CN108350085A - 抗pcsk9抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种抗PCSK9抗体或其抗原结合片段。本发明还提供了编码该抗体的核酸，包含该抗体的组合物，以及制备该抗体并使用该抗体治疗或预防诸如血脂异常、代谢性疾病、高胆固醇血症、炎症性疾病和感染性疾病的疾病的方法。

Description

抗PCSK9抗体及其应用
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年10月16日提交的中国专利申请号为201510673316.1的优先权，其全部内容通过引用整体并入本文。
引用电子提交的序列表
本申请包含一个序列表，它通过EFS-Web以电子方式提交，作为ASCII格式的序列表，文件名为“序列表文件”，创建日期为2016年9月19日，大小约为76.7kB。通过EFS-Web提交的序列表是本说明书的一部分，并且其全部内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明涉及单克隆抗PCSK9抗体，编码所述抗体的核酸和表达载体，含有所述载体的重组细胞，以及包含所述抗体的组合物。还提供了制备所述抗体的方法，以及使用所述抗体治疗包括血脂异常、代谢性疾病、高胆固醇血症、炎症性疾病和感染性疾病在内的疾病的方法。
背景技术
2008年，约有1700万人死于心血管疾病，约占全球死亡人数的三分之一。预计到2030年这一数字将增加到2360万(Mozaffarian等，2015，循环.131(4):e29-322).各种研究表明，低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平与心血管疾病的发展之间存在强相关性，这主要是由于LDL-C在动脉粥样硬化中起关键作用(Rallidis和Lekakis，2016，Hellenic JCardiol.57(2):86-91).因此认为降低血浆LDL-C水平可能是预防心血管疾病的有效方法。他汀类药物多年来一直是高胆固醇血症的主要治疗药物，并且在很大程度上是有效的。然而，在相当数量的高危患者中，他汀类药物治疗未能成功靶向降低LDL-C水平，因此需要新的降低LDL-C水平的治疗方法。
大部分LDL-C由肝细胞上的LDL受体(LDLR)清除。2003年，发现前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9a型(PCSK9)是LDL-C清除途径中的关键因子。PCSK9主要在肝细胞中产生，是一种分泌型丝氨酸蛋白酶，其与LDLR结合并导致LDLR的内化和溶酶体降解。由此导致的肝细胞表面LDLR蛋白浓度的降低，引起从血浆中清除的LDL-C的减少。因此，PCSK9的存在可以抑制血浆LDL-C的肝脏代谢。除LDLR和ApoB外，PCSK9是第三个与常染色体显性家族性高脂血症相关的基因(Rallidis和Lekakis，2016，Hellenic J Cardiol.57(2):86-91).
PCSK9的功能丧失型突变与LDL-C水平和心血管疾病的降低有关，而PCSK9高水平的人群LDL-C水平升高并且心血管疾病风险显著增加。PCSK9的功能获得型突变与家族性高胆固醇血症有因果关系(Gencer等，2015，Swiss Med Wkly.145:w14094)。体外实验表明，PCSK9可以降低HepG2细胞上的LDLR的表达水平。类似地，小鼠中PCSK9水平的增加降低了肝脏中的LDLR表达，而PCSK9敲除小鼠具有升高的LDLR表达。综上所述，数据表明PCSK9是治疗脂质紊乱的有希望的治疗靶点。
自他汀类药物以来，针对PCSK9的抗体被认为是预防心血管疾病的最大进步，并且认为它们可以用作治疗例如高胆固醇，高脂血症，冠心病，代谢综合征和急性冠状动脉综合征的治疗剂。
来自例如安进和赛诺菲/再生元的全人PCSK9单克隆抗体(mAb)的I期和II期临床试验已经完成，并且给出了一系列有希望的结果。例如，阿利库单抗(赛诺菲/再生元)的研究发现LDL-C水平从39.2％降至67.9％(Gencer等，2015，Swiss Med Wkly.145:w14094)。目前正在进行III期临床试验，其目的是评估PCSK9的抑制对急性冠脉综合征患者心血管事件发生的影响。
尽管取得了进展，但本领域需要更有效的治疗剂，包含有效抑制PCSK9与LDLR结合，同时引起人体最小不良副作用的抗PCSK9抗体。
发明概述
本发明通过提供以高亲和力特异性结合PCSK9，诱导肝细胞摄取LDL并防止体内LDLR降解的单克隆抗体，满足了这一需求。具体而言，本发明的全人抗PCSK9抗体具有比阿利库单抗(再生元)更高的对PCSK9的亲和力。
在一个一般方面，本发明涉及结合PCSK9的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段。
根据一具体方面，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含具有以下多肽序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3：
(1)分别为SEQ ID NOs:38、39、40、34、35、和36；
(2)分别为SEQ ID NOs:6、7、8、2、3、和4；
(3)分别为SEQ ID NOs:14、15、16、10、11、和12；
(4)分别为SEQ ID NOs:22、23、24、18、19、和20；
(5)分别为SEQ ID NOs:30、31、32、26、27、和28；或
(6)分别为SEQ ID NOs:46、47、48、42、43、和44；
其中，所述抗体或其抗原结合片段特异性结合PCSK9，优选地特异性结合人PCSK9。
根据另一具体方面，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：38的多肽序列的LCDR1；
(2)具有SEQ ID NO：39的多肽序列的LCDR2；
(3)具有SEQ ID NO：40的多肽序列的LCDR3；
(4)具有SEQ ID NO：34的多肽序列的HCDR1；
(5)具有SEQ ID NO：35的多肽序列的HCDR2；和
(6)具有SEQ ID NOs：36和73-90之一的多肽序列的HCDR3。
其中，所述抗体或其抗原结合片段结合PCSK9，优选地特异性结合人PCSK9。
根据另一具体方面，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含具有与SEQ ID NO：1、9、17、25、33、或91-108或41之一至少85％，较佳的至少90％，更佳的至少95％同源性的多肽序列的重链可变区，或具有与SEQ ID NO：5、13、21、29、37或45之一至少85％，较佳的至少90％，更佳的至少95％同源性的多肽序列的轻链可变区。
根据一种实施方式，本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段是人/大鼠嵌合的。
根据另一种实施方式，本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段是人的。
根据另一种实施方式，本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，还包含一恒定区，优选人重链IgG1恒定区，和人抗体轻链κ恒定区。
在另一个一般方面，本发明涉及一种分离的编码本发明单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸。
在另一个一般方面，本发明涉及一种载体，其包含分离的编码本发明单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸。
在另一个一般方面，本发明涉及一种宿主细胞，其包含分离的编码本发明单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸。
在另一个一般方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含分离的本发明单克隆抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。
在另一个一般方面，本发明涉及在有需要的受试者中阻断PCSK9与LDLR结合的方法，或增加LDL摄取的方法，包括向受试者施用本发明的药物组合物。
在另一个一般方面，本发明涉及一种治疗有需要的受试者的疾病、障碍或病症(优选血脂异常、代谢性疾病、炎症性疾病、感染性疾病)的方法，包括向受试者施用本发明的药物组合物。
在另一个一般方面，本发明涉及制备本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，包括在一定条件下培养包含编码单克隆抗体或抗原结合片段的核酸的细胞，以产生单克隆抗体或其抗原结合片段，并从细胞或细胞培养物中回收抗体或其抗原结合片段。
在另一个一般方面，本发明涉及制备包含本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物的方法，包括将单克隆抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的载体组合以获得所述药物组合物。
根据以下公开内容，包括发明详述、及其优选实施方式以及所附权利要求，本发明的其它方面、特征和优点是显而易见的。
附图的简要说明
结合附图将更好地理解前述概述以及以下的发明详述。应理解，本发明不限于附图中所示的确切的实施方式。
在附图中：
图1显示不同批次的免疫原A(hPCSK9-His)对HepG2细胞中LDL摄取的抑制的影响；
图2显示了通过ELISA测定的根据本发明的实施方式的嵌合抗PCSK9抗体对免疫原A(hPCSK9-His)的结合活性；
图3显示了通过ELISA测定的根据本发明的实施方式的嵌合抗PCSK9抗体对重组人PCSK9D374Y蛋白的结合活性；
图4显示了通过ELISA测定的根据本发明的实施方式的嵌合抗PCSK9抗体与重组食蟹猴PCSK9蛋白的结合活性；
图5显示了通过ELISA测定的根据本发明的实施方式的嵌合抗PCSK9抗体对重组PCSK9蛋白与LDLR ECD蛋白的结合的抑制；
图6显示了通过ELISA测定的根据本发明的实施方式的嵌合抗PCSK9抗体对重组PCSK9D374Y蛋白与LDLR ECD蛋白的结合的抑制；
图7显示了通过FACS测定的根据本发明的实施方式的嵌合抗PCSK9抗体对PCSK9D374Y诱导的LDLR下调的抑制；
图8显示根据本发明的实施方式的嵌合抗PCSK9抗体对PCSK9D374Y诱导的HepG2细胞中LDL摄取的抑制；
图9显示了通过ELISA测定的根据本发明的实施方式的全人抗PCSK9抗体对免疫原A(hPCSK9-His)的结合活性；
图10显示了通过ELISA测定的根据本发明的实施方式的全人抗PCSK9抗体对重组PCSK9D374Y蛋白的结合活性；
图11显示了通过ELISA测定的根据本发明的实施方式的全人抗PCSK9抗体对食蟹猴PCSK9的结合活性；
图12显示了通过ELISA测定的根据本发明的实施方式的全人抗PCSK9抗体对重组PCSK9蛋白与LDLR ECD蛋白的结合的抑制；
图13显示了通过ELISA测定的根据本发明的实施方式的全人抗PCSK9抗体对重组PCSK9D374Y蛋白与LDLR ECD蛋白的结合的抑制；
图14显示了根据本发明的实施方式的全人抗PCSK9抗体对PCSK9D374Y诱导的HepG2细胞中LDL摄取的抑制；
图15显示了根据本发明的实施方式的全人抗PCSK9抗体对PCSK9D374Y诱导的HepG2细胞中LDL摄取的抑制；
图16显示了根据本发明的实施方式的全人抗PCSK9抗体对PCSK9D374Y诱导的HepG2细胞中LDL摄取的抑制；
图17显示了通过ELISA测定的根据本发明的实施方式的全人抗PCSK9抗体对免疫原A的结合活性；
图18显示了通过ELISA测定的根据本发明的实施方式的全人抗PCSK9抗体对重组PCSK9D374Y蛋白的结合活性；
图19显示了通过ELISA测定的根据本发明的实施方式的全人抗PCSK9抗体对食蟹猴PCSK9的结合活性；
图20显示了通过ELISA测定的根据本发明的实施方式的全人抗PCSK9抗体对重组PCSK9蛋白与LDLR ECD蛋白的结合的抑制；
图21显示了通过ELISA测定的根据本发明的实施方式的全人抗PCSK9抗体对重组PCSK9D374Y与LDLR ECD蛋白的结合的抑制；
图22显示了通过ELISA测定的根据本发明的实施方式的全人抗PCSK9抗体对PCSK9D374Y诱导的HepG2细胞中LDL摄取的抑制；
图23A和B显示根据本发明的实施方式的抗PCSK9抗体对小鼠中重组hPCSK9蛋白介导的LDLR降解的抑制：使用针对小鼠LDLR(mLDLR)的抗体和针对小鼠β-肌动蛋白(mβ-肌动蛋白)的抗体，对施用了重组人PCSK9蛋白(hPCSK9)以及抗PCSK9抗体、对照IgG或溶媒的小鼠的肝裂解物进行蛋白印迹分析，其中绘制了蛋白印迹上mLDLR条带的密度与mβ-肌动蛋白条带的密度的比值：
图23A：施用30mg/kg，3mg/kg，或0.3mg/kg的139G1C8、对照IgG或溶媒的小鼠中mLDLR/mβ-肌动蛋白的比值；和
图23B：施用30mg/kg，3mg/kg，或0.3mg/kg的96F8C6、对照IgG或溶媒的小鼠中mLDLR/mβ-肌动蛋白的比值；
图24显示了通过差示扫描量热法(DSC)测定的根据本发明的实施方式的全人抗PCSK9抗体的热稳定性；
图25显示了根据本发明的实施方式的全人抗PCSK9抗体的冻/融稳定性；
图26显示了根据本发明的实施方式的全人抗PCSK9抗体的溶解度；和
图27A和B显示了根据本发明的实施方式，本发明的实施方式的具有提高的亲和力的多种人抗PCSK9抗体，对PCSK9D374Y诱导的HepG2细胞中LDL摄取的抑制：
图27A：抗体克隆AF-mab023_06，AF-mab023_12或96F8C6对PCSK9D374Y诱导的HepG2细胞中LDL摄取的抑制；和
图27B：抗体克隆AF-mab023_01，AF-mab023_11，AF-mab023_14或AF-mab023_18对HepG2细胞中PCSK9D374Y诱导的LDL摄取的抑制。
发明详述
在背景和整个说明书中，引用或描述了多种出版物、文章和专利；这些参考文献中的每一个都通过引用整体并入本文。本说明书中包含的文件、法案、材料、装置、文章等的讨论用于提供本发明的上下文的目的。对于本发明所公开或要求保护的任何内容，这样的讨论并不是承认任何或全部这些事项构成现有技术的一部分。
除非另外定义，本文所用的所有技术和科学术语与本发明所属领域中的普通技术人员通常理解的具有相同含义。另外，本文所用的具体术语具有说明书中定义的含义。本文引用的所有专利，公开的专利申请和出版物通过引用并入本文，如同在此完全阐述一样。需要注意的是，除非上下文另有明确指示，如本文和所附权利要求书中所用的，单数形式的“一”、“一个”和“该”包括复数形式。
除非另有说明，在所有情况下，本文所述的任何数值(例如本文所述的浓度或浓度范围)应当理解为均被术语“约”修饰。因此，某一数值通常包括所述值的±10％。例如，1mg/mL的浓度包括0.9mg/mL至1.1mg/mL。同样，1％至10％(w/v)的浓度范围包括0.9％(w/v)至11％(w/v)。除非上下文另有明确指示，如本文所用，所用数值范围特别地包括所有可能的子范围，在该范围内的所有单个数值，包括在这样的范围内的整数以及该值的分数。
本发明通常涉及分离的抗PCSK9抗体，编码所述抗体的核酸和表达载体，含有所述载体的重组细胞，以及包含所述抗体的组合物。还提供了制备所述抗体的方法，以及使用所述抗体治疗包括血脂异常、代谢性疾病、高胆固醇血症、炎症性疾病和感染性疾病在内的疾病的方法。本发明的抗体具有一种或多种期望的功能特性，包括但不限于结合PCSK9的高亲和力，对PCSK9的高特异性，阻断PCSK9与LDLR结合的能力，刺激LDL摄取的能力,阻止由PCSK9诱导的降解LDLR的能力。
在一般方面，本发明涉及结合PCSK9的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段。
如本文所用，术语“抗体”以广义使用，包括免疫球蛋白或抗体分子，包括人、人源化、复合和嵌合抗体，以及单克隆或多克隆抗体片段。通常，抗体是对特定抗原表现出结合特异性的蛋白或肽链。抗体的结构是众所周知的。根据重链恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白可分为五个主要类型(即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)。IgA和IgG被进一步细分为同种型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。因此，本发明的抗体可以是五个主要类型或相应亚类中的任何一个。优选地，本发明的抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。根据其恒定区的氨基酸序列，可以将脊椎动物物种的抗体轻链归类为两种明显不同的类型之一，即κ和λ。因此，本发明的抗体可以含有κ或λ轻链恒定结构域。根据具体的实施方式，本发明的抗体包括来自大鼠或人抗体的重链和/或轻链恒定区。除了重链和轻链恒定结构域之外，抗体还含有由轻链可变区和重链可变区组成的抗原结合区，每个区含有三个结构域(即CDR1，CDR2和CDR3)。轻链可变区结构域任选地涉及LCDR1，LCDR2和LCRD3，重链可变区结构域任选地涉及HCDR1，HCRD2和HCDR3。
如本文所用，术语“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合PCSK9的分离的抗体基本上不含不结合PCSK9的抗体)。另外，分离的抗体基本上不含其他细胞物质和/或化学物质。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群获得的抗体，即除了可能少量存在的天然的突变以外，构成所述抗体群的单个抗体是同一的。本发明的单克隆抗体可以通过杂交瘤方法、噬菌体展示技术、单一淋巴细胞基因克隆技术，或通过重组DNA方法制备。例如，可以通过杂交瘤产生单克隆抗体，所述杂交瘤包含从非人转基因动物(例如转基因小鼠或大鼠)获得的B细胞，其具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组。
如本文所用，术语“抗原结合片段”是指抗体片段，例如双抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定性Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫键稳定性双抗体(ds双抗体)、单链抗体分子(scFv)、单域抗体(sdab)、scFv二聚体(二价双抗体)、包含一个或多个CDR的部分抗体形成的多特异性抗体、骆驼单域抗体、纳米抗体、结构域抗体、二价结构域抗体、或与抗原结合但不包含完整的抗体结构的任何其他抗体片段。抗原结合片段能够与相同抗原(与亲本抗体或亲本抗体片段结合的相同抗原)结合。根据具体实施方式，抗原结合片段包含轻链可变区、轻链恒定区、和重链恒定区的Fd区段。根据其他具体实施方式，抗原结合片段包含Fab和F(ab’)。
如本文所用，术语“单链抗体”是指本领域的常规单链抗体，其包含由约15至约20个氨基酸的短肽连接的重链可变区和轻链可变区。如本文所用，术语“单域抗体”是指本领域中的常规单域抗体，其包含重链可变区和重链恒定区，或其仅包含重链可变区。
如本文所用，术语“人抗体”是指通过人生产的抗体，或利用本领域已知的任何技术制备的具有对应于通过人生产的抗体的氨基酸序列的抗体。人抗体的定义包括完整或全长抗体、其片段、和/或包含至少一个人重链和/或轻链多肽的抗体。
如本文所用，术语“人源化抗体”是指为增强其与人抗体的序列同源性而进行修饰的非人类抗体，以保留抗体的抗原结合特性，并降低其在人体中的抗原性。
如本文所用，术语“嵌合抗体”是指免疫球蛋白分子的氨基酸序列来源于两种或多种物种的抗体。通常，轻链和重链可变区都对应于衍生自一种哺乳动物(例如小鼠，大鼠，兔等)的具有期望的特异性、亲和力、和性能的抗体的可变区，而恒定区对应于衍生自另一种哺乳动物(例如人)的抗体的序列，以避免在该物种中引起免疫应答。
如本文所用，术语“PCSK9”是指前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型蛋白，其是一种分泌蛋白，是分泌型丝氨酸内蛋白酶的哺乳动物前蛋白转化酶家族的可溶性成员。分泌的PCSK9与细胞表面的LDLR结合。在结合的蛋白质内化后，PCSK9防止LDLR内吞再循环，并导致两种蛋白质的溶酶体降解(Rallidis和Lekakis，2016，Hellenic J Cardiol.57(2):86-91).术语“人PCSK9”是指来源于人的PCSK9。GenBank登录号NP_777596.2显示了人PCSK9的示例性氨基酸序列。
如本文所用，“特异性结合PCSK9”的抗体是指与PCSK9，优选人PCSK9结合的抗体，其KD值小于1×10-7M，优选小于1×10-8M，更优选小于5×10-9M、小于1×10-9M、小于5×10- 10M、小于1×10-10M。术语“KD”指由Kd与Ka之比(即Kd/Ka)获得的解离常数，并表示为摩尔浓度(M)。基于本发明，可以使用本领域的方法确定抗体的KD值。例如，抗体的KD可以通过使用表面等离子体共振来确定，诸如通过使用生物传感器系统，例如系统，或通过使用生物膜层干涉测量技术，例如Octet RED96系统。
抗体的KD值越小，抗体与靶抗原结合的亲和力越高。
根据一具体方面，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含具有以下多肽序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3：
(1)分别为SEQ ID NOs:38、39、40、34、35、和36；
(2)分别为SEQ ID NOs:6、7、8、2、3、和4；
(3)分别为SEQ ID NOs:14、15、16、10、11、和12；
(4)分别为SEQ ID NOs:22、23、24、18、19、和20；
(5)分别为SEQ ID NOs:30、31、32、26、27、和28；或
(6)分别为SEQ ID NOs:46、47、48、42、43、和44；
其中，所述抗体或其抗原结合片段结合PCSK9，优选地特异性结合人PCSK9。
根据另一具体方面，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：38的多肽序列的LCDR1；
(2)具有SEQ ID NO：39的多肽序列的LCDR2；
(3)具有SEQ ID NO：40的多肽序列的LCDR3；
(4)具有SEQ ID NO：34的多肽序列的HCDR1；
(5)具有SEQ ID NO：35的多肽序列的HCDR2；和
(6)具有SEQ ID NOs：36和73-90之一的多肽序列的HCDR3。
其中，所述抗体或其抗原结合片段结合PCSK9，优选地特异性结合人PCSK9。
根据另一具体方面，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含具有与SEQ ID NOs：1、9、17、25、33、或91-108或41之一至少85％，较佳的90％，更佳的95％同源性的多肽序列的重链可变区，或具有与SEQ ID NOs：5、13、21、29、37或45之一至少85％，较佳的90％，更佳的95％同源性的多肽序列的轻链可变区。根据一种优选的实施方式，本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NOs：1、9、17、25、33、或41至少85％，较佳的90％，更佳的95％同源性的多肽序列的重链可变区，和具有分别与SEQ ID NOs：5、13、21、29、37或45至少85％，较佳的90％，更佳的95％同源性的多肽序列的轻链可变区。根据另一优选的方面，本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NOs：33或91-108之一至少85％，较佳的90％，更佳的95％同源性的多肽序列的重链可变区，和具有与SEQ ID NO：37至少85％，较佳的90％，更佳的95％同源性的多肽序列的轻链可变区。
根据另一具体方面，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含：
a.具有SEQ ID NO：1的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID No：5的多肽序列的轻链可变区；
b.具有SEQ ID NO：9的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID No：13的多肽序列的轻链可变区；
c.具有SEQ ID NO：17的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID No：21的多肽序列的轻链可变区；
d.具有SEQ ID NO：25的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID No：29的多肽序列的轻链可变区；
e.具有选自下组的多肽序列的重链可变区：SEQ ID NOs：33和91-108，和具有SEQID No：37的多肽序列的轻链可变区；或
f.具有SEQ ID NO：41的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID No：45的多肽序列的轻链可变区；或
在一种实施方式中，本发明涉及一种包含LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其分别具有SEQ ID No:6、7、8、2、3、和4的多肽序列。在另一实施方式中，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQID No：1至少85％,较佳的90％,更佳的95％同源性的多肽序列的重链可变区,和具有与SEQID No：5至少85％,较佳的90％,更佳的95％同源性的多肽序列的轻链可变区。优选地，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：1的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：5的多肽序列的轻链可变区。
在一种实施方式中，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3，分别具有SEQ ID No:14、15、16、10、11、和12的多肽序列。在另一实施方式中，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID No：9至少85％,较佳的90％,更佳的95％同源性的多肽序列的重链可变区,和具有与SEQ ID No：13至少85％,较佳的90％,更佳的95％同源性的多肽序列的轻链可变区。优选地，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：9的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：13的多肽序列的轻链可变区。
在一种实施方式中，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3，分别具有SEQ ID No:22、23、24、18、19、和20的多肽序列。在另一实施方式中，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID No：17至少85％,较佳的90％,更佳的95％同源性的多肽序列的重链可变区,和具有与SEQ ID No：21至少85％,较佳的90％,更佳的95％同源性的多肽序列的轻链可变区。优选地，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：17的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：21的多肽序列的轻链可变区。
在一种实施方式中，本发明涉及一种包含LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其分别具有SEQ ID No:30、31、32、26、27、和28的多肽序列。在另一实施方式中，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID No：25至少85％,较佳的90％,更佳的95％同源性的多肽序列的重链可变区,和具有与SEQ ID No：29至少85％,较佳的90％,更佳的95％同源性的多肽序列的轻链可变区。优选地，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：25的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：29的多肽序列的轻链可变区。
在一种实施方式中，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3，分别具有SEQ ID No:38、39、40、34、35、和36的多肽序列。在另一实施方式中，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID No：33至少85％,较佳的90％,更佳的95％同源性的多肽序列的重链可变区,和具有与SEQ ID No：37至少85％,较佳的90％,更佳的95％同源性的多肽序列的轻链可变区。优选地，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：33的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：37的多肽序列的轻链可变区。
在一种实施方式中，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含具有SEQ ID NO：38的多肽序列的LCDR1，具有SEQ ID NO：39的多肽序列的LCDR2，具有SEQID NO：40的多肽序列的LCDR3，具有SEQ ID NO：34的多肽序列的HCDR1，具有SEQ ID NO：35的多肽序列的HCDR2，和具有选自下组的多肽序列的HCDR3：SEQ ID NO：36和73-90。
在另一实施方式中，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQID No：91-108之一至少85％,较佳的90％,更佳的95％同源性的多肽序列的重链可变区,和具有与SEQ ID No：37至少85％,较佳的90％,更佳的95％同源性的多肽序列的轻链可变区。优选地，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID No：91-108之一的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：37的多肽序列的轻链可变区。
在一种实施方式中，本发明涉及一种包含LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其分别具有SEQ ID No:46、47、48、42、43、和44的多肽序列。在另一实施方式中，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID No：41至少85％,较佳的90％,更佳的95％同源性的多肽序列的重链可变区,和具有与SEQ ID No：45至少85％,较佳的90％,更佳的95％同源性的多肽序列的轻链可变区。优选地，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：41的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：45的多肽序列的轻链可变区。
根据另一具体方面，本发明涉及一种本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述的抗体或其抗原结合片段是嵌合的。
根据另一具体方面，本发明涉及一种本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述的抗体或其抗原结合片段是人的。
根据另一具体方面，本发明涉及一种本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含一恒定区，优选人重链IgG1恒定区(SEQ ID NO：67)，和人抗体轻链，优选人轻链κ恒定区(SEQ ID NO：69)。
在另一个一般方面，本发明涉及一种分离的编码本发明单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸。本领域技术人员可以理解，蛋白质的编码序列可以在不改变蛋白质的氨基酸序列的情况下被改变(例如替换，删除，插入等)。因此，本领域技术人员能够理解，可以在不改变蛋白质的氨基酸序列的情况下，改变编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸序列。
在另一个一般方面，本发明涉及一种载体，其包含分离的编码本发明单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸。鉴于本公开，可以使用本领域技术人员已知的任何载体，例如质粒，粘粒，噬菌体载体或病毒载体。在一些实施方式中，所述载体是重组表达载体，如质粒。所述载体可以包括用于构建常规功能的表达载体的任何元件，例如启动子、核糖体结合元件、终止子、增强子、筛选标记和复制起点。启动子可以是组成型、诱导型或抑制型启动子。本领域已知，许多表达载体能够将核酸递送至细胞，其可以在本发明中使用，用于在细胞中产生抗体或其抗原结合片段。根据本发明的实施方式，可以利用常规克隆技术或人工基因合成生产重组表达载体。
在另一个一般方面，本发明涉及一种宿主细胞，其包含分离的编码本发明单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸。鉴于本公开内容，本领域技术人员已知的任何宿主细胞可用于重组表达本发明的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，宿主细胞是大肠杆菌TG1或BL21细胞(用于表达例如scFv或Fab抗体),CHO-DG44或CHO-K1细胞(用于表达例如全长IgG抗体)。根据具体的实施方式，通过常规方法例如化学转染，热休克或电穿孔将重组表达载体转化到宿主细胞中，其被稳定整合到宿主细胞基因组中，使得重组核酸得到有效表达。
在另一个一般方面，本发明涉及制备本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，包括在一定条件下培养包含编码单克隆抗体或抗原结合片段的核酸的细胞，以产生本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段，并从细胞或细胞培养物(如从上清液中)中回收抗体或其抗原结合片段。可以从细胞中收获表达的抗体或其抗原结合片段，并根据本领域已知和本文所述的常规技术进行纯化。
在另一个一般方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含分离的本发明单克隆抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。
如本文所用，术语“载体”是指任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、油、脂质、含囊泡的脂质、微球体、脂质体包封(liposomal encapsulation)、或本领域已知的用于药物制剂的其他物质。应当理解，载体、赋形剂或稀释剂的特性取决于具体应用的给药途径。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指不干扰本发明所述组合物的有效性或本发明所述组合物的生物活性的无毒物质。根据具体实施方式，鉴于本公开内容，适用于抗体药物组合物的任何药学上可接受的载体均可用于本发明。
在另一个一般方面，本发明涉及在有需要的受试者的肝脏中增加LDL摄取，或阻断PCSK9与LDLR结合的方法，包括向受试者施用本发明的药物组合物。
与PCSK9结合的抗体及其抗原结合片段的功能活性可以通过本领域已知的和本文所述的方法进行表征。表征与PCSK9结合的抗体及其抗原结合片段的方法包括但不限于，亲和力和特异性试验，包括Biacore、ELISA和OctetRed分析；受体配体结合试验，以检测对PCSK9与LDLR结合的阻断；检测HepG2细胞中对PCSK9诱导的LDLR降解的抑制的试验，检测HepG2细胞对LDL摄取的增加的试验，检测肝脏中对PCSK9诱导的LDLR降解的抑制的实验等。根据具体的实施方式，表征与PCSK9结合的抗体及其抗原结合片段的方法包括以下实施例2-15中所述的方法。
在另一个一般方面，本发明涉及治疗有需要的受试者的血脂异常、代谢性疾病、高胆固醇血症、炎症性疾病和感染性疾病的方法，包括向受试者施用本发明的药物组合物。
如本文所用，术语“受试者”是指动物，优选哺乳动物。根据具体的实施方式，受试者是哺乳动物，包括非灵长类(例如，骆驼、驴、斑马、牛、猪、马、山羊、绵羊、猫、狗、大鼠、兔子、豚鼠或小鼠)或灵长类动物(例如猴子、黑猩猩或人)。在具体的实施方式中，所述受试者是人。
根据本发明的实施方式，所述药物组合物包含治疗有效量的抗PCSK9抗体或其抗原结合片段。如本文所用，术语“治疗有效量”是指在受试者中引起期望的生物或药物反应的活性成分或组分的量。根据所述目的，可以以经验和常规方式确定治疗有效量。
如本文所用，关于抗PCSK9抗体或其抗原结合片段，治疗有效量是指在有需要的受试者中刺激LDL摄取的抗PCSK9抗体或其抗原结合片段的量。同样地，如本文所用，关于抗PCSK9抗体或其抗原结合片段，治疗有效量是指治疗疾病、障碍或病症；预防或减缓疾病、障碍或病症发展；或减轻或完全减轻与代谢性疾病、障碍或病症有关的症状的抗PCSK9抗体或其抗原结合片段的量。
根据具体的实施方式，待治疗的疾病，障碍或病症是血脂异常、高脂血症、脂代谢紊乱或代谢性疾病。根据更具体的实施方式，待治疗的疾病、障碍或病症是血脂异常，包括但不限于原发性高脂血症、混合性脂代谢紊乱、纯合子型家族性高胆固醇血症。根据其他具体的实施方式，待治疗的疾病、障碍或病症是炎症性疾病，例如脓毒症，或感染性疾病。
根据具体的实施方式，治疗有效量是指足以实现1、2、3、4或更多种以下效果的治疗量：(i)减轻或改善待治疗的疾病、障碍或病症或与之相关的症状的严重程度、(ii)减少待治疗的疾病、障碍或病症或与之相关的症状的持续时间、(iii)预防待治疗的疾病、障碍或病症或与之相关的症状发展、(iv)使待治疗的疾病、障碍或病症或与之相关的症状退化、(v)预防待治疗的疾病、障碍或病症或与之相关的症状的发展或发作、(vi)预防待治疗的疾病、障碍或病症或与之相关的症状的复发、(vii)减少患有待治疗的疾病、障碍或病症或与之相关的症状的受试者的住院治疗、(viii)减少患有待治疗的疾病、障碍或病症或与之相关的症状的受试者的住院时间、(ix)增加患有待治疗的疾病、障碍或病症或与之相关的症状的受试者的存活率、(xi)抑制或减轻受试者中待治疗的疾病、障碍或病症或与之相关的症状、和/或(xii)增强或改善另一种疗法的预防或治疗效果。
治疗有效量或剂量可根据各种因素而变化，例如待治疗的疾病、障碍或病症、给药方式、靶位点、受试者的生理状态(包括，例如年龄、体重、健康状况)、受试者是人还是动物、施用的其他药物、以及该处理是预防还是治疗。优化滴定的治疗剂量，以优化安全性和有效性。
根据具体的实施方式，配制本文所述的组合物，以使其适合向受试者施用的预期途径。例如，本文所述的组合物可以配制成适合于静脉内、皮下或肌肉内施用形式。
如本文所用，术语“治疗”、“治疗的”和“疗法”均指改善或逆转至少一种与下述疾病相关的可测的生理参数，所述疾病包括：脂类疾病、障碍或病症，代谢性疾病、障碍或病症，其在受试者中未必一定可辨别，但可以在受试者中辨别。术语“治疗”、“治疗的”和“疗法”还可指使得疾病、障碍或病症消退、阻碍其进展、或至少减缓其进展。在具体的实施方式中，“治疗”、“治疗的”和“疗法”是指减轻，预防与疾病、障碍或病症相关的一种或多种症状的发展或发作，或减少其持续时间，所述的疾病、障碍或病症为，如血脂异常、高脂血症、脂代谢紊乱、混合性脂代谢紊乱、纯合子型家族性高胆固醇血症、代谢性疾病、炎症性疾病，例如脓毒症、或感染性疾病。在具体的实施方式中，“治疗”、“治疗的”和“疗法”是指预防疾病、障碍或病症的复发。在具体的实施方式中，“治疗”、“治疗的”和“疗法”是指增加患有疾病、障碍或病症的受试者的存活率。在具体的实施方式中，“治疗”、“治疗的”和“疗法”是指治愈受试者的疾病、障碍或病症。
根据具体的实施方式，用于治疗脂类疾病、障碍或病症或代谢性疾病、障碍或病症的组合物可以与另一种疗法联合应用，其包括但不限于他汀类药物或其他降脂药物。
如本文所用，上下文中向受试者施用两种或更多种疗法的术语“联合”是指使用多于一种的疗法。使用的术语“联合”不限制向受试者施用的治疗的顺序。例如，向受试者施用第一种疗法(例如，本文所述的组合物)可以在施用第二种疗法之前(例如，提前5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)，同时，或之后(例如，延后5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)。
在另一个一般方面，本发明涉及制备包含本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物的方法，包括将单克隆抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的载体组合以获得所述药物组合物。
实施方式
本发明还提供以下非限制性实施方式。
实施方式1是一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含具有以下多肽序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3：
(1)分别为SEQ ID NOs:6、7、8、2、3、和4；
(2)分别为SEQ ID NOs:14、15、16、10、11、和12；
(3)分别为SEQ ID NOs:22、23、24、18、19、和20；
(4)分别为SEQ ID NOs:30、31、32、26、27、和28；
(5)分别为SEQ ID NOs:38、39、40、34、35、和36；或
(6)分别为SEQ ID NOs:46、47、48、42、43、和44；
其中，所述抗体或其抗原结合片段结合PCSK9，优选地特异性结合人PCSK9。
实施方式2是一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：38的多肽序列的LCDR1；
(2)具有SEQ ID NO：39的多肽序列的LCDR2；
(3)具有SEQ ID NO：40的多肽序列的LCDR3；
(4)具有SEQ ID NO：34的多肽序列的HCDR1；
(5)具有SEQ ID NO：35的多肽序列的HCDR2；
(6)具有SEQ ID NOs：36和73-90之一的多肽序列的HCDR3。
其中，所述抗体或其抗原结合片段结合PCSK9，优选地特异性结合人PCSK9。
实施方式3是实施方式1或2的分离的单克隆抗体或抗原结合片段，其包含具有与SEQ ID NO：1、9、17、25、33、或91-108、或41之一至少95％同源性的多肽序列的重链可变区，或具有与SEQ ID NO：5、13、21、29、37或45之一至少95％同源性的多肽序列的轻链可变区。
实施方式4是实施方式3的分离的单克隆抗体或抗原结合片段，其包含分别具有与SEQ ID NO：1、9、17、25、33或41至少95％同源的多肽序列的重链可变区，和具有分别与SEQID NO：5、13、21、29、37或45至少95％同源的多肽序列的轻链可变区。
实施方式5是实施方式3的分离的单克隆抗体或抗原结合片段，其包含具有与SEQID NO：91-108之一至少95％同源性的多肽序列的重链可变区，和具有与SEQ ID NO：37至少95％同源性的多肽序列的轻链可变区。
实施方式6是实施方式4或5的分离的单克隆抗体或抗原结合片段，其包含：
(a)具有SEQ ID NO：1的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID No：5的多肽序列的轻链可变区；
(b)具有SEQ ID NO：9的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID No：13的多肽序列的轻链可变区；
(c)具有SEQ ID NO：17的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID No：21的多肽序列的轻链可变区；
(d)具有SEQ ID NO：25的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID No：29的多肽序列的轻链可变区；
(e)具有SEQ ID NOs：33或91-108之一的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ IDNo：37的多肽序列的轻链可变区；或
(f)具有SEQ ID NO：41的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID No：45的多肽序列的轻链可变区。
实施方式7是实施方式1至6中任一项的分离的单克隆抗体或抗原结合片段，其中，所述的抗体或其抗原结合片段是嵌合的。
实施方式8是实施方式1至7中任一项的分离的单克隆抗体或抗原结合片段，其中，所述的抗体或其抗原结合片段是人的。
实施方式9是实施方式8的分离的抗体或抗原结合片段，其包含人重链IgG1恒定区和人抗体轻链κ恒定区。
实施方式10是实施方式1至9中任一项的分离的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段结合人的PCSK9的KD值小于5×109M，优选KD值小于1×109M，其中，KD通过表面等离子体共振分析(如使用Biacore系统)或通过生物层干涉测量技术(如使用OctetRED96系统)进行测量。
实施方式11是分离的编码实施方式1至10中任一项的单克隆抗体或抗原结合片段的核酸。
实施方式12是包含实施方式11的分离的核酸的载体。
实施方式13是包含实施方式12的核酸的宿主细胞。
实施方式14是一种药物组合物，其包含实施方式1至10中任一项的分离的单克隆抗体或抗原结合片段，和药学上可接受的载体。
实施方式15是一种在有需要的受试者中阻断PCSK9与LDLR结合、或增加LDL摄取的方法，其包括向所述受试者施用实施方式14中的药物组合物。
实施方式16是一种在有需要的受试者中治疗脂类疾病、障碍或病症，代谢性疾病、障碍或病症，炎症性疾病、障碍或病症，感染性疾病、障碍或病症的方法，其包括向所述受试者施用实施方式14中的药物组合物。
实施方式17是实施方式16的方法，所述方法还包括向受试者施用额外的药剂，用于治疗有需要的受试者的血脂异常、代谢性疾病、炎症性疾病或感染性疾病。
实施方式18是治疗有需要的受试者的血脂异常、代谢性疾病、炎症性疾病或感染性疾病的方法，包括向受试者施用实施方式14的药物组合物，
实施方式19是实施方式18的方法，其中,所述的血脂异常或代谢性疾病为高血脂症、原发性高脂血症、脂代谢紊乱、混合性脂代谢紊乱、纯合子型家族性高胆固醇血症，或者其中所述的炎症性疾病是脓毒症。
实施方式20是实施方式18-19中任一项的方法，所述方法还包括向受试者施用额外的药剂，用于治疗有需要的受试者的血脂异常、代谢性疾病、炎症性疾病或感染性疾病。
实施方式21是一种制备实施方式1至10中任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，包括在一定条件下培养包含编码单克隆抗体或抗原结合片段的核酸的细胞，以产生单克隆抗体或抗原结合片段，并从细胞或细胞培养物中回收抗体或抗原结合片段。
实施方式22是一种制备包含实施方式1至10中任一项的单克隆抗体或抗原结合片段的药物组合物的方法，包括将所述单克隆抗体或抗原结合片段与药学上可接受的载体结合，以获得所述药物组合物。
实施方式23是实施方式1至10中任一项的分离的单克隆抗体或抗原结合片段在治疗有需要的受试者的血脂异常、代谢性疾病、炎症性疾病、或感染性疾病，例如高血脂症、原发性高脂血症、脂代谢紊乱、混合性脂代谢紊乱、纯合子型家族性高胆固醇血症或脓毒症的应用。
实施方式24是实施方式14的药物组合物在治疗有需要的受试者的血脂异常、代谢性疾病、炎症性疾病、或感染性疾病，例如高血脂症、原发性高脂血症、脂代谢紊乱、混合性脂代谢紊乱、纯合子型家族性高胆固醇血症或脓毒症的应用。
实施方式25是实施方式1至10中任一项的分离的单克隆抗体或抗原结合片段的用途，用于制备一种药物，所述的药物用于治疗有需要的受试者的血脂异常、代谢性疾病、炎症性疾病、或感染性疾病，例如高血脂症、原发性高脂血症、脂代谢紊乱、混合性脂代谢紊乱、纯合子型家族性高胆固醇血症或脓毒症。
实施方式26是实施方式14的药物组合物的用途，用于制备一种药物，所述的药物用于治疗有需要的受试者的血脂异常、代谢性疾病、炎症性疾病、或感染性疾病，例如高血脂症、原发性高脂血症、脂代谢紊乱、混合性脂代谢紊乱、纯合子型家族性高胆固醇血症或脓毒症。
实施例
本发明的以下实施例是为了进一步说明本发明。应该理解，以下实施例不限制本发明，并且本发明的范围由所附的权利要求确定。
实施例1-抗PCSK9抗体的制备
使用人PCSK9蛋白作为免疫原产生抗PCSK9抗体。利用人类免疫球蛋白转基因小鼠技术进行全人抗体的开发和制备，首次记载于Abgenix(Xenon小鼠和Medarex(HuMab“mouse”)；Lonberg等,1994,自然368:856-859；Lonberg和Huszar,1995,InternalRev.Immunol.13:65-93；Harding和Lonberg,1995,Ann.N.Y.Acad.Sci.764:536-546)。
通过进行中试抗体生产、纯化和验证试验，获得对PCSK9有高亲和力(KD<1×10-9M)的抗体。对PCSK9特异性的抗体能够阻断PCSK9与LDLR的结合。使用标准分子生物学方法测定产生的抗PCSK9抗体的重链和轻链可变区的氨基酸序列，并将其概括在表1中。
表1.本发明的嵌合抗PCSK9抗体的重链可变区，HCDR，轻链可变区和LCDR的氨基酸序列SEQ ID NO编号
表1列出的抗PCSK9抗体的重链和轻链可变区由总结于表2的核酸序列所编码。
表2.本发明的嵌合抗PCSK9抗体的重链和轻链可变区的核酸序列SEQ ID NO编号
制备了全人类型的抗PCSK9抗体。该全人抗PCSK9抗体以高亲和力(KD<1*10-9M)结合于人PCSK9，并阻断PCSK9与LDLR的结合。通过受体配体阻断试验和LDL摄取试验来评估抗PCSK9抗体的生物学活性，其中它们在体内阻断了PCSK9与LDLR的结合，增强了HepG2细胞对LDL的摄取，并阻止了PCSK9诱导的LDLR降解。抗PCSK9抗体可用于治疗血脂异常、代谢性疾病、高胆固醇血症、炎症性疾病或感染性疾病。
实施例2-抗PCSK9抗体的制备
(步骤1)制备免疫原A，His标记的PCSK9(PCSK9-His)
利用标准分子生物学克隆技术(Sambrook和Russell，1989，分子克隆实验手册，纽约：冷泉港实验室出版社，第二版)，将对应于SEQ ID NO：62的全长蛋白序列(UniProtKB IDQ8NBP7)的人PCSK9的编码序列(hPCSK9；SEQ ID NO：61)与His标签一起，克隆至pCpC载体(Invitrogen，#V044-50)。利用聚乙烯亚胺(PEI，Polysciences)和质粒，对HEK293细胞(Invitrogen)进行瞬时转染，并在37℃在FreeStyle 293表达培养基(Invitrogen)中进行扩增。扩增4天后，收集培养基并离心以去除细胞组分。培养上清含有重组的His标签的PCSK9。向含有重组的His标签的PCSK9的培养上清液中加入咪唑至终浓度为10mM。将样品通过0.22微米无菌过滤器并进行Ni-NTA亲和层析。用缓冲液A[含有20mM咪唑的1×PBS，pH7.2)和缓冲液B[(缓冲液A，0.1％(v/v)Trition X100,0.1％(v/v)Triton X114]平衡样品后，用缓冲液C[1×PBS(pH7.2)，250mM咪唑]将His标记的PCSK9蛋白(PCSK9-His)从Ni-NTA亲和层析柱上洗脱下来。使用Superdex 200柱(GE，医疗保健)进一步纯化洗脱液以获得高纯度的His标记的重组人PCSK9蛋白。样品在4℃用1×PBS(pH7.2)透析过夜。透析后，将纯化的PCSK9-His通过0.22微米无菌过滤器，分装并储存于-80℃。
为了鉴定PCSK9-His免疫原，测定样品的蛋白质浓度和纯度，并测定免疫原的分子量和生物活性。
通过一系列体外鉴定方法，对His标记的hPCSK9免疫原的生物活性进行评估，发现免疫原显示PCSK9的生物活性，并且以剂量依赖的方式抑制HepG2细胞对LDL的摄取。生产的两批His标记的hPCSK9免疫原在抑制HepG2的LDL摄取上，表现出相当的生物活性(参见图1)。将这两批具有生物活性的His标记的hPCSK9免疫原用于小鼠免疫。
表3.重组人PCSK9抑制HepG2细胞对LDL的摄取
(步骤2)制备免疫原B，hPCS9表达构建体
将人PCSK9的编码序列(hPCSK9；SEQ ID NO:61)亚克隆到pcDNA3.1载体(Invitrogen)中，将所得质粒包被至1.0um胶体金子弹(Bio-RAD)，随后根据Helios基因枪说明书，利用Helios基因枪(Bio-rad No.165-2431)进行免疫。
(步骤3)杂交瘤细胞融合和抗体筛选
由于人Ig Fc与小鼠Fc受体不相互作用，因此含有hFc的免疫原在小鼠中引发的免疫应答较弱，导致单克隆抗体制备的效率低。通过在小鼠基因组引入编码人免疫球蛋白(Ig)可变区的基因和编码大鼠Ig恒定区的基因，从而制备Harbour H2L2转基因小鼠，使得小鼠含有包含hV-rC的嵌合Ig，同时小鼠Ig的表达被灭活(WO2010/070263A1)。HarbourH2L2转基因小鼠能够产生与野生型小鼠(例如Balb/c)相当的免疫应答和抗体效价。
(3A部分)用免疫原A免疫6-8周龄的Harbor H2L2转基因小鼠(北京维通利华)，并将小鼠在无特定病原体(SPF)的条件下饲养。初次免疫时，将50ug的免疫原A与0.25mL完全弗氏佐剂(CFA)一起注射到每只小鼠的腹腔中。为增强免疫应答，在初次免疫两周后，将50ug的免疫原A与0.25mL不完全弗氏佐剂(IFA)一起注射到每只小鼠的腹腔中，随后间隔3周给予加强免疫。免疫后一周收集血液样品。通过ELISA检测血清中的抗体效价和特异性，结果如表4所示。空白对照是1％(w/w)BSA。表4所示OD450nm值是ELISA测定的第三次加强免疫后7天的血清效价值。第三次加强后的血清效价通常达到至少1：10,000。
表4.ELISA测定的用hPCSK9-His蛋白免疫的Harbour H2L2转基因小鼠的血清效价
(3B部分)用免疫原A免疫6-8周龄的Harbor H2L2转基因小鼠(北京维通利华)，并将小鼠在SPF条件下饲养。初次免疫时，将50ug的免疫原A连同0.20ml的Gerbu佐剂(Invitrogen)一起注射到每只小鼠的尾根部(BOT)。初次免疫后两周给予第一次加强免疫，随后每间隔三周给予加强免疫。免疫后一周收集血液样品。通过ELISA检测血清中的抗体效价和特异性，结果如表5所示。空白对照是1％(w/w)BSA。表5所示OD450nm值是ELISA测定的第三次加强免疫后7天的血清效价值。第三次加强免疫后的血清效价通常达到1：10,000以上。
表5.ELISA测定的用hPCSK9-His蛋白免疫的Harbour H2L2转基因小鼠的血清效价
(3C部分)用免疫原A免疫6-8周龄的Harbor H2L2转基因小鼠(北京维通利华)，并将小鼠在SPF条件下饲养。初次免疫时，将50ug的免疫原A与0.25mL完全弗氏佐剂(CFA)一起注射到每只小鼠的腹腔中。为增强免疫应答，在初次免疫两周后，将50ug的免疫原A与0.25mL不完全弗氏佐剂(IFA)一起注射到每只小鼠的腹腔中，随后每间隔3周给予加强免疫。免疫后一周收集血液样品。通过ELISA和FACS分析检测血清中的抗体效价和特异性，结果如表6所示。表6说明，PCSK9免疫小鼠的血清表现出不同的结合免疫原A的水平。最高血清稀释度约为一百万。空白对照是1％(w/w)BSA。表6所示OD450nm值是ELISA测定的第三次加强免疫后7天的血清效价值。
表6.ELISA测定的用hPCSK9-His蛋白免疫的Harbour H2L2转基因小鼠的血清效价
上述步骤3A-C完成之前，选择具有针对hPCSK9的特异性免疫应答的小鼠用于融合，并通过腹膜内注射100μg hPCSK9-His，给予最后一次冲刺免疫。3天后，处死小鼠，收集其脾细胞。向脾细胞样品中加入NH4OH至最终浓度为1％(w/w)，以裂解样品中的红细胞。1000rpm离心样品，并用DMEM培养基洗涤三次。检测脾细胞的活力，随后采用高效电融合方法(参见酶学方法，Vol.220)，将存活的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0(ATCC)以5：1的比例进行融合。
将融合细胞重悬于含有20％FBS和1x次黄嘌呤-氨基喋呤-胸苷(HAT)培养基(w/w)的DMEM培养基中，并将浓度调节至105个细胞/200μL。将200uL的融合细胞加入到96孔板的每个孔中，在37℃，5％CO2下孵育。细胞融合14天后，收集杂交瘤上清液并用ELISA进行筛选。在37℃，5％(v/v)CO2条件下,在含有DMEM，10％(w/w)热失活的FBS的24孔板中，用ELISA对OD450nm大于0.5的克隆进行扩增。培养3天后收集上清液。测定抗体的同种型，并通过ELISA测定其与重组PCSK9D374Y蛋白(功能获得性突变体；利用实施例1的方法制备)结合的能力(参见实施例3)。进行受体配体结合试验，以测定杂交瘤上清液的阻断活性(参见实施例4)，进行测量LDLR降解的试验(参见实施例5)，并且进行测量PCSK9介导的细胞LDL摄取的阻断试验(参见实施例6)。
基于24孔板的筛选结果，挑选与PCSK9结合，阻断PCSK9与LDLR之间的受体-配体相互作用，并抑制PCSK9介导的LDL摄取减少的克隆，并对其进行亚克隆。在37℃和5％(v/v)CO2条件下，用含有10％(v/v)FBS的DMEM培养基，在96孔板中通过有限稀释进行亚克隆。培养10天后，收集上清液，如利用ELISA进行测定，通过评估其结合重组人PCSK9，PCSK9D374Y，食蟹猴PCSK9(SEQ ID NO：63，利用实施例1的方法制备)和小鼠PCSK9(UniProtKB ID Q80W65；SEQ ID NO：65，利用实施例1的方法制备)的能力，或其阻断PCSK9或PCSK9D374Y与LDLR结合的能力，进行初步筛选。
将符合选择标准的克隆在含有10％(w/w)FBS的DMEM培养基中，在37℃，5％(v/v)CO2条件下进行扩增，并在液氮中冷冻，以便杂交瘤细胞可用于随后的抗体产生和纯化。
(步骤4)先导候选抗体的生产和纯化
来自杂交瘤细胞的抗体浓度低，约为1-10ug/mL，并且抗体浓度变化很大。另外，FBS和培养基的组分可能会干扰分析。因此，有必要进行小规模的抗体生产和纯化(1-5毫克)。
在T-75培养瓶中，用杂交瘤无血清培养基(Invitrogen)培养实施例2中的杂交瘤细胞，并传代3代。当杂交瘤细胞处于良好状态时，将细胞转移到2L培养瓶中。向每个培养瓶中加入500mL生产培养基，并将细胞密度调节至105个细胞/mL。将培养瓶置于37℃旋转培养箱中，转速3周/分钟。将杂交瘤细胞培养14天，之后收集上清液并除去细胞。随后，用0.45微米的过滤器过滤上清液。随后，培养上清液可用于纯化或储存于-30℃。
将杂交瘤培养上清液流过2mL蛋白G柱(GE医疗保健)来纯化单克隆抗体。首先用PBS缓冲液(pH7.2)平衡蛋白G柱，然后将杂交瘤培养上清液以3mL/分钟的恒定流速上样至平衡的蛋白G柱。然后用4倍体积的PBS缓冲液洗涤柱子。然后用洗脱缓冲液(0.1M乙酸盐缓冲液，pH2.5)洗脱抗PCSK9抗体，用UV检测器(A280紫外吸收峰)监测洗脱液的UV吸光度。向洗脱液中加入10％的1.0M Tris-HCL缓冲液以中和pH，将样品通过0.22微米过滤器进行无菌过滤。获得无菌过滤的纯化的抗PCSK9抗体。
采用UV吸光度(A280/1.4)检测纯化的抗PCSK9抗体的浓度，并检测纯度和内毒素水平(Lonza试剂盒)。分析结果如表7所示。纯化的抗PCSK9抗体的内毒素浓度小于1.0EU/mg。
表7.来自杂交瘤的纯化嵌合PCSK9mAb的质量控制分析
克隆ID 纯度 蛋白浓度(μg/mL) 内毒素(EU/μg)
74C10A8 >90％ 1.35 <0.12
76A1B11 >90％ 0.58 <0.12
139G1C5 >90％ 0.30 <0.12
152G2F7 >90％ 0.54 <0.12
96F8C6 >90％ 0.98 <0.12
103C11E8 ND 0.43 <0.12
实施例3-先导候选抗体的表征
(A部分)ELISA检测抗PCSK9抗体与重组PCSK9和PCSK9D374Y蛋白的结合
通过ELISA分析实施例2所得纯化的抗PCSK9抗体与重组人PCSK9蛋白(免疫原A)，PCSK9D374Y和食蟹猴PCSK9蛋白的结合。
用PBS稀释链霉亲和素(Cat No.85878，Sigma)至终浓度为1ug/mL，将100uL加入到96孔ELISA板的每个孔中，随后用塑料膜密封该板，并在4℃孵育过夜。第二天，用洗涤缓冲液[0.01％(v/v)吐温20]洗板两次，随后用封闭缓冲液[0.01％(v/v)0.1％BSA(w/w)吐温20]室温封闭2小时。吸去封闭缓冲液，每孔加入100uL 0.5ug/mL的生物素化的免疫原A(hPCSK9-His)、生物素化的PCSK9D374Y或生物素化的食蟹猴PCSK9蛋白(生物素标记试剂盒，Invitrogen)，并在37℃温育1小时。用洗涤缓冲液[0.01％(v/v)吐温20]洗板三次，以除去未结合的PCSK9蛋白。将200uL实施例2所得纯化的PCSK9抗体加入到每个孔中，37℃温育1小时。用洗涤缓冲液[0.01％(v/v)吐温20]洗板两次，并向各孔加入200uL HRP偶联的二抗(Sigma)，37℃温育2小时。洗涤缓冲液洗板三次后，每孔加入100μl TMB底物，室温下温育30分钟。每孔加入100uL终止液(0.1N HCl)，终止反应。用ELISA读板器(384plus SpectraMax，Molecular Devices)测量450nm处的吸光值。结果如图2-4和表8-10所示。IgG对照为大鼠IgG。
表8.ELISA检测嵌合抗PCSK9mAb与人PCSK9-His的结合活性
表9.ELISA检测嵌合抗PCSK9mAb与人PCSK9D374Y的结合活性
表10ELISA检测嵌合抗PCSK9mAb与食蟹猴PCSK9-Hi s的结合活性
实施例4-测定抗PCSK9抗体阻断PCSK9和PCSK9D374Y与LDLR结合的能力
野生型PCSK9及其突变型PCSK9D374Y都与LDLR结合，与野生型相比，突变型PCSK9D374Y对LDLR具有更高的结合亲和力。进行受体配体结合试验，以检测抗PCSK9抗体阻断PCSK9和PCSK9D374Y与LDLR结合的能力。
将LDLR的胞外结构域(SEQ IDNO：64；对应于全长LDLR的Ala22-Arg788)与His标记一起进行克隆(LDLRECD-His；利用实施例1的方法制备)。用PBS稀释纯化的LDLRECD-His至终浓度为1.0ug/mL，将100uL稀释的LDLRECD-His加入到96孔板的每个孔中，然后用塑料膜封闭，4℃过夜孵育。用洗涤缓冲液[PBS+0.01％(v/v)吐温20]洗板两次，并用封闭缓冲液[PBS+0.01％(v/v)BSA++1％吐温20(w/w)]室温孵育2小时。吸出封闭缓冲液，将50uL实施例2所得纯化的抗PCSK9抗体加入到96孔板的每个孔中。每孔加入50μl 0.5μg/mL的生物素化的重组hPCSK9-His或生物素化的PCSK9D374Y蛋白(利用生物素标记试剂盒进行生物素化，Invitrogen)，混合，并在37℃孵育2小时。用洗涤缓冲液[PBS+0.01％(v/v)吐温20]洗板三次。然后，每孔加入100uL HRP偶联的链霉亲和素(Sigma)，37℃孵育1小时。然后用洗涤缓冲液洗板三次，并将100uL TMB底物加入到各孔中。室温孵育15分钟后，加入50uL终止液(0.1NHCl)终止反应。用ELISA读板器(384plus SpectraMax，Molecular Devices)检测OD450nm处的吸光值。结果如图5-6和表11-12所示，结果表明，抗PCSK9抗体可以阻断PCSK9和PCSK9D374Y与LDLR的结合。
表11.通过ELISA测定的嵌合抗PCSK9mAb对人PCSK9与LDLR结合的抑制
表12.通过ELISA测定的嵌合抗PCSK9mAb对人PCSK9D374Y与LDLR结合的抑制
实施例5-测定PCSK9介导的LDLR降解的试验
用胰蛋白酶消化对数期HepG2细胞(ATCC)，离心并重悬于补充有10％(w/w)胎牛血清的MEM培养基(Invitrogen Cat.No.11095-080)。将细胞密度调节至3×105个细胞/mL，并将细胞加入24孔板的每个孔中。将板温育6小时以使HepG2细胞粘附后，吸去培养基，添加补充有10％(w/w)LPDS(Kalen生物医药有限责任公司，880100-2)的MEM培养基并温育过夜。第二天，将实施例2所得0.4ug/mL的PCSK9D374Y和抗PCSK9抗体混合并加入到24孔板中，将其在37℃温育4小时。弃去添加有10％LPDS的MEM培养基，用PBS洗板两次。使用Versene溶液(Invitrogen)从平板上分离并收集HepG2细胞。将细胞用PBS洗涤2次，测定细胞数，并用PBS将细胞密度调整为2×106个细胞/mL。向细胞悬液中加入封闭缓冲液[1％(w/w)FBS PBS]，并向96孔FACS板(FACS Calibur，BD)的每个孔中加入100uL细胞悬液，该96孔FACS板在冰上孵育15分钟，随后离心。吸去封闭缓冲液，每孔加入100μL 1ug/μL的LDLR抗体(Progen，61009)，冰上孵育15分钟。用FACS缓冲液[1％(w/w)BSA HBSS]洗板两次，每孔加入100uLAlexa-488偶联的抗兔二抗(分子探针公司，A-11034)，冰上孵育15分钟。用FACS缓冲液洗板三次，并在最后一次洗涤后重悬于100uL FACS缓冲液中。用FACS Calibur(BD)检测平均荧光强度(MFI)，结果如图7和表13所示。IgG对照为大鼠IgG，表中的值为细胞群的平均荧光强度。结果显示，抗PCSK9抗体以剂量依赖的方式抑制PCSK9D374Y诱导HepG2细胞中的LDLR降解。
表13.嵌合抗PCSK9mAb对人PCSK9D374Y介导的LDLR下调的影响
实施例6-测定PCSK9介导HepG2细胞中LDL摄取的抑制的试验
用胰蛋白酶消化对数期HepG2细胞(ATCC)，离心并重悬于补充有10％(w/w)胎牛血清的MEM培养基(Invitrogen Cat.No.11095-080)。将细胞密度调整至5×105个细胞/mL，将细胞加至PDL包被的(Millipore，A-003-E)96孔板中。将板温育6小时以使HepG2细胞粘附后，吸去培养基，添加补充有10％(w/w)LPDS(Kalen生物医药有限责任公司，880100-2)的MEM培养基并温育过夜。将10ug/mL的 FL LDL(Invitrogen，L3483)、0.5ug/mL的PCSK9D374Y和实施例2所得的抗PCSK9抗体混合并加入到96孔板中，将其温育6小时。吸去培养基，用PBS洗板两次，使用M5读板器(分子器件)测量520nm/485nm处的荧光强度。结果如图8和表14和15中所示，表明抗PCSK9抗体以剂量依赖的方式阻断了PCSK9D374Y介导的对LDL摄取的抑制。
表14.嵌合抗PCSK9mAb对人PCSK9D374Y介导的LDL摄取抑制的影响
表15.嵌合抗PCSK9mAb对人PCSK9D374Y介导的LDL摄取抑制的影响
实施例7-确定抗PCSK9抗体可变区中的氨基酸序列
总RNA分离：对实施例2所得杂交瘤亚克隆的上清液进行鉴定(即生物活性的验证和测定，实施例3-6)后，离心收集5×107个杂交瘤细胞。将1mL Trizol加入到细胞沉淀中，混合并转移到1.5mL离心管中，室温孵育5分钟。向样品中加入0.2mL氯仿，涡旋15秒。放置2分钟后，将混合物4℃，12000g离心5分钟。收集上清液，转移到新的1.5mL离心管中，加入0.5mL异丙醇，轻轻混合，将样品在室温下孵育10分钟。样品4℃，12000g离心15分钟。吸出上清液，用1mL 75％(v/v)乙醇洗涤沉淀物。将混合物4℃，12000g离心5分钟，弃去上清液，风干沉淀物。将DEPC处理的水加入沉淀物中(55℃水浴10分钟)获得总RNA。
逆转录和PCR：将1ug RNA和逆转录酶加入终体积为20uL的反应混合物中，并将混合物在42℃孵育60分钟，然后在70℃孵育10分钟以终止反应。制备50uL PCR反应混合物，其含有1uL cDNA，25pmol各引物，1uL DNA聚合酶，250umol dNTPs和缓冲系统。PCR程序设置如下：95℃变性3分钟，35个循环的变性(95℃30秒)、退火(55℃30秒)和延伸(72℃35秒)，随后72℃最后延伸5分钟，以获得PCR产物。使用的市售逆转录试剂盒是PrimeScript RT MasterMix(Takara，RR036)，市售的Q5超保真聚合酶PCR试剂盒来自NEB(M0492)。
克隆和测序：琼脂糖凝胶电泳检测5uL的PCR产物，用NucleoSpin Gel&PCR纯化试剂盒(MACHEREY-NAGEL，740609)从琼脂糖凝胶中回收样品。连接反应：向50ng样品中加入50ng T载体，0.5uL连接酶和1uL缓冲液，用水调整终体积至10uL。使用T4DNA连接酶(NEB，M0402)，将反应混合物16℃温育30分钟。向冰上孵育5分钟的100uL感受态细胞(Ecos 101感受态细胞，Yeastern，FYE607)中加入5uL连接产物，42℃热休克1分钟，并再次在冰上孵育1分钟。加入650uL不含抗生素的SOC培养基回收细胞，振荡培养箱中37℃，200rpm孵育30分钟。将200uL的各细菌培养物涂布于含有抗生素的LB琼脂平板上，37℃过夜。第二天，用T载体引物M13F和M13R进行PCR反应。使用移液枪头挑取细菌菌落浸入PCR反应混合物中，并上下吸取。将一半反应混合物转移到含有100nM氨苄青霉素的LB琼脂平板上。PCR反应结束后，取5uL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，阳性样品送去进行测序分析(Kabat，1991，“目标兴趣蛋白序列”，NIH,Bethesda,MD)。测序结果如表1-2所示。
实施例8-全人抗PCSK9抗体的转化，表达和纯化
(步骤1)质粒的构建和制备：实施例7获得抗PCSK9抗体重链和轻链可变区的序列。将抗PCSK9抗体的重链可变区序列亚克隆到含有信号肽和人重链IgG1恒定区的表达载体中。将抗PCSK9抗体的轻链可变区序列亚克隆到含有信号肽和人抗体轻链κ恒定区的表达载体中。测序验证和确认重组质粒(测序方法与实施例7相同)。用试剂盒(MACHEREY-NAGEL)进行碱裂解，以提高重组质粒的纯度和质量，并用0.22uM过滤器(Millpore)过滤质粒。将纯化的质粒用于转染。
(步骤2)转染：在37℃，130RPM，8％CO2(v/v)条件下，在FreeStyle 293培养基(Invitrogen)中培养HEK293E细胞(Invitrogen)。将HEK293E细胞的细胞密度调整至1-1.5x106/mL，用于进行转染。将10％(v/v)F68(Invitrogen)加入到FreeStyle 293培养基中，终浓度为0.1％(v/v)，作为培养基A。将5mL培养基A和200ug/mL PEI(Sigma)混合，以产生培养基B。将5mL培养基A和100ug/mL步骤1所得重组质粒混合，以产生培养基C。温育5分钟后，将培养基B和培养基C混合并温育15分钟，以产生混合物D。将10mL混合物D缓慢加入到100mL HEK293E细胞中，连续搅拌以避免PEI的局部积聚。HEK293E细胞振荡孵育过夜。第二天，加入蛋白胨至终浓度为0.5％(w/v)。约第5-7天，检测抗体效价。约第6-7天，对HEK293E培养物离心(30分钟，3500RPM)，收集上清液并用0.22uM过滤器过滤以纯化。
(步骤3)抗体纯化：蛋白A柱(GE)用0.1M NaOH洗涤30分钟，或用5倍柱体积的0.5MNaOH去除内毒素。长时间未使用的柱要在1M NaOH中浸泡至少1小时，用不含内毒素的水洗涤至中性pH，并用10倍床体积的1％Triton X100洗涤。随后，用5倍柱体积的PBS(PBS磷酸盐缓冲液，pH7.2)平衡柱子。将步骤2所得过滤上清液加载到柱子上，如果需要，收集流出物。用5倍柱体积的PBS洗涤柱子，然后用5倍柱体积的0.1M甘氨酸-HCl pH3.0洗脱。用0.5倍柱体积的1M Tris-HCl(NaCl 1.5M)pH8.5中和含抗PCSK9抗体的洗脱液。将人抗PCSK9抗体在1X PBS中透析4小时，以避免内毒素污染。透析后，分光光度法或试剂盒测定抗PCSK9抗体的浓度，用HPLC-SEC测定抗体的纯度，用内毒素检测试剂盒(Lonza)测定内毒素的水平。对全人抗PCSK9抗体进行鉴定，结果如图9-11和17-19以及表16-21所示。
表16.ELISA检测的全人抗PCSK9mAb与人PCSK9的结合活性
表17.ELISA检测的全人抗PCSK9mAb与人PCSK9的结合活性
表18.ELISA检测的全人抗PCSK9mAb与人PCSK9D374Y的结合活性
表19.ELISA检测的全人抗PCSK9mAb与人PCSK9D374Y的结合活性
表20.ELISA检测的全人抗PCSK9mAb与食蟹猴PCSK9的结合活性
表21.ELISA检测的全人抗PCSK9mAb与食蟹猴PCSK9的结合活性
受体配体结合试验证实，由嵌合抗PCSK9抗体转变产生的全人抗PCSK9抗体能够阻断PCSK9与LDLR的结合。结果如图12-13和20-21以及表22-25所示，结果表明，全人抗PCSK9抗体可以阻断PCSK9和PCSK9D374Y与LDLR的结合。IgG对照为人IgG。
表22.通过ELISA测定的全人抗PCSK9mAb对人PCSK9与LDLR结合的抑制
表23.通过ELISA测定的全人抗PCSK9mAb对人PCSK9与LDLR结合的抑制
表24.通过ELISA测定的全人抗PCSK9mAb对人PCSK9D374Y与LDLR结合的抑制
表25.通过ELISA测定的全人抗PCSK9mAb对人PCSK9D374Y与LDLR结合的抑制
由嵌合抗PCSK9抗体转变产生的全人抗PCSK9抗体能够抑制PCSK9D374Y介导的LDL摄取减少。结果如图14-16和22以及表26-27所示，结果表明，全人抗PCSK9抗体阻断了PCSK9D374Y介导的剂量依赖方式的对LDL摄取的抑制。IgG对照为人IgG。
表26.全人抗PCSK9mAb对人PCSK9D374Y介导的LDL摄取抑制的影响
表27.全人抗PCSK9mAb对人PCSK9D374Y介导的LDL摄取抑制的影响
实施例9-Octed Red 96检测结合和解离常数
解离常数通过Octed red 96(Fortiebio)测定。详细的操作和方法按照制造商提供的仪器说明书进行。简言之，使用AHC传感器(抗人Fc传感器，Fortiebio)进行亲和力测定。将抗PCSK9抗体在含有0.1％(w/w)BSA和0.02％(v/v)Tween20的PBS缓冲液(pH7.4)中稀释至10ug/mL，并用AHC传感器温育。将五种不同浓度的重组hPCSK9-His(从100nM或400nM的起始浓度两倍连续稀释)与装载有抗体的AHC传感器在30℃温育3分钟。进一步将反应混合物在含有0.1％(v/w)BSA和0.02％(v/v)Tween20的PBS缓冲液(pH7.4)中30℃温育5分钟。用Octet Red 96实时记录抗PCSK9抗体与免疫原A的结合和解离信号。用Octet User软件确定亲和力、结合和解离常数，结果如表28所示。
表28.Octet Red 96检测的全人抗PCSK9mAb与人PCSK9-His蛋白的结合动力学和亲和力
克隆ID KD(nM) ka(1/Ms) kd(1/s)
74C10A8 14.50 1.96×105 2.84×10-3
76A1B11 12.10 5.31×104 6.43×10-4
139G1C5 0.63 2.54×105 1.61×10-4
152G2F7 2.69 1.68×105 4.53×10-4
96F8C6 3.63 2.55×105 9.25×10-4
103C11E8 2.17 6.95×104 1.51×10-4
实施例10-Biacore检测结合和解离常数
将抗人Fc IgG固定于流动池1和2：使用HBS-EP+(10mM HEPES，150mM NaCl，3mMEDTA，0.05％P 2O，pH 7.4)作为流动缓冲液，并使用固定向导模板(immobilizationwizard template)进行抗人Fc IgG的固定化。用新鲜混合的50mmol/L NHS和200mmol/LEDC活化S系列CM5传感器芯片的流动池1和2。将稀释于10mM NaAC(pH4.5)的20μg/mL的抗人Fc IgG注射到活化的流动池1和2中。剩余的活性偶联位点用1M乙醇胺封闭。
将重组His标记的hPCSK9蛋白稀释至50nM，然后用HBS-EP+缓冲液进行4次2倍连续稀释。His-标记的hPCSK9蛋白的浓度为0nM、3.125nM、6.25nM、12.5nM、25nM和50nM。用HBS-EP+作为流动缓冲液进行KD的测量。将每种抗体以10uL/min的流速注射到CM5传感器流动池2中，以达到230RU响应。然后将制备的His-标记的hPCSK9蛋白以30uL/min的流速注射到流动池1和2中，持续180秒。缓冲液流动维持400秒(30uL/min)用于解离测量。为了除去表面的测试抗体，将pH 1.5的10mM甘氨酸-HCl注射20秒(30uL/min)。流动池1用作参考流动池。对连续稀释的每个浓度的His-标记的hPCSK9蛋白，重复上述步骤。使用Biacore T200评估软件1.0评估每种抗体的KD值，并将数据用1：1结合模型进行拟合。结果如表29所示。
表29.Biacore检测的全人抗PCSK9mAb与人PCSK9-His蛋白的结合动力学和亲和力
实施例11-PCSK9抗体对PCSK9介导的LDLR降解的影响
保持在SPF条件下饲养9-10周龄的C57BL/6小鼠。将小鼠随机分成5组，每组4只小鼠。在第1天，小鼠腹膜内施用30mg/kg，3mg/kg或0.3mg/kg待测抗PCSK9抗体(例如139G1C8或96F8C6)对照IgG或溶媒。第二天，所有小鼠静脉内施用重组人PCSK9蛋白(30ug/小鼠)。注射PCSK9 1小时后，处死小鼠并收获其肝脏。使用针对小鼠LDLR(mLDLR)和针对小鼠β-肌动蛋白(mβ-肌动蛋白)的抗体进行肝裂解物的蛋白印迹分析。使用密度测定法对蛋白条带进行定量，绘制mLDLR与mβ-肌动蛋白的比值。结果如图23A和B所示，表明抗PCSK9抗体在体内抑制了PCSK9介导的LDLR降解。
实施例12-差示扫描量热法(DSC)检测的抗体热稳定性
用样品缓冲液将全人抗PCSK9抗体调整至1mg/mL，终体积为约700uL。参数设置如下(VP-DSC)：起始温度30℃；最终温度100℃；扫描速度50℃/小时；重扫描次数为0；预扫描恒温3分钟；扫描后恒温0分钟；后循环恒温25℃；过滤时间25秒；反馈模式/收益为无；细胞填充参数35℃。得到的蛋白质-缓冲液热分析图结果，通过抵消相应的缓冲液-缓冲液扫描值进行处理，然后将基线拟合至踪迹线。用OriginTM7.0软件记录在热分析图中观察到的每个峰最大值处的Tms。结果如图24所示。
实施例13-抗体的冻/融稳定性
全人抗PCSK9抗体的冻融稳定性的鉴定如下。将100uL各抗PCSK9抗体的小份冷冻原液在室温下解冻。一旦完全解冻，将样品在-80℃冷冻箱中快速冷冻，并在-80℃保持至少2小时，然后再在室温下解冻。对样品进行三次相同的冷冻/解冻循环。用目测检查沉淀情况。在三次冷冻/解冻循环之后，从样品中取出20uL小份试样进行尺寸排阻色谱(SEC)分析。通过HPLC-SEC表征，分析冷冻/解冻循环之前和之后的全人抗PCSK9抗体的稳定性。图25所示结果表明，在三次冷冻/解冻循环后，单体IgG占所测试的各抗PCSK9抗体的95％以上。
实施例14-抗体溶解度
4℃下，将10mg IgG用14000g离心过滤器(Amicon Ultra-0.5mL 30K)浓缩至＞100mg/mL，以鉴定全人抗PCSK9抗体的溶解度。将2mL或更多的IgG加入到离心过滤器中，4℃下14000g浓缩。离心的设置时间为2min、3min、5min、8min、15min和20min，每次将20uL分装到收集管中，用分光光度计在A280处检测浓度。浓度达到100mg/mL时，结束离心。对于HPLC-SEC鉴定，将6uL浓缩样品注射到HPLC-SEC柱中，基于峰面积确定单体和聚集体的百分比。图26所示结果表明，测试的全部全人抗PCSK9抗体具有超过100mg/mL的溶解度，并且对于测试的全部抗PCSK9抗体，单体IgG高于95％。
实施例15-抗PCSK9抗体的亲和力成熟过程
(步骤1)CDR诱变文库构建和验证
1.噬菌体表达载体的构建和scFv展示的验证：根据实施例6的方法，获得了抗PCSK9抗体98F8C6的重链和轻链可变区的序列。使用重叠PCR组装编码重链可变区，接头和轻链可变区的核酸，以产生scFv。将PCR产物连接入噬菌体载体，然后将其转化入TG1细胞。选择来自氨苄青霉素选择平板的阳性克隆，回收其噬菌体表达载体并进行测序。
2.CDR诱变文库的设计：CDR位置由Kabat编号进行定义。在典型的抗体结构中，HCDR3和LCDR3结构域提供了抗原识别的核心界面，其被其他CDR所包围。因此，在缺乏关于抗PCSK9抗体的哪个CRD对抗原结合有贡献的结构信息时，HCDR3和LCDR3是文库产生的最初目标。使用NNK引物(N＝任何核苷酸，K＝G，T)将CDR3环上的氨基酸残基进行随机化突变。每个位置的突变率保持在50％以控制每个变体中突变的数目，并因此最大限度地保留原始结合表位。将长CDR(>10个氨基酸)分成两个或三个重叠的片段。鉴于96F8C6克隆的HCDR3的大小，其被分成两个重叠的片段，CDR-H3-1和CDR-H3-2，并在单独的随机文库中对每个片段进行突变。用于CDR突变的引物如下：
SEQ ID NO:70(CDRH3-1_mut-F)
gtgtattactgtgcgaga(NNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNK)tataactactactactac
SEQ ID NO:71(CDRH3-2_mut-F)
attactatggttcggggagt(NNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNK)tggggccaagggaccacg
SEQ ID NO:72(CDRL3_mut-F)
attttgcaacttattactgc(NNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNK)tttggccaggggaccaagc
3.文库的构建：使用重叠PCR构建随机突变文库。PCR产物用限制性酶SfiI在50℃消化2小时，然后使用T4连接酶16℃过夜连接至Sfi I消化的噬菌体中。将各文库电转化入TG1大肠杆菌中。
4.文库的验证：每个文库的大小在108到109个克隆之间。每个文库进行50个克隆的测序，利用与野生型序列的序列比对评估突变文库的质量，例如评价突变位置和突变率。
5.文库的包装和滴定：在扩增细菌文库后，将辅助噬菌体加入包装的噬菌体颗粒中用于如下淘选步骤。通过对新感染的TG1克隆进行计数来测定纯化的噬菌体文库的滴度。
(步骤2)亲和驱动的文库淘选
在平衡条件下，将生物素化的可溶性hPCSK9作为溶液相中的抗原，对CDR突变ScFv噬菌体文库进行淘选。首先，用2％的MPBS(含2％牛奶的PBS溶液)将待用的离心管和链霉亲和素磁珠室温封闭2小时。在2％的MPBS中，用珠子将文库预先耗尽，随后在封闭管中与生物素-hPCSK9混合，在旋转器上室温孵育2小时。在第一轮淘选中，使用的抗原浓度为10nM，并在随后的轮次中每次减少10倍。将ScFv-抗原-生物素复合物与链霉亲和素磁珠混合并孵育15分钟。利用磁体收集珠子，转移至1.5的微量离心管中，分别用MPBST(2％牛奶，0.5％吐温20的PBS溶液)，PBST(0.5％吐温20的PBS溶液)，MPBS(2％牛奶的PBS)和PBS洗涤5次。37℃下，用1mL胰蛋白酶(PBS中，10ug/mL)从珠上洗脱结合的噬菌体30分钟。利用磁体将珠子吸引到管的一侧，并将含有洗脱的噬菌体的溶液转移到含有4mL TG1(A600≈0.6)的管中，用于滴定淘选文库。
在每轮淘选后，对产出克隆进行测序以确定突变的富集。经过3轮或4轮淘选后，选择所得克隆进行筛选。
(步骤3)亲和力增强的结合变体的ELISA筛选
经过3轮或4轮淘选后，选出超过500个单克隆。IPTG诱导用于诱导ScFv变体的表达，并将具有强ELISA信号的克隆送去测序。
(步骤4)亲和力提高的变体的真核生产和亲和力表征
将来自富集克隆的VH和VL序列克隆至IgG表达载体中，插入相应前导序列和恒定区之间。通过瞬时转染将所得载体转染到HEK293细胞中。如实施例8中所述，5-7天后，利用蛋白A柱通过亲和纯化对培养上清液中的IgG进行纯化。亲和提高的变体的VH序列列于表30中。这些变体的轻链序列与98F8C6抗体轻链的那些相同，例如，分别与SEQ ID NOs：38-40的LCDR 1-3，或SEQ ID NO：37的轻链可变区，或其编码序列SEQ ID NO：58。
表30.亲和力提高的人抗PCSK9mAb变体的VH序列
如实施例10中所述，通过Biacore测定针对人PCSK9的亲和力提高的抗体的最终解离常数(KD)，数据如表31所示。测定了亲和力提高的抗体对重组PCSK9D374Y诱导的LDL摄取的影响，结果如图27A和B以及表32所示。
表31.通过Biacore测定的亲和力提高的人抗PCSK9mAb对人PCSK9-His蛋白的结合动力学和亲和力
克隆ID ka(1/M) kd(1/s) KD(M)
AF-mab023_01 3.20E+05 1.15E-04 3.6E-10
AF-mab023_02 3.06E+05 8.20E-05 2.68E-10
AF-mab023_03 3.70E+05 4.60E-04 1.24E-09
AF-mab023_04 5.84E+05 2.39E-04 4.09E-10
AF-mab023_05 3.05E+05 6.31E-05 2.07E-10
AF-mab023_06 2.93E+05 6.59E-05 2.25E-10
AF-mab023_07 3.27E+05 2.14E-04 6.53E-10
AF-mab023_08 3.57E+05 1.58E-04 4.43E-10
AF-mab023_10 3.13E+05 3.28E-04 1.05E-09
AF-mab023_11 5.53E+05 1.44E-04 2.6E-10
AF-mab023_12 4.80E+05 8.47E-05 1.76E-10
AF-mab023_13 4.55E+05 1.78E-04 3.92E-10
AF-mab023_14 5.34E+05 1.64E-04 3.06E-10
AF-mab023_15 4.77E+05 1.82E-04 3.81E-10
AF-mab023_16 3.19E+05 1.43E-04 4.47E-10
AF-mab023_17 3.51E+05 1.09E-04 3.1E-10
AF-mab023_18 5.51E+05 1.61E-04 2.92E-10
AF-mab023_19 2.26E+05 3.51E-04 1.55E-09
表32.亲和力提高的人抗PCSK9mAb对人PCSK9D374Y介导的LDL摄取抑制的影响
克隆ID IC50(nM)
96F8C6 2.51
AF-mab023_01 1.20
AF-mab023_06 1.05
AF-mab023_11 1.28
AF-mab023_12 1.21
AF-mab023_14 1.25
AF-mab023_18 0.99
在详细描述本发明的情况下，参照其具体实施方式，对于本领域普通技术人员来说，在不脱离本发明主题和范围的情况下，进行各种变化和修饰是显而易见的。
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Gly Gly Ser Ile Asn Thr Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Glu Arg Phe Thr Met Val Arg Gly Val Met Met Asp Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
Gly Gly Ser Ile Asn Thr Tyr Tyr Trp Ser
1 5 10
<210> 3
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 3
Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 4
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 4
Arg Glu Arg Phe Thr Met Val Arg Gly Val Met Met Asp Tyr Tyr Tyr
1 5 10 15
Tyr Gly Met Asp Val
20
<210> 5
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 5
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<212> PRT
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<400> 6
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
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<211> 7
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Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser
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<212> PRT
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Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Arg Thr
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 9
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Thr Gly Phe Thr Phe Ser Ile Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Ser Asp Tyr Phe Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 10
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 10
Gly Phe Thr Phe Ser Ile Tyr Gly Met His
1 5 10
<210> 11
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 11
Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 12
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 12
Ser Asp Tyr Phe Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
1 5 10 15
Val
<210> 13
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 13
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Val Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Thr Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Tyr Asn Ser Ala Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 14
Arg Ala Ser Gln Val Ile Ser Asn Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 15
Thr Ala Ser Thr Leu Gln Ser
1 5
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 16
Gln Lys Tyr Asn Ser Ala Pro Tyr Thr
1 5
<210> 17
<211> 118
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 17
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Arg Asn
20 25 30
Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Leu Leu Gly Ile Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 18
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 18
Gly Gly Ser Ile Ser Arg Asn Asn Trp Trp Ser
1 5 10
<210> 19
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 19
Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 20
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 20
Arg Asp Leu Leu Gly Ile Gly Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 21
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 21
Glu Phe Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Ile Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Ser Asn Trp Met Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 22
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 22
Arg Ala Ser Gln Ser Phe Ser Ser Tyr Ile Ala
1 5 10
<210> 23
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 23
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 24
Gln Gln His Ser Asn Trp Met Tyr Thr
1 5
<210> 25
<211> 129
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 25
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Phe Thr Phe Gly Gly Tyr
20 25 30
Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu His Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Thr Thr Met Ile Arg Gly Val Ser Leu Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Ala Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 26
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 26
Glu Phe Thr Phe Gly Gly Tyr Trp Met Thr
1 5 10
<210> 27
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 27
Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 28
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 28
Arg Asp Arg Thr Thr Met Ile Arg Gly Val Ser Leu Tyr Tyr Tyr Tyr
1 5 10 15
Tyr Gly Met Asp Val
20
<210> 29
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 29
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 30
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 30
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 31
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 32
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 33
<211> 130
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 33
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Asn Tyr
100 105 110
Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser
130
<210> 34
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 34
Gly Ile Thr Phe Ser Ser Tyr Trp Met Ser
1 5 10
<210> 35
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 35
Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 36
<211> 22
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 36
Arg Asp Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Asn Tyr Tyr
1 5 10 15
Tyr Tyr Gly Met Asp Val
20
<210> 37
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 37
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 38
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 38
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 39
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 39
Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser
1 5
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 40
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser Tyr Thr
1 5
<210> 41
<211> 121
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 41
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ile Ala Val Ala Gly Thr Asp Val Met Asp Ala Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 42
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 42
Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser Asn Trp Trp Ser
1 5 10
<210> 43
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 43
Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 44
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 44
Arg Gly Ile Ala Val Ala Gly Thr Asp Val Met Asp Ala
1 5 10
<210> 45
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 45
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Gly Asn Trp Met Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 46
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 46
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Val
1 5 10
<210> 47
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 47
Gly Thr Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 48
Gln Gln Arg Gly Asn Trp Met Tyr Thr
1 5
<210> 49
<211> 384
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 49
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcagtg tctctggtgg ctccatcaat acttactact ggagctggat ccggcagccc 120
ccagggaagg gactggagtg gattgggtat atctattaca gtgggagcac caactacaac 180
ccctccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240
aagttgactt ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgag agaaaggttt 300
actatggttc ggggagttat gatggactac tactactacg gtatggacgt ctggggccaa 360
gggaccacgg tcaccgtctc ctca 384
<210> 50
<211> 375
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 50
caggtgcagt tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgactggatt caccttcagt atctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg gactggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaagtaa taaatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcatcatc tccagagaca attccaagaa tacgttgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agtcgaggac acggctgttt attactgtgt gagcgattac 300
tttggttcgg ggaactccta ttactactac ggtatggacg tctggggcca agggaccacg 360
gtcaccgtct cctca 375
<210> 51
<211> 354
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 51
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggggac cctgtccctc 60
acctgcgctg tctctggtgg ctccatcagc aggaataatt ggtggagttg ggtccgccag 120
cccccaggga aggggctgga gtggattggg gaaatctatc atagtgggag caccaactac 180
aacccgtccc tcaagagtcg agtcaccata tcagtagaca agtccaagaa ccagttctcc 240
ctgaagctga gctctgtgac ggccgcggac acggccgtgt attactgtgc gagagatctg 300
ctggggatcg gtcttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 354
<210> 52
<211> 387
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 52
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggagggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctgaatt cacctttggt ggctattgga tgacctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtggccaac ataaagcaag atggaagtga gaaatactat 180
gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcacatga acagcctgag agccgaggac acggctgtat attactgtgc gagagatcgg 300
actactatga ttcggggagt ctctctttac tactactact acggtatgga cgtctggggc 360
caagggaccg cggtcaccgt ctcctca 387
<210> 53
<211> 390
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 53
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggaat cacctttagt agctattgga tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtggccaac ataaagcaag atgggagtga gaaatactat 180
gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca tcgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatagg 300
ggaacgtatt actatggttc ggggagttat aactactact actacggtat ggacgtctgg 360
ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 390
<210> 54
<211> 363
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 54
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggggac cctgtccctc 60
acctgcgctg tctctggtgg ctccatcagc agtagtaact ggtggagttg ggtccgccag 120
cccccaggga aggggctgga gtggattggg gaaatctatc atagtgggag caccaactac 180
aacccgtccc tcaagagtcg agtcaccata tcagtagaca agtccaagaa ccagttctcc 240
ctgaagctga gctctgtgac cgccgcggac acggccgtgt attactgtgc gagaggaata 300
gcagtggctg gtacggatgt tatggatgcc tggggtcaag gagcttcagt cactgtctcc 360
tca 363
<210> 55
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 55
gacatccagt tgacccagtc tccatccttc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggccagtca gggcattagt agttatttag cctggtatca gcaaaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccactt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgtcaacag cttaatagtt accctcggac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa a 321
<210> 56
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 56
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcgagtca ggtcattagc aattatttag cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagttc ctaagctcct gatctatact gcatccactt tacaatcagg ggtcccttct 180
cggttcagtg gcagtggatc tggggcagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagatgttg caacttatta ctgtcaaaag tataacagtg ccccgtacac ttttggccag 300
gggaccaagc tggagatcaa a 321
<210> 57
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 57
gaatttgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccaggtga aagagccatc 60
ctctcctgca gggccagtca gagttttagc agctacatag cctggtacca acagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag catagcaact ggatgtacac ttttggccag 300
gggaccaagc tggagatcaa a 321
<210> 58
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 58
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggcctctcac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 59
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 59
gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggccagtca gagtattagt agttggttgg cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctataag gcgtctagtt tagaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gatgattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt attcgtacac ttttggccag 300
gggaccaagc tggagatcaa a 321
<210> 60
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 60
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag tttggtacca acagaaatct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatggt acatccaaca gggccactgg catcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240
gaagattttg cactttatta ctgtcagcag cgtggcaact ggatgtacac ttttggccag 300
gggaccaagc tggagatcaa a 321
<210> 61
<211> 2079
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 61
atgggcaccg tcagctccag gcggtcctgg tggccgctgc cactgctgct gctgctgctg 60
ctgctcctgg gtcccgcggg cgcccgtgcg caggaggacg aggacggcga ctacgaggag 120
ctggtgctag ccttgcgttc cgaggaggac ggcctggccg aagcacccga gcacggaacc 180
acagccacct tccaccgctg cgccaaggat ccgtggaggt tgcctggcac ctacgtggtg 240
gtgctgaagg aggagaccca cctctcgcag tcagagcgca ctgcccgccg cctgcaggcc 300
caggctgccc gccggggata cctcaccaag atcctgcatg tcttccatgg ccttcttcct 360
ggcttcctgg tgaagatgag tggcgacctg ctggagctgg ccttgaagtt gccccatgtc 420
gactacatcg aggaggactc ctctgtcttt gcccagagca tcccgtggaa cctggagcgg 480
attacccctc cacggtaccg ggcggatgaa taccagcccc ccgacggagg cagcctggtg 540
gaggtgtatc tcctagacac cagcatacag agtgaccacc gggaaatcga gggcagggtc 600
atggtcaccg acttcgagaa tgtgcccgag gaggacggga cccgcttcca cagacaggcc 660
agcaagtgtg acagtcatgg cacccacctg gcaggggtgg tcagcggccg ggatgccggc 720
gtggccaagg gtgccagcat gcgcagcctg cgcgtgctca actgccaagg gaagggcacg 780
gttagcggca ccctcatagg cctggagttt attcggaaaa gccagctggt ccagcctgtg 840
gggccactgg tggtgctgct gcccctggcg ggtgggtaca gccgcgtcct caacgccgcc 900
tgccagcgcc tggcgagggc tggggtcgtg ctggtcaccg ctgccggcaa cttccgggac 960
gatgcctgcc tctactcccc agcctcagct cccgaggtca tcacagttgg ggccaccaat 1020
gcccaagacc agccggtgac cctggggact ttggggacca actttggccg ctgtgtggac 1080
ctctttgccc caggggagga catcattggt gcctccagcg actgcagcac ctgctttgtg 1140
tcacagagtg ggacatcaca ggctgctgcc cacgtggctg gcattgcagc catgatgctg 1200
tctgccgagc cggagctcac cctggccgag ttgaggcaga gactgatcca cttctctgcc 1260
aaagatgtca tcaatgaggc ctggttccct gaggaccagc gggtactgac ccccaacctg 1320
gtggccgccc tgccccccag cacccatggg gcaggttggc agctgttttg caggactgta 1380
tggtcagcac actcggggcc tacacggatg gccacagccg tcgcccgctg cgccccagat 1440
gaggagctgc tgagctgctc cagtttctcc aggagtggga agcggcgggg cgagcgcatg 1500
gaggcccaag ggggcaagct ggtctgccgg gcccacaacg cttttggggg tgagggtgtc 1560
tacgccattg ccaggtgctg cctgctaccc caggccaact gcagcgtcca cacagctcca 1620
ccagctgagg ccagcatggg gacccgtgtc cactgccacc aacagggcca cgtcctcaca 1680
ggctgcagct cccactggga ggtggaggac cttggcaccc acaagccgcc tgtgctgagg 1740
ccacgaggtc agcccaacca gtgcgtgggc cacagggagg ccagcatcca cgcttcctgc 1800
tgccatgccc caggtctgga atgcaaagtc aaggagcatg gaatcccggc ccctcaggag 1860
caggtgaccg tggcctgcga ggagggctgg accctgactg gctgcagtgc cctccctggg 1920
acctcccacg tcctgggggc ctacgccgta gacaacacgt gtgtagtcag gagccgggac 1980
gtcagcacta caggcagcac cagcgaaggg gccgtgacag ccgttgccat ctgctgccgg 2040
agccggcacc tggcgcaggc ctcccaggag ctccagtga 2079
<210> 62
<211> 692
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 62
Met Gly Thr Val Ser Ser Arg Arg Ser Trp Trp Pro Leu Pro Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Ala Gly Ala Arg Ala Gln Glu
20 25 30
Asp Glu Asp Gly Asp Tyr Glu Glu Leu Val Leu Ala Leu Arg Ser Glu
35 40 45
Glu Asp Gly Leu Ala Glu Ala Pro Glu His Gly Thr Thr Ala Thr Phe
50 55 60
His Arg Cys Ala Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly Thr Tyr Val Val
65 70 75 80
Val Leu Lys Glu Glu Thr His Leu Ser Gln Ser Glu Arg Thr Ala Arg
85 90 95
Arg Leu Gln Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Ile Leu
100 105 110
His Val Phe His Gly Leu Leu Pro Gly Phe Leu Val Lys Met Ser Gly
115 120 125
Asp Leu Leu Glu Leu Ala Leu Lys Leu Pro His Val Asp Tyr Ile Glu
130 135 140
Glu Asp Ser Ser Val Phe Ala Gln Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg
145 150 155 160
Ile Thr Pro Pro Arg Tyr Arg Ala Asp Glu Tyr Gln Pro Pro Asp Gly
165 170 175
Gly Ser Leu Val Glu Val Tyr Leu Leu Asp Thr Ser Ile Gln Ser Asp
180 185 190
His Arg Glu Ile Glu Gly Arg Val Met Val Thr Asp Phe Glu Asn Val
195 200 205
Pro Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys Asp
210 215 220
Ser His Gly Thr His Leu Ala Gly Val Val Ser Gly Arg Asp Ala Gly
225 230 235 240
Val Ala Lys Gly Ala Ser Met Arg Ser Leu Arg Val Leu Asn Cys Gln
245 250 255
Gly Lys Gly Thr Val Ser Gly Thr Leu Ile Gly Leu Glu Phe Ile Arg
260 265 270
Lys Ser Gln Leu Val Gln Pro Val Gly Pro Leu Val Val Leu Leu Pro
275 280 285
Leu Ala Gly Gly Tyr Ser Arg Val Leu Asn Ala Ala Cys Gln Arg Leu
290 295 300
Ala Arg Ala Gly Val Val Leu Val Thr Ala Ala Gly Asn Phe Arg Asp
305 310 315 320
Asp Ala Cys Leu Tyr Ser Pro Ala Ser Ala Pro Glu Val Ile Thr Val
325 330 335
Gly Ala Thr Asn Ala Gln Asp Gln Pro Val Thr Leu Gly Thr Leu Gly
340 345 350
Thr Asn Phe Gly Arg Cys Val Asp Leu Phe Ala Pro Gly Glu Asp Ile
355 360 365
Ile Gly Ala Ser Ser Tyr Cys Ser Thr Cys Phe Val Ser Gln Ser Gly
370 375 380
Thr Ser Gln Ala Ala Ala His Val Ala Gly Ile Ala Ala Met Met Leu
385 390 395 400
Ser Ala Glu Pro Glu Leu Thr Leu Ala Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ile
405 410 415
His Phe Ser Ala Lys Asp Val Ile Asn Glu Ala Trp Phe Pro Glu Asp
420 425 430
Gln Arg Val Leu Thr Pro Asn Leu Val Ala Ala Leu Pro Pro Ser Thr
435 440 445
His Gly Ala Gly Trp Gln Leu Phe Cys Arg Thr Val Trp Ser Ala His
450 455 460
Ser Gly Pro Thr Arg Met Ala Thr Ala Val Ala Arg Cys Ala Pro Asp
465 470 475 480
Glu Glu Leu Leu Ser Cys Ser Ser Phe Ser Arg Ser Gly Lys Arg Arg
485 490 495
Gly Glu Arg Met Glu Ala Gln Gly Gly Lys Leu Val Cys Arg Ala His
500 505 510
Asn Ala Phe Gly Gly Glu Gly Val Tyr Ala Ile Ala Arg Cys Cys Leu
515 520 525
Leu Pro Gln Ala Asn Cys Ser Val His Thr Ala Pro Pro Ala Glu Ala
530 535 540
Ser Met Gly Thr Arg Val His Cys His Gln Gln Gly His Val Leu Thr
545 550 555 560
Gly Cys Ser Ser His Trp Glu Val Glu Asp Leu Gly Thr His Lys Pro
565 570 575
Pro Val Leu Arg Pro Arg Gly Gln Pro Asn Gln Cys Val Gly His Arg
580 585 590
Glu Ala Ser Ile His Ala Ser Cys Cys His Ala Pro Gly Leu Glu Cys
595 600 605
Lys Val Lys Glu His Gly Ile Pro Ala Pro Gln Glu Gln Val Thr Val
610 615 620
Ala Cys Glu Glu Gly Trp Thr Leu Thr Gly Cys Ser Ala Leu Pro Gly
625 630 635 640
Thr Ser His Val Leu Gly Ala Tyr Ala Val Asp Asn Thr Cys Val Val
645 650 655
Arg Ser Arg Asp Val Ser Thr Thr Gly Ser Thr Ser Glu Gly Ala Val
660 665 670
Thr Ala Val Ala Ile Cys Cys Arg Ser Arg His Leu Ala Gln Ala Ser
675 680 685
Gln Glu Leu Gln
690
<210> 63
<211> 2079
<212> DNA
<213> 食蟹猴(Macaca fascicularis)
<400> 63
atgggtaccg tcagctccag gcggtcctgg tggcctctgc cgctgccact gctgctgctc 60
ctgctcctgg gtcccgctgg cgcccgtgcg caggaggacg aggacggcga ctacgaggag 120
ctggtgctag ccttgcgttc cgaggaggac ggcctggccg acgcacccga gcacggagcc 180
acagccacct tccaccgctg cgccaaggat ccgtggaggc tgcccggcac ctacgtggtg 240
gtgctgaagg aggagaccca ccgctcgcag tcagagcgca ctgcccgccg cctgcaggcc 300
caagctgccc gccggggata cctcaccaag atcctgcatg tcttccatca ccttcttcct 360
ggcttcctgg tgaagatgag tggcgacctg ctggagctgg ccctgaagtt gccccatgtc 420
gactacatcg aggaggactc ctctgtcttt gcccagagca tcccatggaa cctggagcga 480
attactcctg cacggtaccg ggcggatgaa taccagcccc ccaaaggagg cagcctggtg 540
gaggtgtatc tcctagacac cagcatacag agtgaccacc gggaaatcga gggcagggtc 600
atggtcaccg acttcgagag tgtgcccgag gaggacggga cccgcttcca cagacaggcc 660
agcaagtgtg acagccatgg cacccacctg gcaggggtgg tcagcggccg ggatgccggc 720
gtggccaagg gtgccggcct gcgtagcctg cgcgtgctca actgccaagg gaagggcacg 780
gtcagcggca ccctcatagg tctggagttt attcggaaaa gccagctggt ccagcccgtg 840
gggccactgg ttgtgctgct gcccctggcg ggtgggtaca gccgggtctt caacgccgcc 900
tgccagcgcc tggcgagggc tggggtcgtg ctggtcaccg ctgccggcaa cttccgggac 960
gatgcctgcc tctactcccc agcctcggct cccgaggtca tcacagttgg ggccaccaat 1020
gcccaggacc agccggtgac cctggggact ttggggacca actttggccg ctgtgtggac 1080
ctctttgccc caggggagga catcattggt gcctccagcg actgcagcac ctgctttgtg 1140
tcacggagtg ggacatcgca ggctgctgcc cacgtggctg gcattgcagc catgatgctg 1200
tctgccgagc cggagctcac tctggccgag ttgaggcaga gactgatcca cttctctgcc 1260
aaagatgtca tcaatgaggc ctggttccct gaggaccagc gggtactgac ccccaacctg 1320
gtggccgccc tgccccccag cacccacagg gcaggttggc agctgttttg caggactgtg 1380
tggtcagcac actcggggcc tacacggatg gccacagccg tagcccgctg cgcccaggat 1440
gaggagctgc tgagctgctc cagtttctcc aggagtggga agcggcgggg cgagcgcatc 1500
gaggcccaag ggggcaagcg ggtctgccgg gcccacaacg cttttggggg tgagggtgtc 1560
tacgccattg ccaggtgctg cctgctaccc caggtcaact gcagcgtcca cacagctcca 1620
ccagctgggg ccagcatggg gacccgtgtc cactgccatc agcagggcca cgtcctcaca 1680
ggctgcagct cccactggga ggtggaggac cttggcaccc acaagccgcc tgtgctgagg 1740
ccacgaggtc agcccaacca gtgtgtgggc cacagggagg ccagcatcca cgcttcctgc 1800
tgccatgccc caggtctgga atgcaaagtc aaggagcatg gaatcccggc ccctcaggag 1860
caggttatcg tggcctgtga ggacggctgg accctgaccg gctgcagtcc cctccctggg 1920
acctcccatg tcctgggggc ctacgctgta gacaacacgt gtgtggtcag gagccgggac 1980
gtcagcacca caggcagcac cagcaaagaa gccgtggcag ccgttgccat ctgctgccgg 2040
agccggcacc tggtgcaggc ctcccaagag ctccagtga 2079
<210> 64
<211> 2301
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 64
gcagtgggcg acagatgcga aagaaacgag ttccagtgcc aagacgggaa atgcatctcc 60
tacaagtggg tctgcgatgg cagcgctgag tgccaggatg gctctgatga gtcccaggag 120
acgtgcttgt ctgtcacctg caaatccggg gacttcagct gtgggggccg tgtcaaccgc 180
tgcattcctc agttctggag gtgcgatggc caagtggact gcgacaacgg ctcagacgag 240
caaggctgtc cccccaagac gtgctcccag gacgagtttc gctgccacga tgggaagtgc 300
atctctcggc agttcgtctg tgactcagac cgggactgct tggacggctc agacgaggcc 360
tcctgcccgg tgctcacctg tggtcccgcc agcttccagt gcaacagctc cacctgcatc 420
ccccagctgt gggcctgcga caacgacccc gactgcgaag atggctcgga tgagtggccg 480
cagcgctgta ggggtcttta cgtgttccaa ggggacagta gcccctgctc ggccttcgag 540
ttccactgcc taagtggcga gtgcatccac tccagctggc gctgtgatgg tggccccgac 600
tgcaaggaca aatctgacga ggaaaactgc gctgtggcca cctgtcgccc tgacgaattc 660
cagtgctctg atggaaactg catccatggc agccggcagt gtgaccggga atatgactgc 720
aaggacatga gcgatgaagt tggctgcgtt aatgtgacac tctgcgaggg acccaacaag 780
ttcaagtgtc acagcggcga atgcatcacc ctggacaaag tctgcaacat ggctagagac 840
tgccgggact ggtcagatga acccatcaaa gagtgcggga ccaacgaatg cttggacaac 900
aacggcggct gttcccacgt ctgcaatgac cttaagatcg gctacgagtg cctgtgcccc 960
gacggcttcc agctggtggc ccagcgaaga tgcgaagata tcgatgagtg tcaggatccc 1020
gacacctgca gccagctctg cgtgaacctg gagggtggct acaagtgcca gtgtgaggaa 1080
ggcttccagc tggaccccca cacgaaggcc tgcaaggctg tgggctccat cgcctacctc 1140
ttcttcacca accggcacga ggtcaggaag atgacgctgg accggagcga gtacaccagc 1200
ctcatcccca acctgaggaa cgtggtcgct ctggacacgg aggtggccag caatagaatc 1260
tactggtctg acctgtccca gagaatgatc tgcagcaccc agcttgacag agcccacggc 1320
gtctcttcct atgacaccgt catcagcaga gacatccagg cccccgacgg gctggctgtg 1380
gactggatcc acagcaacat ctactggacc gactctgtcc tgggcactgt ctctgttgcg 1440
gataccaagg gcgtgaagag gaaaacgtta ttcagggaga acggctccaa gccaagggcc 1500
atcgtggtgg atcctgttca tggcttcatg tactggactg actggggaac tcccgccaag 1560
atcaagaaag ggggcctgaa tggtgtggac atctactcgc tggtgactga aaacattcag 1620
tggcccaatg gcatcaccct agatctcctc agtggccgcc tctactgggt tgactccaaa 1680
cttcactcca tctcaagcat cgatgtcaac gggggcaacc ggaagaccat cttggaggat 1740
gaaaagaggc tggcccaccc cttctccttg gccgtctttg aggacaaagt attttggaca 1800
gatatcatca acgaagccat tttcagtgcc aaccgcctca caggttccga tgtcaacttg 1860
ttggctgaaa acctactgtc cccagaggat atggttctct tccacaacct cacccagcca 1920
agaggagtga actggtgtga gaggaccacc ctgagcaatg gcggctgcca gtatctgtgc 1980
ctccctgccc cgcagatcaa cccccactcg cccaagttta cctgcgcctg cccggacggc 2040
atgctgctgg ccagggacat gaggagctgc ctcacagagg ctgaggctgc agtggccacc 2100
caggagacat ccaccgtcag gctaaaggtc agctccacag ccgtaaggac acagcacaca 2160
accacccgac ctgttcccga cacctcccgg ctgcctgggg ccacccctgg gctcaccacg 2220
gtggagatag tgacaatgtc tcaccaagct ctgggcgacg ttgctggcag aggaaatgag 2280
aagaagccca gtagcgtgag g 2301
<210> 65
<211> 2085
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 65
atgggcaccc actgctctgc gtggctgcgg tggccgctgt tgccgctgtt gccgccgctg 60
ctgctgctgt tgctgctact gtgccccacc ggcgctggtg cccaggacga ggatggagat 120
tatgaagagc tgatgctcgc cctcccgtcc caggaggatg gcctggctga tgaggccgca 180
catgtggcca ccgccacctt ccgccgttgc tccaaggagg cctggaggct gccaggaacc 240
tacattgtgg tgctgatgga ggagacccag aggctacaga ttgaacaaac tgcccaccgc 300
ctgcagaccc gggctgcccg ccggggctat gtcatcaagg ttctacatat cttttatgac 360
ctcttccctg gcttcttggt gaagatgagc agtgacctgt tgggcctggc cctgaagttg 420
ccccatgtgg agtacattga ggaagactcc tttgtcttcg cccagagcat cccatggaac 480
ctggagcgaa ttatcccagc atggcaccag acagaggaag accgctcccc tgatggaagc 540
agccaggtgg aggtgtatct cttagatacc agcatccagg gtgcccatcg ggagattgag 600
ggcagggtca ccatcaccga cttcaacagc gtgccggagg aggatgggac acgcttccac 660
agacaggcga gcaagtgtga cagccacggc acccacctgg caggtgtggt cagcggccgg 720
gatgctggtg tggccaaggg caccagcctg cacagcctgc gtgtgctcaa ctgtcaaggg 780
aagggcacag tcagcggcac cctcataggc ctggagttta ttcggaagag tcagctaatc 840
cagccctcgg ggccactcgt ggttctgctg cccctggccg gtgggtatag ccgcatcctc 900
aacgctgcct gccggcacct ggcgaggact ggggtggtgc tggttgcagc agctgggaac 960
ttccgggacg acgcctgcct ctactcccca gcttctgctc cagaggtcat cacagtcggg 1020
gccacgaatg cccaggacca gccagttacc ttggggactt tggggactaa ttttggacgc 1080
tgtgtggatc tctttgcccc cgggaaggac atcatcggag cgtccagtga ctgcagcaca 1140
tgcttcatgt cacagagtgg gacctcacag gctgctgccc acgtggccgg cattgtggct 1200
cggatgctga gccgggagcc cacacttacc ctggccgagc tgcggcagag gctgatccac 1260
ttctctacca aagacgtcat caacatggcc tggttccctg aggaccagca ggtgctgacc 1320
cccaacctgg tggccacact gccccccagc acccatgaga caggcgggca gctgctctgt 1380
aggacggtgt ggtcggcaca ctcggggccc actcgaacag ctacagctac agcccgctgt 1440
gccccagaag aggagctgct gagctgctcc agcttctcca ggagcgggag gcgtcgtggt 1500
gattggattg aggccatagg aggccagcag gtctgcaagg ccctcaatgc atttgggggt 1560
gagggtgtct atgccgtcgc gagatgctgc ctggttcccc gtgccaactg cagcatccac 1620
aacacccctg cagccagagc tggcctggag acccatgtcc actgccacca gaaggaccat 1680
gttctcacag gctgcagctt ccattgggaa gtggaagacc ttagtgtccg gaggcagcct 1740
gcgctgaggt ccagacgtca gcctggccag tgcgttggcc accaggcggc cagtgtctat 1800
gcttcctgct gccatgcccc agggctggaa tgcaaaatca aggagcatgg gatctcaggt 1860
ccttcagagc aggtcactgt ggcctgcgaa gcaggatgga ccctgactgg atgcaatgtg 1920
ctccctgggg catccctcac tctgggagcc tacagcgtgg acaacctgtg tgtggcaaga 1980
gtccatgaca ctgccagagc agacaggacc agtggagaag ccacagtagc tgctgccatc 2040
tgctgccgga gccggccttc agcaaaggcc tcctgggttc agtga 2085
<210> 66
<211> 990
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
gcttcgacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaagc cgcgggggga 360
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgcgaggag 720
atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 990
<210> 67
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 68
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60
ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120
tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180
agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240
aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300
agcttcaaca ggggagagtg ttga 324
<210> 69
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 70
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 70
gtgtattact gtgcgagann nnnnnnnnnt ataactacta ctactac 47
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<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(30)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 71
attactatgg ttcggggagt nnnnnnnnnn tggggccaag ggaccacg 48
<210> 72
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 72
attttgcaac ttattactgc nnnnnnnnnt ttggccaggg gaccaagc 48
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<211> 21
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Tyr Gly Met Asp Val
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Tyr Gly Met Asp Val
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Tyr Gly Met Asp Val
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Tyr Gly Met Asp Val
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Tyr Gly Met Asp Val
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Tyr Gly Met Asp Val
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Tyr Gly Met Asp Val
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1 5 10 15
Tyr Gly Met Asp Val
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
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Ser Ser
130
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
115 120 125
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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100 105 110
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115 120 125
Ser Ser
130
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<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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100 105 110
Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser
130
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 95
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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100 105 110
Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser
130
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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100 105 110
Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Asp Ser Gly Arg Tyr Asn Tyr
100 105 110
Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser
130
<210> 100
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gln Glu Gly Ser Tyr Asn Tyr
100 105 110
Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser
130
<210> 101
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Thr Glu Gly Gly Tyr Asn Tyr
100 105 110
Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser
130
<210> 102
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Thr Glu Gly Ser Tyr Asn Tyr
100 105 110
Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser
130
<210> 103
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Ala Asp Gly Gly Tyr Asn Tyr
100 105 110
Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser
130
<210> 104
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 104
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gln Asp Gly Asn Tyr Asn Tyr
100 105 110
Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser
130
<210> 105
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 105
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gln Asp Gly Lys Tyr Asn Tyr
100 105 110
Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser
130
<210> 106
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 106
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Gly Thr Tyr Tyr Thr Gly Met Gly Glu Tyr Asn Tyr
100 105 110
Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser
130
<210> 107
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 107
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Ala Asp Gly Asp Tyr Asn Tyr
100 105 110
Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser
130
<210> 108
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 108
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Ala Ser Gly Lys Tyr Asn Tyr
100 105 110
Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser
130

Claims (17)

1.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含：
具有SEQ ID NO：38的多肽序列的LCDR1；
具有SEQ ID NO：39的多肽序列的LCDR2；
具有SEQ ID NO：40的多肽序列的LCDR3；
具有SEQ ID NO：34的多肽序列的HCDR1；
具有SEQ ID NO：35的多肽序列的HCDR2；和
具有选自下组的多肽序列的HCDR3：SEQ ID NOs：36和73-90。
其中，所述的抗体或其抗原结合片段结合PCSK9。
2.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含具有以下多肽序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3：
分别为SEQ ID NOs:6、7、8、2、3、和4；
分别为SEQ ID NOs:14、15、16、10、11、和12；
分别为SEQ ID NOs:22、23、24、18、19、和20；
分别为SEQ ID NOs:30、31、32、26、27、和28；或
分别为SEQ ID NOs:46、47、48、42、43、和44；
其中，所述的抗体或其抗原结合片段结合PCSK9。
3.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含具有与SEQ ID NO：33至少85％同源的多肽序列的重链可变区，和具有与SEQ ID NO：37至少85％同源的多肽序列的轻链可变区。
4.如权利要求1-3中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含一重链可变区，所述的重链可变区具有与选自下组的序列至少95％同源的多肽序列：SEQ IDNOs：1、9、17、25、33、41和91-108；和一轻链可变区，所述的轻链可变区具有分别与选自下组的序列至少95％同源的多肽序列：SEQ ID NOs：5、13、21、29、37和45。
5.如权利要求1-4中任一项所述的分离的单克隆抗体或抗原结合片段，其包含：
a.具有选自下组的多肽序列的重链可变区：SEQ ID NOs：33和91-108，和具有SEQ IDNo：37的多肽序列的轻链可变区；
b.具有SEQ ID NO：1的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID No：5的多肽序列的轻链可变区；
c.具有SEQ ID NO：9的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID No：13的多肽序列的轻链可变区；
d.具有SEQ ID NO：17的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID No：21的多肽序列的轻链可变区；
e.具有SEQ ID NO：25的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID No：29的多肽序列的轻链可变区；或
f.具有SEQ ID NO：41的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID No：45的多肽序列的轻链可变区。
6.如权利要求1至5中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述的抗体或其抗原结合片段是嵌合的。
7.如权利要求1至6中任一项所述的分离的单克隆抗体或抗原结合片段，其中，所述的抗体或其抗原结合片段是人的。
8.如权利要求7所述的分离的单克隆抗体或抗原结合片段，其包含人重链IgG1恒定区和人抗体轻链κ恒定区恒定区。
9.一种分离的编码权利要求1至8中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段的核酸。
10.一种包含权利要求9所述的分离的核酸的载体。
11.一种包含权利要求9所述的核酸的宿主细胞。
12.一种药物组合物，其包含权利要求1至8中任一项所述的分离的单克隆抗体或抗原结合片段，和药学上可接受的载体。
13.一种在有需要的受试者中阻断PCSK9与LDLR结合、或增加LDL摄取的方法，其包括向所述受试者施用权利要求12所述的药物组合物。
14.一种在有需要的受试者中治疗脂类疾病、障碍或病症，代谢性疾病、障碍或病症，炎症性疾病、障碍或病症，感染性疾病、障碍或病症的方法，其包括向所述受试者施用权利要求12所述的药物组合物。
15.一种在有需要的受试者中治疗血脂异常、代谢性疾病或炎症性疾病的方法，其包括向所述受试者施用权利要求12所述的药物组合物，其中，所述的血脂异常、代谢性疾病或炎症性疾病选自下组：高脂血症、原发性高脂血症、脂代谢紊乱、混合性脂代谢紊乱、纯合子型家族性高胆固醇血症和脓毒症。
16.一种制备权利要求1至8中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，包括在一定条件下培养包含编码单克隆抗体或抗原结合片段的核酸的细胞，以产生单克隆抗体或抗原结合片段，并从细胞或细胞培养物中回收抗体或抗原结合片段。
17.一种制备包含权利要求1至8中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段的药物组合物的方法，包括将所述单克隆抗体或抗原结合片段与药学上可接受的载体组合，以获得所述药物组合物。
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