렌]비스(옥시)]-11β,21-디히드록시-프레그나-1,4-디엔-3,20-디온), 부틱소코르트 프로피오네이트, RPR-106541, 및 ST-126을 포함한다. 바람직한 코르티코스테로이드는 플루티카손 프로피오네이트, 6α,9α-디플루오로-11β-히드록시-16α-메틸-17α-[(4-메틸-1,3-티아졸-5-카르보닐)옥시]-3-옥소-안드로스타-1,4-디엔-17β-카르보티오산 S-플루오로메틸 에스테르 및 6α,9α-디플루오로-17α-[(2-푸라닐카르보닐)옥시]-11β-히드록시-16α-메틸-3-옥소-안드로스타-1,4-디엔-17β-카르보티오산 S-플루오로메틸 에스테르, 더욱 바람직하게는, 6α,9α-디플루오로-17α-[(2-푸라닐카르보닐)옥시]-11β-히드록시-16α-메틸-3-옥소-안드로스타-1,4-디엔-17β-카르보티오산 S-플루오로메틸 에스테르를 포함한다.
전이활성에 대한 트랜스억제에 대한 선택성을 가질 수 있으며, 병합 치료에 유용할 수 있는 글루코코르티코이드 아고니즘을 갖는 비스테로이드 화합물은 하기 특허에 포함된 것을 포함한다: WO03/082827, WO01/10143, WO98/54159, WO04/005229, WO04/009016, WO04/009017, WO04/018429, WO03/104195, WO03/082787, WO03/082280, WO03/059899, WO03/101932, WO02/02565, WO01/16128, WO00/66590, WO03/086294, WO04/026248, WO03/061651, WO03/08277.
적합한 항-염증제는 비스테로이드성 항염증 약물 (NSAID)을 포함한다.
적합한 NSAID는 나트륨 크로모글리케이트, 네도크로밀 나트륨, 포스포디에스테라아제 (PDE) 억제제 (예를 들어, 테오필린, PDE4 억제제 또는 혼합된 PDE3/PDE4 억제제), 류코트리엔 안타고니스트, 류코트리엔 합성 억제제 (예를 들어, 몬테루카스트 (montelukast)), iNOS 억제제, 트립타아제 및 엘라스타아제 억제제, 베타-2 인테그린 안타고니스트 및 아데노신 수용체 아고니스트 또는 안타고니스트 (예를 들어, 아데노신 2a 아고니스트), 사이토킨 안타고니스트 (예를 들어, 케모틴 안타고니스트 예컨대, CCR3 안타고니스트) 또는 사이토킨 합성 억제제, 또는 5-리폭시게나아제 억제제를 포함한다. 적합한 기타 β2-아드레노수용체 아고니스트는 살메테롤 (예를 들어, 지나포에이트 (xinafoate)), 살부타몰 (예를 들어, 설페이트 또는 유기 염기로서), 포르모테롤 (예를 들어, 푸마레이트로서), 페노테롤 또는 테르부탈린 및 이의 염을 포함한다. iNOS (유도성 산화질소 합성효소)는 바람직하게는, 경구 투여용이다. 적합한 iNOS 억제제는 WO93/13055, WO98/30537, WO02/50021, WO95/34534 및 WO99/62875에 기술된 것을 포함한다. 적합한 CCR3 억제제는 WO02/26722에 기술된 것을 포함한다.
특히, 포스포디에스테라아제 4 (PDE4) 억제제와 함께 본 발명의 항체를 사용하는 것이 이롭다. 본 발명에 유용한 PDE4-특이적 억제제는 PDE4 효소를 억제하는 것으로 공지된 화합물 또는 PDE4 억제제로서 작용하는 것으로 밝혀진 화합물일 수 있으며, 이는 단지 PDE4 억제제일 수 있으며, PDE4 뿐만 아니라 PDE 패밀리의 다른 구성원 예컨대, PDE3 및 PDE5을 억제하는 화합물은 아니다.
대상 화합물은 cis-4-시아노-4-(3-시클로펜틸옥시-4-메톡시페닐)시클로헥산-1-카르복실산, 2-카르보메톡시-4-시아노-4-(3-시클로프로필메톡시-4-디플루오로메톡시페닐)시클로헥산-1-온 및 cis-[4-시아노-4-(3-시클로프로필메톡시-4-디플루오로메톡시페닐)시클로헥산-1-올]을 포함한다. 또한, cis-4-시아노-4-[3-(시클로펜틸옥시)-4-메톡시페닐]시클로헥산-1-카르복실산 (또한, 실로밀라스트 (cilomilast)로서 공지되어 있음) 및 이의 염, 에스테르, 전구약물 또는 물리적 형성물을 포함하며, 이는 [U.S. patent 5,552,438 issued 03 September, 1996]에 기술되어 있으며, 이러한 특허 및 여기에 기술된 화합물은 본원에 참고문헌으로 인용되었다.
엘비온 (Elbion)으로부터의 AWD-12-281 (Hofgen, N. et al. 15th EFMC lnt Symp Med Chem (Sept 6- 10, Edinburgh) 1998, Abst P.98; CAS reference No. 247584020-9)); 9-벤질아데닌 유도체 (NCS-613로 명명됨) (INSERM); 키로사이언스 및 쉐링-플로그 (Chiroscience and Schering-Plough)로부터의 D-4418; CI-1018 (PD- 168787)로 확인되고 프피저 (Pfizer)로부터의 벤조디아제핀 PDE4 억제제; WO99/16766에 교와 하코 (Kyowa Hakko)에 의해 기술된 벤조디옥솔 유도체; 교와 하코로부터의 K-34; 냅 (Napp (Landells, L.J. et al. Eur Resp J [Annu Cong Eur Resp Soc (Sept 19-23, Geneva) 1998] 1998, 12 (Suppl. 28): Abst P2393))으로부터의 V-11294A; 로플루밀라스트 (roflumilast) (CAS reference No 162401-32-3) 및 프탈라지논 (pthalazinone) (WO99/47505, 본원에 참고문헌으로 인용됨) (Byk-Gulden); 푸마펜트린 (Pumafentrine), (-)-p-[(4aR*,10bS*)-9-에톡시-1,2,3,4,4a,10b-헥사히드로-8-메톡시-2-메틸벤조[c][1,6]나프티리딘-6-일]-N,N-디이소프로필벤즈아미드 (이는 혼합된 PDE3/PDE4 억제제로서, 비크-굴덴 (Byk-Gulden), 현재의 알타나 (Altana)에 의해 제조되고 공개됨); 알미랄-프로데스파르마 (Almirall-Prodesfarma)에 의해 개발되는 아로필린 (arofylline); 베르날리스 (Vernalis)로부터의 VM554/UM565; 또는 T-440 (Tanabe Seiyaku; Fuji, K. et al- J Pharmacol Exp Ther,1998, 284(1): 162), 및 T2585.
추가의 대상 화합물은 WO04/024728 (Glaxo Group Ltd), PCT/EP2003/014867 (Glaxo Group Ltd) 및 PCT/EP2004/005494 (Glaxo Group Ltd)에 기술되어 있다.
적합한 항콜린성 제제는 무스카린 수용체에서 안타고니스트로서 작용하는 화합물 특히, M1 또는 M3 수용체의 안타고니스트, M1/M3 또는 M2/M3 수용체의 이중 안타고니스트 또는 M1/M2/M3 수용체의 판-안타고니스트인 화합물이다. 흡입에 의해 투여하기 위한 예시적 화합물은 이프라트로피움 (ipratropium) (예를 들어, 브로마이드로서, CAS 22254-24-6, 아트로벤트 (Atrovent)로서 시판중), 옥시트로피움 (oxitropium) (예를 들어, 브로마이드로서, CAS 30286-75-0) 및 티오트로피움 (tiotropium) (예를 들어, 브로마이드로서, CAS 136310-93-5, 스피리바 (Spiriva)로서 시판중)을 포함한다. 또한, 레바트로페이트 (revatropate) (예를 들어, 히드로브로마이드로서, CAS 262586-79-8) 및 WO01/04118에 기술된 LAS-34273이 흥미롭다. 경구 투여용의 예시적 화합물은 피레제핀 (pirenzepine) (CAS 28797-61-7), 다리페나신 (darifeNaCln) (에나블렉스 (Enablex)로서 시판되는 히드로브로마이드에 있어서 CAS 133099-04-4, 또는 CAS 133099-07-7), 옥시부티닌 (CAS 5633-20-5, 디트로판 (Ditropan)으로 시판), 테로딜린 (terodiline) (CAS 15793-40-5), 톨테로딘 (tolterodine) (타르트레이트에 있어서 CAS 124937-51-5 또는 CAS 124937-52-6, 데트롤 (Detrol)로 시판), 오틸로늄 (otilonium) (예를 들어, 브로마이드로서, CAS 26095-59-0, 스파스모멘 (Spasmomen)으로 시판), 트로스품 클로라이드 (trospium chloride) (CAS 10405-02-4) 및 솔리페나신 (solifenacin) (석시네이트에 있어서, CAS 242478-37-1 , 또는 CAS 242478-38-2, YM-905로서 공지됨, 베시케어 (Vesicare)로서 시판)가 흥미롭다.
기타 적합한 항콜린성 제제는 US 특허 출원 60/487981에 기술되어 있는 화학식 (XXI)의 화합물을 포함하며;
Figure 112008057105853-PCT00001
[상기 식에서, 트로판 고리에 부착된 알킬 사슬의 바람직한 배향은 엔도이며;
R31 및 R32는 바람직하게는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 저급 알킬기, 5 내지 6개 탄소 원자를 갖는 시클로알킬기, 6 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 시클로알킬-알킬, 2-티에닐, 2-피리딜, 페닐, 4개를 초과하지 않는 탄소 원자를 갖는 알킬기로 치환된 페닐, 및 4개를 초과하지 않는 탄소 원자를 갖는 알콕시 기로 치환된 페닐로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되며;
X-는 N 원자의 양전하와 결합된 음이온을 나타낸다. X-는 비제한적으로, 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 설페이트, 벤젠 설포네이트, 및 톨루엔 설포네이트일 수 있다]
예를 들어,
(3-엔도)-3-(2,2-디-2-티에닐에테닐)-8,8-디메틸-8-아조니아비시클로[3.2.1]옥탄 브로마이드;
(3-엔도)-3-(2,2-디페닐에테닐)-8,8-디메틸-8-아조니아비시클로[3.2.1]옥탄 브로마이드;
(3-엔도)-3-(2,2-디페닐에테닐)-8,8-디메틸-8-아조니아비시클로[3.2.1]옥탄 4-메틸벤젠설포네이트;
(3-엔도)-8,8-디메틸-3-[2-페닐-2-(2-티에닐)에테닐]-8-아조니아비시클로[3.2.1]옥탄 브로마이드; 및/또는
(3-엔도)-8,8-디메틸-3-[2-페닐-2-(2-피리디닐)에테닐]-8-아조니아비시클로[3.2.1]옥탄 브로마이드를 포함한다.
추가의 적합한 항콜린성 제제는 US 특허 출원 60/511009에 기재된 화학식 (XXII) 또는 (XXIII)의 화합물을 포함하며;
Figure 112008057105853-PCT00002
[상기 식에서,
표시된 H 원자는 엑소 위치에 있으며;
R41-은 N 원자의 양전하와 결합된 음이온을 나타낸다. R1-는 비제한적으로, 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 설페이트, 벤젠 설포네이트, 및 톨루엔 설포네이트일 수 있으며,
R42 및 R43은 독립적으로, 직쇄 또는 분지쇄의 저급 알킬기 (바람직하게는, 1 내지 6개의 탄소 원자를 가짐), 시클로알킬기 (5 내지 6개의 탄소 원자를 가짐), 시클로알킬-알킬 (6 내지 10개의 탄소 원자를 가짐), 헤테로원자로서 N 또는 O을 갖는 헤테로시클로알킬 (5내지 6개의 탄소 원자를 가짐), 헤테로원자로서 N 또는 O을 갖는 헤테로시클로알킬-알킬 (6 내지 10개의 탄소 원자를 가짐), 아릴, 선택적으로 치환된 아릴, 헤테로아릴, 및 선택적으로 치환된 헤테로아릴로 구성된 군으로부터 선택되며;
R44는 (C1-C6)알킬, (C3-C12)시클로알킬, (C3-C7)헤테로시클로알킬, (C1-C6)알킬(C3-C12)시클로알킬, (C1-C6)알킬(C3-C7)헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, (C1-C6)알킬-아릴, (C1-C6)알킬-헤테로아릴, -OR45, -CH2OR45, -CH2OH, -CN, -CF3, -CH2O(CO)R46, -CO2R47, -CH2NH2, -CH2N(R47)SO2R45, -SO2N(R47)(R48), -CON(R47)(R48), -CH2N(R48)CO(R46), -CH2N(R48)SO2(R46), -CH2N(R48)CO2(R45), -CH2N(R48)CONH(R47)로 구성된 군으로부터 선택되며;
R45는 (C1-C6)알킬, (C1-C6)알킬(C3-C12)시클로알킬, (C1-C6)알킬(C3-C7)헤테로시클로알킬, (C1-C6)알킬-아릴, (C1-C6)알킬-헤테로아릴로 구성된 군으로부터 선택되며;
R46는 (C1-C6)알킬, (C3-C12)시클로알킬, (C3-C7)헤테로시클로알킬, (C1-C6)알킬(C3-C12)시클로알킬, (C1-C6)알킬(C3-C7)헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, (C1-C6)알킬-아릴, (C1-C6)알킬-헤테로아릴로 구성된 군으로부터 선택되며;
R47 및 R48은 독립적으로, H, (C1-C6)알킬, (C3-C12)시클로알킬, (C3-C7)헤테로시클로알킬, (C1-C6)알킬(C3-C12)시클로알킬, (C1-C6)알킬(C3-C7)헤테로시클로알킬, (C1-C6)알킬-아릴, 및 (C1-C6)알킬-헤테로아릴로 구성된 군으로부터 선택된다]
예를 들어,
(엔도)-3-(2-메톡시-2,2-디-티오펜-2-일-에틸)-8,8-디메틸-8-아조니아-비시클로[3.2.1]옥탄 요오다이드;
3-((엔도)-8-메틸-8-아자-비시클로[3.2.1]옥트-3-일)-2,2-디페닐-프로피오니트릴;
(엔도)-8-메틸-3-(2,2,2-트리페닐-에틸)-8-아자-비시클로[3.2.1]옥탄;
3-((엔도)-8-메틸-8-아자-비시클로[3.2.1]옥트-3-일)-2,2-디페닐-프로피온아미드;
3-((엔도)-8-메틸-8-아자-비시클로[3.2.1]옥트-3-일)-2,2-디페닐-프로피온산;
(엔도)-3-(2-시아노-2,2-디페닐-에틸)-8,8-디메틸-8-아조니아-비시클로[3.2.1]옥탄 요오다이드;
(엔도)-3-(2-시아노-2,2-디페닐-에틸)-8,8-디메틸-8-아조니아-비시클로[3.2.1]옥탄 브로마이드;
3-((엔도)-8-메틸-8-아자-비시클로[3.2.1]옥트-3-일)-2,2-디페닐-프로판-1-올;
N-벤질-3-((엔도)-8-메틸-8-아자-비시클로[3.2.1]옥트-3-일)-2,2-디페닐-프로피온아미드;
(엔도)-3-(2-카르바모일-2,2-디페닐-에틸)-8,8-디메틸-8-아조니아-비시클로[3.2.1]옥탄 요오다이드;
1-벤질-3-[3-((엔도)-8-메틸-8-아자-비시클로[3.2.1]옥트-3-일)-2,2-디페닐-프로필]-우레아;
1-에틸-3-[3-((엔도)-8-메틸-8-아자-비시클로[3.2.1]옥트-3-일)-2,2-디페닐-프로필]-우레아;
N-[3-((엔도)-8-메틸-8-아자-비시클로[3.2.1]옥트-3-일)-2,2-디페닐-프로필]-아세트아미드;
N-[3-((엔도)-8-메틸-8-아자-비시클로[3.2.1]옥트-3-일)-2,2-디페닐-프로필]-벤즈아미드;
3-((엔도)-8-메틸-8-아자-비시클로[3.2.1]옥트-3-일)-2,2-디-티오펜-2-일-프로피오니트릴;
(엔도)-3-(2-시아노-2,2-디-티오펜-2-일-에틸)-8,8-디메틸-8-아조니아-비시클로[3.2.1]옥탄 요오다이드;
N-[3-((엔도)-8-메틸-8-아자-비시클로[3.2.1]옥트-3-일)-2,2-디페닐-프로필]- 벤젠설폰아미드;
[3-((엔도)-8-메틸-8-아자-비시클로[3.2.1]옥트-3-일)-2,2-디페닐-프로필]-우레아;
N-[3-((엔도)-8-메틸-8-아자-비시클로[3.2.1]옥트-3-일)-2,2-디페닐-프로필]-메탄설폰아미드; 및/또는
(엔도)-3-{2,2-디페닐-3-[(1-페닐-메타노일)-아미노]-프로필}-8,8-디메틸-8-아조니아-비시클로[3.2.1]옥탄 브로마이드를 포함한다.
본 발명에 유용한 더욱 바람직한 화합물은 하기를 포함한다:
(엔도)-3-(2-메톡시-2,2-디-티오펜-2-일-에틸)-8,8-디메틸-8-아조니아-비시클로[3.2.1]옥탄 요오다이드;
(엔도)-3-(2-시아노-2,2-디페닐-에틸)-8,8-디메틸-8-아조니아-비시클로[3.2.1]옥탄 요오다이드;
(엔도)-3-(2-시아노-2,2-디페닐-에틸)-8,8-디메틸-8-아조니아-비시클로[3.2.1]옥탄 브로마이드;
(엔도)-3-(2-카르바모일-2,2-디페닐-에틸)-8,8-디메틸-8-아조니아-비시클로[3.2.1]옥탄 요오다이드;
(엔도)-3-(2-시아노-2,2-디-티오펜-2-일-에틸)-8,8-디메틸-8-아조니아-비시클로[3.2.1]옥탄 요오다이드; 및/또는
(엔도)-3-{2,2-디페닐-3-[(1-페닐-메타노일)-아미노]-프로필}-8,8-디메틸-8-아조니아-비시클로[3.2.1]옥탄 브로마이드.
적합한 항히스타민 (또한, H1-수용체 안타고니스트로서 명명됨)은 H1-수용체를 억제하는 공지된 많은 안타고니스트중 하나 이상을 포함하며, 인간 사용에 안정적이다. 제 1 생성 안타고니스트는 에탄올아민, 에틸렌디아민, 및 알킬아민 예를 들어, 디페닐히드라민, 피릴아민, 클레마스틴, 클로페니르아민의 유도체를 포함한다. 비안정성인 제 2 생성 안타고니스트는 로라티딘, 데스로라티딘, 테르펜아딘, 아스테미졸, 아크리바스틴, 아젤라스틴, 레보세티리진 펙소펜아딘 및 세티리진을 포함한다.
바람직한 항-히스타민의 예로는 로라티딘, 데스로라티딘, 펙소펜아딘 및 세티리진을 포함한다.
기타 고려되는 조합으로는 항-IL-4 제제 (예를 들어, 항-IL-4 항체 예컨대, 파스콜리주맙) 및/또는 항-IL-5 제제 (예를 들어, 항-IL-5 항체 예컨대, 메폴리주맙) 및/또는 항-IgE 제제 (예를 들어, 항-IgE 항체 예컨대, 오말리주맙 (omalizumab) (XolairTM) 또는 탈리주맙 (talizumab))과 함께 본 발명의 항체의 사용을 포함한다.
편리하게는, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 또 다른 의약을 포함하는 키트 일부의 약제 조성물과 이의 사용 설명서가 본 발명에 의해 고려된다.
또한, 본 발명은 hIL-13과 hIL-13R의 상호작용 조절에 반응적인 질환의 치료에 사용하기 위해 본원에 기술된 바와 같은 모노클로날 치료학적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 치료학적 유효량으로 포함하는 약제 조성물이 고려된다.
본 발명에 있어서, SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14로 구성된 군으로부터 선택된 VH 도메인 및 SEQ ID NO: 15, 16, 17로 구성된 군으로부터 선택된 VL 도메인을 포함하는 모노클로날 인간화된 치료학적 항체를 치료학적 유효량으로 포함하는 약제 조성물이 제공된다..
본 발명에 있어서, SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄 및 SEQ ID NO: 22, 23, 24로 구성된 군으로부터 선택된 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체를 포함하는 약제 조성물이 제공된다.
본 발명에 있어서, SEQ ID NO: 18의 중쇄 및 SEQ ID NO:22의 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제 조성물이 제공된다.
본 발명에 있어서, SEQ ID NO: 18의 중쇄 및 SEQ ID NO:22의 경쇄를 포함하는 (또는 이들로 필수적으로 구성된) 모노클로날 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제 조성물이 제공된다.
본 발명에 있어서, 치료학적 유효량의, SEQ ID NO: 18의 중쇄 및 SEQ ID NO:22의 경쇄를 포함하는 항체의 모노클로날 군집, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제 조성물이 제공된다.
본 발명에 있어서, 치료학적 유효량의, SEQ ID NO: 18의 중쇄 및 SEQ ID NO:23의 경쇄를 포함하는 항체의 모노클로날 군집, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제 조성물이 제공된다.
본 발명에 있어서, 치료학적 유효량의, SEQ ID NO: 18의 중쇄 및 SEQ ID NO:24의 경쇄를 포함하는 항체의 모노클로날 군집, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제 조성물이 제공된다.
본 발명에 있어서, 치료학적 유효량의, SEQ ID NO: 19의 중쇄 및 SEQ ID NO:22의 경쇄를 포함하는 항체의 모노클로날 군집, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제 조성물이 제공된다.
본 발명에 있어서, 치료학적 유효량의, SEQ ID NO: 19의 중쇄 및 SEQ ID NO:23의 경쇄를 포함하는 항체의 모노클로날 군집, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제 조성물이 제공된다.
본 발명에 있어서, 치료학적 유효량의, SEQ ID NO: 19의 중쇄 및 SEQ ID NO:24의 경쇄를 포함하는 항체의 모노클로날 군집, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제 조성물이 제공된다.
본 발명에 있어서, 치료학적 유효량의, SEQ ID NO: 20의 중쇄 및 SEQ ID NO:22의 경쇄를 포함하는 항체의 모노클로날 군집, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제 조성물이 제공된다.
본 발명에 있어서, 치료학적 유효량의, SEQ ID NO: 20의 중쇄 및 SEQ ID NO:23의 경쇄를 포함하는 항체의 모노클로날 군집, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제 조성물이 제공된다.
본 발명에 있어서, 치료학적 유효량의, SEQ ID NO: 20의 중쇄 및 SEQ ID NO:24의 경쇄를 포함하는 항체의 모노클로날 군집, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제 조성물이 제공된다.
본 발명에 있어서, 치료학적 유효량의, SEQ ID NO: 21의 중쇄 및 SEQ ID NO:22의 경쇄를 포함하는 항체의 모노클로날 군집, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제 조성물이 제공된다.
본 발명에 있어서, 치료학적 유효량의, SEQ ID NO: 21의 중쇄 및 SEQ ID NO:23의 경쇄를 포함하는 항체의 모노클로날 군집, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제 조성물이 제공된다.
본 발명에 있어서, 치료학적 유효량의, SEQ ID NO: 21의 중쇄 및 SEQ ID NO:24의 경쇄를 포함하는 항체의 모노클로날 군집, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제 조성물이 제공된다.
5. 임상 용도
본 발명의 항체는 아토피성 질환/질병 및 만성 염증 질환/질병의 치료에 사용될 수 있다. 특히, 천식 예컨대, 알레르기 천식, 특히 중증 천식 (전신 투여된 코르티코스테로이드를 포함한 현재 치료법에 비반응적인 천식; 문헌 [Busse WW et al, J Allergy Clin. Immunol 2000, 106: 1033-1042] 참조), "어려운(difficult)" 천식 (최대치로 권고된 용량의 처방된 흡입된 스테로이드에도 불구하고 제어되지 않음을 특징으로 하는 천식 표현형으로서 규정됨; 문헌 [Barnes PJ (1998), Eur Respir J 12:1208-1218] 참조), "과민한 (brittle)" 천식 (높은 용량의 흡입된 스테로이드에도 불구하고 넓은 최대호기류 속도 (PEF) 가변성을 유지하는 중증의 불안정한 천식을 갖는 환자의 하위 그룹으로 규정됨; 문헌 [Ayres JG et al (1998) Thorax 58:315-321] 참조), 야간 천식, 월경전 천식, 스테로이드 내성 천식 (문헌 [Woodcock AJ (1993) Eur Respir J 6:743-747] 참조), 스테로이드 의존성 천식 (높은 용량의 경구용 스테로이드로만 제어될 수 있는 천식으로서 규정됨), 아스피린 유도된 천식, 성인 천식, 소아 천식의 치료에 흥미롭다. 본 발명의 항체는 급성의 천식 에피소드 (천식 지속상태)을 예방하거나, 이의 빈도를 저하시키거나, 이의 영향을 완화시키는데 사용될 수 있다. 본 발명의 항체는 천식 치료에 사용되는 기타 약물의 요구되는 용량 (투여되는 양 또는 투여 횟수에 있어서)을 저하시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 코르티코스테로이드 치료과 같은 천식의 스테로이드 치료에 요망되는 용량을 저하시키는데 사용될 수 있다 ("스테로이드 스페어링 (steroid sparing)"). 본 발명의 항체로 치료될 수 있는 기타 질환 또는 질병으로는 아토피성 피부염, 알레르기 비염, 크론병, 만성 폐색성 폐 질환 (COPD), 호산성 식도염, 섬유성 질환 또는 질병 예컨대, 특발성 폐 섬유증, 진행성 전신 경화증 (공피증), 간 섬유증, 간 육아종, 주혈흡충증, 레슈마니아증, 및 세포 주기 조절 질환 예를 들어, 호지킨병, B 세포 만성 림프성 백혈병을 포함한다. 본 발명의 항체로 치료될 수 있는 추가의 질환 또는 질병은 상기 본 발명의 배경기술에 기술되어 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 코르티코스테로이드로의 치료에 불응성인 천식 질환에 걸린 인간 환자를 치료하는 방법으로서, 치료학적 유효량의 본 발명의 항체를 상기 환자에 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
또 다른 구체예에서, 인간 환자에서 급성 천식 발생을 예방하는 방법으로서, 치료학적 유효량의 본 발명의 항체를 상기 환자에 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
또 다른 구체예에서, 인간의 급성 천식 발생의 빈도를 저하시키고/거나 이의 효과를 완화시키는 방법으로서, 치료학적 유효량의 본 발명의 항체를 상기 환자에 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 인간 환자에서 염증 및/또는 알레르기 상해 후 Th1 타입 반응에 대한 T 헬퍼 세포 반응을 치우치게하는 방법으로서, 치료학적 유효량의 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 상기 환자에 투여하는 것을 포함하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 천식 예컨대, 중증 천식에 걸린 Q130hIL-13 변이체를 갖는 인간 환자를 치료하는 방법으로서, 치료학적 유효량의 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 상기 환자에 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
본 발명이 주로 인간 질환 또는 질병의 치료에 관한 것이지만, 본 발명은 또한 인간 이외의 포유류의 유사한 질환 또는 질병의 치료에 적용될 수 있다.
하기에서는 본 발명을 예로서 기술하겠다.
도면의 간단한 설명
도 1
증가된 농도로 재조합 E.coli-발현된 인간 IL-13으로의 마우스 모노클로날 항체 3G4의 결합을 나타내는 샌드위치 ELISA
도 2a
TF-1 세포 증식 검정에서 재조합 E.coli-발현된 인간 IL-13의 생활성을 억제하는, 증가하는 농도에서의 마우스 모노클로날 항체 3G4의 능력을 나타내는 중화 검정
도 2b
TF-1 세포 증식 검정에서 재조합 E.coli-발현된 인간 IL-13의 생활성을 억제하는, 증가하는 농도에서의 키메라 3G4의 능력을 나타내는 중화 검정
도 3
TF-1 세포 증식 검정에서 재조합 E.coli-발현된 사이노몰구스 IL-13의 생활성을 억제하는, 증가하는 농도에서의 마우스 모노클로날 항체 3G4 (및 키메라 3G4)의 능력을 나타내는 중화 검정. "캄패스"로 표시한 곡선은 본 실험에서 무관한 항체 대조군으로서 작용하는 항-CD52 인간화된 항체 알렘투주맙 (alemtuzumab)을 사용하여 수득된 것이다. "항-hIL13 폴리"로 표시한 선은 파지티브 대조군으로서 중화 폴리클로날 항-IL-13 제조물 (R&D Systems, 카탈로그 넘버 AF-213-NA)을 사용하여 수득된 것이다.
도 4
TF-1 세포 증식 검정에서 포유동물-발현된 (CHO 세포) 인간 IL-13의 생활성을 억제하는, 증가하는 농도에서의 마우스 모노클로날 항체 3G4 (및 키메라 3G4)의 능력을 나타내는 중화 검정. 캄패스 및 항-hIL13은 상기 기술된 바와 같은 대조군 시약이다.
도 5
TF-1 세포 증식 검정법에서 재조합 E.coli-발현된 Q130 인간 IL-13의 생활성을 억제하는, 증가하는 농도에서의 마우스 모노클로날 항체 3G4 및 (키메라 3G4)의 능력을 나타내는 중화 검정. 캄패스 및 항-hIL13은 상기 기술된 바와 같은 대조군 시약이다.
도 6
인간 및 사이노몰구스 IL-13에 대한 마우스 모노클로날 항체 3G4에 대한 결합 에피토프를 결정하기 위한 에피토프 맵핑 ELISA
도 7a
인간 IL-13에 대한 마우스 모노클로날 항체 3G4의 미세한 결합 특이성을 확인하기 위한 에피토프 맵핑 ELISA
도 7b
사이노몰구스 IL-13에 대한 마우스 모노클로날 항체 3G4의 미세한 결합 특이성을 확인하기 위한 에피토프 맵핑 ELISA
도 8
인간 IL-13에 대한 마우스 모노클로날 항체 3G4의 결합에 요구되는 주요 아미노산 잔기를 결정하기 위한 에피토프 맵핑 ELISA
도 9
인간 IL-13에 대한 마우스 모노클로날 항체 3G4의 결합에 요구되는 주요 아미노산 잔기를 결정하기 위한 에피토프 맵핑 ELISA
도 10
증가하는 농도에서 재조합체 E.coli-발현된 인간 IL-13에 대한 마우스 모노클로날 항체 3G4, 3G4 키메라 및 인간화된 mAb H2L1, H3L1의 결합을 나타내는 샌드위치 ELISA
도 11
TF-1 세포 증식 검정에서 재조합체 E.coli-발현된 인간 IL-13의 생활성을 억제하는, 증가되는 농도에서 마우스 모노클로날 항체 3G4, 3G4 키메라 및 인간화된 mAb H2L1, H3L1의 능력을 나타내는 중화 검정
도 12
TF-1 세포 증식 검정에서 재조합체 E.coli-발현된 인간 IL-13의 생활성을 억제하는, 증가되는 농도에서 마우스 모노클로날 항체 3G4, 3G4 키메라 및 인간화된 mAb H2L1, H3L1의 능력을 나타내는 중화 검정
도 13
TF-1 세포 증식 검정에서 포유류-발현된 (CHO 세포) 인간 IL-13의 생활성을 억제하는, 증가되는 농도에서 마우스 모노클로날 항체 3G4, 3G4 키메라 및 인간화된 mAb H2L1, H3L1의 능력을 나타내는 중화 검정
도 14
TF-1 세포 증식 검정에서 재조합체 E.coli-발현된 Q130 인간 IL-13의 생활성을 억제하는, 증가되는 농도에서 마우스 모노클로날 항체 3G4, 3G4 키메라 및 인간화된 mAb H2L1, H3L1의 능력을 나타내는 중화 검정
도 15
마우스 모노클로날 항체 3G4, 3G4 키메라 및 인간화된 mAb H2L1, H3L1은 재조합체 E.coli-발현된 인간 IL-4에 결합하지 않음을 입증하는 샌드위치 ELISA
도 16
마우스 모노클로날 항체 3G4, 3G4 키메라 및 인간화된 mAb H2L1, H3L1은 재조합체 E.coli-발현된 인간 IL-5에 결합하지 않음을 입증하는 샌드위치 ELISA
도 17
마우스 모노클로날 항체 3G4, 3G4 키메라 및 인간화된 mAb H2L1, H3L1은 인간 GM-CSF에 결합하지 않음을 입증하는 직접 결합 ELISA
도 18
증가하는 농도에서 천연 인간 IL-13으로의 마우스 모노클로날 항체 3G4, 3G4 키메라 및 인간화된 mAb H2L1, H3L1의 결합을 나타내는 샌드위치 ELISA
도 19
인간 IL-13 수용체 α1 사슬로의 재조합체 E.coli-발현된 인간 IL-13 결합을 억제하는, 증가하는 농도에서의 마우스 모노클로날 항체 3G4, 3G4 키메라 및 인간화된 mAb H2L1, H3L1의 능력을 나타내는 ELISA
도 20
인간 IL-13 수용체 α2 사슬로의 재조합체 E.coli-발현된 인간 IL-13 결합을 억제하는, 증가하는 농도에서의 마우스 모노클로날 항체 3G4, 3G4 키메라 및 인간화된 mAb H2L1, H3L1의 능력을 나타내는 ELISA
1. 모노클로날 항체의 생성 및 마우스 모노클로날 항체 3G4의 특성
5마리의 SJL 마우스에 E.coli로부터 유래된 2㎍ 재조합체 인간 IL-13을 각각 복강내 주입함으로써 상기 마우스를 면역화시켰다 (Cambridge Bioscience, Cat. No. CH- 013). 마우스로부터의 비장 세포를 제거하고, B 림프구를 PEG1500 (Boehringer)를 사용하여 P3X로부터 유래된 마우스 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마를 생성시켰다. 개개의 하이브리도마 세포주를 제한 희석에 의해 클로닝하였다 (E Harlow and D Lane). 단일 콜로니를 함유하는 웰을 미세현미경으로 확인하고, 활성에 대해 상청액을 시험하였다. 가장 활성인 클론으로부터의 세포를 동결보존, 항체 생성 등을 위해 확대시켰다. 먼저, 하이브리도마 상청액을 샌드위치 검정 포맷에서 E.coli-발현된 재조합체 det-1 태깅된 인간 IL-13 단백질 (자체 제조됨)에 대한 결합 활성을 스크리닝하였다. BIAcoreTM 방법을 이용하여 이들 파지티브의 이차 스크린을 완료하여 det-1 태깅된 인간 IL-13 단백질로의 결합을 검출하였다. 이들 하이브리도마로부터의 샘플을, TF-1 세포 생검정에서 E.coli-발현된 재조합 인간 IL-13 (Cambridge Bioscience, cat. no CH-013)의 생활성을 중화시키는 능력에 대해 시험하였다.
인간 IL-13 중화 생검정으로부터 확인된 포지티브를 제한 희석에 의해 서브클로닝하여 안정한 모노클로날 세포주를 생성시켰다. 혈청 비함유 조건하에 세포 공장에서 성장된 이들 하이브리도마로부터의 면역글로불린을 고정화된 단백질 A 칼럼을 사용하여 정제하였다. 그 후, 이러한 정제된 mAb를 동일한 세개의 검정 시스템에서 재스크리닝하였다.
모노클로날 항체 3G4를 인간 IL-13 생활성을 중화시키는 잠재적 항체로서 확인하였다.
3G4는 SEQ ID NO:7의 VH 영역 아미노산 서열을 갖는다.
3G4는 SEQ ID NO:8의 VL 영역 아미노산 서열을 갖는다.
키메라 항체를 3G4 뮤린 모노클로날 항체로부터 가변 영역을 취하고, 이들을 인간 IgG1/k 야생형 C 영역으로 이식함으로써 작제하였다. 인간 시그널 서열 (SEQ ID NO:43에 기재된 바와 같은)을 이들 작제물을 작제하는데 사용하였다. 이러한 키메라 항체는 3G4C로 명명되었다.
1.1. E.coli-발현된 재조합 인간 IL-13으로의 결합
샌드위치 ELISA에서 E.coli-발현된 재조합체 인간 IL-13에 결합된 3G4를 실시예 6.1에 기술된 바와 같이 처리하였다 (도 1 참조).
1.2 TF-1 세포 증식 생검정에서 E.coli-발현된 재조합체 인간 및 사이노몰구스 IL-13의 중화
인간 IL-13 및 사이노몰구스 IL-13에 대한 반응에서 TF-1 세포 증식. 인간 및 사이노몰구스 IL-13-유도된 TF-1 세포 증식의 중화 능력을 평가하기 위해 생검정을 개발하였다. 방법은 실시예 6.2에 기술된 바와 같이 수행하였다.
사이노몰구스 IL-13에 대한 아미노산 서열 및 cDNA 서열 (시그널 서열 미포함)은 각각 SEQ ID NO:41 및 SEQ ID NO:42에 기술되어 있다.
3G4는 TF-1 세포 생검정시 재조합체 인간 IL-13의 생활성을 중화시켰다 (도 2a 참조).
3G4는 인간 IL-13 보다는 덜 유효하게 사이노몰구스 IL-13 생활성을 중화시켰다 (도 3 참조).
모노클로날 항체 3G4에 의한 TF-1 세포 생검정에서 약 10ng/ml의 E.coli-발현된 재조합체 사이노몰구스 IL-13 생활성을 중화시키는데 0.13㎍/ml의 평균 ND50 값이 계산되었다 [ND50 (중화 용량) 값은 지정 농도의 IL-13에 반응하여 TF-1 세포 증식을 50% 저하시키는데 요구되는 모노클로날 항체의 농도이다].
1.3 TF-1 세포 증식 생검정에서 포유동물-발현된 (CHO 세포) 인간 IL-13의 중화
CHO 세포로부터 발현된 인간 IL-13에 대한 모노클로날 항체 3G4의 중화 능력을 TF-1 세포 증식 검정에서 평가하였다. 실시예 6.2에 기술된 방법을 수행하였다. 3G4는 시중에서 입수가능한 항-인간 IL-13 폴리클로날 시약보다 더욱 효과적으로 포유류-발현된 인간 IL-13을 중화시켰다. 모노클로날 항체 3G4에 의한 TF-1 세포 생검정에서 ~20ng/ml 포유류-발현된 인간 IL-13을 중화시키는데 0.31㎍/ml의 평균 ND50 값이 계산되었다. 도 4 참조.
1.4 TF-1 세포 증식 생검정에서 재조합체 Q130 인간 IL-13 변이체의 중화
E.coli-발현된 재조합체 Q130 인간 IL-13 (Peprotech, Cat. No. 200-13A)에 대한 모노클로날 항체 3G4의 중화 능력을 TF-1 세포 증식 검정으로 평가하였다. 실시예 6.2에 기술된 바와 같이 방법을 수행하였다. 3G4는 시중에서 입수가능한 항-인간 IL-13 폴리글로날 시약보다 더욱 유효하게 Q130 인간 IL-13을 중화시켰다. 모노클로날 항체 3G4에 의한 TF-1 세포 생검정에서 ~60ng/ml Q130 인간 IL-13 생활성을 중화시키는데 0.025㎍/ml의 평균 ND50 값이 계산되었다. 도 5 참조.
1.5 BIAcore TM 분석
재조합제 인간 및 사이노몰구스 IL-13에 대한 3G4 마우스 mAb의 친화도를 BIAcoreTM (표면 플라스몬 공명) 검정에 의해 평가하였다. 표 2 참조.
BIAcoreTM 검정을 항-마우스 IgG 포획을 이용하여 수행하였다. 항-마우스 IgG 항체를 제조업자 권고에 따라 일차 아민 커플링에 의해 CM5 칩상에 결합시켰다. 그 후, 3G4 어미 마우스 mAb를 이러한 표면상에 포획시키고, 인간 또는 사이노몰구스 IL-13은 규정된 농도에서 통과하였다. 표면을 완만한 산 용리 조건을 이용하여 항-마우스 IgG 표면에 대해 재생시켰으며, 이는 후속 IL-13 결합에 대한 항체의 포획 능력에 현저하게 영향을 끼치지 않았다. 이러한 작업을 Biacore 3000에서 수행하고, 기계 고유의 평가 소프트웨어를 사용하여 분석하고, 데이타를 1:1 결합 모델을 이용하여 분석하였다. 인간 IL-13 결합에 대한 데이타는 재조합 E.coli-발현된 Det-1 태깅된 인간 IL-13 및 시중의 재조합체 E.coli-발현된 비태깅 된 인간 IL-13 시약 (Peprotech)을 사용하여 생성시켰다. 재조합체 E.coli-발현된 사이노몰구스 IL-13은 GSK에서 생성하였다. 모든 Biacore를 25℃에서 수행하였다.
표 2. 인간 및 사이노몰구스 IL-13으로의 어미 3G4 마우스 mAb 결합에 대한 Biacore 3000 데이타
Figure 112008057105853-PCT00003
Det-1 태깅된 인간 IL-13에 있어서, 데이타는 2개의 독립적인 실험으로부터 유도되었으며, 이 둘은 이중으로 수행한 것이다. 데이타는 이들 결과의 평균 및 표준 편차 (괄호내)로 나타내었다.
인간 IL-13 (Peprotech) 및 사이노몰구스 IL-13 (GSK 제조)에 있어서, 데이타는 하나의 실험으로부터의 결과이며, 이러한 실험은 이중으로 수행한 것이다.
상기 기술된 데이타에 있어서, 이중 수행한 값을 함께 분석하여 한 실험에 대해 하나의 값을 제공하였다.
이들 데이타는 3G4 마우스 mAb가 인간 IL-13에 대해 매우 높은 결합 친화도를 가지며, 사이노몰구스 IL-13에 대한 3G4 마우스 mAb의 결합 친화도는 비교시 덜 유효함을 나타낸다.
2. 클론 3G4의 인간화
2.1 서열 분석
3G4 가변 영역의 서열을 기타 뮤린 및 인간 면역글로불린 서열과 비교하였다. 이는 FASTA 및 BLAST 프로그램을 사용하였으며, 검열에 의해 수행하였다.
3G4에서 하기 프레임워크 잔기는 항체의 CDR-이식된 (인간화된) 버젼의 설계에서 잠재적으로 중요한 것으로 확인되었다:
위치 3G4 VH
10 D
30 I
93 T
위치는 Kabat 등의 넘버링 시스템에 따른다.
위치 3G4 VH
98 L
3G4 VH에 대한 적합한 인간 수용체 프레임워크가 확인되었다:
SEQ DI NO: 44
3G4 VL에 대한 적합한 인간 수용체 프레임워크가 확인되었다:
SEQ DI NO: 45
SEQ ID NO: 44에서, CRDH1 및 H2가 존재하며, CDRH3은 XXXXXXXXXX에 의해 나타내었다. SEQ ID NO: 45에서, CRDL1 및 L2가 존재하며, CDRL3은 XXXXXXXXX에 의해 나타내었다.
CDR 이식에서, 전형적으로, 만족할만한 결합을 달성하기 위해서는 공여체 항체로부터 하나 이상의 프레임워크 잔기를 수용체 프레임워크에 이들 정형의 위치에 포함시키는 것이 요구된다. 상기 기술된 것 이외에, 하기 뮤린 프레임워크 잔기가 또한, 인간화된 항체 설계내로 보유가 가능할 것으로 고려되었다:
Figure 112008057105853-PCT00004
Figure 112008057105853-PCT00005
만족할만한 활성을 갖는 인간화된 항체를 수득하기 위해 상이한 역변이를 갖는 4개의 인간화된 VH 작제물을 설계하였다. 이들은 H1에서 H4로 넘버링하였다.
H1은 특정화된 수용체 서열로 3G4 VH CDR이 이식된 CDR 이식물로 이루어진다. 또한, H1은 위치 30번에서 뮤린 잔기를 함유한다 (이소류신). 이는 CDR의 Kabat 규정 밖에 있으며, Chothia의 CDR H1 규정내에 있다. 이러한 경우, 이러한 잔기는 진정한 프레임워크 역변이체라기 보다는 CDR의 일부로서 간주된다.
H2는 H1과 동일하나, 93번 위치의 아미노산이 알라닌 대신 트레오닌인 역변이를 갖는다. H3는 H2와 동일하나, 10번 위치의 아미노산이 글루탐산 대신 아스파르트산인 추가적인 역변이를 갖는다. H4는 H3과 동일하나, 67번 (발린 대신 알라닌), 69번 (메티오닌 대신 류신), 71번 (아르기닌 대신 알라닌) 및 73번 (트레오닌 대신 리신)에서 4개의 추가적인 역변이를 갖는다.
상이한 역변이를 갖는 3개의 인간화된 VL 작제물은 만족할만한 활성을 갖는 인간화된 항체를 수득하기 위해 고안되었다. 이들은 L1 내지 L3으로 넘버링하였다.
L1은 CDR의 Kabat 규정을 이용하여 특이적 수용체 서열로 3G4 VL CDR이 이식된 CDR 이식물로 구성된다. L2는 L1과 동일하나, 98번 위치에서 아미노산이 페닐알라닌 대신 류신인 역변이를 갖는다. L3은 L2와 동일하나, 76번 위치에서 아미노산이 세린 대신 아스파라긴인 추가적인 역변이를 갖는다.
인간화된 V H 작제물 H1:
SEQ ID NO:11
인간화된 V H 작제물 H2:
SEQ ID NO:12
인간화된 V H 작제물 H3:
SEQ ID NO:13
인간화된 V H 작제물 H4:
SEQ ID NO:14
인간화된 V L 작제물 L1 :
SEQ ID NO:15
인간화된 V L 작제물 L2:
SEQ ID NO:16
인간화된 V L 작제물 L3:
SEQ ID NO:17
2.2 3G4의 인간화
인간화된 VH 및 VL 작제물을 Rld 및 Rln 포유동물 발현 벡터로 클로닝하기 위한 제한 부위를 포함하는 중복 올리고누클레오티드 및 인간 시그널 서열을 새로이 형성시킴으로써 제조하였다. Hind III 및 Spe I 제한 부위를 유입시켜 인간 γ1 야생형 불변 영역을 함유하는 Rld로 클로닝하기 위한 인간 시그널 서열 (SEQ ID NO: 43)을 함유하는 VH 도메인을 프레임하였다. Hind III 및 BsiW I 제한 부위를 유입시켜 인간 카파 불변 영역을 함유하는 Rln으로 클로닝하기 위한 인간 시그널 서열을 함유하는 VL 도메인을 프레임하였다. 이는 WO 2004/014953에 기재되어 있다.
3. 인간화된 항체의 발현 및 특성 결정
인간화된 VH 작제물 (H1, H2, H3 및 H4) 및 두개의 인간화된 VL 작제물 (L1 및 L2)을 Rld hCγ1wt 및 Rln hCκ 인간화된 발현 벡터내에서 제조하였다. 플라스미드 중쇄-경쇄 조합 (H1L1, H1L2, H2L1, H2L2, H3L1, H3L2, H4L1, H4L2)를 일시적으로 CHO 세포로 공동트랜스펙션시키고, 소규모로 발현시켜 8개의 상이한 인간화된 항체를 수득하였다.
CHO 세포 상청액중의 생성된 항체 및 후속의 정제된 항체 배치를, 인간 IL-13 중화 생검정으로 인간 IL-13 결합 ELISA에서의 활성을 분석하고, BIAcoreTM에 의해 인간 IL-13으로의 결합을 분석하였다. 이들 검정 각각에서 모든 8개의 인간화된 mAb는 인간 IL-13의 결합 및/또는 중화를 나타내었다. H2L1 및 H3L1은 제한된 수의 역변이를 제공하면서, BIAcoreTM에 의한 인간 IL-13으로의 결합 및 인간 IL-13 중화 생검정에서 더욱 우수한 성능으로 인해 추가 검정에 선택되었다.
3.1 E.coli 발현된 재조합체 인간 IL-13으로의 결합
3G4C, H2L1 및 H3L1은 샌드위치 ELISA에서 E.coli 발현된 재조합체 인간 IL13과 유사한 프로필로 결합하였다. 방법은 실시예 6.1A에 기술된 바와 같이 수행하였다. 표 3은 평균 ED50 값을 나타낸다 (도 10 참조). [ED50 (유효량)는 본 ELISA에서 IL-13으로의 반최대 결합에 필요한 항체의 농도이다]
표 3
mAb ED50 (㎍/ml) 표준 오차
키메라 3G4 0.04 0.021
H2L1 0.04 0.001
H3L1 0.05 0.007
3G4, 3G4C, H2L1 및 H3L1은 또한, ELISA에 의해 인간 IL-13 수용체 사슬 (IL13Rα1 및 IL13Rα2)로의 인간 IL-13 결합을 억제하는 것으로 나타났다. 이러한 방법은 실시예 6.5 및 6.6에 기술된 바와 같이 수행하였다.
도 19는 IL13Rα1로의 결합 억제를 입증하는 데이타를 나타낸다.
표 4는 IL13Rα2로의 결합 억제에 대한 평균 IC50 값이다. [IC50는 지정된 양의 인간 IL-13의 IL13Rα2로의 결합을 50% 억제하는데 요구되는 mAb의 농도이다].
표 4
Figure 112008057105853-PCT00006
도 19는 3G4, 3G4, H2L1, 및 H3L1이 유사한 효력으로 인간 IL-13의 IL13Rα1로의 결합을 억제함을 보여준다.
도 20은 3G4, 3G4C, H2L1, 및 H3L1이 유사한 효력으로 인간 IL-13의 IL13Rα2로의 결합을 억제함을 보여준다.
3.2 천연 인간 IL-13으로의 결합
HDLM-2 세포주 (원래 골수로부터 유래된 리드-스타인버그형 (Reed-Steinberg-like) 세포주)로 인간 IL-13을 제조하고, 이를 성장을 위해 오토크린 양식에 사용하였다. 이러한 천연 인간 IL-13은 HDLM-2 세포 상청액으로 분비되었다. 이를 이용하여 천연 인간 IL-13에 대한 3G4, 3G4C, H2L1 및 H3L1의 결합을 실시예 6.1B에 기술된 방법에 따라 평가하였다. ELISA에 의해, 모든 네개의 항체가 어미 3G4 mAb와 매우 유사한 성능으로 HDLM2 세포 상청액중의 천연 인간 IL-13에 결합함 을 확인하였다. 도 18 참조.
3.3. TF-1 세포 증식 생검정에서 E.coli 발현된 재조합체 인간 및 사이노몰구스 IL-13의 중화
3G4, 3G4C, H2L1 및 H3L1는 E-coli 발현된 재조합체 인간 및 사이노몰구스 IL-13의 생활성을 중화시켰다. 방법은 실시예 6.2A에 기술된 바와 같이 수행하였다. 3G4, 3G4C, H2L1 및 H3L1는 E-coli 발현된 재조합체 사이노몰구스 IL-13의 생활성을 인간 IL-13 보다 덜 유효하게 중화시켰다. [ND50 (중화 용량)은 지정 농도의 IL-13에 반응하여 TF-1 세포 증식을 50%까지 저하시키는데 요구되는 mAb의 농도이다].
하기 표 5 및 도 11 및 12 참조.
표 5
Figure 112008057105853-PCT00007
약 10ng/ml를 중화시키는 것으로 계산된 3G4에 대한 평균 ND50 값은 0.049㎍/ml이다. 표 5의 결과는 4개의 독립된 값의 평균이다. 수득된 값은 이전에 수득 된 ND50 값에 필적하지만, 이 보다 약 2배 낮다 (실시예 1.2 참조).
어미 3G4 마우스 mAb에 대해 수득된 E.coli 발현된 인간 IL13의 중화 수준은 키메라 3G4에 의해 수득된 값에 필적하다. H2L1 및 H3L1의 효력은 어미 3G4 마우스 mAb 및 키메라 3G4 둘 모두와 비교하여 감소되었다.
3G4 어미에 대한 평균 ND50 값은 34㎍/ml이다. 이는 TF-1 검정에서 약 10ng/ml의 E.coli-발현된 재조합체 사이노몰구스 IL-13 생활성을 중화시키는 것으로 계산된 값이다. 이 값은 어미 3G4에 대해 이전에 기록된 값과 유사하였다 (실시예 1.2 참조). H2L1 및 H3L1 또한, 사이노몰구스 IL13에 대해 3G4와 유사한 효력을 나타내었다.
3.4 TF-1 세포 증식 생검정에서 포유동물 발현된 (CHO 세포) 인간 IL-13의 중화
CHO 세포로부터 발현된 인간 IL-13에 대한 모노클로날 항체 3G4, 3G4C, H2L1 및 H3L1의 중화 능력을 실시예 6.2A에 기술된 바와 같은 방법에 따라 TF-1 세포 증식 검정으로 평가하였다. 3G4, 3G4C, H2L1 및 H3L1은 재조합체 CHO-발현된 인간 IL13의 생활성을 중화시켰다 (표 6 및 도 13 참조). [ND50 (중화 용량)은 지정된 농도의 IL-13에 대한 반응에서 TF-1 세포 증식을 50%까지 저하시키는데 요구되는 mAb의 농도이다].
표 6
Figure 112008057105853-PCT00008
3G4 어미에 대한 평균 ND50 값은 0.05㎍/ml이다. 이는 TF-1 세포 생검정에서 ~ 10ng/ml의 포유류-발현된 인간 IL-13을 중화시키기 위한 값으로 계산되었다. 이 값은 이전에 수득된 값과는 상이하였다 (실시예 1.3 참조). 그러나, 이들 실험에서 TF-1 세포의 증식을 자극하는데 사용된 인간 IL13의 양이 이전에 사용한 값보다 낮았다 (10ng/ml). 어미 3G4 mAb에 의해 달성된 CHO 발현된 인간 IL13의 중화 수준은 3G4C의 수준보다 약간 우수하였다. H2L1 및 H3L1의 효능은 어미 3G4 mAb 및 키메라 3G4와 비교하여 저하되었다.
3.5 TF-1 세포 증식 생검정에서 재조합체 Q130 인간 IL-13 변이체의 중화
E.coli-발현된 재조합체 Q130 인간 IL-13에 있어서 3G4, 3G4C, H2L1 및 H3L1의 중화 능력을 TF-1 세포 증식 검정에서 평가하였다. 방법은 실시예 6.2A에 기술된 것으로 수행하였다. 0.274㎍/ml의 ND50 값을 수득하였다. 이는 이전에 수득된 ND50 값과 상이하였다 (실시예 1.4 참조). 이들 ND50 값을 확인하기 위해 이러한 검 정을 수차례 반복하였다. (상이한 횟수로 수행된) 양 세트의 실험에 사용된 시중 공급원의 Q130 인간 IL-13 제조물의 품질로 인해 이들 2개 데이타 세트에 대해 관찰된 차이가 설명될 수 있다. 표 7은 모두 유사한 3G4C, H2L1 및 H3L1의 효력을 나타낸다. 도 14 참조.
표 7
Figure 112008057105853-PCT00009
3.6 BIAcore TM 분석
재조합체 인간 및 사이노몰구스 IL-13에 대한 3G4C, H2L1 및 H3L1의 친화도를 BIAcoreTM 분석에 의해 평가하였다. 표 8, 9 및 10 참조.
분석은 단백질 A 포획물 (Protein A capture)을 사용하여 수행하였다. 간단하게는, 제조업자의 권고에 따라 단백질 A를 일차 아민 커플링에 의해 CM5 칩상에 결합시켰다. 그 후, 키메라 항체 또는 인간화된 항체를 이러한 표면상에 포획시키고, 인간 또는 사이노몰구스 IL-13은 규정된 농도에서 통과하였다. 표면을 완만한 산 용리 조건을 이용하여 단백질 A 표면에 대해 재생시켰으며, 이는 후속 IL-13 결 합에 대한 항체의 포획 능력에 현저하게 영향을 끼치지 않았다. 이러한 작업을 Biacore 3000 및 T100 Biacor 기기에서 수행하고, 기계 고유의 평가 소프트웨어를 사용하여 분석하고, 데이타를 1:1 결합 모델에 적용시켰다. 데이타는 두 기기간에 약간의 차이가 있었지만, 인간 IL-13에 결합하는 키메라 및 인간화된 항체에 대한 동력은 두 기기에 있어서 유사하였다. 그러나, 인간 IL-13에 대한 결합 데이타는 모든 작제물에 대한 1:1 모델에 잘 적용되었으나, 사이노몰구스 IL-13에 대한 결합에는 잘 적용되지 않았으며, 실제 값이 이의 빈약한 적용성 및 분석의 어려움으로 인해 보고된 것보다 약간 나쁠 가능성이 있을 수 있다 (예를 들어, 2-3배 차). 비태깅된 재조합체 인간 또는 사이노몰구스 IL-13 (GSK 제조)을 사용하여 데이타를 생성시켰다. 모든 Biacore를 25℃에서 수행하였다.
표 8: 인간 IL-13으로의 키메라 및 인간화된 항체 결합에 대한 Biacore 3000 데이타
Figure 112008057105853-PCT00010
키메라 3G4에 있어서, 데이타는 4개의 독립적인 실험으로부터 수득하였다 (이들중 두개는 이중으로 수행된 것이며, 이중으로 수행된 것 각각을 별도로 분석하였다). H2L1 및 H3L1 인간화된 mAb에 있어서, 데이타는 이중으로 수행된 2개의 독립적인 실험으로터 수득되었다 (이중으로 수행된 것 각각을 별도로 분석하였다). 데이타는 이들 값의 평균 및 표준 편차 (괄호)로서 나타내었다.
표 9: 인간 IL-13으로의 키메라 및 인간화된 항체 결합에 대한 T100 데이타
Figure 112008057105853-PCT00011
데이타는 2개의 독립적인 실험으로부터 수득되며, 이들 결과의 평균 및 표준 편차 (괄호)로 나타내었다.
3G4 키메라 항체 및 인간화된 mAb H2L1 및 H3L1은 높은 친화도로 인간 IL-13에 결합하며, 이들 데이타는 인간 IL-13에 있어서 어미 3G4 마우스 mAb의 결합 친화도에 필적한다.
표 10: 사이노몰구스 IL-13으로의 키메라 및 인간화된 항체 결합에 대한 T100 데이타
Figure 112008057105853-PCT00012
데이타는 단일 실험으로부터 수득하였다. 3G4 키메라 항체 및 인간화된 mAb H2L1 및 H3L1은, 인간 IL-13에 대한 결합 친화도와 비교하여 더 낮은 친화도로 사이노몰구스 IL-13에 결합한다.
3.7 인간 IL-13으로의 결합에 대한 3G4C, H2L1 및 H3L1의 특이성
인간 IL-13에 대한 3G4C, H2L1 및 H3L1의 특이성을 결합 ELISA에서 인간 IL-4, 인간 IL-5 및 인간 GM-CSF에 대한 가교-반응성 효력에 대한 분석에 의해 평가하였다. 이들 방법은 각각 섹션 6.7, 6.8 및 6.9에 기술된 바와 같이 수행하였다. 도 15, 16 및 17 참조. 이들 mAb는 IL-13으로의 결합에 특이적인 것으로 밝혀졌으며, 30㎍/ml 이하의 mAb 농도에서 인간 IL-4, 인간 IL-5 또는 인간 GM-CSF에 대한 교차 반응성이 없었다. 3G4 키메라는 30㎍/ml에서 인간 IL-5에 일부 결합을 나타내는 것으로 보여지며, 이는 아마도, 피펫팅 에러로 인한 것이며, 이러한 관찰은 유사한 농도의 인간화된 mAb H2L1 및 H3L1에서는 관찰되지 않았다.
4. 바이오티닐화된 펩티드를 사용한 3G4의 에피토프 맵핑
일련의 에피토프 맵핑 실험을 수행하여 IL-13의 어느 아미노산 잔기가 3G4 마우스 mAb의 결합에 요구되는 지를 측정하였다.
4.1 인간 및 사이노몰구스 IL-13에 대한 3G4 마우스 mAb 결합 에피토프의 미정제 맵핑
4를 차감시킨 바이오티닐화된 16머 펩티드를 합성하여 인간 및 사이노몰구스 IL-13에 대한 마우스 mAb 3G4에 의해 인지된 결합 에피토프의 위치를 맵핑하였다. 실시예 6.3에 기술된 바와 같이 ELISA 방법을 사용하여 어미 마우스 mAb 3G4로의 고정된 바이오티닐화된 펩티드의 결합을 검출하였다. 16머 맞춤 디자인 펩티드의 상세 내역: 88 x 16머, 4 차감 (Mimotopes, Australia).
포맷: 펩티드 25 & 44 = 바이오틴-SGSG-펩티드-산
펩티드 2-24 & 27-43 = 바이오틴-SGSG-펩티드-아미드
Figure 112008057105853-PCT00013
Figure 112008057105853-PCT00014
(*는 높은 수소성 값을 나타냄)
두개의 펩티드에 결합된 3G4 마우스 mAb가 하기와 같이 나타내었다 (도 6 참조).
Figure 112008057105853-PCT00015
펩티드 25는 인간 IL-13으로부터 유래된다.
펩티드 44는 사이노몰구스 IL-13으로부터 유래된다.
NB: 굵은체는 인간 IL-13과 사이노몰구스 IL-13 상동체간의 잔기 차이를 나타낸다.
4.2 바이오티닐화된 펩티드를 사용한 인간 및 사이노몰구스 IL-13에 대한 3G4 마우스 mAb 결합 에피토프의 미세 맵핑
인간 IL-13에 대한 마우스 mAb 3G4에 대한 최소 결합 에피토프를 펩티드 서열 QFVKDLLLHLKKLFREGRFN (SEQ ID NO:90) 주위에 기초한 펩티드 세트를 사용하여 측정하였다. 마우스 mAb 3G4에 대한 정확한 선형 결합 에피토프를 규정하기 위해 이러한 어미 펩티드 서열의 N 또는 C-말단으로부터 1개의 아미노산이 연속하여 제거된 펩티드를 수득하였다. 유사한 방법을 위하여 사이노몰구스 IL-13에 대한 결합을 맵핑하였다. ELISA 방법 (실시예 6.4에 기술된 바와 같이 수행)을 이용하여 어미 마우스 mAb 3G4에 대한 고정화된 바이오티닐화된 펩티드의 결합을 검출하였다 (도 7a 및 7b).
결과는 어미 마우스 mAb 3G4가 인간 IL-13의 C-말단 영역에서 최소 아미노산 에피토프 LLHLKKLFREG (SEQ ID NO: 91)에 결합함을 나타낸다. 그러나, 상기 펩티드 서열 (인간 IL-13 서열)의 N-말단에 인접하게 위치한 2개의 아미노산 (D 및 L)이 결합에 중요할 수 있는데, 그 이유는 이들 잔기가 존재하는 경우 결합 시그널이 향상되기 때문이다. 유사하게는, 상기 펩티드 서열 (인간 IL-13 서열)의 C-말단에 인접하게 위치한 3개의 아미노산 (R, F 및 N)이 결합에 중요할 수 있는데, 그 이유는 R 및 F가 존재하는 경우 결합 시그널이 손실되나, N 잔기가 존재하는 경우 결합 시그널이 복구되기 때문이다.
사이노몰구스 IL-13 펩티드 세트로의 마우스 mAb 3G4의 결합에 있어서 유사한 결과가 수득되었다. 결과는 어미 마우스 mAb 3G4가 사이노몰구스 IL-13의 C-말단 영역에서 최소 아미노산 에피토프 LLVHLKKLFREG (SEQ ID NO:98)에 결합함을 나타낸다. 그러나, 상기 펩티드 서열 (사이노몰구스 IL-13 서열)의 N-말단에 인접하게 위치한 1개의 아미노산 (D)이 결합에 중요할 수 있는데, 그 이유는 결합 시그널이 이 잔기가 존재하는 경우 향상되기 때문이다. 유사하게는, 상기 펩티드 서열(사이노몰구스 IL-13 서열)의 C-말단에 인접하게 위치한 3개의 아미노산 (Q, F 및 N)이 결합에 중요할 수 있는데, 그 이유는 Q 및 F가 존재하는 경우 결합 시그널이 손실되나, N 잔기가 존재하는 경우 결합 시그널이 복구되기 때문이다.
4.3 바이오티닐화된 펩티드를 사용한 마우스 mAb 3G4 결합 에피토프의 알라닌 스캐닝
마우스 mAb 3G4와 인간 IL-13의 상호작용과 관련된 주요 잔기를 확인하기 위해, 어미 펩티드 서열 QFVKDLLLHLKKLFREGRFN (SEQ ID NO:90)을 사용하여 알라닌 스캐닝 방법을 채택하였다. 이러한 분석에 있어서, 표 11에 지정된 바와 같은 펩티드를 수득하였으며 (AnaSpec Inc), 여기서 하나의 아미노산이 어미 QFVKDLLLHLKKLFREGRFN (SEQ ID NO:90) 에피토프의 LKKLFRE (SEQ ID NO:92) 부분에서 각 아미노산 위치 잔기에서 알라닌 잔기에 대해 연속적으로 치환되었다.
표 11
Figure 112008057105853-PCT00016
ELISA 방법을 이용하여 (실시예 6.4에서와 유사하게) 어미 마우스 mAb 3G4로의 고정화된 바이오티닐화된 펩티드의 결합을 검출하였다 (도 8 참조).
이들 데이타는 어미 마우스 mAb 3G4와 인간 IL-13의 상호작용에 관련된 주요 아미노산 잔기가 적어도 107번 위치의 아르기닌 (R), 103번 위치의 리신 (K) 및 104번 위치의 리신 (K)임을 확인시켜 준다. 이들 넘버링은 WO2006/003407에 기술된 바에 따른다.
상기 분석이 단지 최소 결합 에피토프의 LKKLFRE (SEQ ID NO:92) 부분을 스 캐닝하였기 때문에, 표 12에 기술된 추가 세트의 펩티드를 수득하여 최소 결합 에피토프중의 다른 아미노산 잔기에 대한 알라닌 스캐닝 연구를 확대시켰다.
표 12
Figure 112008057105853-PCT00017
또한, ELISA 방법을 이용하여 (실시예 6.4에서와 유사하게) 어미 마우스 mAb 3G4로의 고정화된 바이오티닐화된 펩티드의 결합을 검출하였다. 도 9 참조 (본 실험에서, 펩티드 QFVKDLLLHLKKLFREGRFN (SEQ ID NO: 90)은 최대 결합을 나타내는 파지티브 대조군이며, 펩티드 QFVKDLLLHLKKLFAEGRFN (SEQ ID NO:104)는 최소 결합을 나타내는 네거티브 대조군이다).
이들 데이타는, 111번 위치에서 페닐알라닌 (F) 잔기가 또한 인간 IL-13과 어미 마우스 mAb 3G4의 상호작용에 중요함을 시사한다. 이들 잔기의 넘버링은 WO2006/003407에 기술된 바에 따른다.
5. 사이노몰구스 천식 모델에서 인간화된 항-IL-13 mAb의 효능
본 실시예는 전조이다.
사이노몰구스 원숭이 (Macaca fascicularis)에서 아스카리스 섬(Ascaris suum)-유도된 (A.suum) 폐 기관지수축 모델은 인간 천식과 가장 유사하고 관련된 비임상 모델로서 넓게 인식되었다 (Patterson R, et a/ Trans. Assoc. Am. Physicians 1980 93:317-325; Patterson R, et al J. Lab. Clin. Med. 1983 101 :864-872).
이 모델에서, A.suum에 대해 선천적 폐 민감성을 갖는 동물을 천식 반응을 유도하기 위해 중화된 A.suum에 노출시켰다. 이러한 천식 반응은 기도 과반응성 (AHR), 기관지폐포 세척액 (BAL)에서 측정된 바와 같은 세포 침투 및 혈청 IgE 수준을 측정함으로써 특성 결정될 수 있다. 실험 방법은 문헌 [Mauser P, et al in Am. J. Resp. Crit. Care Med. 1995 204:467-472 and by Evanoff H, et al in Immunologic Investigation 1992 21 :39]에 기술된 것과 유사하다.
본 연구는 특이적 용량의 A.suum 항원에 대한 파지티브 기관지수축제 반응이 입증된 사전 선택된 30마리 동물을 이용하였다. A.suum을 각 동물에 대한 최적 반응 용량으로 투여하였다. 이는 에어로졸 흡입에 의해 적어도 40%의 RL (폐 내성) 증가 및 적어도 35%의 CDYN (동순응도) 감소를 유도하는 사전 측정된 용량의 A.suum이다 (뉴블라이저를 사용하여 15회 호흡에 걸쳐 제공된 단일 용량).
본 연구는 2 페이스에서 수행하였다. 페이스 1 동안, AHR은 A.suum 항원 투여 (A.suum이 에어로졸 흡입에 의해 각각의 동물에 최적의 사전결정된 용량으로 투여되는 경우, 9일 및 10일에) 전 (1일에 기준선 폐 작용 평가) 및 후 (11일)에 정 맥내 (i/v) 히스타민 (즉, 기준선 (PC30) 위로 적어도 30% RL 증가를 유도하기에 충분한 히스타민 용량) 자극에 대해 평가되었다.
페이스 2는 동물을 항체로 처리하는 것을 제외하고는 페이스 1과 동일하며 (하기 참조), 각각의 항체는 1, 5 및 9일에 i/v 주입에 의해 약 30mg/kg으로 3회 투여되었다.
그룹 1 (n=12): 인간화된 항-IL-13 mAb (30mg/kg)
그룹 2 (n=12): 인간화된 항-IL-13 mAb (30mg/kg) 및 파스콜리주맙 (Pascolizumab) (인간화된 항-IL4 mAb, 30mg/kg)
그룹 3 (n=6): 비히클 단독 네거티브 대조군 처리
페이스 1 및 2로부터의 AHR 정보는 벅스코 (Buxco) 폐 기기 시스템을 사용하여, 히스타민에 대한 반응에서 압력 및 기류 해석 - 폐 내성 (RL) 및 동순응도 (DDYN)-을 취하여 계산하였다. A.suum 항원 자극 후 비교한 기준선으로부터의 최대 변화율 [폐 내성 (RL) 및 동순응도 (DDYN)에 있어서]을 페이스 1 및 2, 즉 항체 처리 또는 비처리에 대해 비교하고, 이들 데이타를 사용하여 AHR 표현형을 평가하였다.
또한, BAL 샘플을 페이스 1 및 2에서 1일 및 11일에 취하여 세포 침투 및 특히, 호산구증가증을 측정하였다. 혈청 샘플을 취하여 IgE 수준을 모니터링하였다.
6.1. 인간 또는 사이노몰구스 IL-13 결합 ELISA
이러한 검정은 인간 또는 사이노몰구스 IL-13으로의 항체 결합을 검출하는 ELISA를 기술한다. 이는 샌드위치 ELISA 포맷이다.
6.1.1 재료
1. Nunc 면역플레이트 1 F96 맥시솝 (Maxisorp) (Life Technologies, 4-39454A)
2. 인간 IL-13 (캠브리지 바이오사이언스(Cambridge Biosciences)에서 발현된 E.coli, cat. no. CH1- 013)
3. 사이노몰구스 IL-13 (GSK 제조)
4. 염소 항-인간 IL-13 폴리클로날 항체 (R+D Systems, cat. no. AF-213- NA)
5. 항-인간 IgG-HRP (Sigma, Cat No. A-6029)
6. 항-마우스 IgG-HRP (Sigma, Cat No. A-9309)
7. 탄산염/중탄산염 완충제 (Sigma; cat. no. C-3041)
8. TBST [트리스 완충된 염수 (6.06g Tris + 8.06g NaCl + 0.2g KCI + 1L가 되게하는 H20) + 0.05% Tween 20]
9. BSA (Sigma A-7030)
10. OPD (Sigma, Cat. No. P-9187)
11. 황산
6.1.2 방법
1. 차단 용액은 3% BSA+TBST이다.
2. 세척 용액은 TBST이다.
3. 'Nunc 맥시솝' ELISA 플레이트를 탄산염/중탄산염 완충제 (Sigma; cat. no. C-3041 , 제조업자의 지시에 따라 제조)중의 5ug/ml 염소 항-인간 IL-13 폴리클로날 항체 (R+D Systems, cat. no. AF-213-NA. 제조업자의 지시에 따라 500ug/ml의 스톡 농도로 제조하고, -20C에서 분취액으로 저장) 50㎕로 코팅하고, 플레이트 밀봉기로 덮고, 밤새 4℃에서 인큐베이션시켰다.
4. 100ul의 3% BSA/TBST로 차단하고, 1시간 동안 실온압에서 인큐베이션하였다.
5. TBST로 3회 세척하였다 (세척당 웰당 200ul 이상의 세척 용액).
6. 차단 용액중의 웰당 20ng (50ul 부피중)의 인간 IL-13 (Cambridge Bioscience, cat. no. CH1-013. 제조업자의 지시에 따라 100ng/ul의 스톡 농도로 제조되고, -20C에서 분취액중에 저장됨) 또는 웰당 20ng의 사이노몰구스 IL-13을 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다.
7. TBST로 3회 세척하였다.
8. 차단 용액중의 50ul 항체 샘플 (필요에 따라, 종말점 역가 데이타를 수득하기 위해 적정함)을 첨가하고, 1시간 동안 실온압에서 인큐베이션하였다.
9. TBST로 3회 세척하였다.
10. 3G4 키메라 항체 또는 인간화된 항체에 있어서, 1시간 동안 실온압에서 차단 용액중에서 1/2000 희석으로 웰당 50ul의 항-인간 IgG-HRP (Sigma, Cat No. A-6029)를 사용하여 결합을 검출하였다. 3G4 마우스 모노클로날 항체에 있어서, 1시간 동안 실온압에서 차단 용액중에 1/1000 희석으로 웰당 50ul의 항-마우스 IgG-HRP (Sigma, Cat No. A-9309)를 사용하여 결합을 검출하였다.
11. TBST로 3회 세척하였다.
12. 100ul OPD로 전개시키고 (Sigma, Cat. No. P-9187. 제조업자의 지시에 따라 제조), 5Oul 3M H2SO4로 중단시키고, 490nm의 흡광도에서 판독하였다. 전개 시간은 ~12분이다.
6.1A 인간 IL-13 결합 ELISA
본 검정은 인간 IL-13으로 항체의 결합을 검출하는 ELISA를 기술한다. 이는 샌드위치 ELISA 포맷이며, 실시예 6.1에 기술된 것과 약간 상이하다.
6.1A.1 재료
1. 코스타르 96 웰 EIA 플레이트 (Corning Costar cat. no 3369)
2. 인간 IL-13 (Peprotech cat. no. 200-13)
3. 염소 항-인간 IL-13 폴리클로날 항체 (R+D Systems, cat. no. AF-213- NA)
4. 항-인간 카파 경쇄-HRP (Sigma, Cat No. A7164)
5. 탄산염/중탄산염 완충제 (Sigma; cat. no. C-3041)
6. TBST [트리스 완충된 염수 (6.06g Tris + 8.06g NaCl + 0.2g KCl + 1L가 되게하는 H2O) + 0.05% Tween 20]
7. BSA (Sigma A-7030)
8. OPD (Sigma, Cat. No. P-9187)
9. 황산
6.1A.2 방법
1. 차단 용액은 3% BSA+TBST이다.
2. 세척 용액은 TBST이다.
3. '코스타르 E1A/RIA' ELISA 플레이트를 탄산염/중탄산염 완충제 (Sigma; cat. no. C-3041 , 제조업자의 지시에 따라 제조)중의 5ug/ml 염소 항-인간 IL-13 폴리클로날 항체 (R+D Systems, cat. no. AF-213-NA. 제조업자의 지시에 따라 500ug/ml의 스톡 농도로 제조하고, -20C에서 분취액으로 저장) 50㎕로 코팅하고, 플레이트 밀봉기로 덮고, 밤새 4℃에서 인큐베이션시켰다.
4. 100ul의 3% BSA/TBST로 차단하고, 1시간동안 실온압에서 또는 최소 하룻밤 동안 4℃에서 인큐베이션하였다.
5. TBST로 2회 세척하였다 (세척당 웰당 200ul 이상의 세척 용액).
6. 웰당 20ng (50ul 부피중)의 인간 IL-13 (Peprotech cat. no. 200-13. 제조업자의 지시에 따라 100ng/ul의 스톡 농도로 제조하고, -20C에서 분취액중에 저장)을 첨가하고, 차단 용액으로 희석하고, 1시간 동안 실온압에서 인큐베이션하였다.
7. TBST로 2회 세척하였다.
8. 차단 용액중의 50ul 항체 샘플 (필요에 따라, 종말점 역가 데이타를 수득하기 위해 적정함)을 첨가하고, 1시간 동안 실온압에서 인큐베이션하였다.
9. TBST로 2회 세척하였다.
10. 3G4 키메라 항체 또는 인간화된 항체에 있어서, 1시간 동안 실온압에서 차단 용액중에서 1/2000 희석으로 웰당 50ul의 항-인간 카파 경쇄-HRP (Sigma, Cat No. A-7164)를 사용하여 결합을 검출하였다.
11. TBST로 2회 세척하였다.
12. 100ul OPD로 전개시키고 (Sigma, Cat. No. P-9187. 제조업자의 지시에 따라 제조), 5Oul 3M H2SO4로 중단시키고, 490nm의 흡광도에서 판독하였다.
6.1B 천연 인간 IL-13 결합 ELISA
본 검정은 천연 인간 IL-13으로의 항체의 결합을 검출하는 ELISA를 기술한다. 이는 샌드위치 ELISA 포맷이다.
6.1B.1 재료
1. Nunc 면역플레이트 1 F96 맥시솝 (Life Technologies, 4-39454A)
2. 천연 인간 IL-13 (HDLM-2 세포 상청액)
3. 항-인간 IL13 항체 (Pharmingen, Cat.No. 554570)
4. 바이오티닐화된 항-인간 IL13 항체 (Pharmingen, Cat.No. 555054)
5. 스트렙타비딘-HRP (Sigma, Cat No. E2886)
6. 탄산염/중탄산염 완충제 (Sigma; cat. no. C-3041)
7. RPMI + 20% FBS + 2mM 글루타민
8. PBST (PBS + 0.05% Tween 20)
9. BSA (Sigma A-7030)
10. OPD (Sigma, Cat. No. P-9187)
11. 황산
6.1B.2 방법
1. 차단 용액은 PBST중의 1% BSA이다.
2. 세척 용액은 PBST이다.
3. 'Nunc 맥시솝' ELISA 플레이트를 탄산염/중탄산염 완충제중의 5ug/ml 3G4 키메라 또는 인간화된 항체 또는 2ug/ml 항 인간 IL13 (Pharmingen cat no. 554570) 50㎕ 희석물로 코팅하고, 플레이트 밀봉기로 덮고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
4. 200ul의 1% BSA/PBST로 차단하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다.
5. PBST로 3회 세척하였다.
6. HDLM2 상청액 샘플 (적정됨)중에 존재하는 50ul 천연 IL13을 첨가하고, RPMI + 20% FBS + 2mM 글루타민 용액으로 희석하고, 1시간 동안 실온압에서 인큐베이션하였다.
7. PBST로 3회 세척하였다.
8. 웰당 50ul 바이오티닐화된 항-인간 IL13 1ug/ml (Pharmaingen, Cat. No. 555054)를 첨가하고, PBST + 1% BSA로 희석하고, 실온압에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
9. PBST로 3회 세척하였다.
10. 웰당 50ul의 스트렙타비딘-HRP 컨쥬게이트를 첨가하고, 1/1000 희석으로 PBST + 1% BSA중에 희석시켰다. 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다.
11. TBST로 3회 세척하였다.
12. 웰당 100ul OPD (Sigma, Cat. No. P-9187. 제조업자의 지시에 따라 제조)로 전개시키고, 웰당 5Oul 3M H2SO4로 중단시키고, 490nm의 흡광도에서 판독하였다.
6.2. IL-13 중화 생검정 (TF-1 세포 증식 검정)
이는 항-IL-13 항체의 중화 능력을 측정하기 위해 사용될 수 있는 IL-13 생검정법이다. 하기 기술된 방법은 재조합 인간 또는 사이노몰구스 IL-13을 사용하였다. 포유류-발현된 인간 IL-13 또는 Q130 인간 IL-13 변이체 또한 본 검정에 사용될 수 있다.
6.2.1 재료
1. TF-1 세포주 (자체 수득된 TF-1 세포주, NB, ATCC 버젼 이용가능)
2. 96 웰 조직 배양 플레이트 (Invitrogen)
3. 인간 IL-13 (Cambridge Bioscience, cat. no. CH1-013)
4. 셀티터 (CellTiter) 96 비방사선 세포 증식 검정 (Promega, Cat. No. G4000)
6.2.2 방법
1. TF-1 세포 생검정에서 재조합체 인간 또는 사이노몰구스 IL-13의 생활성을 중화시키는 항-인간 IL-13 mAb의 능력을 측정하는 방법.
2. 본 검정을 멸균 조건하에서 멸균 96 웰 조직 배양 플레이트 (Invitrogen)에서 수행하였다. 모든 시험을 삼중으로 수행하였다.
3. 10ng/ml 인간 IL-3 (Cambridge Bioscience, cat. no. CH1-013. 클래스 2 조직 배양 후드에서 멸균 기법을 이용하여 제조업자의 지시에 따라 100ng/ul의 스톡 농도로 제조하고, 소량의 분취물로 -20C에서 저장) 또는 10ng/ml 사이노몰구스 IL-13 (GSK 제조)와 항-인간 IL-13 mAb의 다양한 희석물 (3배 희석으로 6ug/ml로부터 0.025ug/ml로 희석됨)을 총 50ul의 부피로 1시간 동안 37C에서 사전 인큐베이션하였다. IL-13이 존재하나, 항-인간 IL-13 mAb는 갖지 않는 파지티브 대조군 웰이 또한 포함되었다. 또한, IL-13 및 항-인간 IL-13 mAb이 존재하지 않는 네거티브 대조군 웰이 포함되었다. 이러한 사전 인큐베이션을 위해 멸균된 낮은 단백질 결합의 둥근 바닥 96 웰 플레이트를 사용하였다. (IL-13 및 항-인간 IL-13 mAb의 농도는 세포가 첨가되는 경우, 후속 단계에서 반감될 것이다).
4. 멸균의 96 웰 조직 배양 플레이트에서 ml 당 2x105로 50ul TF-1 세포를 플레이팅하였다. 1시간 동안 사전 인큐베이션시킨 후, IL-13 및 항-인간 IL-13 mAb 샘플을 세포에 첨가하였다. 다양한 항-인간 IL-13 mAb 희석물, 재조합체 IL-13 및 TF-1 세포를 함유하는 최종 100ul 검정 부피를 가습된 CO2 인큐베이터에서 ~70시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다.
5. ~66시간에, 웰을 스캔하여 이들이 멸균 상태에 있으며, 박테리아 오염이 발생하지 않았음을 확인하였다.
6. 마지막 4시간의 인큐베이션 동안에는 웰당 15ul의 필터 멸균된 MTT 기질 (Cat. No. G4000, Promega. 제조업자의 지시에 따라 제조)을 첨가하였다.
7. 대사된 블루 포르마잔 생성물을 용해시키기 위해 100ul의 중단 용액 (MTT 키트에 제공됨)으로 반응을 중단시켰다. 2시간 이상 동안 방치한 후, 피펫으로 혼합하여 결정의 용해를 도왔다. 대안적으로, 플레이트 밀봉기로 덮고, 4C에서 밤새 방치한 후, 다음날 피펫으로 혼합하였다 (이는 피펫팅에 있어서, 더욱 용이함).
8. 570nm 파장에서 96-웰 플레이트 판독기에서 각각의 웰중의 용액의 흡광도를 판독하였다.
9. 인간 또는 사이노몰구스 IL-13 생활성을 중화시키는 항-인간 IL-13 mAb의 능력을, 규정된 양의 인간 또는 사이노몰구스 IL-13 (5ng/ml)의 생활성을 50%까지 중화시키는데 필요한 항-인간 IL-13 mAb의 농도 (=ND50)로서 나타내었다. 요구되는 농도가 더 낮을 수록, 중화 능력이 더욱 유효한 것이다.
6.2.A IL-13 중화 생검정 (TF-1 세포 증식 검정)
항-IL-13 항체의 중화 능력을 측정하는데 사용될 수 있는 IL-13 생검정법이다. 하기 기술된 방법은 재조합체 인간 및 사이노몰구스 IL-13을 사용한다. 포유류-발현된 인간 IL-13 또는 Q130 인간 IL-13 변이체가 본 검정에 또한 사용될 수 있다. 이러한 방법은 실시예 6.2에 기술된 것과 약간 상이하다.
6.2.A.1 재료
1. TF-1 세포주 (자체 수득된 TF-1 세포주, NB, ATCC 버젼 이용가능)
2. 96 웰 조직 배양 플레이트 (Corning costar, cat no. 3596)
3. 인간 IL-13 (Peprotech, cat. no. 200-13)
4. GSK에서 생성한 인간 IL-13 (CHO 세포 발현됨)
5. 인간 IL-13 Q130 변이체 (Peprotech, cat. no. 200-13A)
6. 사이노몰구스 IL-13 (GSK 생성).
7. 폴리클로날 항-인간 IL13 (R&D systems AF-213-NA)
8. 96 웰 조직 배양 플레이트 (Corning costar, cat no.3790)
9. 셀티터 96 비방사선 세포 증식 검정 (Promega, Cat. No. G4000)
6.2.A. 2 방법
1. TF-1 세포 생검정에서 재조합체 인간 또는 사이노몰구스 IL-13의 생활성을 중화시키는 항-인간 IL-13 mAb의 능력을 측정하기 위한 방법.
2. 본 검정을 멸균 조건하에서 멸균 96 웰 조직 배양 플레이트 (Corning costar, cat no. 3596)에서 수행하였다. 모든 시험을 삼중으로 수행하였다.
3. 10ng/ml 인간 IL-3 (Peprotech, cat. no. 200-13) 또는 10ng/ml CHO 발현된 인간 IL-13 (GSK 제조) 또는 60ng/ml 인간 IL-13 Q130 변이체 (Peprotech, cat. no. 200-13A), 또는 10ng/ml 사이노몰구스 IL-13 (GSK 생성)을 사전 인큐베이션하였다 (클래스 2 조직 배양 후드에서 멸균 기법을 이용하여 제조업자의 지시에 따라 스톡 농도로 시중의 Ab를 제조하고, 소량의 분취물로 -20C에서 저장). 항-인간 IL-13 mAb의 다양한 희석물 (6ug/ml 또는 2ug/ml 또는 180ug/ml로부터 각각 0.025ug/ml 또는 0.008ug/ml 또는 0.74ug/ml로 3배 희석)과 함께 37C에서 1시간 동 안 50ul의 전체 부피로 인큐베이션하였다. 또한, IL-13은 존재하나 항-인간 IL-13 mAb는 존재하지 않는 파지티브 대조군 웰이 포함되었다. 또한, IL-13이 존재하지 않으며, 항-인간 IL-13 mAb도 존재하지 않는 네거티브 대조군 웰도 포함되었다. 사전 인큐베이션에 있어서 멸균된 낮은 단백질 결합의 둥근 바닥 96 웰 플레이트를 사용하였다 (Corning costar, cat no. 3790). (세포가 첨가되는 경우, IL-13 및 항-인간 IL-13 mAb의 농도는 후속 단계에서 반감될 것이다).
4. 멸균 96 웰 조직 배양 플레이트 (Corning costar, cat no. 3596)에서 50ul의 TF-1 세포를 ml 당 2x105 로 플레이팅시켰다. 1시간 사전 인큐베이션 후, IL-13 및 항-인간 IL-13 mAb 샘플을 세포에 첨가하였다. 다양한 항-인간 IL-13 mAb 희석물, 재조합체 IL-13 및 TF-1 세포를 함유하는 최종 100ul 부피 검정물을 가습된 CO2 인큐베이터에서 37℃에서 3일 동안 인큐베이션하였다.
5. 웰을 스캔하여 이들이 멸균되며, 어떠한 박테리아 오염도 발생하지 않음을 확인하였다.
6. 인큐베이션 마지막 4시간 동안 웰당 15ul의 MTT 기질 (Cat. No. G4000, Promega)를 첨가하였다.
7. 대사된 블루 포르마잔 생성물을 용해시키기 위해 100ul의 중단 용액 (MTT 키트에 제공됨)으로 반응을 중단시켰다. 2시간 이상 동안 실온에서 방치한 후, 플레이트 쉐이커상에서 플레이트를 ~30분 동안 쉐이킹하였다. 대안적으로, 플레이트 밀봉기로 덮고, 4C에서 밤새 방치한 후, 플레이트 쉐이커상에서 플레이트를 ~30분 동안 쉐이킹하였다. 570nm 파장에서 96-웰 플레이트 판독기에서 각각의 웰중의 용액 흡광도를 판독하였다.
8. 인간 또는 사이노몰구스 IL-13 생활성을 중화시키는 항-인간 IL-13 mAb의 능력을, 규정된 양의 인간 또는 사이노몰구스 IL-13 (5ng/ml)를 50% 까지 중화시키는데 필요한 항-인간 IL-13 mAb의 농도(=ND50)로서 나타내었다. 요구되는 농도가 더 낮을 수록, 중화 능력이 더욱 유효한 것이다.
6.3. 에피토프 미정제 맵핑 ELISA
본 검정은 마우스 mAb 3G4의 인간 또는 사이노몰구스 IL-13 펩티드로의 결합을 측정하는 ELISA를 기술한다.
6.3.1 재료
1. Nunc 면역플레이트 1 F96 맥시솝 (Life Technologies, 4-39454A)
2. 이뮤노퓨어ⓒ 스트렙타비딘 (Pierce, cat. no. 21125)
3. PBST (PBS + 0.05% Tween 20)
4. BSA (Sigma A-7030)
5. 펩티드당 인간 및 사이노몰구스 IL-13 16머, 오프셋 = 4 (미모토프 관행 순서로 공급)
6. 펩티드당 파지티브 및 네거티브 대조군 20 (미모토프 관행 순서로 공급)
7. 3G4 마우스 mAb
8. 대조군 Ab (미모토프 관행 순서로 공급)
9. 래빗 항-마우스 Ig HRP 컨쥬게이팅됨 (DAKO, code no. P0260)
10. OPD (Sigma, Cat. No. P-9187)
11. 3M 황산
6.3.2 방법
1. 차단 용액은 PBST중의 3% BSA + PBST이다.
2. 세척 용액은 PBST이다.
3. 희석액으로서 PBST를 사용하여 'Nunc 맥시솝' ELISA 플레이트를 5㎕/ml 이뮤노퓨어ⓒ 스트렙타비딘 (Pierce, cat. no. 21125. 제조업자의 지시에 따라 1mg/ml의 스톡 농도로 제조되고, +4℃에서 분취물중에 저장됨)로 코팅하였다. 37℃에서 밤새 인큐베이션시켜 용액을 건조시켰다.
4. 200㎕의 3% BSA/PBST로 차단하였다. 플레이트 밀봉기를 가하고, 실온압에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다.
5. PBST로 3회 세척하였다 (세척당 웰당 200㎕ 이상의 세척 용액).
6. 이중으로 하고, 희석액으로서 PBST를 사용하고, 각 펩티드 (제조업자의 지시에 따라 200㎕ 40% 아세토니트릴 60% 물중에서 용해시킨 후, 동일한 용매중에 10배 희석으로 분취하고, -20℃에서 저장)의 1,000배 희석물을 웰당 100㎕ 첨가하였다 (대조군 웰 제외).
7. 대조군 웰에서는, 이중으로 하고, 희석액으로서 PBST를 사용하고, 대조군 펩티드 (제조업자의 지시에 따라 1ml 40% 아세토니트릴 60% 물중에서 용해시키고, -20℃에서 저장)의 10배 희석물을 웰당 100㎕ 첨가하였다. 플레이트 밀봉기를 가하고, 쉐이킹 테이블에서 1시간 동안 실온압에서 인큐베이션하였다.
8. PBST에서 3회 세척하였다 (세척 당 웰당 200㎕ 이상의 세척 용액).
9. PBST중 1.506㎍/ml 마우스 mAb를 웰당 100㎕ 가하였다 (대조군 웰 제외).
10. 희석제로서 PBST를 사용하고, 대조군 웰에는 웰당 단지 4, 16 및 32배 대조군 항체 희석물 (제조업자에 의해 공급된 바와 같이 사용하고, -20℃에서 저장됨)을 100㎕ 가하였다. 플레이트 밀봉기를 가하고, 실온압 (실온 및 압력)에서 1시간 동안 쉐이킹 테이블상에서 인큐베이션하였다 (실온 및 압력).
11. PBST로 3회 세척하였다 (세척 당 웰당 200㎕ 이상의 세척 용액).
12. 희석제로서 PBST를 사용하여 래빗 항-마우스 Ig HRP-컨쥬게이션 (DAKO, 공급된 바와 같이 사용되고 +4℃에서 저장한 code no. P0260)의 2,000배 희석물을 웰당 100㎕ 첨가하였다. 플레이트 밀봉기를 가하고, 쉐이킹 테이블상에서 1시간 동안 실온압에서 인큐베이션시켰다.
13. PBST로 3회 세척하였다 (세척 당 웰당 200㎕ 이상의 세척 용액).
14. 웰당 100㎕ OPD (Sigma, Cat. No. P-9187. 제조업자의 지시에 따라 제조)로 전개시키고, 5O㎕ 3M H2SO4로 중단시키고, 490nm의 흡광도에서 판독하였다. 전개 시간은 ~10분이다.
6.4. 에피토프 미세 맵핑 ELISA
본 검정은 mAb 3G4의 인간 또는 사이노몰구스 IL-13 펩티드로의 결합을 측정하는 ELISA를 기술한다.
6.4.1 재료
1. Nunc 면역플레이트 1 F96 맥시솝 (Life Technologies, 4-39454A)
2. 이뮤노퓨어ⓒ 스트렙타비딘 (Pierce, cat. no. 21125)
3. PBST (PBS + 0.05% Tween 20)
4. BSA (Sigma A-7030)
5. 인간 및 사이노몰구스 IL-13 일부 영역 순수 펩티드(양 N- 및 C-말단으로부터 한번에 하나의 아미노산이 절두된14-머; 미모토프 관행 순서)
6. 파지티브 대조군 16 머 펩티드 (이전의 미모토프 관행 순서로 공급).
7. 3G4 mAb (자체 제조)
8. 항체 (Sigma A-9309)에 컨쥬게이팅된 염소 항-마우스 IgG (Fc 특이적) HRP
9. OPD (Sigma, Cat. No. P-9187)
10. 3M 황산
6.4.2 방법
1. 차단 용액은 3% BSA + PBST이다.
2. 세척 용액은 PBST이다.
3. 'Nunc 맥시솝' ELISA 플레이트를 초고순도 물중의 5㎍/ml 이뮤노퓨어ⓒ 스트렙타비딘 (Pierce, cat. no. 21125. 제조업자의 지시에 따라 1mg/ml의 스톡 농도로 제조되고, +4℃에서 저장됨) 100㎕로 코팅하였다. +37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다.
4. PBST중의 200㎕의 3% BSA로 차단하였다. 플레이트 밀봉기를 가하고, 밤새 +4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다.
5. PBST로 3회 세척하였다 (세척당 웰당 200㎕ 이상의 세척 용액).
6. 이중으로 하고, 희석제로서 PBST중의 3% BSA를 사용하고, 각 펩티드 (제조업자의 지시에 따라 200㎕ 40% 아세토니트릴 60% 물중에서 용해시키고, -20℃에서 저장)의 1,000배 희석물을 웰당 100㎕ 첨가하였다. 플레이트 밀봉기를 가하고, 쉐이킹 테이블에서 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다.
7. PBST로 3회 세척하였다 (세척 당 웰당 200㎕ 이상의 세척 용액).
8. PBST중 3% BSA중에 희석된 3㎍/ml 3G4를 웰당 100㎕ 첨가하였다. 플레이트 밀봉기를 가하고, 쉐이킹 테이블에서 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다.
9. PBST로 3회 세척하였다 (세척 당 웰당 200㎕ 이상의 세척 용액).
10. 희석물로서 PBST중의 3% BSA를 사용하여 염소 항-마우스 IgG HRP-컨쥬게이팅된 항체 (공급된 바와 같이 사용되고, +4℃에서 저장된 Sigma A-9309)의 1,000배 희석물을 웰당 100㎕ 첨가하였다. 플레이트 밀봉기를 가하고, 쉐이킹 테이블에서 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다.
11. PBST로 3회 세척하였다 (세척 당 웰당 200㎕ 이상의 세척 용액).
12. 100㎕ OPD (Sigma, Cat. No. P-9187. 제조업자의 지시에 따라 제조)로 전개시키고, 웰당 5Oul 3M H2SO4로 중단시키고, 490nm의 흡광도에서 판독하였다. 전개 시간은 ~10분이다.
6.5 인간 IL-13Rα1 사슬 ELISA에 결합하는 인간 IL-13
이러한 ELISA는, 인간 IL-13이 인간 IL13Rα1 사슬에 결합하는 것을 항체가 억제시킬 수 있는지의 여부를 측정한다.
6.5.1 재료
1. Nunc 면역플레이트 1 F96 맥시솝 (Life Technologies, 4-39454A)
2. 인간 IL13Rα1-Fc (R & D Systems, cat. no. 146-IR)
3. 인간 IL-13 (자체 제조)
4. 바이오티닐화된 항-인간 IL-13 (R & D Systems, cat. no. BAF213)
5. 스트렙타비딘-HRP (Sigma cat no. E2886)
6. 탄산염/중탄산염 완충제 (Sigma; cat. no. C-3041)
7. TBST [트리스 완충된 염수 (6.06g Tris + 8.06g NaCl + 0.2g KCl + 1L가 되게하는 H2O) + 0.05% 트윈 20]
8. BSA (Sigma A-7030)
9. OPD (Sigma, Cat. No. P-9187)
10. 황산
6.5.2 방법
1. 차단 용액은 3% BSA + TBST이다.
2. 세척 용액은 TBST이다.
3. 'Nunc 맥시솝' ELISA 플레이트를 탄산염/중탄산염 완충제중의 5ng/ul 인간 IL-13Rα1-Fc 50ul로 코팅하였다. 플레이트 밀봉기를 가하고, 밤새 +4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다.
4. 3% BSA/TBST 100ul로 차단하고, 1시간 동안 실온압에서 인큐베이션시켰다.
5. TBST로 3회 세척하였다 (세척당 웰당 200㎕ 이상의 세척 용액).
6. 50ul의 최종 부피중에서, 30분 동안 차단 용액중의 항체 샘플 (적정됨)과 0.4ng/ul 인간 IL-13을 사전 인큐베이션하였다. 사전 인큐베이션된 샘플을 수용체-코팅된 ELISA 플레이트에 가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
7. TBST로 3회 세척하였다.
8. 1ug/ml로 희석된, 웰당 50ul의 바이오티닐화된 항-인간 IL-13을 사용하여 결합된 인간 IL-13을 검출하였다. 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
9. TBST로 3회 세척하였다.
10. 1/1000 희석으로 웰당 스트렙타비딘-HRP 컨쥬게이트 50㎕를 가하였다. 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
11. TBST로 3회 세척하였다.
12. 웰당 100㎕ OPD (Sigma, Cat. No. P-9187. 제조업자의 지시에 따라 제조)로 전개시키고, 웰당 5Oul 3M H2SO4로 중단시키고, 490nm의 흡광도에서 판독하였다.
6.6 인간 IL-13Rα2 사슬 ELISA에 결합하는 인간 IL-13
이러한 ELISA는, 인간 IL-13이 인간 IL13Rα2 사슬에 결합하는 것을 항체가 억제시킬 수 있는지의 여부를 측정한다.
6.6.1 재료
1. Nunc 면역플레이트 1 F96 맥시솝 (Life Technologies, 4-39454A)
2. 인간 IL13Rα2-Fc (R & D Systems, cat. no. 614-IR)
3. 인간 IL-13 (GSK 제조)
4. 바이오티닐화된 항-인간 IL-13 (R & D Systems, cat. no. BAF213)
5. 스트렙타비딘-HRP
6. 탄산염/중탄산염 완충제 (Sigma; cat. no. C-3041)
7. TBST [트리스 완충된 염수 (6.06g Tris + 8.06g NaCl + 0.2g KCl + 1L가 되게하는 H2O) + 0.05% 트윈 20]
8. BSA (Sigma A-7030)
9. OPD (Sigma, Cat. No. P-9187)
10. 황산
6.5.2 방법
1. 차단 용액은 3% BSA + TBST이다.
2. 세척 용액은 TBST이다.
3. 'Nunc 맥시솝' ELISA 플레이트를 탄산염/중탄산염 완충제중의 5ng/ul 인간 IL-13Rα2-Fc 50ul로 코팅하였다. 플레이트 밀봉기를 가하고, 밤새 +4℃에서 인큐베이션시켰다.
4. 3% BSA/TBST 100ul로 차단하고, 1시간 동안 실온압에서 인큐베이션시켰 다.
5. TBST로 3회 세척하였다 (세척당 웰당 200㎕ 이상의 세척 용액).
6. 50ul의 최종 부피중에서, 60분 동안 차단 용액중의 항체 샘플 (적정됨)과 0.01ng/ul 인간 IL-13을 사전 인큐베이션하였다. 사전 인큐베이션된 샘플을 수용체-코팅된 ELISA 플레이트에 가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
7. TBST로 3회 세척하였다.
8. 0.5ug/ml로 희석된, 바이오티닐화된 항-이간 IL-13을 웰당 50ul 사용하여 결합된 인간 IL-13을 검출하였다. 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
9. TBST로 3회 세척하였다.
10. 1/1000 희석으로 웰당 스트렙타비딘-HRP 컨쥬게이트를 가하였다. 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
11. TBST로 3회 세척하였다.
12. 웰당 100㎕ OPD (Sigma, Cat. No. P-9187. 제조업자의 지시에 따라 제조)로 전개시키고, 웰당 5Oul 3M H2SO4로 중단시키고, 490nm의 흡광도에서 판독하였다. 전개 시간은 ~2분이었다.
6.7 인간 IL-4 결합 ELISA
본 검정은 인간 IL-4로의 항체의 결합을 검출하는 ELISA를 기술한다. 이는 샌드위치 ELISA 포맷이다.
6.7.1. 재료
12. Nunc 면역플레이트 1 F96 맥시솝 (Life Technologies, 4-39454A)
13. 인간 IL-4 (R+D Systems, cat. no. 204IL)
14. 염소 항-인간 IL-4 폴리클로날 항체 (R+D Systems, Cat. No. AF-204-NA)
15. 바이오티닐화된 래트 항-인간 IL-4 항체 (R+D Systems, Cat. No. BAF204)
16. 항-마우스 IGg-HRP (Dako, Cat No. P0260)
17. 항-인간 카파 경쇄-HRP (Sigma A7164)
18. 스트렙타비딘-HRP (Sigma cat no. E2886)
19. 탄산염/중탄산염 완충제 (Sigma; cat. no. C-3041)
20. TBST [트리스 완충된 염수 (6.06g Tris + 8.06g NaCl + 0.2g KCl + 1L가 되게하는 양의 H20) + 0.05% 트윈 20]
21. BSA (Sigma A-7030)
22. OPD (Sigma, Cat. No. P-9187)
23. 황산
6.7.2 방법
13. 차단 용액은 TBST중의 3% BSA이다.
14. 세척 용액은 TBST이다.
15. 'Nunc 맥시솝' ELISA 플레이트를 탄산염/중탄산염 완충제 (Sigma; cat. no. C-3041, 제조업자의 지시에 따라 제조)중의 5ug/ml 염소 항-인간 IL-4 폴리클로날 항체 (R+D Systems, cat. no. AF-204-NA. 제조업자의 지시에 따라 500ug/ml 스톡 농도로 제조하고, 분취물로 -20C에서 저장) 50ul로 코팅하고, 플레이트 밀봉기로 덮고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
16. 100ul의 3% BSA/TBST로 차단하고, 1시간 동안 실온압 (rtp)에서 인큐베이션하였다.
17. TBST로 3회 세척하였다 (세척 당 웰당 200㎕ 이상의 세척 용액).
18. 차단용액중의 1ng/ml (50ul 부피중) 인간 IL-4를 가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
19. TBST로 3회 세척하였다.
20. 차단 용액중의 50ul 항체 샘플 (필요에 따라, 종말점 역가 데이타를 수득하기 위해 적정함)을 첨가하고, 1시간 동안 실온압에서 인큐베이션하였다. 인간 IL-4로의 결합에 대한 파지티브 대조군으로서, 바이오티닐화된 항-인간 IL-4 모노클로날 항체 (적정됨)를 사용하였다.
21. TBST로 3회 세척하였다.
22. 3G4 마우스 모노클로날 항체에 있어서, 1시간 동안 실온압에서 차단 용액중에 1/2000 희석으로 웰당 50ul의 항-마우스 IgG-HRP (Dako, Cat No. P0260)를 사용하여 결합을 검출하였다. 3G4 키메라 항체 또는 인간화된 항체에 있어서, 1시간 동안 실온압에서 차단 용액중에 1/2000 희석으로 웰당 50ul의 항-인간 카파 경쇄-HRP (Sigma, Cat No. Sigma A7164)를 사용하여 결합을 검출하였다. 파지티브 대조군 바이오티닐화된 래트 항-인간 IL-4 모노클로날 항체에 있어서, 1시간 동안 실온압에서 차단 용액중의 1/1000 희석으로 스트렙타비딘-HRP 컨쥬게이팅된 항체 (Sigma cat no. E2886)를 사용하여 검출하였다.
23. TBST로 3회 세척하였다.
24. 100ul OPD로 전개시키고 (Sigma, Cat. No. P-9187. 제조업자의 지시에 따라 제조), 5Oul 3M H2SO4로 중단시키고, 490nm의 흡광도에서 판독하였다.
6.8 인간 IL-5 결합 ELISA
본 검정은 인간 IL-5에 대한 항체의 결합을 검출하는 ELISA를 기술한다. 이는 샌드위치 ELISA 포맷이다.
6.8.1. 재료
24. Nunc 면역플레이트 1 F96 맥시솝 (Life Technologies, 4-3945A)
25. 인간 IL-5 (R+D Systems, cat. no. 205IL)
26. 항-인간 IL-5 폴리클로날 항체 (R+D Systems, Cat. No. AF-205-NA)
27. 항-인간 IL-5 메폴리주맙 (자체 임상 등급)
28. 항-마우스 IgG-HRP (Dako, Cat No. P0260)
29. 항-마우스 카파 경쇄-HRP (Sigma A7164)
30. 탄산염/중탄산염 완충제 (Sigma; cat.no. C-3041)
31. TBST [트리스 완충된 염수 (6.06g Tris + 8.06g NaCl + 0.2g KCl + 1L가 되게하는 H20) + 0.05% 트윈 20]
32. BSA (Sigma A-7030)
33. OPD (Sigma, Cat. No. P-9187)
34. 황산
6.8.2. 방법
25. 차단 용액은 TBST중의 3% BSA이다.
26. 세척 용액은 TPBST이다.
27. 'Nunc 맥시솝' ELISA 플레이트를 탄산염/중탄산염 완충제 (Sigma; cat. no. C-3041, 제조업자의 지시에 따라 제조)중의 5ug/ml 염소 항-인간 IL-5 폴리클로날 항체 (R+D Systems, cat. no. AF-205-NA. 제조업자의 지시에 따라 500ug/ml 스톡 농도로 제조하고, 분취물로 -20C에서 저장) 50ul로 코팅하고, 플레이트를 밀봉기로 덮고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
28. 100ul의 3% BSA/TBST로 차단하고, 1시간 동안 실온압 (rtp)에서 인큐베이션하였다.
29. TBST로 3회 세척하였다 (세척 당 웰당 200㎕ 이상의 세척 용액).
30. 차단용액중의 100ng/ml (50ul 부피) 인간 IL-5 (R + D Systems, cat no. 205IL)를 가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
31. TBST로 3회 세척하였다.
32. 차단 용액중의 50ul 항체 샘플 (필요에 따라, 종말점 역가 데이타를 수득하기 위해 적정함)을 첨가하고, 1시간 동안 실온압에서 인큐베이션하였다. 인간 IL-5로의 결합에 대한 파지티브 대조군으로서, 항-인간 IL-5 메폴리주맙 항체 (적정됨)를 사용하였다.
33. TBST로 3회 세척하였다.
34. 3G4 마우스 모노클로날 항체에 있어서, 1시간 동안 실온압에서 차단 용액중에서 1/2000 희석으로 웰당 50ul의 항-마우스 IgG-HRP (Dako, Cat No. P0260)를 사용하여 결합을 검출하였다. 3G4 키메라 항체 또는 인간화된 항체 및 항 IL5 메폴리주맙에 있어서, 1시간 동안 실온압에서 차단 용액중에 1/2000 희석으로 웰당 50ul의 항-인간 카파 경쇄-HRP (Sigma, Cat No. Sigma A7164)를 사용하여 결합을 검출하였다.
35. TBST로 3회 세척하였다.
36. 100ul OPD로 전개시키고 (Sigma, Cat. No. P-9187. 제조업자의 지시에 따라 제조), 5Oul 3M H2SO4로 중단시키고, 490nm의 흡광도에서 판독하였다.
6.9. 인간 GM-CSF 결합 ELISA
본 검정은 인간 GM-CSF로의 항체 결합을 검출하는 ELISA를 기술한다. 이는 직접 결합 ELISA 포맷이다.
6.9.1. 재료
35. Nunc 면역플레이트 1 F96 맥시솝 (Life Technologies, 4-39454A)
36. 인간 GM-CSF (자체 임상 등급)
37. 항-인간 GM-CSF 모노클로날 항체 (R+D Systmes, Cat. No. MAB215)
38. 항-마우스 IgG-HRP (Dako, Cat No. P0260)
39. 항-인간 카파 경쇄-HRP (Sigma A7164)
40. 탄산염/중탄산염 완충제 (Sigma; cat.no. C-3041)
41. PBST (PBS + 0.05% Tween 20)
42. BSA (Sigma A-7030)
43. OPD (Sigma, Cat. No. P-9187)
44. 황산
6.9.2. 방법
37. 차단 용액은 PBST중의 3% BSA이다.
38. 세척 용액은 PBST이다.
39. 'Nunc 맥시솝' ELISA 플레이트를 2ug/ml의 PBS중의 인간 GM-CSF 희석액 50ul로 코팅하고, 플레이트 밀봉기로 덮고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
40. 200ul의 3% BSA/PBST로 차단하고, 1시간 동안 실온압 (rtp)에서 인큐베이션하였다.
41. PBST로 3회 세척하였다.
42. 차단용액중의 50ul 항체 샘플 (필요에 따라, 종말점 역가 데이타를 수득하기 위해 적정함)을 첨가하고, 1시간 동안 실온압에서 인큐베이션하였다. 인간 IL-GM-CSF으로의 결합에 대한 파지티브 대조군으로서, 항-인간 GM-CSF (R&D systems cat no. MAB215 항체 (적정됨))를 사용하였다.
43. PBST로 3회 세척하였다.
44. 항 GM CSF 마우스 모노클로날 항체에 있어서, 1시간 동안 실온압에서 차단 용액중에서 1/2000 희석으로 웰당 50ul의 항-마우스 IgG-HRP (Dako, Cat No. P0260)를 사용하여 결합을 검출하였다. 3G4 키메라 항체 또는 인간화된 항체에 있 어서, 1시간 동안 실온압에서 차단 용액중에 1/2000 희석으로 웰당 50ul의 항-인간 카파 경쇄-HRP (Sigma, Cat No. Sigma A7164)를 사용하여 결합을 검출하였다.
45. PBST로 3회 세척하였다.
46. 100ul OPD로 전개시키고 (Sigma, Cat. No. P-9187. 제조업자의 지시에 따라 제조), 5Oul 3M H2SO4로 중단시키고, 490nm의 흡광도에서 판독하였다.
표 13:
Figure 112008057105853-PCT00018
Figure 112008057105853-PCT00019
주의: SEQ ID NO: 11 내지 24 및 27 내지 40 (포함)의 단백질 또는 DNA 폴리누클레오티드 서열 또한 시그널 서열을 포함한다.
Figure 112008057105853-PCT00020
Figure 112008057105853-PCT00021
Figure 112008057105853-PCT00022
Figure 112008057105853-PCT00023
Figure 112008057105853-PCT00024
Figure 112008057105853-PCT00025
Figure 112008057105853-PCT00026
Figure 112008057105853-PCT00027
Figure 112008057105853-PCT00028
Figure 112008057105853-PCT00029
Figure 112008057105853-PCT00030
Figure 112008057105853-PCT00031
Figure 112008057105853-PCT00032
Figure 112008057105853-PCT00033
Figure 112008057105853-PCT00034
Figure 112008057105853-PCT00035
Figure 112008057105853-PCT00036
SEQUENCE LISTING <110> ASHMAN, Claire CASSIDY, Martin John CLARKSON, Jane Elizabeth ELLIS, Jonathan Henry WATTAM, Trevor Anthony Kenneth <120> Immunolobulins <130> PB61797 <140> PCT/EP2007/050219 <141> 2007-01-10 <150> GB0600488.1 <151> 2006-01-11 <160> 114 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> MUS MUSCULUS <400> 1 Asp Tyr Glu Ile His 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> MUS MUSCULUS <400> 2 Ala Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> MUS MUSCULUS <400> 3 Ile Leu Leu Tyr Tyr Tyr Pro Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> MUS MUSCULUS <400> 4 Arg Ala Ser Gln Asn Ile Ser Asp Tyr Leu His 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> MUS MUSCULUS <400> 5 Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> MUS MUSCULUS <400> 6 Gln Asn Gly His Ser Phe Pro Leu Thr 1 5 <210> 7 <211> 119 <212> PRT <213> MUS MUSCULUS <400> 7 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Asp Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Asp Tyr 20 25 30 Glu Ile His Trp Met Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Ile Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Ile Leu Leu Tyr Tyr Tyr Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 8 <211> 107 <212> PRT <213> MUS MUSCULUS <400> 8 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Ser Asp Tyr 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Ser Phe Pro Leu 85 90 95 Thr Leu Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 9 <211> 112 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 9 Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu Ile Glu Glu Leu 1 5 10 15 Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met 20 25 30 Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu 35 40 45 Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln Arg 50 55 60 Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln Phe Ser 65 70 75 80 Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe Val Lys 85 90 95 Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg Phe Asn 100 105 110 <210> 10 <211> 339 <212> DNA <213> HOMO SAPIENS <400> 10 ggccctgtgc ctccctctac agccctcagg gagctcattg aggagctggt caacatcacc 60 cagaaccaga aggctccgct ctgcaatggc agcatggtat ggagcatcaa cctgacagct 120 ggcatgtact gtgcagccct ggaatccctg atcaacgtgt caggctgcag tgccatcgag 180 aagacccaga ggatgctgag cggattctgc ccgcacaagg tctcagctgg gcagttttcc 240 agcttgcatg tccgagacac caaaatcgag gtggcccagt ttgtaaagga cctgctctta 300 catttaaaga aactttttcg cgagggacgg ttcaactga 339 <210> 11 <211> 138 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 11 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Ile Asp Tyr Glu Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Ala Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ile Leu Leu Tyr Tyr Tyr Pro Met Asp Tyr Trp 115 120 125 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 12 <211> 138 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 12 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Ile Asp Tyr Glu Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Ala Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Thr Arg Ile Leu Leu Tyr Tyr Tyr Pro Met Asp Tyr Trp 115 120 125 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 13 <211> 138 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 13 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Asp Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Ile Asp Tyr Glu Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Ala Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Thr Arg Ile Leu Leu Tyr Tyr Tyr Pro Met Asp Tyr Trp 115 120 125 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 14 <211> 138 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 14 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Asp Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Ile Asp Tyr Glu Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Ala Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Thr Arg Ile Leu Leu Tyr Tyr Tyr Pro Met Asp Tyr Trp 115 120 125 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 15 <211> 126 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 15 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu 20 25 30 Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile 35 40 45 Ser Asp Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg 50 55 60 Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser 85 90 95 Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Ser 100 105 110 Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 16 <211> 126 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 16 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu 20 25 30 Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile 35 40 45 Ser Asp Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg 50 55 60 Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser 85 90 95 Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Ser 100 105 110 Phe Pro Leu Thr Leu Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 17 <211> 126 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 17 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu 20 25 30 Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile 35 40 45 Ser Asp Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg 50 55 60 Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser 85 90 95 Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Ser 100 105 110 Phe Pro Leu Thr Leu Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 18 <211> 468 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 18 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Ile Asp Tyr Glu Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Ala Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ile Leu Leu Tyr Tyr Tyr Pro Met Asp Tyr Trp 115 120 125 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 130 135 140 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 145 150 155 160 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 165 170 175 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 180 185 190 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 195 200 205 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 210 215 220 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 225 230 235 240 Cys Asp 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Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 450 455 460 Ser Pro Gly Lys 465 <210> 19 <211> 468 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 19 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Ile Asp Tyr Glu Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Ala Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Thr Arg Ile Leu Leu Tyr Tyr Tyr Pro Met Asp Tyr Trp 115 120 125 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 130 135 140 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 145 150 155 160 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 165 170 175 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu 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Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE <400> 80 Ser Gly Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln Phe Ser 1 5 10 15 Ser Leu Arg Val 20 <210> 81 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE <400> 81 Ser Gly Ser Gly Lys Val Ser Ala Gly Gln Phe Ser Ser Leu Arg Val 1 5 10 15 Arg Asp Thr Lys 20 <210> 82 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE <400> 82 Ser Gly Ser Gly Gly Gln Phe Ser Ser Leu Arg Val Arg Asp Thr Lys 1 5 10 15 Ile Glu Val Ala 20 <210> 83 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE <400> 83 Ser Gly Ser Gly Ser Leu Arg Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala 1 5 10 15 Gln Phe Val Lys 20 <210> 84 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE <400> 84 Ser Gly Ser Gly Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe Val Lys 1 5 10 15 Asp Leu Leu Val 20 <210> 85 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE <400> 85 Ser Gly Ser Gly Ile Glu Val Ala Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Val 1 5 10 15 His Leu Lys Lys 20 <210> 86 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE <400> 86 Ser Gly Ser Gly Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Val His Leu Lys Lys 1 5 10 15 Leu Phe Arg Glu 20 <210> 87 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE <400> 87 Ser Gly Ser Gly Asp Leu Leu Val His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu 1 5 10 15 Gly Gln Phe Asn 20 <210> 88 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE <400> 88 Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg Phe Asn 1 5 10 15 <210> 89 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE <400> 89 Asp Leu Leu Val His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Gln Phe Asn 1 5 10 15 <210> 90 <211> 20 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <220> <223> PRIMER SEQUENCE <400> 90 Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu 1 5 10 15 Gly Arg Phe Asn 20 <210> 91 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE <400> 91 Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly 1 5 10 <210> 92 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE <400> 92 Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu 1 5 <210> 93 <211> 357 <212> DNA <213> HOMO SAPIENS <400> 93 caggtgcagc tggtgcagag cggagccgag gtgaagaagc ctggcgccag cgtcaaggtg 60 tcctgcaagg ccagcggcta caccttcatc gactacgaga tccactgggt gcggcaggct 120 cctggacagg gcctggaatg gatgggcgcc atcgaccccg agacaggcgg caccgcctac 180 aaccagaagt tcaagggccg ggtcaccatg accaccgaca ccagcaccag caccgcctat 240 atggaactgc ggagcctgag aagcgacgac accgccgtgt actactgcac ccggatcctg 300 ctgtactact accccatgga ctactggggc cagggcacac tagtcaccgt gagcagc 357 <210> 94 <211> 321 <212> DNA <213> HOMO SAPIENS <400> 94 gagatcgtgc tgacccagag ccccgccacc ctgagcctga gccctggcga gcgggccacc 60 ctgtcctgcc gggccagcca gaacatcagc gactacctgc actggtatca gcagaagccc 120 ggccaggccc ccaggctgct gatctactac gccagccagt ccatctccgg catccccgcc 180 aggttcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagctc tctggaaccc 240 gaggacttcg ccgtgtatta ttgccagaac ggccacagct tccccctgac ctttggcggc 300 ggaacaaagg tggagatcaa g 321 <210> 95 <211> 1407 <212> DNA <213> HOMO SAPIENS <400> 95 atgggatgga gctgcatcat cctcttcctg gtggccacgg ctaccggcgt gcatagccag 60 gtgcagctcg tccagtctgg ggccgaggtg aagaagcccg gagcttctgt gaaggtgtcc 120 tgcaaggcca gcggctatac cttcatcgac tacgagatcc attgggtgag gcaggctccc 180 gggcagggcc tggagtggat gggcgccatc gacccagaga ccggaggcac ggcgtacaac 240 cagaagttca agggacgggt caccatgaca accgatacca gcacctccac cgcttacatg 300 gagctgcgca gcctgagaag cgacgacacc gcggtgtact actgtacgcg catcctgctc 360 tactactacc ccatggatta ctggggccag ggcacactag tcacagtctc ctcagcctcc 420 accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 480 gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 540 tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 600 tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 660 tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 720 tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 780 gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 840 acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 900 gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 960 taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 1020 aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1080 aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 1140 aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1200 gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1260 tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1320 gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1380 agcctctccc tgtctccggg taaatga 1407 <210> 96 <211> 1407 <212> DNA <213> HOMO SAPIENS <400> 96 atgggatgga gctgcatcat cctcttcctg gtggccacgg ctaccggcgt gcatagccag 60 gtgcagctcg tccagtctgg ggccgacgtg aagaagcccg gagcttctgt gaaggtgtcc 120 tgcaaggcca gcggctatac cttcatcgac tacgagatcc attgggtgag gcaggctccc 180 gggcagggcc tggagtggat gggcgccatc gacccagaga ccggaggcac ggcgtacaac 240 cagaagttca agggacgggt caccatgaca accgatacca gcacctccac cgcttacatg 300 gagctgcgca gcctgagaag cgacgacacc gcggtgtact actgtacgcg catcctgctc 360 tactactacc ccatggatta ctggggccag ggcacactag tcacagtctc ctcagcctcc 420 accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 480 gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 540 tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 600 tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 660 tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 720 tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 780 gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 840 acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 900 gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 960 taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 1020 aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1080 aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 1140 aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1200 gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1260 tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1320 gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1380 agcctctccc tgtctccggg taaatga 1407 <210> 97 <211> 702 <212> DNA <213> HOMO SAPIENS <400> 97 atgggatggt cttgtatcat cctgttcctg gtggcgaccg ccaccggcgt gcactccgag 60 atcgtgctga cccagagtcc agccaccctc agcctgagcc ctggggaacg cgccaccctg 120 tcctgccggg cgagtcagaa catctccgac tacctgcatt ggtaccagca gaagcccggc 180 caggcccctc gcctgctgat ctactacgcc tcccagagca tcagcggaat ccccgcccgg 240 ttctccggaa gtgggtccgg aaccgacttt accctgacca tcagctctct cgagccagag 300 gacttcgcgg tgtactactg ccagaacggg catagtttcc cactgacctt cggagggggc 360 acaaaggtgg agatcaagcg tacggtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct 420 gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 480 agagaggcca aagtacagtg gaaggtggac aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag 540 agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg 600 agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg 660 agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt ag 702 <210> 98 <211> 12 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 98 Leu Leu Val His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly 1 5 10 <210> 99 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE <400> 99 Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Ala Lys Lys Leu Phe Arg Glu 1 5 10 15 Gly Arg Phe Asn 20 <210> 100 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE <400> 100 Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Ala Lys Leu Phe Arg Glu 1 5 10 15 Gly Arg Phe Asn 20 <210> 101 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE <400> 101 Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Ala Leu Phe Arg Glu 1 5 10 15 Gly Arg Phe Asn 20 <210> 102 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE <400> 102 Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Ala Phe Arg Glu 1 5 10 15 Gly Arg Phe Asn 20 <210> 103 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE <400> 103 Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Ala Arg Glu 1 5 10 15 Gly Arg Phe Asn 20 <210> 104 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE <400> 104 Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Ala Glu 1 5 10 15 Gly Arg Phe Asn 20 <210> 105 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE <400> 105 Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Ala 1 5 10 15 Gly Arg Phe Asn 20 <210> 106 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE <400> 106 Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu Ala Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu 1 5 10 15 Gly Arg Phe Asn 20 <210> 107 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE <400> 107 Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Ala His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu 1 5 10 15 Gly Arg Phe Asn 20 <210> 108 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE <400> 108 Gln Phe Val Lys Asp Leu Ala Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu 1 5 10 15 Gly Arg Phe Asn 20 <210> 109 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE <400> 109 Gln Phe Val Lys Asp Ala Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu 1 5 10 15 Gly Arg Phe Asn 20 <210> 110 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE <400> 110 Gln Phe Val Lys Ala Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu 1 5 10 15 Gly Arg Phe Asn 20 <210> 111 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE <400> 111 Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu 1 5 10 15 Ala Arg Phe Asn 20 <210> 112 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE <400> 112 Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu 1 5 10 15 Gly Ala Phe Asn 20 <210> 113 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE <400> 113 Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu 1 5 10 15 Gly Arg Ala Asn 20 <210> 114 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE <400> 114 Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu 1 5 10 15 Gly Arg Phe Ala 20

Claims (46)

  1. hIL-13에 특이적으로 결합하며, SEQ ID NO:3의 CDRH3, 또는 상기 CDRH3내의 1 또는 2개의 아미노산 잔기가 SEQ ID NO:3에서 상응하는 위치의 아미노산 잔기와 상이한 이의 변이체를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 제 1항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 인간 IL-13을 중화시키는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 인간 IL-13의 이의 수용체로의 결합을 조절하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제 1항 내지 제 3항중의 어느 한 항에 있어서, CDRH3이 SEQ ID NO:3의 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제 1항 내지 제 4항중의 어느 한 항에 있어서, CDRH2: SEQ ID NO:2, CDRH1: SEQ ID NO:1, CDRL1: SEQ ID NO:4, CDRL2: SEQ ID NO:5 및 CDRL3: SEQ ID NO:6 또는 상기 CDR내의 1 또는 2개의 아미노산 잔기가 상기 SEQ ID NO의 상응하는 위치에서의 아미노산 잔기와 상이한 이의 변이체중 하나 이상을 추가로 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제 1항 내지 제 5항중의 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 하기 CDR을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    CDRH1 : SEQ.I.D.NO:1
    CDRH2: SEQ.I.D.NO:2
    CDRH3: SEQ.I.D.NO:3
    CDRL1: SEQ.I.D.NO:4
    CDRL2: SEQ.I.D.NO:5
    CDRL3: SEQ.I.D.NO:6
  7. SEQ ID NO:90, 99, 102, 103, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112 및 114의 펩티드에 결합하나, SEQ ID NO: 100, 101 , 104 및 113의 펩티드에는 결합하지 않는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 제 1항 내지 제 7항중의 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO:91의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 제 1항 내지 제 8항중의 어느 한 항에 있어서, 항체가 본래의 항체인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  10. 제 9항에 있어서, 항체가 래트 (rat), 마우스 (mouse), 영장류 (예를 들어, 사이노몰구스 (cynomolgus), 올드 월드 멍키 (Old World monkey) 또는 유인원) 또는 인간인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  11. 제 1항 내지 제 9항중의 어느 한 항에 있어서, 항체가 인간화된 항체 또는 키메라 항체인 항체.
  12. 제 9항 내지 제 11항중의 어느 한 항에 있어서, 항체가 인간 불변 영역을 포함하는 항체.
  13. 제 9항 내지 제 12항중의 어느 한 항에 있어서, 항체가 IgG 이소타입의 불변 영역을 포함하는 항체.
  14. 제 13항에 있어서, 항체가 IgG1, IgG2 또는 IgG4인 항체.
  15. 제 6항에 있어서, SEQ ID NO:7의 VH 도메인 및 SEQ ID NO:8의 VL 도메인을 포함하는 항체.
  16. 제 6항에 있어서, SEQ ID NO:12의 VH 도메인 및 SEQ ID NO:15의 VL 도메인을 포함하는 인간화된 항체.
  17. 제 6항에 있어서, SEQ ID NO:13의 VH 도메인 및 SEQ ID NO:15의 VL 도메인을 포함하는 인간화된 항체.
  18. 제 16항 또는 제 17항에 있어서, IgG 이소타입의 인간 불변 영역 (예를 들어, IgG1 또는 IgG4)를 추가로 포함하는 인간화된 항체.
  19. SEQ ID NO:19의 중쇄 및 SEQ ID NO:22의 경쇄를 포함하는 인간화된 항체.
  20. SEQ ID NO:20의 중쇄 및 SEQ ID NO:22의 경쇄를 포함하는 인간화된 항체.
  21. 제 1항 내지 제 8항중의 어느 한 항에 있어서, 단편이 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 디아바디 (diabody), 트리아바디 (triabody), 테트라바디 (tetrabody), 미니항체(miniantibody), 미니바디(minibody), 단리된 VH, 단리된 VL인 항원 결합 단편.
  22. 제 21항에 있어서, ScFv를 포함하거나 ScFv로 이루어진 항원 결합 단편.
  23. 제 1항 내지 제 20항중의 어느 한 항에 있어서, 항체가 저하된 ADCC 및/또는 보체 활성을 갖도록, 변이된 Fc 영역을 포함하는 항체.
  24. 제 1 벡터 및 제 2 벡터를 포함하는 형질전환되거나 트랜스펙션된 재조합 숙주 세포로서, 상기 제 1 벡터는 제 1항 내지 제 23항중의 어느 한 항에 따른 항체의 중쇄를 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 포함하며, 상기 제 2 벡터는 제 1항 내지 제 23항중의 어느 한 항에 따른 경쇄를 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 포함하는 숙주 세포.
  25. 제 24항에 있어서, 세포가 진핵세포인 숙주 세포.
  26. 제 25항에 있어서, 세포가 포유류 세포인 숙주 세포.
  27. 제 26항에 있어서, 세포가 CHO 세포 또는 NS0 세포인 숙주 세포.
  28. 제 1항 내지 제 20항 또는 제 23항중의 어느 한 항에 따른 항체를 생성시키는 방법으로서, 혈청비함유 배양 배지중에 제 24항 내지 제 27항중의 어느 한 항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법.
  29. 제 28항에 있어서, 상기 항체가 상기 숙주 세포에 의해 상기 배양 배지로 분비되는 방법.
  30. 제 29항에 있어서, 상기 항체가 상기 항체 함유 배양 배지에 대하여 95% 이상 (예를 들어, 98% 또는 그 초과)으로 추가로 정제되는 방법.
  31. 제 1항 내지 제 23항중의 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제 조성물.
  32. 제 31항에 따른 조성물과 사용 설명서를 포함하는 부품의 키트.
  33. 치료학적 유효량의 제 1항 내지 제 23항중의 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 투여하는 단계를 포함하여, 천식에 걸린 인간 환자를 치료하는 방법.
  34. 제 33항에 있어서, 상기 환자가 알레르기 천식, 중증 천식, 어려운 천식 (difficult asthma), 과민한 천식 (brittle asthma), 야간 천식, 월경전 천식, 스테로이드 내성 천식, 스테로이드 의존성 천식, 아스피린 유도된 천식, 성인형 천식, 소아 천식으로부터 선택된 천식에 걸린 환자인 방법.
  35. 치료학적 유효량의 제 1항 내지 제 23항중의 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코르티코스테로이드로의 처리에 무반응성인 천식 질환에 걸린 인간 환자에 투여하는 단계를 포함하여, 코르티코스테로이드로의 처리에 무반응 성인 천식 질환에 걸린 인간 환자를 치료하는 방법.
  36. 치료학적 유효량의 제 1항 내지 제 23항중의 어느 한 항에 따른 항체를 인간 환자에 투여하는 단계를 포함하여, 인간 환자에서 급성 천식 발병을 예방하는 방법.
  37. 치료학적 유효량의 제 1항 내지 제 23항중의 어느 한 항에 따른 항체를 인간 환자에 투여하는 단계를 포함하여, 인간 환자에서 급성 천식 발생의 빈도를 저하시키고/거나 이의 영향을 완화시키는 방법.
  38. 치료학적 유효량의 제 1항 내지 제 23항중의 어느 한 항에 따른 항체를 인간 환자에 투여하는 단계를 포함하여, 아토피성 피부염, 알레르기 비염, 크론병, COPD, 섬유성 질환 또는 질병 예컨대, 특발성 폐 섬유증, 진행성 전신 경화증, 간 섬유증, 간 육아종, 주혈흡충증, 리슈만편모충증, 세포 주기 조절 질환 예컨대, 호지킨병, B-세포 만성 림프구 백혈병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환 또는 질병에 걸린 인간 환자를 치료하는 방법.
  39. 알레르기 천식, 중증 천식, 어려운 천식, 과민한 천식, 야간 천식, 월경전 천식, 스테로이드 내성 천식, 스테로이드 의존성 천식, 아스피린 유도된 천식, 성인 천식, 소아 천식, 아토피성 피부염, 알레르기 비염, 크론병, COPD, 섬유성 질환 또는 질병 예컨대, 특발성 폐 섬유증, 진행성 전신 경화증, 간 섬유증, 간 육아종, 주혈흡충증, 리슈만편모충증, 세포 주기 조절 질환 예컨대, 호지킨병, B 세포 만성 림프구 백혈병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환 또는 질병을 치료하기 위한 의약 제조시 제 1항 내지 제 23항중의 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도.
  40. 치료학적 유효량의 제 1항 내지 제 23항중의 어느 한 항에 따른 항체 및 치료학적 유효량의 항-IL-4 모노클로날 항체를 투여하는 것을 포함하여, 알레르기 천식, 중증 천식, 어려운 천식, 과민한 천식, 야간 천식, 월경전 천식, 스테로이드 내성 천식, 스테로이드 의존성 천식, 아스피린 유도된 천식, 성인 천식, 소아 천식, 아토피성 피부염, 알레르기 비염, 크론병, COPD, 섬유성 질환 또는 질병 예컨대, 특발성 폐 섬유증, 진행성 전신 경화증, 간 섬유증, 간 육아종, 주혈흡충증, 리슈만편모충증, 세포 주기 조절 질환 예컨대, 호지킨병, B 세포 만성 림프구 백혈병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환 또는 질병에 걸린 인간 환자를 치료하는 방법.
  41. 제 40항에 있어서, 항-IL-4 모노클로날 항체가 제 1항 내지 제 23항중의 어느 한 항에 따른 항체와 동시에, 연속적으로, 또는 분리되어 투여되는 방법.
  42. 제 40항 또는 제 41항에 있어서, 항-IL-4 항체가 파스콜리주맙 (pascolizumab)인 방법.
  43. 알레르기 천식, 중증 천식, 어려운 천식, 과민한 천식, 야간 천식, 월경전 천식, 스테로이드 내성 천식, 스테로이드 의존성 천식, 아스피린 유도된 천식, 성인 천식, 소아 천식, 아토피성 피부염, 알레르기 비염, 크론병, COPD, 섬유성 질환 또는 질병 예컨대, 특발성 폐 섬유증, 진행성 전신 경화증, 간 섬유증, 간 육아종, 주혈흡충증, 리슈만편모충증, 세포 주기 조절 질환 예컨대, 호지킨병, B 세포 만성 림프구 백혈병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환 또는 질병을 치료하기 위한 의약의 제조시 제 1항 내지 제 23항중의 어느 한 항에 따른 항체 및 항-IL-4 모노클로날 항체 예컨대, 파스콜리주맙의 용도.
  44. 알레르기 천식, 중증 천식, 어려운 천식, 과민한 천식, 야간 천식, 월경전 천식, 스테로이드 내성 천식, 스테로이드 의존성 천식, 아스피린 유도된 천식, 성인 천식, 소아 천식, 아토피성 피부염, 알레르기 비염, 크론병, COPD, 섬유성 질환 또는 질병 예컨대, 특발성 폐 섬유증, 진행성 전신 경화증, 간 섬유증, 간 육아종, 주혈흡충증, 리슈만편모충증, 세포 주기 조절 질환 예컨대, 호지킨병, B 세포 만성 림프구 백혈병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환 또는 질병을 치료하기 위한 키트 제조시 제 1항 내지 제 23항중의 어느 한 항에 따른 항체 및 항-IL-4 모노클로날 항체 예컨대, 파스콜리주맙의 용도.
  45. 제 1항 내지 제 23항중의 어느 한 항에 따른 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제 1 약제 조성물, 및 항-IL-4 모노클로날 항체 예컨대, 파스콜리주맙 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제 2 약제 조성물과 선택적으로 사용 설명서를 포함하는 부품의 키트.
  46. 제 1항 내지 제 23항중의 어느 한 항에 따른 제 1 항체, 및 항-IL-4 항체 예컨대, 파스콜리주맙인 제 2 항체, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제 조성물.
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