KR20090088849A

KR20090088849A - 천연두 단일클론 항체

Info

Publication number: KR20090088849A
Application number: KR1020097005915A
Authority: KR
Inventors: 쟝-피에르 키넷; 마리-헬레네 주뱅
Original assignee: 퀘르세젠 파마 엘엘씨
Priority date: 2006-08-23
Filing date: 2007-08-22
Publication date: 2009-08-20
Also published as: CA2661659C; US7811568B2; CN101553255A; ZA200901481B; EP2061511A2; AU2007342327B2; WO2008085551A3; US20080112959A1; AU2007342327A1; TW200831529A; CA2661659A1; EP2061511A4; JP2010507362A; WO2008085551A2

Abstract

우두 바이러스 B5R 표면 항원에 대한 인간화된 단일클론 항체에 관한 것이다. 상기 항체는 천연두 감염 치료에 효과적이다. 또한, 이러한 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 핵산, 및 그들을 발현하는 세포가 개시된다.

우두 바이러스, 항원, 단일클론 항체, 핵산, 면역글로불린

Description

천연두 단일클론 항체{SMALLPOX MONOCLONAL ANITBODY}

본원은 2006년 8월 23일자로 출원한 가출원번호 제60/839,579호를 우선권으로 주장하며, 그의 전문이 참고로 본원에 원용된다.

천연두(smallpox)는 바리올라 바이러스(variola virus)에 의해 유발되는 심각하고 고전염성인, 때때로 치명적인 감염성 질병이다. 천연두는 지난 수 천년 동안 발병되어 왔으나, 상기 질병은 성공적인 세계적 백신접종 프로그램 이후 1977년에 실질적으로 근절되었다. 이러한 질병이 제거된 이후, 더 이상의 예방이 필요치 않아, 일반 대중들 사이에서 천연두에 대한 일반적인 백신예방접종이 중지되었다. 그 결과, 현재 인간 모집단의 일부가 천연두에 대해 면역되어 있지 않고 있다. 결과로서, 생물학적 테러리스트인 바리올라 바이러스의 공격은 황폐화시킬 수도 있다. 중요하게도, 이러한 공격이 수행되면, 백신접종이 목적 집단 내에서 천연두의 빠른 확산을 효과적으로 지연시키기에는 너무 느리다. 그러므로, 천연두 감염 치료를 위한 효과적이고 빠르게 작용하는 조성물이 요구되고 있다.

요약

본 발명은 부분적으로, 바리올라 바이러스와 밀접하게 관련된 폭스바이러스 과(family)의 구성원인 우두 바이러스의 B5R 항원에 대한 인간화된 단일클론 항체가 천연두 감염을 무력화시키는데 효과적임을 발견한 것에 기초한다.

따라서, 본 발명의 일 측면은 B5R 항원에 대한 항원-결합 도메인을 포함하는 인간화된 단일클론 항체에 관한 것이다. 이러한 인간화된 단일클론 항체(hB5RmAb)는 우두 바이러스 감염 환자에게 투여될 때 우두 바이러스의 진행을 지연시킬 수 있다. 이는 EM-1000 하이브리도마 세포주(ATCC 수탁번호 PTA-7594)에 의해 생산되는 단일클론 항체와 동일한 에피토프(epitope) 특이성을 가질 수 있다. 상기 인간화된 항체는 2개 이하의 단일 아미노산 차이를 갖는 서열번호 1(하기 참조)과 동일한 제1 중쇄 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR) 서열, 4개 이하의 단일 아미노산 차이를 갖는 서열번호 2(하기 참조)와 동일한 제2 중쇄 CDR 서열, 4개 이하의 단일 아미노산 차이를 갖는 서열번호 3(하기 참조)과 동일한 제3 중쇄 CDR 서열, 4개 이하의 단일 아미노산 차이를 갖는 서열번호 4(하기 참조)와 동일한 제1 경쇄 CDR 서열, 3개 이하의 단일 아미노산 차이를 갖는 서열번호 5(하기에 보임)와 동일한 제2 경쇄 CDR 서열 및 3개 이하의 단일 아미노산 차이를 갖는 서열번호 6(하기에 보임)과 동일한 제3 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다. 상기 인간화된 항체는 전술한 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 포함하는 단일 폴리펩타이드를 구성할 수 있다.

본 발명의 다른 측면은 전술한 항체를 포함하는 배양 세포에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은 전술한 중쇄 또는 경쇄 CDR 서열을 포함하는 인간화된 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화(encoding)하는 분리된 핵산에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은 전술한 핵산 중 하나를 포함하는 배양 세포에 관한 것이다.

본 발명의 기타 특징 또는 장점은 이하의 상세한 설명 및 청구항으로부터 명백해질 것이다.

상세한 설명

바리올라 바이러스의 검출과 그의 숙주 세포 감염능 저해에 유용한, 우두 바이러스 B5R 항원(hB5RmAb)에 대한 공여자(예를 들면, 래트 또는 마우스)의 단일클론 항체 유래의 신규한 인간화된 단일클론 항체가 하기에 설명된다. 인간에서 치료제로서 설치류 mAbs의 투여는 심각한 면역반응을 일으킬 가능성이 있다. 본 발명의 인간화된 단일클론 항체는 이 면역 반응을 유발하지 않아 치료 또는 예방 제제로서 사용될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "단일클론 항체"란 용어는 면역글로불린의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 임의의 폴리펩타이드를 의미한다. 이러한 폴리펩타이드는 예를 들어 임의의 면역글로불린의 아미노산 서열과 관련성이 없거나 낮은 서열 상동성(즉, 60% 이하)의 아미노산 서열에 대한, 2가 항체, 1가 항체, 단일사슬 항체(즉, 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일 폴리펩타이드), Fab 단편, 다이아바디(diabodies), 모노바디(monobodies) 및 이들의 혼합물을 포함한다.

"인간화된 단일클론 항체"란 용어는 적어도 하나의 가변 영역 골격(framework) 서열이 인간 골격 서열과 유사하거나 동일한, 상기에서 언급된 임의의 폴리펩타이드(예를 들면, 인간 면역글로불린 파지 디스플레이 라이브러리(phage display library)에서 분리된 항체)를 의미한다.

본 명세서에 기재된 hB5RmAbs에 의해 인식되는 B5R 단백질의 서열(Genebank CAA46496)은 하기와 같다:

MKTISVVTLLCVLPAVVYSTCTVPTMNNAKLTSTETSFNDKQKVTFTCDSGYYSLDPNAVCETDKWKYENPCKKMCTVSDYVSELYNKPLYEVNAIITLICKDETKYFRCEEKNGNTSWNDTVTCPNAECQSLQLDHGSCQPVKEKYSFGEHITINCDVGYEVIGASYITCTANSWNVIPSCQQKCDIPSLSNGLISGSTFSIGGVIHLSCKSGFILTGSPSSTCIDGKWNPVLPICIRSNEEFDPVEDGPDDETDLSKLSKDVVQYEQEIESLEATYHIIIVALTIMGVIFLISVIVLVCSCNKNNDQYKFHKLLL(서열번호 7)

B5R 항원에 대한 모체 항체 또는 인간화된 항체의 친화도를 결정하는데 당업계에 알려진 공지의 평가법을 이용할 수 있다. 이에 대해서는 예를 들어 문헌[Azimzadeh et al., J. Immunol Methods, 141(2): 199-208 (1991); 및 Ota et al., Hybridoma, 17(5):471-7 (1998)]을 참조할 수 있다. hB5RmAbs는 EM-1000 하이브리도마에 의해 생산되는 항체와 동일한 B5R 항원 에피토프 특이성을 가질 수 있다(후술함). 에피토프 맵핑 방법은 예를 들어 문헌[Steinmann et al., J. Virol. 78(17):9030-40 (2004)]에 설명된 대로 잘 확립되어 있고, 용이하게 수행될 수 있다.

본 발명의 hB5RmAbs는 B5R 항원에 대한 공여자(예를 들어, 마우스 또는 래트) 단일클론 항체 유래의, 하기 제1, 제2 및 제3 중쇄 상보성 결정 영역(H-CDRs 1-3)을 가질 수 있다:

H-CDR 1 NYHVH (서열번호 1)

H-CDR 2 LMWRDGDTSYNPTLKS (서열번호 2)

H-CDR 3 GSEYYGLLGYVMGA (서열번호 3)

그들은 하기 제1, 제2 및 제3 경쇄 상보성 결정 영역(L-CDRs 1-3)을 가질 수 있다:

L-CDR 1 KASKSISKSLA (서열번호 4)

L-CDR 2 SGSTLQS (서열번호 5)

L-CDR 3 QQHNEYPVT (서열번호 6)

상기 요약 부분에서 언급했듯이, 본 명세서에 기재된 hB5RmAbs 내의 CDR 서열 각각은 상기 목록의 서열번호 1 내지 6과 관련하여 다수의 아미노산 차이를 포함할 수 있다:

H-CDR 1 서열번호 1과 비교하여 2개 이하의 단일 아미노산 차이

H-CDR 2 서열번호 2와 비교하여 4개 이하의 단일 아미노산 차이

H-CDR 3 서열번호 3과 비교하여 4개 이하의 단일 아미노산 차이

L-CDR 1 서열번호 4와 비교하여 4개 이하의 단일 아미노산 차이

L-CDR 2 서열번호 5와 비교하여 3개 이하의 단일 아미노산 차이

L-CDR 3 서열번호 6과 비교하여 3개 이하의 단일 아미노산 차이

차이는 아미노산 치환, 결실, 삽입, 및 첨가를 포함할 수 있다. 상기 차이가 아미노산 치환인 경우, 보존성 아미노산 치환이 바람직하다. 보존성 아미노산 치환은 하나의 아미노산이 유사한 화학적 성질을 갖는 다른 아미노산에 의해 치환되는 것이다. 표 1은 20개의 유전적으로 암호화된 아미노산이 그들의 화학적 성질에 따라 어떻게 그룹화될 수 있는 지를 예시하고 있다.

화학적 성질에 따라 그룹화된 아미노산
산성	중성	지방족	방향족	염기성
아스파르테이트 글루타메이트	아스파라진, 시스테인, 글루타민, 메티오닌, 프롤린, 세린, 트레오닌	알라닌, 글라이신, 아이소류신, 류신, 발린	히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 타이로신	알지닌, 라이신

상기 돌연변이 중 어느 하나를 도입하는 기술은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 위치-지정 돌연변이(site-directed mutagenesis), 에러-프론(error-prone) PCR, 및 에러-프론 숙주 세포 내의 서열복제). 전술한 유형의 어떤 돌연변이를 포함하는 hB5RmAbs가 B5R에 결합하는 능력은 다수의 통상적인 기술, 예를 들어, ELISA 또는 파지 디스플레이를 통해 효율적으로 검사될 수 있다. 이들 평가법의 고효율적인 버전이 당업계에 공지되어 있고, 돌연변이 기술과 병용될 수 있어, 과도한 노력 없이도 훨씬 높은 항원 친화도를 갖는 hB5RmAbs를 분리해낼 수 있다. 이에 대해서는 미국 특허 제6,916,474호 공보를 참조할 수 있다.

hB5RmAbs의 가변 영역을 위해, 임의의 인간 수용체의 가변 영역 골격 서열을 공여자 항체(이들로부터 항원 결합 영역이 유래됨)의 분류나 종류를 고려하여 이용할 수 있다. 인간 수용체의 가변 영역 골격 서열은 또한 보존 서열, 즉, 자연적으로 발생되는 몇몇 서열에 기초하여 생성되는 것일 수도 있다. 이용되는 인간 수용체 골격의 종류는 공여자 항체와 비교하여 동일 혹은 유사한 분류 또는 종류인 것이 바람직하다. 바람직하게는, 인간 그룹 Ⅲ 감마 배자 계열(germ line) 골격은 복합 중쇄에 이용되고, 인간 그룹 Ⅰ 카파 배자 계열 골격은 복합 경쇄에 이용된다. hB5RmAbs의 중쇄 및 경쇄는 각각 공여자의 가변 영역 골격 서열로부터 유래되는 약 15개 이하의 잔기를 포함할 수 있다. hB5RmAbs 골격 영역 서열 내에 공여자의 가변 영역 골격 잔기를 포함하는 것은 그의 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 적절한 공여자 골격 잔기의 선택방법은 예를 들어 미국특허 제5,998,586호 및 제6,056,957호 공보에 기재되어 있다.

본 명세서에 기재된 hB5RmAbs의 불변 영역 도메인(constant region domains)은 항체의 제안된 기능, 특히, 요구될 수 있는 작동자(effector) 기능을 고려하여 선택된다. 예를 들어, 불변 영역 도메인은 인간 IgA, IgE, IgG 또는 IgM 도메인일 수 있다. 그 중에서도, hB5RmAbs가 치료용으로 의도되고, 항체 작동자 기능이 필요할 경우, IgG 인간 불변 영역 도메인이 사용될 수 있고, 특별히 IgG1 및 IgG3 아이소타입을 사용할 수 있다. 변형된 인간 불변 영역 도메인은 또한 하나 이상의 아미노산 잔기를 변경시키거나 결실시켜 특정 작동자 기능을 변화시키는데 사용될 수도 있다.

본 명세서에 기재된 hB5RmAbs는 작동자 또는 보고자(reporter) 분자를 부속시킬 수 있다(예를 들어, 융합 폴리펩타이드로서). 대안적으로, 상기 중쇄 또는 경쇄의 불변 영역의 아미노산 서열은 기능적인 비-면역글로불린 폴리펩타이드, 예컨대, 친화도 표지, 형광 단백질, 효소, 독소 분자를 암호화하는 아미노산 서열로 대체될 수 있다. 따라서, 항체 분자의 나머지 부분은 면역글로불린 유래의 서열만으로 구성될 필요는 없다.

본 발명의 다른 측면은 hB5RmAbs를 형성하는 인간화된 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 DNA 서열을 포함한다. DNA 서열을 포함하는 클로닝 및 발현 벡터, DNA 서열로 형질전환된 숙주 세포 및 해당 형질전환된 숙주 세포 내에서 DNA 서열을 발현하는 것을 포함하는 항체분자의 생산 방법도 본 발명의 또 다른 측면이다. 벡터가 구축될 수 있는 일반적인 방법, 형질전환 방법 및 세포배양 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 과도한 노력 없이 용이하게 수행할 수 있다. 항-B5R 공여자 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열은 공지된 방법, 예컨대, 국제특허출원 공개 제WO93/16184호 공보에 기재된 바와 같은 방법에 의해 용이하게 얻을 수 있다. 예를 들어, 상기 항-B5R 암호화 서열은 적절한 하이브리도마 세포주로부터 유전자 클로닝 또는 cDNA 클로닝에 의해 얻을 수 있다. 양성 클론은 필요로 하는 중쇄 및 경쇄에 대한 적합한 프로브를 이용하여 스크리닝될 수 있다. 대안적으로, PCR 클로닝이 사용될 수 있다.

인간 수용체 아미노산 서열은 임의 다수의 표준 방법을 통해 얻을 수 있다. 예를 들어, 인간 그룹 Ⅰ경쇄 및 인간 그룹 Ⅲ 중쇄 등의 인간 수용체 골격을 암호화하는 DNA 서열은 공지되어 있고, 이것은 당업자들에게 널리 이용가능하다.

바람직한 DNA 서열을 제조하기 위해 표준 분자생물학기술을 이용할 수 있다. 상기 서열은 올리고뉴클레오타이드 합성 기술을 이용하여 완전하게 또는 부분적으로 합성될 수 있다. 위치-지정 돌연변이 및 PCR 기술이 필요에 따라 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Jones et al. Nature, 321, 522 (1986)]에 기재된 바와 같은 올리고뉴클레오타이드 지정 합성법(oligonucleotide directed synthesis)이 사용될 수 있다. 또, 문헌[Verhoeyen et al., Science, 239, 1534-1536 (1988)]에 기재된 바와 같은 기존의 가변 영역(pre-existing variable region)의 올리고뉴클레오타이드 지정 합성법이 이용될 수 있다. 또한, 문헌[Queen et al., Proc. Natl. Acad. ScL USA, 86, 10029-10033 (1989)] 및 WO 90/07861호 공보에 기재된 바와 같은 T4 DNA 중합효소를 사용한 갭이 형성된 올리고뉴클레오타이드의 효소적인 매움법(enzymatic filling-in of gapped oligonucleotides)을 이용할 수 있다.

핵산은 또한 Sigma-Genosys(sigma-genosys.com/oligo.asp); Midland Certified Reagent Company(mcrc@oligos.com); Great American Gene Company (genco.com); ExpressGen Inc.(expressgen.com); Operon Technologies Inc.(Alameda, CA) 및 기타 많은 기업 등의 다양한 상업적 경로를 통해 입수될 수 있다.

임의의 적합한 숙주 세포 및 벡터 시스템이 hB5RmAbs 중쇄 또는 경쇄를 암호화하는 DNA 서열의 발현에 이용될 수 있다. 바람직하게는, 진핵(예를 들어, 포유류) 숙주 세포 발현 시스템이 이용된다. 특히, 적합한 포유류 숙주 세포는 CHO 세포 및 골수종 세포주 또는 하이브리도마 세포주를 포함한다.

일 실시형태에서, 상기 hB5RmAbs는 EM-1000 하이브리도마 세포주에서 분비된다. 본 출원인은 EM-1000 하이브리도마 세포주(ATCC 기탁번호 PTA-7594)를 부다페스트-협정에 따라, ATCC(American Type Culture Collection)(Manassas, VA 20110-2209, U.S.A)에 기탁하였다. 상기 기탁된 하이브리도마 세포주는, 본원 출원일 이전 이래로, EMAB LLC(3 Hunt Road, Lexington, MA 02421)에 의해 유지된 동일한 기탁물로부터 취득할 수 있다. 상기 하이브리도마의 기탁물은 30년, 가장 최근 요청 이후 5년, 또는 특허의 유효 기간 중 더 긴 기간 동안 제한 없이 ATCC 기탁소에 유지될 수 있으며, 상기 기탁물이 그 기간 동안 생존하지 못하게 되면, 교체될 것이다.

전술된 hB5RmAbs는 예방 또는 치료 용도를 위한 약제학적 조성물에 통합시킬 수 있다. 예를 들면, 약제학적 조성물은 유효량의 hB5RmAbs 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 일반적으로, 유효량은 순환하는 바리올라 또는 우두 바이러스와 양적으로 결합하는 데 충분한 순환하는 hB5RmAbs 농도로 되거나, 감염 대상에서 감염의 진행을 지연시킬 것이다. 그렇지만, 유효량은, 당업자가 인식하고 있듯이, 감염의 중증도, 중재의 단계, 일반적인 건강상태 또는 대상자의 나이, 이전의 치료, 투여 경로, 부형제 사용, 및 다른 예방 혹은 치료와의 병용 가능성에 따라 달라질 수 있다.

또한, 전술한 항체의 유효량을 이를 필요로 하는 대상에게 투여함으로써 해당 대상에서 천연두 감염을 치료하는 방법도 본 발명의 범위 내이다. 치료될 대상은 천연두 감염과 관련된 병상을 지니거나 해당 병상에 걸릴 위험성이 있는 것으로서 확인될 수 있다. "치료하는"이란 용어는, 질병, 질병의 증상, 질병에 대한 2차적인 질병상태 또는 질병에 대한 소인을 치유(cure), 완화(alleviate), 구제(relieve), 제거(remedy), 또는 개선(ameliorate)하기 위한 목적으로, 대상에게 조성물을 투여하는 것을 의미한다. "유효량"은 치료 대상에서 의학적으로 원하는 결과를 낼 수 있는 능력을 가진 조성물의 양이다.

본 발명의 방법을 실시하기 위해, hB5RmAbs-함유 조성물은 비경구적 경로를 통해 전신에 투여될 수 있다. 투여될 때, 상기 치료 조성물은 바람직하게는 발열원이 제거된(pyrogen-free) 비경구적으로 허용가능한 수용액 형태이다. 이러한 비경구적으로 허용가능한 단백질 용액(pH, 등장성, 안정성 등과 관련된 원인을 갖는)은 당업계의 기술 내에 있다. 비경구적으로 허용가능한 비히클(vehicles) 및 용매 가운데, 만니톨, 물, 링거용액 및 생리식염액를 사용할 수 있다.

필요한 경우, hB5RmAbs는 일정 기간에 걸쳐 지속적으로 투여될 수 있다. 조성물을 지속적으로 주입하고 시간이 지남에 따른 전신의 농도를 유지하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 삼투압성 미니-펌프 또는 기타 시간에 따른 방출 기구로부터 방출되거나 운반될 수 있다. 기본적인 삼투압성 미니-펌프로부터의 방출 속도는 방출 구멍 내에 배치된 미세다공성의 빠른-반응성 겔(fast-response gel)로 조절될 수 있다. 삼투압성 미니-펌프는 장기간에 걸친(예를 들어, 1시간 내지 1주) 조성물의 방출을 조절하는데 유용하다. 이러한 미니 펌프뿐만 아니라 다른 서방성 기구도 상업적으로 입수가능한데, 예를 들면, 두렉트사(DURECT corporation, 캘리포니아주의 큐퍼티노시에 소재)로부터 입수 가능하다. 활성 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌약 형태로 투여될 수 있다.

하기의 특정 실시예는 단지 실례로서 해석되고, 어떠한 방법으로든 설명 이외의 것에 의해 제한받지 않는다. 당업자라면 추가의 노력없이도 본 명세서의 설명에 기초하여 본 발명을 최대한 이용할 수 있을 것으로 여겨진다. 본 명세서에서 인용된 모든 간행물은 그 전문이 참고로 본원에 포함된다.

항-B5R 단일클론 항체를 통한 생체 내에서(in vito)의 우두 바이러스의 무력화

우두 바이러스의 외피 단백질 B5R에 대한 항-B5R 래트 하이브리도마를 DMEM에서 키웠다(Schmelz et al., J Virol., 68(l):130-147 (1994); 및 Galmiche et al., Virology, 254(l):71-80 (1999)). 상기 단일클론 항체는 단백질 G 세파로즈 상에서 정제하였다.

6 내지 8주령의 Balb/c 마우스(그룹별로 3마리씩)를 우두 바이러스의 10⁷ 플라크 형성 단위로 비강내 감염시켰다. 5시간 후, 그들은 10㎍ 또는 30㎍의 항-B5R 단일클론 항체 또는 사전-면역된 래트의 IgG(PI)로 복강내 주사되었다. 마우스의 체중은 12일 동안 이틀 간격으로 관찰하였다. 결과는 각각의 투여량에서 언페어드 원사이드 티 테스트(unpaired one-side t test)를 이용하여 항-B5R과 PI 동물 간에 비교하였다.

대조군 동물에서, 2일째 되는 날에 체중감소가 관찰되었고, 6일째에 가장 감소량이 컸으며, 상기 마우스는 12일째에 회복되었다. 항-B5R 처리 동물에서, 유사한 패턴이 관찰되었다. 하지만, 6일째의 체중감소 정도는 30㎍의 항-B5R을 받은 동물이 유의하게 적었다(조건에 비교하여 p<0.001).

항-B5R 단일클론 항체의 인간화

항-B5R 경쇄 및 중쇄의 가변영역에 대한 cDNA를 PCR로 증폭하고, 서열 결정을 위해 pCRII(Invitrogen)에 서브클로닝하였다. 핵산 서열은 몇몇 독립적인 클론에서 얻었다. 항-B5R의 경쇄 또는 중쇄 가변 영역을 나타내도록 독립적인 클론 유래의 동일한 cDNA 서열을 선택하였다.

래트 항-B5R 항체의 인간화를 위해 CDR 융합을 이용할 수 있다. 결합친화도 및 특이성을 유지하기 위해서는, 인간 골격 상으로 CDR을 이식할 경우 가변 영역 입체 형태를 보존하는 것이 필수적이다. 아미노산 서열 비교 후, 인간 항체 IC4의 골격 영역을 래트 항-B5R의 인간화를 위한 골격 공여자로 사용하였다.

단일 펩타이드를 비롯한, 인간화된 항-B5R 가변 영역의 단백질 서열을 암호화하기 위해 4쌍의 프라이머(각각 약 80개의 염기 길이)를 설계하여 합성하였다. 각각의 쌍 내의 프라이머들은 약 20개의 뉴클레오타이드가 중복되었다. 상기 유전자의 조립 및 증폭은 이하의 4단계로 수행하였다: (1) 4 쌍의 상보적인 올리고뉴클레오타이드를 4 개의 분리된 반응에 있어서 클레나우(Klenow) 단편으로 어닐링 및 연장시키는 단계; (2) 얻어진 4개의 dsDNA 단편을 2개의 분리된 반응에 있어서 쌍방향(pair wise)으로 혼합, 변성, 재어닐링 및 연장시키는 단계; (3) 얻어진 2개의 dsDNA 단편을 혼합, 변성, 재어닐링 및 연장시켜 최종적인 전체-길이 dsDNA를 생성하는 단계; 및 (4) 얻어진 DNA를 도록 프라이머로 PCR 증폭시켜 양 말단에 XbaI 제한효소 부위를 도입하는 단계. 상기 PCR 단편은 이후 XbaI로 절단시켜 각각의 XbaI-절단된 pV_k 및 pVg₄ 벡터 내로 삽입시켰다.

인간화된 항-B5R의 특이성은 하기에 기재된 대로 검사하였다. 인간화된 항-B5R 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 플라스미드를 COS-7 세포 내로 공동-형질전환(co-transfection)하였다. 배양 세포로부터 배출된 상등액을 모아 정제하였다. 인간화된 항-B5R는 웨스턴 블롯 분석법으로 COS-7 세포 또는 대장균(E.coli)에서 발현되는 B5R의 세포외 도메인과의 작용능을 검사하였다.

인간화된 항-B5R를 생산하는 안정적인 세포주를 개발하기 위해, 인간화된 항-B5R의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 플라스미드들을 리포펙타민 2000(Invitrogen)을 사용하여 CHO/dhfr-세포 내로 함께 공동-형질전환하였다. 형질전환 24시간 후에,세포를 선택배지(알파 MEM 내의 20nM 메토트렉사트)를 갖는 96-웰 조직 배양 플레이트 내로 평판 배양하였다. MTX-저항성 클론은 인간 IgG 생산을 검사하였다. 고수율의 단일클론성 세포주를 동정하기 위해 제한적인 희석제가 사용될 수 있다.

다른 실시형태

본원 명세서에 개시된 모든 특징들은 임의의 조합으로 결합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각 특징들은 동일, 동등 혹은 유사한 목적을 제공하는 대안적인 특징으로 대체될 수 있다.

이상의 설명으로부터, 당업자라면 본 발명의 필수적인 특성을 쉽게 확인할 수 있고, 본 발명의 기술 사상 및 범위로부터 벗어나지 않고 본 발명을 다양하게 변경 및 변형하여 다양한 사용과 조건에 적용할 수 있다. 따라서, 다른 실시형태도 상정될 수 있다.

<110> QUERCEGEN PHARMA LLC <120> SMALLPOX MONOCLONAL ANTIBODY <130> QPP09133 <150> US60/839,579 <151> 2006-08-23 <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1 Asn Tyr His Val His 1 5 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 2 Leu Met Trp Arg Asp Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Pro Thr Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 3 Gly Ser Glu Tyr Tyr Gly Leu Leu Gly Tyr Val Met Gly Ala 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 4 Lys Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Ser Leu Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 5 Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 6 Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Val Thr 1 5 <210> 7 <211> 317 <212> PRT <213> Variola virus <400> 7 Met Lys Thr Ile Ser Val Val Thr Leu Leu Cys Val Leu Pro Ala Val 1 5 10 15 Val Tyr Ser Thr Cys Thr Val Pro Thr Met Asn Asn Ala Lys Leu Thr 20 25 30 Ser Thr Glu Thr Ser Phe Asn Asp Lys Gln Lys Val Thr Phe Thr Cys 35 40 45 Asp Ser Gly Tyr Tyr Ser Leu Asp Pro Asn Ala Val Cys Glu Thr Asp 50 55 60 Lys Trp Lys Tyr Glu Asn Pro Cys Lys Lys Met Cys Thr Val Ser Asp 65 70 75 80 Tyr Val Ser Glu Leu Tyr Asn Lys Pro Leu Tyr Glu Val Asn Ala Ile 85 90 95 Ile Thr Leu Ile Cys Lys Asp Glu Thr Lys Tyr Phe Arg Cys Glu Glu 100 105 110 Lys Asn Gly Asn Thr Ser Trp Asn Asp Thr Val Thr Cys Pro Asn Ala 115 120 125 Glu Cys Gln Ser Leu Gln Leu Asp His Gly Ser Cys Gln Pro Val Lys 130 135 140 Glu Lys Tyr Ser Phe Gly Glu His Ile Thr Ile Asn Cys Asp Val Gly 145 150 155 160 Tyr Glu Val Ile Gly Ala Ser Tyr Ile Thr Cys Thr Ala Asn Ser Trp 165 170 175 Asn Val Ile Pro Ser Cys Gln Gln Lys Cys Asp Ile Pro Ser Leu Ser 180 185 190 Asn Gly Leu Ile Ser Gly Ser Thr Phe Ser Ile Gly Gly Val Ile His 195 200 205 Leu Ser Cys Lys Ser Gly Phe Ile Leu Thr Gly Ser Pro Ser Ser Thr 210 215 220 Cys Ile Asp Gly Lys Trp Asn Pro Val Leu Pro Ile Cys Ile Arg Ser 225 230 235 240 Asn Glu Glu Phe Asp Pro Val Glu Asp Gly Pro Asp Asp Glu Thr Asp 245 250 255 Leu Ser Lys Leu Ser Lys Asp Val Val Gln Tyr Glu Gln Glu Ile Glu 260 265 270 Ser Leu Glu Ala Thr Tyr His Ile Ile Ile Val Ala Leu Thr Ile Met 275 280 285 Gly Val Ile Phe Leu Ile Ser Val Ile Val Leu Val Cys Ser Cys Asn 290 295 300 Lys Asn Asn Asp Gln Tyr Lys Phe His Lys Leu Leu Leu 305 310 315

Claims

B5R 항원에 대한 항원-결합 도메인을 포함하는 인간화된 단일클론 항체로서, 상기 항체는 B5R 항원에 결합하는 것인, 인간화된 단일클론 항체.
제1항에 있어서, 상기 항체는 우두 바이러스 감염 환자에게 투여될 때 우두 바이러스의 진행을 지연시키는 것인, 인간화된 단일클론 항체.
제1항에 있어서, 상기 항체는 2개 이하의 단일 아미노산 차이를 갖는 서열번호 1과 동일한 제1 중쇄 CDR(상보성 결정 영역) 서열, 4개 이하의 단일 아미노산 차이를 갖는 서열번호 2와 동일한 제2 중쇄 CDR 서열, 4개 이하의 단일 아미노산 차이를 갖는 서열번호 3과 동일한 제3 중쇄 CDR 서열; 4개 이하의 단일 아미노산 차이를 갖는 서열번호 4와 동일한 제1 경쇄 CDR 서열, 3개 이하의 단일 아미노산 차이를 갖는 서열번호 5와 동일한 제2 경쇄 CDR 서열 및 3개 이하의 단일 아미노산 차이를 갖는 서열번호 6과 동일한 제3 경쇄 CDR 서열을 포함하는 것인, 인간화된 단일클론 항체.
제3항에 있어서, 상기 항체는 단일 폴리펩타이드로 이루어진 것인, 인간화된 단일클론 항체.
제3항에 있어서, 상기 제1 중쇄 CDR(상보성 결정 영역) 서열은 서열번호 1과 동일하고, 상기 제2 중쇄 CDR 서열은 서열번호 2와 동일하며, 상기 제3 중쇄 CDR 서열은 서열번호 3과 동일하고; 상기 제1 경쇄 CDR 서열은 서열번호 4와 동일하며, 제2 경쇄 CDR 서열은 서열번호 5와 동일하고, 제3 경쇄 CDR 서열은 서열번호 6과 동일한 것인, 인간화된 단일클론 항체.
제5항에 있어서, 상기 항체는 단일 폴리펩타이드로 이루어진 것인, 인간화된 단일클론 항체.
제1항에 있어서, 상기 항체는 ATCC 수탁번호 PTA-7594의 세포주에 의해 생산되는 단일클론 항체와 동일한 에피토프 특이성을 갖는 것인, 인간화된 단일클론 항체.
제7항에 있어서, 상기 항체는 ATCC 수탁번호 PTA-7594의 세포주에 의해 생산되는 것인, 인간화된 단일클론 항체.
제7항에 있어서, 상기 항체는 단일 폴리펩타이드로 이루어진 것인, 인간화된 단일클론 항체.
2개 이하의 단일 아미노산 차이를 갖는 서열번호 1과 동일한 제1 CDR 서열, 4개 이하의 단일 아미노산 차이를 갖는 서열번호 2와 동일한 제2 CDR 서열 및 4개 이하의 단일 아미노산 차이를 갖는 서열번호 3과 동일한 제3 CDR 서열을 함유하는 인간화된 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 분리된 핵산.
제10항에 있어서, 상기 제1 CDR 서열은 서열번호 1과 동일하고, 제2 CDR 서열은 서열번호 2와 동일하며, 제3 CDR 서열은 서열번호 3과 동일한 것인, 분리된 핵산.
제11항에 있어서, 상기 암호화된 폴리펩타이드는 서열번호 7을 포함하는 것인, 분리된 핵산.
4개 이하의 단일 아미노산 차이를 갖는 서열번호 4와 동일한 제1 CDR 서열, 3개 이하의 단일 아미노산 차이를 갖는 서열번호 5와 동일한 제2 CDR 서열 및 3개 이하의 단일 아미노산 차이를 갖는 서열번호 6과 동일한 제3 CDR 서열을 함유하는 인간화된 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산.
제13항에 있어서, 상기 제1 CDR 서열은 서열번호 4와 동일하며, 제2 CDR 서열은 서열번호 5와 동일하고, 제3 CDR 서열은 서열번호 6과 동일한 것인, 분리된 핵산.
제13항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 8을 포함하는 것인, 분리된 핵산.
제1항의 단일클론 항체를 포함하는 배양 세포.
제3항의 단일클론 항체를 포함하는 배양 세포.
제11항의 핵산을 포함하는 배양 세포.
제13항의 핵산을 포함하는 배양 세포.
제19항에 있어서, 2개 이하의 단일 아미노산 차이를 갖는 서열번호 1과 동일한 제1 CDR 서열, 4개 이하의 단일 아미노산 차이를 갖는 서열번호 2와 동일한 제2 CDR 서열 및 4개 이하의 단일 아미노산 차이를 갖는 서열번호 3과 동일한 제3 CDR 서열을 함유하는 인간화된 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산을 추가로 포함하는 것인, 배양 세포.
제1항의 항체의 유효량을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서의 천연두 감염을 치료하는 방법.