JP2003530095A - Ｇタンパク質共役型受容体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、アデニンに特異性を有するＧタンパク質共役型受容体（アデニン結合ＧＰＣＲ）をコードする核酸、単離されたアデニン結合ＧＰＣＲ、それらを使用するアッセイおよび治療方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野 本発明は、新規の哺乳動物Ｇタンパク質共役型受容体、それをコードする核酸
およびアッセイにおけるその使用に関する。発明の背景 ＧＴＰ結合タンパク質（Ｇタンパク質）は、リガンド、例えばホルモンおよび
その他の化学メディエーターのＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）への結合
と、細胞内エフェクターの活性化との間の媒介体として作用する。ＧＰＣＲへの
リガンドの結合の際、受容体の細胞質ドメインは、受容体とＧタンパク質との相
互作用を可能とし、他方では細胞内中間体、例えばアデニル酸シクラーゼ、ホス
ホリパーゼＣまたはイオンチャンネルの活性化を可能とするコーホーメーション
変化を受ける。ＧＰＣＲにおける単一リガンドの結合に応答して多数の二次メッ
センジャーが産生できるので、かかる系は、当初のシグナルの増幅を可能とする
。この機序を通じて、細胞は、これらの外的環境中の変化を感知および応答でき
る。

【０００２】 Ｇタンパク質共役型受容体は内在性形質膜タンパク質のスーパーファミリーを
形成し、それぞれの受容体は７個の疎水性膜貫通ドメインの共通の特徴を共有し
、そのそれぞれは、２０〜３０アミノ酸長さでありそして種々の長さの親水性ア
ミノ酸配列により連結している。受容体のアミノ末端は細胞外にあり、細胞の細
胞質内に見出されるカルボキシ末端を有する。

【０００３】 ＧＰＣＲは、広範囲の組織および細胞タイプ内に見出されそして多数の異なる
生理学的プロセス内に含まれる。これらは、広範囲のリガンド、例えばホルモン
、例えば黄体刺激ホルモン、濾胞刺激ホルモン、絨毛性性腺刺激ホルモン、チロ
トロピン、アドレノコルチコトロピン、グルカゴンおよびバソプレッシン、神経
伝達物質、例えば５−ＨＴ、アセチルコリン（ムスカリン性ＡｃｈＲ）、ヒスタ
ミン、プロスタグランジン、カルシトニン、ロイコトリエンおよびＣａ²⁺により
活性化される。ＧＰＣＲの広範な分布および各種の役割は、ＧＰＣＲが各種の病
理学的条件において重要な役割を演するであろうことを示す。実際に、ＧＰＣＲ
は、気管支収縮、高血圧、炎症、ホルモン障害、糖尿病、アポトーシス、痛覚(n
ociception) 、神経伝達の促進および振せん障害に関係する疾患に関係すること
が見出されている。

【０００４】 特に重要なＧＰＣＲの一つの群は、ヌクレオチドのための受容体として作用す
るものである。ヌクレオチド受容体は、３ファミリー：Ｐ１、Ｐ２ＹおよびＰ２
Ｘ(Ralevic and Burnstock, 1998 Pharmacological Reviews 50(3);413-492) か
ら構成され、この中で、Ｐ１およびＰ２ＹファミリーがＧＰＣＲである。Ｐ１受
容体はアデノシンにより活性化されそしてアデニンを結合しない(Bruns et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 77(50):5547-51, 1980、Schwabe and Trost, 1
980 Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmocol. 313(3):197-87、Schwabe et al.,
1982 Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmocol. 321(1):84-87) 。Ｐ１受容体ファ
ミリーのメンバーは、アデノシンタイプ１ファミリー、アデノシンタイプ２ファ
ミリーおよびアデノシンタイプ３ファミリーとして知られる３種のサブファミリ
ーに分類される。

【０００５】 Ｐ２Ｙファミリーは、ヌクレオチドにより活性化されるＧＰＣＲの４種のファ
ミリーを含む。詳細には、これらはＰ２Ｙ１（ＡＤＰおよびＡＴＰにより活性化
）、Ｐ２Ｙ（Ｐ２Ｕとも呼ばれ、これらのＧＰＣＲはＡＴＰおよびＵＴＰにより
同等の効力で活性化される）、Ｐ２Ｙ３およびＰ２Ｙ６（相対アゴニスト強さは
、ＵＤＰ＞ＵＴＰ＞ＡＤＰ）およびＰ２Ｙ４（ＵＴＰ＞ＡＴＰ）である。Ｐ２Ｙ
２群に配列相同性を有する多数の他のＧＰＣＲは、最初にはヌクレオチド受容体
とも考えられた（Ｐ２Ｙ５、Ｐ２Ｙ７、Ｐ２Ｙ９およびＰ２Ｙ１０）が、しかし
今ではヌクレオチドにより活性化されないことが分かっている。

【０００６】 Ｐ２Ｘファミリーは、Ｇタンパク質に連結しない無関係なタンパク質の群であ
る。この群のメンバーはリガンド依存性イオンチャンネルである。

【０００７】 Ｇタンパク質共役型受容体は広範囲の細胞および生理学的プロセスにおいてこ
のような重要な役割を演ずるので、かかる受容体の機能および種々の疾患におけ
るこれらの可能な役割を評価することが益々重要となる。発明の要旨 ＧＰＣＲに関する研究の過程で、本発明者らは、ＧＰＣＲの新しい種類を表し
そしてアデニン結合ＧＰＣＲを呼ばれる新規ＧＰＣＲを発見した。ラット内の新
規ＧＰＣＲの配列を従来技術で利用されるものと比較すると、本発明者らは、最
も近縁のＧＰＣＲが新規受容体と約５０％の配列同一性を共有するのみであり、
新規ＧＰＣＲがＧＰＣＲの新しい種類のメンバーを表すと示唆することを意外に
も発見した。さらなる研究は、受容体の天然リガンドがアデニンであることを同
定した。これは、天然リガンドとしてアデニンを有するＧＰＣＲの最初の証明で
あり、このＧＰＣＲがＧＰＣＲの新しい種類を表すことを示唆する。実際、これ
はその自然リガンドとしてアデニンを有するあらゆる種類の受容体の最初の証明
であり、そして、この新規受容体が哺乳動物皮質中に存在することが発見された
ので、神経伝達物質としてのアデニンの最初の発見である。さらなる研究は、受
容体の６種のヒト同族体を同定し、これらも本発明の一部を形成する。

【０００８】 本発明は、アデニン結合Ｇタンパク質共役型受容体を提供する。具体的には、
本発明は、配列番号２または配列番号４の配列を有する単離されたポリペプチド
を提供する。配列番号２または配列番号４の該ポリペプチドのフラグメントであ
るポリペプチドも提供し、該フラグメントは、少なくとも１０、例えば少なくと
も２０、３０、４０、５０、７５、１００または１５０またはそれ以上のアミノ
酸の大きさである。かかるフラグメントは、それぞれ配列番号２または配列番号
４のＮ−末端領域より誘導されてもよい。Ｎ−末端領域を含むフラグメントは、
受容体の細胞外部分を再構成して受容体結合部位を提供するために使用してもよ
い。好ましくは、フラグメントはアデニンを結合する能力を保有する。

【０００９】 別の態様では、本発明は、配列番号２または配列番号４のポリペプチドに少な
くとも５０％そして好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９
５％または９８％の配列同一性を有する単離されたポリペプチドを提供する。か
かるポリペプチドは、望ましくは、アデニンを結合しそして好ましくはアデニン
により活性化できる受容体を形成する能力を保有する。同様に、好ましくはＮ末
端フラグメントを含み、適当な長さの配列番号２または配列番号４のフラグメン
トに少なくとも５０％そして好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、９
０％、９５％または９８％の同一性を有するこれらのポリペプチドの少なくとも
２０アミノ酸のフラグメントであるポリペプチドが提供される。かかるポリペプ
チドは、望ましくは、アデニンを結合しそして好ましくはアデニンにより活性化
できる受容体を形成する能力を保有する。

【００１０】 本発明は、配列番号２または配列番号４のポリペプチドをコードする単離され
た核酸配列も提供する。好ましい局面では、単離された配列は、配列番号１また
は配列番号３のものである。本発明は、配列番号２または配列番号４のポリペプ
チドをコードするＤＮＡ分子も提供する。本発明により、上記の２パラグラフに
記載したポリペプチドをコードする単離された核酸も提供する。さらに該ポリペ
プチドをコードするＤＮＡ分子が提供される。

【００１１】 本発明の核酸は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、６、７、８もしくは
９またはこれらの相補体の核酸配列に少なくとも５０％そして好ましくは少なく
とも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９８％の配列同一性を有
する配列を含んでなる核酸をさらに含む。好ましくは、これらの配列は非特異性
結合を最少化するために制御された条件下で相当な核酸にハイブリダイズする。
好ましくは、ストリンジェントないし中程度にストリンジェントなハイブリダイ
ゼーション条件が好ましい。適当な条件は、例えば、約８０〜９０％同一である
配列の検出のためには、０．２５Ｍ Ｎａ₂ ＨＰＯ₄ 、ｐＨ７．２、６．５％Ｓ
ＤＳ、１０％硫酸デキストラン中、４２□Ｃでの一晩のハイブリダイゼーション
および０．１Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５５□Ｃでの最終洗浄を含む。約
９０％同一を越える配列の検出のためには、適当な条件は、０．２５Ｍ Ｎａ₂
ＨＰＯ₄ 、ｐＨ７．２、６．５％ＳＤＳ、１０％硫酸デキストラン中、６５□Ｃ
での一晩のハイブリダイゼーションおよび０．１Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中
、６０□Ｃでの最終洗浄を含む。

【００１２】 かかる核酸は「全長」ポリペプチドをコードする必要は必ずしもないことが認
められ、従って例えば終止コドンをもたらす置換またはフレームシフト突然変異
のいずれかによりコーディング配列が事前に終止したアデニン結合ＧＰＣＲ遺伝
子の突然変異形を表す核酸を含むであろう。これらも本発明の核酸である。

【００１３】 本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸のフラグメントである核酸
も提供する。一つの局面では、本発明は、本発明のポリペプチドまたはその相補
体をコードする配列の１５〜５０、例えば１５〜３５、１８〜３５、１５〜２４
、１８〜３０、１８〜２１または２１〜２４ヌクレオチドから本質的に成る核酸
プライマーを提供する。

【００１４】 本発明の核酸およびポリペプチドは、疾患を治療するために治療的に使用して
もよい。具体的には、これらは、その病理がプリン受容体における作用に関連す
る疾患、特に本来のアデニン結合ＧＰＣＲの発現の突然変異またはダウンレギュ
ラーションに関連するものを治療するために使用してもよい。特定すると、これ
らは、抗痙攣剤、鎮静剤、催眠剤、降圧剤、抗不整脈剤、陰性変時剤、変動剤お
よび変力剤として、または病理学的振セン障害、運動失調症、または神経伝達の
侵害または促進に関連する疾患の治療に使用されてもよい。さらに、ＣＮＳと関
連する障害への使用の発見と同様に、これらは血小板凝固の阻害剤、心臓血管系
内の血管内皮細胞によるＮＯ産生の促進剤として、胃腸分泌の阻害剤としてまた
はアポトーシス、気管支収縮、血管拡張または炎症と関連する疾患に使用しても
よい。

【００１５】 別の局面では、該核酸の配列を含んでなるベクター、特に本発明の核酸配列に
操作可能に連結するプロモーターを含んでなる発現ベクターが提供される。ベク
ターは、宿主細胞により保持され、そして該細胞内で発現されてもよい。該発現
の後、本発明のポリペプチドを回収してもよい。

【００１６】 別の局面では、本発明は、本発明のポリペプチドの活性を結合または調節する
物質の同定のためのアッセイ方法を提供する。具体的には、ペプチドまたは非ペ
プチドであってもよいかかる分子を上記の治療の方法に使用することをこれは意
図する。

【００１７】 発明者らは最初に、その自然リガンドとしてアデニンを有するある種類の受容
体を同定し、そして、新規の受容体が哺乳動物皮質内に存在することを発見した
ので、発明者らはアデニンを神経伝達物質として開示する最初のものである。従
って、本発明は、アデニン自体および／またはアデニンを模擬またはアンタゴナ
イズする化合物を治療用途に使用する可能性を開示する。従って、本発明はヒト
または動物身体の治療方法における使用のためのアデニンにさらに拡張される。
特に、アデニンは疾患の病理がプリン受容体、特にアデニン受容体における作用
と関連する疾患の治療のために使用されることが予見される。さらに、本発明は
上記のあらゆる疾患または状態の治療のための薬剤の調製におけるアデニンの使
用に拡張される。

【００１８】 本発明は、本発明のポリペプチドに選択的に結合が可能な抗体およびその結合
フラグメントも提供する。従って、抗体および結合フラグメントは、生物学的試
料中の本発明のポリペプチドの同定のための診断試験に使用してもよい。

【００１９】 本発明のこれらおよびその他の局面は、本明細書中でさらに詳細に説明される
。配列の説明 配列番号１は、ラットアデニン結合ＧＰＣＲのヌクレオチド配列を示す。 配列番号２は、ラットアデニン結合ＧＰＣＲのアミノ酸配列を示す。 配列番号３は、ヒトアデニン結合ＧＰＣＲ１のヌクレオチド配列を示す。 配列番号４は、ヒトアデニン結合ＧＰＣＲ１のアミノ酸配列を示す。 配列番号５は、ヒトアデニン結合ＧＰＣＲ２のヌクレオチド配列を示す。 配列番号６は、ヒトアデニン結合ＧＰＣＲ３のヌクレオチド配列を示す。 配列番号７は、ヒトアデニン結合ＧＰＣＲ４のヌクレオチド配列を示す。 配列番号８は、ヒトアデニン結合ＧＰＣＲ５のヌクレオチド配列を示す。 配列番号９は、ヒトアデニン結合ＧＰＣＲ６のヌクレオチド配列を示す。発明の詳細な記述 核酸 核酸は、ＤＮＡ（ゲノムおよびｃＤＮＡの両者と含む）およびＲＮＡを含む。
本発明による核酸がＲＮＡを含む場合には、添付の表中に示した配列の引用は、
Ｔを置換したＵを有するＲＮＡ等価物への引用としても考慮するものとする。

【００２０】 本発明の核酸は、一本鎖および二本鎖であってもよい。本発明の一本鎖核酸は
、アンチセンス核酸を含む。従って、配列番号１もしくは配列番号１を含んでな
る配列またはそれらのフラグメントの引用が、本文内容が明確に反対でない限り
、相補配列を含むと理解される。同様のことが配列番号３、５、６、７、８およ
び９にも適用される。

【００２１】 一般に、本発明による核酸は、単離物、単離および／または精製された形、ま
たはそれが自然に関連している物質を含まないかまたは本質的に含まないで、例
えばヒトゲノム内の遺伝子に近接する核酸を含まないかまたは本質的に含まない
で提供され、ただし発現のための可能な１個またはそれを越える調節配列を除く
。核酸は、完全にまたは部分的に合成されてもよくそしてゲノムＤＮＡ、ｃＤＮ
ＡまたはＲＮＡを含んでもよい。

【００２２】 本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸のフラグメントである核酸
も提供する。一つの局面では、本発明は、本発明のポリペプチドまたはその相補
体をコードする配列の１５〜５０、例えば１５〜３５、１８〜３５、１５〜２４
、１８〜３０、１８〜２１または２１〜２４ヌクレオチドから本質的になる核酸
プライマーを提供する。

【００２３】 「本質的に成る」の用語とは、しかしながら、いかなる追加の５’または３’
核酸配列をも含まない核酸を呼ぶ。本発明の別の局面では、以上に定義した１５
〜３０ヌクレオチドから本質的になる本発明の核酸が、これらが自然には連結し
ていない追加の配列をショート（例えば４から１５、例えば４から１０ヌクレオ
チド）して３’においてしかし好ましくは５’において連結してもよい。かかる
追加の配列は、好ましくは、本発明の核酸が例えばＰＣＲプライマーとして使用
される場合にクローニングを促進するための制限酵素認識部位を含んでなるリン
カーである。

【００２４】 本発明のプライマーは、望ましくは、本発明のポリペプチドをコードする核酸
に選択的にハイブリダイズ可能である。「選択的」とは、他のプリン受容体をコ
ードする配列に関して、そして特にアデニン受容体以外の受容体に関する選択的
を意味する。選択的にハイブリダイズする配列の能力は、実験または計算により
決定してもよい。

【００２５】 例えば、プライマーのＴｍを算出するための一つの方法は、相同標的配列への
プライマーのＴｍを算出するための式を引用することによる。この式は、Ｔｍ（
□Ｃ）＝２（Ａ＋Ｔ）＋４（Ｇ＋Ｃ）−５である。これは３ｘＳＣＣおよび０．
１％ＳＤＳ（ここでＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナト
リウム、ｐＨ７である）の条件下でのＴｍを与える。この式は、一般に長さ約５
０ヌクレオチドまでのプライマーに適する。本発明において、この式は、本発明
のポリペプチドをコードする配列から誘導された特定の配列のためのプライマー
の見かけのＴｍを算出するためのアルゴリズムとして使用してもよい。Ｔｍは、
これらの他の配列のいかなる部分にでも適合する最大数に基づいて、ヒトおよび
ラットのＧＰＣＲ配列に対する算出Ｔｍと比較してもよい。

【００２６】 標的配列にハイブリダイズするプライマーのための適当な条件も実験的に測定
してもよい。適当な実験条件は、本発明のポリペプチドをコードする核酸および
他のアデニン受容体をコードする核酸の両者への候補プライマーを固体担体上、
低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件（例えば５５□Ｃでの６ｘＳ
ＳＣ）下でハイブリダイゼーションし、低いＳＳＣおよび／または高い温度、例
えば４５□Ｃでの０．２ｘＳＳＣにおいて洗浄し、そしてハイブリダイゼーショ
ン温度を段階的に上昇して、プライマーが本発明のポリペプチドをコードする核
酸へはハイブリダイズできるがしかし他のプリン受容体をコードする核酸にはし
ないハイブリダイゼーション条件を決定することを含んでなる。

【００２７】 本発明による核酸、特にプライマーは、顕示的な標識を有してもよい。適当な
標識は、放射性同位元素、例えば³²Ｐまたは³⁵Ｓ、蛍光標識、酵素標識、または
その他のタンパク質標識例えばビオチンを含む。かかる標識は、本発明のポリヌ
クレオチドまたはプライマーに加えてもよくそして自体公知の技術を用いて検出
してもよい。

【００２８】 本発明のプライマーは、合成核酸、例えば細胞内の核酸の安定性を改善する目
的の修飾骨格構造を有するものを含んでなってもよい。オリゴヌクレオチドへの
修飾の多数の異なるタイプが当該技術分野では公知である。これらには、メチル
ホスホネートおよびホスホロチオエート骨格、分子の３’および／または５’末
端へのアクリジンまたはポリリシン連鎖の付加が含まれる。本発明の目的のため
に、本明細書中に記載のポリヌクレオチドが当該技術分野で入手可能ないかなる
方法によって修飾されてもよいと理解されるべきである。かかる修飾は、本発明
のポリヌクレオチドの生体内活性または寿命を増進するために行ってもよい。

【００２９】 本発明の範囲内には、本明細書中に記載の核酸配列、好ましくはオリゴヌクレ
オチド、特には安定化されたオリゴヌクレオチド、またはリボザイムの形に基づ
くアンチセンス配列が含まれる。

【００３０】 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、核酸、プレ−ｍＲＮＡまたは成熟ｍＲＮ
Ａの相補配列にハイブリダイズして、与えられた標的ＤＮＡ配列によりコードさ
れるポリペプチドの産生を妨害し、その発現が低下または完全に防止されるよう
に設計してもよい。リボザイムは、本発明の核酸配列をコードするアデニン結合
ＧＰＣＲによりコードされるｍＲＮＡを、望ましくはアデニン結合ＧＰＣＲに特
異性の標的配列、すなわち他のＧＰＣＲ配列と共通ではない標的配列において開
裂するように設計される。アンチセンス配列の構造およびこれらの使用は、ペイ
マンおよびウルマン(Peyman and Ulman, Chemical Reviews, 90:543-584,(1990)
) 、クルック(Crooke,Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 32:329-376, (1992))お
よびザメツニクおよびステフェンソン(Zamecnik and Stephenson, P.N.A.S., 75
:280-284,(1974))に記載されている。リボザイムの構造およびこれらの使用は、
例えばジブソンおよびシリトウ(Gibson and Shillitoe, Molecular Biotechnolo
gy 7(2):125-137(1997))中に記載されている。

【００３１】 本発明のアンチセンスおよびリボザイム配列は、培養中の哺乳動物細胞系統内
に導入して、アデニン結合ＧＰＣＲの機能を、例えばこの遺伝子のダウンレギュ
ラーションを起こして表現型効果、またはアデニン結合ＧＰＣＲと関連する本明
細書中に記載のタンパク質の発現または場所を観察することにより研究してもよ
い。アデニン結合ＧＰＣＲの異常な発現が起きる細胞内で、かかるアンチセンス
およびリボザイム配列は遺伝子の発現をダウンレギュラーションするために使用
されてもよい。

【００３２】 本発明のＧＰＣＲのｃＤＮＡ配列は、標準ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）ク
ローニング技術を用いてクローニングされてもよい。これは、配列番号１の反対
鎖上の５’および３’末端にプライマーの対を作製し、哺乳動物皮質細胞から得
たｍＲＮＡまたはｃＤＮＡにプライマーを接触させ、所望の領域の増幅をもたら
す条件下でポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅されたフラグメントを単離し（例
えば反応混合物をアガロースゲルで精製して）そして増幅されたＤＮＡを回収す
ることを含む。プライマーは、増幅されたＤＮＡが適当なクローニングベクター
内にクローニングできるような適当な制限酵素認識部位を含むように設計されて
もよい。同様のことは配列番号３、５、６、７、８および９にも適用される。

【００３３】 配列番号１または配列番号３の配列と１００％相同ではないがしかし配列番号
２もしくは配列番号４または本発明の他のポリペプチドのいずれかをコードする
ポリヌクレオチドは、多数の方法で得ることができる。

【００３４】 例えば、配列番号１または配列番号３の配列の部位特異的変異誘発を行っても
よい。これは、例えばポリヌクレオチド配列が発現されている特定の宿主細胞の
ためのコドン優先を最適化するための配列に、例えばサイレントコドン変化が配
列に要求される場合に有用である。その他の配列変化は、制限酵素認識部位を導
入するために、またはポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの性質
または機能を改変するために望ましいであろう。さらなる変化は、例えば保存的
置換を得るために必要である特定のコーディング変化を表すために望ましいであ
ろう。

【００３５】 本発明の核酸は、５’または３’末端で追加の配列を含んでなってもよい。例
えば、合成または自然の５’リーダー配列は、本発明のポリペプチドをコードす
る核酸に結合してもよい。追加の配列は、特定の宿主細胞内で本発明の核酸の転
写のために必要な５’または３’非翻訳領域も含んでもよい。

【００３６】 さらに、他の動物、具体的には哺乳動物（例えばヒトまたはラビット）、さら
に具体的にはヒトを含む霊長類の、アデニン結合ＧＰＣＲの同族体が得られるで
あろう。かかる配列は、他の動物種からの分裂中の細胞または組織から作製され
たｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリーを作製または得て、そ
して中程度ないし高いストリンジェンシー（例えば約５０℃〜６０℃での０．０
３Ｍ塩化ナトリウムおよび０．３Ｍクエン酸ナトリウム）の条件下で配列番号１
または配列番号３の全てまたは部分を含んでなるプローブを用いてかかるライブ
ラリーをプローブして得てもよい。

【００３７】 本発明は、さらに、本発明のポリペプチドをコードする配列を含んでなる単離
されたＤＮＡに拡張されるが、しかしその中でコードする配列は２個またはそれ
を越える（好ましくは５個を越えない、例えば４個または３個）エキソンに分割
される。かかるエキソン配列は、自然のままであるかまたはゲノムクローン、ま
たは合成から得てもよい。エキソン配列は、その配列が１個またはそれ以上のエ
キソン配列により中断されている本発明のポリペプチドをコードする核酸を含ん
でなるミニ遺伝子配列の構築物中に使用してもよい。

【００３８】 ミニ遺伝子は、あらゆる真核起源から誘導された異種エキソンを用いて構築さ
れてもよい。

【００３９】 本発明による核酸、例えば全長コーディング配列またはオリゴヌクレオチドプ
ローブまたはプライマーは、例えば内容が外部環境から保護されている適当な容
器、例えばバイアル中のキットの一部分として提供されてもよい。キットは、例
えばＰＣＲおよび／または試験試料内の重要な核酸の存在を決定するための方法
において核酸の使用のための説明書を含んでもよい。核酸をＰＣＲに使用するこ
とを意図するキットは、反応に必要な１種またはそれ以上の薬品、例えばポリメ
ラーゼ、ヌクレオシド、緩衝液などを含んでもよい。

【００４０】 本発明の核酸は、ラット、ヒトまたはその他の哺乳動物の身体もしくは組織ま
たはそれらから得た試料中のアデニン結合ＧＰＣＲをコードする配列を検出する
ための核酸に基づく試験中に使用してもよい。検出の場合に、これはＤＮＡチッ
プ上のマイクロアレイ技術のような方法を含み、定性的および／または定量的で
あってもよい。検出は、検出段階、例えば遺伝子の全体または部分を配列決定す
ることを含むものも含む。

【００４１】 検出のためのかかる試験は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含むヒト試料を、本発明の
核酸または本発明のプライマーを含んでなるプローブとハイブリダイジング条件
下で接触させ、そしてプローブと試料中の核酸との間に形成されたあらゆる二本
鎖を検出することを一般的に含んでなる。かかる検出は、例えばＰＣＲのような
技術を用いるかまたはプローブ固体担体上に固定し、プローブにハイブリダイズ
されなかった試料中の核酸を除去し、次いでプローブにハイブリダイズされた核
酸を検出することにより達成されてもよい。あるいは、試料核酸は、固体担体上
に固定してもよく、そうするとかかる担体に結合したプロブの量が検出できる。
そのあらゆる他のフォーマットの適当なアッセイ方法は、例えばＷＯ８９／０３
８９１号およびＷＯ９０／１３６６７号中に見出すことができる。

【００４２】 本発明による検出のさらなる方法は、野生型アデニン結合ＧＰＣＲ遺伝子の変
化を、単一塩基変化を含み、例えば一本鎖コンホーメーション多形性（ＳＳＣＰ
）分析を用いて検出する方法である。試料中のアデニン結合ＧＰＣＲをコードす
るＤＮＡまたはｍＲＮＡの全体または部分からの核酸配列は基準配列にハイブリ
ダイズされてもよく、そしてハイブリッドの移動性は、二本鎖内のあらゆる非ハ
イブリダイズ領域が移動性を変化させるような条件下でゲル中で観察される。

【００４３】 本発明の核酸は、皮質、後根（ｄｏｒｓａｌ ｒｏｏｔ）、ＣＮＳおおびＰＮ
Ｓおよびその他の組織中のこの遺伝子の分布の知識を確認および拡張するための
組織分布研究にも有用である。ポリペプチド 本発明の単離されたポリペプチドは、上記に定義のようにこれが自然に関連す
る物質、例えばこれが細胞内に見出される他のポリペプチドを含まないかまたは
本質的に含まない単離された形にあるものである。ポリペプチドは、勿論、希釈
剤またはアジュバントを用いて処方されてもよく、そして実際的な目的から、単
離されていてもよく、例えば免疫アッセイに使用するためのマイクロタイター(m
icrotitre)プレートをコーティングするために使用される場合に、ポリペプチド
はゼラチンまたはその他のキャリヤーと通常は混合される。ポリペプチドは、自
然にまたは異種真核細胞の系のいずれかによりグリコシル化されてもよく、また
はこれらは非グリコシル化であってもよい（例えば原核細胞内の発現により産生
された場合）。ポリペプチドは、リン酸化および／またはアセチル化されてもよ
い。

【００４４】 本発明のポリペプチドは本質的に精製された形であってもよく、この場合に、
これは調製物中のポリペプチド中に、調製物中のポリペプチドの９０％以上、例
えば９５％、９８％または９９％が本発明のポリペプチドである調製物中のポリ
ペプチドを一般的に含んでなる。

【００４５】 本発明のポリペプチドは、例えばこれらの精製を援助するためのヒスチジン残
基の添加によりまたは細胞からのこれらの分泌を促進するためのシグナル配列の
付加により変更されてもよい。

【００４６】 配列番号２または配列番号４に少なくとも５０％、例えば６０％、７０％、８
０％、９０％、９５％または９８％の配列同一性を有するポリペプチドは、それ
それ配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列変種、対立遺伝子、誘導体また
は変異体であるポリペプチドであってもよく、そして本発明により供給される。
例えば、かかるポリペプチドは、配列番号２または配列番号４に記載のものから
１個またはそれを越える（例えば１〜２０、例えば２、３、４、または５〜１０
個）アミノ酸の１個またはそれを越える付加、置換、欠失および挿入により相違
するアミノ酸配列を有してもよい。

【００４７】 ポリペプチド配列の同一性百分率は、基準配列（例えば本発明の配列番号２ま
たは配列番号４）と質問(query) 配列とを比較する市場で入手できるアルゴリズ
ムを用いて算出できる。アッセイ方法のこれ以上の詳細は、以下に記載される。

【００４８】 本研究において、配列番号２のヌクレオチド配列は、ＢＬＡＳＴ（(Altschul
et al., 1997))サーチにより、既知リガンドと関連するＧＰＣＲが発見できるか
どうかを検査するために分析した。しかし、選別されたこのオーファンＧＰＣＲ
の最も近い同族体は、オーファンＧＰＣＲ自体であった。これらはラットアデニ
ン結合ＧＰＣＲと共通の残基の約５０％を有する後根神経節からクローニングし
たヒトＧＰＣＲ（ダーウエント(Derwent) 配列データベース受託番号Ｚ１００６
７、Ｚ１００６８、Ｚ１００６９、Ｚ１００７０、Ｚ１００７１およびＺ１００
７２）のファミリーであった。ここで本発明は、これら６個のオーファンＧＰＣ
Ｒをラットアデニン結合ＧＰＣＲの６個の同族体として同定した。この６個の同
族体は、ヒトアデニン結合ＧＰＣＲ１、２、３、４、５および６とそれぞれ名付
けられた。次に最も近い同族体は、アデニン結合ＧＰＣＲと３３％の残基を共有
するｍａｓ関連遺伝子である。

【００４９】 質問配列が配列番号２または配列番号４のものと少なくとも５０％そして好ま
しくは少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の同一
性を有し、該配列がアデニン結合受容体活性を保有するポリペプチドのものであ
ると決定された場合に、かかる配列は本発明の一部分を形成する。

【００５０】 本発明によるポリペプチドは、例えばコードするアミノ酸からの発現による産
生の後に単離および／または精製（例えば抗体を用いる）してもよい。単離およ
び／または精製されたポリペプチドは、組成物の処方内に使用されてもよく、こ
れは少なくとも１種の追加の成分、例えば製剤学的に許容できる賦形剤、ビヒク
ルまたはキャリヤーを含む薬剤組成物を含んでもよい。

【００５１】 本発明によるポリペプチドは、免疫原としてもしくは特異性抗体を得るために
使用してもよい。抗体は精製およびその他のポリペプチドの操作、診断スクリー
ニングおよび治療の範囲内で有用である。これはさらに以下に考察する。

【００５２】 本発明によるポリペプチドは、これに結合するかまたはその活性または機能を
変更する分子に関するスクリーニングに使用してもよい。かかる分子は、治療（
予防も多分含み）の範囲内で有用であってもよい。

【００５３】 本発明のポリペプチドは、顕示的な標識で標識されてもよい。顕示的な標識は
、ポリペプチドを検出させるあらゆる適当な標識であってもよい。適当な標識に
は、放射性同位元素、例えば ¹²⁵Ｉ、酵素、抗体、ポリヌクレオチドおよびリン
カー例えばビオチンを含む。本発明の標識したポリペプチドは、診断処置、例え
ば試料内の本発明のポリペプチドの量を決定するための免疫アッセイ中に使用し
てもよい。本発明のポリペプチドまたは標識したポリペプチドは、標準プロトコ
ールを用いる動物およびヒト中での該ポリペプチドへの免疫反応性の検出のため
の血清学的または細胞媒介免疫アッセイに使用してもよい。

【００５４】 本発明のポリペプチドもしくは標識したポリペプチドまたはそれらのフラグメ
ントは、固相、例えば免疫アッセイウエルまたはディップスティックの表面に固
定してもよい。かかる標識および／または固定化ポリペプチドは、適当な容器内
に、適当な試薬、対照体、説明書などと一緒にキットとして包装してもよい。

【００５５】 かかるポリペプチドおよびキットは、試料もしくは活性部分またはそれらのフ
ラグメント内に存在するかかるポリペプチドへの抗体の免疫アッセイによる検出
の方法に使用してもよい。

【００５６】 免疫アッセイ法は、当該技術分野では周知でありそして一般に （ａ）該タンパク質に対する抗体により結合可能なエピトープを含んでなるポリ
ペプチドを提供し、 （ｂ）抗体−抗原複合体の形成を可能とする条件下で該ポリペプチドと一緒に生
物学的試料をインキュベーションし、そして （ｃ）該ポリペプチドを含んでなる抗体−抗原複合体が形成されたかどうかを決
定する ことを含んでなる。配列同一性 核酸およびポリペプチド配列の同一性百分率は、基準配列を質問配列と比較す
る市場で入手できるアルゴリズムを用いて算出できる。下記のプログラム（Nati
onal Center for Biotechnology Information により提供される）を相同性／同
一性性を決定するために使用してもよい：ＢＬＡＳＴ、ギャップドＢＬＡＳＴ、
ＢＬＡＳＴＮおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ、これらはデフォールトパラメーターを
用いて使用してもよい。

【００５７】 アルゴリズムＧＡＰ（Genetics Computer Group, Madison, WI) は、適合の数
を最大化しそしてギャップの数を最小化するように２個の完全配列を整列するニ
ードルマンとヴンシュ(Needleman and Wunsch)アルゴリズムを使用する、一般に
、gap creation penalty＝１２、およびgap extension penalty ＝４のデフォー
ルトパラメーターを用いる。

【００５８】 核酸配列またはその部分と質問配列との間の最善の全体的適合を決定するため
の別の方法は、ブルトラグら(Brutlag et al., Comp. App. Biosci., 6; 237-24
5(1990))のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムの使用
である。このプログラムは、包括的配列整列を提供する。該包括的配列整列の結
果は、同一性百分率である。同一性百分率を算出するためのＤＮＡ配列のＦＡＳ
ＴＤＢサーチに使用される適当なパラメーターは下記である：Matrix＝Unitary
、k-tuple ＝４、Mismatch penalty＝１、Joining Penalty ＝３０、Randomiz
ation Group length＝０、Cutoff Score＝１、Gap Penalty ＝５、Gap Size Pen
alty＝０．０５、およびWindow Size ＝５００またはヌクレオチド塩基で表した
質問配列長さのいずれか短い方。アミノ酸整列の同一性および類似百分率を算出
するために適当なパラメーターは下記である：Matrix＝PAM 150 、k-tuple ＝２
、Mismatch penalty＝１、Joining Penalty ＝２０、Randomization Group leng
th＝０、Cutoff Score＝１、Gap Penalty ＝５、Gap Size Penalty＝０．０５、
およびWindow Size ＝５００またはヌクレオチド塩基で表した質問配列長さのい
ずれか短い方。抗体 本発明のポリペプチドの提供は、特定の様式でラットまたはヒトアデニン結合
ＧＰＣＲを結合できる抗体の産生を可能とする。従って、本発明は、本発明のポ
リペプチドに特異的に結合できそしてその他のプリン作動性ＧＰＣＲには結合し
ない抗体を提供する。かかる抗体は、本発明のポリペプチドに対して、他のプリ
ン作動性ＧＰＣＲよりも少なくとも１００倍、好ましくは少なくとも１０００倍
高いポリペプチドへの親和性を有する。かかる抗体は、他のＧＰＣＲ中には存在
しない本発明のポリペプチドのエピトープを用いて産生してもよい。かかるエピ
トープは、本発明のポリペプチドと他のプリン作動性ＧＰＣＲの間の相違を追求
して決定できる。

【００５９】 抗体は、当該技術分野で標準である技術を用いて得てもよい。抗体を産生する
方法は、本発明のポリペプチドを用いて哺乳動物（例えばマウス、ラット、ラビ
ット）を免疫化することを含む。抗体は、当該技術分野では公知の種々の技術の
いずれかを用いて免疫化した動物から得て、そして好ましくは関係する抗原への
抗体の結合を用いてスクリーニングしてもよい。例えば、ウエスタンブロッティ
ング技術または免疫沈降法を使用してもよい(Armitage et al, Nature 357:80-8
2, 1992)。

【００６０】 ペプチドを用いて哺乳動物を免疫化するための代替または補足として、タンパ
ク質に特異性の抗体は、発現された免疫グロブリン可変ドメインの組換え産生ラ
イブラリーから、例えばこれらの表面上に機能性免疫グロブリン結合ドメインを
示すラムダバクテリオファージまたは繊維状バクテリオファージを用いて得ても
よい。例えばＷＯ９２／０１０４７号参照。

【００６１】 本発明による抗体は、多数の方法で修飾できる。実際、「抗体」という用語は
、所要の特異性を有する結合ドメインを有するあらゆる結合物質を包含すると解
釈される。従って、本発明は、形態が抗原またはエピトープを結合することを可
能とする抗体のものを模擬する合成された分子および多数の分子を含み、抗体フ
ラグメント、誘導体、機能性等価物および抗体の同族体を包含する。

【００６２】 抗原またはその他の結合相手を結合できる抗体フラグメントの例は、ＶＬ、Ｖ
Ｈ、Ｃ１およびＣＨ１ドメインからなるＦａｂフラグメント；ＶＨおよびＣＨ１
ドメインからなるＦｄフラグメント；抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメイ
ンからなるＦｖフラグメント；ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント；単離
されたＣＤＲ領域およびヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２個の
Ｆａｂフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ（ａｂ’）フラグメントで
ある。単一鎖Ｆｖフラグメントも含まれる。

【００６３】 試料上の抗体の反応性は、いかなる適当な手段により決定されてもよい。個別
のレポーター分子を用いるタグ付加は一つの可能性である。レポーター分子は検
出可能、そして好ましくは測定可能なシグナルを直接または間接に生成してもよ
い。レポーター分子の連結は、直接または間接、例えばペプチド結合を介する共
有、または非共有であってもよい。ペプチド結合を介する連結は、抗体およびレ
ポーター分子をコードする遺伝子融合の組換え発現の結果であってもよい。

【００６４】 結合を決定するモードは本発明の特徴ではなくそして当該技術分野の熟練者は
彼らの選択および一般的知識に従って選定できる。

【００６５】 本発明に従う抗体は、例えば考察したような細胞または細胞溶解物を含む試験
試料中のポリペプチドの存在をスクリーニングするために使用してもよく、そし
て例えばそれらをコードする核酸からの発現によるポリペプチドの産生の後に、
本発明によるポリペプチドの精製および／または単離のために使用してもよい。
抗体は、それらが結合するポリペプチドの活性を調節してもよくそしてポリペプ
チドが個体内で有害な影響を有する場合に、治療の範囲内で有用であろう（これ
は予防を含んでもよい）。

【００６６】 抗体は、抗体を使用するための説明書、例えば試験試料内の特定の物質の存在
を決定するためのものを含んでもよいキットとして提供されてもよい。１種また
はそれ以上の試薬、例えば標識分子、緩衝液、溶離剤などを含んでもよい。試薬
は、外的環境からこれらを防御する容器、例えばシールしたバイアル内で提供さ
れてもよい。ベクター 本発明の核酸配列は、ベクター、特には発現ベクター中に組み込まれてもよい
。ベクターは、適合する宿主細胞内の核酸を複製するために使用されてもよい。
従って、別の態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを複製可能なベク
ター内に導入し、ベクターを適合する宿主細胞内に導入し、そしてベクターの複
製をもたらす条件下で宿主細胞を増殖することによる本発明のポリヌクレオチド
を作製する方法を提供する。ベクターは、宿主細胞から回収されてもよい。適当
な宿主細胞は、発現ベクターに関連して以下に記載する。

【００６７】 好ましくは、ベクター内の本発明のポリヌクレオチドは、宿主細胞によるコー
ディング配列の発現をもたらすことができる制御配列に操作可能に連結し、すな
わちベクターは発現ベクターである。

【００６８】 「操作可能に連結」の用語とは、記載の成分がそれらの意図する様式でそれら
を機能させるような関係にある近位を呼ぶ。コーディング配列に「操作可能に連
結」する制御配列は、コーディング配列の発現が制御配列と整合する条件下で達
成されるような様式で結合される。

【００６９】 適当なベクターは、プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化
配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子およびその他の配列を含む適当な制御
配列を含むと選定または解釈できる。ベクターは、プラスミド、ウイルス、例え
ばファージ、ファジェミドまたはバキュロウイルス、コスミド、ＹＡＣ、ＢＡＣ
、またはＰＡＣなど適宜であってもよい。ベクターは、遺伝子治療ベクター、例
えばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス（例えばＨＩＶまた
はＭＬＶ）またはアルファウイルスベクターに基づくベクターを含む。

【００７０】 ベクターは、複製の開始点、場合により該ポリヌクレオチドの発現のためのプ
ロモーターおよび場合によりプロモーターのレギュレーターと共に提供されても
よい。ベクターは、１種またはそれ以上の選択可能なマーカー遺伝子、例えば細
菌性プラスミドの場合にはアンピシリン耐性遺伝子または哺乳動物ベクターに対
するネオマイシン耐性遺伝子を含んでもよい。ベクターは、生体外で、例えばＲ
ＮＡの産生のために使用してもまたは宿主細胞をトランスフェクションまたは形
質転換するために使用してもよい。ベクターは、生体内で、例えば遺伝子治療の
方法内で使用するために適合させてもよい。種々の宿主細胞内でのポリペプチド
のクローニングおよび発現のための系は周知である。適当な宿主細胞には、細菌
、真核細胞、例えば哺乳動物細胞おび酵母、およびバキュロウイルス系が含まれ
る。異種ポリペプチドの発現のために当該技術分野で利用可能な哺乳動物細胞系
統は、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ハムスター幼児腎臓細
胞、ＣＯＳ細胞および多数のその他のものを含む。

【００７１】 プロモーターおよびその他の発現調節シグナルは、発現ベクターが設計される
宿主細胞と適合するように選定されてもよい。例えば、酵母プロモーターには、
Ｓ．セレビシー(S. cerevisiae) ＧＡＬ４およびＡＤＨプロモーター、Ｓ．ポン
ベ(S, pombe)ｎｍｔ１およびａｄｈプロモーターが含まれる。哺乳動物プロモー
ターには、重金属、例えばカドミウムに応答して誘導できるメタロチオネインプ
ロモーターが含まれる。ウイルスプロモーター、例えばＳＶ４０ラージＴ抗原プ
ロモーターまたはアデノウイルスプロモーターを使用してもよい。これらのプロ
モーターのすべては、当該技術分野で容易に利用できる。

【００７２】 ベクターは、他の配列、例えば挿入された核酸発現を作動するプロモーターま
たはエンハンサー、ポリペプチドが融合物として産生されるような核酸配列およ
び／または宿主細胞内で産生されるポリペプチドが細胞から分泌されるような分
泌シグナルをコードする核酸を含んでもよい。

【００７３】 遺伝子治療に使用するための本発明のポリペプチドの産生のためのベクターは
、本発明のミニ遺伝子配列を有するベクターを含む。

【００７４】 これ以上の詳細に関しては、例えば「分子クローニング、実験マニュアル」(M
olecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al., 198
9, Cold Spring Harbor Laboratory Press) を参照のこと。核酸の操作のための
多数の既知の技術およびプロトコール、例えば核酸構築物の調製、突然変異誘発
、配列決定、細胞内へのＤＮＡの導入および遺伝子発現、およびタンパク質の分
析は、「分子生物学の最近のプロトコール」(Current Protocols in Molecular
Biology, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992)に記載されている。

【００７５】 ベクターは、上記のような適当な宿主細胞内に形質転換して本発明のポリペプ
チドの発現をもたらしてもよい。従って、別の局面では、本発明はポリペプチド
をコードするコーディング配列のベクターにより発現をもたらすための条件下で
上記の発現ベクターを用いて形質転換またはトランスフェクションされた宿主細
胞を培養し、そして発現されたポリペプチドを回収することを含んでなる、本発
明によるポリペプチドを調製するための方法を提供する。ポリペプチドは、生体
外の系、例えば網状赤血球溶解物中で発現されてもよい。

【００７６】 本発明の別の態様は、本発明のポリヌクレオチドの複製および発現のためのベ
クターを用いて形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞を提供する
。細胞は、該ベクターと適合するように選定されそして例えば細菌、酵母、昆虫
または哺乳動物性であってもよい。宿主細胞は、遺伝子の発現のための条件下で
培養されてもよく、コードされたポリペプチドが産生される。ポリペプチドが適
当なシグナルリーダーペプチドに結合して発現される場合には、これは細胞から
培地内に分泌されてもよい。発現による産生の後に、ポリペプチドは、該当する
場合には宿主細胞および／または培地から単離および／または精製されてもよく
、そして引き続いて希望に従って、例えば１種またはそれ以上の追加の成分を含
んでもよい組成物、例えば１種またはそれ以上の製剤学的に許容できる賦形剤、
ビヒクルまたはキャリヤーを含む薬剤組成物の処方に使用される。

【００７７】 本発明によるポリヌクレオチドは、アンチセンスＲＮＡまたはリボザイムの産
生をもたらすためにアンチセンス方向で上記ベクター内に挿入されてもよい。アッセイ 本発明は、本発明のアデニン結合ＧＰＣＲポリペプチドと相互作用が可能な化
合物のためのアッセイも提供し、そのアッセイは、本発明による少なくとも一種
のポリペプチドを含んでなるＧタンパク質共役型受容体を提供し、受容体を推定
結合化合物と接触させ、そして該化合物が該受容体と相互作用が可能かどうかを
決定することを含んでなる。

【００７８】 アッセイの一つの態様において、受容体または受容体のサブユニットを結合ア
ッセイ内に使用してもよい。結合アッセイは、競合的でも非競合的であってもよ
い。かかるアッセイは、存在する場合にどの化合物がポリペプチドに結合できる
かどかを決定するために非常に多数の化合物の迅速なスクリーニングを包含する
ことができる。次いで、さらに詳細なアッセイが、かかる化合物が本発明のポリ
ペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストとして作用するかどうかをさらに決
定するために、結合すると見出されたこれらの化合物を用いて実施できる。

【００７９】 本発明は、さらに、本発明のポリペプチドを含んでなる受容体の活性を調節す
る化合物を同定するためのバイオアッセイを提供する。一つの態様では、バイオ
アッセイは、酵母細胞の接合および交配のために必要なフェロモン経路として通
常は機能する内因性ＧＰＣＲおよびＧタンパク質を置換する本発明のＧＰＣＲお
よびラットまたはヒトＧタンパク質を用いて操作されたサッカロミセス・セレビ
シー(Saccharomyces cerevisiae)細胞を用いて行われる。活性化リガンドに対す
る通常の酵母反応（成長停止）は、積極的な成長に変換するようにも操作される
。かかる操作を用いて、酵母細胞は本発明のＧＰＣＲに対するアゴニストおよび
アンタゴニストを、ＧＰＣＲの増殖指示活性化を用いて同定するための機能性ア
ッセイに用いることができる。例えば、バイオアッセイは、本発明のポリペプチ
ドを含んでなるＧＰＣＲを発現するかかる酵母細胞を少なくとも一種の潜在的ア
ゴニストと接触させ、その後、増殖活性における変化に関して細胞を測定して行
ってもよい。さらに別の態様では、バイオアッセイは、本発明のポリペプチドを
含んでなるかかる酵母細胞発現性受容体を、一定量の既知アゴニスト、例えばア
デニンと接触させ、そして少なくとも一種の潜在的アンタゴニストの量を増加さ
せそしてその後増殖における変化に関して細胞を測定することにより行われる。

【００８０】 本発明は、アデニン結合ＧＰＣＲ遺伝子の制御領域を調節する化合物を同定す
るためのバイオアッセイも提供する。かかるアッセイは、本発明のポリペプチド
（好ましくは配列番号２または配列番号４のもの）を発現できるラットまたはヒ
ト細胞を用いて行われる。細胞を少なくとも１種の化合物と接触させ、ここで制
御領域を調節する該化合物の能力は既知である。その後、細胞を本発明の核酸の
発現に関して測定する。あるいは、プロモーターはレポーター遺伝子に結合して
いてもよい。使用してもよい適当なレポーター遺伝子は、例えばクロラムフェニ
コールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子等を含んでも
よい。

【００８１】 本発明のポリペプチドの「活性を調節」する化合物またはシグナルとは、ポリ
ペプチドの活性を改変して、化合物またはシグナルが存在する場合には化合物ま
たはシグナルが存在しない場合とは異なって挙動する化合物またはシグナルを呼
ぶ。調節に影響を及ぼす化合物には、アゴニストおよびアンタゴニストが含まれ
る。アゴニストは、アデニン結合ＧＰＣＲ機能を活性化するアデニンなどの化合
物を包含する。あるいは、アンタゴニストは、アデニン結合ＧＰＣＲ機能を妨害
する化合物を含む。典型的には、アンタゴニストの効果は、アゴニスト誘導受容
体活性化のブロッキングとして観察される。アンタゴニストには、競合的ならび
に非競合的アンタゴニストが含まれる。競合的アンタゴニスト（または競合的ブ
ロッカー）は、アゴニスト結合のために特異的な部位と相互作用するかまたはそ
の近傍にある。非競合的アンタゴニストまたはブロッカーは、アゴニスト相互作
用部位以外の部位と相互作用して受容体の機能を不活性化する。以下に記載のよ
うに、グアニンはこれらの受容体に対して弱いアンタゴニスト効果を有する。

【００８２】 当該技術分野の熟練者には理解されるように、本発明のポリペプチドのような
受容体の活性を調節する化合物を同定するためのバイオアッセイ法は、一般に対
照との比較を必要とする。「対照」の一つのタイプは、化合物に暴露される試験
細胞または試験培養物と本質的には同様に処理されるが、「対照」細胞または培
養物が化合物に暴露されない点のみ異なる細胞または培養物である。使用できる
「対照」細胞または培養物の別のタイプは、トランスフェクションされた細胞と
同様であるが、しかし「対照」細胞または培養物は機能的アデニン結合ＧＰＣＲ
を発現しない点が異なる細胞または培養物である。従って、トランスフェクショ
ンされた細胞の応答は、同じ反応条件下で同じ化合物に対する「対照」細胞また
は培養物のものと比較できる。

【００８３】 アッセイの特に好ましいタイプは、下記のように行れる結合アッセイおよび機
能アッセイを含む。結合アッセイ 細胞系統（哺乳動物ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞およびＳｆ９昆虫細胞を含
む）中の本発明のポリペプチドをコードする核酸の過剰発現は、リガンド結合研
究のために該ポリペプチド（便宜上、本節内ではアデニン結合ＧＰＣＲと呼ぶ）
を有する膜調製物を産生するために使用してもよい。これらの膜調製物は、慣用
のフィルター結合アッセイ（例えばブランデル(Brandel) フィルターアッセイ装
置の使用）または大量迅速処理シンチレーションプロキシミティタイプ結合アッ
セイ（ＳＰＡおよびサイトスター−Ｔフラッシュプレート(Cytostar-T flashpla
te) 技術；Amersham Pharmacia Biotech）において、放射能標識プリン作動性リ
ガンド〔２−³Ｈアデニン(Amersham TRK311) および８−³Ｈアデニン(Amersham
TRK343) を含む〕の結合および結合部位に対する競合体によるかかる放射性リガ
ンドの転置を検出するために使用できる。放射能は、９６−、３８４−１５３６
−マイクロタイターウエルフォーマットから迅速な測定ができるパッカード・ト
ップカウント(Packard Topcount)または同様の装置を用いて測定できる。ＳＰＡ
／サイトスター−Ｔ技術は、特に大量迅速処理スクリーニングを扱いやすく、従
ってこの技術は標準リガンドを転置できる化合物のためのスクリーンとしての使
用に適する。

【００８４】 本来の状態に近似した環境におけるアデニン結合ＧＰＣＲタンパク質へのリガ
ンドの結合を研究する別の方法は、バイオコア(Biocore) 装置(Biocore) により
開発された表面プラスモン共鳴効果を利用する。膜調製物または全細胞中のアデ
ニン結合ＧＰＣＲを、バイオコアのバイオセンサーチップに取り付けそしてリガ
ンドの結合を化合物の存在または不在において検査して結合部位の競合体を同定
することができる。機能アッセイ アデニン結合ＧＰＣＲは、通常はＧＩＲＫ（内向き選別(inward rectifying)
カリウムチャンネル）と相互作用するＧ_i またはＧ_o （阻害性Ｇタンパク質）を
介して作用するので、カリウムイオンフラックスはこれらの受容体の活性化をも
たらすであろう。このイオンのフラックスは、種々の技術を用いて実時間で、特
定の化合物のアゴニストまたはアンタゴニスト効果を決定して測定してもよい。
従って、細胞系統または例えばアメリカツノガエル(Xenopus) 卵母細胞中に発現
された組換えアデニン結合ＧＰＣＲ受容体は、全細胞および単一チャンネル電気
生理学を用いて重要な化合物作用の機序を決定して特性付けることができる。ア
デニン結合ＧＰＣＲで活性の化合物に対する電気生理学的スクリーニングは、慣
用の電気生理学的技術を用い、そして利用できる場合には、現在開発中の新しい
大量迅速処理方法を利用して行ってもよい。蛍光 −カルシウムおよびナトリウムフラックスは、フルオ(fluo)−３、フルオ−
４、フルオ−５Ｎ、フラ・レッド(fura red)、ナトリウムグリーン、ＳＢＦＩお
よびモレキュラー・プローブ(Molecular Probe) を含む供給者からのその他の類
似したプローブを含む吸う種のイオン感受性蛍光色素を用いて測定可能である。
アデニン結合ＧＰＣＲの結果としてのカルシウムおよびナトリウム流入は、この
ようにして、イメージ分析アルゴリズムと組み合わせたレーザー共焦点法を用い
るか用いない蛍光顕微鏡測定を含む、蛍光測定および蛍光イメージング技術を用
いて実時間で特性付けできる。

【００８５】 別の方法は、カルシウム過渡体(transient) に影響を及ぼすアゴニストまたは
モジュレーターのいずれかとして活性の化合物のための大量迅速処理スクリーニ
ングアッセイである。このアッセイは、蛍光イメージングプレートリーダー(Flu
orescence Imaging Plate Reader (FLIPR ^TM), Molecular Devices Corporation
) と呼ばれる装置に基づく。その最も通常の構成では、これはフルオレセインに
基づく色素により発光する蛍光を励起および測定する。これは蛍光体の４８８ｎ
ｍにおける高出力励起を生成するアルゴンイオンレーザー、９６−／３８４−ウ
エルプレートのボトムの上を迅速に走査するための光学系および射出された蛍光
を捕そくするための高感度、冷却ＣＣＤカメラを用いる。これは９６−／３８４
−ウエルプレートのウエル内に試験薬剤の溶液を供給するための装置を可能とす
る９６−／３８４−ウエルプレートピペッッティングヘッドも含む。ＦＬＩＰＲ
アッセイは、化合物の添加の前、その間およびその後において、実時間で、すべ
ての９６−／３８４−ウエルから同時に、細胞の集団からの蛍光シグナルを測定
するように設計されている。ＦＬＩＰＲアッセイは、細胞系統内で発現された組
換えアデニン結合ＧＰＣＲ、例えばラットまたはヒトアデニン結合ＧＰＣＲに対
して機能的に活性の化合物をスクリーニングおよび特性付けるために使用しても
よい。以下に記載するように、アデニン結合ＧＰＣＲを用いてトランスフェクシ
ョンした細胞内のカルシウム過渡体は、受容体の自然リガンドを決定するために
種々の基体による受容体の活性化を測定するためのＦＬＩＰＲアッセイを用いて
測定する。

【００８６】 本発明のポリペプチドの活性を調節することが見出された化合物は、多数の治
療用途を有する。ＢＬＡＳＴサーチから明らかなように、アデニン結合ＧＰＣＲ
は、アデニンと同様の活性化構造であるＧＰＣＲの既知のサブファミリーのいず
れにも属していない。これは、アデニン結合ＧＰＣＲがプリン作動性ＧＰＣＲの
新しいサブグループのメンバーであり、ここでプリン作動性がこれまで適用され
ている種々の治療分野のための新規の薬理学を開発することが可能であることを
示唆する。具体的には、これはアポトーシス(Chow et al., 1997) 、病理学的振
せん障害(Mally and Stone,1996)、痛覚(Brunstock, 1997) に関連する疾患を含
む。プリン作動性化合物は、抗痙攣剤、鎮静剤、催眠剤、失調症剤（ＣＮＳ）、
降圧剤、抗不整脈剤、陰性変時剤、変動剤および変力剤、血小板凝集の阻害剤、
心臓血管系内の血管内皮細胞によるＮＯ産生の刺激剤および胃腸分泌の阻害剤と
しての使用が示唆されている(Gil-Rodrigo et al. Pharmacol. Res. 22(2):103-
13, 1990) 。トランスジェニック動物に基づくさらなる研究は、このファミリー
からの受容体が、気管支収縮、血管拡張、炎症および神経伝達の促進に役割を演
じることを示唆する(Nyce, 1999)。要約すると、アデニン結合ＧＰＣＲおよび関
連する受容体は、種々の治療分野内での薬剤開発のための価値ある道具として使
用できる。

【００８７】 さらに、アデニン自体がこの受容体への自然リガンドとして作用するという証
明は、アデニンおよびアデニンを模擬またはアンタゴニスト作用する化合物の上
記の疾患のための治療の開発に使用の可能性を開く。組織分布研究 アデニン結合ＧＰＣＲ ＤＮＡ配列は、ヒトの健康および疾患におけるハイブ
リダイゼーション／ＰＣＲ研究によるこのＧＰＣＲの分布の知識を確認および拡
張するために有用である。細胞系統内の組換えアデニン結合ＧＰＣＲは、アデニ
ン結合ＧＰＣＲ機能を特性づけるために有用でありそして種々の生化学的及び生
物物理的方法がこの受容体をアッセイするために利用できる。本明細書中に記載
した本発明のアッセイは、薬剤発見スクリーニングの目的のためにも有用である
。結合剤 このように、本発明は、本発明によるアッセイにより得られた調節剤、および
かかる薬剤を含んでなる組成物を含む新規の結合剤をさらに提供する。受容体に
結合しそしてアゴニストまたはアンタゴニスト活性を有するであろう薬剤は、そ
の病理がアデニン結合ＧＰＣＲ受容体を介する作用により特性付けられる疾患を
治療する方法に使用してもよく、そしてかかる使用は本発明のさらなる局面を形
成する。かかる疾患は、アポトーシス、病理学的振せん障害および痛覚、気管支
収縮、血管拡張、炎症および神経伝達の促進に関連する疾患を含んでもよい。さ
らに、この薬剤は、抗痙攣剤、鎮静剤、催眠剤、失調症剤（ＣＮＳ）、降圧剤、
抗不整脈剤、陰性変時剤、変動剤および変力剤、血小板凝集の阻害剤、心臓血管
系内の血管内皮細胞によるＮＯ産生の刺激剤または胃腸分泌の阻害剤としての使
用が有用である治療に使用してもよい。薬剤は本発明の薬剤の有効量を投薬して
もよい。多数の上記の病状は慢性でありしばしば治療不能なので、「治療」は一
定の期間、例えば数時間、数日または数週間だけ症状を緩和することを含みそし
て疾患の経過の進行を遅延させることを含むことを意図すると理解される。

【００８８】 かかる薬剤は、薬剤を製剤学的に許容できるキャリヤーまたは増量剤と一緒に
含んでなる組成物に処方してもよい。薬剤は生理学的に機能性の誘導体、例えば
エステルまたは塩、例えば酸付加塩または塩基性金属塩、またはＮまたはＳ酸化
物の形であってもよい。組成物は、投薬のいかなる適当な経路よび手段のために
処方されてもよい。製剤学的に許容できるキャリヤーまたは増量剤は、経口、経
直腸、経鼻、吸入、局所（バッカルまたは舌下）、経膣または非経口（皮下、筋
肉内、静脈内、動脈内、皮内、髄腔内および硬膜を含む）投薬に適する処方に使
用されるものを含む。キャリヤーまたは増量剤の選定は、投薬の提示された経路
に依存することは勿論であり、これは薬剤およびその治療目的に依存してもよい
。処方剤は、便宜的に単位投薬単位として提供してもよくそして薬剤学の当該技
術分野では周知のいずれの方法により調製されてもよい。かかる方法は、活性成
分を１種またはそれ以上の付加成分を構成するキャリヤーと一緒にする工程を含
む。一般に、処方剤は均質にそして活性成分を液状キャリヤーまたは微細に分割
した固体キャリヤーまたは両者と緊密に混合し次いで必要な場合には製品を成形
する。

【００８９】 固体組成物のために、例えばマンニトール、ラクトース、セルロース、セルロ
ース誘導体、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム塩、
タルク、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどの医薬用グレードを含
む慣用の非毒性固体キャリヤーを含んでもよい。上記の定義した活性化合物は、
例えばポリアルキレングリコール、アセチル化トリグリセリドなどをキャリヤー
とし用いる座薬として処方してもよい。液状の薬剤として投薬できる組成物は、
例えば上記に定義した活性化合物と場合により薬剤的アジュバントとをキャリヤ
ー、例えば水、生理食塩水、デキストロース水溶液、グリセロール、エタノール
などの中に溶解、分散などにより溶液または懸濁液を形成して調製できる。所望
の場合には、投薬される薬剤組成物は、少量の非毒性補助物質、例えば湿潤また
は乳化剤、ｐＨ緩衝剤など、例えば酢酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン
、トリエタノールアミンナトリウムアセテート、モノラウリン酸ソルビタン、オ
レイン酸トリエタノールアミンなども含んでもよい。かかる投薬形態を調製する
ための実際の方法は、当該技術分野の熟練者には既知であるかまたは明らかであ
り、例えば「レミントンの薬剤科学」(Remington's Pharmaceutical Science, M
ack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 15 Edition, 1975) 参照。

【００９０】 投薬される組成物または処方剤は、いかなる場合でも、治療される患者の病状
を軽減するために有効な量の活性化合物（単独または多数）の量を含む。

【００９１】 ０．２５〜９５％の範囲内の活性成分を非毒性キャリヤーから成る残部と共に
含む投薬形または組成物を調製してもよい。

【００９２】 経口投与のために、製剤学的に許容できる非毒性組成物は、通常使用される賦
形剤、例えばマンニトール、ラクトース、セルロース、セルロース誘導体、クロ
スカルメロースナトリウム(sodium crosscarmellose)，デンプン、ステアリン酸
マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、グルコース、スクロース、炭酸
マグネシウムなどの医薬用グレードのいずれかを組み込んで形成される。かかる
組成物は、液剤、懸濁剤、錠剤、丸薬、カプセル剤、散剤、徐放処方などの形を
取る。かかる組成物は、活性成分１％〜９５％、さらに好ましくは２〜５０％、
最も好ましくは５〜８％を含んでもよい。

【００９３】 非経口投与は、一般に皮下、筋肉内または静脈内のいずれかによる注射による
ことを特徴とする。注射用薬剤は、慣用の形、すなわち液状溶液または懸濁液、
注射の前に液体中の溶液または懸濁液とすることに適する固体形、またはエマル
ションとして調製できる。適当な賦形剤は、例えば水、生理食塩水、デキストロ
ース、グリセロール、エタノールなどである。さらに所望の場合には、投薬され
る薬剤組成物は少量の非毒性補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤
など、例えば酢酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタ
ノールアミン、トリエタノールアミンナトリウムアセテートなども含んでもよい
。

【００９４】 かかる非経口組成物内に含まれる活性化合物の割合は、その特定の性質、なら
びに化合物の活性および患者の必要性に大きく依存する。しかし、溶液中の０．
１％〜１０％の活性成分の割合が使用可能であり、そして組成物が、後に上記の
割合に希釈される固体である場合にはさらに高いであろう。好ましくは、組成物
は溶液内で活性薬剤の０．２〜２％を含む。

【００９５】 実施例 下記の実施例は、本発明を例示する。その他の態様は、これらの実施例を参考
にして当該技術分野の熟練者により考案されるであろう。

【００９６】 実施例１ 新規ＧＰＣＲの分析 配列番号１中に記載の配列は、既知リガンドを有する関連ＧＰＣＲが発見でき
るかどうかを試験するためにＢＬＡＳＴ(Altschul et al., 1997) サーチにより
分析した。しかし、選別されたこのオーファンＧＰＣＲの最も近い同族体はオー
ファンＧＰＣＲ自体であった。新規のＧＰＣＲ（ラットアデニン結合ＧＰＣＲ）
と共通の残基を約５０％有する後根神経節からクローンしたヒトＧＰＣＲのファ
ミリーがあった（ダーヴェント配列データベース受託番号Ｚ１００６７、Ｚ１０
０６８、Ｚ１００６９、Ｚ１００７０、Ｚ１００７１およびＺ１００７２）。次
に最も近い同族体は、アデニン結合ＧＰＣＲと３３％の残基を共有するｍａｓ関
連遺伝子であった。

【００９７】 配列番号１のヌクレオチド配列を用いて、本発明者らは、上記のヒトＧＰＣＲ
がラットの新規ＧＰＣＲの６個のヒト同族体であると同定した。これらはヒトア
デニン結合ＧＰＣＲ１（配列番号３）、ヒトアデニン結合ＧＰＣＲ２（配列番号
５）、ヒトアデニン結合ＧＰＣＲ３（配列番号６）、ヒトアデニン結合ＧＰＣＲ
４（配列番号７）ヒトアデニン結合ＧＰＣＲ５（配列番号８）およびヒトアデニ
ン結合ＧＰＣＲ６（配列番号９）と名付けられた。ヒトアデニン結合ＧＰＣＲ１
のヌクレオチドおよび核酸配列を配列番号３および配列番号４に示し、ラットア
デニン結合ＧＰＣＲ（配列番号２およびヒトアデニン結合ＧＰＣＲ１（配列番号
４）のアミノ酸配列を整列して図１に示した。ヒトアデニン結合ＧＰＣＲ２、ヒ
トアデニン結合ＧＰＣＲ３、ヒトアデニン結合ＧＰＣＲ４、ヒトアデニン結合Ｇ
ＰＣＲ５およびヒトアデニン結合ＧＰＣＲ６の核酸配列を、それぞれ配列番号５
〜９に示した。配列番号５中の「Ｎ」はＡまたはＴまたはＣまたはＧである。

【００９８】 実施例２ 新規ＧＰＣＲの自然リガンドの同定 既知リガンドと関連するＧＰＣＲが従来技術からは発見できなかったので、発
明者らは、どの自然リガンドが受容体に結合するかを同定する試みを始めた。配
列決定されたＧＰＣＲの自然リガンドを同定するために、「逆薬理学」を採用し
た。本質的に、このＧＰＣＲが発現される組織（大脳皮質）からの抽出物を調製
し、そして自然リガンドの精製に次いでオーファンＧＰＣＲの活性化に基づく細
胞アッセイを行った。

【００９９】 実施例３ 哺乳動物内の一過性発現およびＦＬＩＰＲアッセイ 全長リーディングフレームを哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３(Invitrogen,
Carlsbad, CA, U.S.A.)内に挿入し、そして得られた発現構築物をＦｕＧＥＮＥ
試薬(Roche Molecular Biochemicals,Mannheim、ドイツ) を用いて、ｐＬＥＧ／
ＧｑｉまたはｐＬＥＧ／Ｇｑｉｏ(Molecular Devices, Sunnydale, CA, U.S.A.)
を用いて安定にトランスフェクションしたＨＥＫ２６３細胞(E. Bender, 未発表
) 内に一過性トランスフェクションした。供給者の推奨に従って、フルオ−４(M
olecular Probes, Eugene, OR, U.S.A.)を細胞に加えた。

【０１００】 実施例４ 組織抽出物の調製および抽出物分別 ブタ皮質１０ｋｇをホモジナイズし、そしてメタノール／水／酢酸、９０／９
／１，ｖ／ｖ／ｖ中で抽出した。遠心分離した後、上清をｎ−ヘキサン抽出によ
り脱脂質しそして水相をメガボンデルト(Megabondelute) 分別により分別した。
５０％アセトニトリル／Ｈ₂ Ｏで溶離する物質をさらにＨＰＬＣ１８カラムで分
別した。これから誘導された画分をＦＬＩＰＲアッセイおける新規ＧＰＣＲの活
性化に関して試験した。引き続くハイパーシル(Hypersil)Ｃ１８、分析Ｃ８カラ
ム、バイオセプ(Biocep)カラム、そして最後にＨＰＬＣ Ｃ１８カラムでの精製
工程に続いて、新規のＧＰＣＲトランスフェクション細胞を活性化する画分のた
めのＦＬＩＰＲに基づく活性化アッセイを行った。最終精製工程後に活性を含む
画分を質量分光測定により分析した（Ｑ−ＴＯＦ、MicroMass, Manchester, U.K
.)。

【０１０１】 Ｃ１８カラムによる最初の分別の後のブタ皮質抽出物のスクリーニングは、む
しろ広範囲の画分を与え、これは新規のＧＰＣＲ発現構築物を用いて一過性トラ
ンスフェクションした細胞に対して一過性細胞内Ｃａ²⁺放出をもたらした。これ
はＧｑｏまたはＧｑｉキメラのいずれかを発現するＨＥＫ２９３細胞の場合に該
当する（図２および図３）が、しかし野生型ＨＥＫ２９３細胞の場合には該当し
ない（データは記載しない）。これらの画分の一つである両方のＧタンパク質キ
メラに対して強い刺激を発生した第１９番をさらなる二次分別のために選定しそ
して上記のように処理した。精製は、活性アッセイに基づくＦＬＩＰＲにより行
われそして最後のカラム流から活性を示した画分を質量分光測定にかけて純度な
らびにこれが含む化合物の構造を決定した。

【０１０２】 実施例５ 質量分光測定による活性化物質の同定 シンメトリー(Symmetry)Ｃ１８（４．６ｘ２５０ｍｍ、５μｍ、Waters）逆相
カラムからの活性精製画分の質量分析は、ｍ／ｚ１３６における一つの主要イオ
ンを与えた。質量を、重要なイオン（１３６．０６２３Ｄａ）に対してさらに正
確な質量を与える（ＮａＩ＋Ｎａ）⁺ イオン（１７２．８８４０Ｄａ）に固定し
た。この質量を元素組成分析に使用した。質量精度許容範囲を２０ｐｐｍに設定
した。最善の適合はＣ₅ Ｈ₆ Ｎ₅ （１３６．０６２３Ｄａ）により与えられ、こ
れはアデニン＋Ｈ⁺ に相当する。本来の分子のＣＩＤスペクトルを合成アデニン
のものと比較した。

【０１０３】 両方の親分子のフラグメント化は、ｍ／ｚ１１９．０、１０９．０、９４．０
、９２．０、８２．０、７７．０、６７．０および６５．０における同じフラグ
メントイオンをもたらした。Ｑ−ＴＯＦに基づくタンデム質量分光測定により得
られた結果からの結論は、活性化物質はアデニンであるというものであった。従
って、新規ＧＰＣＲはアデニン結合ＧＰＣＲと命名された。

【０１０４】 実施例６ 選択された純粋化合物を用いる新規ＧＰＣＲの試験 質量分光測定から得られた結果を確認するために、純粋アデニンを最終濃度３
．３ｎＭ〜３３μＭとなるようにＰＢＳ中に溶かし、そしてラット新規ＧＰＣＲ
（アデニン結合ＧＰＣＲ）／ｐｃＤＮＡ発現構築物を用いて一過性トランスフェ
クションしたＨＥＫ２９３／Ｇａｑｏ細胞、および空の発現ベクターを用いてト
ランスフェクションしたものに加えた。上記のＦＬＩＰＲアッセイを用いて、２
種の過渡体の間の差として測定した新規ＧＰＣＲへ帰属できる過渡体を有する両
方の細胞の組内でカルシウム過渡体を測定した。結果を図４に示す。アデニンは
、細胞内で投与量応答性カルシウム過渡体を引き起し、新規ＧＰＣＲ（アデニン
結合ＧＰＣＲ）がこの化合物に対して高い親和性を有することを示した。反対に
、他のプリン類およびピリミジン類は、アゴニスト活性を示さなかった。図５は
、カルシウム過渡体が３．３μＭのウリジン、グアニン、ヒポキサンチン、キサ
ンチン、カフェイン、ＵＤＰまたはＵＤＰの添加によりＨＥＫ２９３／Ｇａｑｏ
細胞中に誘発できず、アデニンに対するアデニン結合ＧＰＣＲ受容体の特異性を
確認した。アデニンに対する受容体の特異性をさらに試験するために、多数のヌ
クレオシドおよびヌクレオチド誘導体を同じアッセイを用いて試験した。結果を
図６に示す。アデニンのヌクレオシドおよびヌクレオチド誘導体に対して、アデ
ノシンおよびＡＭＰのみが高濃度でいくらかの弱い部分アゴニズムを示す（＞３
．３・Ｍ）。

【０１０５】 同じ化合物の間で、アンタゴニスト性を有する分子を見出すことができるかど
うかを試験するために、アデニン結合ＧＰＣＲを用いてトランスフェクションし
た細胞を種々のプリン類（グアニン、ヒポキサンチン、キサンチン、カフェイン
、テオフィリン）、ピリミジン類（ウリジン、ＵＤＰ、ＵＴＰ）、他のヌクレオ
チド受容体に対する既知アンタゴニスト（スラミン、反応性ブルー）およびアデ
ニンのヌクレオシドおよびヌクレオチド誘導体（アデノシン、ＡＭＰ、ＡＤＰ、
ＡＴＰ）に３０μＭから３０ｐＭの範囲の濃度で、ＦＬＩＰＲでＣａ²⁺過渡体を
測定しながら暴露した。上記の以外のさらなるアゴニスト効果はこの実験で発見
されなかった。室温で１５分間のインキュベーションの後、同じ細胞を３０ｎＭ
アデニンを用いてチャレンジしてスーパーフュージョンの第一ラウンドで加えた
分子のアンタゴニスト性質を検出した。グアニンのみが３０および３μＭで弱い
アンタゴニスト効果を示した（図７）。すべての他の化合物は、試験した濃度で
はアデニン結合ＧＰＣＲに対してアンタゴニスト効果を誘発しなかった。

【０１０６】 実施例７〜１２ 一過性および永久トランスフェクションされたＣＨＯ細胞上 のラットアデニン受容体の特性付け 新規のラットアデニン受容体をさらに特性付けるために、リポフェクタミンプ
ラス法(lipofectamine plus method) を用いてＣＨＯ細胞を一過性および永久ト
ランスフェクションした。種々のアデニン誘導体の薬理学的性質は、放射リガン
ド結合実験、〔³⁵Ｓ〕ＧＴＰγＳ結合の刺激およびｃＡＭＰ測定を用いて評価し
た。すべてのこれらの実験は、対照としての野生型ＣＨＯ細胞と平行して行った
。

【０１０７】 実施例７は、一過性および永久トランスフェクションしたＣＨＯ細胞中での〔
³Ｈ〕アデニンを用いる放射リガンド結合実験を記述する。アデニンに応答する
〔³⁵Ｓ〕ＧＴＰγＳの結合の測定は、実施例８および１０中のそれぞれ一過性お
よび永久トランスフェクションした細胞について記述する。アデニンに応答する
ｃＡＭＰの測定は、実施例９および１１中のそれぞれ一過性および永久トランス
フェクションした細胞について記述する。実施例１２では、細胞内Ｃａ²⁺へのア
デニンの効果を記述する。細胞培養およびトランスフェクション方法 ＣＨＯ細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清、および１００ＩＵ／ｍｌペニ
シリンＧ、１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン、１１０μｇ／μｌピルビ
ン酸および３００μｇ／ｍｌ Ｌ−グルタミンを含む抗生物質溶液を１：１の比
で補足したダルベッコ(Dulbecco)の変更イーグル培地（ＤＭＥＭ）／栄養素混合
物ハム(Ham) のＦ１２(Life Technologies、ベルギー）中で維持した。細胞を１
７５ｃｍ² 培養フラスコ中、３７℃、５％ＣＯ₂ 環境中で培養した。永久トラン
スフェクションされた細胞のために、２週間に１回、トランスフェクションされ
た細胞を、８００μｇ／ｍｌゲネチシン(geneticine)（Ｇ４１８）を含む選択培
地（ダルベッコの変更イーグル培地（ＤＭＥＭ） 栄養素混合物ハムのＦ１２（
比率１：１）、Life Technologies 、ベルギー）中で培養した。

【０１０８】 ＣＨＯ細胞の一過性トランスフェクションのために、リポフェクタミンＰＬＵ
Ｓ法(Life Technologies) を利用した。トランスフェクションの１日前に、ＤＭ
ＥＭ栄養素混合物ハムのＦ１２（比率１：１）(Life Technologies) 中に２０，
０００細胞／ｃｍ² の密度で、５０ｍｍペトリ皿中にＣＨＯ細胞を接種分散した
。１枚のペトリ皿のトランスフェクションのために、６．５μｇ ＤＮＡを１７
．５μｌ ＰＬＵＳ試薬(Life Technologies) に加え、混合しそして１５分間室
温でインキュベーションした（溶液Ａ）。リポフェクタミンＰＬＵＳ試薬１５μ
ｌを７３５μｌ無血清培地に加えた（溶液Ｂ）。溶液ＡおよびＢを一緒にし、軽
く混合しそして１５分間室温でインキュベーションして複合体を形成させた。１
５分後に、３．５ｍｌ無血清培地を混合物に加えた。細胞を無血清培地を用いて
１回洗浄しそしてＤＮＡ−リポフェクタミンＰＬＵＳ複合体（最終体積５ｍｌ中
）を細胞上に加えそして３時間、３７℃、５％ＣＯ₂ のインキュベーター中でイ
ンキュベーションした。インキュベーションの後、２０％熱不活性化ウシ胎児血
清を補足したＤＭＥＭ／ハムのＦ１２（比率１：１）５ｍｌを細胞上に加えそし
て一晩インキュベーター内に置いた。次の日に、培地を取り去りそして上記と同
じ培養培地と交換した。

【０１０９】 リポフェクタミンＰＬＵＳ法は、ＣＨＯ細胞の永久トランスフェクションのた
めにも僅かな変更を加えて利用した。トランスフェクションの１日後、培地を選
択培地に交換し、これを２〜３日毎に交換した。細胞をコロニーが出現するまで
培養し（８〜１０日）そしてさらなる培養および実験のために１７５ｃｍ² 培養
フラスコに分けた。モノクローナル細胞系統は、９６ウエルプレート内に限定希
釈接種により調製した。膜調製 膜は、全粒状画分として調製した。細胞系統を１４５ｍｍペトリ皿上で９０％
集密となるまで培養しそして５ｍＭ酪酸ナトリウムを用いて採取の２４時間前に
処理した。培地を取り除きそして細胞を氷冷リン酸塩緩衝塩水（Ｃａ²⁺およびＭ
ｇ²⁺を含まないＰＢＳ）を用いて２回洗浄し、プレートから５０ｍＭトリス−Ｈ
Ｃｌ緩衝液、ｐＨ７．４中にかき落とし、そして遠心分離（１６，０００ＲＰＭ
、４℃で１０分間）により捕集した。細胞ペレットを等張性５ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ緩衝液、ｐＨ７．４中に再懸濁し、そしてウルトラタラックス(Ultra Turrax)
ホモジナイザー(Janker Kunkel、ドイツ）を用いてホモジナイズした。ホモジナ
イズ物を１８，０００ＲＰＭ、４℃で２０分間遠心分離した。最終ペレットを５
０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４中に再懸濁し、そして−７０℃のアリ
コート内に保管した。タンパク質測定は、ブラドフォード(Bradford)タンパク質
アッセイ(Biorad 、ドイツ）を用い、標準としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
を用いて行った。

【０１１０】 実施例７ 〔³Ｈ〕アデニン結合 Ａ）方法 −〔³Ｈ〕アデニン結合実験は、トランスフェクション前の野生型細胞
系統ならびに一過性および永久トランスフェクションした細胞系統を特性付ける
ために行った。膜を氷上で解凍しそして１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ および１ｍＭ Ｅ
ＧＴＡを補足した５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．４中で希釈した。非特
異性結合は１μＭアデニンの存在下で定義されそして２５℃で〔 ³Ｈ〕アデニン
（比放射能３０．４Ｃｉ／ミリモル）を用いる１時間インキュベーションが、飽
和および競合結合アッセイのために最適と分かった。両方のアッセイは、最終体
積５００μｌで、トランスフェクションされたＣＨＯ細胞のためには膜タンパク
質１８μｇそして野生型ＣＨＯ細胞のためには膜タンパク質３０μｇを飽和結合
のために使用して行った。競合結合実験のためには、膜タンパク質１５および５
０μｇをそれぞれトランスフェクションおよび野生型細胞のために使用した。反
応は、ブランデル(Brandel) ミニチャンネル細胞ハーベスター（９６ウエル）を
用いてウオットマン(Whatman) ＧＦ／Ｂフィルターを通す迅速濾過により終結さ
せた。フィルターを３回、氷冷５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．４を用い
て洗浄し、液体シンチレーションバイアルに移しそしてシンチレーション液３ｍ
ｌ（Ultima Gold MV, Packard,オランダ）３ｍｌを加えた。ガラス繊維フィルタ
ーを均等に半透明にするために、試料を少なくとも６時間後にβ−シンチレーシ
ョンカウンターで計数した。

【０１１１】 〔³Ｈ〕アデニン結合の飽和分析は、０．２〜９０ｎＭの範囲の放射リガンド
の１８種の濃度を用いて行った。

【０１１２】 化合物、アデニン、１−メチルアデニンおよびその他の類似体による〔³Ｈ〕
アデニンの競合的阻害は、〔³Ｈ〕アデニン１０ｎＭおよび５桁にわたる種々の
濃度の非標識化合物を用いて行った。

【０１１３】 結合部位の最高数（Ｂ_max）、見かけの平衡解離定数（Ｋ_D）およびｐＩＣ₅₀値
（ＩＣ₅₀値としては比放射リガンド結合の５０％を阻害する濃度を表す）を非線
型あてはめより誘導した。ｂ）結果： 〔³Ｈ〕アデニンを用いる予備放射リガンド結合実験を種々の受容体
の野生型細胞について行った。アッセイ条件は、トランスフェクションされた細
胞のためのものと同様であった。種々の細胞系統を用いて得られた結合結果を以
下に示す。 Ｃ６グリオーム： ８３９ ｆモル／ｍｇタンパク質 Ｃｏｓ７： ２２６ ｆモル／ｍｇタンパク質 ＨＥＫ２９３： １６８ ｆモル／ｍｇタンパク質 ＮＩＨ３Ｔ３： ６４２ ｆモル／ｍｇタンパク質 ＣＨＯ： ３０３ ｆモル／ｍｇタンパク質（プール１） ５８３ ｆモル／ｍｇタンパク質（プール２） ＣＨＯ細胞は、ラットアデニン受容体を用いるトランスフェクションおよびさ
らなる実験のために選択した。

【０１１４】 独立した実験で、トランスフェクション（熟練者には公知の慣用の技術を用い
るβ−ｇａｌ染色により評価して効率は約５０〜６０％であった）後４８時間の
ＣＨＯ細胞を〔³Ｈ〕アデニン結合に関して評価した。４ｎＭ〔³Ｈ〕アデニンを
用いて行った予備結合実験において、下記の結合レベルが観察された： プール１ ３５５４ ｆモル／ｍｇタンパク質 プール２ ３４４４ ｆモル／ｍｇタンパク質 プール３ ２４３６ ｆモル／ｍｇタンパク質 プール４ １７１７ ｆモル／ｍｇタンパク質 〔 ³Ｈ〕アデニンの飽和結合分析は、トランスフェクションならびに野生型Ｃ
ＨＯ細胞に対して１００・Ｍグアニリルイミドジホスファート（Ｇｐｐ−ＮＨｐ
）を加えおよび加えないで、０．１〜８０ｎＭの範囲の平均して１６種の放射リ
ガンド濃度を用いて行った（表１）。Ｇｐｐ−ＮＨｐの添加は、ＧＰＣＲの高親
和性またはアゴニスト結合部位をブロックして、低親和性部位のみが利用された
。

【０１１５】 トランスフェクションされた細胞中で、平均飽和結合レベルは約１９ｐモル／
ｍｇであり、〔 ³Ｈ〕アデニンに対するＫ_D 値は２４ｎＭであった。同様のＫ_D
値を有する特異性結合が野生型ＣＨＯ細胞でも観察されたが、しかし大幅に低い
Ｂｍａｘ（約１．１ｐモル／ｍｇ）を有していた。さらに、トランスフェクショ
ンされた細胞のＫ_DはＧｐｐ−ＮＨｐ添加に影響を受けたが、一方、野生型細胞
におけるＫ_Dは影響を受けなかった。

【０１１６】 種々のアデニン誘導体による〔³Ｈ〕アデニン結合の競合阻害は、受容体を用
いて一過性トランスフェクションされた細胞および野生型ＣＨＯ細胞に対して〔³ Ｈ〕アデニン１５ｎＭを用いて行った（表２）。

【０１１７】 高親和性競合結合は、アデニン自体を用いてのみ得られ、１８ｎＭのＫｉ値を
有し、これは直接測定したＫ_D 値に非常に近かった。

【０１１８】 実施例８ 一過性感染細胞における〔³⁵Ｓ〕ＧＴＰ・Ｓ結合 ａ）方法 −Ｇタンパク質への〔³⁵Ｓ〕ＧＴＰ・Ｓ結合の決定は、ラザレノ(Lazar
eno, Methods Mol.Biol., 83:107-116, 1997) の変更した方法に従って行った。
これらの実験は、膜調製のレベルに対する受容体の一次機能評価のために行った
。

【０１１９】 予備〔³⁵Ｓ〕ＧＴＰγＳ結合実験において、アッセイ条件を最適化し、これは
下記のインキュベーション緩衝液の選択となった：１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０
・Ｍ ＧＤＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ および１０μｇ／ｍｌサポニンを含む２０
ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．４。アッセイ混合物は、トランスフェクションおよ
び野生型ＣＨＯ細胞に対してそれぞれ１０および３５μｇの膜タンパク質を含ん
でいた。

【０１２０】 アゴニスト活性を試験するために、希釈した膜１７５μｌを上記の緩衝液中で
、緩衝液２５μｌおよび種々の濃度の化合物２５μｌと一緒に全体積２２５μｌ
中で前インキュベーションした。３０℃での２０分間の前インキュベーション期
間の後、〔³⁵Ｓ〕ＧＴＰγＳ ２５μｌを最終濃度０．２５ｎＭまで加えそして
アッセイ混合物をさらに２０分間、３０℃でインキュベーションした。結合およ
び遊離〔³⁵Ｓ〕ＧＴＰγＳを、フィルターメイト(Filtermate)１９６濾過を用い
る減圧下でのユニフィルター^TM(Unifilter) −９６、ＧＦ／Ｂ^TM上での迅速濾過
(Packard Company、オランダ）により分離した。フルター装置上の結合放射能の
量は、フィルターの乾燥およびシンチラント(scintillant) 添加(Microscint-O;
Packard Company) の後に液体シンチレーション計数により決定した。

【０１２１】 基礎〔³⁵Ｓ〕ＧＴＰγＳ結合は、化合物の不在で測定した。アゴニストによる
刺激は、基礎レベル上の増加割合として算出した。Ｓ字型アゴニスト濃度−応答
曲線は、グラフパッドプリズム(GraphPad Prism)プログラムを用いる非線型回帰
より解析した。種々の濃度点で二重に試験し、そして報告したデータは独立した
実験から選別した。ｂ）結果 −一過性トランスフェクションされたＣＨＯ細胞からの膜上の〔³⁵Ｓ〕
ＧＴＰγＳ結合は、基礎結合レベルの１５０％上のアデニンによる最高刺激を有
していた。アデニンの平均ＥＣ₅₀は１１２ｎＭであった。１−メチルアデニンお
よびＡＭＰは、受容体を部分的に大きく下回る効力で刺激し、これは競合結合ア
ッセイにおけるこれらの低い親和性と同一性した。

【０１２２】 ＧＴＰγＳ結合の非刺激が、野生型ＣＨＯ細胞中で測定された（表３および図
８ａ（一過性トランスフェクションされたＣＨＯ）および表８ｂ（野生型ＣＨＯ
）参照）。百分率の値は、最高アデニン応答に対して正規化しすなわち基礎レベ
ル上のアデニン刺激を１００％とした。

【０１２３】 実施例９ 一過性トランスフェクションされたＣＨＯ細胞におけるｃＡＭＰ測 定 ａ）方法 −一過性トランスフェクションされたＣＨＯ細胞に対して、ｃＡＭＰ測
定をＮＥＮ（ベルギー）からの直接ＲＩＡキットを用いて行った。

【０１２４】 １ｍｌ ０．０４％ＥＤＴＡを加えて細胞を５０ｍｍペトリ皿から採取しそし
てＰＢＳ（Ｃａ²⁺およびＭｇ²⁺を含まず）中に再懸濁した。次いで細胞を５分間
、１，５００ＲＰＭで遠心分離し、上清を取り去りそしてペレットを刺激緩衝液
（供給者のＮＥＮから提供）中に再懸濁した。細胞を計数しそして５０μｌを９
６ウエルフラッシュプレートのそれぞれのウエルに１０⁶ 細胞／ウエルの密度で
加えた。ｃＡＭＰの標準曲線は、１０〜１，０００ｎＭの範囲にわたる刺激緩衝
液中で調製し、そして５０μｌをフラッシュプレートに加えた。

【０１２５】 フォルスコリン(forskolin) （５０μＭで）を含むＰＢＳ中に化合物を希釈し
、そして最終濃度の２倍のリガンド５０μｌを細胞に加えそして２０分間、３７
℃でインキュベーションした。２０分間のインキュベーションの後、〔 ¹²⁵Ｉ〕
ｃＡＭＰトレーサー（２μＣｉ）の１００μｌをそれぞれのウエルに加えて、２
００μｌ／ウエルの最終体積とした。プレートをトップカウント^TMマイクロプレ
ートシンチレーションカウンター(Packard, オランダ) 中で計数するまで室温に
置いた。Ｓ字型濃度応答曲線（二重測定点）をグラフパッドプリズムプログラム
(GraphPad Software, CA, USA)を用いて解析した。ｂ）結果 −直接法を用いるフォルスコリン刺激ｃＡＭＰの阻害は、非常に低かっ
た（１５〜３０％）。フォルスコリン、基礎および両方の方法のｐＥＣ₅₀値を表
４に示す。アッセイからの代表的な値を図９ａ（０．５％ｈｉＦＣＳ）および図
９ｂ（２％ｈｉＦＣＳ）に示す。

【０１２６】 このアッセイの応答ウインドウは低いけれども、アッセイは受容体に対するア
デニンのアゴニスト活性を確認しそして測定されたＥＣ₅₀（約１５ｎＭ）がその
アデニン親和性に近かった。

【０１２７】 一過性トランスフェクションされた細胞に対する機能性ｃＡＭＰアッセイにお
ける低いシグナルは細胞の異種性（トランスフェクションおよび非トランスフェ
クション細胞）によるものであったので、永久トランスフェクションされた細胞
系統を選択することが決定された。

【０１２８】 多数のモノクローナル細胞系統が、さらなる研究のために選択された３種のク
ローン２６（マザープレート１）、２８、２９および３０（マザープレート９）
を用いて上記の放射リガンド結合により研究された。

【０１２９】 実施例１０ 永久トランスフェクションされた細胞における〔³⁵Ｓ〕ＧＴＰγ Ｓ結合 モノクローナル細胞系統の一次機能的特性検討は、〔³⁵Ｓ〕ＧＴＰγＳ結合実
験で行った。４種の選択したクローンのそれぞれに対するアデニンによる〔³⁵Ｓ
〕ＧＴＰγＳ結合の最大刺激は、一過性トランスフェクション体に見出されたも
のよりもはるかに高く（５００〜６５０倍）、永久細胞系統の期待された通りの
良いカプリングを確認した（表５参照）。しかし、６２ｎＭの平均ＥＣ５０は、
一過性調製体に近い（実施例８参照）。アデニンによる〔³⁵Ｓ〕ＧＴＰγＳ結合
刺激の例を図１０に示す。

【０１３０】 実施例１１ 永久トランスフェクションされたＣＨＯ細胞におけるｃＡＭＰ測 定 永久トランスフェクションされたＣＨＯ細胞について、ＮＥＮ（ベルギー）か
らの間接ＲＩＡキットを用いてｃＡＭＰ測定を行った。 ａ）方法：実験の２日前に、実験の日に約９０％集密となるために必要な密度で
９６ウエルプレート中に細胞を接種分散させた。培養媒体を取り去った後に、２
５ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１２０ｍＭ ＮａＣｌ、５．４ｍＭ ＫＣ
ｌ、０．８ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、１．８ｍＭ ＣａＣｌ₂ 、１５ｍＭグルコースお
よび１５ｍｇ／ｌフェノールレッドを含む制御された塩溶液（ＣＳＳ）を、濃度
１ｍＭのホスホジエステラーゼ阻害剤ＩＢＭＸ（３−イソブチル−１−メチルキ
サンチン）および０．１％ＢＳＡの添加を伴って細胞を２回洗浄した。基礎ｃＡ
ＭＰレベルは、これらの添加剤を含むＣＳＳ中で決定しそして最高に刺激された
ｃＡＭＰレベルは、５０μＭフォルスコリンの存在下で決定された。アゴニスト
活性を試験するために、化合物を細胞を一緒に２０分間、３７℃でインキュベー
ションした。反応は氷冷ＨＣｌＯ₄ （１Ｎ）を添加して停止しそして−２０℃で
保管した。解凍の後、混合物を当量のリン酸塩緩衝ＫＯＨを用いて中和し、４℃
で３０分間放置して塩を沈降させそして２，０００ＲＰＭで５分間、４℃で遠心
分離した。

【０１３１】 ｃＡＭＰレベルの定量的測定のために、ＮＥＮからの９６ウエルフラッシュプ
レート放射免疫アッセイキットを供給者のプロトコールに従って使用した。Ｓ字
型濃度応答曲線（二重点）をグラフパッドプリズムプログラムを用いて解析した
。ｂ）結果 −酪酸Ｎａ誘導および種々の血清濃度の影響を評価した。４種の選択し
たクローンを研究し、クローン２８（ＭＰ９）はフォルスコリン刺激ｃＡＭＰレ
ベルの最高（−７５％）の阻害を示した。野生型ＣＨＯ細胞はアデニンに対して
いかなる応答も示さなかった。クローン２８および野生型ＣＨＯ細胞のフォルス
コリン、基礎およびｐＥＣ₅₀値を表６に示す。ｃＡＭＰ試験における信頼できる
高ウインドウは、受容体発現レベルの酪酸Ｎａ誘発の後にのみ得られた。測定さ
れたＲＣ５０は、低いナノモル範囲（３ｎＭ）であった。代表的な濃度応答曲線
を永久トランスフェクションおよび野生型ＣＨＯ細胞について図１１ａおよび１
１ｂにそれぞれ示す。

【０１３２】 実施例１２ 永久トランスフェクションされたＣＨＯ細胞における細胞内カル シウム測定 最後に、細胞内Ｃａ²⁺の測定を最善に機能的にカプリングしたＣＨＯ細胞系統
、すなわちクローン２８、に関して行った。酪酸Ｎａ前処理の効果は、アデニン
の投与量応答曲線を用いて研究した。ａ）方法 −実験の２日前に、実験の日に約９０％細胞集密となるために必要な密
度で９６ウエルプレート中に細胞を接種分散させた。カルシウム緩衝液（５ｍＭ
ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ、ｐＨ７．４、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣ
ｌ₂ 、５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭグルコース、１．２５ｍＭ ＣａＣｌ₂ 、２．
５ｍＭプロベネシド、ｐＨ７．４）中で化合物を最終濃度の２倍に希釈した。基
礎値のためにはカルシウム緩衝液を加えそして最高応答のためには１０μＭイオ
ノマイシンを使用した。培地を取り去りそしてプロベネシド（５ｍＭ）、指示薬
フルオ−３（２μＭ）、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ、ｐＨ７．４および０
．１％ＢＳＡを補足した無血清培地内にインキュベーター中３７℃で細胞を加え
た。６０分間のインキュベーションの後、細胞をカルシウム緩衝液を用いて３回
洗浄した。希釈した化合物１００μｌをウエルに移しそして細胞内カルシウムレ
ベルの変化をＦＬＩＰＲ^TM（蛍光測定イメージングプレートリーダー、Molecula
r Devices ）を用いて測定した。それぞれのデータ点は２重に試験しそしてＣａ²⁺ 一過性体のピークを関連シグナルと考えた。Ｓ字型濃度応答曲線をグラフパッ
ドプリズムプログラムを用いて解析した。ｂ）結果 −野生型ＣＨＯ細胞はアデニンに対していかなる応答も示さなかった。
非−酪酸Ｎａ処理細胞に対しては、アデニンは基礎相対蛍光単位（ＲＦＵ）の１
．２５倍の増加を起こし、６８００〜８５００の範囲にあった。酪酸Ｎａ処理細
胞に対しては、アデニンはＲＦＵの３倍の増加を誘発し、６６００〜１９８００
の範囲であった。アデニン応答のｐＥＣ₅₀値は、それぞれ７．１４おおび７．８
３であった。アデニンにより誘発されたＣａ²⁺応答の代表的な例は、永久トラン
スフェクションおよび野生型ＣＨＯ細胞に対してそれぞれ図１２ａおよび図１２
ｂに示す。

【０１３３】

【表１】

【０１３４】

【表２】

【０１３５】

【表３】

【０１３６】

【表４】

【０１３７】

【表５】

【０１３８】

【表６】

【図面の簡単な説明】

【図１】 ラットアデニン結合ＧＰＣＲ（配列番号２）およびヒトアデニン結合ＧＰＣＲ
１（配列番号４）のアミノ酸配列の配列整列を示す。

【図２】 Ｇαｑｏキメラを発現するＨＥＫ２９３細胞内に一過性トランスフェクション
した後のブタ皮質抽出Ｃ１８フラグメントによるラットアデニン結合ＧＰＣＲの
活性化を示す。

【図３】 Ｇαｑｉキメラを発現するＨＥＫ２９３細胞内に一過性トランスフェクション
した後のブタ皮質抽出Ｃ１８フラグメントによるラットアデニン結合ＧＰＣＲの
活性化を示す。

【図４】 ３．３ｎＭ〜３３ｎＭアデニンの添加によるラットアデニン結合ＧＰＣＲ／ｐ
ｃＤＮＡ３を用いてトランスフェクションしたＨＥＫ２９３／Ｇαｑｉ測定中の
Ｃａ²⁺過渡体の刺激を示す。

【図５】 ３．３μＭウリジン、グアニン、ヒポキサンチン、キサンチン、カフェイン、
ＵＤＰ、およびアデニンの添加によりラットアデニン結合ＧＰＣＲ／ｐｃＤＮＡ
３を用いてトランスフェクションしたＨＥＫ２９３／Ｇαｑｉ細胞中に誘発され
たＣａ²⁺過渡体を示す。

【図６】 ３．３・Ｍアデノシン、ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰおよびアデニンの添加により
ラットアデニン結合ＧＰＣＲ／ｐｃＤＮＡ３を用いてトランスフェクションした
ＨＥＫ２９３／Ｇαｑｉ細胞中に誘発されたＣａ²⁺過渡体を示す。

【図７】 ３・Ｍ ＰＢＳ、キサンチン、グアニンおよびヒポキサンチンの添加によりラ
ットアデニン結合ＧＰＣＲ／ｐｃＤＮＡ３を用いてトランスフェクションしたＨ
ＥＫ２９３／Ｇαｑｉ細胞中に誘発されたＣａ²⁺過渡体を示す。

【図８ａ，ｂ】 ８ａは、ラットアデニン結合ＧＰＣＲを用いて一過性トランスフェクションさ
れたＣＨＯ膜に対する〔³⁵Ｓ〕ＧＴＰγＳ結合の刺激を示す。データは３回の独
立した実験の平均として表し（±ＳＥＭ、ｎ＝３）、８ｂは、野生型ＣＨＯ膜に
対する〔³⁵Ｓ〕ＧＴＰγＳ結合の刺激を示す。データは３回の独立した実験の平
均として表す（±ＳＥＭ、ｎ＝３）。

【図９ａ，ｂ】 ９ａは、ラットアデニン結合ＧＰＣＲを用いて一過性トランスフェクションさ
れたＣＨＯ膜に対するフォルスコリン刺激ｃＡＭＰ形成の阻害を示す。アッセイ
は、ＮＥＮからの直接ＲＩＡキットを用いて、０．５％ｈｉＦＣＳ中で行った。
代表曲線で、９ｂは、ラットアデニン結合ＧＰＣＲを用いて一過性トランスフェ
クションされたＣＨＯ膜に対するフォルスコリン刺激ｃＡＭＰ形成の阻害を示す
。アッセイは、ＮＥＮからの直接ＲＩＡキットを用いて、２％ｈｉＦＣＳ中で行
った。代表曲線。

【図１０】 ラットアデニン結合ＧＰＣＲを用いて永久トランスフェクションされたＣＨＯ
膜に対する〔³⁵Ｓ〕ＧＴＰγＳ結合の刺激に対するアデニン投与量応答曲線を示
す。

【図１１ａ，ｂ】 １１ａは、ラットアデニン結合ＧＰＣＲを用いて永久トランスフェクションさ
れたＣＨＯ細胞（クローン２８）に対するフォルスコリン刺激ｃＡＭＰ形成の阻
害を示す。図は、それぞれ酪酸Ｎａ誘導の存在および存在しない場合の０．５お
よび１０％血清濃度を用いて得た代表的曲線を示し、１１ｂは、野生型ＣＨＯ細
胞に対するフォルスコリン刺激ｃＡＭＰ形成の阻害を示す。図は、それぞれ酪酸
Ｎａ誘導の存在および存在しない場合の０．５および１０％血清濃度を用いて得
た代表的曲線を示す。

【図１２ａ，ｂ】 １２ａは、酪酸Ｎａの存在および存在しない場合のラットアデニン結合ＧＰＣ
Ｒを用いて永久トランスフェクションされたＣＨＯ細胞（クローン２８）に対す
る細胞内Ｃａ²⁺測定のアデニン投与量応答曲線を示し、１２ｂは、酪酸Ｎａの存
在および存在しない場合の野生型ＣＨＯ細胞に対する細胞内Ｃａ²⁺測定のアデニ
ン投与量応答曲線を示す。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 9/00 Ａ６１Ｐ 9/12 9/06 25/00 9/12 25/04 25/00 25/14 25/04 25/20 25/14 Ｃ０７Ｋ 14/705 25/20 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ０７Ｋ 14/705 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 5/00 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ， ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ブイスト，アルジヤン ベルギー・ビー−2340ビールセ・トウルン ホウトセベーク30・ジヤンセン・フアーマ シユーチカ・ナームローゼ・フエンノート シヤツプ (72)発明者 エルケン，マルテイネ ベルギー・ビー−2340ビールセ・トウルン ホウトセベーク30・ジヤンセン・フアーマ シユーチカ・ナームローゼ・フエンノート シヤツプ (72)発明者 バツゲルマン，ゲールト・リユク・エリザ ベス ベルギー・ビー−3000リユーベン・オウデ マルクト13・カトリーケウニベルシタイト リユーベン (72)発明者 ユルザク，ミレク ベルギー・ビー−2340ビールセ・トウルン ホウトセベーク30・ジヤンセン・フアーマ シユーチカ・ナームローゼ・フエンノート シヤツプ (72)発明者 シヨーフス，リリアン・アメリー・ヘンリ カ ベルギー・ビー−3000リユーベン・オウデ マルクト13・カトリーケウニベルシタイト リユーベン (72)発明者 ルイテン，ワルター・ヘルマン・マリア・ ルイス ベルギー・ビー−2340ビールセ・トウルン ホウトセベーク30・ジヤンセン・フアーマ シユーチカ・ナームローゼ・フエンノート シヤツプ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA63 CA01 GA11 HA11 4B063 QA18 QA20 QQ42 QR08 QR32 QR42 QR62 QS25 QS34 QX01 4B065 AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 4C084 AA07 AA13 BA22 MA52 MA55 NA14 ZA011 ZA051 ZA221 ZA361 ZA421 ZA541 ZC781 4H045 AA10 AA30 BA10 CA40 DA50 EA20 FA74

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号２または配列番号４のポリペプチドをコードする単
   離された核酸配列。
2. 【請求項２】 配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番
   号７、配列番号８または配列番号９を含んでなる単離された核酸配列。
3. 【請求項３】 配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番
   号７、配列番号８または配列番号９に少なくとも５０％の配列同一性を有する単
   離された核酸配列。
4. 【請求項４】 配列番号２または配列番号４の配列を有する単離されたポリ
   ペプチド。
5. 【請求項５】 配列番号２または配列番号４のポリペプチドに少なくとも５
   ０％の配列同一性を有する単離されたポリペプチド。
6. 【請求項６】 ポリペプチドがアデニン結合活性を保有する、請求項５記載
   の単離されたポリペプチド。
7. 【請求項７】 請求項４または５のポリペプチドのフラグメントを含んでな
   りそしてアデニン結合活性を保有する、単離されたポリペプチド。
8. 【請求項８】 請求項４、５、６、または７中に定義されたポリペプチドを
   コードする単離された核酸。
9. 【請求項９】 プロモーターに操作可能に連結した請求項１から３までまた
   は請求項８のいずれかに定義された核酸を含んでなる発現ベクター。
10. 【請求項１０】 請求項９記載のベクターを有する宿主細胞。
11. 【請求項１１】 請求項４、５、６、または７のいずれか１項記載のポリペ
    プチドをコードする核酸の１５から５０個までのヌクレオチドのフラグメントか
    ら本質的に成る核酸プライマー。
12. 【請求項１２】 請求項４、５、６、または７のいずれか１項記載の少なく
    とも１個のポリペプチドを含んでなるＧタンパク質共役型受容体を提供し、 該受容体を推定される相互作用化合物と接触させ、そして 該化合物が該受容体と相互作用可能がであるかどうかを決定する ことを含んでなる、Ｇタンパク質共役型受容体と相互作用が可能な化合物のため
    のアッセイ。
13. 【請求項１３】 該相互作用が、該化合物が該受容体に結合する能力により
    決定される、請求項１２記載のアッセイ。
14. 【請求項１４】 該相互作用が、該化合物が該受容体の活性を調節する能力
    により決定される、請求項１２記載のアッセイ。
15. 【請求項１５】 該受容体が、細胞の中で請求項４、５、６、または７のい
    ずれか１項記載のポリペプチドが請求項９記載のベクターより発現される細胞の
    膜内に位置する、請求項１２から１４までのいずれか１項記載のアッセイ。
16. 【請求項１６】 疾患の病理がプリン受容体における作用と関連する疾患の
    治療のためのモジュレーター化合物の同定のための請求項１２から１５までのい
    ずれか１項記載のアッセイの使用。
17. 【請求項１７】 請求項１２から１５のいずれか１項記載のアッセイにより
    得られる新規化合物。
18. 【請求項１８】 疾患の病理がプリン受容体における作用と関連する疾患の
    治療のための薬剤の調製における請求項１７記載の化合物の使用。
19. 【請求項１９】 ヒトまたは動物身体内における治療方法における使用のた
    めのアデニン。
20. 【請求項２０】 疾患の病理がプリン受容体における作用と関連する疾患の
    治療のための薬剤の調製におけるアデニンの使用。
21. 【請求項２１】 ヒトまたは動物身体内における治療方法における使用のた
    めの請求項４、５、６、または７のいずれか１項記載の単離されたポリペプチド
    。
22. 【請求項２２】 疾患の病理がプリン受容体における作用と関連する疾患の
    治療のための薬剤の調製における請求項４、５、６、または７のいずれか１項記
    載の単離されたポリペプチドの使用。
23. 【請求項２３】 疾患の病理がプリン受容体における作用と関連する疾患の
    治療のための薬剤の調製における請求項１、２、３、または８のいずれか１項記
    載の単離された核酸の使用。