JP2003524372A - ヒトｋｉａａ０００１レセプターとそのリガンドの間の相互作用のアゴニストおよびアンタゴニストのためのスクリーニング方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＵＤＰ-グルコース、ＵＤＰ-ガラクトース、ＵＤＰ-グルクロン酸、ＵＤＰ-Ｎ-アセチルグルコサミンならびに関連するＵＤＰ糖とそれらの細胞レセプター、ヒトＫＩＡＡ０００１の間の相互作用のアゴニストおよびアンタゴニストを見つけるための方法を開示する。これらは、細菌、真菌、原虫およびウイルス感染、特にＨＩＶ-１またはＨＩＶ-２により引き起こされる感染のような感染；痛み；癌；糖尿病；肥満；食欲不振；大食；喘息；パーキンソン病；急性心不全；低血圧；高血圧；尿閉；骨粗鬆症；狭心症；心筋梗塞；再狭窄；アテローム性動脈硬化症；過剰な平滑筋細胞の増殖により特徴付けられる疾患；動脈瘤；創傷治癒；平滑筋細胞の欠損または平滑筋細胞の増殖の低下により特徴付けられる疾患；脳卒中；虚血；潰瘍；喘息；アレルギー；良性前立腺肥大；偏頭痛；嘔吐；不安、精神分裂病、躁鬱病、鬱病、譫妄、痴呆および重度精神遅滞を含む精神病および神経病疾患；神経組織変性疾患のような退行性疾患および、特にハンチントン病またはジル・ド・ラ・トゥレット病のような運動異常症を含むがこれらには限定されない数種のヒトの病気および疾患の治療に有効であり得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 関連出願の相互参照 本出願の特許請求の範囲は、先の仮米国特許出願 No.60/083,967(1998年5月1
日に出願)の利益を主張するもので、その内容を本明細書中に出典明示により完
全に組み入れる。

【０００２】 技術分野 本発明は、ＵＤＰ-糖（例えばＵＤＰ-グルコース、ＵＤＰ-ガラクトース、Ｕ
ＤＰ-グルクロン酸および、ＵＤＰ-Ｎ-アセチルグルコサミン）とそれらの細胞
レセプターであるヒトＫＩＡＡ０００１レセプターの間の相互作用のアゴニスト
およびアンタゴニストを見つけるための方法に関する。本発明はまた、細菌、真
菌、原虫およびウイルス感染、特にＨＩＶ-１またはＨＩＶ-２により引き起こさ
れる感染のような感染；痛み；癌；糖尿病；肥満；食欲不振；大食；喘息；パー
キンソン病；急性心不全；低血圧；高血圧；尿閉；骨粗鬆症；狭心症；心筋梗塞
；再狭窄；アテローム性動脈硬化症；過剰な平滑筋細胞の増殖により特徴付けら
れる疾患；動脈瘤；創傷治癒；平滑筋細胞の欠損または平滑筋細胞の増殖の低下
により特徴付けられる疾患；脳卒中；虚血；潰瘍；喘息；アレルギー；良性前立
腺肥大；偏頭痛；嘔吐；不安、精神分裂病、躁鬱病、鬱病、譫妄、痴呆および重
度精神遅滞を含む精神病および神経病疾患；神経組織変性疾患のような退行性疾
患および、特にハンチントン病またはジル・ド・ラ・トゥレット病のような運動
異常症を含むがこれらには限定されないヒトの病気／疾患の治療に潜在的に有効
な同定アゴニスト、アンタゴニストおよび／またはインヒビターの使用に関する
。

【０００３】 背景技術 多くの医学的に重要な生物学的プロセスが、Ｇタンパク質および／または第二
メッセンジャー、例えばｃＡＭＰを含むシグナル伝達経路に関与するタンパク質
により媒介されることは十分確立されている(Lefkowitz, Nature, 1991, 351:35
3-354)。本明細書中、これらのタンパク質を、Ｇタンパク質を含む経路に関与す
るタンパク質またはＰＰＧタンパク質という。これらのタンパク質のいくつかの
例には、アドレナリン作動性因子およびドーパミンのレセプターのようなＧタン
パク質結合（ＧＰＣ）レセプター（Kobilka,B.K.ら、 Proc. Natl Acad. Sci.、
USA、 1987、 84:46-50；Kobilka,B.K.ら、 Science、1987、 238:650−656；B
unzow, J.R.ら、 Nature、 1988、336:783-787）、Ｇタンパク質自身、エフェク
ター タンパク質（例えば、ホスホリパーゼＣ、アデニルシクラーゼ、およびホ
スホジエステラーゼ）および、アクチュエーター タンパク質（例えば、プロテ
インキナーゼＡおよびプロテインキナーゼＣ）（Siom, M.I.ら、Nature、1991、
252:802-8）が含まれる。

【０００４】 例えば、シグナル伝達の一つの形態におけるホルモン結合の効果は、細胞の内
側に存在する酵素、アデニル酸シクラーゼの活性化である。ホルモンによる酵素
の活性化は、ヌクレオチドＧＴＰの存在に依存する。ＧＴＰはまた、ホルモン結
合に影響を与える。Ｇタンパク質はホルモンレセプターをアデニル酸シクラーゼ
に接続する。ホルモンレセプターにより活性化されるとＧタンパク質はＧＴＰを
結合ＧＤＰと交換することがわかった。ＧＴＰを有する形態が次いで活性化され
たアデニル酸シクラーゼに結合する。Ｇタンパク質自身によって触媒されるＧＴ
ＰのＧＤＰへの加水分解により、Ｇタンパク質がもとの不活性型に戻る。このよ
うにして、Ｇタンパク質は、レセプターからエフェクターへシグナルを中継する
媒体として、およびシグナルの持続を制御する時計としての二重の役割を果たす
。

【０００５】 Ｇタンパク質結合レセプターの膜タンパク質遺伝子スーパーファミリーは７つ
の推定膜貫通ドメインを有するものとして特徴付けられている。そのドメインは
細胞外または細胞質ループにより連結する膜貫通αへリックスを表すと考えられ
ている。Ｇタンパク質結合レセプターには、ホルモンレセプター、ウイルスレセ
プター、成長因子レセプター、および神経レセプターのような広範囲の生物学的
に活性なレセプターが含まれる。

【０００６】 Ｇタンパク質結合レセプター（別には、７ＴＭレセプターとして知られる）は
、約２０〜３０個のアミノ酸から成るこれら７つの保存された疎水性範囲を含み
、少なくとも８つの互いに異なる親水性のループを結合しているものとして特徴
付けられている。Ｇタンパク質結合レセプター ファミリーには、精神病および
神経疾患の治療に使用される神経弛緩薬に結合するドーパミンレセプターが含ま
れる。このファミリーのメンバーの他の例には、限定されるものではないが、カ
ルシトニン レセプター、アドレナリン様物質レセプター、エンドセリン レセプ
ター、ｃＡＭＰ レセプター、アデノシン レセプター、ムスカリン様物質 レセ
プター、アセチルコリン レセプター、セロトニン レセプター、ヒスタミン レ
セプター、トロンビン レセプター、キニン レセプター、卵胞刺激ホルモン レ
セプター、オプシン レセプター、内皮細胞分化遺伝子−１ レセプター、ロドプ
シン レセプター、臭気物質レセプター、およびサイトメガロウイルス レセプタ
ーが含まれる。

【０００７】 ほとんどのＧタンパク質結合レセプターは、始めの２つの細胞外ループの各々
に、機能タンパク質の構造を安定化させると考えられているジスルフィド結合を
形成する保存されたシステイン残基を一つだけ有する。７つの膜貫通領域は、Ｔ
Ｍ１、ＴＭ２、ＴＭ３、ＴＭ４、ＴＭ５、ＴＭ６およびＴＭ７と称されている。
ＴＭ３がシグナル伝達に関係している。システイン残基のリン酸化および脂質付
加(lipidation)（パルミチル化またはファルネシル化(farnesylation)）は、い
くつかのＧタンパク質結合レセプターのシグナル伝達に影響を与え得る。ほとん
どのＧタンパク質結合レセプターは、三番目の細胞質ループ内におよび／または
カルボキシ末端に潜在的リン酸化部位を有する。β−アドレノレセプターのよう
ないくつかのＧタンパク質結合レセプターに関して、プロテインキナーゼＡおよ
び／または特異的レセプターキナーゼによるリン酸化はレセプターの脱感作を媒
介する。

【０００８】 いくつかのレセプターに関して、Ｇタンパク質結合レセプターのリガンド結合
部位は、いくつかのＧタンパク質結合レセプターの膜貫通ドメインによって形成
される親水性ソケットを含んでなり、該ソケットはＧタンパク質結合レセプター
の疎水性残基で囲まれていると考えられている。各Ｇタンパク質結合レセプター
膜貫通へリックスの親水性サイドは内側を向き、極性のリガンド結合部位を形成
すると仮定されている。ＴＭ３アスパラギン酸残基のようなＴＭ３が、Ｇタンパ
ク質結合レセプターがリガンド結合部位を有するべく、いくつかのＧタンパク質
結合レセプターに含まれている。ＴＭ５セリン、ＴＭ６アスパラギン、および、
ＴＭ６またはＴＭ７のフェニルアラニンまたはチロシンもまた、リガンド結合に
関与する。

【０００９】 Ｇ-タンパク質結合レセプターは、細胞内でヘテロ３量体Ｇタンパク質により
、様々な細胞内の酵素、イオンチャンネルおよびトランスポーターに結合するこ
とができる（Jhonsonら、Endoc. Rev.,1989, 10:317-331を参照)。異なるＧタン
パク質αサブユニットが特定のエフェクターを選択的に刺激して、細胞内の様々
な生物学的機能を調節する。Ｇタンパク質結合レセプターの細胞質残基のリン酸
化が、いくつかのＧタンパク質結合レセプターのＧタンパク質結合の制御にとっ
て重要な機構として確認されている。Ｇタンパク質結合レセプターは、哺乳動物
宿主内の多くの場所で見出されている。 過去１５年間に、７つの膜貫通（７ＴＭ）レセプターを標的とする３５０近く
の治療薬が市場に導入され、成功を修めている。

【００１０】 発明の概略 一態様において本発明は、ヒトＫＩＡＡ０００１ポリペプチドおよび組換え物
質およびそれらの製造法に関する。本発明のもう一つの態様は、そのようなヒト
ＫＩＡＡ０００１ポリペプチドおよびポリヌクレオチドを使用するための方法に
関する。そのような使用には、細菌、真菌、原虫およびウイルス感染、特にＨＩ
Ｖ-１またはＨＩＶ-２により引き起こされる感染のような感染；痛み；癌；糖尿
病；肥満；食欲不振；大食；喘息；パーキンソン病；急性心不全；低血圧；高血
圧；尿閉；骨粗鬆症；狭心症；心筋梗塞；再狭窄；アテローム性動脈硬化症；過
剰な平滑筋細胞の増殖により特徴付けられる疾患；動脈瘤；創傷治癒；平滑筋細
胞の欠損または平滑筋細胞の増殖の低下により特徴付けられる疾患；脳卒中；虚
血；潰瘍；喘息；アレルギー；良性前立腺肥大；偏頭痛；嘔吐；不安、精神分裂
病、躁鬱病、鬱病、譫妄、痴呆および重度精神遅滞を含む精神病および神経病疾
患；神経組織変性疾患のような退行性疾患および、特にハンチントン病またはジ
ル・ド・ラ・トゥレット病のような運動異常症の治療が含まれる。

【００１１】 一態様において本発明は、ヒトＫＩＡＡ０００１ポリペプチド（レセプター）
に結合し、それを活性化する（アゴニスト）またはその活性化を阻害する（アン
タゴニスト）化合物および、レセプターのリガンド、ＵＤＰ糖（例えば、ＵＤＰ
-グルコース、ＵＤＰ-ガラクトース、ＵＤＰ-グルクロン酸およびＵＤＰ-Ｎ-ア
セチルグルコサミン）をスクリーニングする方法を提供する。 特に、ヒトＫＩＡＡ０００１ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニスト
を同定するための好ましい方法は、 （ａ）細胞表面にレセプター（該レセプターは化合物の該レセプターへの結合に
応答して検出可能なシグナルを提供することができる第二の成分と会合する）を
発現している細胞を、スクリーニングすべき化合物と、ポリペプチドへの結合を
可能にする条件下で接触させること；および、 （ｂ）該化合物と該レセプターの相互作用から生じるシグナルのレベルを測定す
ることにより、化合物がレセプターに結合し、それを活性化したかどうか、ある
いは阻害したかどうかを決定すること； を含む。

【００１２】 さらに好ましい態様において本方法は、標識または非標識のＵＤＰ-糖（例え
ば、ＵＤＰ-グルコース、ＵＤＰ-ガラクトース、ＵＤＰ-グルクロン酸および、
ＵＤＰ-Ｎ-アセチルグルコサミン）の存在下でアゴニストまたはアンタゴニスト
の同定を行うことをさらに含む。 もう一つの態様において、ヒトＫＩＡＡ０００１レセプターのアゴニストまた
はアンタゴニストを同定するための方法は、 候補となる化合物の存在下、レセプターへの結合を許容する条件下で、表面に
レセプターを有する細胞への、あるいはレセプターを含む細胞膜へのリガンドの
結合の阻害を測定すること；および、 レセプターに結合したリガンドの量を測定すること（リガンドの結合の低下を
引き起こすことができる化合物がアゴニストまたはアンタゴニストである。）；
を含む。好ましくは、リガンドは、ＵＤＰ-糖（例えば、ＵＤＰ-グルコース、Ｕ
ＤＰ-ガラクトース、ＵＤＰ-グルクロン酸またはＵＤＰ-Ｎ-アセチルグルコサミ
ン）である。ＵＤＰ-糖（例えばＵＤＰ-グルコース、ＵＤＰ-ガラクトース、Ｕ
ＤＰ-ガラクトース、ＵＤＰ-グルクロン酸またはＵＤＰ-Ｎ-アセチルグルコサミ
ン）は標識されることがなおいっそう好ましい。

【００１３】 発明の開示定義 本明細書中に頻用する語の理解を容易にするために、以下の定義を提供する。 「ヒトＫＩＡＡ０００１」は一般に、配列番号２に記載するアミノ酸配列を有
するポリペプチドまたはその対立変種を言う。 「ＵＤＰ糖」はひとまとめにして、ＵＤＰ-グルコース、ＵＤＰ-ガラクトース
、ＵＤＰ-グルクロン酸、ＵＤＰ-Ｎ-アセチル グルコサミンおよび関連するＵＤ
Ｐ糖を言う。ＵＤＰ-グルコース、ＵＤＰ-ガラクトース、ＵＤＰ-グルクロン酸
、ＵＤＰ-Ｎ-アセチルグル コサミンの構造を以下に示す。

【００１４】

【化１】

【００１５】

【化２】

【００１６】 「レセプターの活性」または「レセプターの生物学的活性」は、類似の活性ま
たは変更された活性または、望ましくない副作用が低下した活性を含む、該ヒト
ＫＩＡＡ０００１の代謝的または生理的機能を言う。さらに、該ヒトＫＩＡＡ０
００１の抗原性活性および免疫原性活性も含まれる。 「ヒトＫＩＡＡ０００１ポリペプチド」は、ヒトＫＩＡＡ０００１と十分類似
するアミノ酸配列を有し、好ましくはレセプターの生物学的活性を少なくとも一
つ呈するポリペプチドを言う。 「ヒトＫＩＡＡ０００１遺伝子」は、配列番号１に記載したヌクレオチド配列
を有するポリヌクレオチドまたはその対立変種および／またはその補体を言う。 「ヒトＫＩＡＡポリヌクレオチド」は、配列番号２のヒトＫＩＡＡ０００１ポ
リペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドまたは、配列
番号１に含まれるヌクレオチド配列に対し、増幅のために、あるいはプローブ若
しくはマーカーとしての使用のために用いることができる条件下でハイブリダイ
ゼーションするのに十分な同一性を有するヌクレオチド配列を言う。 本明細書中に使用される「抗体」は、ポリクロナールおよびモノクロナール抗
体、キメラ抗体、単鎖抗体およびヒト化抗体、ならびにＦａｂまたは他の免疫グ
ロブリン発現ライブラリーの産物を含むＦａｂフラグメントを含む。 「単離」とは「人間の手によって」その自然状態から変更されたことを意味す
る。「単離された」組成物または物質が自然に存在する場合、それはすでに変更
されているか、あるいはその元の環境から移動させられているか、またはその両
方である。例えば、生きている動物に自然に存在するポリヌクレオチドやポリペ
プチドは「単離」されたものではないが、その本来の状態で共存する物質から分
離された同一のポリヌクレオチドやポリペプチドは、本明細書で用いる用語であ
る「単離」されたものである。

【００１７】 「ポリヌクレオチド」は一般に、修飾されてないＲＮＡもしくはＤＮＡまたは
修飾されているＲＮＡもしくはＤＮＡであってよい、あらゆるポリリボヌクレオ
チドあるいはポリデオキシリボヌクレオチドをいう。「ポリヌクレオチド」は、
制限なしに、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖と二本鎖の領域が混合したもの
であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖の領域
が混合したものであるＲＮＡ、一本鎖または、より典型的には二本鎖、または一
本鎖と二本鎖の領域が混合したものであってもよいＤＮＡとＲＮＡを含んでなる
ハイブリッド分子を含む。加えて「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡもしくはＤＮ
Ａまたは、ＲＮＡとＤＮＡとの両方を含んでなる三本鎖領域もいう。ポリヌクレ
オチドなる用語は、一以上の修飾された塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡおよび、
安定性あるいはその他の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮ
Ａをも含む。「修飾された」塩基には例えば、トリチル化された塩基およびイノ
シンのような通常とは異なる塩基が含まれる。様々な修飾がＤＮＡまたはＲＮＡ
に対してなされている。つまり、「ポリヌクレオチド」の用語は、自然に典型的
に見出されるような化学的、酵素的あるいは代謝的に修飾されたポリヌクレオチ
ドの形態、ならびにウィルスおよび細胞に特有のＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形
態を含む。「ポリヌクレオチド」の用語は、しばしばオリゴヌクレオチドと呼ば
れる比較的短いポリヌクレオチドも含む。

【００１８】 「ポリペプチド」は、ペプチド結合または変更ペプチド結合により互いに結合
した２またはそれ以上のアミノ酸、すなわちペプチドアイソスターを含むいずれ
かのペプチドまたはタンパク質を言う。「ポリペプチド」は一般にペプチド、オ
リゴペプチドまたはオリゴマーと呼ばれる単鎖のものと、一般にタンパク質と呼
ばれる長鎖のものの両方を言う。ポリペプチドは２０の遺伝子コードされたアミ
ノ酸以外のアミノ酸を含んでもよい。「ポリペプチド」は、翻訳後のプロセシン
グのような自然プロセスまたは当分野で周知の化学的修飾法のいずれかにより変
更されたアミノ酸配列を含む。そのような修飾は基本書およびより詳細な研究論
文、ならびに多数の調査文献に明確に開示されている。修飾は、ペプチド骨格、
アミノ酸側鎖およびアミノ末端あるいはカルボキシル末端を含むポリペプチド中
のどこでも起こり得る。同じタイプの修飾が、同程度、または異なる程度で本ポ
リペプチドの数カ所に存在する可能性があることが認識されるであろう。また本
ポリペプチドは、多くのタイプの修飾を含んでもよい。ポリペプチドはユビキチ
ン結合の結果として枝分かれしてもよく、枝分かれを有する環式であっても、あ
るいは枝分かれのない環式であってもよい。環式、分枝および分枝環式ポリペプ
チドは翻訳後の自然のプロセスから得ることができ、または合成法により作成す
ることもできる。修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ-リボシル化、アミ
ド化、フラビンの共有結合、ヘム族の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチ
ド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシト
ールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル反応、共有架橋
の形成、システインの形成、ピルグルタメートの形成、ホルミル化、ガンマ-カ
ルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化
、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、
プレニル化、ラセミ化、セレノイル化(selenoylation)、硫酸化、アルギニル化(
arginylation)のような、タンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ媒介性の付加お
よび、ユビキチン結合が含まれる。例えば、「蛋白質構造と分子特性」、第２版
, T. E. Creighton, W. H. Freeman および Company, New York, 1993 およ
び Wold, F., 翻訳後のタンパク質の修飾: 展望と期待、「タンパク質の翻訳後
の共有結合性修飾」 1-12頁、 B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New Yo
rk, 1983; Seifterら、「タンパク質の修飾と非タンパク質コファクターの分析
」, Meth Enzymol (1990) 182:626-646 および Rattanら、「蛋白合成: 翻訳後
の修飾と熟成」、 Ann NY Acad Sci (1992) 663:48-62を参照されたい。

【００１９】 本明細書中に使用する用語としての「変種」は、対照ポリヌクレオチドまたは
ポリペプチドとそれぞれ異なるが本質的な特性は保持するポリヌクレオチドまた
はポリペプチドである。ポリヌクレオチドの典型的な変種は、ヌクレオチド配列
がもう一方の対照ポリヌクレオチドから異なる。変種のヌクレオチド配列の変更
は、対照ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変
更するものであってもよいし、変更しないものであってもよい。ヌクレオチドの
変更は以下に記載するように、対照配列によりコードされるポリペプチドにおけ
るアミノ酸の置換、付加、欠失、融合および切断に帰着し得る。ポリペプチドの
典型的な変種はもう一方の対照ポリペプチドとアミノ酸配列に関して異なる。一
般に、違いは対照ポリペプチドと変種の配列が全体的には密接に類似するように
、および多くの領域において同一であるように制限される。変種および対照ポリ
ペプチドは、１またはそれ以上の置換、付加、欠失のいずれかの組み合わせによ
りアミノ酸配列に関して異なっていてもよい。置換または挿入アミノ酸残基は遺
伝子コードによりコードされるものであってもよいしそうでなくてもよい。ポリ
ヌクレオチドまたはポリペプチドの変種は対立変種のような自然に生じるもので
あってもよいし、あるいは自然に生じることが知られていない変種であってもよ
い。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの自然に生じるものではない変種は突
然変異誘発法または直接合成により作成することができる。

【００２０】 当分野で公知の「同一性」は、配列を比較することにより決定される２または
それ以上のポリペプチド配列または、２またはそれ以上のポリヌクレオチド配列
間の関連性を言う。当分野では、「同一性」はまた、場合によりそのような一連
の配列間の対応により決定されるような、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド
配列間の配列の関連性の程度をも意味する。「同一性」および「類似性」は、「
コンピューター分子生物学」、 Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, N
ew York, 1988; Biocomputing: 「情報科学とゲノム プロジェクト」, Smith, D
.W.ら、 Academic Press, New York, 1993; 「配列データのコンピューター解析
」、 パート I, Griffin, A.M.および Griffin, H.G., eds., Humana Press, Ne
w Jersey, 1994; 「分子生物学における配列分析」、 von Heinje, G., Academi
c Press, 1987; および、「配列解析プライマー」、 Gribskov, M. および Deve
reux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; および Carillo, H., お
よび Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)に記載の公知の方
法を含むがこれらには制限されない公知の方法により、容易に予測することがで
きる。同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間で最大の対応
を得るべく設計する。同一性および類似性を決定するための方法は、公に利用で
きるコンピュータープログラム中に体系化されている。２つの配列間の同一性お
よび類似性を決定するために好ましいコンピュータープログラム法には、ＧＣＧ
プログラムパッケージ(Devereux, J.ら, 核酸研究 12(1): 387 (1984))、ＢＬＡ
ＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ(Atschul, S.F.ら, J. Molec. Biol. 21
5: 403-410 (1990)が含まれるがこれらには制限されない。ＢＬＡＳＴ Ｘプログ
ラムは、ＮＣＢＩおよび他の情報源から公に利用できる(BLAST マニュアル, Alt
schul, S.ら., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S.ら, J. Mol. B
iol. 215: 403-410 (1990)。周知のスミス ウォーターマン アルゴリズムも同一
性を決定するために用いることができる。

【００２１】 ポリペプチド配列比較のための好ましいパラメータとしては、以下のものが挙
げられる。 １）アルゴリズム:Needleman および Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970
) 比較マトリックス： Hentikoff および HentikoffからのBLOSSUM62、 Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA. 89:10915-10919 (1992) ギャップ ペナルティー：１２ ギャップ長 ペナルティー：４ これらのパラメータを用いる有用なプログラムは、ウィスコンシン州マジソン
のジェネティクス コンピューター グループ(Genetics Computer Group)から「
ギャップ」プログラムとして公に入手可能である。前記のパラメータは、ペプチ
ド比較のためのデフォルト パラメータである（エンド ギャップについてのペナ
ルティーなしで）。 ポリヌクレオチド比較のための好ましいパラメータとして、以下のものが挙げ
られる。 １）アルゴリズム：Needleman および Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453 (197
0) 比較マトリックス：マッチ＝+１０、ミスマッチ＝０ ギャップ ペナルティー：５０ ギャップ レングス ペナルティー：３ 入手可能：ウィスコンシン州マジソンのジェネティクス コンピューター グルー
プからの「ギャップ」プログラム。これらは、核酸比較のためのデフォルト パ
ラメータである。

【００２２】 例として、本発明のポリヌクレオチド配列は配列番号：２の対照配列と同一で
あってもよく、すなわち、１００％同一であってもよく、あるいは対照配列と比
較してある程度の数までのアミノ酸の変化を有していてもよい(その場合、同一
性％は１００％未満である)。かかる変化は、少なくとも１個の核酸の欠失、置
換(トランジションおよびトランスバージョンを包含)または挿入からなる群より
選択され、該変化は対照ポリヌクレオチド配列の５’または３’末端の位置ある
いはそれらの末端位置の間のいずれかの位置において、対照配列中の核酸におい
て個々に、あるいは対照配列中の１またはそれ以上の連続した群のどちらかとし
て散在してもよい。配列番号：２中の全アミノ酸数にパーセント同一性を示す整
数(１００で割ったもの)をかけて、その積を配列番号：２中の全アミノ酸数から
差し引くことにより同一性％値についての核酸変化数を決定する。あるいはこの
ことは下式により説明される： ｎ_n＝ｘ_n−(ｘ_n・ｙ) 式中、ｎ_nはアミノ酸変化の数であり、ｘ_nは配列番号：２中の全アミノ酸数であ
り、ｙは、例えば７０％なら０．７０、８０％なら０．８０、８５％なら０．８
５等であり、・は積の演算子であり、ｘ_nとｙとの整数でない積は切り捨てによ
り最も近い整数とした後、ｘ_nから差し引く。

【００２３】 好ましいポリペプチドの具体例はさらに、配列番号：２のポリペプチド対照配
列に対して少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９７または
１００％の同一性を有するポリペプチドを含む単離ポリペプチドを包含し、該ポ
リペプチド配列は配列番号：２の対照配列と同一であってもよく、あるいは対照
配列と比較してある程度の数までのアミノ酸の変化を有していてもよい。かかる
変化は、少なくとも１個のアミノ酸の欠失、置換(保存的および非保存的置換を
包含)または挿入からなる群より選択され、該変化は対照ポリペプチド配列のア
ミノまたはカルボキシ末端の位置あるいはそれらの末端位置の間のいずれかの位
置において、対照配列中のアミノ酸において個々に、あるいは対照配列中の１ま
たはそれ以上の連続した群としてのどちらかで散在してもよい。配列番号：２中
の全アミノ酸数と同一性パーセントを示す整数(１００で割ったもの)とをかけて
、その積を配列番号：２中の全アミノ酸数から差し引くことによりアミノ酸変化
の数を決定する。これを下式により説明する： ｎ_a＝ｘ_a−(ｘ_a・ｙ) 式中、ｎ_aはアミノ酸変化数であり、ｘ_aは配列番号：２中の全アミノ酸数であり
、ｙは、５０％なら０．５０、６０％なら０．６０、７０％なら０．７０、８０
％なら０．８０、８５％なら０．８５、９０％なら０．９０、９５％なら０．９
５、９７％なら０．９７、１００％なら１．００であり、・は積の演算子であり
、ｘ_aとｙとの整数でない積は切り捨てにより最も近い整数とした後、ｘ_aから差
し引く。

【００２４】 例えば、本発明のポリペプチド配列は配列番号：２の対照配列と同一であって
もよく、すなわち、１００％同一であってもよく、あるいは対照配列と比較して
ある程度の数までのアミノ酸の変化を有していてもよい(その場合、同一性％は
１００％未満である)。かかる変化は、少なくとも１個のアミノ酸の欠失、置換(
保存的または非保存的置換を包含)または挿入からなる群より選択され、該変化
は対照ポリペプチド配列のアミノまたはカルボキシ末端の位置あるいはそれらの
末端位置の間のいずれかの位置において、対照配列中のアミノ酸において個々に
、あるいは対照配列中の１またはそれ以上の連続した群としてのどちらかで散在
して生じてもよい。配列番号：２中の全アミノ酸数にの同一性パーセントを示す
整数(１００で割ったもの)をかけて、その積を配列番号：２中の全アミノ酸数か
ら差し引くことにより同一性％値についてのアミノ酸変化数を決定する。これを
下式により説明する： ｎ_a＝ｘ_a−(ｘ_a・ｙ) 式中、ｎ_aはアミノ酸変化の数であり、ｘ_aは配列番号：２中の全アミノ酸数であ
り、ｙは、例えば７０％なら０．７０、８０％なら０．８０、８５％なら０．８
５等であり、・は積の演算子であり、ｘ_aとｙとの整数でない積は切り捨てによ
り最も近い整数とした後、ｘ_aから差し引く。

【００２５】 本発明のポリペプチド 本発明のヒトＫＩＡＡ０００１ポリペプチドは、配列番号２のポリペプチド（
特に成熟ポリペプチド）を含む。ヒトＫＩＡＡ０００１ポリペプチドは「成熟」
タンパク質の形態であってもよく、融合タンパク質のような巨大タンパク質の一
部であってもよい。分泌またはリーダー配列、プロ配列、複合ヒスチジン残基の
ような、精製を促進する配列若しくは組換え体を産生する間の安定化のための付
加的配列を含む更なるアミノ酸配列を含むことがしばしば好都合である。 ヒトＫＩＡＡ０００１ポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントも本発明
中に含まれる。フラグメントは、前記のヒトＫＩＡＡ０００１ポリペプチドのア
ミノ酸配列の全部ではないが一部として、完全に同一なアミノ酸配列を有するポ
リペプチドである。ヒトＫＩＡＡ０００１ポリペプチドに関して、フラグメント
はそれ自体の自立構造で存在していてもよく、または、一部または最も好ましく
は単一の連続領域としての領域を形成する巨大ポリペプチド内に含まれてもよい
。本発明のポリペプチド フラグメントの典型的な例には、例えば、おおよその
アミノ酸Ｎｏ．１〜２０、２１〜４０、４１〜６０、６１〜８０、８１〜１００
および１０１〜末端のヒトＫＩＡＡ０００１ポリペプチドが含まれる。本明細書
の文脈中「おおよその」は、どちらかの末端または両末端で数個、５個、４個、
３個、２個または１個だけ多いまたは少ない個々の範囲を含む。 好ましいフラグメントには例えば、アミノ末端を含む連続残基の欠失またはカ
ルボキシル末端を含む連続残基の欠失もしくは、アミノ末端を含む連続残基とカ
ルボキシル末端を含む連続残基の２つの連続残基の欠失を除く、ヒトＫＩＡＡ０
００１ポリペプチドのアミノ酸配列を有する切断ポリペプチドが含まれる。さら
に好ましくは、アルファ-ヘリックスおよびアルファ-ヘリックス形成領域、ベー
タ-シートおよびベータ-シート形成領域、ターンおよびターン-形成領域、コイ
ルおよびコイル-形成領域、親水性領域、疎水性領域、アルファ両親媒性領域、
ベータ両親媒性領域、柔軟性領域、表面-形成領域、基質結合領域および高抗原
性インデックス領域を含むフラグメントのような構造特性若しくは機能特性によ
り特徴付けられるフラグメントである。生物学的に活性なフラグメントはレセプ
ターの活性を媒介するフラグメントであり、同様の活性もしくは改変された活性
を有するフラグメント、または望ましくない活性が低下したフラグメントを含む
。さらに、動物、特にヒトにおいて抗原性あるいは免疫原性であるフラグメント
が含まれる。

【００２６】 つまり、本発明のポリペプチドには、配列番号２に記載したアミノ酸配列を有
するポリペプチドが含まれる。これらのポリペプチドの全てが、レセプターの生
物学的活性（抗原活性を含む）を保持することが好ましい。このグループに含ま
れるものは、定義した配列およびフラグメントの変種である。好ましい変種は、
保存的アミノ酸置換により対照ポリペプチドから異なるもの、すなわち、残基を
同様の特性を有する他の残基で置換したものである。典型的なそのような置換は
、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕとＩｌｅ間；ＳｅｒとＴｈｒ間；酸性残基ＡｓｐとＧ
ｌｕ間；ＡｓｎとＧｌｎ間；および塩基性残基ＬｙｓとＡｒｇ間；または芳香族
残基ＰｈｅとＴｙｒ間の置換である。特に好ましいのは、いくらかの、５〜１０
個、１〜５個または１〜２個のアミノ酸の置換、欠失または付加がいずれの組み
合わせで生じた変種である。 本発明のヒトＫＩＡＡ０００１ポリペプチドは、いずれかの適当な方法で調製
することができる。そのようなポリペプチドには、単離された自然に生じるポリ
ペプチド、組換え産生されたポリペプチド、合成産生されたポリペプチドまたは
、これらの方法の組み合わせにより産生されたポリペプチドが含まれる。そのよ
うなポリペプチドの調製法は当分野で容易に理解される。

【００２７】 本発明のポリヌクレオチド 本発明の他の態様は、ＫＩＡＡ０００１ポリペプチドおよび、それに密接に関
連するポリヌクレオチドをコードする単離ポリヌクレオチドに関する。 配列番号１のヌクレオチド配列は、ヒトＫＩＡＡ０００１レセプターと相同関
係を示す(Nomura N.ら, DNA Res 1994;1(1):27-35 および Nomura N.ら、 DNA R
es 1994;1(1):47-56)。配列番号１のヌクレオチド配列はｃＤＮＡ配列であり、
３３８アミノ酸から成るポリペプチド（配列番号２のポリペプチド）をコードす
るポリペプチドコード配列（ヌクレオチド１から２４１６）から成る。配列番号
２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１に含まれるポリ
ペプチドコード配列と同一であってもよく、遺伝子コードの重複（縮重）の結果
としてさらに配列番号２のポリペプチドをコードする、配列番号１に含まれる配
列以外の配列であってもよい。配列番号２のポリペプチドは、ヒトＫＩＡＡ００
０１レセプターと相同性および／または構造上の類似性を有するＧ-結合タンパ
ク質レセプター ファミリーの他のタンパク質と構造的に関連する(Nomura N.ら,
DNA Res 1994;1(1):27-35 および Nomura, N.ら, DNA Res 1994;1(1):47-56)。
ヒトＫＩＡＡ０００１をコードする本発明のあるポリヌクレオチドは、常套のク
ローニング法およびスクリーニング法を用いて、ヒト胎盤細胞中のｍＲＮＡから
誘導されるｃＤＮＡライブラリーから、発現配列タグ（ＥＳＴ）分析を用いて得
ることができる(Adams, M.D.ら、 Science (1991) 252:1651-1656; Adams, M.D.
ら, Nature, (1992) 355:632-634; Adams, M.D.ら, Nature (1995) 377 Supp:3
-174)。本発明のポリヌクレオチドはまた、ゲノムＤＮＡライブラリーのような
自然供給源から得ることもでき、周知の工業利用可能な技術を用いて合成するこ
ともできる。 従って、ヒトＫＩＡＡ０００１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は
、その全長に渡って図１のコード配列（配列番号１）と同一である可能性がある
。

【００２８】 本発明のポリヌクレオチドをヒトＫＩＡＡ０００１ポリペプチドの組換え体産
生のために使用する場合、ポリヌクレオチドは成熟ポリペプチドまたはそのフラ
グメントのためのコード配列を単独で含んでもよく、リーディングフレーム中に
リーダーまたは分泌配列、プレ、またはプロまたはプレプロタンパク質配列また
は他の融合ペプチド部分をコードする配列のような、他のコード配列を有する成
熟ポリペプチドまたはフラグメントのためのコード配列を含んでもよい。例えば
、融合ポリペプチドの精製を容易にするマーカー配列をコードすることができる
。本発明のこの態様のある好ましい具体例において、マーカー配列は、ｐＱＥベ
クター（Qiagen, Inc.）中に提供され、Gentzら, Proc Natl Acad Sci USA (198
9) 86:821-824に開示されるようなヘキサ-ヒスチジン ペプチドまたはＨＡタグ
である。ポリヌクレオチドは、転写される非翻訳配列、スプライシングおよびポ
リアデニル化シグナル、リボゾーム結合部位およびｍＲＮＡを安定化する配列の
ような非コーディング５’および３’配列を含んでもよい。 本発明の特に好ましい態様は、図２に記載するアミノ酸配列（配列番号２）を
有するヒトＫＩＡＡ０００１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび
その変種である。 さらに好ましい態様は、いくらかの、５〜１０個、１〜５個、１〜３個、１〜
２個または１個のアミノ酸残基の置換、欠失、または付加がいずれかの組み合わ
せで生じた図２のヒトＫＩＡＡ０００１のアミノ酸配列（配列番号２）を有する
ヒトＫＩＡＡ０００１変種をコードするポリヌクレオチドである。

【００２９】 ベクター、宿主細胞、発現 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド（複数）を
含むベクターおよび、本発明のベクターを用いて遺伝子操作された宿主細胞およ
び、組換え技術による本発明のポリペプチドの産生に関する。無細胞翻訳系も、
本発明のＤＮＡ構築物から誘導されるＲＮＡを用いてそのようなタンパク質を製
造するために用いることができる。 組換え体の産生に関しては、宿主細胞を遺伝的操作して本発明のポリヌクレオチ
ドのための発現系またはその部分を組み込むことができる。ポリヌクレオチドの
宿主細胞への導入は、Davisら, 分子生物学における基本法 (1986) および Samb
rookら, モレキュラー クローニング: 研究室マニュアル、第２版, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)のような多くの
基本的な研究室マニュアルに記載される、リン酸カルシウム トランスフェクシ
ョン、ＤＥＡＥ-デキストラン媒介トランスフェクション、トランスフェクショ
ン、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレ
クトロポーレーション、形質導入、スクレープ ローディング(scrape loading)
、弾道導入(ballistic introduction)または感染のような方法により達成するこ
とができる。

【００３０】 適当な宿主の典型的な例には、細菌細胞、例えばストレプトコッカス(strepto
cocci)、スタフィロコッカス(staphylococci)、イー．コリ、ストレプトマイセ
ス(Streptomyces)およびバシラス サチリス(Bacillus subtilis)細胞；真菌細胞
、例えば酵母細胞およびアスペルギルス(Aspergillus)細胞；昆虫細胞、例えば
ドロソフィラ(Drosophila)Ｓ２およびスポドプテラ(Spodoptera)Ｓｆ９細胞；動
物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ヒーラー、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、２９３
およびボーズ(Bowes)黒色腫細胞；および植物細胞が含まれる。 非常に様々な発現系を用いることができる。そのような系にはとりわけ、染色
体、エピソームおよびウイルス由来の系、例えば細菌のプラスミド、バクテリオ
ファージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入エレメント、酵母染色体エレ
メント、バキュロウイルス、パポーバウイルス（例えば、ＳＶ４０）、ヴィシナ
ウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、偽狂犬病ウイルスおよびレトロウイ
ルスなどのウイルス由来のベクター、およびそれらを組み合わせたものに由来す
るベクター（例えば、プラスミドおよびバクテリオファージの遺伝子エレメント
由来のベクター（例えば、コスミドおよびファージミド））が含まれる。発現系
は、発現を調節し、発生するコントロール領域を含んでもよい。一般に、宿主中
でポリペプチドを産出するポリヌクレオチドを維持、増殖または発現させるのに
適したいずれの系またはベクターを用いてもよい。適当なヌクレオチド配列は例
えばSambrookら、 モレキュラー クローニング、研究質マニュアル (既出)に記
載されているような、様々な周知かつルーチンの方法のいずれかにより発現系へ
挿入することができる。

【００３１】 小胞体内腔、細胞周辺腔または細胞外環境への翻訳タンパク質の分泌のために
、適当な分泌シグナルを所望のポリペプチドに組み込んでもよい。これらのシグ
ナルはポリペプチドに内在するものであってもよいし、異種構造シグナルであっ
てもよい。 ヒトＫＩＡＡ０００１ポリペプチドをスクリーニングアッセイにおいて使用す
るために発現させる場合、一般に、ポリペプチドは細胞の表面で産生されること
が好ましい。この場合、細胞はスクリーニング アッセイに使用する前に回収す
ることができる。ヒトＫＩＡＡ０００１ポリペプチドが培地中に分泌される場合
、培地をポリペプチドを回収および精製するために回収することができ、細胞内
で産出される場合は、細胞はポリペプチドを回収する前にまず溶解しなければな
らない。 ヒトＫＩＡＡ０００１ポリペプチドは、組換え培養細胞から硫酸アンモニウム
またはエタノール沈殿法、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフ
ィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイト クロマトグ
ラフィーおよびレクチン クロマトグラフィーを含む周知の方法により組換え細
胞培養液から回収および精製することができる。最も好ましくは、高速液体クロ
マトグラフィーを精製のために用いる。ポリペプチドが単離および、または精製
中に変性された場合に活性構造を再生するために、周知の技術を用いてタンパク
質を再び折りたたむことができる。

【００３２】 抗体 本発明のポリペプチドまたはそのフラグメントまたはその類似体または、それ
らを発現している細胞はまた、ヒトＫＩＡＡ０００１ポリペプチドに対して免疫
特異的な抗体を製造するための免疫原として使用することができる。「免疫特異
的」なる用語は、抗体が先行技術における他の関連するポリペプチドに対する親
和力よりも大きな親和力を本発明のポリペプチドに対して実質上有することを意
味する。 ヒトＫＩＡＡ０００１ポリペプチドに対して作成される抗体は、通常のプロト
コールを用いて、動物、好ましくはヒト以外の動物にポリペプチドまたはエピト
ープを有するフラグメント、類似体または細胞を投与することにより得ることが
できる。モノクローナル抗体の調製に関しては、継代培養細胞系統により産生さ
れる抗体を提供するいかなる技術も用いることができる。その例には、ハイブリ
ドーマ法(Kohler, G. および Milstein, C., Nature (1975) 256:495-497)、ト
リオーマ法、ヒトＢ-細胞ハイブリドーマ法(Kozborら, 今日の免疫学 (1983) 4:
72)およびＥＢＶ-ハイブリドーマ法(Coleら, モノクローナル抗体と癌治療、 pp
. 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985)が含まれる。 単鎖の抗体の産生のための技術（Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．4,946,778)も、本発明の
ポリペプチドに対する単鎖の抗体を産生するために適合することができる。また
、形質転換マウスまたは他の哺乳動物を含む他の生物体をヒト化抗体を発現させ
るために用いることができる。 前記の抗体はポリペプチドを発現しているクローンを単離あるいは同定するた
めに、あるいはアフィニティークロマトグラフィーによりポリペプチドを精製す
るために用いることができる。

【００３３】 ヒトＫＩＡＡ０００１ポリペプチドに対する抗体は、細菌、真菌、原虫および
ウイルス感染、特にＨＩＶ-ＩまたはＨＩＶ-２により引き起こされる感染のよう
な感染；痛み；癌；糖尿病；肥満；食欲不振；大食；喘息；パーキンソン病；急
性心不全；低血圧；高血圧；尿閉；骨粗鬆症；狭心症；心筋梗塞；再狭窄；アテ
ローム性動脈硬化症；平滑筋細胞の過剰増殖により特徴付けられる疾患；動脈瘤
；創傷治癒；平滑筋細胞の欠損または平滑筋細胞の増殖の低下により特徴付けら
れる疾患；脳卒中；虚血；潰瘍；喘息；アレルギー；良性前立腺肥大；偏頭痛；
嘔吐；不安、精神分裂病、躁鬱病、鬱病、譫妄、痴呆および重度の精神遅滞を含
む精神病および神経病疾患；神経組織変性疾患のような退行性疾患；およびとり
わけ、ハンチントン病またはジル・ド・ラ・トゥレット病のような運動異常症を
治療するのに用いることもできる。

【００３４】 スクリーニング アッセイ ヒトのＫＩＡＡ０００１ポリペプチド（本発明のレセプター）は、レセプターに
結合し、本発明のレセプターポリペプチドを活性化する（アゴニスト）、または
その活性を阻害する（アンタゴニスト）化合物のためのスクリーニング法におい
て使用することができる。つまり、本発明のポリペプチドは、例えば細胞、無細
胞調製物、化学ライブラリーおよび自然産物混合物中の小分子基質およびリガン
ドの結合を評価するために用いることもできる。これらの基質およびリガンドは
自然の基質およびリガンドであってもよく、構造的あるいは機能的擬似物であっ
てもよい。Coliganら、 免疫学の最新のプロトコール 1(2): 5章(1991)を参照さ
れたい。

【００３５】 ＫＩＡＡ０００１タンパク質は哺乳動物の宿主中に偏在し、多くの病状を含む
多くの生物学的機能の原因である。従って、一方ではＫＩＡＡ０００１を刺激す
ることができる化合物および薬物を、他方ではＫＩＡＡ０００１の機能を阻害す
ることができる化合物および薬物を見出すことが望まれる。一般に、アゴニスト
は、細菌、真菌、原虫およびウイルス感染、特にＨＩＶ-ＩまたはＨＩＶ-２によ
り引き起こされる感染；痛み；癌；糖尿病；肥満；食欲不振；大食；喘息；パー
キンソン病；急性心不全；低血圧；高血圧；尿閉；骨粗鬆症；狭心症；心筋梗塞
；再狭窄；アテローム性動脈硬化症；平滑筋細胞の過剰増殖により特徴付けられ
る疾患；脳卒中；虚血；潰瘍；喘息；アレルギー；良性前立腺肥大；偏頭痛；嘔
吐；不安、精神分裂病、躁鬱病、鬱病、譫妄、痴呆および重度の精神遅滞を含む
精神病および神経病疾患；神経組織変性疾患および虚血性脳卒中のような退行性
疾患；および特に、ハンチントン病またはジル・ド・ラ・トゥレット病のような
運動異常症のような感染のような症状のための治療的および予防的目的のために
使用する。アンタゴニストは細菌、真菌、原虫およびウイルス感染、特にＨＩＶ
-ＩまたはＨＩＶ-２により引き起こされる感染；痛み；癌；糖尿病；肥満；食欲
不振；大食；喘息；パーキンソン病；急性心不全；低血圧；高血圧；尿閉；骨粗
鬆症；狭心症；心筋梗塞；再狭窄；動脈瘤；創傷治癒；平滑筋細胞の欠損または
平滑筋細胞増殖の低下により特徴付けられる疾患；脳卒中；虚血；潰瘍；喘息；
アレルギー；良性前立腺肥大；偏頭痛；嘔吐；不安、精神分裂病、躁鬱病、鬱病
、譫妄、痴呆および重度の精神遅滞を含む精神病および神経病疾患；神経組織変
性疾患のような退行性疾患；および、特にハンチントン病またはジル・ド・ラ・
トゥレット病のような運動異常症のような症状のための様々な治療的および予防
的目的のために使用することができる。

【００３６】 一般にそのようなスクリーニング法は、表面で本発明のレセプターポリペプチ
ドを発現する適当な細胞を提供することを含む。そのような細胞には、哺乳動物
由来の細胞、酵母、ドロソフィラまたはイー.コリが含まれる。特に本発明のレ
セプターをコードするポリヌクレオチドを用いて細胞に感染させ、それによりヒ
トＫＩＡＡ０００１ポリペプチドを発現させる。発現されたレセプターを次いで
試験化合物と接触させ、結合、機能的応答の刺激または阻害を観察する。 一つのそのようなスクリーニング法は、ヒトＫＩＡＡ０００１ポリペプチドを
発現させるために感染させるメラニン細胞の使用を含む。そのようなスクリーニ
ング法は、１９９２年２月６日に公開されたＰＣＴ ＷＯ９２／０１８１０に開
示されている。そのようなアッセイは、レセプターをコードするメラニン細胞を
ＵＤＰ-グルコースのようなレセプターリガンドおよびスクリーニングすべき化
合物と接触させることにより本発明のレセプターの活性化を阻害する化合物をス
クリーニングするために用いることができる。リガンドが発生するシグナルの阻
害は、化合物がレセプターのための潜在的なアンタゴニストであること、すなわ
ち、レセプターの活性化を阻害することを示す。 該方法を、そのような細胞をスクリーニングすべき化合物と接触させ、そのよ
うな化合物がシグナルを生じるかどうか、すなわち、レセプターを活性化させる
かどうかを決定することにより、本発明のレセプターを活性化させる化合物をス
クリーニングするために用いてもよい。

【００３７】 他のスクリーニング法は、レセプターの活性化により引き起こされる細胞外ｐ
Ｈの変化を測定する系において、ヒトＫＩＡＡ０００１ポリペプチドレセプター
（例えば、感染したＣＨＯ細胞）を発現する細胞を使用することを包含する。こ
の方法では、化合物を本発明のレセプターポリペプチドを発現している細胞と接
触させることができる。次いで第二メッセンジャー応答、例えばシグナル伝達ま
たはｐＨの変化を測定し、潜在的な化合物がレセプターを活性化するかどうか、
または阻害するかどうかを決定する。 他のスクリーニング法は、ヒトＫＩＡＡ０００１ポリペプチドを発現させ、該レ
セプターをホスホリパーゼＣまたはＤと結合させることを含む。そのような細胞
の典型的な例には、内皮細胞、平滑筋細胞および胎児腎臓細胞が含まれるがこれ
らには限定されない。スクリーニングは、前記のようにレセプターの活性化また
はレセプターの活性化の阻害をホスホリパーゼセカンドシグナルから検出するこ
とにより達成することができる。

【００３８】 もう一つの方法は、ＵＤＰ-糖（例えばＵＤＰ-グルコース、ＵＤＰ-ガラクトー
ス、ＵＤＰ-グルクロン酸およびＵＤＰ-Ｎ-アセチルグルコサミン）のような標
識リガンドの、表面にレセプターを有する細胞またはレセプターを含む細胞膜へ
の結合の阻害を測定することにより、アンタゴニストである化合物、つまり、そ
れゆえ本発明のレセプターポリペプチドの活性を阻害する化合物をスクリーニン
グすることに関する。そのような方法は、細胞がその表面にレセプターを発現す
るように真核細胞をヒトＫＩＡＡ０００１ポリペプチドをコードするＤＮＡで感
染させることを含む。細胞を次いで、ＵＤＰ-糖（例えば、ＵＤＰ-グルコース、
ＵＤＰ-ガラクトース、ＵＤＰ-グルクロン酸およびＵＤＰ-Ｎ-アセチルグルコサ
ミン）のようなリガンドの標識型の存在下で潜在的なアンタゴニストと接触させ
る。リガンドは例えば放射能により標識することができる。レセプターに結合す
る標識リガンドの量は、例えば、感染細胞またはこれらの細胞由来の膜に付随す
る放射能を測定することにより測定する。化合物がレセプターに結合すると、レ
セプターに結合する標識リガンドの減少により測定されるように、標識リガンド
のレセプターへの結合が阻害される。この方法は、結合アッセイと呼ばれる。

【００３９】 もう一つのそのようなスクリーニング法は、感染させて本発明のレセプターを
発現させる哺乳動物の細胞の使用を含む。細胞に、カルシウムに結合すると蛍光
シグナルを生じる指示色素を添加し、細胞を試験物質およびレセプターアゴニス
ト、例えばＵＤＰ-糖（例えばＵＤＰ-グルコース、ＵＤＰ-ガラクトース、ＵＤ
Ｐ-グルクロン酸およびＵＤＰ-Ｎ-アセチルグルコサミン）と接触させる。蛍光
シグナルの変化はいずれも、定められた期間、例えば蛍光分光光度計または蛍光
イメージング プレート リーダーを用いて測定する。リガンドが発生する蛍光シ
グナルパターンの変化は、化合物がレセプターの潜在的なアンタゴニスト（また
はアゴニスト）であることを示す。 もう一つのそのようなスクリーニング法は、本発明のレセプターを発現させるた
めに感染させ、さらに、レセプターの活性化と関連するレポーター遺伝子構築物
（例えば適当なプロモーターの後のルシフェラーゼまたはβ-ガラクトシダーゼ
）で感染させる哺乳動物の使用を含む。細胞を試験物質およびレセプターアゴニ
スト、例えばＵＤＰ-糖（例えばＵＤＰ-グルコース、ＵＤＰ-ガラクトース、Ｕ
ＤＰ-グルクロン酸およびＵＤＰ-Ｎ-アセチルグルコサミン）と接触させ、レポ
ーター遺伝子が発生するシグナルを定められた期間後に測定する。シグナルは、
照度計、分光光度計、蛍光計または使用される特定のレポーター構築物に適した
他の装置を用いて測定することができる。リガンドが発生するシグナルの阻害は
、化合物がレセプターの潜在的なアンタゴニストであることを示す。

【００４０】 アンタゴニストまたはアゴニストのための他のスクリーニング法は、レセプタ
ーを一時的、あるいは安定的に発現させるために、ヒトＫＩＡＡ０００１ポリペ
プチドをコードするＲＮＡをアフリカツメガエルに導入することを含む。卵母細
胞レセプターを次いでＵＤＰ-糖（例えばＵＤＰ-グルコース、ＵＤＰ-ガラクト
ース、ＵＤＰ-グルクロン酸およびＵＤＰ-Ｎ-アセチルグルコサミン）のような
レセプターリガンドおよびスクリーニングすべき化合物と接触させる。レセプタ
ーの阻害または活性化を次いで、ｃＡＭＰ、カルシウム、プロトンまたは他のイ
オンのようなシグナルの検出により測定する。 他の方法は、ヒトＫＩＡＡ０００１ポリペプチドが媒介するｃＡＭＰおよび／ま
たはアデニル酸シクラーゼの蓄積または減少の阻害または刺激を測定することに
よりヒトＫＩＡＡ０００１ポリペプチド インヒビターをスクリーニングするこ
とを含む。そのような方法は、細胞表面でレセプターを発現させるために、ヒト
ＫＩＡＡ０００１ポリペプチドを用いて真核細胞を一時的または安定的に感染さ
せることを含む。細胞を次いで、ＵＤＰ-糖（例えばＵＤＰ-グルコース、ＵＤＰ
-ガラクトース、ＵＤＰ-グルクロン酸およびＵＤＰ-Ｎ-アセチルグルコサミン）
のようなＫＩＡＡ０００１ポリペプチド リガンドの存在下で潜在的なアンタゴ
ニストに暴露する。次いでｃＡＭＰ蓄積量を、例えばラジオイムノアッセイまた
はタンパク質結合アッセイにより（例えばフラッシュプレートまたはシンチレー
ション近接アッセイ(scintillation proximity assay)を用いて）測定する。ｃ
ＡＭＰレベルの変化は、破壊細胞調製物中の酵素、アデニリル シクラーゼの活
性を直接測定することにより測定することもできる。潜在的なアンタゴニストが
レセプターに結合すると、つまり、ヒトＫＩＡＡ０００１ポリペプチドの結合を
阻害すると、ヒトＫＩＡＡ０００１ポリペプチドが媒介するｃＡＭＰまたはアデ
ニル酸シクラーゼ活性のレベルが低下または増加する。

【００４１】 アゴニストおよびアンタゴニストのためのもう一つのスクリーニング法は、酵
母、サッカロマイセスセレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)中の内在性フェロ
モンの応答経路による。酵母の異体性株は、２つの有糸分裂安定半数性接合型、
ＭＡＴａおよびＭＡＴαで存在することができる。各細胞タイプは、もう一方の
成熟型細胞上のＧ-タンパク質結合レセプターに結合し、細胞融合の前兆として
のＧ１抑止を導くＭＡＰキナーゼカスケードを誘発する小ペプチドホルモンを分
泌する。フェロモン応答経路におけるある種の遺伝子の遺伝的変更により、フェ
ロモンに対する正常応答を変更することができ、内在性フェロモンレセプターを
欠く酵母細胞中での異質組織発現およびヒトＧ-タンパク質結合レセプターとヒ
ト化Ｇ-タンパク質サブユニットの結合は、下流のシグナル化経路とレポーター
遺伝子に関連付けることができる（例えば、Ｕ．Ｓ．特許5,063,154;5,482,835;
5,691,188)。そのような遺伝子変更には、（ｉ）フェロモンレセプターと結合す
る内在性Ｇ-タンパク質をコードするＳＴＥ２またはＳＴＥ３遺伝子の欠失；（
ｉｉ）細胞サイクルの抑止に至る、サイクリン依存性キナーゼと通常関連するタ
ンパク質をコードするＦＡＲ１遺伝子の欠失および、（ｉｉｉ）ＦＵＳ１遺伝子
プロモーター（ＦＵＳ１は細胞融合に必要とされる膜停泊糖タンパク質をコード
する）と融合するレポーター遺伝子の構築；を含むが、これらには限定されない
。下流レポーター遺伝子は、用いられる特定レポーター構築物により、陽性増殖
選択（例えばＦＵＳ１-ＨＩＳ３レポーターを用いたヒスチジン プロトトロフィ
ー）または、比色計、蛍光計または分光光度計からの読出し（例えば、ＦＵＳ１
-ＬａｃＺ レポーターを用いたβ-ガラクトシダーゼの誘導）のいずれかを可能
にする。

【００４２】 酵母細胞をさらに操作して、ランダムなペプチドライブラリー由来の小ペプチ
ド（そのいくらかは、異種組織発現性ヒト（または哺乳動物）Ｇ-タンパク質結
合レセプターの自己分泌活性化を可能にすることができる）を発現および分泌さ
せることができる(Broach, J.R. および Thorner, J. Nature 384: 14-16, 1996
; Manfrediら, Mol. Cell. Biol. 16: 4700-4709, 1996)。これにより、特定の
レセプターまたはオーファンレセプターを活性化する代用ペプチドアゴニストの
ための（例えばＦＵＳ１-ＨＩＳ３レポーターを用いた）迅速な直接的増殖選択
法(rapid direct growth selection)が提供される。これとは別に、レポーター
遺伝子の読出し(例えば、ＦＵＳ１-ＬａｃＺ）と関連するヒト（または哺乳動物
）Ｇ-タンパク質結合レセプターを機能的に発現する酵母細胞を、公知のリガン
ド、生物学的抽出物のフラクションおよび、天然または代用リガンドいずれかの
ための化学的化合物のライブラリーの高処理(high-throughput)スクリーニング
のプラットフォームとして使用することができる。十分有効な（天然または代用
の）機能的アゴニストを、Ｇ-タンパク質結合レセプターアンタゴニストを同定
するための酵母細胞に基づくアッセイにおいて、スクリーニングの道具として用
いることができる。この目的に関して、酵母系は、その利用しやすさと、しばし
ばアゴニストまたはアンタゴニストの同定を妨げる、レセプターのバックグラウ
ンドが存在しない（内在性Ｇ-タンパク質結合レセプターを欠く）ために、哺乳
動物の発現系よりも好都合である。

【００４３】 本発明はまた、ヒトＫＩＡＡ０００１ポリペプチドに結合することができるこ
とが知られていないリガンドがそのようなレセプターに結合することができるか
どうかを決定するための、ヒトＫＩＡＡ０００１ポリペプチドを発現する酵母ま
たは哺乳動物細胞をリガンド、例えばＵＤＰ-糖（例えばＵＤＰ-グルコース、Ｕ
ＤＰ-ガラクトース、ＵＤＰ-グルクロン酸およびＵＤＰ-Ｎ-アセチルグルコサミ
ン）と、候補となるリガンドのヒトＫＩＡＡ０００１ポリペプチドへの結合を可
能にする条件下で接触させ、かつ、レセプターに結合する候補リガンドの存在を
検出し、それにより、リガンドがヒトＫＩＡＡ０００１ポリペプチドに結合する
かどうかを決定することを含む方法も提供する。アゴニストおよび／またはアン
タゴニストを決定するための前記の系を、レセプターに結合するリガンドを決定
するために用いてもよい。 本発明はまた、前記のスクリーニング法から得られるアゴニストおよびアンタゴ
ニストも意図する。

【００４４】 潜在的なヒトＫＩＡＡ０００１ポリペプチド アンタゴニストの例には、レセ
プターに結合するが、第二メッセンジャー応答を誘発せず、その結果、レセプタ
ーの活性を妨げる抗体、いくらかの場合においてはオリゴヌクレオチドが含まれ
る。潜在的なアンタゴニストには、ヒトＫＩＡＡ０００１ポリペプチドのリガン
ドと密接に関連する化合物、すなわち生物学的機能を失った、ヒトＫＩＡＡ００
０１ポリペプチドに結合した時応答を誘発しないリガンドのフラグメントも含ま
れる。 つまり、もう一つの態様において本発明は、ＫＩＡＡ０００１ポリペプチドに
対するアゴニスト、アンタゴニストおよびリガンドを同定するためのスクリーニ
ング キットに関し、該キットは、 （ａ）ＫＩＡＡ０００１ポリペプチド、好ましくは配列番号２のＫＩＡＡ０００
１ポリペプチドを含み、およびさらに好ましくは、標識または非標識ＵＤＰ-糖
（例えばＵＤＰ-グルコース、ＵＤＰ-ガラクトース、ＵＤＰ-グルクロン酸およ
びＵＤＰ-Ｎ-アセチルグルコサミン）を含む； （ｂ）ＫＩＡＡ０００１ポリペプチドを発現している組換え細胞、好ましくは配
列番号２のＫＩＡＡ０００１ポリペプチドを発現している組換え細胞を含み、お
よびさらに好ましくは、標識または非標識ＵＤＰ-糖（例えばＵＤＰ-グルコース
、ＵＤＰ-ガラクトース、ＵＤＰ-グルクロン酸およびＵＤＰ-Ｎ-アセチルグルコ
サミン）を含む；または、 （ｃ）ＫＩＡＡ０００１ポリペプチドを発現している細胞膜、好ましくは配列番
号２のＫＩＡＡ０００１ポリペプチドを発現している細胞膜を含み、およびさら
に好ましくは、標識または非標識ＵＤＰ-糖（例えばＵＤＰ-グルコース、ＵＤＰ
-ガラクトース、ＵＤＰ-グルクロン酸およびＵＤＰ-Ｎ-アセチルグルコサミン）
を含む。

【００４５】 いずれかのそのようなキットにおいて、（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）が実質
的な成分を含んでもよいことが認識されるであろう。 潜在的なアンタゴニストには、ＫＩＡＡ０００１ポリペプチド レセプターの
溶解型、例えばリガンドに結合してリガンドが膜結合ＫＩＡ０００１ポリペプチ
ド レセプターと相互作用することを妨げるレセプターのフラグメントも含まれ
る。 潜在的なアンタゴニストにはまた、アンチセンス法の使用により調製されるア
ンチセンス構築物も含まれる。アンチセンス法を用いて、三重螺旋の形成または
アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡにより遺伝子発現をコントロールすることがで
きるが、両方法ともポリヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づくも
のである。例えば本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列
の５’コーディング部分を、約１０〜４０塩基対の長さのアンチセンスＲＮＡオ
リゴヌクレオチドを設計するために用いる。ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、転写
に関与する遺伝子の領域に相補的になるように設計し(三重らせん - Leeら、 Nu
cl. Acids Res., 6: 3073 (1979); Cooneyら、 Science, 241: 456 (1988); お
よび Dervanら、 Science, 251: 1360 (1991)を参照されたい。)、それによりＫ
ＩＡ０００１レセプター ポリペプチドの翻訳と産生を妨げる。アンチセンスＲ
ＮＡオリゴヌクレオチドはイン ビボでｍＲＮＡにハイブリダイゼーションし、
ｍＲＮＡ分子のＫＩＡＡ０００１ポリペプチドへの翻訳をブロックする(アンチ
センス - Okano, J., Neurochem., 56: 560 (1991); 遺伝子発現のアンチセンス
インヒビターとしてのオリゴデオキシヌクレオチド、 CRC Press, Boca Raton,
FL (1988))。前記のオリゴヌクレオチドは、細胞へ送達することもでき、その
結果、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡがインビボで発現され、ヒトＫＩＡＡポ
リペプチドの産生を阻害することができる。

【００４６】 予防および治療法 本発明は、ヒトＫＩＡＡ０００１レセプターの過剰活性および不充分活性の両
方に関連する異常症状を治療する方法を提供する。 ヒトＫＩＡＡ０００１レセプターの活性が過剰である場合、いくらかの手段を
利用できる。一つの手段は、ヒトＫＩＡＡ０００１レセプターへのリガンドの結
合をブロックすることにより、あるいはセカンドシグナルを阻害することにより
レセプターの活性化を阻害するのに有効な量で、前記のインヒビター化合物（ア
ンタゴニスト）を医薬上許容されるキャリアと共に患者に投与することおよび、
それにより異常症状を緩和することを含む。 もう一つの手段においては、内在性ヒトＫＩＡＡ０００１と競争してリガンド
を結合することができるヒトＫＩＡＡ０００１ポリペプチドの溶解型を投与して
もよい。そのような競争物の典型的な具体例には、ヒトＫＩＡＡ０００１ポリペ
プチドのフラグメントが含まれる。 さらにもう一つの手段においては、内在性ヒトＫＩＡＡ０００１をコードする
遺伝子の発現を、発現ブロッキング法を用いて阻害することができる。公知のそ
のような技術は、体内で形成された、あるいは別に投与するアンチセンス配列の
使用を含む。例えば、「遺伝子発現のアンチセンス インヒビターとしてのオリ
ゴデオキシヌクレオチド」、 CRC Press, Boca Raton, FL (1988)中のO'Connor,
J Neurochem (1991) 56:560を参照されたい。これとは別に、遺伝子と三重螺旋
を形成するオリゴヌクレオチドを供給することができる。例えば、Leeら、 Nucl
eic Acids Res (1979) 6:3073; Cooneyら、 Science (1988) 241:456; Dervanら
、 Science (1991) 251:1360を参照されたい。これらのオリゴマーはそれ自体を
投与することができ、あるいは適切なオリゴマーをインビボで発現させることが
できる。

【００４７】 ヒトＫＩＡＡ０００１レセプターの不充分な発現およびその活性に関連する異
常症状を治療するために、いくらかの手段を利用することができる。一手段は、
患者に治療的有効量の、ヒトＫＩＡＡ０００１レセプターを活性化させる化合物
すなわち前記のアゴニストを医薬上許容されるキャリアと組み合わせて投与し、
それにより異常症状を緩和することを含む。これとは別に、遺伝子治療法を用い
て患者体内の関連細胞によるヒトＫＩＡＡ０００１レセプターの体内産生を達成
してもよい。例えば、発現のために、本発明のポリヌクレオチドを前記のような
複製欠損性レトロウイルスベクターに組み込んでもよい。次いで、本発明のポリ
ペプチドをコードするＲＮＡを含有するレトロウイルスプラスミドベクターを用
いて形質導入したパッケージ細胞が、目的とする遺伝子を含有する感染性ウイル
ス粒子を産生するように、レトロウイルス発現構築物を単離し、そのパッケージ
細胞に導入することができる。このような産生細胞をインビボで細胞を操作し、
インビボでポリペプチドを発現させるために患者に投与してもよい。遺伝子治療
の概説としては、ヒト分子遺伝学、第２０章、 遺伝子治療および他の分子遺伝
学に基づく治療的アプローチ、(およびその中に記載される引用) 、 T Strachan
および A P Read, BIOS Scientific Publishers Ltd. (1996)を参照されたい。

【００４８】 処方および投与 ヒトＫＩＡＡ０００１ポリペプチドの溶解型のようなペプチドおよびアゴニス
トおよびアンタゴニストペプチドまたは小分子は、適当な医薬キャリアと組み合
わせて調剤することができる。そのような製剤は、治療的有効量のポリペプチド
または化合物および、医薬上許容されるキャリアまたは賦形剤を含む。そのよう
なキャリアには、塩水、緩衝剤で処理された塩水、デキストロース、水、グリセ
ロール、エタノールおよびそれらの組み合わせを含むがこれらには制限されない
。調剤は、投与の様式に適するべきであり、適切に当分野の技術範囲内にある。
本発明はさらに、前記本発明組成物の１またはそれ以上の成分で充填された１ま
たはそれ以上の容器を含む医薬パックおよびキットに関する。 本発明のポリペプチドおよび他の化合物は単独で、あるいは治療用化合物のよ
うな他の化合物と共に用いてもよい。 医薬組成物の全身投与の好ましい形態は、典型的には静脈注射による注射を含む
。皮下、筋肉内または腹膜内のような他の注射経路を用いることができる。全身
投与のためのこれとは別の手段は、肝汁塩またはフシジン酸または他の界面活性
剤のような浸透剤を用いた粘膜通過性および経皮投与を含む。さらに、腸溶性ま
たは被包性製剤中に適当に処方する場合、経口投与も可能である。これらの化合
物の投与は、軟膏、ペースト、ジェルなどの形態で局所および／または局部投与
してもよい。

【００４９】 必要とされる投与量の範囲は、ペプチドの選択、投与の経路、製剤の特性、患
者の疾患の特性および主治医の判断による。しかし、適当な投与量は、０．１-
１００μｇ／患者のｋｇの範囲内である。しかし、利用できる化合物の種類およ
び種々の投与経路の有効性を考慮すると、必要投与量の幅広い変動が予想される
。例えば、経口投与は静脈注射による投与よりも高投与量を必要とすることが予
想される。これらの投与レベルの変動は、当業者によく理解されるように最適化
のための標準の経験的常套法を用いて調整することができる。 治療に用いられるポリペプチドは、前記のように「遺伝子治療」としばしば呼ば
れる治療様相において、患者の体内で作成することもできる。つまり、例えば、
生体外でポリペプチドをコードするためのポリヌクレオチド、例えばＤＮＡまた
はＲＮＡなどを用いて、および例えばレトロウイルス プラスミド ベクターを使
用することにより患者由来の細胞を遺伝子操作することができる。次いで細胞を
患者に導入する。

【００５０】 実施例実施例１ 酵母細胞による発現 本発明のレセプターを、標準２ミクロンの、エス．セレビジエに基づくイー．コ
リ、シャトルプラスミド（アンピシリン耐性、ＣｏｌＥ１複製起点およびエス．
セレビジエＬＥＵ２遺伝子のための遺伝子を含む）上に保有されているＰＧＫ１
プロモーターを用いて、サッカロマイセスセレビジエ中で恒常的に発現させた。
ヒトＫＩＡＡ０００１ｃＤＮＡを５’末端と３’ＵＴＲｓを削除することにより
改変し、酵母発現ベクター中にサブクローンした。通常の酵母遺伝子技術を用い
て酵母細胞中に導入後、Ｃ-末端に標識をつけたヒトＫＩＡＡ０００１構築物と
、エピトープタグに対する抗体を用いたウェスタン ブロッティングにより、ヒ
トＫＩＡＡ０００１ポリペプチドの発現を検出した。ヒトＫＩＡＡ０００１ポリ
ペプチド（非標識）の機能的発現は実施例８に記載のように測定した。

【００５１】実施例２ 結合および機能アッセイのためのリガンドバンク ２００を越す推定レセプターリガンドのバンクをスクリーニングのために集め
た。バンクには、ヒトの７つの膜内外（７ＴＭ）レセプターを介して作用するこ
とが知られている伝達物質、ホルモンおよびケモキネ；自然に生じる化合物（ヒ
ト７ＴＭレセプターの推定アゴニストである可能性がある、哺乳動物以外の動物
由来の、哺乳動物で対応するものが未だ同定されていない生物学的に活性なペプ
チドであってもよい）；および、天然には見出されないが、未知の天然リガンド
とともに７ＴＭレセプターを活性化させる化合物；が含まれる。このバンクは、
公知のリガンドに対するレセプターを機能アッセイ（すなわち、カルシウム、ｃ
ＡＭＰ、マイクロフィジオメーター、卵母細胞エレクトロフィジオロジーなど、
以下参照）と結合アッセイの両方を用いて最初にスクリーニングするのに用いる
。

【００５２】実施例３ リガンド結合アッセイ リガンド結合アッセイは、レセプターの薬理(pharmacology)を確認するための
直接法を提供し、高処理量フォーマットに当てはめることができる。レセプター
に対する精製リガンドを、結合研究のために高比放射能(high specific activit
y)（５０-２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）に放射能標識した。放射能標識のプロセス
がリガンドのそのレセプターへの活性を減じないことの確認を次いで行った。バ
ッファー、イオン、ｐＨおよび他の調節物、例えばヌクレオチドに関するアッセ
イ条件を、膜および全細胞レセプター源の両方に関するノイズ比に対して実際に
使えるシグナルを確立するために最適化した。これらのアッセイに関して、特定
レセプターの結合を、全付随放射能活性から過剰の非標識競合リガンドの存在下
で測定した放射能活性を引いたものとして定義した。可能な場合、１以上の競合
リガンドを用いて残りの非特異的結合を特徴付けた。

【００５３】実施例４ アフリカツメガエルの卵母細胞における機能アッセイ キャップしたＲＮＡ転写産物を、本発明のレセプターｃＤＮＡｓをコードする
線状化したプラスミドの鋳型から、インビトロでＲＮＡポリメラーゼを用いて常
套法に従い合成した。インビトロ転写産物を水中０．２ｍｇ／ｍｌの最終濃度に
懸濁した。卵巣の突出部を大人のメスのカエルから切除し、第５期の脱小嚢化し
た(defolliculated)卵母細胞を得、ＲＮＡ転写産物（１０ｎｇ／卵母細胞）を５
０ｎｌボーラスで極微注射装置を用いて注射した。アゴニストへの暴露に応答し
た個々のアフリカツメガエルの卵母細胞からの電流を測定するために、２つの電
極ボルトクランプを用いた。Ｃａ²⁺を除いたバース(Barth's)培地中、室温で記
録を行った。アフリカツメガエル系は、公知のリガンドおよびリガンドを活性化
させるための組織／細胞抽出物をスクリーニングするために用いることができる
。

【００５４】実施例５ アッセイ 幅広い種類の第二メッセンジャー系が活性化されると、細胞から少量の酸が迸
出される。形成された酸は大部分が、細胞内シグナル化プロセスをあおるために
必要とされる増加した代謝活性の結果として生じたものである。細胞を囲む培地
のｐＨ変化は非常に小さいが、サイトセンサー(ＣＹＴＯＳＥＮＳＯＲ)(Molecul
ar Devices Ltd., Menlo Park, CA)により検出できる。サイトセンサーはつまり
、エネルギーを利用している細胞内シグナル化経路と連結するレセプター、例え
ば本発明のＧ-タンパク質結合レセプターの活性化を検出することができる。

【００５５】実施例６ 抽出物／細胞上清スクリーニング 同系の(cognate)活性化リガンド（アゴニスト）が未だ発見されていない多数
の哺乳動物のレセプターが存在する。つまり、これらのレセプターに対する活性
化リガンドは、今日までに同定されたリガンドバンクに含まれていない可能性が
ある。従って本発明の７ＴＭレセプターをまた、天然のリガンドを同定するため
に、組織抽出物に対して（カルシウム、ｃＡＭＰ、マイクロフィジオメーター、
卵母細胞エレクトロフィジオロジーなど、機能的スクリーニングを用いて）機能
的にスクリーニングする。ポジティブな機能応答を生じる抽出物は、活性化リガ
ンドが単離または同定されるまで続けて副次分画する(subfractionated)ことが
できる。

【００５６】実施例７ カルシウムとｃＡＭＰの機能アッセイ ＨＥＫ２９３細胞中で発現される７ＴＭレセプターは、ＰＬＣの活性化および
カルシウムの動員および／またはｃＡＭＰの刺激または阻害と機能的に関連して
いることがすでに示されている。レセプターを形質移入したＨＥＫ２９３細胞ま
たはベクター制御細胞の基底カルシウムレベルは、通常の範囲、１００ｎＭから
２００ｎＭの範囲内にあることが観察された。組換えレセプターを発現している
ＨＥＫ２９３細胞にｆｕｒａ２を添加し、１日で、１５０を越す選択リガンドま
たは組織／細胞抽出物を、アゴニスト誘導性のカルシウムの動員に関して評価し
た。同様に、組換えレセプターを発現しているＨＥＫ２９３細胞を、常套のｃＡ
ＭＰ計量アッセイを用いてｃＡＭＰ産生の刺激または阻害に関して評価した。カ
ルシウム過渡応答またはｃＡＭＰの変動を呈するアゴニストをベクターコントロ
ール細胞中で試験し、応答がレセプターを発現している感染細胞にユニークなも
のであるかを決定した。 ＫＩＡＡ０００１レセプターをＨＥＫ２９３細胞に瞬間的に感染させ、または
、Ｇ・１６を用いて同時感染させた。図４Ａは、ＵＤＰ-グルコースに対するカ
ルシウムの機能的応答がＧ・１６を用いた同時感染を必要とすることを示す。該
レセプターのみで感染したＨＥＫ２９３親細胞系統およびＨＥＫ２９３細胞は、
ＵＤＰ-グルコースに応答しなかった。図４Ｂに示す結果により、ＵＤＰ-グルコ
ースおよびＵＤＰ-ガラクトースの２リガンドを、ＫＩＡＡ０００１レセプター
とＧ・１６を用いて同時感染させたＨＥＫ２９３細胞に対する有力なアゴニスト
として同定した。これらのリガンドに関するＥＣ₅₀（最大応答５０％を与える濃
度）は約３００ｎＭであった。図４Ｂは、細胞がＣＤＰ-グルコースに対して、
Ｅ₅₀が約５０,０００ｎＭと低い効能で応答したことを示す。

【００５７】実施例８ 酵母における、ＵＤＰ-糖（例えば、ＵＤＰ-グルコース、ＵＤＰ-ガ
ラクトース、ＵＤＰ-グルクロン酸およびＵＤＰ-Ｎ-アセチルグルコサミン）誘
導性レポーター遺伝子の発現 ヒトＫＩＡＡ０００１レセプターを、酵母内在性Ｇ-タンパク質および／また
は、同時発現した酵母／ヒトのキメラＧタンパク質、および／またはヒトＧ-タ
ンパク質を含む酵母株中で発現させた。用いられた酵母株は、遺伝子中のフェロ
モン応答経路中に変異：例えば、（ｉ）内在性Ｇ-タンパク質結合フェロモンレ
セプターをコードするＳＴＥ２またはＳＴＥ３の欠失；（ｉｉ）細胞サイクルの
抑止を導くサイクリン依存性キナーゼと通常関連するタンパク質をコードするＦ
ＡＲ１遺伝子の欠失；および、（ｉｉｉ）ＦＵＳ１遺伝子プロモーター（ＦＵＳ
１は細胞融合に必要とされる膜停泊糖タンパク質をコードする）に融合するレポ
ーター遺伝子の構築；を含む。下流のレポーター（ＦＵＳ１-ＬａｃＺ）はリガ
ンドに応答して比色計または蛍光計の読出しを可能にする。ヒトＫＩＡＡ０００
１レセプターを発現しているＦＵＳ１-ＬａｃＺ酵母はガラクトシダーゼの発現
により測定されるように、ＵＤＰ-糖（例えばＵＤＰ-グルコース、ＵＤＰ-ガラ
クトース、ＵＤＰ-グルクロン酸およびＵＤＰ-Ｎ-アセチルグルコサミン）に対
してレセプター依存性の応答を示した。図３に示すＵＤＰ-グルコースに対する
応答は、ヒトＫＩＡＡ０００１レセプターの、酵母または酵母／ヒトのキメラＧ
-タンパク質に対する機能的結合を示唆する。

【００５８】 この応答の特異性は、１０ｎｍｏｌ（１０ｍＭ溶液の１μｌ）の各々のヌクレ
オチド二リン酸-糖を、前記のようなヒトＫＩＡＡ０００１レセプターおよびＦ
ＵＳ１-ＬａｃＺレポーターを保有している酵母株をしみこませたアガロースプ
レート上にスポットすることにより決定した。ＵＤＰ-グルコース、ＵＤＰ-ガラ
クトース、ＵＤＰ-グルクロン酸およびＵＤＰ-アセチルグルコサミンはポジティ
ブな応答を生じたのに対して、ＡＤＰ-リボース、ＧＤＰ-グルコース、ＡＤＰ-
グルコース、ＡＤＰ-マンノース、ＧＤＰ-フコース、ＣＤＰ-グルコース、ＧＤ
Ｐ-マンノースおよびＴＤＰ-グルコースは応答を生じなかった。

【００５９】実施例９ ヒト培養大動脈平滑筋細胞の増殖へのＵＤＰ-グルコースの効果 ヒト培養大動脈平滑筋細胞（ＨＡＳＭＣｓ）の増殖へのＵＤＰ-グルコースの
効果を評価するための研究を行った。結果はトリチウム化チミジンの取り込みに
より測定されるように、１〜１０μＭの用量依存方式において、細胞増殖の有意
な低下を示した。トリチウム化チミジンの取り込みの研究は、Sungら、 Journal
of Pharmacology および Experimental Therapeutics 271: 429-437 (1994)に
より記載されるように行った。評価された最大投与量、１０μＭで、２７％の細
胞増殖の低下が引き起こされた。ＨＣＡＳＭＣｓはクロネティクス(Clonetics)(
San Diego, California)から購入し、販売者の指示に従って培養した。 この実験からの結果により、ＵＤＰ-グルコースのアゴニストが好都合である
疾患が再狭窄、アテローム性動脈硬化症および、過剰な平滑筋細胞の増殖により
特徴付けられる他の疾患であろうことが明らかになった。ＵＤＰ-グルコースの
アンタゴニストは、動脈瘤、創傷治癒および平滑筋細胞の欠損または、平滑筋細
胞増殖の低下により特徴付けられる他の疾患を含む疾患に好都合であろう。

【００６０】 本明細書中に引用される、これに限定されるものではないが、特許および特許
出願を含む全ての刊行物は、あたかも十分に開示されているものとして、たとえ
、個々の各刊行物が具体的かつ個別的に出典を明示することで本明細書の一部と
することを意図するとしても、その全体を本明細書中に組み入れるものとする。
前記の記載は完全に本発明を開示し、その好ましい具体例を含むものである。本
明細書中に詳細に開示する具体例の変更および改良は、前記請求項の範囲内にあ
る。さらに詳細な記載がなくても、当業者は前記の記載を用いて本発明をその最
大程度まで利用することができる。それゆえ、本明細書中に提供される実施例は
、単に実例と解釈されるべきであり、どうあっても本発明の範囲を制限するもの
ではない。限定的特性または権利を主張する本発明の態様を前記特許請求の範囲
に規定する。

【００６１】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、ヒトＫＩＡＡ０００１レセプターのヌクレオチド配列（
配列番号：１）を示す。酵母の好ましいコドンをコード化するために、輪郭が浮
き上がった(bolded)ヌクレオチドをＰＣＲによりゆっくりと変化させた。

【図２】 図２は、ヒトＫＩＡＡ０００１レセプターの推定アミノ酸配列（
配列番号２）を示す。

【図３】 図３は、経路誘導性ＦＵＩ１-ＬａｃＺレポーターを含み、かつ
液体ｌａｃＺアッセイフォーマット中でＧＰＡ１と共にヒトＫＩＡＡ０００１レ
セプターを発現している酵母細胞に対するＵＤＰ-グルコースの濃度応答曲線を
示す。

【図４Ａおよび図４Ｂ】 図４Ａおよび図４Ｂは、ヒトＫＩＡＡ０００１レ
セプターに一時感染したＨＥＫ２９３細胞に対するＵＤＰ-グルコースおよびＵ
ＤＰ-ガラクトースの濃度応答曲線を示す。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 スミスクライン ビーチャム パブリック リミテッド カンパニー ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ ｐ．ｌ．ｃ． イギリス国 ティダブリュ８ ９ジーエ ス，ミドルセックス，ブレントフォード， グレート ウェスト ロード 980 (72)発明者 ロバート・エス・エイムズ アメリカ合衆国19083ペンシルベニア州ヘ イバータウン、エリス・ロード276番 (72)発明者 アン・ロマニック・アーノルド アメリカ合衆国ペンシルベニア州ウィンウ ッド、ドーブ・ロード807番 (72)発明者 ジョナサン・ケイ・チェンバーズ イギリス、シーエム19・５エイディ、エセ ックス、ハーロウ、ザ・ピナクルズ、コー ルドハーバー・ロード (72)発明者 ジェイムズ・ジェイ・フォーリー アメリカ合衆国19087ペンシルベニア州ラ ドノー、ティモシー・サークル117番 (72)発明者 ヘンリー・エム・サロー アメリカ合衆国19438ペンシルベニア州ハ ーリーズビル、メイプル・アベニュー348 番 (72)発明者 ブライアン・アール・スチュアート イギリス、シーエム19・５エイディ、エセ ックス、ハーロウ、ザ・ピナクルズ、コー ルドハーバー・ロード Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 CB01 DA13 DA36 4B024 AA01 BA63 CA04 DA02 EA02 EA04 GA11 HA01 4B063 QA01 QA18 QQ01 QQ08 QQ67 QR33 QR60 QR77 QR80 QS05 QX07 4B065 AA90X AA93Y AB01 BA02 CA24 CA44

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ａ）細胞表面にポリペプチド（該ポリペプチドは化合物の
   該ポリペプチドへの結合に応答して検出可能なシグナルを提供することができる
   第二の成分と会合する）を発現している細胞を、スクリーニングすべき化合物と
   、ポリペプチドへの結合を可能にする条件下で接触させること；および、 （ｂ）該化合物と該ポリペプチドの相互作用から生じるシグナルのレベルを測定
   することにより、化合物がポリペプチドに結合し、それを活性化したかどうか、
   あるいは阻害したかどうかを決定すること； を含む、配列番号２に記載のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストを
   同定するための方法。
2. 【請求項２】 該方法が、ＵＤＰ-グルコース、ＵＤＰ-ガラクトース、ＵＤ
   Ｐ-グルクロン酸および、ＵＤＰ-Ｎ-アセチルグルコサミンから成る群から選択
   される標識または非標識ＵＤＰ-糖の存在下で、アゴニストまたはアンタゴニス
   トの同定を行うことをさらに含む請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 細胞が哺乳動物細胞である請求項２記載の方法。
4. 【請求項４】 請求項３記載の方法により同定されるアゴニスト。
5. 【請求項５】 請求項３記載の方法により同定されるアンタゴニスト。
6. 【請求項６】 細胞が哺乳動物のＨＥＫ２９３細胞である請求項３記載の方
   法。
7. 【請求項７】 （ａ）候補となる化合物の存在下、ポリペプチドへの結合を
   許容する条件下で、表面にポリペプチドを有する細胞への、あるいはポリペプチ
   ドを含む細胞膜へのリガンドの結合の阻害を測定すること；および、 （ｂ）レセプターに結合したリガンドの量を測定すること（リガンドの結合の低
   下を引き起こすことができる化合物がアゴニストまたはアンタゴニストである。
   ）； の段階を含む、配列番号２記載のＫＩＡＡ０００１ポリペプチドのアゴニストま
   たはアンタゴニストを同定するための方法。
8. 【請求項８】 リガンドが、ＵＤＰ-グルコース、ＵＤＰ-ガラクトース、Ｕ
   ＤＰ-グルクロン酸および、ＵＤＰ-Ｎ-アセチルグルコサミンから成る群から選
   択される標識または非標識ＵＤＰ-糖である請求項７記載の方法。
9. 【請求項９】 細胞が哺乳動物細胞である請求項８記載の方法。
10. 【請求項１０】 請求項９記載の方法により同定されるアゴニスト。
11. 【請求項１１】 請求項９記載の方法により同定されるアンタゴスト。
12. 【請求項１２】 細胞が哺乳動物のＨＥＫ２９３細胞である請求項８記載の
    方法。