JP2592063B2 - リガンド、そのアンタゴニストまたはアゴニストの効率的な測定のためのハイブリツドリセプター - Google Patents

リガンド、そのアンタゴニストまたはアゴニストの効率的な測定のためのハイブリツドリセプター

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JP2592063B2 JP62107893A JP10789387A JP2592063B2 JP 2592063 B2 JP2592063 B2 JP 2592063B2 JP 62107893 A JP62107893 A JP 62107893A JP 10789387 A JP10789387 A JP 10789387A JP 2592063 B2 JP2592063 B2 JP 2592063B2
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Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、通常インビボにおいてリセプター（受容
体）と相互作用するリガンドの機能をまねるようにして
あるいは該機能に拮抗するようにして、該リセプターと
結合する能力について、候補薬物をスクリーニングする
方法に関するものである。また、本発明はリガンドの機
能的な分析法に関するものである。
発明の構成および目的 リセプターは細胞表面に存在し、シグナル伝達機能を
有するタンパク質性の巨大分子と定義される。細胞膜の
外表面には多くのリセプターが存在する。
これらの細胞表面リセプターは細胞外領域と細胞質
（内）領域とを有しており、細胞外領域と他の細胞の物
質とは特異的に結合することができ、この細胞外領域に
よる物質への結合作用の結果、細胞質領域と他の細胞分
子とが相互作用する。リセプターによって結合される物
質はリガンドと呼称されるが、この言葉は、その相手で
あるリセプターとの関連においてのみ、明確に定義され
るものである。「リガンド」という用語は、その物質
が、リセプターリガンドの存在に関する情報を標的分子
に伝えるような方法で、該リセプターと結合し、開裂
し、あるいはリセプターと相互作用するということを除
けば、特定の分子量、他の構造上の特徴または構成上の
特徴を暗示するものではない。言い換えると、リセプタ
ーと結合し得る物質の全てがリガンドであるとは限らな
いが、リガンドは全てリセプターと結合し得る。リセプ
ターには、免疫グロブリンの様な物質は含まれない。
リセプターは、一般に、構造上３領域に分けられる。
リセプターを細胞表面にうめ込むのに関与していると考
えられる約20〜25残基からなる疎水性の高い領域は、そ
のアミノ末端およびカルボキシ末端で、それぞれ細胞外
環境および細胞質領域（細胞内環境）へ伸びている領域
と、その境を接している。この細胞外領域にはリガンド
結合領域が含まれている。細胞外領域には細胞質に変化
を起こさせる領域が含まれている。一般に、細胞質領域
には、リガンドの結合により引き起こされるリセプター
の凝集または立体配座の変化により活性化される酵素領
域が含まれている。
リセプターは、様々な言葉で表わされる活性化または
シグナル導入（トランスダクション）のプロセスを通し
て機能すると考えられる。リガンドは、細胞質内におけ
るリセプター分子の立体配座を変化させるような方法で
細胞外のリガンド結合領域と結合する。この立体配座の
変化（活性化と呼ばれる）により、リセプターの細胞質
成分に対する作用が変化する。リセプターの活性化によ
ってもたらされる変化には、リセプターの酵素的作用の
変化または発生が含まれる。
近年、製薬業界においては、疾病または傷害における
リセプターの役割に関する研究に重点が置かれ、リセプ
ターと結合し得る、一般に低分子量の物質である薬物の
製造に向けて研究がなされてきた。初期のスクリーニン
グで同定された薬物は、生体内または体外移植組織中で
所望の活性について試験される。結局、従来の方法では
大規模なスクリーニングは不可能であった。即ち、標的
であるリセプターを含有する組織標本または単離細胞
（例えば心動脈組織）の取得には多額を要し、これらは
限られた量しか存在せず、また、これらを機能的に生存
可能な状態に維持することが困難である。その上、組織
標本に対して候補薬物を確実に、かつ再現性よく投与す
ることはしばしば困難である。組織培養中で一次外移植
組織（エクスプラント）を用いるスクリーニングアッセ
イは、組織標本を用いて行なわれるアッセイ（分析）よ
りも大規模に行なわれ得る。しかしながら、生理学的な
作用を分析することはより困難であり、その様な分析
は、培養培地や培養条件等、多くの干渉源による干渉を
受ける。最後に、天然物質から単離したリセプターを用
いる分析法には、リセプターが自然に変化し得ること、
および適当な天然の供給源が常に手に入るとは限らない
という不都合がある。本発明は、リガンドの結合のみな
らず、リガンドのアゴニストまたは拮抗物質としての結
合特性を決定するための、大規模な実施が可能であり、
再現容易で簡便な分析システムを提供することを目的と
するものである。
同様に、有意義な臨床診断は、しばしば不活性形のリ
ガンド（例えばリガンドの活性を変化させたり、消滅さ
せるような、試験対象の有する酵素作用または他の作用
の下におかれたリガンド）の干渉を受けることなく、生
物学的に活性なリガンドを分析することに依存してい
る。被検試料中のリガンドの測定には、イムノアッセイ
が広範囲に用いられている。しかしながら、活性形のリ
ガンドと不活性形のリガンドとを識別し得る抗体の同定
は、往々にして極めて困難である。リセプターは、アナ
ライト結合物質としてまれに抗体の代わりに用いられて
いた。しかしながら、リセプターと結合する物質の全て
が、必ずしもリセプターの活性を誘発する、即ち、生物
学的に活性であるとは限らない。本発明は、臨床的な被
検試料中に含まれているリガンドであって、そのものの
リセプターのシグナル導入を誘発し、あるいは阻害する
作用を有するリガンドの同定法を提供するものである。
少くともいくらかの、インビトロで測定可能なリガン
ド相互作用依存性の既知の活性を有する多数のリセプタ
ーが同定されている。例えば、EGFが表皮成長因子受容
体に結合することで、リセプターのホスホトランスフェ
ラーゼ領域が刺激され、その細胞内の細胞質領域に存在
している幾つかの標的アミノ酸残基がりん酸化される
（自己りん酸化、オートホスホリレーションと称される
過程）。また、リセプターは、このホスホトランスフェ
ラーゼ活性部位が位置している領域に結合する、抗体ま
たは特異的な細胞質内の基質ポリペプチド類をりん酸化
することも知られている。不運にも、他のリセプター
は、それらが高い親和性をもってリガンドと結合するこ
とが分かっているにもかかわらず、既知のリガンド依存
性酵素活性を有しないか、あるいはそれらの活性が余り
にも低く、リガンド依存性の活性化の定量分析が困難と
なっている。治療目的にとっては、その様な未解明のリ
セプターとリガンドとの相互作用に拮抗したり、それを
促進することが望ましいが、関連組織が存在しない条件
下、また幾つかの場合には、無傷の生物体の不在下で
は、ある候補薬物とリセプターとの結合が、単なる機能
の中和の状態であるか否かを決定する方法も、候補薬物
がアゴニストまたは拮抗体のいずれかとして結合してい
ることを決定する方法も得られていない。従って本発明
は、あるリガンドのリセプターが既知のシグナル導入特
性を示さない場合に、候補薬物を、リガンドに対するア
ゴニストまたは拮抗体活性に関してスクリーニングする
方法を提供することを目的とするものである。
要約 これらの本発明の目的は、ヘテロローガス（異種）な
リポーターポリペプチドであって、リセプターのリガン
ド結合領域にリガンドあるいはリガンドのアゴニストま
たはアンタゴニスト（拮抗体）が結合した場合に、コン
ホメーション（立体配座）または機能面で分析可能な変
化を生じ得るリポーターポリペプチドと、該リセプター
のリガンド結合領域とが融合してなる新規なリセプター
ハイブリッドを用いることにより達成された。
ある疾病または傷が、特定のリセプターに作用するリ
ガンドに起因するものである場合、その危険にさらされ
ているリセプターに対するリガンドの作用に拮抗し得る
物質、即ち、リガンド拮抗体（アンタゴニスト）をみつ
けることが目的となろう。他方、リガンド活性の不足に
よって特徴づけられる臨床症状のモデル治療は、不充分
なリガンドまたはリガンド欠損を増強または補う薬物、
即ち、リガンドアゴニストで構成されることになる。
本発明のハイブリッドリセプターは、リセプターに対
して活性なアゴニスト薬物をみつけるためのスクリーニ
ング法に有用である。ハイブリッドリセプターと候補薬
物とをインキュベートし、ヘテロローガスなリポーター
ポリペプチドによるシグナルの生成を分析する。一般
に、しかし必然的ではないが、リポーターポリペプチド
によって生成されるシグナルは、リポーターポリペプチ
ドの酵素機能の活性化または刺激作用として測定され
る。候補薬物のアゴニスト活性の定量を欲しないなら
ば、既知量のリガンドを有するスタンダードを含有させ
る必要はない。実際、インビボでリセプターの活性を調
整するリガンドは全く不明であることもある。本発明の
分析系の１つの利点は、アゴニスト薬物を同定するの
に、リセプターに対するリガンドも、リセプターのイン
ビボにおけるシグナル導入機構もわかっていることを要
しないという点にある。
本発明のハイブリッドリセプターは、アゴニスト薬物
をスクリーニングすると同様の方法で、被検試料中の生
物学的なリガンドの量を測定するのに用いることができ
る。この用途は、既知のリガンドの測定を目的としてい
るので、既知量のリガンドを用いて標準曲線を調製し、
被検試料における結果と比較する。
拮抗（アンタゴニスト）薬物候補の選択も、ハイブリ
ッドリセプターを既知のリセプターアゴニストとインキ
ュベートすることを除き、アゴニストの同定に用いた方
法と同様の分析法によって行われる。アゴニスト（薬物
または正常な生体内リガンド）を、リセプターと候補薬
物との接触の前、あるいは、好ましくは同時に、リセプ
ターと共にインキュベートする。拮抗体（アンタゴニス
ト）活性は、リポーターポリペプチドの変化に基づき測
定されるアゴニスト活性またはリガンド活性の変位の関
数である。
本発明のハイブリッドリセプターは、リガンド−リセ
プター相互作用を分析するための、普遍的でポータブル
（持ち運び可能）な分析系を得ることを可能ならしめた
点で、特に有益である。本発明においては、ポータブル
なリポーターポリペプチドとして第１リセプターの細胞
質内領域を選択しようとするものである。この領域を他
のリセプターの細胞質内領域で置換して本発明のハイブ
リッドリセプターを調製する。第１リセプターに有用な
分析系（例、自己りん酸化分析）はその第１リセプター
の細胞質領域を含む他の全てのハイブリッドリセプター
に用いることができる。
図面の簡単な記述 第１図は、インシュリンリセプターと表皮性成長因子
のリセプターとのハイブリッドを発現させるのに用いら
れるプラスミドの構成を示す図である。種々のリセプタ
ー突然変異体をコードしている領域は陰影を付した棒で
示されている（cDNA）。SV40初期プロモーター配列は太
く黒い矢印で示されており、ポリＡ付加部位には印が施
されている。プラスミドの組立てに用いたジヒドロ葉酸
還元酵素（DHFR）暗号配列［シモンセン（Simonsen）お
よびレビンソン（Levinson）、1983、「プロシーディン
グス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイ
エンスィズ（Proc.Notl.Acad.Sci）USA」80:2465−249
9］と制限部位とが示されている。両cDNAの発現は、シ
ミアン（Simian）ウィルス（SV）40の初期領域のプロモ
ーター配列、およびＢ型肝炎ウィルスの表面抗原をコー
ドしている３′非翻訳配列［クローレィら（Crowle
y）、1983、「モレキュラー・セルラー・バイオロジィ
［Mol.Cell.Biol.］３:44−45］によってコントロール
される。複製起源とアンピシリン耐性遺伝子とを含有し
ている大腸菌プラスミドpML［哺乳類細胞内で用いるの
に適したpBR322誘導体；ラスキイ（Lusky）およびボツ
チャン（Botchan）1981、「ネイチャー（Nature）」29
3:79］の配列を、大腸菌内でプラスミドを複製させるた
めに存在させた。
第1b図はインシュリン・リセプター（HIR）、EGFリセ
プター（HER）およびそれらから調製されたハイブリッ
ドリセプターであるIERおよびＩαERを比較した模式図
である。ヒトEGFリセプター（HER）、ヒトインシュリン
リセプター（HIR）、インシュリンリセプターとEGFリセ
プターのキメラ（IER）、およびインシュリン−α−サ
ブユニットリセプターとEGFリセプターのキメラ（ＩαE
R）を平行に並べ、HIRα配列（α）の暗号領域を点描を
施したボックス、HIRβ配列のそれを斜線で陰影をつけ
たボックス、そして、HER配列のそれを空白ボックスで
示した。暗号領域はトランスメンブラン領域と一列に並
んでいる（等尺で描かれていない）。タンパク質のシグ
ナル配列の暗号セグメントは（Ｓ）で表示されており、
前駆体開裂部位は縦線で示されている。ヘテロローガス
なリセプターのcDNAの連結部はジグザグラインで示され
ており、この連結に用いられた合成オリゴヌクレオチド
は黒色の棒で示されている。組立てに関連したDNA制限
エンドヌクレアーゼ開裂部位はcDNA配列の上方に示され
ている。
第２図は、対照である発現ベクターでトランスフェク
トされたCOS−７細胞と比較して、第1a図のcDNA組立て
物でトランスフェクトされたCOS−７細胞では、125Iイ
ンシュリンと結合したCOS−７細胞が多いことを示す図
である。
第3a〜3d図は、実施例に示す如く、様々な形質転換細
胞および対照細胞から得られた自己りん酸化産物の界面
活性剤処理によるリゼイトの適当な抗体による免疫沈降
物をSDS PAGE還元ゲル電気泳動にかけて得た泳動パタ
ーンを示す図である。（＋）および（−）ゲルはインシ
ュリンまたは（A431の場合には）EGF−処置リセプター
を表わす。側部の数字はマーカー分子量である。第3a図
は対照であるmock−形質転換細胞と組換え形質転換細胞
の抗−HER−免疫沈降自己りん酸化産物を示す。この図
は、組換え体内でインシュリン−EGFハイブリッドリセ
プター組立て物が発現したことを示している。
第3b図は、インシュリンリセプターの全細胞外領域を
含有するバイブリッドの自己りん酸化がインシュリンに
よって活性化されることを示している。
第3c図は、インシュリンにより活性化されたIERリセ
プターの自己りん酸化の動力学を示す図である。この図
から、自己りん酸化は、りん酸化の反応時間に依存して
いることが分る。
第3d図はインシュリンによる活性化の後におけるIER
リセプターのSDS−PAGEの移動度の変化を示す図であ
る。
第４図は表皮性成長因子の細胞外領域と、リポーター
分子として使用するerbB腫瘍因子のフラグメントとを含
有するハイブリッドリセプターである、HER−erbBの構
造を示す図である。
第５図は、リガンド（EGF）の存在下（＋）または非存
在下（−）における腫瘍因子−リセプターのハイブリッ
ド組立物の自己りん酸化を示すゲル電気泳動を表わす図
である。
詳しい記述 本明細書に記載した方法の中心はハイブリッドリセプ
ターである。これは、基本的に、リガンド結合領域とリ
ポーターポリペプチドとから成る。リガンド結合領域は
リセプターの細胞外領域に位置している。リガンドの結
合に関与している正確なアミノ酸配列を同定すること
は、しばしば困難である。実際、リガンドの結合に関連
する幾つかの領域があり、特に、リガンドがポリペプチ
ドである場合にはそうである。従って、リセプターの細
胞外領域の全てがハイブリッドを形成していることが好
ましい。このことはまた、リガンド結合領域を確実に、
正しい立体配座に保つことにも役立つ。
適当なリガンド結合領域は、幾つかの方法の内どれか
を用いて選択する。まず、そのハイブリッドリセプター
の使用目的が、被検試料中の既知のリガンドの分析、あ
るいは、その様なリガンドのアゴニストまたは拮抗体の
スクリーニングにあるときは、そのリガンドに対する既
知のリセプターから、リガンド結合部位を選択する。リ
ガンドが既知であって、そのリセプターが既知でない場
合には、リガンドの細胞表面リセプターを同定する必要
がある。このことは、１）リガンドが結合するか、ある
いは機能的に相互作用することが分かっている組織細胞
を得、２）その細胞から既知の方法で膜タンパク質製品
（標本）を得、３）この製品をリガンドとインキュベー
トし、４）インキュベーション混合物からリガンド−リ
セプター−コンプレックスを分離し［例えば、リガンド
を、臭化シアンで活性化したセファロースに予め不溶化
しておく］、５）リセプターをリガンドから分離し、
６）リセプター部分のアミノ酸配列を得、７）決定した
アミノ酸配列をコードしている核酸プローブを調製し
（約40bp以上の長い１本のプローブ、あるいは、短いプ
ローブのプールのいずれか）、８）リセプターが得られ
た生物または細胞から、cDNAまたはゲノムDNAファージ
ライブラリィー、あるいはプラスミド（ベクター）ライ
ブラリィーを調製し、９）プローブとライブラリィーと
をハイブリダイズしてリセプターをコードしているDNA
を含有しているプラスミドまたはファージを同定し、1
0）アミノ末端からトランスメンブラン（膜透過）配列
までの領域を同定するのに必要な程度のヌクレオチド配
列と推定のアミノ酸配列とを決定する。リセプターの細
胞外領域全部をコードしているDNAを含んでいる単一の
ベクターが無い場合には、様々なベクターを共通の部位
で制限酵素消化し、適当なフラグメントを単離して自体
既知の方法で再結合（リライゲーション）することによ
り所望のDNAを組立てる。既知のリガンドに対するリセ
プターを同定するための他の方法は当業者にとって既知
であるか、将来、利用可能となり得る。
推定のリセプターは同定されたかもしれないが、イン
ビボにおけるそのリガンドはなお不明である。例えば、
脳下垂体や副腎の如き腺から得られる内分泌組織の研究
によって、構造上、他の既知のリセプターと似ている膜
結合タンパク質（即ち、大きい（通常500残基以上）細
胞外領域、疎水性のトランスメンブラン配列およびカル
ボキシ末端である細胞質領域とを有するであろう）が同
定されるかもしれない。同様に、悪性腫瘍細胞のリセプ
ター検索は、形質転換された表現型と関連しているかも
しれない、高濃度に存在している特異なリセプター類を
同定するのにも有用であろう。その様なリセプターの細
胞外領域も、本発明にとって有用である。
リセプターとそのリガンドは同定されたが、細胞質領
域は既知の機能を有しないかもしれない。例えば、アデ
ニル酸シクラーゼやグアニル酸シクラーゼを活性化する
ことも、ホスホトランスフェラーゼ活性を有すること
も、リガンドを輸送することも分かっていないかもしれ
ない。天然のリセプターにおいては、リガンド−リセプ
ター相互反応により、検出可能なシグナルは全く、ある
いは僅かしか産生されないにもかかわらず、ハイブリッ
ド構築においてはリポーターポリペプチドから検出可能
なシグナルが供給されるので、その様なリセプターのリ
ガンド領域は有用である。この様に、ある種のリセプタ
ーの場合には、リセプターと結合した候補薬物が非特異
的に結合しているか、あるいはそれがアゴニストまたは
拮抗体として作用するか否かを決定することも、生物学
的に活性な、固有のリガンドを分析することも、リポー
ターポリペプチドなしではできない。
リポーターポリペプチドはリガンド結合部位にとって
ヘテロローガスなポリペプチドであって、それは、リガ
ンドが結合領域に結合した際にその性質を変化させるも
のであれば何でも良い。一般に、この性質の変化は、リ
ポーターポリペプチドの酵素活性または免疫学的な同一
生の変化により検出し得る。通常、リポーターポリペプ
チドはヘテロローガスなリセプター、あるいはリセプタ
ー類似体の細胞質領域であり、例えば、リガンドとの結
合に際して免疫学的または酵素学的な同一性に変化を来
すことが分っている腫瘍遺伝子である。インシュリンリ
セプターや表皮性成長因子リセプター等のリセプター由
来の細胞質性ホスホトランスフェラーゼを用いることが
好ましい。しかしながら、β−アドレナリン作動性リセ
プター、アセチルコリンリセプター、およびアドレナリ
ンリセプター等の他のリセプターも、アデニル酸シクラ
ーゼやグアニル酸シクラーゼの活性化または阻害を介し
て中間体形質導入分子として作用するＧタンパク質と称
されるタンパク質と結合することが分っている。その様
なタンパク質は単離され、特性化されている。リポータ
ーポリペプチドとして、その様なリセプターのＧタンパ
ク質結合領域を用いることも本発明の範囲に含まれる。
ヘテロローガスなリセプターやリセプター同族体の細胞
質領域全てを使用する必要はなく、所望の機能を示す部
分のみを使用すればよく、また、他のリセプターの無傷
で修飾されていない配列を用いる必要もない。例えば、
リガンド結合領域が得られたリセプターの細胞質内領域
のアミド酸配列における変異体や誘導体も許容される。
本発明は、機能についての特性の理論に制限されるも
のではないが、リポーターポリペプチドの性質の変化
は、リガンドによるリポーターポリペプチドに対する立
体障害（例えば、リガンドが立体障害によりリポーター
領域上の活性部位を吸収）によって起こされるものでは
ないと考えられる。本発明で用いる方法はリセプターの
シグナル導入機構（シグナル・トランスデューシング・
メカニズム）を統制することによりリガンド結合領域の
変化が分子中の立体配座における変化によってリセプタ
ー分子からリガンド領域に伝えられ、その変化がリポー
ターの細胞質領域の機能または性質に影響を及ぼすもの
である。この導入機構は、リポーターポリペプチドがリ
ガンド結合領域にとってヘテロローガスなものである場
合にも有効であることが分った。
所望により、ハイブリッドリセプターは、リガンド結
合領域とリポーターポリペプチドとの間に融合されてい
るトランスメンブラン配列を含んでいてもよい。典型的
なトランスメンブラン領域は、約20〜25残基を含有し、
約1.5から3.5にヒドロパシィピークを示すものである。
それらは疎水性の側鎖を有する残基、例えばロイシン、
イソロイシン、フェニルアラニン、バリンおよびメチオ
ニン等を高い割合で含有している。適切なトランスメン
ブラン配列は細胞外のリガンド結合領域を供給するリセ
プターから得られるが、トランスメンブラン配列は全合
成されるか、あるいは膜内在性タンパク質または非関連
リセプターから得ることができる。最後の例には、ヘテ
ロローガスなリセプターの細胞質内領域であるリポータ
ーポリペプチドに通常伴っているトランスメンブラン領
域も含まれる。
ハイブリッドリセプター成分は、ヒト、動物、植物、
昆虫、さらに原虫、ウィルスおよび真菌を含む微生物、
並びにその他の適当な種を起源とする。リガンド結合領
域の供給源となる種は、関心を持たれているリガンドと
結合し得るリガンド結合領域の存在について、あるい
は、標的となっている生理活性の存在について選択され
る。リポーターポリペプチドまたはトランスメンブラン
領域を、リガンド結合領域と同一種から得る必要はな
い。
ハイブリッドリセプターは一般に、今日、技術分野で
利用可能なインビトロの方法で実用的に合成するには、
あまりにも大きく複雑なので組換え細胞培養法で合成す
ることが好ましい。
ハイブリッドリセプターを合成するための組換え法
は、ハイブリッドリセプターをコードしている核酸を含
有する複製可能なベクターの組立てから始まる。一般
に、ベクターは適合し得る宿主細胞と共同して２つの機
能を果たす。１つの機能はハイブリッドリセプターをコ
ードしている核酸のクローニングを促進すること、つま
り、使用可能な量の核酸を生産することにある。もう一
つの機能はハイブリッドリセプターの発現を指令するこ
とにある。これらの機能の一方または両方が、ベクター
−宿主系によってなされる。ベクターは、選択された宿
主細胞と同様、それがなすべき機能に応じて異なる成分
を含有することとなる。
各ベクターはハイブリッドリセプターをコードする核
酸を含有している。通常、これはそのアミノ末端に分泌
シグナルが結合している成熟した形のハイブリッドリセ
プターをコードしているDNAであろう。この分泌シグナ
ルは、リガンド結合領域の得られたリセプターの分泌を
指令する通常のシグナルプレ配列であることが好まし
い。しかしながら、他のリセプターに由来するシグナル
や、同一種または近縁種の分泌ポリペプチドから得られ
るシグナルも適当なシグナルとなり得る。
分泌されたハイブリッドは、それがトランスメンブラ
ン領域を含んでいれば、組換え宿主の膜内に位置する。
その様な領域がハイブリッド中に存在しないときには、
ハイブリッドは培養培地に分泌される。通常、ハイブリ
ッドは、構造を可能な限り忠実に保持するために、トラ
ンスメンブラン領域を含有していることが好ましい。し
かしながら、ハイブリッドリセプターを、他の細胞膜タ
ンパク質を含まないように精製しなければならない膜−
結合性リセプターの場合よりも、トランスメンブラン領
域を欠失したリセプターの精製の方が複雑でない。さら
に、細胞−結合性リセプターの場合、増殖期に細胞膜に
多量の蓄積が起きると、宿主に望ましくない生物学的な
影響を与えるかもしれない。これらの潜在的な可能性
は、ハイブリッドリセプターをコードしているアミノ酸
を誘導可能なプロモーターのコントロール下におくこと
によって克服される。
クローニングベクター中では、通常、ハイブリッドリ
セプターをコードしている核酸は、選択された宿主内
で、宿主の染色体と独立してベクターを複製させる核酸
配列と一緒に存在している。通常、この配列は、複製起
源または自律的複製配列である。その様な配列は、種々
の細菌、酵母およびより高等な真核細胞についてよく知
られている。よく知られたプラスミドpBR322の複製起源
は大腸菌に、２μプラスミドの複製起源は酵母に、そし
て種々のウィルス（SV40ウィルス、ポリオーマウィル
ス、アデノウィルスまたはウシ乳頭腫ウィルス）の複製
起源は哺乳類細胞に適合する。余り望ましくないが、DN
Aは、宿主のゲノムに挿入されることでクローンされ
る。このことは、例えば、バシラスのゲノムDNAと相補
的なベクターDNAに挿入することにより、バシラス種で
は容易に行い得る。このベクターでバシラスがトランス
フェクションされると、ゲノムとのホモローガスな組換
えが起き、ハイブリッドリセプターDNAが挿入される。
しかしながら、ハイブリッドリセプターをコードしてい
るゲノムDNAの回収は、ハイブリッドリセプターDNAをク
ローニングビヒクルのゲノムから回収するために制限酵
素による消化を行う必要があるので、外的に複製された
ウィルスDNAまたはプラスミドDNAの回収よりも複雑であ
る。
発現およびクローニングベクターは選択遺伝子（選択
可能なマーカーとも称される）を含有していなければな
らない。これは、ベクターで形質転換された宿主細胞の
生存または増殖に必要なタンパク質をコードしている遺
伝子である。この遺伝子が存在することにより、挿入体
を発現する宿主のみが確実に増殖することになる。代表
的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質あるいは他の毒素
（例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセー
トまたはテトラサイクリン）に対する耐性を付与する、
または（ｂ）栄養要求性の欠失を補償するタンパク質を
コードしている遺伝子か、あるいは（ｃ）複合培地から
得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコード
している遺伝子（例えば、バシルス）にとっての、Ｄ−
アラニン・ラセマーゼをコードしている遺伝子）であ
る。
酵母内で用いるのに適した選択遺伝子は酵母プラスミ
ドYRp7中に存在するtrp1遺伝子である［スティンチコム
ら（Stinchcomb）、1979“ネイチャー（Nature）”282:
39;キングスマンら（Kingsman）、1979“ジーン（Gen
e）”７:141;またはチエンパーら（Tschemper）、198
0、“ジーン”10:157］。trp1遺伝子はトリプトファン
中で増殖する能力を欠く酵母の突然変異株（例、ATCC
No.44076またはPEP4−１［ジョーンズ（Jones）、1977
“ジェネティックス（Genetics）”85:12］）に選択マ
ーカーを与える。酵母宿主細胞ゲノムにtrp1損傷がある
と、トリプトファンの非存在下で形質転換体を増殖させ
ることで形質転換を検出するのに有効な環境が得られ
る。同様に、Leu2欠損酵母株（ATCC20,622または38,62
6）はLeu2遺伝子を有する既知のプラスミドで補償され
る。
哺乳類細胞にとって適当な選択マーカーは、例えば、
ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）、チミジンキナーゼまた
はネオマイシン耐性を付与するタンパク質である。その
様なマーカーにより、ハイブリッドセプター核酸を取り
入れるのに適した細胞を同定することが可能となる。哺
乳類細胞形質転換体を、マーカーを取り込んだ形質転換
体のみが特異的に生存に適応し得る選択圧の下におく。
選択圧は、培地中の選択物質の濃度が逐字増加されてい
る、連続的な細胞培養中で培養することにより、選択遺
伝子をコードしているDNAとハイブリッドリセプターを
コードしているDNAの両者を増幅させることにより与え
られる。増幅されたDNAにより、ハイブリッドリセプタ
ーの合成量が増加される。
例えば、DHFR形質転換細胞は、ヒポキサンチン、グリ
シンおよびチミジンを欠く培養培地中で選択される。こ
の場合、適当な宿主細胞はウーラウブ（Urlaub）および
チャッシン（Chasin）1980、“プロシーディングス・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンスィ
ズ（プロナス）（Proc.Nat'l.Acad.Sci）USA"77;4216記
載の如くにして調製し、増殖された、DHFR活性を欠くチ
ャイニーズハムスターの卵巣（CHO）セルラインであ
る。
メトトレキセート（MTX）耐性の高い突然変異DHFRが
特に有用なDHFRである（EP117,060A）。この選択物質
は、内因性のDHFRが存在していても、それ以外において
適切な宿主であれば用いることができる。内因性のDHFR
を完全に不活化するには、単に、充分量のMTXが培地中
に含有されていればよく、そうすれば、MTX選択は、突
然変異DHFRのDNAの増幅によってのみ行われる。MTXを吸
着することのできる真核細胞の大多数はメトトレキセー
ト感受性のように思われる。その様な有用なセルライン
の１つに、ある種のCHOライン、即ちCHO−K1（ATCC N
o.CCL61）がある。
ハイブリッドリセプターを脊椎動物の組換え細胞培養
中で合成するのに適応させ得る他の方法、ベクターおよ
び宿主細胞は、ゲッシングら（M.J.Gething）、“ネイ
チャー”293:620〜625（1981）、マンテイら（N.Mante
i）、“ネイチャー”281:40〜46およびレビンソンら
（A.Levison）、EP11706,058Aによって記載されてい
る。
発現ベクターは、クローニングベクターと異なり、ハ
イブリッドリセプターをコードしているDNAが強く転写
されるよう、宿主生物によって認識される、プロモータ
ーおよび／または他の配列を含有していなければならな
い。これは、一般に、意図する宿主のプロモーターとホ
モローガスな配列である。高等な真核細胞の場合、プロ
モーターからの転写をより増大する上で、エンハンサー
配列が有用である。プロモーターと異り、エンハンサー
配列は、ハイブリッドリセプターをコードしている核酸
の５′側に位置している必要はない。原核生物に一般的
に用いられるプロモーターには、β−ラクタマーゼおよ
びラクトースプロモーター系［チャンら（Chang）、197
8“ネイチャー”275:615;ゲツデルら（Goeddel）、1979
“ネイチャー”281:544］、アルカリホスファターゼ、
トリプトファン（trp）プロモーター系［ゲツデル1980
“ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids
Res.）”８:4057およびEPO出願公開No.36,776］、並び
にtacプロモーター［ドゥ・ボアら（H.de Boer）、1983
“プロナス USA"80:21−25］の如きハイブリッドプロ
モーターが含まれる。しかしながら、他の既知の微生物
のプロモーターも適する。それらのヌクレオチド配列は
公開されているので、当業者は、必要な制限部位を与え
るリンカーやアダプターを用いて、それらをプラスミド
ベクター中のハイブリッドリセプターをコードしている
DNAと機能的（操作可能）にライゲート（結合）させる
ことができる［シーベンリストら（Siebenlist）1980
“セル（Cell）”20:269］。原核生物系で用いるための
プロモーターには、ハイブリッドリセプターをコードし
ているDNAと機能的に結合しているシャインダルガルノ
配列も含まれるであろう。
酵母用ベクターの好適なプロモーティング配列には、
以下のものに対するプロモーターが含まれる：メタロチ
オナイン（metallothionein）、３−ホスホグリセレー
ト・キナーゼ［ヒツツマン（Hitzeman）ら、1980“ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリィ”255:20
73］またはエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホス
フェート・デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベ
ート・デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、
グルコース−６−ホスフェート・イソメラーゼ、３−ホ
スホグリセレート・ムターゼ、ピルベート・キナーゼ、
トリオセホスフェート・イソメラーゼ、ホスホグルコー
ス・イソメラーゼ、グルコキナーゼ等の他の解糖酵素類
［ヘス（Hess）ら1968、“ジャーナル・オブ・アドバン
スイズ・イン・エンザイム・レグ（J.Adv.Enzyme Re
g.）”７:149;およびホランド（Holland）ら、1978、
“バイオケミストリィ”17:4900］。
その他、増殖条件によって転写がコントロールされる
という利点をも有するプロモーターとして、アルコール
・デヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸ホスフ
ァターゼ、窒素代謝に関連する減成酵素、前記メタロチ
オナイン、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート・デ
ヒドロゲナーゼ、並びにマルトースおよびラクトースの
利用に与る酵素類等に関するプロモーター領域が含まれ
る。更に、酵母内で発現させる上で好適なベクターおよ
びプロモーターはR.ヒツツマン（R.Hitzman）らによ
り、EPO公開番号第73,657号の中に記述されている。
哺乳類宿主細胞内でのベクターからの転写は、ウシ乳
頭腫ウィルス、ワクシニアウィルス、ポリオーマウィル
ス、アデノウィルス２、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィ
ルスおよび大多数の好ましいシミアンウィルス40（SV4
0）から得られ、ハイブリッドリセプターの核酸と機能
的に結合しているプロモーターおよび／またはエンハン
サーによってコントロールされる。SV40ウィルスの早期
および後期プロモーターはSV40ウィルスの複製起源を含
有しているSV40制限フラグメントと同様、都合良く得ら
れる［ファイヤーズら（Fiers）、1978“ネイチャー”2
73:113］。
本発明においては、宿主細胞またはその近縁種から得
られたプロモーターやエンハンサーも有用であることは
当然である。
核酸は、それが他の核酸配列と機能的な関連性に置か
れている場合、機能的に結合していることになる。例え
ば、プレ配列または分泌リーダーのためのDNAは、それ
がポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として
発現されるならば、ポリペプチドのDNAと機能的に結合
しており、プロモーターまたはエンハンサーは、それが
暗号配列の転写を左右するなら該配列と機能的に結合し
ており、あるいは、リボゾーム結合部位は、それが暗号
配列の翻訳を促進するよう位置せしめるならば該配列と
機能的に結合していることになる。一般に、機能的に結
合しているという言葉は、結合されているDNA配列が近
接しており、さらに、分泌リーダー配列の場合には、近
接し、リーディングフレーム内にあることを意味する。
真核性宿主細胞（酵母、菌類、昆虫、植物、動物また
はヒト）内で用いる発現ベクターは転写の終止およびmR
NAの安定化に必要な配列をも含有しているであろう。そ
の様な配列は、一般に、真核性の、またはウィルスのcD
NAの３′非翻訳領域から得られる。これらの領域は、ハ
イブリッドリセプターをコードしているmRNAの非翻訳部
分に含まれるポリアデニル化セグメントとして転写され
る領域を含有している。この３′非翻訳領域には転写終
止部位も含まれている。
本発明におけるベクターのクローニングまたは発現に
とって好適な宿主細胞は、原核細胞、酵母細胞およびよ
り高等な真核細胞である。原核細胞には、大腸菌やバシ
ラスの如き、グラム陰性またはグラム陽性菌が含まれ
る。好ましいクローニング宿主は大腸菌294（ATCC31,44
6）であるが、大腸菌Ｂ、大腸菌X1776（ATCC31,537）、
大腸菌W3110（ATCC27,325）、シュードモナス種、ある
いはセラシア・マーセサンス（Serratia Marcesans）も
適する。
原核生物に加えて糸状菌や酵母の如き真核微生物もハ
イブリッドリセプターをコードしているベクターの宿主
として適する。下等な真核性宿主微生物の内、サッカロ
ミケス・セレビシエ（Saccharomyces cervisiae）また
は通常のパン酵母が最も普通に用いられる。しかしなが
ら、他の多くの属、種または株も一般に入手可能であ
り、本発明に用い得る。
機能的なハイブリッドリセプターの発現にとって好適
な宿主細胞は多核細胞生物から導かれた細胞の培養物で
ある。多くの場合、ハイブリッドリセプターは下等な微
生物には適合し得ない領域、即ち、適切なジスルフィド
結合を形成する上で複雑なプロセシングを必要とし、し
ばしば、サブユニット・プロセッシングが要求される疎
水性の領域、を含有している。しかも、このリセプター
のグリコシル化は天然のリセプターの場合と同様に行わ
れることが望ましい。これらの機能は全て高等な真核細
胞により、最もよく達成される。原則として、脊椎動物
または無脊椎動物の細胞培養物のいずれでもよく、あら
ゆる高等な真核細胞の培養物が有用であるが、ヒト等の
哺乳類の細胞が好ましい。培養中でのその様な細胞の増
殖は自体既知である［組織培養（Tissueculture）、ア
カデミック・プレス、クルス（Kruse）およびパターソ
ン（Patterson）編（1973）参照］。有用な哺乳類宿主
のセルラインには例えば、VERO細胞、Hella細胞、チャ
イニーズハムスターの卵巣細胞セルライン、WI38、BH
K、COS−７およびMDCKの各セルラインが含まれる。
本発明のハイブリッドリセプターは、原則として、該
リセプターを被検試料、コントロールおよび（所望によ
り）スタンダード（標品）と一緒にインキュベートした
後、リポーターポリペプチドにおける変化を測定するこ
とからなる方法により、薬物のスクリーニング、あるい
は生物活性なリガンドのアツセイに用いられる。リガン
ドの結合がリポーターポリペプチドの立体配座を変化さ
せることは、本発明者らが見い出したことである故、こ
の様な変化を幾つかの方法のどれかを用いて検出するこ
とも本発明の範囲内に含まれる。一般に、リポーターポ
リペプチドのタンパク質結合または酸素活性の変化を測
定する。一つの方法では、活性化された立体配座に対す
る抵抗を惹起させ、リセプターをリガンドまたは候補薬
物と一緒にインキュベートしてから、ハイブリッドリセ
プターに対する抗体の結合を測定する。このアツセイは
従来のタンパク質抗原についてのイムノアツセイと同様
の方法で行われる。抗体はホスホチロシン含有タンパク
質と結合し得ることが自体既知である［ウオン（Wan
g）、1985“モル・アンド・セル・バイオロ（Mol.and C
ell.Biol.）”５（12）:3640〜3643;ロスら（Ross）、1
981、“ネイチャー”294:654;およびパンら（Pang）、1
985、“アーク・バイオケム・バイオフィス（Arch.Bioc
hem.Biophys.）”242（１）:176］。これらの抗体は本
発明の方法に有用であるが、従来技術における抗体と異
なり、ハイブリッドリセプターの場合には、リポーター
ポリペプチドにとって特異的であり、他のリセプターや
りん酸化されたタンパク質とは交差反応せず、リガンド
のリセプター結合領域への結合影響を測定することに関
しては、まさに利用度の高い抗ホスホチロシン抗体が選
ばれる。しかし、この方法は、結合しなかった標識抗体
をリポーターと結合した抗体から除去するために相分離
が必要であるという不都合を有する。しかしながら、こ
の方法では、ハイブリッドリセプターを共有結合的に修
飾しなくともよい。
リポーターポリペプチドに対する特異抗体の結合を利
用するアツセイと同様の方法は、正常な相互作用によっ
てリポーターと結合する非−免疫的な結合タンパク質の
リポーターへの結合を測定する方法である。典型的な結
合タンパク質は、ある種の、リガンドで活性化されたリ
セプターに伴なっているＧタンパク質である。この場合
のリポーターポリペプチドはβ−アドレナリン性リセプ
ター等のリセプターの細胞質内領域である。Ｇタンパク
質の結合は、標識したＧタンパク質の置換により、ある
いは、活性化されたＧタンパク質へのGTPまたはATPの結
合の測定等、抗体結合のアツセイと同様にして分析され
る。
もしもリポーターポリペプチドがヘテロローガスなリ
セプターの酵素学的に活性な細胞質内領域である場合に
は、その活性のアツセイが検出方法として好ましい。今
日、その様な活性には、タンパク質のホスホリルキナー
ゼ活性や一次チロシンキナーゼ活性が含まれるが、いく
つかの例では、セリンキナーゼ活性やスレオニンキナー
ゼ活性も含まれる。キナーゼ活性は、従来のキナーゼ活
性の測定法の内、いずれかの方法によって測定される。
キナーゼ活性の測定法として、本発明において好ましい
従来方法は、32Pを用いた自己りん酸化を介する。リポ
ーターポリペプチドへの放射性りんの挿入を測定する方
法である。同じ種類の活性を有するリセプターのハイブ
リッドを形成することが好ましい。
しかしながら、酵素学的な活性やポリペプチドの相互
作用以外の手段でリポーターポリペプチドの変化を測定
することも本発明の範囲に含まれる。その様な方法の１
つは、リガンドとの結合に際して性質が変化する有機部
分をリセプターに結合させることを含む。例えば、リポ
ーターポリペプチドを安定なフリーラジカルや化学発光
性の基、あるいはフルオレスセイン・イソチオシアナー
トの如き蛍光性の分子でラベルする。これらのラベルは
いずれも診断的免疫化学の分野では良く知られており、
それらをタンパク質と共有結合的に結合させるための常
法も良く知られている。これらの方法はリポーターポリ
ペプチドを他のタンパク質と同様の方法でラベルするの
に有用である。リガンド結合領域に対するリガンドまた
は候補薬物の結合に際するリセプターポリペプチドの立
体配座の変化はラベルの変化に基づいて検出される。例
えば、リポーターポリペプチドの立体配座に対するリガ
ンドの活性化に基づく変化によって安定なフリーラジカ
ル・ラベルの回転モーメントが増加または減少するであ
ろう。同様に、リポーターポリペプチドの蛍光性ラベル
または化学発光性ラベルは、リポーターポリペプチドに
リガンドまたは活性な候補が結合すると分子内のエネル
ギーの移動に関与しているポリペプチド種が再配向（リ
オリエンテーション）されるために変化するであろう。
これは、ラベル分子の強度、分極または波長の変化によ
って検出され、一般に、ラベルの蛍光または化学発光の
増強または消失によって検出される。ラベルしたリポー
ターを用いる方法の利点は、リガンドまたは候補薬物の
分析をもっぱら水溶液中で行うことができ、相分離の必
要がないことにある。このことにより、オートアナライ
ザー等の連続フロー機器を用い、自動的なスクリーニン
グ法が可能となる。その様な方法は、ハイブリッドリセ
プター同様、固有のリセプターにも有用である。
実施例の記載を簡単にするため、頻繁に用いられる方
法を短い熟語に略して示す。
“プラスミド”は小文字のｐを先頭にし、そして／ま
たは大文字および／または数字を続けることによって表
わされる。本発明の出発物質であるプラスミドは市販さ
れているか、または非制限的な施設から一般に入手可能
であり、あるいはこの様にして入手し得るプラスミドか
ら、公知の方法に従って組立てることができる。更に、
その他の同等なプラスミドも当業者には知られており、
通常の技術者にとって自明であろう。
DNAの“消化”または“開裂”とは、DNAを、該DNAの
ある位置に対してのみ作用する酵素で触媒的に開裂する
ことを指す。その様な酵素を制限酵素と称し、該酵素に
とって特異的な部位を制限部位（サイト）と称する。本
発明において用いる様々な制限酵素は市販されており、
その反応条件、コファクター、およびその他必要なもの
は、酵素の供給業者の指示に従って使用した。制限酵素
類は、各制限酵素が最初に得られた微生物を表示する大
文字、次いで他の文字、更に、通常、数字からなる略号
で表わされる。特定の酵素について適当な緩衝液および
基質の量は、製造業者によって明示されている。通常、
インキュベーション時間は37℃で１〜数時間とするが、
供給者の指示に従ってかえてもよい。インキュベーショ
ンした後、フェノールおよびクロロホルムでタンパク質
を抽出して除き、水性フラクションからエタノール沈殿
によって消化された核酸を回収する。時たま、制限酵素
による消化の後、５′末端のホスフェートを細菌性アル
カリホスファターゼで加水分解することがある。これ
は、DNAフラグメントの２つの制限的開裂末端が“閉環
（サーキュライディング）”したり、閉じたループを形
成することにより、該制限部位に他のDNAフラグメント
が挿入されにくくなるのを防止するためである。明示し
ない限り、プラスミドの消化には、５′末端の脱りん反
応は伴なわないものとする。脱りんの方法および試薬は
常法に従う［T.マニアテイス（T.Maniatis）ら、1982、
モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）pp.
133−134］。
“充填（フィリング）”または“平滑末端化（ブラン
ティング）”とは、制限酵素で開裂した核酸の粘着末端
の一本鎖末端を二本鎖に変換する工程を指す。このこと
により、粘着末端が消滅して平滑末端が形成される。こ
の工程は、１個またはほんの少数の他の制限酵素によっ
て作られた末端とのみ結合し得る制限的な切断末端を、
あらゆる、平滑に切断する制限エンドヌクレアーゼで形
成された末端末端または他の充填後の粘着末端に適合し
得る末端に変える上で多方面に利用可能な手段である。
一般に、平滑末端化は、目的とするDNA2〜15μｇ、DNA
ポリメラーゼＩのクレノラフラグメント８単位と４種類
のデオキシヌクレオチドトリホスフェート各250μＭの
存在下、10mMMgCl2、1mMジチオトレイトール、50mMNaC
l、10mMトリス（pH7.5）バツファーの混液中、37℃でイ
ンキュベートすることにより行われる。通常、30分後に
フェノールおよびクロロホルムで抽出し、エタノール沈
殿に付すことによりインキュベーションを終了する。
制限消化物からの特定のDNAフラグメントの“回収”
または“単離”とは、この消化物をポリアクリルアミド
ゲルまたはアガロースゲル電気泳動にかけて分離し、フ
ラグメントの移動度を分子量既知のマーカーDNAフラグ
メントのそれと比較して所望のフラグメントを同定し、
所望のフラグメントを含むゲルの部分を取り除き、該ゲ
ルからDNAを分離することを意味する。この方法は一般
的に知られている。例、R.ローン（R.Lawn）ら、1981、
“ヌクレイック・アシッズ・リサーチ”９:6103−6114
およびD.ゲツデル（D.Goeddel）ら、1980“ヌクレイッ
ク・アシッズ・リサーチ”８:4057参照。
“形転転換”とは、DNAを生物内に導入することを意
味し、その結果DNAが染色体外成分として、あるいは染
色体内に組込まれて複製されること意味する。特に明示
しない限り、本発明における大腸菌の形質転換法にはマ
ンデル（Mandel）らのCaCl2法（1970、“ジャーナル・
オブ・モレキュラー・バイオロジイ”53:154）を採用す
る。
“ライゲーション（結合）”とは、２個の２本鎖核酸
フラグメントの間にホスホジエステル結合を形成する工
程を言う（T.マニアテイスら、前掲p146）。特に明示し
ない限り、ライゲーションは既知の緩衝液と条件を使用
し、ライゲートすべきDNAフラグメント１μｇ当たりT4D
NAリガーゼ（“リガーゼ”）10単位を用いて行う。
形質転換体からDNAを“調製する”とは、プラスミドD
NAを微生物培養物中から単離することを意味する。明示
しない限り、マニアテイスらのアルカリ性/SDS法（同上
p.90）を採用する。
“オリゴヌクレオチド”とは、短かい一本鎖または二
本鎖ポリデオキシヌクレオチドであって、既知の方法に
よって化学的に合成され、次いでポリアクリルアミドゲ
ル上で精製されたものである。
以下の実施例は本発明を実施する上で、現在知られて
いる最良の方法を例示するものにすぎず、本発明がこれ
らに限定されることはない。
本明細書中で引用した文献は全て参照例として示され
ている。
実施例 １ インシュリンリセプター（IR）発現プラス
ミドの組立て 全HIR暗号配列を含有するλHIR−P12から得たゲル精
製Sal Iフラグメント（5.2kb）を、pUC12をSal Iで消化
し、このベクターに精製Sal Iフラグメントをライゲー
トすることによりpUC12［ニューイングランド・バイオ
ラボス（Naw England Biolabs）］のポリリンカー領域
にサブクローンした。コロニーを増殖させ、pUC12Xba I
部位の隣にHIR暗号配列の５′末端が所望の方向性で含
有されているクローンをスクリーニングした。このベク
ターをXba IおよびDra Iで消化し（Dra IはHIRの３′非
翻訳領域に含まれている）、HIR−含有フラグメントを
単離した。このフラグメントを哺乳類の発現ベクター
（pCVSVEHBVE400、欧州公開No.117,060）であって、Bam
H Iで先に消化しておいたベクターに挿入した。BamH I
粘着末端を充填した後、プラスミドをXba Iで消化し
た。従って、Xba I−Dra Iへの挿入は、HIRmRNAが必然
的に発現する方向にのみ可能であった。得られたインシ
ュリンリセプター発現プラスミドをpCVSV−HIRcと命名
した。
実施例 ２ インシュリン−EGFハイブリッドリセプタ
ーを発現させるためのベクターの組立て 以下のフラグメントを、４成分（ファクター）ライゲ
ーションでライゲートさせた。（ａ）IR発現プラスミド
pCVSVE−HIRc由来の931bp BamH I−Aat II制限フラグメ
ント、（ｂ）組換えファージλHER−A64［ウーリッチら
（Ullrich）1984、“ネイチャー”309:418〜425］に含
有されているヒトEGFリセプター配列の1150bpApa I−Ss
t I制限フラグメント、（ｃ）５′−CCCGTCAAATATCGCCA
CTGGGATGGTGGGGGCC−３′および５′−CCCACCATCCCAGTG
GCGATATTTGACGGGACGT−３′を含有する合成オリゴヌク
レオチドリンカー、および（ｄ）Sst IおよびBamH Iで
開裂されたpUC12。この様にして、インシュリンリセプ
ターの細胞外領域をコードしている配列をEGFリセプタ
ーのトランスメンブラン領域および細胞質領域をコード
している配列と結合させ、発現プラスミド内に位置せし
めた。ハイブリッドをコードしているDNAを含有するプ
ラスミドpUC12/HIR−HERI nt.を形質転換された大腸菌2
94のアンピシリン耐性コロニーから回収した。このプラ
スミドをBamH IおよApa Iで消化し、IER連結部（ジャン
クション）を含有する965bpフラグメント（フラグメン
ト１）を回収した。pCVSV−HIRcをPvu IおよびBamH Iで
消化し、残りのIR暗号配列と哺乳類発現ベクターの一部
を含有する3117bpフラグメント（フラグメント２）を回
収した。λHER−A64をApa I−Bgl IIで消化して810bpフ
ラグメント（フラグメント３）、Bgl II−Xmn Iで消化
して1kbフラグメント（フラグメント４）をそれぞれ回
収した。フラグメント３および４はヒトEGFリセプター
のトランスメンブランおよび細胞質領域をコードしてい
る。pCVSVEHBVE400をBamH Iで消化し、制限部位を末端
の充填に対し、このDNAを引き続きPvu Iで消化した。記
載の哺乳類発現ベクターの一部をコードしている4kbBam
H I−Pvu Iフラグメント（フラグメント５）を回収し
た。フラグメント１、２、３、４および５の混合物をラ
イゲートし、大腸菌294DNAの形質転換に用いた。制限分
析によりアンピシリン耐性コロニーをスクリーニングし
た。HIR−HER連結部とオーバラップする241bpのPst Iフ
ラグメントをM13 Tyl 31にクローンし、配列決定を行っ
て予測される連結部を立証した。
トランスメンブラン領域を含有しないハイブリッドリ
セプターの発現ベクターを、Apa I EGFリセプター下流
のトランスメンブラン領域がM13突然変異誘発によって
欠失されており、欠失されたERフラグメントにフレーム
内で、Apa Iアダプターがライゲートされていることを
除き、pCVSV−HIRcを用いて同様の方法で組立てた。
インシュリンリセプターα鎖とEGFリセプターのトラ
ンスメンブランおよび細胞質領域とのハイブリッドであ
って、HIR−β鎖配列を全く含まないハイブリッドリセ
プターＩαERをコードしているベクターをIERプラスミ
ドのオリゴヌクレオチドで指令される欠失突然変異によ
り調製した。結合したインシュリンリセプターおよびEG
Fリセプターの配列をM13mp10ベクターのBamH I部位に導
入した。M13mp10のHind III部位の隣りに所望の方向性
でIR配列を含有している分子を同定し、アデルマン（Ad
elman）ら［“DNA"２:183〜193（1983）］のプロトコー
ルに基づき、オレゴヌクレオチド５′−CCCCAGGCCATCTA
TCGCCACTGGGA−３′を用いた欠失突然変異誘発を行うた
めに、一本鎖の鋳型を調製した。りん酸化したプライマ
ー50mgを一本鎖M13鋳型２μｇとハイブリダイズさせ
た。突然変異した第２の鎖を完成させ、この二本鎖分子
を大腸菌JM101に導入した。得られたプラークを、ハイ
ブリダイゼーションのプローブとしてプライマーを用
い、高いストリンジェンシィの下、ベントン（Benton）
およびデービス（Davis）の“サイエンス”196:180〜18
2（1977）記載の方法に従い、スクリーニングした。二
本鎖DNAを調製し、突然変異した領域を含有する1.2kbBs
tE II制限フラグメントを用いてIER発現プラスミドのそ
れぞれのDNAフラグメントと置換し、p IαERを得た。
実施例 ３ インシュリンおよびEGFのハイブリッドリ
セプターの発現 COS−７サル腎細胞［グルツマン（Gluzman）1981、
“セル”23:175〜182］を10％ウシ胎児血清と抗生物質
とを含んだ、DMEM培地とF12培地の50:50混合物中で培養
した。全細胞培養培地［ギブコ（Gibco）］は、2mM Ｌ
−グルタミンと20mMHEPESpH7.4を含有していた。
実施例２で得たpIERまたはpIαERをグラハム（Graha
m）およびファン・デル・エブ（Van der Eb）、1973
“ヴィロロジィ（Virology）”52:456〜467のプロトコ
ールに基づき、りん酸カルシウムによる共沈法によって
COS−７細胞に導入した。準（サブ）全面成長した細胞
を8cmの培養皿あたり、10μｇのプラスミドでトランス
フェクトした。プラスミドDNAを1mMトリスpH7.5、0.1mM
EDTA、および250mMCaCl20.55mlに溶かした後、50mMHEPE
SpH7.12、280mMNaClおよび1.5mMNA2HPO40.5mlをゆっく
り加えた。45分間の間に沈殿が徐々に形成され、それ
を、細胞培養培地に加えた。トランスフェクトされたCO
S−７細胞を、抗生物質、2mML−グルタミン、20mMHEPES
および10（v/v）％ウシ胎児血清（pH7.4）を含んだDMEM
培地とＦ−12培地の50:50混合物中、37℃で53時間培養
した。
pIERまたはpIαERで形質転換されたCOS−７細胞をPBS
で２回洗浄し、2.2cmのウエルあたり、0.2％ウシ血清ア
ルブミン（シグマ）、バシトラシン（0.5mg/ml、シグ
マ）および125Iインシュリン（0.5μCi/ウエル）、93μ
Ci/μｇを含んだ血清不含細胞培養培地1ml中、21℃で２
時間インキュベートした。細胞を、４℃において、PBS
で３回洗浄し、37℃において、0.1％SDS、0.1MNaOH0.5m
l中で30分間溶解させた。ガンマ・カウンター中で放射
活性を測定した。形質転換体へのインシュリンの結合
が、対照におけるそれよりも増加していることを、第2a
図に示した。
ヒト上皮性腫瘍細胞A431（EGFリセプターの対照リセ
プター供給源）を１あたり4.5mMグルコース、10％ウ
シ胎児血清および抗生物質を含んだDMEM中で培養した。
実施例４ 正常なリセプターおよびハイブリッドリセプ
ターにおけるホルモン刺激下での自己りん酸化 pIERまたはpIαERで形質転換した、並びにmock形質転
換に付されたCOS−７細胞を8cmの培養皿中で53時間増殖
させて得た単層あるいはA431細胞をPBSで２回洗浄し、
クリスら（Kris）、1985“セル"40:619〜625の記載の如
くにして可溶化した。150mMNaCl、1.5mMMgCl2、1mMEGT
A、10％グリセロール、１％トリトンＸ−100、１％アプ
ロチニン（シグマ）および４μg/mlフェニルメチルスル
ホニル・フルオライド（PMSF）（シグマ）並びに0.5mg/
mlバシトラシン（シグマ）を含有する50mMHEPESバツフ
ァー（pH7.5）1mlを、この単層に４℃において５分間加
えた。培養皿から、可溶化されたタンパク質を含有して
いるバツファーを取り、４℃において５分間、10,000g
で遠心した。トランスメンブラン領域を欠失したハイブ
リッドリセプターで形質転換した細胞の培養上清を４℃
において５分間、10,000gで遠心した。細胞溶解液また
は培養上清0.2mlを200nMインシュリン（シグマ）または
１μMEGFと１時間インキュベートした。
インシュリンリセプターと結合し得るマウスのモノク
ローナル抗体［C II25.3、ガングリィら（Ganguly）198
5“細胞制御における今日の話題（Current Topics in C
ellular Regulation）”27:83−94］をプロティンＡ−
セファロースに吸着させて固定化した。しかしながら、
どの様なポリクローナルまたはモノクローナル抗−イン
シュリンリセプター抗体を用いても良いことは、理解で
きるであろう。抗体１μを、界面活性剤不含の溶解バ
ツファー中、膨潤させ、予め洗浄しておいたプロティン
Ａ−セファロース（1:1）のスラリーと30分間混合し、
抗−IR抗体を吸着させた。
固定化抗−IR抗体のスラリー50μをEGFまたはイン
シュリンで処理した細胞リゼイト、あるいは細胞培養上
清に加え、４℃で15分間インキュベートした。生成した
免疫沈降物をHNTGバツファー（20mMHEPES、pH7.5:150mM
NaCl、10％グリセロールおよび0.1％トリトンＸ−100）
0.9mlで４回洗浄した。容量30μの沈殿を5mMMnCl2に
調節し、15μCiのγ−32P−ATP（5,000Ci/mmol）を４℃
において0.5〜10分間で加えた。ATPの終濃度は、0.1pMA
TP（EGF、IERまたはＩαER形質転換体またはそれらの対
照に関して）、あるいは100μMATP（HIP形質転換体また
はその対照に関して）であった。３倍濃度のSDS試料バ
ツファー20μを加えることにより自己りん酸化反応を
反応終了させた。第3a及び3d図においては５分後、第3b
図においては１分後、そして第3c図においては指示した
時間の後に、５分間煮沸することによって自己りん酸化
を終了させた。試料を遠心し、20μづつ、５％/7％SD
Sポリアクリルアミドゲル上で分析した［ラエムリ（Lae
mmli）、1970“ネイチャー”277:680〜685］。
SDS−PAGE還元ゲル上で得られた泳動パターンはチロ
シンキナーゼ配列を含有するポリペプチドに対する35S
−Met標識法の結果と一致した。第3b図（HIR＋）から、
内因性COS−７コントロールの場合よりも、ヒトインシ
ュリンリセプターβサブユニットの場合の方が、インシ
ュリン刺激自己りん酸化が高いことが分る。この場合、
インシュリンリセプターキナーゼにとって必要なATPの
濃度（100μＭ）に起因して、観察されるシグナルは弱
いが、インシュリンの誘導効果は強い。これに対し、A4
31細胞EGF対照リセプター（A431）で認められるよう
に、EGFリセプターキナーゼの活性およびEGF刺激の測定
にはピコモル濃度しか必要としない。キメラリセプター
分子IERが特徴的に低濃度のATPを必要とすることは、そ
こに、EGFリセプターキナーゼが存在していることを示
すものである。リガンド誘導でキナーゼのVmaxが増加さ
れ、最大誘導（４倍）は４℃において、30秒間の反応の
後に認められた（第3c図）。この観察結果は野生型のEG
Fリセプターの動力学的特性とよく関連しており［スタ
ロスら（Staros）1985、「細胞制御の分子的側面（Mole
cular Aspects of Cellular Regulation）」４巻、「ト
ランスメンブランのシグナリングにおける分子機構（Mo
lecular Mechanisms of Transmembrane Signallin
g）］、このことは、インシュリン結合領域によってコ
ントロールされた場合でも、EGFリセプターキナーゼ
は、その本来の特徴を維持することを示すものである。
驚くべきことに、インシュリンで刺激された、あるい
は刺激されていないIEリセプターハイブリッドの130kd
りんタンパク質サブユニットは微妙な、しかし再現性の
ある、サイズの相違を示す（第3d図）。この観察結果か
らリガンド誘導酵素活性は、チロシン残基のりん酸化を
もたらすが、基本的なレベルでの修飾を伴なわず、以後
に続くリセプターの細胞質内領域の立体配座上の変化に
よってSDSゲル内での泳動特性が変化し得るという可能
性が示される。無傷のEGFリセプター内でも同様の変化
が起こり得るが、170kdグリコプロティンという大きい
モノマーサイズを有するので検出されていない。電気泳
動における変化は、Ca2＋／カモルジュリン依存性タン
パク質キナーゼ［クレットら（Kuret）、1985“ジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリィ”260:6427
〜6433］、タイプII cAMP−依存性タンパク質キナーゼ
［ヘミングスら（Hemmings）、1981“ヨーロピアン・ジ
ャーナル・オブ・バイオケミストリィ（Eur.J.Bioche
m.）”119:443〜451］等の他の自己りん酸化タンパク質
についても報告されている。
開裂されていないキメラプロリセプターIERはインシ
ュリン刺激による自己りん酸化を示すので（第3bおよび
3c図、IER＋ゲルの頂上のバンド）、インシュリンの結
合とシグナルの導入に必要な４級構造が、インシュリン
リセプターのタンパク分解的プロセッシングの前に形成
されているに相違なく、このことは先行文献とも一致す
る［ブラツクシェアーら（Blackshear）、1983、“FEB
S"158:243〜24;リース−ジョーンズ（Rees−Jones）198
3“バイオケミカル・アンド・バンドオフィジカル・リ
サーチ・コミュニケーションズ（Biochem.Biophys.Res.
Comm.）116:417〜422］。インシュリンリセプターのβ
サブユニットとプロリセプター開裂部位が欠失された細
胞外部分を有するキメラ組立て物ＩαERを用いた実験
（第3b図、ＩαER比較図、＋と−）によると、得られた
180kdの一本鎖糖タンパク質は、見かけ上インシュリン
に対する結合能力を有するにもかかわらず、細胞質内キ
ナーゼ領域に対するインシュリンの活性化能は失われて
いることが分った。
上記の如く、インシュリンはピコモル濃度以下のATP
の存在下、インシュリンリセプターのホスホトランスフ
ェラーゼが不活性であるような条件の下で、EGFリセプ
ターの自己りん酸化活性の程度を制御する。インシュリ
ンリセプターをαサブユニットとβサブユニット並びに
βサブユニットのアミノ末端にプロセッシングするため
のシグナルを含めて、インシュリンリセプターの完全な
細胞外部分を含有するハイブリッドIERに関してのみ、
ホルモンによるコントロールが認められた。リセプター
のプロセッシングは、本発明の発現系で行われるようで
ある。βサブユニットの全ての部分をも欠き、その結
果、開裂シグナルを欠くキメラＩαERの場合にはホルモ
ンの影響を認めなかった。この様なIERとＩαERとの構
造上の相違が、シグナル導入における決定的なキメラリ
セプターの構造に強く影響していると考えられる。
実施例 ５ リセプター−腫瘍遺伝子ハイブリッド（HE
R−erbB）をコードしているベクターの組立て Ｖ−erbB腫瘍遺伝子産物の細胞内領域とEGFリセプタ
ーの細胞外およびトランスメンブラン領域とを融合させ
たハイブリッドリセプター（HER−erbB、第４図）を組
立てた。
このハイブリッドリセプターは、SV40の初期プロモー
ターのコントロール下、プラスミドから発現される。こ
のプラスミドはメトトレキセート（MTX）耐性のための
突然変異体DHFR遺伝子をも含有している。ネオマイシン
耐性遺伝子をコードしているプラスミドで同時形質転換
して選択を行い、MTX−含有培養培地中で選択すること
によりDNAを増幅させた。
λHER−A64（ウールリッヒら）をSac IおよびNar Iで
消化し、EGFリセプターの全細胞外領域とトランスメン
ブラン領域とをコードしている制限フラグメントを回収
した。AEV−erbB（Ｈ）［ヤマモトら（Yamamoto,T.）19
83“セル”35:71〜78］の全細胞内領域をコードしてい
る1.7kbAha II−Stu I制限フラグメントをEGFフラグメ
ントと一緒に、Sac IとSma Iで切り開いたpUC12プラス
ミドにライゲートした。この組換えプラスミドを大腸菌
HB101内で増幅させ、全キメラリセプターをコードして
いる領域を3.7kbSac I−Xmn I制限フラグメント（両部
位は、それぞれEGFリセプターおよびｖ−erbB配列の非
翻訳領域に位置していた）中に取り出した。
p342E［クロウレィら（Crowley）、1983、“モル・セ
ル・バイオロ（Mol.Cell.Biol.）”３:44〜55］をEcoR
Iで消化し、開裂されたプラスミドを回収した。配列： を有するアダプターを開裂したプラスミドとライゲート
し、ライゲーション混合物で大腸菌294をトランスフェ
クトし、アダプター挿入体を含有するプラスミドpCVSVE
−HBSをアンピシリン耐性コロニーから回収した。
pCVSVE−HBSをSac Iで部分消化し、線状のベクターフ
ラグメント（Ｉ）を回収した。線状プラスミドをHpa I
で消化し、ベクターフラグメントを回収した。
pCVSVE−HBSベクターフラグメントとハイブリッドリ
セプターをコードしているSac I−Xmn Iフラグメントと
ライゲートし、形質転換された大腸菌HB101コロニーか
ら発現ベクターpCVSV−HER−erbBを回収した。
実施例 ６ リセプター−腫瘍遺伝子ハイブリッドの発
現 発現ベクターpCVSVE−HBS−erbBを、ネオマイシン耐
性を付与し得る発現プラスミドと一緒に、グラハムとフ
アン・デァ・エブ（1973）のプロトコールに基づくりん
酸カルシウム共沈法により、正常なラット１線維芽細胞
に同時トランスフェクトした。準全面成長した細胞を、
8cmの培養皿あたり10μｇのプラスミドDNAを用いてトラ
ンスフェクトした。DNAを1mMトリスpH7.5、0.1mM EDT
A、250mM CaCl20.55mlに溶かし、50mM HEPES pH7.12、2
80mM NaCl、1.5mM Na2HPO40.5mlをゆっくり加えた。40
分以内に徐々に沈殿が析出し、これを細胞培養培地10ml
に加えた。トランスフェクションから５時間後、細胞を
PBS中20％グリセロール3ml内で１分間インキュベートす
ることによりグリセリンショック処置に付した。グリセ
リンを洗い流した後、元の培地中で細胞をさらに培養し
た。
選択マーカーとしてSV40初期プロモーターのコントロ
ール下にあるネオマイシン耐性遺伝子を用いた。トラン
スフェクションの２日後、選択開始に際し、400μg/ml
のゲネティション（Geneticin）（シグマG5013）を補充
した培地を用いた。次いで、ネオマイシン耐性細胞を、
７％の透析したウシ胎児血清を含有し、メトトレキセー
ト（シグマA6770）を濃度200nM、次いで1000nMに補充し
た培地で増殖させた。その結果、ネオマイシン耐性セル
ラインにおけるcDNA発現の、段階的な増幅がみられた。
形質転換体内でのハイブリッドの発現は、最初、界面
活性剤によるリゼイトをヒトEGFリセプターに特異的な
マウスのモノクローナル抗体R1で免疫沈降させた後、35
S−メチオニンで代謝的にラベルされたタンパク質を分
析することにより監視された。安定に発現されるセルラ
インは35S−メチオニンで代謝的にラベルされている。
プロティンＡ−セファロースに吸着させたR1抗体によ
り、上記の如く調製された界面活性剤によるリゼイトか
ら特異的なタンパク質を免疫沈降させ、SDS還元ポリア
クリルアミドゲル上で分析した。マウスのR1モノクロー
ナル抗体［ウオーターフィールドら（Waterfield）、19
82、“ジャーナル・オブ・セルラー・バイオケミストリ
ィ（J.Cell.Biochem.）”20:149〜161］は、内因性のラ
ットＩ細胞のEGFリセプターを認識しない。HER−erbBタ
ンパク質は、メトトレキセートによる増幅の前または後
に、免疫沈降法により容易に検出された。予想通り、HE
R−erbBタンパク質はA431細胞内で発現される野生型のE
GFリセプターよりも小さかった。A431内で極めて高いレ
ベルにEGFリセプターが発現された場合と比較すると、
増幅されたRat I細胞は、３倍少ないHER−erbBを発現す
るにすぎない。
ハイブリッドHER−erbBタンパク質は、125I−EGFが種
々の濃度において形質転換体細胞と結合したことから、
特異的なEGF結合を示した。この結合は飽和され得るも
のであり、10倍過剰の非標識EGFの存在下では完全に置
換され得る。全面成長したラットＩ培養への125I−標識
EGFの結合量は個々の細胞培養中で発現されたEGFリセプ
ターまたはキメラリセプターの量に正確に対応してい
た。この様に、組立てられたタンパク質は完全な機能を
持ったEGF結合部位を含有しており、細胞表面に忠実に
移行されていた。
実施例 ７ EGFの刺激下でのインビトロにおける自己
りん酸化 HER−erbBがインビトロでの自己りん酸化活性を有す
るか否かを試験するために、細胞リゼイトを上記の如く
に免疫沈降させ、32P−γ−ATPと一緒にインキュベート
し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動とオートラジオグ
ラフィーによって分析した。8cmの培養皿中で増殖させ
た、形質転換された細胞の単一層をPBSで２回洗浄し、
クリスら（Kris）“セル”40:619〜625（1985）の記載
に従って可溶化した。この単一層に50mM HEPES pH7.5、
150mM NaCl、1.5mM MgCl2、1mM EDTA、10％グリセロー
ル、１％トリトンＸ−100、１％アプロチニンおよび４
μg/mlフェニルメチルスルホニルフルオライド（PMSF）
1mlを４℃で５分間、加えた。可溶可された細胞を４℃
で５分間、10,000gで遠心し、上清を−70℃で保持する
か、さらにプロセッシングした。
自己りん酸化のEGF刺激は、免疫沈降に先立って0.4ml
中、TX−100の濃度を0.5％に希釈しておいた界面活性剤
による細胞リゼイトと５μg/mlEGFとを４℃で15分間イ
ンキュベートすることにより誘導した。30分間プロテイ
ンＡ−セファロースに予め結合させておいたR1抗体を加
え（１μ抗体/50μスラリー、1:1）、４℃で15分間
イキュベーションを続けた。免疫沈殿物をNHTGバツファ
ー（20mM HEPES、pH7.5、150mM NaCl、10％グリセロー
ル、および0.1％トリトンＸ−100）0.9ml中で５回洗浄
した。容量30μの洗浄した免疫沈殿物を5mM MnCl2に
調節し、γ−32P−ATPT15μCiを４℃で0.5分間加えた。
３倍濃度のSDS試料バツファー20μを加えて自己りん
酸化を終了させた。試料を５分間煮沸し、遠心し、20μ
づつ、５％/7％ポリアクリルアミド還元ゲルで分析し
た（ラエムリ、1970）。減圧下、70℃でゲルを固定し、
乾燥させた。対照として、正常なRat I線維芽細胞を用
いた。サイズマーカーはキロダルトンで示されている。
野生型のEGFリセプター同様、HER−erbBハイブリッドに
より、免疫沈降物中に有意な量の32Pが取り込まれた。
りん酸化の程度はEGFの添加（＋で表されている）によ
って増大し;30秒間の測定では、EGFの存在下においてり
ん酸化の速度は３倍高いことが分った。ｖ−erbBタンパ
ク質はそれ自身、極めて低い自己りん酸化活性を有する
にすぎない［ラックスら（Lax）、1985、“EMBOジャー
ナル”４:3179〜3182］。ハイブリッドの自己りん酸化
活性は低いが、EGF結合領域の再構築により、リガンド
によって自己りん酸化活性が誘導され得る。
【図面の簡単な説明】
第1a図は、インシュリンリセプター（HIR）と表皮性成
長因子リセプター（HER）とのハイブリッドリセプター
の模式図である。第1b図は、HIR、HERおよびこれらのハ
イブリッドリセプターを比較して示した模式図である。
第２図は第1a図のcDNA組立て物でトランスフェクトされ
たCOS−７細胞における125Iインシュリンの結合程度を
示すグラフである。第3a〜3d図は、種々に形質転換され
た細胞の免疫沈降−自己りん酸化産物のSDS−PAGE還元
ゲル電気泳動の結果を示す写真の模式図である。第４図
はハイブリッドリセプターHER−erbBの模式図である。
第５図はリガンドの存在（＋）したおよび非存在下
（−）におけるHER−erbBのゲル電気泳動の結果を示す
写真の模写図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アクセル・ウールリッヒ アメリカ合衆国カリフォルニア94117、 サン・フランシスコ、アッパー・テラス 433番

Claims (17)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】（１）リセプターの細胞外領域で構成され
    ているリガンド結合領域、（２）該リガンド結合領域に
    対しヘテロローガスな、リセプターの細胞質領域である
    リポーターポリペプチド、および（３）該リガンド結合
    領域と該リポーターポリペプチドとの間に挿入されたト
    ランスメンブラン領域とを含有するハイブリッドリセプ
    ターであって、該リポーターポリペプチドは、該リガン
    ド結合領域がリガンドまたはリガンドのアゴニストもし
    くはアンタゴニストに結合したときに、コンフォメーシ
    ョンまたは機能面で分析可能な変化を生じ得るものであ
    るハイブリッドリセプター。
  2. 【請求項２】リポーターポリペプチドが腫瘍遺伝子産物
    の細胞質領域である第１項記載のハイブリッドリセプタ
    ー。
  3. 【請求項３】リポーターポリペプチドが酵素である第１
    項記載のハイブリッドリセプター。
  4. 【請求項４】リガンドのハイブリッドリセプターへの結
    合によって酵素が立体的に阻害されない第３項記載のハ
    イブリッドリセプター。
  5. 【請求項５】酵素がホスホリルキナーゼである第３項記
    載のハイブリッドリセプター。
  6. 【請求項６】（１）リセプターの細胞外領域で構成され
    ているリガンド結合領域、（２）該リガンド結合領域に
    対しヘテロローガスな、リセプターの細胞質領域である
    リポーターポリペプチド、および（３）該リガンド結合
    領域と該リポーターポリペプチドとの間に挿入されたト
    ランスメンブラン領域とを含有するハイブリッドリセプ
    ターであって、該リポーターポリペプチドは、該リガン
    ド結合領域がリガンドまたはリガンドのアゴニストもし
    くはアンタゴニストに結合したときに、コンフォメーシ
    ョンまたは機能面で分析可能な変化を生じ得るものであ
    るハイブリッドリセプターの製造方法であって、 （ａ）ハイブリッドリセプターの転写をコントロールす
    るためのプロモーターと機能的に結合しているハイブリ
    ッドリセプターをコードしている核酸を含有するベクタ
    ーで宿主細胞を形質転換し、さらに、 （ｂ）ハイブリッドリセプターの発現のための条件下で
    宿主細胞を培養することからなる方法。
  7. 【請求項７】宿主細胞の培養培地からハイブリッドリセ
    プターを回収することを含む第６項記載の方法。
  8. 【請求項８】宿主細胞の細胞膜からハイブリッドリセプ
    ターを回収することを含む第６項記載の方法。
  9. 【請求項９】生物学的に活性なリガンド、あるいは該リ
    ガンドのアンタゴニストまたはアゴニストを測定する方
    法であって、 （ａ）（１）リセプターの細胞外領域で構成されている
    リガンド結合領域、（２）該リガンド結合領域に対しヘ
    テロローガスな、リセプターの細胞質領域であるリポー
    ターポリペプチド、および（３）該リガンド結合領域と
    該リポーターポリペプチドとの間に挿入されたトランス
    メンブラン領域とを含有するハイブリッドリセプターで
    あって、該リポーターポリペプチドは、該リガンド結合
    領域がリガンドまたはリガンドのアゴニストもしくはア
    ンタゴニストに結合したときに、コンフォメーションま
    たは機能面で分析可能な変化を生じ得るものであるハイ
    ブリッドリセプターを得、 （ｂ）このリセプターを、リガンド、アンタゴニストま
    たはアゴニストを含有することが疑われている被検試料
    と一緒にインキュベートし、 （ｃ）リポーターポリペプチド中の変化を検出し、さら
    に、 （ｄ）該変化を被検試料中のリガンド、アンタゴニスト
    またはアゴニストの存在と関連づけることからなる方
    法。
  10. 【請求項１０】リガンドがポリペプチドであり、リガン
    ド結合領域がイムノグロブリンの抗原結合部位ではない
    第９項記載の方法。
  11. 【請求項１１】リポーターポリペプチドにおける変化が
    該ポリペプチドの酵素活性の変化である第９項記載の方
    法。
  12. 【請求項１２】リポーターポリペプチドにおける変化が
    該リポーターポリペプチドの自己りん酸化である第９項
    記載の方法。
  13. 【請求項１３】被検試料がアンタゴニストを含有してい
    ることを疑われるものであり、リセプターを、該被検試
    料および予め活性が決定されているリガンドまたはリガ
    ンドアゴニストと一緒にインキュベートする第９項記載
    の方法。
  14. 【請求項１４】リポーターポリペプチドにおける変化が
    免疫エピトープにおける変化である第９項記載の方法。
  15. 【請求項１５】リポーターポリペプチドと結合し得る抗
    体とリセプターとを一緒にインキュベートし、結合した
    ポリペプチドまたは結合せずに残存するポリペプチドを
    測定することにより、免疫エピトープに於ける変化を検
    出する第14項記載の方法。
  16. 【請求項１６】リポーターポリペプチドが、さらに、安
    定なフリーラジカル基、蛍光性の基または化学発光性の
    基を含有しており、リポーターポリペプチドの変化を、
    安定なフリーラジカルの回転モーメントの変化、あるい
    は、蛍光性または化学発光性の基の強度、波長または分
    極における変化の測定によって検出する第９項記載の方
    法。
  17. 【請求項１７】リポーターポリペプチドがＧタンパク質
    と結合し得るものである第９項記載の方法。
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