JP4344928B2 - ヒスタミン受容体h3常活性変異体およびその利用 - Google Patents
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Description
〔1〕H3受容体の常活性変異体、
〔2〕H3受容体の内部ドメイン3のC末端側に存在する活性化調節部位の少なくとも1つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換した、〔1〕に記載の常活性変異体、
〔3〕配列番号:1または配列番号:3に記載のアミノ酸配列における352番目、353番目、354番目または357番目の少なくとも一つの部位に相当する部位のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換した、〔1〕または〔2〕に記載の常活性変異体、
〔4〕H3受容体の活性化調節部位のアミノ酸残基の置換が、下記(a)または(b)である、〔1〕または〔2〕に記載の常活性変異体、
(a)ヒトH3受容体において、RDRKVAKから、KDHKVLK、RARKVAK、RDRKVIK、または、RDRKVKKへの置換
(b)マウス、ラットまたはモルモットH3受容体において、RDKKVAKから、KDHKVLK、RAKKVAK、RDKKVIK、もしくは、RDKKVKKへの置換
〔5〕下記(a) 〜(c)の少なくとも一つに記載のアミノ酸置換を含む、〔1〕または〔2〕に記載の常活性変異体、
(a)配列番号:1に記載のアミノ酸配列において少なくとも、357番目のAからKまたはIへの置換
(b)配列番号:1に記載のアミノ酸配列において少なくとも、353番目のDからAへの置換
(c)配列番号:1に記載のアミノ酸配列において少なくとも、352番目のRからK、354番目のKからH、および、357番目のAからLへの置換
〔6〕下記(a) 〜(c)の少なくとも一つに記載のアミノ酸置換を含む、〔1〕または〔2〕に記載の常活性変異体、
(a)配列番号:3に記載のアミノ酸配列において少なくとも、357番目のAからKまたはIへの置換
(b)配列番号:3に記載のアミノ酸配列において少なくとも、353番目のDからAへの置換
(c)配列番号:3に記載のアミノ酸配列において少なくとも、352番目のRからK、354番目のRからH、および、357番目のAからLへの置換
〔7〕〔1〕〜〔6〕のいずれかに記載の常活性変異体をコードするDNA、
〔8〕〔7〕に記載のDNAが挿入されたベクター、
〔9〕〔7〕に記載のDNAまたは〔8〕に記載のベクターを保持する形質転換細胞、
〔10〕被験化合物がH3受容体の常活性変異体の活性を変化させるか否かを評価する方法であって、
(a)H3受容体の常活性変異体を発現している細胞に被験化合物を接触させる工程、
(b)該細胞における常活性変異体の活性を検出する工程、
を含み、上記活性が、被験化合物を接触させないときに比べ増加または減少している場合に、被験化合物が、上記常活性変異体の活性を変化させると判定される方法、
〔11〕cAMP濃度の変化、カルシウム濃度の変化、G蛋白質の活性の変化、ホスホリパーゼCの活性の変化、または、pHの変化を指標に常活性変異体の活性を検出する、〔10〕に記載の方法、
〔12〕以下の(a)および(b)の工程を含む、H3受容体の常活性変異体の活性を変化させる医薬品候補化合物のスクリーニング方法、
(a)〔10〕または〔11〕に記載の方法により、複数の被験化合物について、H3受容体の常活性変異体の活性を変化させるか否かを評価する工程
(b)複数の被験化合物から、該常活性変異体の活性を変化させると評価された化合物を選択する工程
〔13〕医薬品候補化合物がH3受容体のインバースアゴニストである、〔12〕に記載の方法、
を提供するものである。
7回膜貫通型G蛋白質結合受容体の内部ドメイン3(internal domain 3)はG蛋白質の結合また受容体の活性に重要でありよく保存されている。H3受容体はG蛋白質共役型受容体の一種であり同様にこの領域は保存されていた。そこでPCR法を用いてマウスH3受容体cDNAおよびヒトH3受容体cDNAにおける該領域をコードする配列に点変異を導入し、マウスH3受容体およびヒトH3受容体の常活性変異体の作製を試みた。
H3受容体はGi結合型のG蛋白質共役型受容体であるので、ELISA法によってcAMP量の測定を行った。具体的には、試験前日24-ウエルプレートに1ウエルあたり105細胞を培養した。試験当日、非血清存在下で15分間培養した後、0.5mM IBMXで15分間処理した。フォルスコリン(10μM)、ヒスタミン(10-11M〜10-6M)、チオペラミド(10-10M〜10-5M)をそれぞれ加え15分間処理した。cAMP測定にはcAMP enzymeimmunoassay(EIA)system(amersham)を用いた。キットに添付されている溶解試薬1B 150μlで細胞を破砕した。そのうち5μlのセルライセート(cell lysate)とウサギ抗cAMP抗体を抗体固相化プレート中、4℃で2時間静置して反応させた。さらに酵素標識抗体を加え、4℃で1時間静置して反応させた。プレートを緩衝液で洗浄し酵素基質溶液を加え室温で約30分間静置して反応させた。1N硫酸で反応を停止させ吸光度を測定した。標準曲線用cAMP溶液の吸光度より標準曲線を作成し、cAMP量を算出した。なお、pertussis toxin(PTX)は100ng/mlの終濃度で18時間処理し、同様の実験を行った。検討の結果、10μMフォルスコリン存在下、すべてのクローンでヒスタミンにより用量依存的にcAMP量が減少した(図4)。
10μMフォルスコリン存在下、H3インバースアゴニストであるチオペラミドにより用量依存的にcAMP量が特にMT6クローンで増加することを見出した(図5)。H3受容体は天然の状態でも常活性状態にあり、また常活性なコンフォメーションをとりやすいことが報告されているが、MT6クローンはワイルドタイプに比べ約5倍もcAMPの増加が観察され非常に強い常活性状態にあることが示唆された。また、チオペラミドによるcAMP量の増加はGi蛋白質経路のものであるかを確かめるためにpertussis toxin(PTX)を100ng/mlの終濃度で18時間処理し、同様の実験を行った。その結果、PTXによりワイルドタイプH3、MT6クローンともにチオペラミドによるcAMPの増加が阻害された。
Claims (9)
- 下記(a)〜(c)の少なくとも一つに記載のアミノ酸置換を含む、H3受容体の常活性変異体。
(a)配列番号:1に記載のアミノ酸配列において少なくとも、357番目のAからKまたはIへの置換
(b)配列番号:1に記載のアミノ酸配列において少なくとも、353番目のDからAへの置換
(c)配列番号:1に記載のアミノ酸配列において少なくとも、352番目のRからK、354番目のKからH、および、357番目のAからLへの置換 - 下記(a)〜(c)の少なくとも一つに記載のアミノ酸置換を含む、H3受容体の常活性変異体。
(a)配列番号:3に記載のアミノ酸配列において少なくとも、357番目のAからKまたはIへの置換
(b)配列番号:3に記載のアミノ酸配列において少なくとも、353番目のDからAへの置換
(c)配列番号:3に記載のアミノ酸配列において少なくとも、352番目のRからK、354番目のRからH、および、357番目のAからLへの置換 - 請求項1または2に記載の常活性変異体をコードするDNA。
- 請求項3に記載のDNAが挿入されたベクター。
- 請求項3に記載のDNAまたは請求項4に記載のベクターを保持する形質転換細胞。
- 被験化合物が請求項1または2に記載の常活性変異体の活性を変化させるか否かを評価する方法であって、
(a)請求項1または2に記載の常活性変異体を発現している細胞に被験化合物を接触させる工程、
(b)該細胞における常活性変異体の活性を検出する工程、
を含み、上記活性が、被験化合物を接触させないときに比べ増加または減少している場合に、被験化合物が、上記常活性変異体の活性を変化させると判定される方法。 - cAMP濃度の変化、カルシウム濃度の変化、G蛋白質の活性の変化、ホスホリパーゼCの活性の変化、または、pHの変化を指標に常活性変異体の活性を検出する、請求項6に記載の方法。
- 以下の(a)および(b)の工程を含む、請求項1または2に記載の常活性変異体の活性を変化させる医薬品候補化合物のスクリーニング方法。
(a)請求項6または7に記載の方法により、複数の被験化合物について、請求項1または2に記載の常活性変異体の活性を変化させるか否かを評価する工程
(b)複数の被験化合物から、該常活性変異体の活性を変化させると評価された化合物を選択する工程 - 医薬品候補化合物がH3受容体のインバースアゴニストである、請求項8に記載の方法。
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