WO2004101616A1 - 肝臓Ｘ受容体αスプライシング変異体タンパク質、その遺伝子及びそれらの利用 - Google Patents

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WO2004101616A1
WO2004101616A1 PCT/JP2004/006814 JP2004006814W WO2004101616A1 WO 2004101616 A1 WO2004101616 A1 WO 2004101616A1 JP 2004006814 W JP2004006814 W JP 2004006814W WO 2004101616 A1 WO2004101616 A1 WO 2004101616A1
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receptor
liver
amino acid
splicing variant
variant protein
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PCT/JP2004/006814
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Ko Fujimori
Koichi Saito
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Sumitomo Chemical Company, Limited
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Publication date
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)

Definitions

  • Liver X receptor ⁇ -splicing mutant protein its gene and their use
  • the present invention relates to a liver X receptor, which is an isoform of liver X receptor a.
  • Cholesterol is an important lipid in the living body and also a component of various lipids. Cholesterol is biosynthesized from acetyl-CoA in the power absorbed by the intestinal tract by eating or in the liver. After the biosynthesized cholesterol is excreted from the liver, it can be reabsorbed in the small intestine, transported to the liver via the blood, and reused. In the liver, some cholesterol is metabolized to bile acids. Elevated cholesterol levels in the body due to any abnormalities cause hyperlipidemia-induced atherosclerosis due to hypercholesterolemia. The mechanism of the onset of these high cholesterol-related diseases has not been fully elucidated. At present, cholesterol synthesis inhibitors (statins) and fibrate drugs are used as treatments for diseases caused by hypercholesterolemia. However, treatment with these drugs is not always satisfactory in some cases.
  • statins cholesterol synthesis inhibitors
  • fibrate drugs are used as treatments for diseases caused by hypercholesterolemia. However, treatment with these drugs is not always
  • Cholesterol reabsorption and conversion to bile acids are performed by specific transporters or enzymes. Furthermore, it is known that liver X receptor, one of the nuclear receptors, is involved in the regulation of the expression of genes encoding these proteins.
  • liver X receptor has two subtypes (liver X receptor and liver X receptor) (for example, Peet et al., Curr. Op in. Genet. Dev. 8; 571-575, 1998.).
  • Liver X receptor forms a heterodimer with one of nuclear receptors, retinoid X receptor (RXR), and regulates the transcription of the target gene by binding to the transcriptional regulatory region of the target gene.
  • RXR retinoid X receptor
  • Liver X Subtypes and isoforms have also been found in nuclear receptors other than the receptors.For example, RAR, RXR and PPAR have three subtypes and isoforms in which the protein encoded by them has been altered.
  • the isoforms of RAR and PPAR are thought to result from alternative splicing and / or control of different promoters, and are known to differ in their tissue specificity and role in their expression (eg, Takeyama et al. al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 222; 395-400, 1996.). Therefore, it is considered that the subtype and isoform of the nuclear receptor have different functions.
  • liver X receptor ⁇ which plays an important role in the regulation of cholesterol metabolism, if there is an isoform that functions to alter normal cholesterol metabolism by normal liver X receptor ⁇ , Such isoforms are important for elucidating the relevance to pathological conditions whose function is directly or indirectly involved, and for developing pharmaceuticals for the prevention or treatment of those diseases. . Disclosure of the invention
  • the present invention provides a novel liver X receptor ⁇ isoform of liver X receptor splicing mutant protein which is involved in the inhibition of normal cholesterol metabolism by normal liver X receptor, its gene, and genes thereof. Provide usage.
  • the present invention provides
  • liver X receptor ⁇ splicing variant protein (hereinafter referred to as the splicing mutation of the present invention), which is an isoform of liver X receptor ⁇ and has at least the amino acid sequence encoded by exon 5 of the liver X receptor gene.
  • Liver X receptor alpha isoform comprising the amino acid sequence encoded by intron 5 of liver X receptor alpha gene, liver X receptor Splicing mutant protein (hereinafter sometimes referred to as splicing mutant protein 5% of the present invention); 3.
  • the liver X receptor ⁇ splicing variant protein according to the above item 2 which has any one of the following amino acid sequences;
  • liver X receptor splicing variant protein which is an isoform of the liver X receptor, which comprises an amino acid sequence encoded in a part of intron 6 of the liver X receptor ⁇ gene.
  • the splicing variant protein of the present invention may be referred to as 6%.
  • liver X receptor a splicing variant protein according to the above item 4, which has any one of the following amino acid sequences;
  • liver X receptor according to any one of the above items 1 to 5, wherein the liver X receptor has a weak transcription activating ability as compared to the transcription activation ability of the normal liver X receptor a which the ligand has. a splicing variant protein;
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 or a base sequence having complementarity to the base sequence A polynucleotide having:
  • polypeptide according to item 11 which has one of the following amino acid sequences:
  • a polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7, or a nucleotide sequence having complementarity to the nucleotide sequence;
  • a polynucleotide having a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the liver X receptor splicing variant protein according to any one of the preceding items 1 to 6, or the polynucleotide according to any one of the preceding items 7 to 10 (hereinafter referred to as , And may be collectively referred to as the splicing variant protein gene of the present invention.), Or a recombinant vector containing the same (hereinafter, also referred to as the present invention vector);
  • a method for producing a vector having a step of introducing a vector capable of autonomous replication in a host cell (hereinafter referred to as a method for producing the vector of the present invention) Sometimes. );
  • a method for producing a liver X receptor splicing mutant protein comprising the step of culturing the transformant according to the above item 17 to produce a liver X receptor a splicing mutant protein (hereinafter referred to as the present invention)
  • a method for producing a splicing variant protein comprising the step of culturing the transformant according to the above item 17 to produce a liver X receptor a splicing mutant protein (hereinafter referred to as the present invention)
  • a method for producing a splicing variant protein comprising the step of culturing the transformant according to the above item 17 to produce a liver X receptor a splicing mutant protein
  • a polynucleotide having a base sequence encoding the amino acid sequence of any of the liver X receptor splicing variant proteins according to any one of the above items 1 to 6, or the polynucleotide according to the above items 7 to 10! A gene-deficient animal lacking the ability to express any of the polynucleotides;
  • a polynucleotide having a base sequence encoding the amino acid sequence of any one of the polypeptides according to the above items 11 to 12 (hereinafter, sometimes referred to as the polypeptide gene of the present invention), or the above items 13 to 1 A recombinant vector containing any of the polynucleotides of 5;
  • Polynucleotide having a base sequence encoding the amino acid sequence of any one of the polypeptides according to the above paragraphs 11 to 12, or any one of the polynucleotides according to the above paragraphs 13 to 15 is introduced into a host cell.
  • liver X receptor splicing variant protein is any of the liver X receptor ⁇ splicing variant proteins according to 1 to 6 above;
  • liver X receptor splicing variant protein is any of the liver X receptor ⁇ splicing variant proteins according to any one of 1 to 6 above;
  • liver X receptor ⁇ cells that produce splice variant protein, wherein contacting the liver X receptor ⁇ splicing ligand mutant proteins, other undergoing expression regulation by the liver X receptor ⁇ splicing mutant protein
  • a first step of measuring the amount of the protein produced by contacting the cell producing the liver X receptor ⁇ splicing variant protein with both the ligand of the ff organ X receptor a splicing variant protein and the test substance A second step of measuring the amount of production of another protein that is subject to expression regulation by the liver X receptor splicing variant protein, and a step of measuring the amount of the other protein measured in the first step and the second step. Evaluating the antagonism of the test substance to the ligand based on the difference in the amount of production.
  • liver X receptor ⁇ -splicing mutant protein is any of the monthly X-receptor ⁇ -splicing mutant proteins described in 1 to 6 above;
  • liver X receptor ⁇ splicing mutant protein selected by the screening method according to the above items 23 to 28;
  • a second step of amplifying a partial region of the complementary DNA (cDNA) corresponding to the polynucleotide or the polynucleotide according to any one of the above items 13 to 15, and a third step of detecting the amplified partial region A method comprising the steps of:
  • the step of detecting the liver X receptor ⁇ splicing variant protein based on an antigen-antibody reaction using an antibody capable of specifically detecting any one of the polypeptides according to the above paragraphs 11 and 12 is carried out.
  • a first antibody capable of specifically detecting the splicing mutant protein or any one of the polypeptides described in 11 to 12 above is bound to a microtiter well.
  • any of the liver X receptor hiss of items 1 to 6, wherein the biological sample A second step in which the pricing variant protein binds to the first antibody on the microtiter well; after the second step, a third step of removing all unbound biological samples in the microtiter well;
  • a labeled second antibody capable of binding to a different epitope from the first antibody is replaced with a liver X receptor ⁇ -splicing variant protein bound to the first antibody.
  • a method comprising a sixth step of detecting using the label of the antibody as an indicator
  • liver X receptor ⁇ -splicing variant protein as a marker for examining cholesterol metabolism disorders
  • the liver X receptor splicing variant protein is the liver X receptor ⁇ splicing variant protein according to the above item 2, 3, 4, 5 or 6, or a liver X receptor sphing isoform.
  • liver X receptor ⁇ as a marker for examining the presence of cancer cells, wherein the amino acid sequence encoded by exon 5 of the monthly X receptor ⁇ gene is deleted.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing the structural domains of a normal liver X receptor ⁇ gene and three types of liver X receptor splicing variant protein genes. The translation region is shown in black.
  • FIG. 2 shows PCR products amplified by PCR using cDNA derived from human normal tissue or human cancer tissue for type I and a primer (LXR a F LXR a R) specific for liver X receptor ⁇ . Part of the 1 ° // including brominated chimney.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of subjecting to agarose gel electrophoresis, visualizing amplified signals under ultraviolet irradiation after electrophoresis.
  • Breast cancer Brea st carcinoma
  • Lung cancer Lung carcinoma
  • Colorectal cancer Colon adenocarcinoma
  • FIG. 3 shows the results of PCR performed using cDNA derived from human normal tissue or human cancer tissue for type I and a primer set that specifically amplifies each of the three types of liver X receptor ⁇ splicing mutant proteins.
  • FIG. 4 is a view showing a PCR product amplified by the above method.
  • the upper panel shows a primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 designed to specifically amplify the liver X receptor ⁇ splicing mutant protein 5 ⁇ and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13
  • FIG. 3 shows PCR products amplified by PCR performed using primers consisting of:
  • the PCR product derived from hLXRa 5A is a DNA fragment having 432 base pairs.
  • the lower panel shows a primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14 designed to specifically amplify liver X receptor ⁇ ; splicing variant protein 6A.
  • This figure shows PCR products amplified by PCR performed using different primers.
  • the PCR product derived from the liver X receptor ⁇ -splicing mutant protein 6 ⁇ is a DNA fragment having 429 base pairs. ⁇ After cloning, determine the nucleotide sequence of the PCR product obtained by each PCR reaction, and confirm that the target product has been amplified.
  • FIG. 4 is a view showing the results of examining the expression of normal liver X receptor ⁇ and three types of liver X receptor ⁇ splicing mutant proteins in circulatory tissues.
  • the upper panel shows an example in which the expression of normal liver X receptor ⁇ and liver X receptor a splicing mutant protein D5 was examined.
  • the P.CR product from liver X receptor a splicing variant protein D5 is a DNA fragment with 416 base pairs.
  • the middle panel shows a primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13 designed to specifically amplify liver X receptor a splicing mutant protein 5A.
  • This figure shows products amplified by PCR performed using a primer consisting of:
  • the PCR product derived from hLXRa5A is a DNA fragment having 432 base pairs.
  • the lower panel shows a primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 designed to specifically amplify the liver X receptor a splicing mutant protein 6A and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14
  • This figure shows products amplified by PCR using different primers.
  • the PCR product derived from liver X receptor a splicing variant protein 6A is a DNA fragment with 429 base pairs.
  • the base sequence of the PCR product obtained by each PCR reaction was determined after TA cloning, and it was confirmed that the target product was amplified.
  • FIG. 5 shows the results of functional evaluation of liver X receptor splicing mutant proteins (D5, 5A and 6A) by a reporter assay in a transient expression system in HEK293 cells.
  • TATA-LXREx 4-lucif erase vector and one of each of the three types of X-receptor X-receptor a-splicing mutant protein expression vectors were introduced into HEK293 cells and transcribed when various liver X-receptor ⁇ -ligands were added. The result of having measured the activity ability is shown.
  • the untreated group was shown in white, the lg / ml 22R-hydroxycholesterol-treated section was shown in black, and the lg / ml 25-hydroxycholesterol-treated section was shown in gray.
  • Each test plot also contains one 9-cis retinoic acid.
  • the value of luciferase activity in the control group to which only the solvent was added (control) was taken as 100%, and the value of luciferase activity in each test group was shown as a relative value.
  • WT means normal liver X receptor ⁇ .
  • FIG. 4 is a view showing the results of measuring the transcriptional activity when coexisting with.
  • Each test group also contains 1 ⁇ m of 9-cis retinoic acid.
  • the present invention relates to a liver X receptor ⁇ splicing variant protein that is an isoform of liver X receptor ⁇ , its gene, and use thereof.
  • liver X receptor ⁇ splicing mutant proteins isolated in the present invention one is an isoform containing the amino acid sequence encoded by intron 5 (the splicing mutant protein 5 ⁇ of the present invention), The other is an isoform (splicing variant protein 6 of the present invention) containing an amino acid sequence encoded in a partial region in intron 6. These amino acid sequences are newly discovered sequences.
  • the other is an isoform lacking the amino acid sequence encoded by exon 5 (liver X receptor ⁇ -splicing variant protein D5).
  • the amino acid sequence of this isoform was identical to the sequence already registered in the public database (GenBank Accession No. BC008819).
  • the splicing mutant protein 5A of the present invention contains an amino acid sequence encoded by intron 5 downstream of an amino acid residue corresponding to the carboxyl terminus of the amino acid sequence encoded by exon 5 of normal liver X receptor a. Other than that, it has exactly the same nucleotide sequence as the normal type. Further, the splicing variant protein 6A of the present invention comprises an amino acid sequence encoded by a partial region in intron 6 downstream of an amino acid residue corresponding to the carboxyl terminus of the amino acid sequence encoded by exon 6, It has the exact same nucleotide sequence as the normal type.
  • the liver X receptor splicing mutant protein D5 has the same amino acid sequence as the normal type except that the amino acid sequence encoded by exon 5 has been deleted.
  • the normal liver X receptor a possesses the ability of these three types of liver X receptor a splicing mutant proteins to activate transcription by 22R-oxycholesterol, one of the ligands of liver X receptor a. This level is extremely weak or not recognized as compared with the transcription activation ability. Furthermore, when co-expressing normal liver X receptor a and each of the three types of liver X receptor a splicing mutant proteins described above, the ligand dependence observed when only normal liver X receptor a was expressed Transcriptional activation is remarkably suppressed. These findings suggest that the three types of liver X receptor a splicing mutant proteins are dominant negatively involved in the normal inhibition of normal cholesterol metabolism by normal liver X receptor a in vivo. You.
  • the splicing variant protein of the present invention is an isoform of liver X receptor a and has at least the amino acid sequence encoded by exon 5.
  • a typical example is an isoform of liver X receptor a containing an amino acid sequence encoded by intron 5 of liver X receptor a gene (ie, splicing mutant protein 5A of the present invention).
  • An isoform of liver X receptor a containing an amino acid sequence encoded in a part of intron 6 of liver X receptor a gene (ie, splicing variant protein 6A of the present invention), etc. Can be given.
  • splicing variant protein 5A of the present invention (1) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and (2) an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Or (3) a liver X receptor a isoform having an amino acid sequence having 95% or more amino acid identity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the splicing variant protein 6A of the present invention includes (1) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, (2) an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, or (3) The liver X receptor a isoform having any one of the amino acid sequences having 95% or more amino acid identity to the amino acid sequence represented by 2 is exemplified.
  • Such a splicing variant protein of the present invention has a weak transcription activating ability as compared with the ligand-activating ability of the normal liver X receptor a.
  • substantially identical amino acid sequence when the amino acid sequence of a protein having a physiological activity is generally slightly changed, for example, one or more amino acids in the amino acid sequence are deleted or substituted. It is a well-known fact that the biological activity of the protein may be maintained even when there is a change to be added, and therefore, the “substantially the same.
  • amino acid sequence means that one or more amino acids in a specific amino acid sequence (ie, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2) are deleted as long as the biological activity is substantially the same.
  • lost, substituted or added human liver X receptor splicing variant proteins are also meant to be within the scope of the present invention.
  • the number of amino acids to be modified as described above is at least one residue, specifically one or several (here, "several” is about 2 to about 10), or more. is there. The number of such modifications may be any range as long as the physiological activity of the protein is maintained. More specifically, in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, 1 to 20 amino acids, preferably 1 to 10 amino acids, more preferably 1 to 5 amino acids are deleted or substituted. Or an added human liver X receptor splicing variant protein.
  • Such a mutation may be a mutation naturally occurring due to, for example, the processing of a protein in a cell, a species difference, an individual difference, a difference between organs and tissues of an organism from which the protein is derived, or an artificial mutation.
  • Amino acid mutations (for example, in the amino acid sequence of a protein created by introducing a mutation into DNA encoding a natural protein and expressing it by site-directed mutagenesis, mutagenesis, etc.) Amino acid mutation).
  • Such a mutant protein obtained by deletion, substitution or addition of amino acids may include a conservatively substituted amino acid sequence.
  • Non-limiting examples of such conservative substitutions include: 1 glycine, alanine; 2 parin, isoleucine, oral isine; 3 aspartic acid, glutamic acid, asparagine, glutamine, 4 serine, Substitution between aliphatic chain-containing amino acid residues and substitution between polar groups, such as substitution of threonine; 5lysine, anoreginin; 6 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 6 6 6 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ .
  • Mutant proteins with amino acid deletions, substitutions, or amino acids can be obtained, for example, by introducing a site-specific mutation into a gene having a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence, which is known in the art (for example, Nelson and McClelland, Methods Enzymol, 216; 279, 1992, etc., using a method using a bumper mutation (gapped 'duplex method, Nucleic Acids Res., 12, 9441-9456, 1984), a method using PCR using mutagenic primers) Can be obtained by Site-directed mutagenesis can be performed using a synthetic primer containing the mutation to be introduced.
  • an amplification reaction is carried out using the above-mentioned synthetic oligonucleotide and a primer having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence thereof as a primer and a plasmid containing a normal liver X receptor gene as a ⁇ -type. Then, treatment with Dpn I, a methionylation-sensitive restriction enzyme, leaves only the newly formed DNA having the mutation.
  • This reaction solution is used to transform Escherichia coli XLI-Blue, which is then plated on LB agar medium containing ampicillin. 37. (: Overnight, and isolate the plasmid from the proliferated colonies. This makes it possible to obtain a plasmid containing the mutated DNA.
  • Kits based on the above method include, for example, the QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Manufactured by Stratagene), etc. These may be used. The introduction of the desired mutation can be confirmed by determining its nucleotide sequence.
  • a method for performing substitution or addition in addition to the above-described site-directed mutagenesis, a method of treating a gene with a mutagen or cleaving a gene with a restriction enzyme to remove, add, or remove a selected gene fragment Substitution followed by ligation can also be mentioned.
  • the term “normal liver X receptor” refers to a liver X receptor ⁇ consisting of the most frequently occurring amino acid sequence in nature in the receptor protein derived from the same species of organism.
  • the human-derived normal liver X receptor ⁇ includes a monthly X receptor ⁇ consisting of an amino acid sequence (GenBank Accession No. Access—005693) registered in a public database.
  • amino acid identity and “base identity” refer to sequence identity and homology between two proteins or two DNs. Said "identity” is determined by comparing two sequences aligned optimally over the entire region of the sequence to be compared.
  • the protein or DNA to be compared may have an addition or deletion (for example, a gap or the like) in the optimal alignment of the two sequences.
  • identity can be calculated, for example, by creating an alignment using the ClustalW algorithm (Nucleic Acid Res., 22 (22): 4673-4680 (1994)) using Vector NTI.
  • the identity can be measured using sequence analysis software, specifically, an analysis tool provided by Vect or NTI, GENETYX-MAC, or a public database. It is generally available at http: jww.ddbj.nig.ac.jp “Amino acid identical 'I” life ”in the present invention is based on the amino acid sequence, for example, about 95% or more.
  • the “base identity” is based on the nucleotide sequence, and is preferably, for example, about 95% or more.
  • the splicing variant protein of the present invention can be obtained by a hybridization method. It can be obtained by conventional genetic engineering methods such as PCR.
  • RNA is extracted according to genetic engineering methods to synthesize single-stranded cDNA. Specifically, for example, liver This tissue is crushed in a solution containing a protein denaturant such as guanidine thiocyanate, and the denatured protein is further added to the crushed material by addition of black-mouthed form. After removing the denatured protein by centrifugation or the like, total RNA is extracted from the collected supernatant fraction using phenol, pore form, or the like.
  • kits based on these methods include, for example, IS0GEN (manufactured by Nippon Gene) and TRIZ0L reagent (manufactured by Invitrogen).
  • RNA was used as type I, and an oligo dT primer was bound to the polyA sequence of the mRNA, and a reverse transcriptase, for example, RNaseH-Superscript II Reverse Transcriptase (manufactured by Invitrogen) and the attached buffer and oligo were used.
  • a reverse transcriptase for example, RNaseH-Superscript II Reverse Transcriptase (manufactured by Invitrogen) and the attached buffer and oligo were used.
  • RNaseH-Superscript II Reverse Transcriptase manufactured by Invitrogen
  • Incubate the reverse transcriptase with the dT primer by incubating at 42 ° C for 1 hour and then heating at 99 ° C for 5 minutes.
  • the mRNA strand is nicked with RNaseH, the single-stranded cDNA is converted into type II, and double-stranded cDNA is synthesized with E. coli DNA polymerase I.
  • the ends of the obtained double-stranded cDNA are blunt-ended with T4 DNA polymerase.
  • the blunted double-stranded cDNA is introduced into a vector such as a pBluescript II vector or a pacteriophage, for example, gtll or EMBL3, using T4 ligase to prepare a cDNA library.
  • kits based on these methods include, for example, cDNA Synthesis System Plus (manufactured by Amersham Bioscience) and TimeSaver cDNA synthesis kit (manufactured by Amersham Bioscience).
  • hybridization is performed using, for example, a DNA having a partial nucleotide sequence of the nucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 3, 4, 7, and 8 as a probe.
  • Conditions for hybridization include conditions that allow hybridization under stringent conditions. Hybridization is carried out, for example, as described in Sambrook, Frisch EF, Maniatis T., Molecular Cloning 2nd edition, published by Cold Spring Harbor Laboratory press (Cold Spring Harbor Laboratory press), etc. This can be done according to the method. "Stringent conditions” refers to, for example, 45 ° C.
  • the salt concentration in the washing step ranges, for example, from about 50 ° C under 2 XSSC (low stringency condition) to about 50 ° C under 0.2 XSSC (high stringency condition). ) Can be selected from.
  • the temperature in the washing step can be selected, for example, from room temperature (low stringency conditions) to 65 ° C (high stringency conditions). It is also possible to change both salt concentration and temperature.
  • the signal is detected by an X-ray film (eg, Hyperfilm-MP; manufactured by Amersham Bioscience) or a bioimaging system (BAS-2000; manufactured by Fuji Film), and the recombinant containing a vector having a base sequence binding to the probe is detected. You can get your body.
  • an X-ray film eg, Hyperfilm-MP; manufactured by Amersham Bioscience
  • a bioimaging system BAS-2000; manufactured by Fuji Film
  • two primers may be selected from the nucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 3, 4, 7, and 8 so as to satisfy the following conditions.
  • the primer length is 15 to 40 bases, preferably 20 to 30 bases.
  • the ratio of guanine to cytosine in the primer is 40% to 60%, preferably 45% to 55%, more preferably 50% to 55%.
  • adenine, thymine, guanine, and cytosine should not be partially biased in the primer sequence. For example, regions where guanine and cytosine repeat are not appropriate.
  • the distance on the base sequence of the gene corresponding to the selected primer is preferably 100 to 3000 bases, more preferably 100 to 500 bases.
  • PCR conditions include, for example, adding each primer to the reaction solution to a concentration of 200 nM, converting the single-stranded cDNA synthesized above into type II, for example, LA Taq DNA polymerase (Takara Shuzo) Perform PCR using the reaction buffer attached to the enzyme.
  • PCR includes, for example, 94 ° C., 30 seconds, 55 ° C., 30 seconds, and 72 hours at 95 ° C. for 3 minutes. C.
  • cDNA synthesized as described above commercially available cDNAs derived from various animals, such as Clonetech's Quick Clone cDNA, may be used.
  • a part of the obtained reaction solution is analyzed by agarose gel electrophoresis, and the target band is directly or cut out from the gel, and then cloned into a pGEM-T Easy vector (promega) using a TA cloning system. .
  • the nucleotide sequence of the inserted DNA fragment can be determined and confirmed by the dye terminator method.
  • a vector that can be used in a host cell for transforming the thus-obtained polynucleotide having the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the splicing variant protein of the present invention (that is, the gene of the splicing variant protein of the present invention) can be introduced.
  • a vector that is capable of autonomous replication in a host cell can be isolated and purified from the host cell, and has a detectable marker can be incorporated into a vector having a detectable marker in accordance with ordinary genetic engineering techniques.
  • Vectors containing the inventive splicing variant protein gene can be constructed.
  • vector containing the splicing mutant protein gene of the present invention examples include plasmid pUC19 (Takara Shuzo) and pBluescript II (Stratagene) when Escherichia coli is used as a host cell. it can.
  • plasmid pACT2 manufactured by Clontech
  • pYES2 manufactured by Invitrogen
  • pRc / RSV When mammalian cells are used as host cells, pRc / RSV, pRc / CMV (Invitrodzin) And the like.
  • An upstream motor operable in a host cell is operably linked to the upstream of the splicing variant protein gene of the present invention, and is integrated into the above-described vector to transfer the splicing variant protein gene of the present invention to the host.
  • Vectors that can be expressed in cells can be constructed.
  • the term "functionally linked" means that the splicing variant protein gene of the present invention is expressed under the control of a promoter in a host cell into which the splicing variant protein gene of the present invention is introduced. This means that the promoter and the splicing variant protein gene of the present invention are linked.
  • the promoter used exhibits promoter activity in the host cell to be transformed.
  • the promoter of the rat-tomato operon of O. faecalis Promoters such as a tac promoter and a T7 promoter can be mentioned.
  • the host cell is an animal cell, examples thereof include a rous sarcoma virus (RSV) promoter, a cytomegalovirus (CMV) promoter, and a simian virus (SV40) promoter.
  • RSV rous sarcoma virus
  • CMV cytomegalovirus
  • SV40 simian virus
  • the host cell is a budding yeast, examples thereof include an alcohol dehydrogenase (ADH) l gene promoter and a galactose metabolizing enzyme (GAL) 1 gene promoter.
  • ADH alcohol dehydrogenase
  • GAL galactose metabolizing enzyme
  • the promoter of the vector When a vector that has a promoter that functions in the host cell is used in advance, the promoter of the vector is used so that the vector-containing promoter and the splicing variant protein gene of the present invention are operably linked.
  • the splicing variant protein gene of the present invention may be inserted downstream.
  • the aforementioned plasmids pRc / RSV, pRc / CMV, etc. have a cloning site downstream of a promoter operable in animal cells, and insert the splicing mutant protein gene of the present invention into the cloning site to obtain an animal.
  • the splicing variant protein gene of the present invention When introduced into a cell, the splicing variant protein gene of the present invention can be expressed.
  • the above-described budding yeast plasmid pACT2 has an ADH1 promoter. If the splicing mutant protein gene of the present invention is inserted downstream of the ADH1 promoter of the plasmid or a derivative thereof, the splicing mutant protein gene of the present invention can be obtained.
  • budding yeast such as CG1945 strain (Clontech)
  • the vector of the present invention that can be expressed in a large amount can be constructed.
  • the transformant of the present invention can be obtained by introducing the splicing mutant protein gene of the present invention, the vector of the present invention, or the like into a host cell. As a method for introducing the splicing mutant protein gene of the present invention, the vector of the present invention, etc.
  • an ordinary introducing method according to the host cell to be transformed can be applied.
  • the host cell is a microorganism, Escherichia coli, the salt-forming calcium method described in Molecular 'Cloning 3rd Edition (Sambrook and Russell, Cold' Spring 'Harbor' Laboratory, 2001), etc.
  • An ordinary method such as a deposition method can be used.
  • the cells can be introduced into the cells by a common gene transfer method such as the calcium phosphate method, the electroporation method or the lipofection method.
  • the splicing variant protein gene of the present invention may be expressed using yeast as a host cell.
  • budding yeast for example, Saccharomyces cerevisiae
  • yeast such as Pichia
  • Methods for transforming yeast include, for example, the method of Ito et al. (J. Bacteriol. 153; 163-168, 1983).
  • a transfer vector containing a nucleotide sequence homologous to the genome of the virus to be used can be used.
  • transfer vectors include plasmids such as pVL1392 and pVL1393 (manufactured by Invitrogen).
  • virus genome genomes of paculovirus, adenovirus and the like can be used.
  • virus genome genomes of paculovirus, adenovirus and the like can be used.
  • a virus is used as a vector, a general gene transfer method is used as described above.
  • Viral DNA can be introduced into a host cell by virtue of the ability to introduce the viral DNA into the host cell, or by infecting the recombinant virus directly into the host cell.
  • the splicing variant protein of the present invention can be prepared as a natural protein by a procedure such as extraction and purification from a naturally occurring organism, or it can be prepared as a thread recombinant protein using genetic engineering techniques. You can also.
  • a purified protein can be prepared by preparing a crude extract from human cells and tissues and using various columns.
  • the cells used herein are not particularly limited as long as they produce and express the splicing mutant protein of the present invention.
  • liver-derived cells, kidney-derived cells, and the like can be used.
  • those produced and expressed in an organism other than human can be prepared from the organism.
  • the splicing mutant protein gene of the present invention or the vector of the present invention is transformed into a suitable host cell as described above, and the transformant (ie, the transformant of the present invention) ) To produce the liver X receptor splicing variant protein.
  • the produced liver X receptor a splicing mutant protein is recovered according to a conventional method.
  • the recovered splicing variant protein of the present invention is purified by an appropriate method depending on the purpose.
  • the transformant of the present invention is a microorganism
  • the transformant may be any of various types of carbon and nitrogen sources, organic salts, inorganic salts, and the like appropriately used for ordinary culture in a general microorganism. It is cultured using a medium.
  • the culture is performed according to the usual method for general microorganisms, and solid culture and liquid culture (test tube shaking culture, reciprocal shaking culture, Jar Fermenter culture, tank culture, etc.) are possible. .
  • the culture temperature can be appropriately changed within a range in which the microorganism grows.
  • culture is generally performed in a culture temperature of about 15 ° C to about 40 ° C and a medium having a pH of about 6 to about 8.
  • the culturing time varies depending on the culturing conditions, but is usually about 1 hour to about 24 hours.
  • the induction time is preferably within one day, usually several hours.
  • the transformant is an animal cell such as a mammal or an insect
  • the transformant can be cultured using a medium used for ordinary culture of general cultured cells.
  • a liquid medium (Invitrogen) supplemented with fetal bovine serum (FBS) to a final concentration of about 5% (v / v) to about 10% (v / v) is used. Culturing at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 . After the cells have grown to confluence, for example, add 0.25% (v / v) trypsin / PBS solution to disperse the cells, dilute them several times, inoculate them into new dishes, and culture them. to continue. Similarly for insect cells, for example, 10 ° /. (v / v) Culture may be performed at a culture temperature of about 25 ° C. to about 30 ° C.
  • a Grace medium containing FBS or a serum-free medium such as SF-900 manufactured by Invitrogen.
  • SF-900 serum-free medium
  • Recovery of the splicing variant protein of the present invention produced by the transformant of the present invention may be carried out by appropriately combining ordinary isolation and purification methods.
  • the cells of the transformant are centrifuged.
  • the cells are collected by separation or the like, and the collected cells are suspended in a normal buffer, for example, PBS containing an appropriate protease inhibitor.
  • a normal buffer for example, PBS containing an appropriate protease inhibitor.
  • the objective fraction containing the splicing mutant protein of the present invention can be obtained.
  • the spliced mutant protein of the present invention which is a more purified object, can be recovered.
  • the polypeptide of the present invention can be recovered by the same method as described above, instead of the splicing mutant protein of the present invention.
  • the splicing variant protein of the present invention thus produced is used, for example, for ligand / receptor binding assay for evaluating the binding ability and the amount of the test substance to the splicing variant protein of the present invention. be able to.
  • One Jung method comprises the steps that measure the change in the process and the liver X receptor ⁇ splicing mutant protein contacting a test substance in the liver X receptor ⁇ splicing mutant protein.
  • any liver X-receptor splicing variant protein may be used.
  • the splicing variant protein of the present invention can be mentioned as a particularly suitable one.
  • the concentration of the test substance to be brought into contact with the liver X receptor splicing mutant protein may be generally about 0.1 ⁇ to about 10 ⁇ ⁇ , and 1 ⁇ M to 10 ⁇ ⁇ . ⁇ is preferred.
  • the time of contact with a test substance such as the liver X receptor splicing mutant protein is usually about 18 hours to about 60 hours, and preferably about 24 hours to about 40 hours.
  • the ligand-receptor binding assay using the splicing variant protein of the present invention is a test method capable of measuring the binding ability of a chemical substance to the protein and quantifying the binding amount, and analyzing binding specificity and binding strength. is there. For example, in the state where the labeled ligand is bound to the splicing variant protein of the present invention recovered from the transformant of the present invention as described above, if the test substance is allowed to coexist with the ligand, the test substance and From competition with the labeled ligand, the labeled ligand is released from the splicing mutant protein of the present invention and binds to the splicing mutant protein of the present invention, depending on the affinity of both for the liver X receptor splicing mutant protein.
  • the amount of the labeled ligand thus reduced, and thus the amount of the label bound to the splicing variant protein of the present invention is reduced. Therefore, by monitoring the amount of the free labeled ligand or the amount of the bound labeled ligand, the ability of the test substance to bind to the splicing variant protein of the present invention can be indirectly determined.
  • the labeled ligand for example, tritium-labeled oxycholesterol and the like can be used.
  • the reaction system is roughly divided into three groups. In one system, only the solvent was added where the labeled ligand was bound to the splicing variant protein of the invention. This corresponds to a system in which the concentration of the test substance is zero, and the labeling amount of the bound ligand obtained from this system indicates the total binding amount of the labeled ligand to the splicing variant protein of the present invention. .
  • a labeling ligand is bound to the splicing variant protein of the present invention
  • unlabeled oxycholesterol sufficiently saturates the splicing variant protein of the present invention and the labeled ligand
  • a concentration eg, 10 ⁇
  • the amount of the labeled labeled ligand obtained from this system is non-specific for the spliced variant protein of the present invention. It is determined as the amount of binding. Therefore, the specific binding amount of the labeled ligand to the splicing variant protein of the present invention is a value obtained by subtracting the latter non-specific binding amount from the former total binding amount.
  • the test substance is added to the site where the labeled ligand is bound to the splicing mutant protein of the present invention, for example, at a final concentration of ⁇ .
  • the amount of the labeled labeled ligand obtained from this system is zero when the concentration of the test substance determined as described above is zero. In this case, the amount becomes smaller than the specific binding amount of the labeled ligand to the splicing variant protein of the present invention.
  • the ability of the test substance to bind to the splicing variant protein of the present invention can be examined. If the test substance contains a plurality of substances, the It is also possible to examine whether there is a substance exhibiting affinity for the inventive splicing mutant protein.
  • the concentration of the test substance in the third system is changed and the assay is performed in the same manner to perform the binding-type labeling.
  • the amount of the labeled ligand is measured.
  • the evaluation of whether the liver X receptor splicing mutant protein activates the transcription of a gene under the control of a transcription regulatory region containing the binding sequence of liver X receptor ⁇ was performed.
  • a reporter gene linked downstream of a transcription control region containing a liver X receptor binding sequence can be used for evaluation by a test method such as the reporter assay described below.
  • Liver X receptor ⁇ forms a heterodimer with retinoid X receptor (RXR), which is one of the nuclear receptors, and binds to a transcription control region containing a binding sequence of liver X receptor to form the transcription. Regulates the transcription of genes under the control of control regions.
  • the binding sequence of the monthly X-receptor ⁇ includes the specific sequence of the transcriptional regulatory region containing the core motif having a structure in which two “AGGTCA” (or related 6-nucleotide motif) are arranged in the same direction (cis sequence). ) Can be given.
  • the spacer between the core motifs varies depending on the combination of heterodimers, and is 4 bp (DR4) in the case of the heterodimer between liver X receptor and retinoid receptor (eg, Lehman et al. , J. Biol. Chem., 272; 3137-3140, 1997.).
  • the liver X receptor ⁇ -splicing variant protein, its gene or a partial region thereof according to the present invention relates to the relationship between the liver X receptor ⁇ -splicing variant protein and a pathological condition whose function is directly or indirectly involved. It is extremely useful for elucidating the disease and developing methods and drugs useful for the prevention, diagnosis, and treatment of these pathological symptoms.
  • an effective amount of a substance selected by the screening method of the present invention or a drug containing an antagonist to the substance as an active ingredient can be orally or parenterally administered to mammals such as humans.
  • the drug when administered orally, can be used in usual forms such as tablets, capsules, syrups, suspensions and the like.
  • parenteral administration the drug can be used in the form of ordinary liquid preparations such as solutions, emulsions and suspensions.
  • Examples of the method of parenterally administering the above-mentioned drug-containing fat accumulation regulator in the form described above include an injection method, a method of administering rectally in the form of a suppository, and the like.
  • the above-mentioned appropriate dosage form can be prepared by mixing a substance selected by the screening method of the present invention or an antagonist to the substance with an acceptable ordinary carrier, excipient, binder, stabilizer, diluent, or the like. Can be manufactured.
  • an acceptable buffer, solubilizing agent, isotonic agent and the like can be added.
  • the dosage varies depending on the age, sex, body weight, degree of disease, the type of the drug, the dosage form, etc. of the mammal to be administered.
  • 1 mg to about 2 g, preferably about 5 mg to about 1 g of the active ingredient may be administered, and for injection, an adult may receive about 0.1 mg to about 500 mg of the active ingredient.
  • the above-mentioned daily dose can be administered once or in several divided doses.
  • the present relevance to the pathological condition directly or indirectly involving the splicing variant protein is as follows: first, identify the ligand, and then identify the genes that are transcriptionally regulated by the ligand and the splicing variant protein of the present invention. This can be clarified.
  • the ligand is identified by bringing a test substance into contact with the splicing variant protein of the present invention or the polypeptide of the present invention, thereby changing the expression level of a gene group that is transcriptionally regulated by the splicing variant protein of the present invention or the polypeptide of the present invention. Can be performed by detecting
  • the method of screening for a substance that acts on the liver X receptor Q; splicing variant protein includes the step of contacting the test substance with a cell that produces the liver X receptor ⁇ splicing variant protein; Measuring a production amount of another protein whose expression is regulated by the splicing variant protein, and evaluating an action of the test substance on the liver X receptor ⁇ splicing variant protein based on the production amount. Method may be used.
  • a cell that produces a liver X receptor splicing variant protein is any cell that produces a liver X receptor splicing variant protein.
  • cells producing the splicing variant protein of the present invention can be mentioned as particularly suitable.
  • the concentration of the test substance to be brought into contact with the cells that produce the liver X receptor ⁇ -splicing variant protein is usually about 0.1 to about 10 / ⁇ , preferably 1 to 10 ⁇ .
  • Liver X receptor 0; Splicing variant The time for contacting the cell producing the protein with the test substance is usually about 18 to 60 hours, preferably about 24 to 40 hours. .
  • the above-mentioned monthly X receptor splicing variant protein is added to a cell that produces the liver X receptor ⁇ splicing variant protein.
  • the first step of measuring the amount of production of other proteins whose expression is regulated by the liver X receptor ⁇ -splicing variant protein, the cells producing the splicing variant protein of the present invention The liver X receptor ⁇ splicing mutant protein is brought into contact with both the ligand and the test substance, and the amount of production of another protein whose expression is regulated by the liver X receptor splicing mutant protein is measured.
  • the liver X receptor splicing mutant protein may be any liver X receptor a splicing mutant protein, and for example, the splicing mutant protein of the present invention can be mentioned as a particularly suitable one.
  • the concentration of the ligand or the test substance to be brought into contact with the cells that produce the liver X receptor splicing mutant protein is usually about 0.1 ⁇ to about 10 ⁇ , and 1 ⁇ to 10 ⁇ . ⁇ is preferred.
  • the time for contacting the cells producing the monthly X-receptor ⁇ -splicing variant protein with the ligand or the test substance is usually about 18 to 60 hours, preferably about 24 to 40 hours. No.
  • the splicing mutant protein of the present invention or a fragment thereof can be used.
  • the splicing variant protein of the present invention and the liver X receptor ⁇ splicing variant There is also a method of constructing an expression system for the target gene to which the protein binds, and detecting an increase in the target gene product protein due to the addition of the ligand.
  • a reporter gene that expresses a reporter protein under the control of the target gene promoter such as luciferase, chloramue-coal acetyl transferase, galactosidase, etc.
  • the target gene can be expressed in the host cell.
  • a chimeric gene of the ligand binding region of the protein and a DNA binding protein is expressed, and the presence or absence of the gene can be detected as a reporter gene.
  • a plasmid in which a gene encoding the above-described reporter protein and a minimally active promoter are linked downstream of the base sequence to which the DNA-binding protein binds can be used. , LexA, etc. can be used.
  • An expression system for the splicing mutant protein and the target gene to which the liver X receptor ⁇ -splicing mutant protein binds, and a plasmid for expressing a chimeric gene between the ligand-binding region of the protein and the DNA-binding protein, are commonly used. It can be prepared by genetic recombination techniques.
  • a gene whose expression is controlled by the splicing mutant protein of the present invention can be obtained. It can also be specified.
  • the association with the pathological condition directly or indirectly involving the splicing variant protein of the present invention is based on the expression of the target gene when the cell expressing the splicing variant protein of the present invention is contacted with an antagonist or agonist.
  • the elucidation can be made by specifying the gene to be activated.
  • the method for detecting the presence or absence of the splicing variant protein of the present invention includes the first step of synthesizing complementary DNA (cDNA) from messenger RNA (mRNA) in a biological sample, the splicing variant protein gene of the present invention or the polymorphism of the present invention. ⁇ For peptide genes, etc. A method comprising a second step of amplifying the corresponding partial region of the complementary DNA (cDNA) and a third step of detecting the amplified partial region.
  • Specific examples of the splicing variant protein gene of the present invention or the polypeptide gene of the present invention include a polynucleotide having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3, 4, 7, or 8.
  • the polynucleotide is selected from the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, or SEQ ID NO: 14.
  • a step in which amplification is performed by a PCR method using one or a plurality of primers can also be preferably used.
  • the splicing mutant of the present invention relates to experimental animals such as gene-deficient animals and the like, which are deficient in expressing a polynucleotide having a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence of the splicing mutant of the present invention.
  • a model obtained by disrupting (inactivating) a gene having a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence of an endogenous splicing mutant derived from an experimental animal having a function of a gene having a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence of a protein By preparing an animal and analyzing the physical, biological, pathological and genetic characteristics of this model animal, it is possible to elucidate the relationship between the function of the splicing variant protein of the present invention and disease. It becomes possible.
  • the human-derived gene of the present invention into a model animal in which a gene having a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the endogenous liver X receptor splicing mutant protein described above has been disrupted (inactivated).
  • a drug compound, etc.
  • the present invention further provides a salt of the polypeptide gene of the present invention for gene therapy.
  • the present invention also provides use of a specific DNA probe for a base sequence and use of a specific RNA probe for a base sequence of the polypeptide gene of the present invention for gene therapy.
  • a normal type consisting of all or a part of a gene (DNA or RNA) having a base sequence (or a base sequence complementary to the base sequence) encoding the amino acid sequence of the splicing variant protein of the present invention.
  • the present invention also provides a diagnostic probe for a disease associated with the inhibition of normal cholesterol metabolism by "liver X receptor" and a diagnostic agent for a disease associated with the disorder, which comprises the probe.
  • liver X receptor a diagnostic agent for a disease associated with the disorder
  • the diagnostic probe is all or part of the antisense strand of the splicing variant protein gene (DNA, RNA, cDNA) of the present invention, and has a length (at least 2 It is not particularly limited as long as it has (0 base or more).
  • a suitable buffer or a sterile water in order to use the probe as an active ingredient of the diagnostic agent, it is preferable to dissolve the probe in a suitable buffer or a sterile water so that the probe is not decomposed.
  • the in situ hybridization method include the method described in J. Neurobiol. 29, 1-17 (1996). It is also possible to use the in situ PCR method.
  • a probe In the diagnosis, not only a probe but also an antibody (see below) that specifically recognizes the splicing mutant protein of the present invention can be used.
  • normal liver X receptor is detected by immunostaining. It is possible to detect the presence and progress of diseases related to the inhibition of normal cholesterol metabolism by body ⁇ (Dev. Biol. 170, 207-222 (1995); J. Neurobiol. 29, 1-17 (1996). ))).
  • the antibody to be used can be prepared by a usual method described in, for example, Antibodies si Laboratory Manual, Lane, HD et al., Published by Cold Spring Harber Looratory Press, New York 1989.
  • the splicing variant protein gene of the present invention or the polypeptide gene of the present invention itself is useful for use in gene therapy as an antisense drug that controls the function of the splicing variant protein of the present invention at the gene level.
  • an array A base sequence of 20 or more bases contained in No. 7 or 8, preferably a base sequence of about 30 bases can be used.
  • the aforementioned antisense drugs include not only DNA but also RNA.
  • the base sequence may be a sense sequence or an antisense sequence (ie, a base sequence having complementarity with the sense sequence).
  • the “polypeptide of the present invention” and the “polypeptide of the present invention” are, as described above, a partial region (partial polypeptide) of the splicing variant protein of the present invention or a corresponding gene of the splicing variant protein gene of the present invention.
  • a partial region (partial polynucleotide) which means a polypeptide consisting of a region that does not exist in the normal liver X receptor or a polynucleotide corresponding thereto. Preferably, it contains at least 6 consecutive amino acids or at least 18 consecutive bases.
  • a typical example is the amino acid sequence of the liver X receptor ⁇ isoform (splicing variant protein 5 ⁇ of the present invention) containing intron 5 of the liver X receptor gene as an exon.
  • a polypeptide comprising a region not present in X receptor ⁇ or a polynucleotide corresponding thereto; a liver X receptor ⁇ comprising a part of intron 6 of liver X receptor ⁇ gene as exon
  • the amino acid sequence of the isoform of the present invention the splicing variant protein of the present invention, 6 ⁇
  • a polynucleotide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 or a polynucleotide having a base sequence corresponding thereto for example, a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7
  • a polynucleotide represented by SEQ ID NO: 6 and a polynucleotide represented by SEQ ID NO: 6
  • a polynucleotide having a base sequence corresponding thereto for example, a base sequence represented by SEQ ID NO: 8.
  • the polynucleotide having the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the above-described polypeptide or the recombinant vector containing the above-described polynucleotide may be prepared according to the above-described vector preparation method of the present invention. Furthermore, the set thus prepared A transformant can also be prepared by introducing the recombinant vector into a host cell according to the above-described method for preparing a transformant of the present invention.
  • the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 or 8 is used as a probe or primer to further splice variant liver X receptor other than the splicing variant protein of the present invention. It can be used as a search tool for foreign proteins. It is desirable that the length be a base sequence containing at least 15 consecutive bases. Probes can be labeled by conventional methods, for example, with radioisotopes, digoxigenin, biotin, detectable enzymes, and the like.
  • the probe thus labeled is hybridized with a cDNA library and cloned. Hybridization can be performed by a commonly used method and conditions. For example, 1 ⁇ SSC, 0.5 (w / v) SDS, washing at 65 ° C.
  • the cDNA library may be derived from animals including mammals, but is particularly preferably derived from human itotsuoi 'cells. An antibody or a part of an antibody that specifically recognizes the splicing variant protein of the present invention can be prepared.
  • Antibodies that specifically recognize the splicing variant protein of the present invention having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 2, 5, or 6 include, for example, the splicing variant of the present invention obtained by the above-described conventional method of genetic recombination. Using a body protein or a partial region thereof (polypeptide) or a peptide fragment having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 or 6, it is usually used for producing an antibody such as a heron, a guinea pig, a rat, a mouse, a goat or a sheep. It can be obtained by immunizing animals.
  • a monoclonal antibody can be obtained by fusing spleen cells of an immunized mammal with myeoma cells.
  • Methods for detecting the presence or absence of the splicing variant protein of the present invention using these antibodies include, for example, an antibody capable of specifically detecting the splicing variant protein of the present invention or the polypeptide of the present invention.
  • a method comprising the step of detecting the liver X receptor splicing variant protein based on the antigen-antibody reaction used can be mentioned.
  • a first step of binding a splicing variant protein of the present invention or a first antibody capable of specifically detecting the polypeptide of the present invention to a microtiter well The second step of binding the splicing variant protein of the present invention to the first antibody on the microtiter well, after the second step, all unbound states in the microtiter well (ie, free)
  • Example 1 (Cloning of Monthly Collection X Receptor ⁇ Splicing Mutant Protein Gene)
  • a region corresponding to exon 4 to exon 8 of the human liver X receptor ⁇ gene can be programmed using a programmable thermal cycler. Amplification was performed by the PCR method. The primer was based on the nucleotide sequence of the human liver X receptor a gene (Willy et al., Genes Dev.
  • a primer having the nucleotide sequence of the sense strand (SEQ ID NO: 9, LXR aF) and a primer having the nucleotide sequence of the antisense strand of exon 8 (SEQ ID NO: 10, LXR aR) were designed and chemically synthesized.
  • the reaction conditions for the PCR method were as follows. 1.
  • Plasmid DNA was extracted and isolated from the grown Escherichia coli according to a conventional method. After the isolated plasmid DNA was cleaved with the restriction enzyme EcoRI, it was subjected to 1% agarose gel electrophoresis. After electrophoresis, the size of the inserted DNA fragment was confirmed under ultraviolet irradiation. Furthermore, the nucleotide sequence of the inserted DNA fragment was determined. Thus, the liver X receptor ⁇ -splicing mutant protein gene was cloned.
  • Example 2 (Identification of Pand of Liver X Receptor ⁇ : Presence of Alternative Splicing Transcript) Specific to liver X receptor C consisting of any of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOS: 9 and 10 DNA fragments were amplified using the primers (1 ⁇ 0 ⁇ and 1 ⁇ 3 ⁇ 40; 1) and cDNA derived from human normal tissue or human cancer tissue as type III. The results are shown in Fig. 2. Pand consisting of 506 base pairs shown in the figure shows a known normal liver X receptor ⁇ gene. It corresponded to the amplification band derived from it.
  • Example 3 (Cloning of liver X receptor splicing variant protein gene)
  • the PCR product related to liver X receptor ⁇ was cloned and its nucleotide sequence was determined.
  • the primers for PCR for amplification and cloning the sense primer (LXR aF, SEQ ID NO: 9) and the antisense primer (LXR aR, SEQ ID NO: 10) used in Example 1 were used.
  • PCR was performed using cDNAs derived from human normal tissues and human cancer tissues as type I, and the resulting PCR products were directly ligated to pGEM-T Easy vector (manufactured by Puguchi Mega) by the TA cloning method. As in Example 1, the size of the inserted DNA fragment was confirmed, and then the base sequence of the inserted DNA fragment was determined.
  • liver X receptor ⁇ -splicing mutant protein identification As a result, in addition to the DNA encoding the splicing variant protein D5, a new gene was added to the liver X receptor 0, in which the amino acid sequence encoded by exon 5 was deleted from the monthly X receptor derived from human normal tissue.
  • Two novel liver X receptor ⁇ -splicing mutant proteins (encoded in the liver X receptor ⁇ -splicing mutant protein with an inserted amino acid sequence in intron 5 and in a partial region in intron 6) The presence of DNA encoding the amino acid sequence-inserted liver X receptor ⁇ - splicing variant protein was clearly shown in Example 4.
  • Example 4 (The amino acid sequence encoded by intron 5 was inserted.) Liver X receptor ⁇ splicing mutant protein identification)
  • HLXR (0RF) _F / H SEQ ID NO: 11
  • hLXR a (0RF) —R / B sequence as an antisense primer
  • the DNA fragment was amplified by PCR using No. 12) and a human liver-derived cDNA (Clontech) as type III.
  • the reaction conditions for the PCR method were as follows.
  • This reaction solution was heat-denatured at 96 ° C for 3 minutes, and then subjected to 35 cycles of reaction at 96 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 90 seconds.
  • a part of the obtained PCR products were electrophoresed on 1% Agarosugeru containing odor Chemical Chijiumu, after confirming the amplified DNA fragments, PCR products 1 At 1 to P GEM_T Easy vector (Promega) Ligation was performed using a TA crawling system. Ligation was performed according to the method recommended by the kit used. Using the obtained ligation reaction mixture, E. coli JM109 strain was transformed according to the method recommended by the manufacturer (competent cell, Takara Shuzo).
  • the obtained cells were spread on an LB agar medium containing ampicillin coated with X_gal and disopropyl ⁇ -D-galatatopyranoside (IPTG), and this was cultured at 37 ° C.
  • colony PCR is performed using a transformant that has formed an ampicillin-resistant white colony on the agar medium to obtain a translation region encoding a liver X receptor ⁇ -splicing mutant protein into which intron 5 has been inserted. Whole clones were detected.
  • the reaction conditions for the colony PCR were as follows.
  • LXR-F (SEQ ID NO: 9) was used as a sense primer, and a specific primer LXR a5 ⁇ —R (SEQ ID NO: 13) designed based on the nucleotide sequence in intron 5 was used as an antisense primer.
  • a reaction solution containing a mixture of these two primers, Ex Taq DNA Polymerase (Takara Shuzo), and 200 nM deoxyribonucleotide was prepared. After suspending a small amount of the above-mentioned white transformant collected from the plate, the reaction solution is heat-denatured at 95 ° C for 5 minutes, and then denatured at 94 ° C for 30 seconds.
  • the reaction was performed for 25 cycles at 30 ° C for 30 seconds and at 74 ° C for 30 seconds as one cycle.
  • the obtained PCR product was subjected to electrophoresis on an agarose gel containing bromide medium, and after confirming the amplification of the DNA fragment, a plasmid was extracted from the transformant in which the amplification of the DNA fragment was confirmed.
  • the base sequence of the DNA fragment inserted into the plasmid
  • a clone containing the entire translation region containing the liver X receptor splicing mutant protein into which intron 5 was inserted was obtained.
  • liver X receptor “splicing variant protein” has the amino acid sequence encoded by intron 5 inserted into the normal liver X receptor, and is named liver X receptor splicing variant protein 5A.
  • Figure 1 shows a comparison between the translation region encoding human normal liver X receptor and the translation region encoding liver X receptor ⁇ -splicing variant protein 5 ⁇ .
  • the only difference in the translation region encoding liver X receptor a splice variant protein 5 ⁇ compared to the translation region encoding body a is that intron 5 is included in the translation region. No differences were found in the sequence Even when intron 5 was inserted as a new translation region between exons 5 and 6, 192 bases (SEQ ID NO: 7) were inserted.
  • Liver X receptor splicing mutant protein 5 ⁇ The amino acid sequence derived from the translation region to be converted is a protein consisting of 511 amino acids (1533 bases) out of the amino acid sequence of the liver X receptor ⁇ splicing mutant protein, the amino acid sequence encoded by intron 5 (SEQ ID NO: When the homology of 5) was searched using the genome database and the protein database, it was found that no amino acid sequence having more than 30% homology exists in the database.
  • Amino acid sequence (SEQ ID NO: 5) encoded by intron 5 of ⁇ -splicing variant protein
  • Example 5 Identification of a translation region encoding a liver X receptor ⁇ -splicing mutant protein containing a novel nucleotide sequence (109 bases) added downstream of exon 6)
  • liver X receptor ⁇ -splicing mutant protein into which a partial region in intron 6 has been inserted, as in Example 4, hLXR o; 0RF)-F / H (SEQ ID NO: 11) and hLXRo; (0RF)-RZB (SEQ ID NO: 12) as antisense primers, and human liver-derived cDNA (Clontech) for type I
  • the DNA fragment was amplified by the PCR method.
  • the reaction conditions for the PCR method were as follows.
  • LA Taq DNA Polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.), 200 sense primer nmol, 5 0 ⁇ 1 of a reaction solution containing 200 nmol of single-stranded cDNA is an antisense primer and ⁇ (Clontech liver-derived cDNA) ( MgCl 2 and a mixture of hydroxyribonucleotides) were prepared.
  • This reaction solution was heat-denatured at 96 ° C for 3 minutes, and then subjected to 35 cycles of reaction at 96 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 3 seconds and 72 ° C for 90 seconds as one cycle.
  • a portion of the obtained PCR product is electrophoresed on an agarose gel containing bromide thidium, and after confirming the amplification of the DNA fragment, the PCR product is transferred to pGEM-T Easy vector (Promega) using a TA cloning system. Ligation was performed using Ligation was performed according to the method recommended by the kit used. The resulting ligation reaction solution was used to transform Escherichia coli JM109 strain according to the method recommended by the manufacturer of a competent cell (Takara Shuzo) 1. The obtained cells were plated on LB agar medium containing ampicillin coated with X-gal and isopeptyl ⁇ -D-galactobilanoside (IPTG), and cultured at 37 ° C overnight.
  • IPTG isopeptyl ⁇ -D-galactobilanoside
  • a 30 ⁇ l reaction mixture containing these two primers, Ex Taq DNA Polymerase (Takara Shuzo), and a 200 nM mixture of deoxyribonucleotides was prepared. After suspending a small amount of the above-mentioned white transformant collected from the plate, heat denaturation of the reaction solution at 95 ° C for 5 minutes, and then heat denaturation at 94 ° C for 30 seconds and 55 ° C The reaction was performed for 25 cycles, with one cycle of 30 seconds at C and 30 seconds at 74 ° C.
  • the obtained PCR product was electrophoresed on an agarose gel containing bromide medium, and after confirming the amplification of the DNA fragment, a plasmid was extracted from the transformant in which the amplification of the DNA fragment was confirmed.
  • a clone containing the entire translation region containing the liver X receptor splicing mutant protein into which a partial region in intron 6 was inserted was obtained.
  • FIG. 1 shows a comparison between the translated region encoding human normal liver X receptor ⁇ and the translated region encoding liver X receptor a splice variant protein 6 ⁇ .
  • liver X receptor ⁇ -splicing mutant proteins found by the present invention are present in RNAs derived from human normal tissues and human cancer tissues.
  • a primer consisting of any one of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 9, 10, 13, and 14 to specifically amplify each liver S-storage X receptor ⁇ -splicing mutant protein PCR was performed using cDNAs derived from tissues and human cancer tissues for type III.
  • LXR aF SEQ ID NO: 9
  • LXR CKR SEQ ID NO: 10
  • a primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 and a primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13, which specifically amplifies the monthly receptor X receptor splicing variant protein 5A were used as described above.
  • liver X receptor ⁇ splicing mutant protein 5 ⁇ resulted in amplification of a DNA fragment with 432 base pairs, and liver X receptor a splicing mutant protein.
  • PCR was performed in the same manner as described above using a primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9 and a primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 14 to specifically amplify 6A, the liver X receptor a splicing mutation
  • Amplification of a DNA fragment derived from body protein 6A results in amplification of a DNA fragment having 428 base pairs.
  • PCR was performed for the absence of type III DNA to check for DNA contamination in the reagent. The results are shown in FIGS. 2, 3 and 4.
  • Liver X receptor splicing mutant protein 5A was expressed in some human cancer tissues.
  • Liver X receptor a splicing mutant protein 6A was highly expressed in human circulatory tissues.
  • Liver X receptor "splicing variant protein D5 was expressed at high levels in human cancer tissues.
  • Example 7 Construction of vector expressing liver X receptor a splicing mutant protein
  • Normal liver X receptor a and three kinds of liver X receptor a splicing mutant proteins were cut with restriction enzymes Hind and BamHI according to the method recommended by the manufacturer.
  • the solution treated with the enzyme was subjected to agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment corresponding to the insert DNA was recovered from the gel.
  • the recovered DNA fragment was cloned into pFLAG-CMV2 (Sigma) which had been cut with Hind III and BamHI in advance.
  • T4 ligase was added thereto, and the mixture was added to Ligation was performed at 30 ° C for 30 minutes. Ligation was performed according to the method recommended by the kit used. The resulting ligation reaction mixture was used to transform E. coli JM109 strain according to the method recommended by the manufacturer of the competent cell (Takara Shuzo). The obtained cells were spread on an LB agar medium containing ampicillin coated with X-gal and disopropyl-D-galatatoviranoside (IPTG), and cultured at 37 ° C overnight.
  • IPTG X-gal and disopropyl-D-galatatoviranoside
  • plasmid DNA was prepared from ampicillin-resistant white colonies formed on the agar medium. Furthermore, the nucleotide sequence of the inserted DNA fragment was determined. The obtained nucleotide sequence is compared with the nucleotide sequence obtained by the direct sequence described above, and a plasmid having a confirmed that the nucleotide sequence of the translation region is completely identical is selected. They were named PCMV2-hLXR a WT, pCMV2-hLXR a 5A, pCMV2-hLXR a 6A, and pCMV2-hLXR a D5.
  • Example 8 Preparation of Plasmid Containing Luciferase Reporter Gene Having Liver X Receptor a Binding Sequence
  • Two oligonucleotides consisting of a base sequence derived from the leader sequence and a base sequence in the vicinity of the TATA box of the mouse metamouth zionine I gene i.e., an oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 15 and a base sequence consisting of SEQ ID NO: 16
  • An oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence shown was annealed to form a double-stranded DNA, which was reacted with T4 polynucleotide kinase, and both ends were phosphorylated (hereinafter, the DNA was referred to as TA TA DNA Described).
  • plasmid pGL3-Basic vector (promega) containing the firefly luciferase gene was digested with restriction enzymes Bgl II and Hind III, and then bacterial-derived alkaline phosphatase (BAP) was added thereto. Incubated for hours. Then, The hot solution was subjected to electrophoresis using low-melting point agarose (Agarose L; manufactured by Futatsu Gene), and then a DNA fragment was recovered from the gel of the detected band. About 100 ng of the recovered DNA fragment and about 1 g of the above-mentioned TATA DNA were mixed and ligated with T4 ligase to prepare a plasmid pGL3-TATA.
  • BAP bacterial-derived alkaline phosphatase
  • Oligonucleotides comprising the base sequence (SEQ ID NO: 17) upstream of the cholesterol 7 ⁇ -hydroxylase (CYP7A1) gene of the cytochrome P450 family containing the liver X receptor binding sequence (LXRE) and the base sequence Oligonucleotides consisting of complementary nucleotide sequences (SEQ ID NO: 18) are synthesized, annealed to form double-stranded DNA (hereinafter referred to as LXRE DNA), and then subjected to T4 ligase. This allowed LXRE DNA to bind in tandem. The resulting DNA fragment was reacted with T4 polynucleotide kinase to phosphorylate both ends, thereby obtaining a phosphorylated tandem-binding DNA fragment.
  • LXRE DNA double-stranded DNA
  • pGL3-TATA was digested with a restriction enzyme MluI, and alkaline phosphatase derived from Escherichia coli was added, followed by incubation at 65 ° C for 1 hour. After subjecting the incubating solution to low-melting point agarose gel electrophoresis, DNA fragments were recovered from the gel in the detected band. And D NA of recovered about 100 ng, was mixed with about 1 mu ⁇ of the phosphorylated tandem linked DNA fragments, to ⁇ Ka ⁇ T4 ligase to this, 30 the mixture at 16 ° C Minutes of ligation. Ligation was performed according to the method recommended by the kit used. The resulting ligation reaction mixture was used to transform E.
  • coli DH5 competent cells (Takara Shuzo) according to the method recommended by the manufacturer.
  • the obtained cells are plated on LB agar medium containing ampicillin coated with X-gal and isopeptyl pill ⁇ -D-galatatopyranoside (IPTG), and cultured at 37 ° C overnight. did.
  • IPTG isopeptyl pill ⁇ -D-galatatopyranoside
  • plasmid DNA was prepared from the ampicillin metamura white colony formed on the agar medium. Further, the nucleotide sequence of the inserted DNA fragment was determined.
  • plasmid pGL3-TATA-LXREx plasmid pGL3-TATA-LXREx4.
  • a human fetal kidney-derived HEK293 cell line (ATCC; CRL-1573) was prepared by using 10% fetal bovine serum (FBS) from which low molecular weight substances had been removed using charcoal dextran, penicillin (100 units / ml) and streptomycin as antibiotics. (100 ⁇ g / ml) in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) without phenol red at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 .
  • the subcultured HEK293 cell line was rolled up to about 2 ⁇ 10 6 cells in a 10 cm cell culture dish.
  • the present invention provides a novel liver X receptor ⁇ splice variant, a liver X receptor ⁇ splicing mutant protein, which is involved in the inhibition of normal cholesterol metabolism by normal liver X receptor, its gene, and the like. Can be provided. Sequence listing free text
  • Oligonucleotides designed to synthesize liver X receptor binding element Oligonucleotides designed to synthesize liver X receptor binding element

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Abstract

本発明は、肝臓Ｘ受容体αのアイソフォームであって、肝臓Ｘ受容体α遺伝子のエクソン５にコードされるアミノ酸配列を少なくとも有する、肝臓Ｘ受容体αスプライシング変異体タンパク質、その遺伝子及びそれらの利用等を提供しており、これらは、正常型肝臓Ｘ受容体αによる正常なコレステロール代謝の阻害に関与する疾患や異常の予防、診断、治療等に有用な方法や薬剤の開発に利用することができる。

Description

明細書
肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパク質、 その遺伝子及びそれらの利用 技術分野
本発明は、肝臓 X受容体 aのアイソフォームである肝臓 X受容体ひ
変異体タンパク質、 その遺伝子及びそれらの利用に関する。 背景技術
コレステロールは、生体内における重要な脂質であり、様々な脂質の構成成分でも ある。 コレステロールは、 摂食により腸管から吸収される力、 又は肝臓においてァセ チル- CoAから生合成される。 生合成されたコレステロールは肝臓から排出された後、 小腸において再吸収きれ、 血液を介して肝臓に輸送され、 再利用される。 また、 肝臓 においては、 コレステロールの一部は、 胆汁酸へと代謝される。 生体内におけるコレ ステロールレベルが何らかの異常により上昇すると、高コレステロール血症に由来す る高脂血症ゃァテローム性動脈硬化症の発症原因となる。 これらの高コレステロール に由来する疾患の発症メカニズムについては十分に解明されていなレ、。 現在、 高コレ ステロール血症に由来する疾患の治療薬としては、 コレステロール合成阻害剤 （スタ チン系製剤） ゃフイブラート系薬剤が用いられている。 し力 し、 これらの薬剤による 治療は、 場合によつては必ずしも充分に満足できるものではない。
コレステロールの再吸収や胆汁酸への変換（コレステロール代謝） はそれぞれの特 定のトランスポーター又は酵素により行われている。 さらにこれらのタンパク質をコ ードする遺伝子群の発現調節には核内レセプターの 1つである肝臓 X受容体が関与し ていることが知られている。
肝臓 X受容体には、 これまでに 2種類のサブタイプ （肝臓 X受容体 、 肝臓 X受容 体 ） が存在することが報告されている （例えば、 Peet et al. 、 Curr. Op in. Genet. Dev. 8； 571-575、 1998参照。 ） 。 肝臓 X受容体ひは、 核内レセプターの 1つである レチノイド X受容体 （RXR) とへテロダイマーを形成し、 標的遺伝子の転写制御領域 に結合することにより、標的遺伝子の転写を制御することが知られている。 肝臓 X受 容体以外の核内レセプターにおいても、サブタイプやアイソフォームが見出されてお り、 例えば、 RAR、 RXR及び PPARでは 3種類のサブタイプ並びにこれらによりコード されるタンパク質が変化した形のアイソフォームが見い出されている （例えば、 Mangel sdorf and Evansゝ Cell, 83： 841-850、 1995参照。 ） 。 RAR及び PPARのアイ ソフォームは、選択的スプライシング及び/又は異なるプロモーターの制御により生 じると考えられており、 その発現の組織特異性や役割が異なることが知られている (例えば、 Takeyama et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. 222； 395-400、 1996 参照。 ） 。 従って、 核内レセプターのサブタイプ及ぴァイソフォームは、 それぞれ異 なる機能を有していると考えられる。 コレステロールの代謝調節において重要な役割 を担っている肝臓 X受容体 αに関し、正常型肝臓 X受容体 αによる正常なコレステロ ール代謝を変化させるような機能を有するァイソフォームが存在するならば、かかる ァイソフォームは、その機能が直接的又は間接的に関与する病的症状との関連性を解 明し、 そして、 それら疾患の予防又は治療のための医薬品を開発するために重要であ る。 発明の開示
本発明は、 正常型肝臓 X受容体ひによる正常なコレステロール代謝の阻害に関与す る新規な肝臓 X受容体 αのァイソフォームである肝臓 X受容体ひスプライシング変異 体タンパク質、 その遺伝子及びそれらの利用を提供する。
より詳しくは、 本発明は、
1 . 肝臓 X受容体 αのァイソフォームであって、肝臓 X受容体ひ遺伝子のェクソン 5に コードされるアミノ酸配列を少なくとも有する、 肝臓 X受容体 αスプライシング変異 体タンパク質 （以下、 本発明スプライシング変異体タンパク質と記すこともある。 ） 2 . 肝臓 X受容体 αのァイソフォームであって、肝臓 X受容体 α遺伝子のイントロン 5 にコードされるァミノ酸配列が含まれてなる、 肝臓 X受容体ひスプライシング変異体 タンパク質 （以下、 本発明スプライシング変異体タンパク質 5 Αと記すこともある。 ) ； 3 . 下記のいずれかのァミノ酸配列を有することを特徴とする前項 2記載の肝臓 X受 容体 αスプライシング変異体タンパク質；
( 1 ) 配列番号 1で示されるアミノ酸配列
( 2 ) 配列番号 1で示されるァミノ酸配列と実質的に同一のァミノ酸配列
( 3 ) 配列番号 1で示されるアミノ酸配列に対して、 95%以上のアミノ酸同一性を有 するアミノ酸配列
4 . 肝臓 X受容体 のァイソフォームであって、 肝臓 X受容体 α遺伝子のイントロン 6 内の一部領域にコードされるァミノ酸配列が含まれてなる、 肝臓 X受容体 スプライ シング変異体タンパク質 （以下、 本発明スプライシング変異体タンパク質 6 Αと記す こともある。 ） ；
5 . 下記のいずれかのァミノ酸配列を有することを特徴とする前項 4記載の肝臓 X受 容体 aスプライシング変異体タンパク質；
( 1 ) 配列番号 2で示されるアミノ酸配列
( 2 ) 配列番号 2で示されるァミノ酸配列と実質的に同一のァミノ酸配列
( 3 ) 配列番号 2で示されるアミノ酸配列に対して、 95%以上のアミノ酸同一性を有 するアミノ酸配列
6 . 正常型肝臓 X受容体 aが有する、 リガンドによる転写活性ィ匕能と比較して、 弱い 転写活性化能を有することを特徴とする前項 1〜 5のいずれかに記載の肝臓 X受容体 aスプライシング変異体タンパク質；
7 . 前項 3記載の肝臓 X受容体 aスプライシング変異体タンパク質のァミノ酸配列を コードする塩基配列、 又は当該塩基配列に相補性を有する塩基配列、 を有するポリヌ クレオチド；
8 . 配列番号 3で示される塩基配列、 又は当該塩基配列に相補性を有する塩基配列、 を有するポリヌクレオチド；
9 . 前項 5記載の肝臓 X受容体ひスプライシング変異体タンパク質のアミノ酸配列を コードする塩基配列、 又は当該塩基配列に相補性を有する塩基配列、 を有するポリヌ クレオチド；
1 0 . 配列番号 4で示される塩基配列、又は当該塩基配列に相補性を有する塩基配列 、 を有するポリヌクレオチド；
1 1 .前項 1記載の肝臓 X受容体ひスプライシング変異体タンパク質の部分ポリべプチ ドであって、前項 1記載の肝臓 X受容体ひスプライシング変異体タンパク質のアミノ酸 配列のうち、 正常型肝臓 X受容体 αには存在しないアミノ酸配列からなる、 ポリぺプ チド （以下、 本発明ポリペプチドと記すこともある。 ） ；
1 2 . 下記のいずれかのアミノ酸配列を有することを特徴とする前項 1 1記載のポリ ぺプチド；
( 1 ) 配列番号 5で示されるアミノ酸配列
( 2 ) 配列番号 6で示されるアミノ酸配列
1 3 . 前項 1 2記載のポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列、又は当該 塩基配列に相補性を有する塩基配列、 を有するポリヌクレオチド；
1 4 . 配列番号 7で示される塩基配列、又は当該塩基配列に相補性を有する塩基配列 、 を有するポリヌクレオチド；
1 5 . 配列番号 8で示される塩基配列、 又は当該塩基配列に相補性を有する塩基配列 、 を有するポリヌクレオチド；
1 6 . 前項 1乃至 6記載のいずれかの肝臓 X受容体ひスプライシング変異体タンパク 質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド、又は前項 7乃至 1 0記載のいずれかのポリヌクレオチド （以下、 総じて、 本発明スプライシング変異 体タンパク質遺伝子と記すこともある。 ） 、 を含有する組換えベクター （以下、 本発 明ベクターと記すこともある。 ） ；
1 7 . 前項 1乃至 6記載のいずれかの肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパク 質のアミノ酸配列をコ一ドする塩基配列を有するポリヌクレオチド、又は前項 7乃至 1 0記載のいずれかのポリヌクレオチド、 が宿主細胞に導入されてなる形質転換体 （ 以下、 本発明形質転換体と記すこともある。 ） ；
1 8 . 前項 1乃至 6記載のいずれかの肝臓 X受容体ひスプライシング変異体タンパク 質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド、又は前項 7乃至 1 0記載のいずれかのポリヌクレオチドを、宿主細胞中で自立複製可能なベクターに 導入する工程を有するベクターの製造方法 （以下、本発明ベクターの製造方法と記す こともある。 ） ；
1 9 . 前項 1 7記載の形質転換体を培養して、 肝臓 X受容体 aスプライシング変異体 タンパク質を産生させる工程を有する、 肝臓 X受容体 スプライシング変異体タンパ ク質の製造方法 （以下、本発明スプライシング変異体タンパク質の製造方法と記すこ ともある） ；
2 0 . 前項 1乃至 6記載のいずれかの肝臓 X受容体ひスプライシング変異体タンパク 質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド、又は前項 7乃至 1 0記載の！;、ずれかのポリヌクレオチドを発現する能力を欠損させてなる遺伝子欠 損動物；
2 1 .前項 1 1乃至 1 2記載のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列をコードする 塩基配列を有するポリヌクレオチド （以下、本発明ポリペプチド遺伝子と記すことも ある。 ） 、 又は前項 1 3乃至 1 5記載のいずれかのポリヌクレオチドを含有する組換 えベクター； .
2 2 .前項 1 1乃至 1 2記載のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列をコードする 塩基配列を有するポリヌクレオチド、又は前項 1 3乃至 1 5記載のいずれかのポリヌ クレオチドが宿主細胞に導入されてなる形質転換体；
2 3 . 肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパク質に被験物質を接触させる工程 、 当該肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパク質の変化を測定する工程を有す る、 肝臓 X受容体 スプライシング変異体タンパク質に作用する物質のスクリーニン グ方法 （以下、 本発明スクリーニング方法と記すこともある。 ） ；
2 4 . 肝臓 X受容体 スプライシング変異体タンパク質が、 前項 1乃至 6記載のいず れかの肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパク質である、 前項 2 3記載のスク リーユング方法；
2 5 . 肝臓 X受容体ひスプライシング変異体タンパク質を産生する細胞に被験物質を 接触させる工程、 前記細胞において当該肝臓 X受容体ひスプライシング変異体タンパ ク質により発現調節を受ける他のタンパク質の産生量を測定する工程、及ぴ前記産生 量に基づき被験物質の肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパク質タンパク質に 対する作用性を評価する工程を有する、 肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパ ク質に作用する物質のスクリーニング方法；
2 6 . 肝臓 X受容体 スプライシング変異体タンパク質が、 前項 1乃至 6記載のいず れかの肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパク質である、 前項 2' 5記載のスク リーニング方法；
2 7 . 肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパク質を産生する細胞に、 前記肝臓 X 受容体 αスプライシング変異体タンパク質のリガンドを接触させ、 当該肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパク質により発現調節を受ける他のタンパク質の産生 量を測定する第一工程、 肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパク質を産生する 細胞に、 前記 ff臓 X受容体 aスプライシング変異体タンパク質のリガンド及び被験物 質の両者を接触させ、 当該肝臓 X受容体ひスプライシング変異体タンパク質により発 現調節を受ける他のタンパク質の産生量を測定する第二工程、及び、 前記第一工程と 前記第二工程とで測定された前記他のタンパク質の産生量の差異に基づき被験物質 の前記リガンドに対する拮抗作用性を評価する工程を有する、 肝臓 X受容体 αスプラ ィシング変異体タンパク質に作用する物質のスクリ一二ング方法；
2 8 . 肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパク質が、 前項 1乃至 6記載のいず れかの月刊蔵 X受容体 αスプライシング変異体タンパク質である、 前項 2 7記載のスク リーユング方法；
2 9 . 前項 2 3乃至 2 8記載のスクリーニング方法により選択された肝臓 X受容体 α スプライシング変異体タンパク質に作用する物質；
3 0 . 月刊蔵 X受容体 αスプライシング変異体タンパク質に作用する前項 2 9記載の物 質に対する拮抗物質；
3 1 . 前項 1乃至 6記載のいずれかの肝臓 X受容体ひスプライシング変異体タンパク 質を特異的に認識する抗体又は抗体の一部；
3 2 .前項 7乃至 1 0記載のいずれかのポリヌクレオチドに基づき設計されてなるプ ライマー；
3 3 . 遺伝子治療法のための、 前項 1 3乃至 1 5記載のいずれかのポリヌクレオチド が有する塩基配列に対する特異的 DNAプ口ーブの使用；
3 4 . 遺伝子治療法のための、 前項 1 3乃至 1 5記載のいずれかのポリヌクレオチド が有する塩基配列に対する特異的 RNAプローブの使用；
3 5 . 前項 1乃至 6記載のいずれかの肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパク 質の存在有無を検出する方法であって、 生体試料中のメッセンジャー RNA (mRNA) 力 ら相補的 DNA (cDNA) を合成する第一工程、 前項 1乃至 6記載のいずれかの肝臓 X受容 体 aスプライシング変異体タンパク質若しくは前項 1 1乃至 1 2記載のいずれかの ポリぺプチドのァミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド又は 前項 1 3乃至 1 5記載のいずれかのポリヌクレオチド、 に対応する前記相補的 DNA (c DNA) の部分領域を増幅する第二工程、 及び増幅された部分領域を検出する第三工程 を有する方法；
3 6 . 第二工程において、 配列番号 9、 配列番号 1 0、 配列番号 1 1、 配列番号 1 2 、配列番号 1 3又は配列番号 1 4で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドから 選択される 1つ又は複数をプライマーとして用いる PCR法により増幅する、前項 3 5記 載の方法；
3 7 . 前項 1乃至 6記載のいずれかの肝臓 X受容体ひスプライシング変異体タンパク 質若しくは前項 1 1乃至 1 2記載のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列をコー ドする塩基配列を有するポリヌクレオチド又は前項 1 3乃至 1 5記載のいずれかの ポリヌクレオチドが、配列番号 7又は 8で示される塩基配列を有するポリヌクレオチ ドである、 前項 3 5記載の方法；
3 8 . 前項 1乃至 6記載のいずれかの肝臓 X受容体ひスプライシング変異体タンパク 質の存在有無を検出する方法であって、 前項 1乃至 6記載のいずれかの肝臓 X受容体 スプライシング変異体タンパク質若しくは前項 1 1乃至 1 2記載のいずれかのポ リぺプチドを特異的に検出することができる抗体を用いた抗原抗体反応に基づき前 記肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパク質を検出する工程を有する方法； 3 9 . 前項 1乃至 6記載のいずれかの肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパク 質の存在有無を検出する方法であって、 前項 1乃至 6記載のいずれかの肝臓 X受容体 ひスプライシング変異体タンパク質若しくは前項 1 1乃至 1 2記載のいずれかのポ リぺプチドを特異的に検出することができる第一抗体をマイクロタイターゥエルに 結合させる第一工程、 生体試料中の前項 1乃至 6記載のいずれかの肝臓 X受容体ひス プライシング変異体タンパク質が、マイクロタイターゥエル上の前記第一抗体に結合 させる第二工程、第二工程後、 マイクロタイターゥエル内の全ての非結合状態にある 生体試料を除去する第三工程、 前記肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパク質 における、第一抗体とは異なるェピトープに結合することができる標識された第二抗 体を、 第一抗体に結合された肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパク質に結合 させる第四工程、 第四工程後、 マイクロタイターゥエル内の全ての非結合状態にある 第二抗体を除去する第五工程、 第五工程後、 第二抗体の存在有無を当該第二抗体が有 する標識を指標にして検出する第六工程を有する方法；
4 0 . コレステロール代謝異常を調べるためのマーカーとしての、 肝臓 X受容体 αス プライシング変異体タンパク質の使用；
4 1 . 肝臓 X受容体ひスプライシング変異体タンパク質が、 前項 2、 3、 4、 5又は 6記載の肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパク質、或いは、肝臓 X受容体ひの ァイソフォームであって、 肝臓 X受容体 α遺伝子のェクソン 5にコードされるァミノ 酸配列が欠失してなる肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパク質であることを 特徴とする前項 4 0記載の使用；
4 2 . ガン細胞の存在を調べるためのマーカーとしての、 肝臓 X受容体 αのアイソフ オームであって、 月刊蔵 X受容体 α遺伝子のェクソン 5にコードされるァミノ酸配列が 欠失してなる、 肝臓 X受容体ひスプライシング変異体タンパク質の使用；
4 3 . コレステロール代鶴す異常を調べるためのマーカーとしての、 肝臓 X受容体 αス プライシング変異体タンパク質のァミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリ ヌクレオチドの使用；
4 4 . 肝臓 X受容体ひスプライシング変異体タンパク質のァミノ酸配列をコードする 塩基配列を有するポリヌクレオチドが、 前項 7乃至 1 0、又は 1 3乃至 1 5記載のポ リヌクレオチドであることを特徴とする前項 4 3記載の使用；
4 5 . ガン細胞の存在を調べるためのマーカーとしての、 肝臓 X受容体 αのアイソフ オームであって、 月刊蔵 X受容体 α遺伝子のェクソン 5にコードされるアミノ酸配列が 欠失してなる、 肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパク質のァミノ酸配列をコ 一ドする塩基配列を有するポリヌクレオチドの使用； 等を提供するものである。 図面の簡単な説明
図 1は、 正常型肝臓 X受容体 α遺伝子と 3種類の肝臓 X受容体 スプライシング変異 体タンパク質遺伝子の構造ドメインを図式的に示した図である。翻訳領域は黒色で示 した。
図 2は、 ヒト正常組織又はヒトガン組織由来の cDNAを鎵型に用いかつ肝臓 X受容体 αに特異的なプライマー （LXR a F LXR a R) を用いて行った PCRにより増幅された P CR産物の一部を、 臭化工チジゥムを含む 1°/。ァガロースゲル電気泳動に供し、 電気泳動 後、 紫外線照射下で増幅シグナルを可視化した結果を示した図である。 乳ガン、 Brea st carcinoma；肺ガン、 Lung carcinoma；大腸ガン、 Colon adenocarcinoma； 目 U立 fe フ ン、 Prostatic adenocarcinoma 卵桌ガン、 Ovarian carcinoma0
, 図 3は、 ヒト正常組織又はヒトガン組織由来の cDNAを錶型に用いかつ 3種類の各々 の肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパク質を特異的に増幅するプライマーセ ットを用いて行った PCRにより増幅された PCR産物を示した図である。 上段の図は、肝 臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパク質 5Αを特異的に増幅するように設計され た、配列番号 9で示される塩基配列からなるプライマー及ぴ配列番号 1 3で示される 塩基配列からなるプライマーを用いて行つた PCRにより増幅された PCR産物を示した ものである。 hLXR a 5Aに由来する PCR産物は 432塩基対を有する DNA断片である。 下段 の図は、 肝臓 X受容体 ο;スプライシング変異体タンパク質 6Aを特異的に増幅するよう に設計された、配列番号 9で示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号 1 4 で示される塩基配列からなるプライマーを用いて行つた PCRにより増幅された PCR産 物を示したものである。 肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパク質 6Αに由来す る PCR産物は 429塩基対を有する DNA断片である。 各々の PCR反応により得られた PCR産 物は、 ΤΑクローニング後、 その塩基配列の決定を行い、 目的物が増幅されていること を確 し 7こ。 乳ガン、 Breast carcinoma；月巿ガン、 Lung carcinoma；大月昜ガン、 Colo n adenocarcinoma；目 ij iL腺ガン、 Prostatic adenocarcinoma；卵巣カン、 Ovarian ca rcinoma0 図 4は、 正常型肝臓 X受容体 α及び 3種類の肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タ ンパク質の循環器系組織における発現を調べた結果を示した図である。 上段の図は、 正常型肝臓 X受容体 α及び肝臓 X受容体 aスプライシング変異体タンパク質 D5の発現 を調べた一例である。肝臓 X受容体 aスプライシング変異体タンパク質 D5に由来する P. CR産物は 416塩基対を有する DNA断片である。 中段の図は、 肝臓 X受容体 aスプライシ ング変異体タンパク質 5Aを特異的に増幅するように設計された、配列番号 9で示され る塩基配列からなるプライマー及び配列番号 1 3で示される塩基配列からなるブラ ィマーを用いて行った PCRにより増幅された産物を示したものである。 hLXR a 5Aに由 来する PCR産物は 432塩基対を有する DNA断片である。 下段の図は、肝臓 X受容体 aスプ ライシング変異体タンパク質 6Aを特異的に増幅するように設計された配列番号 9で 示される塩基配列からなるプライマ一及び配列番号 1 4で示される塩基配列からな るプライマーを用いて行った PCRにより増幅された産物を示したものである。肝臓 X受 容体 aスプライシング変異体タンパク質 6 Aに由来する PCR産物は 429塩基対を有する DNA断片である。 各々の PCR反応により得られた PCR産物は、 TAクロー-ング後、 その 塩基配列の決定を行い、 目的物が増幅されていることを確認した。
囪 5は、 HEK293細胞における一過性発現系におけるレポーターァッセィによる肝臓 X受容体 スプライシング変異体タンパク質 （D5, 5A及び 6A) の機能評価の結果を示し た図である。 TATA- LXREx 4 - lucif eraseベクタ一と 3種類の各々の月干臓 X受容体 aスプ ライシング変異体タンパク質発現ベクターとを HEK293細胞に導入し、 各種肝臓 X受容 体 αリガンドを加えた時の転写活性ィヒ能を測定した結果を示している。無処理区は白 色で表し、 l g/mlの 22R-ヒドロキシコレステロール処理区は黒色で表し、 l g/ml の 25-ヒドロキシコレステロール処理区は灰色で表した。 また、 各々の試験区では 1 の 9- cis レチノイン酸を含む。 溶媒のみ添加した対照区 （コントロール） におけ るルシフェラーゼ活性の値を 100%として、各試験区におけるルシフェラーゼ活性の値 を相対値として示した。 WTは正常型肝臓 X受容体 αを意味している。
図 6は、 ΗΕΚ293細胞において、 正常型肝臓 X受容体 a (LXR a WT) 発現ベクターと肝 臓 X受容体ひスプライシング変異体タンパク質 （LXR a D5、 LXR a 5AN LXRひ 6A) 発現べ クタ一とを共存させた時の転写活性ィヒ能を測定した結果を示した図である。無処理区 は白色で表し、 l ^i g/mlの 22R -ヒドロキシコレステロール処理区は黒色で表し、 l ^ g /mlの 25 -ヒドロキシコレステロール処理区は灰色で表した。 また、 各々の試験区で は 1 μ の 9 - cis レチノイン酸を含む。 溶媒のみ添加した対照区 （コントロール） に おけるルシフェラーゼ活性の値を 100%として、各試験区におけるルシフェラーゼ活性 の値を相対値として示した。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明について詳細に説明する。
本発明は、肝臓 X受容体 αのアイソフォームである肝臓 X受容体 αスプライシング変 異体タンパク質、 その遺伝子及びそれらの利用に関する。
本発明において単離された 3種類の肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパク 質のうち、 1つはイントロン 5にコードされるアミノ酸配列が含まれるァイソフォー ム （本発明スプライシング変異体タンパク質 5 Α) 、 他の 1つはイントロン 6内の一 部領域にコードされるアミノ酸配列が含まれるァイソフォーム（本発明スプライシン グ変異体タンパク質 6 Α) である。 これらのアミノ酸配列は新規に見い出された配列 である。 さらにもう 1っはェクソン 5にコードされるアミノ酸配列が欠失したアイソ フォーム （肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパク質 D5) である。 このアイソ フォームのァミノ酸配列は公共データベースに既に登録されている配列と同一であ つた （GenBank Accession No. BC008819) 。
本発明スプライシング変異体タンパク質 5Aは、 正常型肝臓 X受容体 aのェクソン 5 にコードされるアミノ酸配列のカルボキシル末端に相当するアミノ酸残基の下流に、 イントロン 5にコードされるァミノ酸配列が含まれる以外は、正常型と全く同一の塩 基配列を有している。 また、 本発明スプライシング変異体タンパク質 6Aは、 ェクソン 6にコードされるアミノ酸配列のカルボキシル末端に相当するアミノ酸残基の下流 にイントロン 6内の一部領域にコードされるアミノ酸配列が含まれる以外は、正常型 と全く同一の塩基配列を有している。 尚、 肝臓 X受容体ひスプライシング変異体タン パク質 D5は、 ェクソン 5にコードされるアミノ酸配列が欠失した以外は、 正常型と全 く同一のアミノ酸配列を有している。 これら 3種類の肝臓 X受容体 aスプライシング変異体タンパク質が有する、肝臓 X受 容体 aのリガンドの 1つである 22R—ォキシコレステロールによる転写活性ィヒ能は、 正常型肝臓 X受容体 aが有する当該転写活性化能と比較して極めて弱い又は認められ ないレベルである。 さらに、 正常型肝臓 X受容体 aと上記 3種類の肝臓 X受容体 aスプ ライシング変異体タンパク質それぞれを共発現させたところ、 正常型肝臓 X受容体 a のみを発現させたときに見られるリガンド依存的な転写活性化は著しく抑制される。 以上の知見から、 3種類の肝臓 X受容体 aスプライシング変異体タンパク質は、 生体内 においてドミナントネガティブ的に、 正常型肝臓 X受容体 aによる正常なコレステロ ール代謝の阻害に関与することが示唆される。 本発明スプライシング変異体タンパク質は、 肝臓 X受容体 aのァイソフォームであ つて、 少なくともェクソン 5にコードされるアミノ酸配列を有する。
代表的な例としては、 肝臓 X受容体 a遺伝子のィントロン 5にコードされるァミノ 酸配列が含まれてなる肝臓 X受容体 aのァイソフォーム （即ち、 本発明スプライシン グ変異体タンパク質 5 A) 、肝臓 X受容体 a遺伝子のイントロン 6内の一部領域にコー ドされるアミノ酸配列が含まれてなる肝臓 X受容体 aのァイソフォーム （即ち、 本発 明スプライシング変異体タンパク質 6 A) 等をあげることができる。
さらに具体的には、 本発明スプライシング変異体タンパク質 5 Aとして、 （1 ) 配 列番号 1で示されるァミノ酸配列、 （ 2 ) 配列番号 1で示されるァミノ酸配列と実質 的に同一のアミノ酸配列、 又は （3 ) 配列番号 1で示されるアミノ酸配列に対して、 95%以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を有す る肝臓 X受容体 aアイソフオームがあげられる。 また、 本発明スプライシング変異体 タンパク質 6 Aとして、 （1 ) 配列番号 2で示されるアミノ酸配列、 （2 ) 配列番号 2で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列、 又は （3 ) 配列番号 2で 示されるアミノ酸配列に対して、 95%以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列の いずれかのアミノ酸配列を有する肝臓 X受容体 aアイソフォームがあげられる。
かかる本発明スプライシング変異体タンパク質は、 正常型肝臓 X受容体 aが有する 、 リガンドによる転写活性化能と比較して、 弱い転写活性化能を有する。 ここで 「実質的に同一のアミノ酸配列」 の定義に関して、 一般に生理活性を有する タンパク質のアミノ酸配列が多少変更された場合には、 例えば、 当該アミノ酸配列中 の 1又は複数のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されるような変更があった場合で も、当該タンパク質の生理活性が維持される場合があることはよく知られた事実であ り、 従って、 本明細書でいう 「実質的に同一のアミノ酸配列」 とは、 特定のアミノ酸 配列 （即ち、 配列番号 1又は 2で示されるアミノ酸配列） と実質的に同等の生物活性 が保持される限り、 当該アミノ酸配列中の 1又は複数のアミノ酸が欠失、 置換若しく は付加されたヒ ト肝臓 X受容体ひスプライシング変異体タンパク質も本発明の範囲に 含まれることを意味する。 前記で改変されるアミノ酸の数については、少なくとも 1 残基、 具体的には 1若しくは数個 （ここで 「数個」 とは、 2〜約 1 0個程度である。 ) 、 又はそれ以上である。 かかる改変の数は、 当該タンパク質の生理活性が維持され る範囲であればよい。 より具体的には、 配列番号 1又は 2で示されるアミノ酸配列中 の 1個以上 20個以下、 好ましくは 1個以上 10個以下、 さらに好ましくは 1個以上 5個 以下のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたヒト肝臓 X受容体ひスプライシング 変異体タンパク質である。 このような変異は、 例えば、 蛋白質が細胞内で受けるプロ セシング、 該蛋白質が由来する生物の種差、 個体差、 器官、 組織間の差異等により天 然に生じる変異であってもよいし、 人為的なアミノ酸の変異 （例えば、 部位特異的変 異導入法や突然変異処理等によって、天然の蛋白質をコードする D NAに変異を導入 し発現させることにより作出された蛋白質が有するアミノ酸配列中に存在するアミ ノ酸の変異） であってもよい。 このようなアミノ酸の欠失、置換若しくは付加による変異体タンパク質は、保存的 に置換されたアミノ酸配列を含んでいてもよい。 これは特定のアミノ酸残基が物理ィ匕 学的類似性 （例えば、 疎水性、 電荷、 p K、 立体構造上における特徴等の類似した性 質） を有する残基によって置換されていてもよいことを意味している。 このような保 存的置換の非限定的な例には、 ①グリシン、 ァラニン；②パリン、 イソロイシン、 口 イシン；③ァスパラギン酸、 グルタミン酸、 ァスパラギン、 グルタミン、 ④セリン、 スレオニン；⑤リジン、 ァノレギニン；⑥フエニノレアラニン、 チロシンのグノレープ内で の置換のような、脂肪族鎖含有ァミノ酸残基の間の置換や極性基の間の置換等が挙げ られる。 アミノ酸の欠失、 置換若しくは付カ卩による変異体タンパク質は、 例えば、 そのアミ ノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子に公知技術である部位特異的変異導 入 （例えば、 Nelson and McClelland, Methods Enzymol、 216； 279、 1992等、 ァ ンパー変異を利用する方法 （ギャップド'デュプレックス法、 Nucleic Acids Res.、 12、 9441-9456、 1984) 、 変異導入用プライマーを用いた PCRによる方法） を行うこと により得ることができる。 部位特異的変異導入は、導入したい変異を含む合成プライマーを用いて行うことが できる。 即ち、 プライマーとして前記合成オリゴヌクレオチド及びその塩基配列に相 補的な塩基配列を有するプライマーを用いて、 正常型肝臓 X受容体 の遺伝子を含む プラスミ .ドを錶型として、 増幅反応を行う。 次に、 メチノレ化感受性制限酵素である Dp n Iで処理することにより、新たに形成された変異を有する DNAのみが残る。 この反応 液を用いて大腸菌 XLI- Blue株を形質転換し、 アンピシリン含有 LB寒天培地に捲く。 37 。(：で一晩培養し、 増殖したコロニーからプラスミドを単離する。 これにより、 変異 された DNAを含むプラスミドを得ることができる。 上記方法に基づくキットとしては 、 例えば、 QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene社製) 等力販 売されており、 これらを利用してもよい。 目的の変異が導入されたことは、 その塩基 配列を決定することにより確認できる。 さらにまた、 アミノ酸配列の欠失、 置換若しくは付カ卩を行う方法としては、 前記の 部位特異的変異導入の他にも、遺伝子を変異原で処理する方法又は遺伝子を制限酵素 で開裂し、 選択した遺伝子断片を除去、 付加若しくは置換し、 次いで連結する方法等 も挙げることができる。 ここで 「正常型肝臓 X受容体 」 とは、 同一種の生物由来の当該受容体タンパク質 のアミノ酸配列において、 天然に最も高頻度に出現するアミノ酸配列からなる肝臓 X 受容体 αを意味する。 例えば、 ヒ ト由来正常型肝臓 X受容体 αとしては、 公共データ ベースに登録されているアミノ酸配列 （GenBank Accession No. 丽— 005693) からな る月刊蔵 X受容体 αを挙げることができる。 本発明において 「アミノ酸同一性」 、 「塩基同一性」 とは、 2つの蛋白質又は 2つ の D N Α間の配列の同一性及び相同性をいう。 前記 「同一性」 は、 比較対象の配列の 全領域にわたって、最適な状態にァラインメントされた 2つの配列を比較することに より決定される。 ここで、 比較対象の蛋白質又は D NAは、 2つの配列の最適なァラ インメントにおいて、 付加又は欠失 （例えばギャップ等） を有していてもよい。 この ような同一性に関しては、 例えば、 Vector NTIを用いて、 ClustalWアルゴリズム（Nuc leic Acid Res.、 22 (22) : 4673- 4680 (1994)を利用してアラインメントを作成すること により算出することができる。 尚、 当該同一性は、 配列解析ソフト、 具体的には Vect or NTI、 GENETYX- MACや公共のデータベースで提供される解析ツールを用いて測定さ れる。 前記公共データベースは、 例えば、 ホームページアドレス http：〃 ww. ddbj. ni g. ac. jpにおいて、 一般的に利用可能である。 本発明における 「アミノ酸同一' I"生」 はアミノ酸配列基準であって、 例えば、 約 95% 以上であることが好ましい。 「塩基同一性」 は塩基配列基準であって、 例えば、 約 95 %以上であることが好ましレ、。 本発明スプライシング変異体タンパク質は、 ハイプリダイゼーション法ゃ PCR法等 の通常の遺伝子工学的方法により取得することができる。
例えば、 ヒト、 サル、 ゥサギ、 ラット、 マウス等の哺乳類等の動物組織又はそれら の動物由来培養細胞から、 Sambrook and Russell；モレキュラー クローニング第 3版 、 コールドスプリング ハーバー ラボラトリー （2001年） 等に記載される遺伝子工学 的方法に準じて RNAを抽出し、 一本鎖 cDNAを合成する。 具体的には、 例えば、 肝臓等 の組織をチオシアン酸グァニジン等のタンパク質変性剤を含む溶液中で破砕し、 さら に当該破砕物にクロ口ホルム等を加えることによりタンパク質を変性させる。変性タ ンパク質を遠心分離等により除去した後、 回収された上清画分からフエノール、 クロ 口ホルム等を用いて全 RNAを抽出する。 尚、 これらの方法に基づいた市販のキットと しては、 例えば、 IS0GEN (二ツボンジーン社製） 、 TRIZ0L試薬 （インビトロジェン社 製） がある。
得られた全 RNAを鎵型としてオリゴ dTプライマーを mRNAのポリ A配列に結合させ、逆 転写酵素、 例えば、 RNaseH- Superscript II Reverse Transcriptase (インビ卜ロジ ェン社製)及び添付されたバッファーとオリゴ dTプライマーとを用いて、 42 °Cで 1時 間反応させ、 次いで 99 °Cで 5分間加熱することにより、 逆転写酵素を失活させる。 次 いで、 RNaseHにより、 mRNA鎖にニックを入れ、 該 1本鎖 cDNAを铸型にして大腸菌 DNA ポリメラーゼ Iにより 2本鎖 cDNAを合成する。得られた 2本鎖 cDNAの末端を T4 DNAポリ メラーゼにより平滑化する。平滑化された 2本鎖 cDNAを pBluescript II vectorやパク テリオファージ、 例えば、 gtll、 EMBL3等のベクターに T4リガーゼにより揷入し、 c DNAライプラリーを作成する。 尚、 これらの方法に基づいた市販のキットとしては、 例えば、 cDNA合成システムプラス （アマシャムバイオサイエンス社製） や TimeSaver cDNA合成キット （アマシャムバイオサイエンス社製） 等が挙げられる。 このようにし て作製された cDNAライブラリーから、 例えば、 配列番号 3、 4、 7又は 8のいずれか で示される塩基配列の部分塩基配列を有する DNAをプローブとしてハイブリダィゼー ションを行う。 ハイブリダィゼーションの条件としては、 ストリンジヱントな条件下 でハイブリダイズするような条件をあげることができる。ハイプリダイゼーションは 、 例えば、 Sambrook 、 Frisch E. F.、 Maniatis T.著、 モレキュラークローニン グ第 2版 （Molecular Cloning 2nd edition) 、 コールド スプリング ハーバー ラ ボラトリー発行 （Cold Spring Harbor Laboratory press) 等に記載される通常の方 法に準じて行うことができる。 「ストリンジヱントな条件下」 とは、 例えば、 6 X SS C ( 1 . 5 M NaCl、 0 . 1 5 M クェン酸三ナトリウムを含む溶液を 1 0 X SSCとする ) を含む溶液中で 4 5 °Cにてハイプリッドを形成させた後、 2 X SSCで 5 0 °Cにて洗浄 するような条件 （Molecular Biology, John Wiley & Sons、 N. Y. (1989)、 6. 3. 1 -6.3.6) や、 50%ホルムアミド、 6 XSSC、 5 Xデンハルト溶液、 0.5%(w/v) SDS及び 熱変性したサケ精子 DNA (100 μ g/ml) を含む溶液中に、 ランダムプライミング法に より [o;_32P]dCTPで標識された前記プローブ （10 X 106 cpm/nil) を用いて、 42 °Cに てー晚保温してハイブリッドを形成させた後、 0.1°/。(w/v) SDSを含む 2XSSC中、 室温 で 10分間洗浄し、 さらに 0. l°/。(w/v) SDSを含む 0.2XSSC中、 55 °Cで 10分間 2回洗浄す るような条件等を挙げることができる。 尚、 洗浄ステップにおける塩濃度は、 例えば 、 2 XSSCで約 50°C程度の条件 （低ストリンジエンシーな条件） から 0. 2 XSSCで 約 50°C程度までの条件 （高ストリンジエンシーな条件） から選択することができる 。 洗浄ステップにおける温度は、 例えば、 室温 （低ストリンジエンシーな条件） から 65°C (高ストリンジエンシーな条件） から選択することができる。 また、 塩濃度と 温度の両方を変えることもできる。
次いで X線フィルム （例えば、 Hyperfilm- MP；アマシャムバイオサイエンス社製） 又はバイオイメージングシステム (BAS-2000；富士フィルム社製) によりシグナルを 検出し、プローブと結合する塩基配列を有するベクターを含む組換え体を得ることが できる。
PCR法のプライマーを設計する場合には、 例えば、 配列番号 3、 4、 7又は 8のい ずれかで示される塩基配列から、例えば、 以下の条件を満たすように 2つを選定すれ ばよい。
1) プライマーの長さが 15塩基から 40塩基、 好ましくは、 20塩基から 30塩基。
2) プライマーの中のグァニンとシトシンとの割合が、 40%〜60%、 好ましくは 45% 〜55%、 より好ましくは 50%〜55%。
3) プライマー配列において、 アデニン、 チミン、 グァニン、 シトシンの分布が部分 的に偏らないこと。 例えば、 グァニン、 シトシンが繰り返すような領域は適切ではな い。
4) 選定されるプライマーに対応する遺伝子の塩基配列上の距離が、 好ましくは 100 塩基乃至 3000塩基、 さらに好ましくは、 100塩基乃至 500塩基。
5) 各プライマー自身又は 2つのプライマー間に相補的な配列が存在しないこと。 プライマーの塩基配列が選定されれば、市販の D N A合成機により化学合成すれば よい。
例えば、センスプライマーとして配列番号 1 1で示される塩基配列からなるプライ マーを、アンチセンスプライマーとして配列番号 1 2で示される塩基配列からなるプ ライマーを使う組み合わせが挙げられる。 PCRの条件としては、 例えば、 反応液中に 、 プライマーをそれぞれ 200 nMになるように添加し、 上記で合成した 1本鎖 cDNAを铸 型にして、 例えば、 LA Taq DNAポリメラーゼ （宝酒造社製） 及び当該酵素に添付され た反応緩衝液を用いて PCRを行う。 かかる PCRとしては、 例えば、 95 °C、 3分間の熱変 性後、 94 °C、 30秒間、 55 °C、 30秒間、 72。C、 1分間を 1サイクルとして 35サイク ル程度行う。 ここで、 上記のようにして合成された cDNAの代わりに、 クロンテック社 製クイッククローン cDNA等の市販の各種動物由来の cDNAを用いてもよい。得られた反 応液の一部を、 ァガロースゲル電気泳動により解析し、 目的のパンドを、 直接又はゲ ルから切り出した後、 TAクローニングシステムにより pGEM-T Easyベクター (プロメ ガ社製） にクローニングする。 挿入された DNA断片の塩基配列は、 ダイターミネータ 一法により決定し、 確認することができる。 このようにして取得された本発明スプライシング変異体タンパク質のァミノ酸配 列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド （即ち、本発明スプライシング変 異体タンパク質遺伝子） を形質転換させる宿主細胞において利用可能なベクターに導 入することができる。 例えば、 宿主細胞中で自立複製可能なベクターであって、 宿主 細胞からの単離、 精製が可能であり、 検出可能なマーカーをもつベクターに、 通常の 遺伝子工学的手法に準じて組み込むことにより本発明スプライシング変異体タンパ ク質遺伝子を含むベクターを構築することができる。本発明スプライシング変異体タ ンパク質遺伝子を含むベクターとしては、具体的には大腸菌を宿主細胞とする場合に は、 例えば、 プラスミド pUC19 (宝酒造社製） 、 pBluescript II (Stratagene社） 等 を挙げることができる。 出芽酵母を宿主細胞とする場合には、 プラスミド pACT2 (ク ロンテック社製） 、 pYES2 (インビトロジェン社製)等を挙げることができる。 また、 哺乳類動物細胞を宿主細胞とする場合には pRc/RSV、 pRc/CMV (ィンビトロジヱン社） 等のプラスミド等を挙げることができる。 本発明スプライシング変異体タンパク質遺伝子の上流に、宿主細胞で機能可能なプ 口モーターを機能可能な形で結合させ、 これを上述のようなベクターに組み込むこと により、本発明スプライシング変異体タンパク質遺伝子を宿主細胞で発現させること が可能なべクターを構築することができる。 ここで、 「機能可能な形で結合させる」 とは、本発明スプライシング変異体タンパク質遺伝子が導入される宿主細胞において 、プロモーターの制御下に本発明スプライシング変異体タンパク質遺伝子が発現され るように、当該プロモーターと本発明スプライシング変異体タンパク質遺伝子とを結 合させることを意味する。 使用されるプロモーターは、形質転換する宿主細胞内でプ 口モーター活性を示すものであって、 例えば、 宿主細胞が大募菌である場合には、 大 月昜菌のラタトースォペロンのプロモーター、 tacプロモーター、 T7プロモーター等の プロモーターを挙げることができる。 宿主細胞が動物細胞である場合には、 例えば、 ラウス肉腫ウィルス（RSV)プロモーター、 サイ トメガロウィルス（CMV)プロモーター、 シミアンウィルス（SV40)プロモーター等を挙げることができる。宿主細胞が出芽酵母 である場合には、 アルコール脱水素酵素 （ADH) l遺伝子プロモーター、 ガラクトース 代謝酵素 (GAL) 1遺伝子プロモーター等を挙げることができる。
また、宿主細胞において機能するプロモーターをあらかじめ保有するベクターを使 用する場合には、ベクター保有のプロモーターと本発明スプライシング変異体タンパ ク質遺伝子とが機能可能な形で結合するように、当該プロモーターの下流に本発明ス プライシング変異体タンパク質遺伝子を揷入すればよい。 例えば、前述のプラスミド pRc/RSV、 pRc/CMV等は、動物細胞で機能可能なプロモーターの下流にクローニング部 位が設けられており、当該クローニング部位に本発明スプライシング変異体タンパク 質遺伝子を挿入し動物細胞へ導入すれば、本発明スプライシング変異体タンパク質遺 伝子を発現させることができる。 また前述の出芽酵母用プラスミド pACT2は ADH1プロ モーターを有しており、当該プラスミド又はその誘導体の ADH1プロモーターの下流に 本発明スプライシング変異体タンパク質遺伝子を揷入すれば、本発明スプライシング 変異体タンパク質遺伝子を、 例えば、 CG1945株（クロンテック社製)等の出芽酵母内で 大量発現させることが可能な本発明ベクターが構築できる。 本発明スプライシング変異体タンパク質遺伝子又は本発明ベクター等を宿主細胞 に導入することにより、 本発明形質転換体を取得することができる。 本発明スプライ シング変異体タンパク質遺伝子又は本発明べクター等を宿主細胞へ導入する方法と しては、 形質転換される宿主細胞に応じた通常の導入方法を適用することができる。 例えば、 微生物である大腸菌を宿主細胞とする場合には、 モレキュラー 'クローニン グ第 3版 （Sambrook and Russell、 コールド 'スプリング 'ハーバー 'ラボラトリー 、 2001年） 等に記載される塩ィ匕カルシウム法、 エレクトロポレーシヨン法等の通常の 方法を用いることができる。 また、 哺乳類動物細胞又は昆虫類細胞を宿主細胞とする 場合は、 例えば、 リン酸カルシウム法、 エレクトロポレーシヨン法又はリポフエクシ ヨン法等の一般的な遺伝子導入法により前記細胞に導入することができる。 また、 本 発明スプライシング変異体タンパク質遺伝子を、酵母を宿主細胞として発現させても よい。 この場合、 好ましくは、 出芽酵母 （例えば、 サッカロミセスセレビシェ） を用 いるが、 ピキア （Pichia) 等の酵母を用いてもよい。 酵母を形質転換する方法として は、 例えば、 Itoらの方法 （J. Bacteriol. 153 ; 163-168、 1983) 等をあげること ができる。
バキュ口ウィルスやワクシニアウィルス等のウイノレスに本発明スプライシング変 異体タンパク質遺伝子を組み込むには、使用しょうとするウィルスのゲノムと相同な 塩基配列を含有するトランスファーベクターを用いることができる。 このようなトラ ンスファーベクターの具体的例としては、 pVL1392、 pVL1393 (インビトロジェン社製 ) 等のプラスミ ドを挙げることができる。 本発明スプライシング変異体タンパク質遺 伝子を前記のようなトランスファーベクターに揷入し、 当該トランスファーベクター とウィルスゲノムとを同時に宿主細胞に導入すると、 トランスファーベクターとウイ ルスゲノムとの間で相同組換えが起こり、本宪明スプライシング変異体タンパク質遺 伝子がゲノム上に組み込まれた組換えウィルスを得ることができる。 ウィルスゲノム としては、 パキュロウィルス、 アデノウイルス等のゲノムを用いることができる。 尚 、 ウィルスをベクターに用いる場合には、 上述のように一般的な遺伝子導入法により ウィルス DNAを宿主細胞に導入できるほ力、、 組み換えウィルスを直接、 宿主細胞へ感 染させることによつてもウィルス DNAを宿主細胞に導入することができる。 本発明スプライシング変異体タンパク質は、 天然に存在する生物体から抽出、精製 等の操作により、 天然タンパク質として調製することができるし、 又は、 遺伝子工学 的手法を用いて糸且換えタンパク質として調製することもできる。 例えば、 ヒトの細胞 、 組織から粗抽出液を調製し、 種々のカラムを使うことにより、 精製タンパク質を調 製することができる。 ここでの細胞としては、 本発明スプライシング変異体タンパク 質を産生 ·発現しているものであれば特に限定されず、 例えば、 肝臓由来細胞、 腎臓 由来細胞等を用いることができる。 また、本発明スプライシング変異体タンパク質の 中でヒト以外の生物において産生 '発現されているものについては、 当該生物から調 製することができる。 本発明スプライシング変異体タンパク質を製造するには、上記のようにして本発明 スプライシング変異体タンパク質遺伝子又は本発明ベクター等を適当な宿主細胞に 形質転換し、 当該形質転換体 （即ち、 本発明形質転換体） を培養して、 肝臓 X受容体 ひスプライシング変異体タンパク質を産生させればよい。 産生された肝臓 X受容体 a スプライシング変異体タンパク質を通常の方法に従って回収する。回収された本発明 スプライシング変異体タンパク質は、 目的に応じて適当な方法により精製される。 例 えば、 本発明形質転換体が微生物である場合には、 当該形質転換体は、 一般微生物に おける通常の培養に使用される炭素源や窒素源、 有機塩、無機塩等を適宜含む各種の 培地を用いて培養される。 培養は一般微生物における通常の方法に準じて行い、 固体 培養、 液体培養 （試験管振とう式培養、 往復式振とう培養、 ジャーフアーメンター （ Jar Fermenter) 培養、 タンク培養等） 等が可能である。 培養温度は、 微生物が生育 する範囲で適宜変更できるが、 例えば、 約 15°C〜約 40 °Cの培養温度、 pHが約 6〜約 8 の培地において培養するのが一般的である。 培養時間は、培養条件によって異なるが 、 通常、 約 1時間〜約 24時間である。 誘導型のプロモーターを用いている場合は、 誘 導時間は 1日以内が望ましく、 通常数時間である。 また、 上記形質転換体が哺乳類、 昆虫類等の動物細胞である場合には、 当該形質転 換体は一般の培養細胞における通常の培養に使用される培地を用いて培養すること ができる。 動物細胞の場合には、 例えば、 終濃度が約 5% (v/v)〜約 10% (v/v)となるよ う牛胎児血清 （Fetal Bovine Serum; FBS) を添加した液体培地 （インビトロジェン 社製等） を用いて 37 °C、 5% C02存在下等の条件で培養すればよい。 細胞がコンフル ェントになるまで増殖したら、例えば、 0. 25% (v/v)程度のトリプシン/ PBS溶液を加え て個々の細胞に分散させ、数倍に希釈して新しいシャーレに播種し培養を続ける。 昆 虫類細胞の場合も同様に、 例えば、 10°/。(v/v) FBSを含む Grace培地等或いは SF- 900 ( インビトロジェン社製）等の無血清培地を用いて培養温度約 25 °C〜約 30 °Cで培養す ればよい。 また、 バキュロウィルス等の組換えウィルスベクターを用いる場合、感染 後、 72時間以内に細胞を回収するのが望ましい。
本発明形質転換体により産生された本発明スプライシング変異体タンパク質の回 収は、 適宜、 通常の単離、 精製の方法を組み合わせて行えばよく、 例えば、 培養終了 後、 形質転換体の細胞を遠心分離等で集め、 集められた該細胞を通常のバッファー、 例えば、 適当なプロテアーゼ阻害剤を含む PBSに懸濁した後、 超音波処理、 ダウンス ホモジナイザー等で破砕し、 破碎液を 20， 000 X gで数十分間から 1時間程度遠心分離 し、 上清画分を回収することにより、 目的である本発明スプライシング変異体タンパ ク質を含む画分を得ることができる。 さらに、 前記上清画分から通常のタンパク精製 技術により各種クロマトグラフィーに供することにより、 より精製された目的である 本発明スプライシング変異体タンパク質を回収することもできる。 尚、本発明スプラ ィシング変異体タンパク質の代わりに本発明ポリぺプチドを前述と同様な方法によ り回収することができる。 このようにして製造された本発明スプライシング変異体タンパク質は、例えば、被 験物質と本発明スプライシング変異体タンパク質との結合能や結合量等を評価する ためのリガンド ·レセプターパインディングアツセィ等に用いることができる。 例えば、 肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパク質に作用する物質のスクリ 一ユング方法は、 肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパク質に被験物質を接触 させる工程及び当該肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパク質の変化を測定す る工程を有する。
月刊蔵 X受容体ひスプライシング変異体タンパク質としては、如何なる肝臓 X受容体ひ スプライシング変異体タンパク質であってもよレ、が、例えば、本発明スプライシング 変異体タンパク質を特に適するものとして挙げることができる。 尚、 上記方法において、 肝臓 X受容体ひスプライシング変異体タンパク質と接触さ せる被験物質の濃度は、 通常、 約 0 . 1 μ Μ〜約 1 0 Μであればよく、 1 μ M〜 1 0 μ Μが好ましい。 肝臓 X受容体ひスプライシング変異体タンパク質ど被験物質とを 接触させる時間は、 通常、 1 8時間以上 6 0時間程度であり、 好ましくは 2 4時間か ら 4 0時間程度が挙げられる。 本発明スプライシング変異体タンパク質を用いたリガンド ·レセプターバインディ ングァッセィは、当該タンパク質に対する化学物質の結合能の測定や結合量の定量の ほカ 結合特異性、 結合力の分析等が可能な試験方法である。 例えば、 上述のように して本発明形質転換体から回収された本発明スプライシング変異体タンパク質に標 識されたリガンドが結合している状態において、 これに被験物質を共存させると、被 験物質と標識リガンドとの競合から、 両者の肝臓 X受容体ひスプライシング変異体タ ンパク質への親和性に応じて、標識リガンドが本発明スプライシング変異体タンパク 質から遊離し、本発明スプライシング変異体タンパク質に結合した標識リガンドの量 が減少し、 よって本発明スプライシング変異体タンパク質に結合した標識量が減少す る。 従って、遊離型の標識リガンドの標識量又は結合型の標識リガンドの標識量をモ 二ターすることにより、被験物質の本発明スプライシング変異体タンパク質への結合 能が間接的に分かる。
標識リガンドとしては、例えば、 トリチウム標識されたォキシコレステロール等を 用いることができる。 反応系は大きく 3群に分けられる。 1つの系は、 本発明スプライ シング変異体タンパク質に標識リガンドが結合しているところへ溶媒のみが添加さ れる群であり、被験物質の濃度がゼロの系に相当し、 この系から得られる結合型の標 識リガンドの標識量は、標識リガンドの本発明スプライシング変異体タンパク質に対 する総結合量を示す。 もう 1つの系は、 本発明スプライシング変異体タンパク質に標 識リガンドが結合しているところへ、 例えば、標識されていないォキシコレステロ一 ルが、本発明スプライシング変異体タンパク質を十分飽和し標識リガンドが結合でき なくなるだけの濃度 （例えば 10 μ Μ) となるよう添加された系であり、 この系から得 られる結合型の標識リガンドの標識量は、標識リガンドの本発明スプライシング変異 体タンパク質に対する非特異的結合量と判断される。 従って、本発明スプライシング 変異体タンパク質への標識リガンドの特異的結合量は、前者の総結合量から後者の非 特異的結合量を引いた値となる。 3番目の系は、 本発明スプライシング変異体タンパ ク質に標識リガンドが結合しているところへ、 被験物質が、 例えば、 最終濃度 ΙΟ μ Μ
(この濃度は目的により任意に変更する。 ) となるよう添加された系である。 被験物 質が本発明スプライシング変異体タンパク質への結合能を有する場合には、 この系か ら得られる結合型の標識リガンドの標識量は、上記のようにして求めた被験物質の濃 度がゼロの時の本発明スプライシング変異体タンパク質への標識リガンドの特異的 結合量より小さくなる。 このようにしてリガンド'レセプターパインディングアツセ ィを行うことにより、本発明スプライシング変異体タンパク質に対する被験物質の結 合能を調べることができ、被験物質が複数の物質を含む場合にはその中に本発明スプ ライシング変異体タンパク質に親和性を示す物質が存在するかどうかを調べること もできる。 さらに、本発明スプライシング変異体タンパク質に対する被験物質の結合 能をより詳細に評価するには、 例えば、 前記の 3番目の系における被験物質の添加濃 度を変えて同様にアツセィを行い結合型の標識リガンドの標識量を測定する。当該測 定値に基づき、各アツセィにおける結合型と遊離型のリガンド量を算出して、被験物 質と本宪明スプライシング変異体タンパク質との結合親和性、結合特異性、 結合容量 等を評価することができる。 また、肝臓 X受容体ひスプライシング変異体タンパク質が、肝臓 X受容体 αの結合配 列を含む転写制御領域の制御下にある遺伝子の転写を活性化するかどうかの評価は、 例えば、 肝臓 X受容体 の結合配列を含む転写制御領域の下流に連結されてなるレポ 一ター遺伝子を使用して、後述のレポーターアツセィ等の試験方法により評価するこ とができる。 肝臓 X受容体 αは、 核内レセプターの 1つであるレチノィド X受容体 （RXR ) とへテロダイマーを形成し、 肝臓 X受容体ひの結合配列を含む転写制御領域に結合 することにより、 該転写制御領域の制御下にある遺伝子の転写を制御する。 月刊蔵 X受 容体 αの結合配列としては、 " AGGTCA" (又は関連の 6ヌクレオチドからなるモチー フ）が同方向に 2つ並んだ構造を有するコアモチーフを含む転写調節領域の特定配列 (シス配列） をあげることができる。 コアモチーフ間のスぺーサ一はへテロダイマー の組み合わせにより異なっており、 肝臓 X受容体とレチノィド受容体とのへテ口ダイ マーの場合には 4 bp (DR4) である （例えば、 Lehman et al.、 J. Biol. Chem.、 272 ； 3137-3140、 1997参照。 ) 。 本発明の肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパク質、 その遺伝子又はそれら 部分領域は、 当該肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパク質とその機能が直接 的又は間接的に関与する病的症状との関連性を解明し、 そして、 それら病的症状の予 防又は診断 ·治療に有用な方法や薬剤を開発するために極めて有用である。 上述のよ うなスクリ一ユング方法により、 当該肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパク 質に作用する物質や、 前記物質に対する拮抗物質を探索することができ、 これら物質 を医薬品の候補として提供することが可能となる。 本発明スクリーニング方法により選抜される物質又は当該物質に対する拮抗物質 を有効成分とする薬剤は、その有効量を経口的または非経口的にヒト等の哺乳動物に 対し投与することができる。 例えば、 経口的に投与する場合には、 当該薬剤は錠剤、 カプセル剤、 シロップ剤、 懸濁液等の通常の形態で使用することができる。 また、 非 経口的に投与する場合には、 前記薬剤を溶液、 乳剤、 懸濁液等の通常の液剤の形態で 使用することができる。前記形態の前記薬剤本脂肪蓄積調節剤を非経口的に投与する 方法としては、 例えば注射する方法、坐剤の形で直腸に投与する方法等を挙げること ができる。 前記の適当な投与剤型は許容される通常の担体、 賦型剤、 結合剤、 安定剤、 希釈剤 等に本発明スクリーニング方法により選抜される物質又は当該物質に対する拮抗物 質を配合することにより製造することができる。 また注射剤型で用いる場合には、 許 容される緩衝剤、 溶解補助剤、 等張剤等を添加することもできる。 投与量は、 投与される哺乳動物の年令、 性別、 体重、 疾患の程度、 前記薬剤の種類 、 投与形態等によって異なるが、通常は経口の場合には成人で 1日あたり有効成分量 として約 1 m g〜約 2 g、好ましくは有効成分量として約 5 m g〜約 1 gを投与すれ ばよく、 注射の場合には成人で有効成分量として約 0 . l m g〜約 5 0 0 m gを投与 すればよい。 また、 前記の 1日の投与量を 1回または数回に分けて投与することがで きる。 本努明スプライシング変異体タンパク質が直接的又は間接的に関与する病的症状 との関連性は、 まずリガンドを特定し、 次いでリガンドと本発明スプライシング変異 体タンパク質とにより転写制御される遺伝子群を特定することによつて解明するこ とができる。 リガンドの特定は、本発明スプライシング変異体タンパク質又は本発明 ポリぺプチドに被験物質を接触させることにより、本発明スプライシング変異体タン パク質又は本発明ポリベプチドにより転写制御される遺伝子群の発現レベルの変化 を検出することによって行うことができる。
また、 肝臓 X受容体 Q；スプライシング変異体タンパク質に作用する物質のスクリー ユング方法は、 肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパク質を産生する細胞に被 験物質を接触させる工程、 当該肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパク質によ り発現調節を受ける他のタンパク質の産生量を測定する工程、及び前記産生量に基づ き被験物質の肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパク質に対する作用性を評価 する工程を有する方法であってもよい。
ここで、 肝臓 X受容体ひスプライシング変異体タンパク質を産生する細胞としては 、 如何なる肝臓 X受容体ひスプライシング変異体タンパク質を産生する細胞であつて もよいが、 例えば、本発明スプライシング変異体タンパク質を産生する細胞を特に適 するものとして挙げることができる。 肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパク 質を産生する細胞と接触させる被験物質の濃度は、 通常、約 0 . 1 〜約 1 0 / Μ であればよく、 1 Μ~ 1 0 μ Μが好ましい。 肝臓 X受容体 0；スプライシング変異体 タンパク質を産生する細胞と被験物質とを接触させる時間は、 通常、 1 8時間以上 6 0時間程度であり、 好ましくは 2 4時間から 4 0時間程度が挙げられる。 また、 肝臓 X受容体ひスプライシング変異体タンパク質に作用する物質のスクリー ニング方法としては、 例えば、 肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパク質を産 生する細胞に、 前記月刊蔵 X受容体 スプライシング変異体タンパク質のリガンドを接 触させ、 当該肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパク質により発現調節を受け る他のタンパク質の産生量を測定する第一工程、本発明スプライシング変異体タンパ ク質を産生する細胞に、 前記肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパク質のリガ ンド及ぴ被験物質の両者を接触させ、 当該肝臓 X受容体ひスプライシング変異体タン パク質により発現調節を受ける他のタンパク質の産生量を測定する第二工程、 及び、 前記第一工程と前記第二工程とで測定された前記他のタンパク質の産生量の差異に 基づき被験物質の前記リガンドに対する拮抗作用性を評価する工程を有する方法も あげることができる。 ここで、 肝臓 X受容体 スプライシング変異体タンパク質とし ては、 如何なる肝臓 X受容体 aスプライシング変異体タンパク質であってもよいが、 例えば、本発明'スプライシング変異体タンパク質を特に適するものとして挙げること ができる。 肝臓 X受容体ひスプライシング変異体タンパク質を産生する細胞と接触さ せるリガンド又は被験物質の濃度は、 通常、約 0 . 1 μ Μ〜約 1 0 μ Μであればよく 、 1 μ Μ〜1 0 μ Μが好ましい。 月刊蔵 X受容体 αスプライシング変異体タンパク質を 産生する細胞とリガンド又は被験物質とを接触させる時間は、 通常、 1 8時間以上 6 0時間程度であり、 好ましくは 2 4時間から 4 0時間程度が挙げられる。
さらにまた、 一般的に行われているパインデイングアツセィ等においては、本発明 スプライシング変異体タンパク質又はその断片を用いて行うことができる。 また、 本 発明スプライシング変異体タンパク質と当該肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タ ンパク質が結合する標的遺伝子との発現系を構築し、 リガンド添加による標的遺伝子 産物であるタンパク質の増加を検出する方法もあげられる。 例えば、 ルシフェラ"ゼ 、 クロラムフエ-コールァセチル転移酵素、 —ガラクトシダーゼ等のようなレポ一 タータンパク質を標的遺伝子のプロモーターの制御下で発現するようなレポーター 遺伝子を用いることにより、宿主細胞中での標的遺伝子の発現の有無を容易に検出す ることができる。 さらに、本発明スプライシング変異体タンパク質の全長の代わりに 、 当該タンパク質のリガンド結合領域と DNA結合性タンパク質とのキメラ遺伝子を発 現させ、 レポーター遺伝子として、 DNA結合性タンパク質が結合する塩基配列の下流 に最小活性プ口モータ一及び前述のレポータータンパク質をコードする遺伝子を連 結したプラスミドを用いることができる。 DNA結合性タンパク質としては、 例えば、 G AL4、 LexA等を用いることができる。 本発明スプライシング変異体タンパク質と当該 肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパク質が結合する標的遺伝子との発現系及 び当該タンパク質のリガンド結合領域と DNA結合性タンパク質とのキメラ遺伝子を発 現させるプラスミドは、 通常の遺伝子組換技術により調製することができる。
さらにまた、 細胞中で発現された mRNAから標識ィヒされた DNAを転写させ、 得られた 標識 DNAを DNAライブラリーチップとハイブリダィズさせることにより本発明スプラ イシング変異体タンパク質により発現制御された遺伝子を特定することもできる。 本発明スプライシング変異体タンパク質が直接的又は間接的に関与する病的症状 との関連性は、 本発明スプライシング変異体タンパク質を発現する細胞に、 アンタゴ ニスト又はァゴニストを接触させた時の標的遺伝子の発現量と、被験物質を接触させ ていない前記本発明スプライシング変異体タンパク質発現細胞における標的遺伝子 の発現量とを比較することにより、活性化される遺伝子を特定することにより解明が 可能である。 本発明スプライシング変異体タンパク質の存在有無を検出する方法としては、生体 試料中のメッセンジャー RNA (mRNA) から相補的 DNA (cDNA) を合成する第一工程、 本 発明スプライシング変異体タンパク質遺伝子又は本発明ポリぺプチド遺伝子等に対 応する前記相捕的 DNA (cDNA) の部分領域を増幅する第二工程、 及び増幅された部分 領域を検出する第三工程を有する方法をあげることができる。 本発明スプライシング変異体タンパク質遺伝子又は本発明ポリぺプチド遺伝子等 としては、 具体的には、 配列番号 3、 4、 7又は 8で示される塩基配列を有するポリ ヌクレオチド等をあげることができる。 また、 第二工程において、 配列番号 9、 配列番号 1 0、 配列番号 1 1、 配列番号 1 2、配列番号 1 3又は配列番号 1 4で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドか ら選択される 1つ又は複数をプライマーとして用いる PCR法により増幅するようなェ 程を好ましくあげることもできる。 また、本発明スプライシング変異体タンパク質のァミノ酸配列をコードする塩基配 列を有するポリヌクレオチド等を発現する能力を欠損させてなる遺伝子欠損動物等 の実験動物及びその利用に関しては、本発明スプライシング変異体タンパク質のアミ ノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子の機能を有する実験動物由来の内在 性スプライシング変異体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を破 壊 （不活性化） することによりモデル動物を作成し、 このモデル動物の物理学的、 生 物学的、 病理学的及び遺伝子的特徴を分析することにより、 本発明スプライシング変 異体タンパク質の機能と疾病との関連性を解明することも可能となる。 また、 前述した内在性肝臓 X受容体ひスプライシング変異体タンパク質のアミノ酸 配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を破壊 （不活性化） されたモデル動物に、 本発明のヒト由来遺伝子を導入することにより、本発明のヒト由来遺伝子のみを有す るモデル動物を作成し、 導入されたヒト由来遺伝子をターゲットとした薬剤 （化合物 等） を投与することにより、 その薬剤の治療学的効果を評価することも可能である。 本発明は、 さらに、 遺伝子治療法のための、 本発明ポリペプチド遺伝子が有する塩 基配列に対する特異的 DNAプローブの使用や、 遺伝子治療法のための、 本発明ポリべ プチド遺伝子が有する塩基配列に対する特異的 RNAプローブの使用も提供する。 この ような本発明スプライシング変異体タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配 列 （又は当該塩基配列に相補性を有する塩基配列） を有する遺伝子 （D NA又は R N A) の全部又は一部よりなる、 正常型肝臓 X受容体 "による正常なコレステロール代 謝の阻害に関与する疾患の診断用プローブ及び当該プローブを含有してなる当該障 害を伴う疾患の診断薬をも提供するものである。 例えば、 病理切片に対して本発明ス プライシング変異体タンパク質遺伝子の In situハイブリダィゼーシヨンを行うこと により、 当該障害を伴う疾患の有無や進行具合を検出することができる。
ここで診断用プローブとしては、 本発明スプライシング変異体タンパク質遺伝子 （ D NA、 R NA、 c D NA) のアンチセンス鎖の全部又は一部であり、 プローブとし て成立する程度の長さ （少なくとも 2 0ベース以上） を有するものであれば特に制限 されるものではない。 当該プローブを診断薬の有効成分とするためには、 プローブが 分解されないような適当なパッファ一類や滅菌水に溶解することが好ましい。 また、 In situハイブリダィゼーシヨンの方法としては、 例えば、 J. Neurobiol. 29、 1 - 17 (1996)に記載の手法が挙げられる。 また、 In situ PCRの方法を利用することも可 能である。
前記診断においては、 プローブのみならず、本発明スプライシング変異体タンパク 質を特異的に認識する抗体 （後述参照） を使用することができ、 .この場合には、 免疫 染色法により正常型肝臓 X受容体 αによる正常なコレステロール代謝の阻害に関与す る疾患の有無や進行具合を検出することができる （Dev. Biol. 170、 207-222 (1995 ) ; J. Neurobiol. 29、 1-17 (1996)参照) 。 使用される抗体は、 例えば、 Antibodie s i A Laboratory Manual, Lane, H. D. ら編、 Cold Spring Harber Looratory Press 出版 New York 1989等に記載の通常の方法により作製することができる。 本発明ズプライシング変異体タンパク質遺伝子又は本発明ポリぺプチド遺伝子は、 それ自体、本発明スプライシング変異体タンパク質の機能を遺伝子レベルで制御する アンチセンス医薬品として、 遺伝子治療での使用において有用である。 例えば、 配列 番号 7又は 8に含まれる 20塩基以上の塩基配列、好ましくは 30塩基前後の塩基配列を 用いることができる。
上述のアンチセンス医薬品には、 DNAのみならず RNAも含まれる。 また、 塩基配列は 、 センス配列でもアンチセンス配列 （即ち、 センス配列に相補性を有する塩基配列） でも構わない。 ここで 「本発明ポリペプチド」 、 「本発明ポリペプチド遺伝子」 とは、 前述の如く 、 本発明スプライシング変異体タンパク質の部分領域 （部分ポリペプチド） 又はこれ に対応する本発明スプライシング変異体タンパク質遺伝子の部分領域（部分ポリヌク レオチド） であり、 正常型肝臓 X受容体ひには存在しない領域からなるポリペプチド 又はこれに対応するポリヌクレオチドを意味する。 好ましくは、 少なくとも 6個の連 続するアミノ酸又は少なくとも 1 8個の連続する塩基を含むことがよい。
代表的な例としては、 肝臓 X受容体ひ遺伝子のィントロン 5がェクソンとして含ま れてなる肝臓 X受容体 αのアイソフォーム （本発明スプライシング変異体タンパク質 5 Α) のアミノ酸配列のうち、 正常型肝臓 X受容体 αには存在しない領域からなるポリ ぺプチド又はこれに対応するポリヌクレオチドゃ、 肝臓 X受容体 α遺伝子のィントロ ン 6内の一部領域がェクソンとして含まれてなる肝臓 X受容体 αのァイソフォーム （ 本 明スプライシング変異体タンパク質 6 Α) のアミノ酸配列のうち、 正常型肝臓 X受 容体 αには存在しない領域からなるポリべプチド又はこれに対応するポリヌクレオ チド等をあげることができる。
さらに具体的には、配列番号 5で示されるァミノ酸配列を有するポリべプチド又は これに対応する塩基配列 （例えば、 配列番号 7で示される塩基配列） を有するポリヌ クレオチドゃ、配列番号 6で示されるァミノ酸配列を有するポリぺプチド又はこれに 対応する塩基配列 （例えば、 配列番号 8で示される塩基配列） を有するポリヌクレオ チド等があげられる。
また、上記のポリぺプチドのァミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌク レオチド又は上記のポリヌクレオチドを含有する組換えベクターは、前述の本発明べ クタ一調製方法に準じて調製すればよい。 さらにまた、 このようにして調製された組 換えベクターを前述の本発明形質転換体調製方法に準じて宿主細胞に導入すること により形質転換体を調製することもできる。 本発明スプライシング変異体タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列の うち、 配列番号 7又は 8で示される塩基配列は、 プローブ又はプライマーとして本発 明スプライシング変異体タンパク質以外のさらなる肝臓 X受容体ひスプライシング変 異体タンパク質の探索ツールとして利用することが可能である。その長さは少なくと も 15個の連続する塩基を含む塩基配列であることが望ましい。プローブは慣用方法に より、 例えば、 放射性同位元素、 ジゴキシゲニン、 ピオチン、 検出可能な酵素等によ り標識できる。 例えば放射能ラベルされたリンを用いる場合、 cDNA断片を用レヽる場合 には、 ランダムプライミングラベルにより標識し、 また、 合成プライマーを使用する 場合はリン酸化酵素により 5'末端標識すると都合がよい。 このように標識したプロ一 ブを cDNAライブラリーとハイプリダイゼーシヨンしてクローニングを行う。ハイプリ ダイゼーシヨンは、 慣用された方法、 条件により行うことができる。 例えば、 1XSSC 、 0. 5 (w/v) SDS、 65 °Cでの洗浄である。 cDNAライプラリーは、 哺乳類を含む動物由 来のものであってもよいが、 特にヒトの糸且織 '細胞由来のものが望ましい。 本発明スプライシング変異体タンパク質を特異的に認識する抗体又は抗体の一部 を作製することができる。
配列番号 1、 2、 5又は 6で示されるアミノ酸配列を有する本発明スプライシング 変異体タンパク質を特異的に認識する抗体は、例えば、 前述の遺伝子組換えの通常の 方法により得られた本発明スプライシング変異体タンパク質又はその部分領域（ポリ ペプチド） 、或いは配列番号 5又は 6で示されるアミノ酸配列を有するペプチド断片 を用いて、 ゥサギ、 モルモット、 ラット、 マウス、 ャギ又はヒッジ等の通常抗体作成 に用いられる動物に免疫することにより得ることができる。 また、免疫した哺乳動物 の脾臓細胞とミエ口一マ細胞とを融合することによりモノクローナル抗体を得るこ ともできる。 これらの抗体を利用した、本発明スプライシング変異体タンパク質の存在有無を検 出する方法としては、例えば、本発明スプライシング変異体タンパク質若しくは本発 明ポリぺプチドを特異的に検出することができる抗体を用いた抗原抗体反応に基づ き前記肝臓 X受容体ひスプライシング変異体タンパク質を検出する工程を有する方法 をあげることができる。 さらに具体的には、 例えば、 本発明スプライシング変異体タ ンパク質若しくは本発明ポリぺプチドを特異的に検出することができる第一抗体を マイクロタイターゥエルに結合させる第一工程、生体試料中の本発明スプライシング 変異体タンパク質が、マイクロタイターゥエル上の前記第一抗体に結合させる第二ェ 程、 第二工程後、 マイクロタイターゥヱル内の全ての非結合状態にある （即ち、 遊離 の） 生体試料を除去する第三工程、 前記肝臓 X受容体 aスプライシング変異体タンパ ク質における、第一抗体とは異なるェピトープに結合することができる標識された第 二抗体を、 第一抗体に結合された肝臓 X受容体ひスプライシング変異体タンパク質に 結合させる第四工程、 第四工程後、 マイクロタイターゥエル内の全ての非結合状態に ある （即ち、 遊離の） 第二抗体を除去する第五工程、 第五工程後、 第二抗体の存在有 無を当該第二抗体が有する標識を指標にして検出する第六工程を有する本発明スプ ライシング変異体タンパク質の存在有無を検出する方法があげられる。 実施例
以下の実施例により、 本発明をさらに詳細に説明するが、 本発明はこれらの実施例 に限定されるものではない。 実施例 1 (月刊蔵 X受容体 αスプライシング変異体タンパク質遺伝子のクローニング )
ヒト各組織由来 cDNA (クロンテック社製 Multiple Tissue cDNA (MTC) Panels) を 錶型として、 ヒト肝臓 X受容体 α遺伝子のェクソン 4からェクソン 8までに相当する 領域を、 プログラム可能なサーマルサイクラ一を用いた PCR法により増幅した。 プラ イマ一は、 ヒト肝臓 X受容体 a遺伝子の塩基配列 （Willy et al.、 Genes Dev. 9： 10 33-1045、 1995 ; GenBank Accession number、 匪— 005693) に基づき、 ェクソン 4の センス鎖の塩基配列を有するプライマー （配列番号 9、 LXR a F) 、 及ぴェクソン 8の アンチセンス鎖の塩基配列を有するプライマー （配列番号 1 0、 LXR a R) を設計し、 化学合成した。 PCR法の反応条件は、 下記の通りであった。 . 1. 25 unitの Ex Taq DNA P olymerase (宝酒造社製）、 200 nmolのセンスプライマー LXR a F (配列番号 9 ) 、 200 nmolのアンチセンスプライマー LXR a R (配列番号 1 0 ) 及び鎵型である一本鎖 cDNA を含む 50 μ 1の反応液 （MgCl 2 、 デォキシリボヌクレオチド混合液を含む） を準備 した。 この反応液を、 95 °Cで 3分間熱変性した後、 94 °Cで 30秒間、 55 °Cで 30秒間及 ぴ 74 °Cで 60秒間を 1サイクルとして 35サイクルの反応に供した。 得られた PCR産物を '、 1°/。ァガロースゲルにて電気泳動し、 DNA断片の増幅を確認した後、 1 μ 1の PCR産物 を pGEM- T Easy vector (プロメガ社製） に TAクロー-ングシステムを用いてライゲー シヨンした。 ライゲーシヨンは、用いたキットにより推奨される方法に従って行われ た。 得られたライゲーシヨン反応液により、 大腸菌 JM109株のコンビテントセル （宝 酒造社製） 力 製造者により推奨される方法に従って形質転換された。 得られた菌体 を、 X- gal及びイソプロピル ]3 - D-ガラクトピラノシド （IPTG) が塗布された、 アンピ シリンを含む LB寒天培地上にまき、 これを 37 °Cで一晩培養した。 培養後、 当該寒天 培地上に形成されたアンピシリン耐性白色コロニーをアンピシリンを含む 3 mlの LB 液体培地に植菌し、 これを 37°Cで一晩培養して増殖させた。 増殖された大腸菌から、 プラスミド DNAを通常の方法に従い抽出し、 単離した。 単離されたプラスミド DNAを制 限酵素 Eco RIにより切断した後、 これを 1%ァガロースゲル電気泳動に供した。 電気 泳動後、 紫外線照射下で、 揷入された DNA断片の大きさを確認した。 さらに、 揷入さ れた DNA断片の塩基配列を決定した。 このようにして、肝臓 X受容体 αスプライシング 変異体タンパク質遺伝子がクロー-ングされた。 実施例 2 (肝臓 X受容体 αのパンドの同定：選択的スプライシング転写物の存在） 配列番号 9及ぴ 1 0で示される塩基配列のいずれかからなる、 肝臓 X受容体 C に特 異的なプライマー （1^ 0^及び1^¾ 0；1 を用い、 かつヒト正常組織又はヒトガン組織 由来の cDNA を铸型に用いて DNA断片の増幅を行った。 その結果を図 2に示す。 矢印に より示された 506塩基対からなるパンドは、公知である正常型肝臓 X受容体 α遺伝子に 由来する増幅パンドに相当した。 これ以外に、 PCRの反応条件を変化させても消失し ない 2種のバンド、即ちより低分子量のバンド及びより高分子量のバンドが存在する ことが明らかになった （図 2参照） 。 これらのパンドは、 肝臓 X受容体 αの選択的ス
"転写物が存在する可能性を示唆する。 実施例 3 (肝臓 X受容体ひスプライシング変異体タンパク質遺伝子のクローニング )
肝臓 X受容体 αに関連した PCR産物をクローユングし、 その塩基配列を決定した。 増 幅及ぴクローニングのための PCR用プライマーには、 実施例 1で用いられた、 センス プライマー （LXR a F、 配列番号 9 ) 及びアンチセンスプライマー （LXR a R、 配列番号 1 0 ) を用いた。 ヒト正常組織及ぴヒトガン組織由来の cDNAを鎵型として用いて PCR を行い、 得られた PCR産物を直接、 TAクローニング法により pGEM-T Easy vector (プ 口メガ社製） にライゲーシヨンした。 実施例 1と同様に、 揷入された DNA断片の大き さを確認した後、 さらに挿入された DNA断片の塩基配列を決定した。 その結果、 ヒト 正常組織由来の月刊蔵 X受容体"からェクソン 5にコードされるアミノ酸配列が欠失し た肝臓 X受容体 0；スプライシング変異体タンパク質 D5をコードする DNAに加えて、新た に 2つの新規な肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパク質 （イントロン 5にコ 一ドされるアミノ酸配列が挿入された肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパク 質及ぴィントロン 6内の一部領域にコードされるアミノ酸配列が挿入された肝臓 X受 容体 αスプライシング変異体タンパク質） にコードする DNAが存在することが明ら力、 となった。 実施例 4 (イントロン 5にコードされるァミノ酸配列が揷入された肝臓 X受容体 α スプライシング変異体タンパク質の同定）
イントロン 5にコードされるァミノ酸配列が揷入された肝臓 X受容体 aスプライシ ング変異体タンパク質をコードする翻訳領域全体を単離するために、新たに翻訳領域 全体を増幅できるようなプライマーを設計した。センスプライマーとして hLXRひ (0RF ) _F/H (配列番号 1 1 )及ぴアンチセンスプライマーとして hLXR a (0RF)— R/B (配列 番号 1 2 )を用いかつヒト肝臓由来 cDNA (クロンテック社製） を鎵型に用いて PCR法に より D NA断片の増幅を行った。 PCR法の反応条件は、 下記の通りであった。 1. 25 un itの Ex Taq DNA Polymerase (宝酒造社製）、 200 nmolのセンスプライマー hLXR a (OR F)— F/H (配列番号 1 1 )、 200 nmolのアンチセンスプライマー hLXR a (0RF)— RZB (配 列番号 1 2 )及び鎵型である一本鎖 cDNA (クロンテック社製の肝臓由来 cDNA) を含む 5 0 μ 1の反応液 （MgCl 2 、 デォキシリポヌクレオチド混合液を含む） を準備した。 こ の反応液を、 96 °Cで 3分間熱変性した後、 96 °Cで 30秒間、 55 °Cで 30秒間及び 72 °C で 90秒間を 1サイクルとして 35サイクルの反応に供した。 得られた PCR産物の一部を、 臭化工チジゥムを含む 1%ァガロースゲルにて電気泳動し、 DNA断片の増幅を確認した 後、 1 At 1の PCR産物を PGEM_T Easy vector (プロメガ社製） に TAクローユングシス テムを用いてライゲーシヨンした。 ライゲーシヨンは、 用いたキットにより推奨され る方法に従って行われた。 得られたライゲーシヨン反応液により、 大腸菌 JM109株の コンビテントセル （宝酒造社製） ί 製造者により推奨される方法に従って形質転換 された。 得られた菌体を、 X_gal及ぴィソプロピル β - D-ガラタトピラノシド （IPTG) が塗布されたアンピシリンを含む LB寒天培地上にまき、 これを 37 °Cでー晚培養した 。 培養後、 当該寒天培地上にアンピシリン耐性白色コロニーを形成した形質転換体を 用いてコロニー PCRを行うことにより、イントロン 5が揷入された肝臓 X受容体 αスプ ライシング変異体タンパク質をコードする翻訳領域全体を含むクローンの検出を行 つた。 コロニー PCR法の反応条件は下記の通りであった。 センスプライマーとして LXR ひ F (配列番号 9 )、 アンチセンスプライマーとしてイントロン 5内の塩基配列に基づ き設計された特異的プライマー LXR a 5 Α— R (配列番号 1 3 )を用いた。 これら 2種の プライマー、 Ex Taq DNA Polymerase (宝酒造社製）、及ぴ 200 nMデォキシリボヌクレ ォチド混合液を含む反応液を準備した。 これに、 プレートから採取されたわずかな量 の上記の白色を呈する形質転換体を懸濁した後、 この反応液を 95 °Cで 5分間熱変性し た後、 94 °Cで 30秒間、 55 °Cで 30秒間及ぴ 74 °Cで 30秒間を 1サイクルとして 25サイク ルの反応に供した。 得られた PCR産物を臭化工チジゥムを含むァガロースゲルにて電 気泳動し、 D N A断片の増幅を確認した後、 D N A断片の増幅が確認された形質転換 体からプラスミドを抽出した。 当該プラスミド中に挿入された DNA断片の塩基配列を 確認することにより、 イントロン 5が揷入された肝臓 X受容体ひスプライシング変異 体タンパク質を含む翻訳領域全体を含むクローンを得た。 当該肝臓 X受容体 "スブラ イシング変異体タンパク質は、 正常型肝臓 X受容体ひに、 イントロン 5にコードされ るアミノ酸配列が挿入されており、肝臓 X受容体ひスプライシング変異体タンパク質 5 Aと命名された。 図 1は、 ヒ ト正常型肝臓 X受容体ひをコードする翻訳領域と肝臓 X受 容体 αスプライシング変異体タンパク質 5Αをコードする翻訳領域との比較を表して いる。 ヒト正常型肝臓 X受容体 aをコードする翻訳^域と比較して、肝臓 X受容体 aス プライシング変異体タンパク質 5Αをコードする翻訳領域の相違点は、イントロン 5が 翻訳領域に含まれる点のみであり、 その他の塩基配列には違いは認められなかった。 イントロン 5がェクソン 5と 6との間に新たな翻訳領域として挿入されても、揷入さ れる塩基（配列番号 7 )の数が 192個（配列番号 5で示される 64アミノ酸をコードする） 、 即ち 3の倍数であることから、 ェクソン 6以降の読み枠は正常型と全く同じであつ た。 肝臓 X受容体ひスプライシング変異体タンパク質 5Αをコードする翻訳領域に由来 するアミノ酸配列は、 511アミノ酸 （1533塩基） 力 らなるタンパク質となる。 肝臓 X受 容体 αスプライシング変異体タンパク質のアミノ酸配列のうち、イントロン 5にコー ドされるアミノ酸配列 （配列番号 5 ) の相同性を、 ゲノムデータベース及ぴタンパク 質データベースを用いて検索したところ、 30%を超える相同性を有するァミノ酸配列 はデータベースに存在しないことが判った。 このことから、 月刊蔵 X受容体 αスプライ シング変異体タンパク質の、 イントロン 5にコードされるァミノ酸配列 （配列番号 5 ) は新規であることが確認された。 実施例 5 (ェクソン 6の下流に付加された新規な塩基配列 （109塩基） を含む、 肝 臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパク質をコードする翻訳領域の同定）
イントロン 6内の一部領域が挿入された、 肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タ ンパク質をコードする翻訳領域全体を単離するために、 実施例 4と同様に、 センスプ ライマーとして hLXR o; (0RF)— F/H (配列番号 1 1 )及びアンチセンスプライマーとし て hLXR o; (0RF)— RZB (配列番号 1 2 )を用い、 かつヒト肝臓由来 cDNA (クロンテック 社製） を铸型に用いて PCR法により D NA断片の増幅を行った。 PCR法の反応条件は、 下記の通りであった。 LA Taq DNA Polymerase (宝酒造社製） 、 200 nmolのセンスプライマー、 200 nmolのアンチセンスプライマー及び铸型である一 本鎖 cDNA (クロンテック社製の肝臓由来 cDNA) を含む 50 μ 1の反応液 （MgCl 2 、 デ ォキシリボヌクレオチド混合液を含む） を準備した。 この反応液を、 96 °Cで 3分間熱 変性した後、 96 °Cで 30秒間、 55 °Cで 3り秒間及ぴ 72 °Cで 90秒間を 1サイクルとして 35 サイクルの反応に供した。 得られた PCR産物の一部を、 臭化工チジゥムを含むァガロ ースゲルにて電気泳動し、 DNA断片の増幅を確認した後、 PCR産物を pGEM- T Easy vect or (プロメガ社製） に TAクローニングシステムを用いてライゲーシヨンした。 ライゲ ーシヨンは、用いたキットにより推奨される方法に従って行われた。 得られたライゲ ーシヨン反応液により、 大腸菌 JM109株のコンビテントセル （宝酒造社製） 1 製造 者により推奨される方法に従って形質転換された。 得られた菌体を、 X - gal及びイソ プ口ピル β - D-ガラクトビラノシド （IPTG) が塗布されたアンピシリンを含む LB寒天 培地上にまき、 これを 37 °Cで一晩培養した。 培養後、 当該寒天培地上にアンピシリ ン耐性白色コロニー形成した形質転換体を用いてコ口ニー PCRを行うことにより、 ィ ントロン 6が挿入された月刊蔵 X受容体ひスプライシング変異体タンパク質をコードす る翻訳領域全体を含むクローンの検出を行った。 コロニー PCR法の反応条件は下記の 通りであった。 センスプライマーとして LXR a F (配列番号 9 )、 アンチセンスプライマ 一としてイントロン 6内の塩基配列に基づき設計された特異的プライマー LXR a 6 A 一 R (配列番号 14)を用いた。 これら 2種のプライマー、 Ex Taq DNA Polymerase (宝酒 造社製）、 及ぴ 200 nMデォキシリボヌクレオチド混合液を含む 30 μ 1の反応液を準備 した。 これに、 プレートから採取されたわずかな量の上記の白色を呈する形質転換体 を懸濁した後、 この反応液を 95 °Cで 5分間熱変性した後、 94 °Cで 30秒間、 55 °Cで 30 秒間及び 74 °Cで 30秒間を 1サイクルとして 25サイクルの反応に供した。 得られた PCR 産物を臭化工チジゥムを含むァガロースゲルにて電気泳動し、 D NA断片の増幅を確 認した後、 D NA断片の増幅が確認された形質転換体からプラスミドを抽出した。 当 該プラスミド中に挿入された DNA断片の塩基配列を確認することにより、 イントロン 6内の一部領域が挿入された肝臓 X受容体 スプライシング変異体タンパク質を含む 翻訳領域全体を含むクローンを得た。 当該肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タン パク質は、 イントロン 6内の一部領域の塩基配列 （即ち、 ェクソン 6 Aと呼ばれる塩 基配列）がェクソン 6の下流に挿入された翻訳領域によりコードされることを表すた め、 肝臓 X受容体ひスプライシング変異体タンパク質 6Aと命名された。 図 1は、 ヒ ト 正常型肝臓 X受容体 αをコードする翻訳領域と肝臓 X受容体 aスプライシング変異体 タンパク質 6Αをコードする翻訳領域との比較を表している。 ヒ ト正常型肝臓 X受容体 αをコードする翻訳領域と比較して、 肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパク 質 6Αをコードする翻訳領域の相違点は、イントロン 6の一部領域が翻訳領域に含まれ る点のみであり、 その他の塩基配列には違いは認められなかった。 イントロン 6の塩 基配列のうち、 109塩基対 （配列番号 8 ) からなる領域がェクソン 6と 7との間に新 たな翻訳領域として挿入されると、途中に新たな停止コドンが出現することから、結 局、 新たな 26アミノ酸 （配列番号 6 ) がェクソン 6にコードされるアミノ酸配列の下 流につながることとなる。 つまり、 356アミノ酸からなる新たなポリペプチド （配列 番号 2 ) が産生される。 肝臓 X受容体ひスプライシング変異体タンパク質のアミノ酸 配列のうち、 イントロン 6の一部領域にコードされるァミノ酸配列 （配列番号 6 ) の 相同性を、ゲノムデータベース及びタンパク質データベースを用いて検索したところ 、 30%を超える相同性を有するァミノ酸配列はデータベースに存在しないことが判つ た。 このことから、 肝臓 X受容体 aスプライシング変異体タンパク質のイントロン 6 の一部領域にコードされるアミノ酸配列 （配列番号 6 ) は新規であることが確認され た。 実施例 6 (ヒト組織における 3種類の肝臓 X受容体ひスプライシング変異体タンパ ク質遺伝子の転写物の存在）
本発明により見い出された 3つの肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパク質 がヒト正常組織及ぴヒトガン組織由来の RNA中に存在するのかを確認する。 各々の肝 S蔵 X受容体 αスプライシング変異体タンパク質を特異的に増幅させる、 配列番号 9、 1 0、 1 3及ぴ 1 4で示される塩基配列のいずれかからなるプライマーを用いかつヒ ト正常組織及びヒトガン組織由来の cDNAを铸型に用いて PCRを行った。 当該 PCRにおい て、 プライマーとして LXR a F (配列番号 9 ) 及ぴ LXR CK R (配列番号 1 0 ) を用いる場 合には、正常型肝臓 X受容体 α由来の D NA断片の増幅は 506塩基対を有する D NA断 片の増幅となり、肝臓 X受容体ひ D5由来の D Ν Α断片の増幅は 416塩基対を有する D N A断片の増幅となる。 一方、 月刊蔵 X受容体ひスプライシング変異体タンパク質 5Aを特 異的に増幅させる、配列番号 9で示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号 1 3で示される塩基配列からなるプライマーを用い上記と同様に PCRを行うと、肝臓 X 受容体 αスプライシング変異体タンパク質 5Α由来の D Ν Α断片の増幅は 432塩基対を 有する D NA断片の増幅となり、 また、 肝臓 X受容体 aスプライシング変異体タンパ ク質 6Aを特異的に増幅させる配列番号 9で示される塩基配列からなるプライマー及 ぴ配列番号 1 4で示される塩基配列からなるプライマーを用い上記と同様に PCRを行 うと、肝臓 X受容体 aスプライシング変異体タンパク質 6A由来の D N A断片の増幅は 4 28塩基対を有する D N A断片の増幅となる。 尚、 コントローノレとして、 試薬中の DNA 混入をチェックするために、 錶型 DNA非存在.の PCRを行った。 その結果を図 2、 図 3及ぴ 図 4に示した。
これらの図から明らかなように、
1 ) 正常型肝臓 X受容体 はいずれのヒト正常組織及ぴヒトガン組織においても発現 していた。
2 ) 肝臓 X受容体 スプライシング変異体タンパク質 5Aは、 一部のヒトガン組織にお いて発現していた。
3 ) 肝臓 X受容体 aスプライシング変異体タンパク質 6Aは、 ヒ ト循環器系組織におい て高発現していた。
4 ) 肝臓 X受容体 "スプライシング変異体タンパク質 D5は、 ヒトガン組織において高 レベルに発現していた。
尚、 コントロールは常に陰性であった。 これらの結果は各々の肝臓 X受容体 aスプラ イシング変異体タンパク質が、組織特異的に発現していることを示しており、 特異的 な発現制御を受けていることが判明した。 実施例 7 (肝臓 X受容体 aスプライシング変異体タンパク質発現べクターの構築） 正常型肝臓 X受容体 a及び 3種類の肝臓 X受容体 aスプライシング変異体タンパク質 が各々クロー-ングされたプラスミドを、製造者により推奨された方法に従って、 制 限酵素 Hind ΠΙ及ぴ BamH Iで切断した。当該酵素による処理液をァガロースゲル電気 泳動に供し、 ゲルからインサート DNAに相当する D N A断片を回収した。 回収された D N A断片は、あらかじめ Hind III及ぴ BamH Iで切断しておいた pFLAG- CMV2 (シグマ） にクローニングした。 Hind III及び BamlH Iで切断しておいた pFLAG- CMV2 (約 300 ng ) と上記のインサート DNA (約 500 ng) とを混合した後、 これに T4リガ一ゼを添カロし 、 当該混合物を 16 °Cで 30分間のライゲーシヨンを行った。 ライゲーシヨンは、 用い たキットにより推奨される方法に従って行われた。得られたライゲーシヨン反応液に より、 大腸菌 JM109株のコンビテントセル （宝酒造社製） 力 製造者により推奨され る方法に従って形質転換された。 得られた菌体を、 X- gal及ぴィソプロピル - D-ガラ タトビラノシド （IPTG) が塗布されたァンピシリンを含む LB寒天培地上にまき、 これ を 37 °Cで一晩培養した。 培養後、 当該寒天培地上に形成されたアンピシリン耐性白 色コロニーからプラスミ ド DNAを調製した。 さらに揷入された D N A断片の塩基配列 を決定した。 得られた塩基配列を、 前述のダイレクトシークェンスで得られた塩基配 列と比較して、翻訳領域の塩基配列が完全に一致していることが確認されたプラスミ ドを選択し、 各々のプラスミドを PCMV2- hLXR a WT、 pCMV2- hLXR a 5A、 pCMV2- hLXR a 6A 、 pCMV2-hLXR a D5と命名した。 実施例 8 (肝臓 X受容体 aの結合配列を有するルシフェラーゼレポータ一遺伝子を 含むプラスミ ドの作製）
マウスメタ口チォネィン I遺伝子の TATAボックス近傍の塩基配列とリーダー配列に 由来する塩基配列からなる 2本のオリゴヌクレオチド、 即ち、配列番号 1 5で示され る塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号 1 6で示される塩基配列からな るオリゴヌクレオチドとをアニーリングさせて 2本鎖 D N Aとし、 これに T 4ポリヌク レオチドキナーゼを作用させて、 その両末端をリン酸ィヒした （以下、 当該 D N Aを TA TA DNAと記す） 。 一方、 ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミド pGL3- Basicベ クタ一（プロメガ社製） を制限酵素 Bgl II及び Hind IIIで消化した後、 これに細菌由 来アルカリフォスファターゼ （BAP)を加えて 65°Cで 1時間保温した。 次いで、 当該保 温液を低融点ァガロース （Agarose L；二ツボンジーン社製） を用いた電気泳動に供 した後、 検出されたバンド部分のゲルから D NA断片を回収した。 回収された約 100 ngの D NA断片と、 約 1 gの前記の TATA DNAとを混合し、 T4リガーゼで結合させ ることによりプラスミド pGL3- TATAを作製した。
肝臓 X受容体 の結合配列 （LXRE) を含むヒ トチトク口ーム P450ファミリーのコレ ステロール 7 α -ヒドロキシラーゼ （CYP7A1) 遺伝子上流の塩基配列 （配列番号 1 7 )からなるオリゴヌクレオチド及び当該塩基配列と相補性を有する塩基配列からなる オリゴヌクレオチド （配列番号 1 8 ) を合成し、 これらをアニーリングさせて 2本鎖 D ΝΑ (以下、 LXRE DNAと記す。 ) とした後、 これに T4リガーゼを作用させることにより 、 LXRE DNAをタンデムに結合させた。 得られた D NA断片に T4ポリヌクレオチドキナ ーゼを作用させてその両末端をリン酸化することにより、 リン酸化タンデム結合型 DN A断片を得た。
次に、 pGL3- TATAを制限酵素 Mlu Iで消化した後、 大腸菌由来アルカリホスファタ一 ゼを加えて 65 °Cで 1時間保温した。当該保温液を低融点ァガロースゲル電気泳動に供 した後、 検出されたパンド部分のゲルから DNA断片を回収した。 回収された約 100 ng の D NAと、 約 1 μ §の上記のリン酸化タンデム結合型 DNA断片とを混合した後、 こ れに T4リガーゼを添カ卩し、 当該混合物を 16°Cで 30分間のライゲーシヨンを行った。 ラ ィゲーシヨンは、 用いたキットにより推奨される方法に従って行われた。 得られたラ ィゲーシヨン反応液により、 大腸菌 DH5ひコンビテントセル （宝酒造社製） 力 製造 者により推奨される方法に従って形質転換された。 得られた菌体を、 X - gal及ぴイソ プ口ピル β - D -ガラタトピラノシド （IPTG) が塗布されたアンピシリンを含む LB寒天 培地上にまき、 これを 37 °Cで一晩培養した。 培養後、 当該寒天培地上に形成された アンピシリン而村生白色コロニーからプラスミド DNAを調製した。 さらに挿入された D N A断片の塩基配列を決定した。 得られた塩基配列から、 pGL3-TATAの Mlul部位に LXR E DNAがタンデムに 4つ結合されてなる DNA断片を有するプラスミドを選択し、 これを プラスミド pGL3-TATA- LXREx4と命名した。 実施例 9 (一過性発現系におけるレポーターァッセィによる肝臓 X受容体 ο;スプラ ィシング変異体タンパク質の機能評価）
ヒ ト胎児腎臓由来 HEK293細胞株 (ATCC; CRL- 1573) を、 チヤコールデキストランに より低分子物質を除去した牛胎児血清 (FBS) 10%と抗生物質としてペニシリン （100 u nit/ml) とストレプトマイシン （100 μ g/ml) とを含み、 フエノールレッドを含まな いダルベッコ改変イーグル培地 （DMEM) において 5% C02存在下 37 °Cにて継代培養し た。 継代培養された HEK293細胞株を 10cm細胞培養用ディッシュに約 2 X 106個になる ように捲いた。 これを 37 °Cで 1日間培養した後、 当該細胞に、 Effectene (キアゲン 社製） を用いて当該キットが推奨する方法に従って、各々 1 μ gの正常型肝臓 X受容体 α及ぴヒ ト肝臓 X受容体ひスプライシング変異体タンパク質発現プラスミ ドとレポ一 タープラスミド pGL3- TATA LXRE x4とを導入した。 これを 37 °Cで 24時間培養した後、 当該細胞をピペッティングにより回収した。 回収された細胞を均一懸濁した後、 これ を 96穴プレートに播種した。 さらに、 当該プレートにエタノールで溶解しておいた各 種の化合物が添カ卩された。 これを 37 °Cでさらに約 2日間培養した後、 当該プレートに 5倍に希釈された細胞溶解剤 PGC50 (二ツボンジーン社製） を 50 ^ l/wellずつ加えて 、 時々軽くゆすりながら室温で 30分間放置することにより、 細胞を溶解させた。 この ようにして調製された細胞溶解液を 10 μ 1ずつ 96穴白色サンプルプレート （ベルトー ルドネ土製） に採取し、 ルミノメーター LB96p (ベルトールド社製） で 50 μ ΐ/wellずつ 酵素基質液 PGL100 (二ツボンジーン社製） を添加し、 直ちに発光量を 5秒間測定した 正常型肝臓 X受容体 α又は肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパク質に対す る各種肝臓 X受容体 αリガンド（ァゴニスト）の測定結果をそれぞれ図 5及ぴ 6に示し た。 産業上の利用の可能性
本発明により、 正常型肝臓 X受容体ひによる正常なコレステロール代謝の阻害に関 与する新規な肝臓 X受容体 αのァイソフォームである肝臓 X受容体 αスプライシング 変異体タンパク質、 その遺伝子及ぴそれらの利用が提供可能となる。 配列表フリーテキスト
配列番号 9
P C Rのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号 10
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号 11
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一
配列番号 12
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一
配列番号 13
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一
配列番号 14
P C Rのために設計されたォリゴヌクレオチドプライマー
配列番号 15
プロモーター DNAを合成するために設計されたオリゴヌクレオチド 配列番号 16
プロモーター DNAを合成するために設計されたオリゴヌクレオチド 配列番号 17
肝臓 X受容体結合エレメントを合成するために設計されたオリゴヌクレオチド 配列番号 18
肝臓 X受容体結合エレメントを合成するために設計されたオリゴヌクレオチド

Claims

請求の範囲
1 . 肝臓 X受容体 aのァイソフォームであって、 肝臓 X受容体 α遺伝子のェクソン 5に コードされるアミノ酸配列を少なくとも有する、 肝臓 X受容体ひスプライシング変異 体タンパク質。
2 . 肝臓 X受容体ひのアイソフォームであって、肝臓 X受容体 α遺伝子のイントロン 5 にコードされるァミノ酸配列が含まれてなる、 肝臓 X受容体 スプライシング変異体
3 . 下記のいずれかのァミノ酸配列を有することを特徴とする請求項 2記載の肝臓 X 受容体 スプライシング変異体タンパク質。
( 1 ) 配列番号 1で示されるアミノ酸配列
( 2 ) 配列番号 1で示されるァミノ酸配列と実質的に同一のァミノ酸配列
( 3 ) 配列番号 1で示されるアミノ酸配列に対して、 95%以上のアミノ酸同一性を有 するアミノ酸配列
4 . 肝臓 X受容体 のァイソフォームであって、肝臓 X受容体ひ遺伝子のイントロン 6 内の一部領域にコードされるアミノ酸配列が含まれてなる、 肝臓 X受容体ひスプライ シング変異体タンパク質。
5 . 下記のいずれかのァミノ酸配列を有することを特徴とする請求項 4記載の肝臓 X 受容体 αスプライシング変異体タンパク質。
( 1 ) 配列番号 2で示されるアミノ酸配列
( 2 ) 配列番号 2で示されるァミノ酸配列と実質的に同一のァミノ酸配列
( 3 ) 配列番号 2で示されるアミノ酸配列に対して、 95%以上のアミノ酸同一性を有 するアミノ酸配列
6 . 正常型肝臓 X受容体 が有する、 リガンドによる転写活性ィ匕能と比較して、 弱い 転写活性化能を有することを特徴とする請求項 1〜 5のいずれかに記載の肝臓 X受容 体 αスプライシング変異体タンパク質。
7 . 請求項 3記載の肝臓 X受容体ひスプライシング変異体タンパク質のァミノ酸配列 をコードする塩基配歹 U、 又は当該塩基配列に相補性を有する塩基配列、 を有するポリ ヌクレオチド。
8 . 配列番号 3で示される塩基配列、 又は当該塩基配列に相補性を有する塩基配列、 を有するポリヌクレオチド。
9 . 請求項 5記載の肝臓 X受容体 o;スプライシング変異体タンパク質のアミノ酸配列 をコードする塩基配列、 又は当該塩基配列に相補性を有する塩基配列、 を有するポリ ヌクレオチド。 ·
1 0 . 配列番号 4で示される塩基配列、又は当該塩基配列に相補性を有する塩基配列 、 を有するポリヌクレオチド。
1 1 .請求項 1記載の肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパク質の部分ポリぺプ チドであって、請求項 1記載の肝臓 X受容体ひスプライシング変異体タンパク質のァミ ノ酸配列のうち、 正常型肝臓 X受容体ひには存在しないアミノ酸配列からなる、 ポリ ぺプチド。
1 2 . 下記のいずれかのアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項 1 1記載のポ リぺプチド。
( 1 ) 配列番号 5で示されるアミノ酸配列
( 2 ) 配列番号 6で示されるアミノ酸配列
1 3 . 請求項 1 2記載のポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列、 又は当 該塩基配列に相補性を有する塩基配列、 を有するポリヌクレオチド。
1 4 . 配列番号 7で示される塩基配列、 又は当該塩基配列に相補性を有する塩基配列 、 を有するポリヌクレオチド。
1 5 . 配列番号 8で示される塩基配列、 又は当該塩基配列に相補性を有する塩基配列 、 を有するポリヌクレオチド。
1 6 . 請求項 1乃至 6記載のいずれかの肝臓 X受容体ひスプライシング変異体タンパ ク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド、又は請求項 7 乃至 1 0記載のいずれかのポリヌクレオチド、 を含有する組換えベクター。
1 7 . 請求項 1乃至 6記載のいずれかの肝臓 X受容体ひスプライシング変異体タンパ ク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド、又は請求項 7 乃至 1 0記載のいずれかのポリヌクレオチド、が宿主細胞に導入されてなる形質転換 体。
1 8 . 請求項 1乃至 6記載のいずれかの肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパ ク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド、又は請求項 7 乃至 1 0記載のいずれかのポリヌクレオチドを、宿主細胞中で自立複製可能なベクタ 一に導入する工程を有するベクターの製造方法。
1 9 . 請求項 1 7記載の形質転換体を培養して、 肝臓 X受容体ひスプライシング変異 体タンパク質を産生させる工程を有する、 肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タン パク質の製造方法。
2 0 . 請求項 1乃至 6記載のいずれかの肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパ ク質のァミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド、又は請求項 7 乃至 1 0記載のいずれかのポリヌクレオチドを発現する能力を欠損させてなる遺伝 子欠損動物。
2 1 .請求項 1 1乃至 1 2記載のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列をコードす る塩基配列を有するポリヌクレオチド、又は請求項 1 3乃至 1 5記載のいずれかのポ リヌクレオチドを含有する組換えベクター。
2 2 .請求項 1 1乃至 1 2記載のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列をコードす る塩基配列を有するポリヌクレオチド、又は請求項 1 3乃至 1 5記載のいずれかのポ リヌクレオチドが宿主細胞に導入されてなる形質転換体。
2 3 . 肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパク質に被験物質を接触させる工程 、 当該肝臓 X受容体ひスプライシング変異体タンパク質の変化を測定する工程を有す る、 肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパク質に作用する物質のスクリーニン グ方法。
2 4 . 肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパク質が、 請求項 1乃至 6記載のい ずれかの肝臓 X受容体 スプライシング変異体タンパク質である、 請求項 2 3記載の スクリーニング方法。
2 5 . S刊蔵 X受容体 αスプライシング変異体タンパク質を産生する細胞に被験物質を 接触させる工程、 前記細胞において当該肝臓 X受容体 Q；スプライシング変異体タンパ ク質により発現調節を受ける他のタンパク質の産生量を測定する工程、及び前記産生 量に基づき被験物質の肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパク質タンパク質に 対する作用性を評価する工程を有する、 肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパ ク質に作用する物質のスクリーニング方法。
2 6 . 肝臓 X受容体 o;スプライシング変異体タンパク質が、 請求項 1乃至 6記載のい ずれかの肝臓 X受容体ひスプライシング変異体タンパク質である、 請求項 2 5記載の スクリーニング方法。
2 7 . 肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパク質を産生する細胞に、 前記肝臓 X 受容体 αスプライシング変異体タンパク質のリガンドを接触させ、 当該肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパク質により発現調節を受ける他のタンパク質の産生 量を測定する第一工程、 肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパク質を産生する 細胞に、 前記肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパク質のリガンド及び被験物 質の両者を接触させ、 当該肝臓 X受容体 スプライシング変異体タンパク質により発 現調節を受ける他のタンパク質の産生量を測定する第二工程、 及び、 前記第一工程と 前記第二工程とで測定された前記他のタンパク質の産生量の差異に基づき被験物質 の前記リガンドに対する拮抗作用性を評価する工程を有する、 肝臓 X受容体 ο;スプラ イシング変異体タンパク質に作用する物質のスクリーニング方法。
2 8 . 肝臓 X受容体《スプライシング変異体タンパク質が、 請求項 1乃至 6記載のい ずれかの肝臓 X受容体 aスプライシング変異体タンパク質である、 請求項 2 7記載の スクリーニング方法。
2 9 . 請求項 2 3乃至 2 8記載のスクリーニング方法により選択された肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパク質に作用する物質。
3 0 . 肝臓 X受容体 スプライシング変異体タンパク質に作用する請求項 2 9記載の 物質に対する拮抗物質。
3 1 . 請求項 1乃至 6記載のいずれかの肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパ ク質を特異的に認識する抗体又は抗体の一部。
3 2 .請求項 7乃至 1 0記載のいずれかのポリヌクレオチドに基づき設計されてなる プライマー。
3 3 . 遺伝子治療法のための、 請求項 1 3乃至 1 5記載のいずれかのポリヌクレオチ ドが有する塩基配列に対する特異的 DNAプローブの使用。
3 4 . 遺伝子治療法のための、 請求項 1 3乃至 1 5記載のいずれかのポリヌクレオチ ドが有する塩基配列に対する特異的 RNAプローブの使用。
3 5 . 請求項 1乃至 6記載のいずれかの肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパ ク質の存在有無を検出する方法であって、 生体試料中のメッセンジャー RNA (mRNA) 力 ら相補的 DNA (cDNA) を合成する第一工程、 請求項 1乃至 6記載のいずれかの肝臓 X 受容体ひスプライシング変異体タンパク質若しくは請求項 1 1乃至 1 2記載のいず れかのポリべプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチ ド又は請求項 1 3乃至 1 5記載のいずれかのポリヌクレオチド、に対応する前記相捕 的 DNA (cDNA) の部分領域を増幅する第二工程、 及び増幅された部分領域を検出する 第三工程を有する方法。
3 6 . 第二工程において、 配列番号 9、 配列番号 1 0、 配列番号 1 1、 配列番号 1 2 、配列番号 1 3又は配列番号 1 4で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドから 選択される 1つ又は複数をプライマーとして用いる PCR法により増幅する、請求項 3 5 記載の方法。
3 7 . 請求項 1乃至 6記載のいずれかの肝臓 X受容体 スプライシング変異体タンパ ク質若しくは請求項 1 1乃至 1 2記載のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列を コードする塩基配列を有するポリヌクレオチド又は請求項 1 3乃至 1 5記載のいず れかのポリヌクレオチド力 配列番号 7又は 8で示される塩基配列を有するポリヌク レオチドである、 請求項 3 5記載の方法。
3 8 . 請求項 1乃至 6記載のいずれかの肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパ ク質の存在有無を検出する方法であって、 請求項 1乃至 6記載のいずれかの肝臓 X受 容体ひスプライシング変異体タンパク質若しくは請求項 1 1乃至 1 2記載のいずれ かのポリぺプチドを特異的に検出することができる抗体を用いた抗原抗体反応に基 づき前記肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパク質を検出する工程を有する方 法。
3 9 . 請求項 1乃至 6記載のいずれかの肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパ ク質の存在有無を検出する方法であって、 請求項 1乃至 6記載のいずれかの肝臓 X受 容体 αスプライシング変異体タンパク質若しくは請求項 1 1乃至 1 2記載のいずれ 力のポリぺプチドを特異的に検出することができる第一抗体をマイクロタイターゥ エルに結合させる第一工程、 生体試料中の請求項 1乃至 6記載のいずれかの肝臓 X受 容体 αスプライシング変異体タンパク質が、マイクロタイターゥエル上の前記第一抗 体に結合させる第二工程、 第二工程後、 マイクロタイターゥヱル内の全ての非結合状 態にある生体試料を除去する第三工程、 前記肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タ ンパク質における、第一抗体とは異なるェピトープに結合することができる標識され た第二抗体を、 第一抗体に結合された肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパク 質に結合させる第四工程、 第四工程後、 マイクロタイターゥヱル内の全ての非結合状 態にある第二抗体を除去する第五工程、 第五工程後、 第二抗体の存在有無を当該第二 抗体が有する標識を指標にして検出する第六工程を有する方法。
4 0 . コレステロール代謝異常を調べるためのマーカーとしての、 肝臓 X受容体 αス プライシング変異体タンパク質の使用。
4 1 . 肝臓 X受容体 aスプライシング変異体タンパク質が、 請求項 2、 3、 4、 5又 は 6記載の肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパク質、 或いは、肝臓 X受容体 のァイソフォームであって、 肝臓 X受容体 α遺伝子のェクソン 5にコードされるアミ ノ酸配列が欠失してなる肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパク質であること を特徴とする請求項 4 0記載の使用。
4 2 . ガン細胞の存在を調べるためのマーカーとしての、 肝臓 X受容体 αのアイソフ オームであって、 肝臓 X受容体 α遺伝子のェクソン 5にコードされるアミノ酸配列が 欠失してなる、 肝臓 X受容体 スプライシング変異体タンパク質の使用。
4 3 . コレステロール代謝異常を調べるためのマーカーとしての、 肝臓 X受容体ひス プライシング変異体タンパク質のァミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリ ヌクレオチドの使用。
4 4 . 肝臓 X受容体 αスプライシング変異体タンパク質のァミノ酸配列をコードする 塩基配列を有するポリヌクレオチドが、 請求項 7乃至 1 0、 又は 1 3乃至 1 5記載の ポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項 4 3記載の使用。
4 5 . ガン細胞の存在を調べるためのマーカーとしての、 肝臓 X受容体 αのアイソフ オームであって、 肝臓 X受容体 a遺伝子のェクソン 5にコードされるァミノ酸配列が 欠失してなる、 肝臓 X受容体 スプライシング変異体タンパク質のァミノ酸配列をコ 一ドする塩基配列を有するポリヌクレオチドの使用。
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