CN105330739A

CN105330739A - 与人血管内皮生长因子特异性结合的抗体或其抗原结合片段及其用途

Info

Publication number: CN105330739A
Application number: CN201410395240.6A
Authority: CN
Inventors: 张发明; 席甘; 黄莺; 吴炯; 林峰
Original assignee: Waterstone Pharmaceuticals Wuhan Co Ltd
Current assignee: Sino Us Huashitong Biomedical Technology Wuhan Co ltd
Priority date: 2014-08-12
Filing date: 2014-08-12
Publication date: 2016-02-17
Anticipated expiration: 2034-08-12
Also published as: CN105330739B

Abstract

本发明提出了能够特异性与人血管内皮生长因子结合的抗体或其抗原结合片段及其用途。该抗体或其抗原结合片段包括：具有下列至少之一氨基酸序列的重链可变区：(1)SEQ？ID？NO：1所示的氨基酸序列，(2)SEQ？ID？NO：2所示的氨基酸序列，(3)SEQ？ID？NO：3所示的氨基酸序列，(4)与(1)～(3)相比具有一个以上氨基酸保守突变的氨基酸序列。根据本发明实施例的抗体或其抗原结合片段，能够特异性识别人血管内皮生长因子，并且能够有效地阻断人血管内皮生长因子与其受体的结合，进而阻断人血管内皮生长因子受体例如VEGFR1或2的相关信号通路，从而可以有效地抑制肿瘤的增长。

Description

与人血管内皮生长因子特异性结合的抗体或其抗原结合片段及其用途

技术领域

本发明涉及生物医药领域，更具体的，本发明涉及与人血管内皮生长因子特异性结合的抗体或其抗原结合片段及其用途。进一步，本发明涉及与人血管内皮生长因子特异性结合的抗体或其抗原结合片段、分离的多核苷酸、制备该抗体或其抗原结合片段的方法、杂交瘤、杂交瘤在制备单克隆抗体中的用途、包含该抗体或其抗原结合片段、该多核苷酸或该杂交瘤的药物组合物、用于鉴定能够与人血管内皮生长因子结合的药物的方法、药物联合。

背景技术

1971年Folkman首先观察到当肿瘤体积超过1-2mm³，需要新血管的形成来维持生长，从而最早提出肿瘤生长是血管依赖性的，并指出抗血管生成是控制肿瘤生长的新途径。已有研究表明，几乎所有实体瘤的生长和转移都依赖于肿瘤新血管的生成。

1989年FerraraN发现了血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)，后来被证明是目前发现的最重要的血管形成因子之一，在肿瘤的血管生长中发挥着重要作用。对肿瘤的浸润和转移有重要影响，在肿瘤的血管发生过程中发挥极其重要的作用。VEGF既可以用于肿瘤治疗的理想靶点，也可以作为进行肿瘤诊断和判断预后的标志物。VEGF是相对分子质量34000-42000Da的高度糖基化碱性同源二聚体糖蛋白，其编码基因位于染色体的6q21.3，全长14kb，含有8个外显子和7个内含子，可形成9种异构体，主要包括VEGF121、VEGF165、VEGF189和VEGF206。其中多数组织以表达VEGF165为主。

VEGF和VEGFR2之间的结合是肿瘤血管生成的关键，阻断他们之间的“同形体”则抑制肿瘤血管生成。抗VEGFR2抗体对比贝伐单抗，可同时阻断VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E的作用，具有更有效的抗血管生成效果，因而对肿瘤在体内转移具有特别抑制性。

然而，目前特异性识别VEGF的抗体仍有待改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够特异性与人血管内皮生长因子结合的抗体或其抗原结合片段及其用途。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种与人血管内皮生长因子(huVEGF，在本文中如无特别说明，VEGF指的是人血管内皮生长因子)特异性结合的抗体或其抗原结合片段。根据本发明的实施例，该抗体或其抗原结合片段包括：具有下列至少之一氨基酸序列的重链可变区：(1)SEQIDNO：1所示的氨基酸序列(GYTFTNYGLN)，(2)SEQIDNO：2所示的氨基酸序列(WINTYTGEPTYADDFKG)，(3)SEQIDNO：3所示的氨基酸序列(YGITYEWYFDV)，(4)与(1)～(3)相比具有一个以上氨基酸保守突变的氨基酸序列。序列可以包含某些生物学功能等同的氨基酸或“保守性替代”，其它序列可以包含功能非等同的氨基酸或“非保守性替代”，其经基因工程改造以改进CDR或含CDR抗体的特性。

根据本发明的实施例，该抗体或其抗原结合片段可以进一步包括：具有下列至少之一氨基酸序列的轻链可变区：(5)SEQIDNO：4所示的氨基酸序列(RASQDISNSLN)，(6)SEQIDNO：5所示的氨基酸序列(YTSRLHS)，(7)SEQIDNO：6所示的氨基酸序列(QQGNTFPWT)，(8)与(5)～(6)相比具有一个以上氨基酸保守突变的氨基酸序列。

根据本发明的实施例，该抗体或其抗原结合片段的所述重链可变区具有如SEQIDNO：7所示的氨基酸序列(EVKLQESGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGLNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDMATYFCAKYGITYEWYFDVWGAGTTVTVSS)。

根据本发明的实施例，该抗体或其抗原结合片段的所述轻链可变区具有如SEQIDNO：8所示的氨基酸序列(DIVLTQSTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNSLNWYQQKPNGTVILLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGAVYSLTISDLEQEDIATYFCQQGNTFPWTFGGGTKLEIKR)。

根据本发明的实施例，该抗体或其抗原结合片段的所述抗体为单克隆抗体。

根据本发明的实施例，所述抗体为单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、人源化抗体或其衍生物。

发明人意外发现，根据本发明实施例的抗体或其抗原结合片段，能够特异性识别人血管内皮生长因子，并且能够有效地阻断人血管内皮生长因子与其受体的结合，进而阻断人血管内皮生长因子受体例如VEGFR1或2的相关信号通路，从而可以有效地抑制肿瘤的增长。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种分离的多核苷酸，根据本发明的实施例，该多核苷酸编码前面所述的抗体或其抗原结合片段。

根据本发明的实施例，前面所描述的多核苷酸，包含：重链可变区编码序列，所述重链可变区编码序列具有如SEQIDNO：9所示的核苷酸序列或其互补序列(gaagtcaagctgcaggagtctggacctgagctgaagaagcctggagagacagtcaagatctcctgcaaggcttctgggtataccttcacaaactatggactgaactgggtgaagcaggctccaggaaagggtttaaagtggatgggctggataaacacctacactggagagccaacatatgctgatgacttcaagggacggtttgccttctctttggaaacctctgccagcactgcctatttgcagatcaacaacctcaaaaacgaggacatggctacatatttctgtgcaaagtacggtattacctatgagtggtacttcgatgtctggggcgcagggaccacggtcaccgtctcctca)；和/或轻链可变区编码序列，所述轻链可变区编码序列具有如SEQIDNO：10所示的核苷酸序列或其互补序列(gacattgtgctcacacagtctacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagcaattctttaaactggtatcagcaaaaaccaaatggaactgttatactcctgatctactacacatcaagattgcactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggagcagtttattctctcaccattagcgacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgtttccgtggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaacgg)。

发明人发现，通过采用根据本发明的多核苷酸，能够有效地合成根据本发明实施例的特异性识别人血管内皮生长因子的抗体或其抗原结合片段。关于特异性识别人血管内皮生长因子的抗体或其抗原结合片段，前面所描述的特征和优点同样适用该多核苷酸，在此不再赘述。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种制备前面所述的抗体或其抗原结合片段的方法。根据本发明的实施例，包括：使宿主细胞表达前面所述的多核苷酸。

发明人发现，通过采用根据本发明的方法，能够利用前面所述的多核苷酸有效地合成根据本发明实施例的特异性识别人血管内皮生长因子的抗体或其抗原结合片段。关于特异性识别人血管内皮生长因子的抗体或其抗原结合片段，前面所描述的特征和优点同样适用该方法，在此不再赘述。

在本发明的第四方面，本发明提出了一种杂交瘤(杂交瘤细胞株WS006)，其以保藏号CCTCC：C2014111，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏时间：2014年6月10日。发明人发现，通过采用根据本发明的杂交瘤，能够有效地合成根据本发明实施例的特异性识别人血管内皮生长因子的抗体或其抗原结合片段。关于特异性识别人血管内皮生长因子的抗体或其抗原结合片段，前面所描述的特征和优点同样适用该杂交瘤，在此不再赘述。

在本发明的第五方面，本发明提出了前面所述的杂交瘤在制备单克隆抗体中的用途。

明人发现，通过采用根据本发明的杂交瘤，能够有效地合成根据本发明实施例的特异性识别人血管内皮生长因子的抗体或其抗原结合片段。关于特异性识别人血管内皮生长因子的抗体或其抗原结合片段，前面所描述的特征和优点同样适用该多用途，在此不再赘述。

在本发明的第六方面，本发明提出了前面所述的抗体或其抗原结合片段、前面的多核苷酸、或前面所述的杂交瘤在制备药物中的用途，所述药物用于治疗癌症或者抑制肿瘤增殖。任选的，所述癌症为黑色素瘤或肺癌。

在本发明的第七方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，该药物组合物包含前面所述的抗体或其抗原结合片段、前面的多核苷酸、或前面所述的杂交瘤。

在本发明的第八方面，一种用于鉴定能够与人血管内皮生长因子结合的药物的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：

在候选药物存在时，使前面所述的抗体或其抗原结合片段与抗原接触，并且确定所述抗体或其抗原结合片段与所述抗原的第一结合量，其中，所述抗原为人血管内皮生长因子或其片段；以及

在不存在所述候选药物时，使前面所述的抗体或其抗原结合片段与抗原接触，并且确定所述抗体或其抗原结合片段与所述抗原的第二结合量，其中，所述抗原为人血管内皮生长因子或其片段，

其中，所述第二结合量大于所述第一结合量是候选药物能够与人血管内皮生长因子结合的指示。

由此，通过采用该方法，能够筛选与人血管内皮生长因子结合的候选药物。

在本发明的第九方面，本发明提出了一种药物联合。根据本发明的实施例，该药物联合包括：

(1)前面所述的抗体或其抗原结合片段、前面的多核苷酸、或前面所述的杂交瘤；以及

(2)与(1)不同的癌症治疗药物。

根据本发明的实施例，所述癌症为黑色素瘤或肺癌，所述与(1)不同的癌症治疗药物包括选自下列的至少之一：放疗剂、抗血管发生试剂如制管张素、抑内皮素促血管生成素、诱导凋亡试剂和抗微管蛋白药物如秋水仙素、紫杉醇和长春花碱。由此通过将本发明前面所述的抗体或其抗原结合片段、前面的多核苷酸、或前面所述的杂交瘤与放疗剂、抗血管发生试剂如制管张素、抑内皮素促血管生成素、诱导凋亡试剂和抗微管蛋白药物如秋水仙素、紫杉醇和长春花碱中的任意药物组合使用可以显著提高治疗效果，发挥药物之间的协同增效作用，提高抗体或其抗原结合片段与VEGF的特异性结合。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1为根据本发明一个实施例，间接ELISA法测定单克隆抗体的相对亲和力的图谱；

图2为根据本发明一个实施例，测定单克隆抗体对VEGF与其受体VEGFR1结合的阻抗作用的图谱；

图3为根据本发明一个实施例，测定单克隆抗体对VEGF与其受体VEGFR2结合的阻抗作用的图谱；

图4为根据本发明一个实施例，HuVEC增殖一致法测定单克隆抗体拮抗VEGF的能力的图谱；

图5为根据本发明一个实施例，NevegiMab对A549肿瘤形成的抑制作用的图谱；

图6为根据本发明一个实施例，NevegiMab对黑色素瘤形成的抑制作用的图谱。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，需要说明的是下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。另外，如果没有明确说明，在下面的实施例中所采用的所有试剂均为市场上可以购得的，或者可以按照文本或已知的方法合成的，对于没有列出的反应条件，也均为本领域技术人员容易获得的。

实施例1小鼠单克隆抗体的制备和筛选

(1)小鼠的免疫

HuVEGF₁₆₅氨基酸序列为：

MGWSCIILFLVATGVHSAPMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCECRPKKDRARQENPCGPCSERRKHLFVQDPQTCKCSCKNTDSRCKARQLELNERTCRCDKPRRHHHHHH

将huVEGF₁₆₅蛋白溶解在l×PBS中得到蛋白溶液。取适量的蛋白溶液，利用弗氏完全佐剂(Sigma)混匀乳化，取8周龄的BALB/c雌鼠，皮下多点注射抗原。2周后，取适量的蛋白溶液与弗氏不完全佐剂(Sigma)混匀乳化，在小鼠的皮下，进行第二次免疫。以后每隔3周，进行第三、四次免疫。第四次免疫后3天，取脾脏进行细胞融合。

(2)细胞融合

从免疫小鼠内收获脾细胞，将处于对数生长期的Sp2/0骨髓瘤细胞分别与该脾细胞悬液按1：10-100比例混合，加入聚乙二醇使细胞彼此融合，在两种细胞的混合细胞悬液中滴加培养液，以HAT选择性培养基进行细胞培养。

(3)阳性克隆的筛选

待融合的细胞培养至第5-10天时，吸取96孔培养板的孔中出现克隆细胞簇的培养上清用酶联免疫吸附实验方法检测抗体含量，经有限稀释进行三次亚克隆筛选，依抗体的分泌情况筛选出高效价的抗体分泌孔，将孔中细胞扩大培养，然后进行抗原特异性免疫组织化学原位测定，选高效价，高特异性的细胞株，命名为NevegiMab，其所产生的抗体称为NevegiMab抗体。

4)单克隆抗体免疫球蛋白重链和轻链类型的鉴定

取杂交瘤细胞株培养上清，采用RapidELISAMousemAbIsotypingKit(Pierce公司)利用ELISA法测定抗体重链、轻链类型。经鉴定，NevegiMab抗体亚型为IgG1/kappa。

5)单克隆抗体可变区序列的获得

利用Trizol(Invitrogen)法提取杂交瘤细胞株NevegiMab的总RNA，然后用oligo-dT引物和SuperScriptⅡReverseTranscriptase(lnvitrogen)反转录成cDNA。经PCR扩增获得抗体重链和轻链的DNA片段，连于克隆载体，挑取克隆进行测序。

测序结果如下所示：

重链氨基酸序列如SEQIDNO：7所示，

(EVKLQESGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGLNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDMATYFCAKYGITYEWYFDVWGAGTTVTVSS)。

轻链氨基酸序列如SEQIDNO：8所示，

(DIVLTQSTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNSLNWYQQKPNGTVILLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGAVYSLTISDLEQEDIATYFCQQGNTFPWTFGGGTKLEIKR)。

其中，

重链可变区具有含有如下氨基酸序列的三个高变区的重链可变区：CDRH1(SEQIDNO：1：GYTFTNYGLN)，CDRH2(SEQIDNO：2：WINTYTGEPTYADDFKG)，CDRH3(SEQIDNO：3：YGITYEWYFDV)。

轻链可变区具有含有如下氨基酸序列的三个高变区：CDRL1(SEQIDNO：4：RASQDISNSLN)，CDRL2(SEQIDNO：5：YTSRLHS)，CDRL3(SEQIDNO：6：QQGNTFPWT)。

其重链核苷酸序列如SEQIDNO：9所示(gaagtcaagctgcaggagtctggacctgagctgaagaagcctggagagacagtcaagatctcctgcaaggcttctgggtataccttcacaaactatggactgaactgggtgaagcaggctccaggaaagggtttaaagtggatgggctggataaacacctacactggagagccaacatatgctgatgacttcaagggacggtttgccttctctttggaaacctctgccagcactgcctatttgcagatcaacaacctcaaaaacgaggacatggctacatatttctgtgcaaagtacggtattacctatgagtggtacttcgatgtctggggcgcagggaccacggtcaccgtctcctca)；其轻链核苷酸序列如SEQIDNO：10所示(gacattgtgctcacacagtctacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagcaattctttaaactggtatcagcaaaaaccaaatggaactgttatactcctgatctactacacatcaagattgcactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggagcagtttattctctcaccattagcgacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgtttccgtggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaacgg)。

6)单克隆抗体的纯化

单抗NevegiMab采用Hi-TrapproteinAHP(GEHealthcare)亲和层析柱从杂交瘤细胞上清中纯化，SDS-PAGE电泳证明所得产物纯度大于90％。纯化后的NevegiMab直接用于后续实验。

实施例2小鼠单克隆抗体特性测定

1)间接ELISA法测定单克隆抗体的相对亲和力

用0.5μg/ml的huVEGF标准品包被酶标板，每孔100μl。37摄氏度温育2小时，用含1％Tween-20的PBS洗涤后，封闭2小时。将单抗NevegiMab以起始浓度为1μg/ml做三倍稀释，以商品化贝伐单抗(avastin)作为比对，37摄氏度温育1小时。5次洗涤后，分别加入100μlHRP标记的相应二抗，37摄氏度温育1小时。5次洗涤后，加入50μl显色液，37摄氏度温育15分钟，50μl2M硫酸终止反应，OD₄₅₀读数。

经过四参数拟合后(OriginPro8)，NevegiMab的EC₅₀为20pM，Avastin的EC₅₀为190pM。EC₅₀值指酶催化反应中半数抑制剂的浓度，通过ELISA方法测得样品和对照品的EC₅₀值，可以用来比较其与抗原rh-VEGF₁₆₅结合活性的大小，进而得到样品和对照品与抗原结合程度的大小。所得EC₅₀值越小与抗原结合程度越高。

表1间接ELISA法测定单克隆抗体NevegiMab的相对亲和力

复孔1	复孔2	(ng/ml)	浓度对数	OD平均
					3.533	3.44	400	2.60	3.49
3.335	3.311	80	1.90	3.32
					3.001	2.902	16	1.20	2.95
1.827	1.916	3.2	0.51	1.87
					0.572	0.614	0.64	-0.19	0.59
0.208	0.214	0.128	-0.89	0.21
					0.132	0.135	0.0256	-1.59	0.13
0.115	0.118	0.00512	-2.29	0.12

2)单克隆抗体的特异性检测

分别用huVEGF和鼠VEGF各0.5μg/ml包板，4摄氏度过夜；分别加入NevegiMab和avastin单抗溶液100μl/孔，37摄氏度温育1小时。洗涤后，分别加入100μlHRP标记的相应二抗，37摄氏度温育1小时。洗涤后，加入50μl显色液，37摄氏度温育15分钟，50μl2M硫酸终止反应，OD₄₅₀读数。

结果见下表2。

表2单克隆抗体的特异性检测

NevegiMab	Avastin
		不反应	不反应

可见，NevegiMab和avastin均与huVEGF反应，不与鼠VEGF反应。

3)单克隆抗体作用表位的初步分析

竞争ELISA法测定NevegiMab同Avastin的抗原表位是否重合：往包被人VEGF抗原的酶标板上加入初始浓度为2μg/ml的NevegiMab，3倍稀释，同时加入或不加入浓度为20μg/mlAvastin。最终根据OD₄₅₀读数判断NevegiMab同Avastin的决定簇是否相同。结果见表3。

表3竞争ELISA法分析NevegiMab同Avastin的抗原表位

Avastin的存在严重影响了NevegiMab与VEGF的结合，说明NevegiMab和Avastin针对huVEGF的抗原表位有重叠。

4)ELISA法测定NevegiMab对huVEGF与其受体VEGFR1结合的阻抗作用

用100ng/mlhuVEGF包板后，加入初始浓度为300ng/ml的VEGFR1，3倍稀释，同时加入或不加入浓度为3μg/mlAvastin或NevegiMab。OD₄₅₀读数后，分析单克隆抗体对huVEGF与其受体VEGFR1结合的阻抗作用。结果见附图2。

如附图2所示，OD₄₅₀读数越低，说明单克隆抗体对huVEGF与VEGFR1结合的阻抗越明显。结果显示在同等单克隆抗体浓度下，NevegiMab比Avastin有更高的抑制huVEGF与VEGFR1结合的能力。

5)ELISA法测定NevegiMab对huVEGF与其受体VEGFR2结合的阻抗作用

用500ng/mlhuVEGF包板后，加入初始浓度为2μg/ml的VEGFR2，3倍稀释，同时加入或不加入浓度为500ng/mlAvastin或NevegiMab。OD₄₅₀读数后，分析单克隆抗体对huVEGF与其受体VEGFR2结合的阻抗作用。结果见附图3。

如附图3所示，OD₄₅₀读数越低，说明单克隆抗体对huVEGF与VEGFR1结合的阻抗越明显。结果显示在同等单克隆抗体浓度下，NevegiMab比Avastin有更高的抑制huVEGF与VEGFR2结合的能力。

实施例3小鼠单克隆抗体的活性研究

1)HuVEC增殖一致法测定抗体拮抗VEGF生物学活性的能力

取生长状态良好的人脐静脉内皮细胞(HuVEC)，调整细胞浓度为5×10⁴/ml，接种于96孔细胞培养板，100μl/孔，于孵箱中培养24h后，换0.5％血清含量的培养基，继续培养72h，加入不同浓度梯度的VEGF抗体，每个浓度取3个平行孔，加入终浓度为100ng/ml的huVEGF₁₆₅，培养24h后，用化学发光试剂盒检测。结果如附图4所示。

如附图4所示，Lum读数越低，说明单克隆抗体对细胞增殖的抑制越明显。结果显示在同等单克隆抗体浓度下，NevegiMab比Avastin有更高的抑制HuVEC细胞增殖的能力。

实施例4小鼠单克隆抗体的体内抗肿瘤活性研究

在小鼠肿瘤模型实验中，抗huVEGF单抗对小鼠植入形成的肿瘤呈明显的抑制作用。

1)NevegiMab对肺癌A549肿瘤的抑制

在裸鼠皮下注射对数生长期的A549细胞2×10⁶个细胞，一周后，用游标卡尺测量肿瘤长半径(a)，短半径(b)，并开始给药，以后每3天给药一次并在给药前测量一次，计算肿瘤体积(V)＝1/2ab²。VEGF单抗的给药为25μg，50μg和100μg三个浓度。结果总结如附图5所示。

2)NevegiMab对黑色素瘤的抑制

在C57BL/6小鼠皮下注入2×10⁵个黑色素瘤细胞B16F10，5天成瘤后，开始按实验1方式给药，测量肿瘤体积。如附图6所示。

这两个实验证明NevegiMab单抗对肿瘤尤其是黑色素瘤和肺癌肿瘤产生明显抑制作用。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims

1.一种与人血管内皮生长因子特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，包括：

具有下列至少之一氨基酸序列的重链可变区：

(1)SEQIDNO：1所示的氨基酸序列，

(2)SEQIDNO：2所示的氨基酸序列，

(3)SEQIDNO：3所示的氨基酸序列，

(4)与(1)～(3)相比具有一个以上氨基酸保守突变的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，进一步包括：

具有下列至少之一氨基酸序列的轻链可变区：

(5)SEQIDNO：4所示的氨基酸序列，

(6)SEQIDNO：5所示的氨基酸序列，

(7)SEQIDNO：6所示的氨基酸序列，

(8)与(5)～(6)相比具有一个以上氨基酸保守突变的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区具有如SEQIDNO：7所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述轻链可变区具有如SEQIDNO：8所示的氨基酸序列。

5.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体。

6.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体为单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、人源化抗体或其衍生物。

7.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1～7任一项所述的抗体或其抗原结合片段。

8.根据权利要求7所述的多核苷酸，其特征在于，包含：

重链可变区编码序列，所述重链可变区编码序列具有如SEQIDNO：9所示的核苷酸序列或其互补序列；和/或

轻链可变区编码序列，所述轻链可变区编码序列具有如SEQIDNO：10所示的核苷酸序列或其互补序列。

9.一种制备权利要求1～6任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其特征在于，包括：

使宿主细胞表达权利要求7或8所述的多核苷酸。

10.一种杂交瘤，其以保藏号CCTCC：C2014111，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏时间：2014年6月10日。

11.权利要求10所述的杂交瘤在制备单克隆抗体中的用途。

12.权利要求1～6任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求7或8所述的多核苷酸、或权利要求10所述的杂交瘤在制备药物中的用途，所述药物用于治疗癌症或者抑制肿瘤增殖。

13.根据权利要求12所述的用途，其特征在于，所述癌症为黑色素瘤或肺癌。

14.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1～6任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求7或8所述的多核苷酸、或权利要求10所述的杂交瘤。

15.一种用于鉴定能够与人血管内皮生长因子结合的药物的方法，其特征在于，包括：

在候选药物存在时，使权利要求1～6任一项所述的抗体或其抗原结合片段与抗原接触，并且确定所述抗体或其抗原结合片段与所述抗原的第一结合量，其中，所述抗原为人血管内皮生长因子或其片段；以及

在不存在所述候选药物时，使权利要求1～6任一项所述的抗体或其抗原结合片段与抗原接触，并且确定所述抗体或其抗原结合片段与所述抗原的第二结合量，其中，所述抗原为人血管内皮生长因子或其片段，

其中，所述第二结合量大于所述第一结合量是所述候选药物能够与人血管内皮生长因子结合的指示。

16.一种药物联合，其特征在于，包括：

(1)权利要求1～6任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求7或8所述的多核苷酸、或权利要求10所述的杂交瘤；以及

(2)与(1)不同的癌症治疗药物。

17.根据权利要求16所述的药物联合，其特征在于，所述癌症为黑色素瘤或肺癌，所述与(1)不同的癌症治疗药物包括选自下列的至少之一：

放疗剂、抗血管发生试剂如制管张素、抑内皮素促血管生成素、诱导凋亡试剂和抗微管蛋白药物如秋水仙素、紫杉醇和长春花碱。