CN110606888A - 人体液中抗gababr自身抗体的检测材料、制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了人体液中抗GABABR自身抗体的检测材料、制备方法及应用，本发明将GABABR抗原包被于NC膜上制成抗GABABR受体检测材料，人血清和脑脊液中的特异性GABABR抗体会与抗原结合，利用碱性磷酸酶底物‑配体反应进行显色，并在显色反应中加入本发明的封闭材料，可用通过肉眼观察直接判断检测样品中是否含有GABABR抗体。该方法具有灵敏度高，操作简便，快速检测等优点，有助于抗GABABR受体脑炎的识别和诊断。

Description

人体液中抗GABABR自身抗体的检测材料、制备方法及应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种人体液中抗GABABR自身抗体的检测材料、制备方法及应用。
背景技术
抗γ-氨基丁酸B型受体(gamma-aminobutyric acid receptor，GABABR) 脑炎，属于神经免疫性脑炎，多数以癫痫为首发症状和记忆紊乱、精神症等边缘性脑炎症状，约50％的患者体内产生副肿瘤赘生物，多与小细胞肺癌有关，且预后不良。抗GABABR脑炎最早于2010年由Lancaster等报道，该研究利用免疫沉淀和免疫印迹的方法，于410位疑似副肿瘤相关脑炎或自免脑炎患者血液或脑脊液中检出15例患者含抗GABABR抗体。Romana等人利用免疫印迹和免疫荧光的方法，于9422例疑似自免脑炎患者和其他相关症状患者血液或脑脊液中检出20例含GABABR抗体，且从患者表现出症状到诊断花费时长大约4周左右。继抗GABABR自身抗体发现后，在病因学方面可与病毒性脑炎区分开。抗GABABR抗体的检测在脑脊液中的检出率高于血清，且免疫抑制疗法为有效的治疗方法。故早期抗-GABABR IgG 的识别对这类疾病的诊断和这类患者的治疗、预后有很大价值。
目前常用的检测手段有免疫荧光、ELISA、免疫印迹、免疫组化等方法，这些方法普遍存在检测过程耗时较长，步骤繁琐，抗体需求量大，成本高，灵敏度不高等缺点，利用这些方法很难一次性对大批量样本同时检测或针对某一个样本进行反复检测。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种对GABABR自身抗体进行检测的检测材料、该材料的制备方法及应用，解决现有的检测方法检测耗时长、步骤繁琐、抗体需求量大、成本高、灵敏度低等问题。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案予以实现：
人体液中抗GABABR自身抗体的检测材料的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，获取GABABR的CDS序列作为目的基因，将带有酶切位点的目的基因插入17T2A质粒载体中，得到重组质粒载体17T2A-GABABR；
其中，17T2A质粒载体包括含氨苄青霉素抗性基因AmpR序列、原核复制子pUC Ori序列、病毒复制子SV4 0O ri序列、RSV启动子、慢病毒5’ LTR、慢病毒3’LTR、Gag顺式元件、RRE顺式元件、env顺式元件、cPPT 顺式元件、eWPRE增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件、CMV启动子、 MCS多克隆位点以及T2A元件；
步骤2，将重组质粒载体17T2A-GABABR转染入293T细胞中，得到 17T2A-GABABR-293T细胞；
步骤3，裂解17T2A-GABABR-293T细胞，去除17T2A-GABABR-293T 细胞的核蛋白、DNA和胞浆蛋白，再加入复合提取液，4℃静置15～30min 后在35～40℃水浴，直至出现分层；
其中，复合提取液为Triton X100、CHAPS、N-甲基葡糖胺按照体积比为1:1:1的比例混合或洋地黄皂苷、Triton X100、NP40、CHAPS按照体积比1:1～2：1～2：1的比例混合；
步骤4：取分层后的沉淀，向沉淀中加入混合液混匀后离心，取上清液，在上清液中加入重悬液和BSA混匀，将所得上清液固化在载体膜上，得到人体液中抗GABABR自身抗体的检测材料；
其中，混合液由重悬液和蔗糖混合而成，蔗糖的体积摩尔浓度为1.9～5 mol/L；重悬液由0.6％～1％NaCl、0.05％～0.1％NP40和1xPI混合而成。
具体的，所述的步骤1具体包括以下步骤：
步骤1.1：通过人工合成或者PCR方法获得GABABR的CDS序列作为目的基因，在目的基因两端加设SalI/NotI的酶切位点；
步骤1.2：将带有酶切位点的目的基因插入17T2A质粒载体中，插入位点为SalI/NotI，得到重组质粒，将该重组质粒命名为17T2A-GABABR；
步骤1.3：对重组质粒17T2A-GABABR进行测序，将测序正确的带有目的基因的菌种扩大培养后进行质粒提取，得到重组质粒载体 17T2A-GABABR。
优选的，所述的步骤2中使用PEI转染方法、lipofectamin2000、lipofectamin3000、lipA或电转法将17T2A-GABABR转染入293T细胞中，其中，电转条件为1500V～2000V、25μF、200Ω。
优选的,所述的载体膜为硝酸纤维素膜、PVDF膜、尼龙膜、具有蛋白吸附能力的玻片、塑料材质的细胞培养皿或培养板。
本发明还公开上述制备方法制备的人体液中抗GABABR自身抗体的检测材料，该检测材料包括载体膜和固化在载体膜上的从 17T2A-GABABR-293T细胞提取的膜蛋白-细胞膜复合物。
本发明还公开了上述人体液中抗GABABR自身抗体的检测材料用于检测样品中的GABABR抗体。
具体的，检测样品中的GABABR抗体的检测过程具体包括：将待检测样品和封闭材料混合后孵育，孵育后加入到权利要求1至6任一项所述的抗 GABABR自身抗体的检测材料中再次孵育，洗涤，加入AP标记羊抗人IgG 二抗孵育后进行底物显色；
其中，封闭材料包括经过处理的载体膜和固化在处理后载体膜上的 17T2A-293T细胞蛋白；所述的载体膜的处理过程为：将载体膜加入2～4mol/L 的蔗糖溶液中，在100℃烘干20-30min或者37℃烘干8～16h。
本发明还公开了一种封闭材料的制备方法，包括：将载体膜加入 2～4mol/L的蔗糖溶液中，在100℃烘干20-30min或者37℃烘干8～16h；然后将提取的17T2A-293T细胞蛋白固化在处理后的载体膜上，得到封闭材料。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明选用改造后的慢病毒载体17T2A，利用病毒表达系统将 GABABR蛋白表达于293T细胞膜上，该载体不包含荧光基因看，更大限度的减少了载体的大小，更有助于目的基因的表达。同时本发明利用复合提取液提取GABABR蛋白-细胞膜复合物，获得了结构更完整的GABABR蛋白-细胞膜复合物。而且，本发明制备方法可获得浓度更高的GABABR蛋白-细胞膜复合物，用本发明的检测材料检测体液中GABABR抗体，具有更高的灵敏性和特异性。
(2)目前的GABABR抗体的检测方法主要有间接免疫荧光法、流式细胞术、酶联免疫吸附法、蛋白质免疫印迹法，中间接免疫荧光法与蛋白质免疫印迹法均均有操作复杂，操作技巧强(需专业人士或有经验人士操作)，且检测时长较长(需两天)；酶联免疫吸附法与流式细胞术检测成本高，同时需要特殊设备及需要有经验人士操作。而本发明的检测方法具有操作简单，不需要专业的设备辅助，且检测周期短，整个实验流程仅需1小时左右。
(3)本发明在检测过程中单独制备了封闭材料，该封闭材料来源于与检测材料同源的对照细胞，将该封闭材料应用于GABABR抗体的检测能有效的降低杂质蛋白带来的污染，增加检测灵敏度，强阳性血清稀释千倍以上，中等强度阳性血清稀释百倍以上倍，弱阳性血清稀释10倍以上，仍可检测出抗体。
附图说明
图1是本发明制备的检测材料用于检测样品时的显色反应检测过程。
图2是本发明的17T2A质粒载体图谱。
图3是实施例1的提取物的检测结果图。
图4是实施例5的检测结果，其中，图a为检测材料的示意图，其中A 区域包被GABABR细胞膜复合物，B区域包被对照细胞膜复合物；图b为阳性判读结果；图c为阴性判读结果；图d为阴性判读结果。
图5是实施例5和对比例1获得的检测结果。
图6是实施例5和对比例2获得的检测结果。
图7是实施例5和对比例3获得的检测结果。
具体实施方式
以下给出本发明的具体实施例，需要说明的是以下实施例仅是本发明的较佳实施例，本发明并不局限于以下具体实施例中，凡在本申请技术方案基础上做的等同变换均落入本发明的保护范围。
本发明下列实施例中的pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP载体购于SBI公司，293T细胞购买于ATCC公司，PLP1质粒、PLP2质粒、PMDG质粒均购于SBI公司，所使用的载体膜如NC膜、PVDF膜、尼龙膜、硝酸纤维素膜、玻璃纤维垫等均购买于MILLIPORE公司。
实施例1
步骤1，质粒构建：获取GABABR的CDS序列作为目的基因，将带有酶切位点的目的基因插入17T2A质粒载体中，得到重组质粒载体 17T2A-GABABR，测序正确后提取质粒进行后续实验，本实施例的质粒载体构建具体包括以下步骤：
步骤1.1：通过PCR方法(也可选人工合成法)获得GABABR的CDS 序列作为目的基因，并在目的基因两端加设SalI/NotI的酶切位点；
步骤1.2：将带有酶切位点的目的基因插入17T2A质粒载体中，插入位点为SalI/NotI，得到重组载体，将该重组载体命名为17T2A-GABABR；
其中，17T2A质粒载体是在pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP载体的基础上删除copGFP元件，同时以T2A元件替换FE1启动子，改造后的质粒载体图谱如图2所示。具体的，17T2A质粒载体包括含氨苄青霉素抗性基因 AmpR序列、原核复制子pUC Ori序列、病毒复制子SV4 0Ori序列、RSV 启动子、慢病毒5’LTR、慢病毒3’LTR、Gag顺式元件、RRE顺式元件、env顺式元件、cPPT顺式元件、eWPRE增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件、CMV启动子、MCS多克隆位点以及T2A元件；
其中，17T2A质粒载体的制备步骤为：
(1)合成引物从pCDH-CMV-MCS-T2A-puromycin载体扩增获得 NotI-T2A-puromycin-SalI片段，将PCR产物使用NotI和SaLI酶进行双酶切。
(2)pCDH-CMV-MCS-EF1a-copGFP载体通过NotI和SalI双酶切去除 EF1a-copGFP。(3)将NotI-T2A-puromycin-SalI连入酶切后的 pCDH-CMV-MCS-EF1a-copGFP载体，获得17-T2A。
步骤1.3：对重组质粒17T2A-GABABR进行测序，将测序正确的带有目的基因的菌种与载体菌种(即17T2A载体)扩大培养后进行质粒提取，得到重组载体17T2A-GABABR。
在本实施例中，取17T2A质粒的甘油菌种接种于氨苄青霉素抗性的3mL LB液体培养基，置37℃恒温培养箱，220r/min，过夜摇菌。第二日吸取菌液500μL保存菌种，剩余2.5mL菌液用质粒小提试剂盒提取，测浓度。
17T2A载体酶切：50μL酶切体系，3μg载体，SalI、NotI酶各1μL， 10x酶切Buffer 5μL，ddH2O补齐至50μL，37℃水浴酶切2h。
酶切产物回收，0.8％琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，按照凝胶回收试剂盒说明书进行载体片段回收。
目的基因与载体片段连接：20μL连接体系，50ng 17T2A载体，200ng GABABR基因片段，T4连接酶1μL，ddH2O补齐至20μL，16℃连接过夜。
将上述连接产物质粒分别转化入大肠杆菌DH5α中进行同源重组，涂布于氨苄青霉素固体LB培养板，37℃过夜，第二日挑取5个菌株，接种于氨苄青霉素(25ug/ml)液体LB培养基，37℃过夜培养。次日，各管吸取 500μL菌液，-20℃保存，剩余菌液质粒小提，酶切鉴定正确的菌株送测序再次鉴定。测序鉴定正确的菌株留取菌种，-80℃保存。
测序正确的带有目的基因菌种及载体菌种扩大培养进行质粒大提，测浓度。最终得到重组质粒载体17T2A-GABABR。
步骤2，慢病毒的扩增及感染：
将重组质粒载体17T2A-GABABR转染入293T细胞中，得到慢病毒 17T2A-GABABR-293T细胞，同时，该步骤还同时设置有对照组17T2A质粒(PS)的扩增及感染，具体包括以下步骤：
步骤2.1，293T细胞培养：DMEM高糖培养基与FBS按9:1比例配制成10％FBS-DMEM高糖培养基，将293T细胞培养加入高糖培养基中，待细胞融合至90％按1:5传代，置37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养。
慢病毒包装：待T-25培养瓶中293细胞长至培养皿底面积70％～80％，更换无血清DMEM高糖培养基继续培养2h，取步骤1得到的 17T2A-GABABR重组载体和17T2A载体(PS)总量15μg，与辅助质粒PLP1 质粒、PLP2质粒、PMDG质粒涡旋混合，其中，PLP1质粒:PLP2质粒:PMDG质粒的质量比为6.5:2.5:3.5，PEI 82.5μg，按着PEI转染方法分别转染 17T2A-GABABR重组载体和17T2A载体，6h后更换新鲜培养液，12h后再次更换培养基。
其中，转染方法还可以使用lipofectamin2000、lipofectamin3000、lipA 或电转(电转选用低场强0.4cm电转杯，电转条件1500V～2000V、25μF、 200Ω)。
2.3，慢病毒感染：转染24h后收集细胞培养液，加入到另一皿293T细胞中(细胞密度约为50％～60％)，培养24h后加入嘌呤霉素进行抗生素压力筛选，终浓度为6～8μg/mL。筛选24h后进行细胞传代，培养基中添加 3μg/mL嘌呤霉素，经过1～2次传代后获得稳定表达GABABR蛋白的细胞系(以下简称GABABR细胞)和稳定表达17T2A的对照细胞系(以下简称17T2A细胞，PS)，准备下一步提取蛋白。
步骤3：提取17T2A-GABABR-293T细胞的膜蛋白-细胞膜复合物，具体包括以下步骤：
3.1，弃细胞培养液，用0.85％NaCl清洗细胞1～2次，加入1ml裂解液 (0.85％NaCl，10mM Tris-HCl，1mM EDTA，1×PI)。用细胞刮板刮下 GABABR细胞，收集细胞至2mL EP管中，针头吹打10次，500g，4℃， 3min，收集上清至新的2mL EP管中。
上清中加入复合提取液，4℃静置15～30min后在37℃水浴，直至出现分层；其中，本实施例中的复合提取液为Triton X100、CHAPS、N-甲基葡糖胺按照体积比为1:1:1的比例混合的混合液。
3.2，取分层后沉淀，在冰水环境中静置，向沉淀中加入10％PEG的无水乙醇混匀(也可以是10％PEG的丙酮溶液或10％PEG的异丙酮溶液)； 4℃静置3min，去除上清液，得到沉淀，在沉淀中加入体积重悬液(10mM Tris-HCl，0.05％NP40，2×PI)，使其溶解，旋涡混匀后加入10％的甘油， -20℃保存，备用。如图2所示为利用GABABR抗体，通过Western Blot技术在103KD处出现明确条带，说明提取的样品包含GABABR蛋白。
步骤4，取稀释至合适浓度的膜蛋白-细胞膜复合物，取0.8μL，使用移液枪以圆形印记将其点在载体膜(载体一般选择NC膜)上，于37℃烘箱中烘烤10min，即可得到人体液中抗GABABR自身抗体的检测材料，于 4℃密封保存。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于：步骤3.1中的复合提取液为洋地黄皂苷、TritonX100、NP40、CHAPS按照体积比为1:1:1:1的比例混合的混合液。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于：步骤3.1中的复合提取液为洋地黄皂苷、TritonX100、NP40、CHAPS按照体积比为1:2:2:1的比例混合的混合液。
在将上述实施例中制备的抗GABABR自身抗体检测材料用于检测样品中的GABABR抗体时，本发明首先制备了一种新的封闭材料。由于人血清和脑脊液中存在的某些蛋白，在检测过程中会和抗原进行非特异性结合干扰检测结果，本发明使用一种封闭材料对检测样本进行封闭，实施效果发现可显著降低样本背景，以下给出本发明的封闭材料制备的具体实施例。
实施例4
本实施例公开了一种封闭材料的制备方法，具体包括：
1)将载体膜(本实施例选择玻璃纤维垫)裁成0.5cm×0.5cm的小正方形块，每小块玻璃纤维垫上点15μL 2.0M蔗糖溶液，100℃烤20min，室温放置备用；
2)17T2A细胞(PS)蛋白的提取：刮板刮取上述实施例步骤2.3中获得的17T2A细胞，将17T2A细胞收集于15ml离心管中，1000rpm，5min，室温，弃上清。沉淀加入1mL1×PBS(或生理盐水)，吹打混匀将液体转移至1.5ml EP管中，700g，5min，室温，弃上清。加入1/2细胞团块体积的封闭蛋白提取液(1.25％脱氧胆酸钠，0.25％Triton X-100，0.75％ CHAPS，20mMNaCl，2×PI)，吹打混匀将液体转移至2ml EP管中，涡旋震荡数秒后，静置数分钟直至管中有明显团块生成。补加1/2细胞团块体积0.8％NaCl，吹打，4000g，5min，收集上清，弃沉淀。上清与1/4体积 25％BSA混合，即为17T2A细胞蛋白液。
3)在每小块经1)处理过的玻璃纤维垫上点12μL 17T2A细胞蛋白液， 75℃烤20min，得到封闭材料，4℃放置备用。
封闭材质为玻璃纤维，将对照细胞的蛋白通过高温烘干固定在封闭材料上，使用时加入到血清或脑脊液稀释液中，蛋白可释放到液体中对检测样本中的干扰抗原发生反应，从而达到封闭效果。
实施例5
将实施例1制备的人体液中抗GABABR自身抗体的检测材料用于检测样品中的GABABR抗体，具体的，检测样品中的GABABR抗体的检测过程包括：
1)将上述实施例步骤4中获得的膜蛋白-细胞膜复合物检测材料置于24 孔板中，包被膜蛋白抗原的一面朝上。
2)血清封闭：待检测样品按1:250，用工作液(1×PBS，0.5％Triton X-100，0.04％EDTA)稀释后，每250μL稀释血清中加入一片实施例4制备的封闭材料，室温静置2min后，涡旋震荡数秒，再室温静置5min。
3)血清孵育：将封闭好的血清加入含有膜蛋白-细胞膜复合物检测材料的24孔板中，250μL/孔，将24孔板置于水平摇床(频率约为20次/min)，室温孵育25min。
4)洗涤：去除孔内的血清孵育液，加入工作液，500μL/孔，置于摇床(频率约为40次/min)，室温3min，弃去孔内工作液，重复清洗共3次。
5)二抗孵育：去除孔内的工作液，加入1:1000稀释的AP标记羊抗人 IgG抗体，300μL/孔。置于摇床(频率约为20次/min)，室温孵育25min。
6)洗涤：去除孔内的二抗孵育液，加入洗涤液(0.8％NaCl，0.5％ Triton X-100)，500μL/孔，置于摇床(频率约为40次/min)，室温3min，弃去孔内洗涤液。重复洗涤共3次。
7)显色：去除孔内的洗涤液后，加入底物稀释液(底物:反应缓冲液＝ 1:49)300μL/孔，室温避光静置2～5分钟，获得显色结果。
8)终止显色：弃去孔内的底物稀释液，并用蒸馏水漂洗本发明的检测材料1～2次，将其取出晾干或37℃-45℃烘干，分析结果。
其中，显色反应检测过程示意图如图1所示。图4所示为本实施例中的检测结果，其中，图a为本发明制备的人体抗GABABR自身抗体检测材料的示意图，其中A区域包被GABABR细胞膜复合物；B区域包被对照细胞膜复合物，作为阴性对照；图b为阳性判读结果；图c为阴性判读结果；图 d为阴性判读结果。
阳性结果判读：本发明制备的膜蛋白-细胞膜复合物检测材料的膜蛋白抗原包被区呈现明显的色斑，形状近似圆形，浅蓝灰色至深蓝黑色，颜色较其周边区域及阴性对照区深(如图4中b图所示)。
阴性结果判读：本发明制备的膜蛋白-细胞膜复合物检测材料的膜蛋白抗原包被区颜色浅于阴性对照区(如图4中c图所示)，或等同于阴性对照区 (如图4中d图所示)等，判定为阴性结果。
另外，实施例2和实施例3制备的检测材料用于检测时，检测效果与图实施例1的效果。
对比例1
本对比例与实施例1的区别在于：步骤3.1中所使用的提取液为 10mmol/L CHAPS。
检测过程同实施例3，分别对三个已经明确为GABABR阳性的血清(1 号，2号，3号)进行检测，结果见图5。实施例3组均能正确检出阳性结果，然而对比例1组三个阳性血清均未能检测阳性结果。说明本发明方法中的复合提取液能获得更好的检测效果。
对比例2
本对比例的检测材料的制备同实施例1，血清的检测过程与实施例3的区别在于：检测过程中不加入实施例2制备的封闭材料，不进行实施例3 中的“2)血清封闭”步骤。
两种不同的制备方法分别对三个已经明确为GABABR阳性的血清(1 号，2号，3号)进行检测，结果见图6。其中实施例3组均能正确检出阳性结果，然而对比例2组三个阳性血清均未能检测阳性结果。说明本发明方法中的封闭材料的使用能获得更好的检测效果。
对比例3
本对比例按照申请号201710175642.9的方法进行检测材料制备以及血清样品检测，具体步骤为：
1)通过人工合成获取GABABR的CDS序列，并在目的基因两端加设 NotI/NheI酶切位点；
2)将带有酶切位点的两种目的基因分别插入pCI-neo质粒载体中，插入位点为NotI/NheI，得到带有目的基因的质粒，命名为GABABR；按PEI 转染试剂转染方法转染培养好的HEK293细胞，得到表达GABABR基因的 HEK293/pCI-neo-GABABR细胞。
3)通过离心去除HEK293/pCI-neo-GABABR细胞的细胞核，然后加入 5～20mmol/L的CHAPS去垢剂，4℃作用30～60分钟，再离心去除未溶解部分，上清即为可溶性的GABABR-细胞膜复合物。
4)用1×TBS缓冲液稀释GABABR-细胞膜复合物，配制成GABABR- 细胞膜复合物的稀释液，GABABR-细胞膜复合物的稀释液中GABABR的浓度为0.1～1mg/mL，然后用划膜仪将GABABR-细胞膜复合物的稀释液按圆形或线性印迹在载体上，然后放入37℃烘箱内烘干，再使用固定液固定 10～20分钟，其中固定液为质量分数为4％多聚甲醛、冰甲醇或体积分数为 95％的乙醇；然后用PBS缓冲液洗去固定液，最后用质量分数为1％的BSA 封闭液于室温条件下封闭1小时或4℃封闭16～20小时，沥干封闭液并用双蒸水清洗干净，在20～28℃下晾干，即得到人体抗GABABR自身抗体检测材料，于-20℃密封保存待用；
5)用于检测样品中的GABABR抗体，具体检测过程为：
制备的人体抗GABABR自身抗体检测材料置于12孔板，包被GABABR 抗原的一面朝上；
血清孵育：检测样品按1:500稀释后加至孔内，1mL/孔。将12孔板置于水平摇床(频率约为30次/分钟)，室温孵育40分钟。
洗涤：去除孔内的血清孵育液，加入洗涤液，1mL/孔，置于摇床(频率约为30次/分钟)，室温3-5分钟，弃去孔内的洗涤液。重复清洗共3次。
二抗孵育：去除孔内的洗涤液，加入1:100稀释的AP标记羊抗人IgG 抗体，1mL/孔。置于摇床(频率约为30次/分钟)，室温孵育30分钟。
洗涤：去除孔内的二抗孵育液，加入洗涤液，1mL/孔，置于摇床(频率约为30次/分钟)，室温3～5分钟，弃去孔内洗涤液。重复洗涤共3次。
显色：去除孔内的洗涤液后，加入底物的稀释液(底物:反应缓冲液＝ 1:49)，1mL/孔。室温避光静置2～5分钟，可每隔1分钟查看一次。
终止显色：弃去孔内的底物稀释液，并用蒸馏水漂洗本发明的检测材料 1～2次，将其取出晾干或37℃～45℃烘干，分析结果。
两种不同的制备方法分别对三个已经明确为GABABR阳性的血清(1 号，2号，3号)进行检测，结果见图7。其中实施例3组均能正确检出阳性结果，然而对比例3组三个阳性血清均未能检测阳性结果。说明申请号 201710175642.9的方法不适用于GABABR抗体的检测。

Claims (8)

1.人体液中抗GABABR自身抗体的检测材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，获取GABABR的CDS序列作为目的基因，将带有酶切位点的目的基因插入17T2A质粒载体中，得到重组质粒载体17T2A-GABABR；
其中，17T2A质粒载体包括含氨苄青霉素抗性基因AmpR序列、原核复制子pUC Ori序列、病毒复制子SV4 0O ri序列、RSV启动子、慢病毒5’LTR、慢病毒3’LTR、Gag顺式元件、RRE顺式元件、env顺式元件、cPPT顺式元件、eWPRE增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件、CMV启动子、MCS多克隆位点以及T2A元件；
步骤2，将重组质粒载体17T2A-GABABR转染入293T细胞中，得到17T2A-GABABR-293T细胞；
步骤3，裂解17T2A-GABABR-293T细胞，去除17T2A-GABABR-293T细胞的核蛋白、DNA和胞浆蛋白，再加入复合提取液，4℃静置15～30min后在35～40℃水浴，直至出现分层；
其中，复合提取液为Triton X100、CHAPS、N-甲基葡糖胺按照体积比为1:1:1的比例混合或洋地黄皂苷、Triton X100、NP40、CHAPS按照体积比1:1～2：1～2：1的比例混合；
步骤4：取分层后的沉淀，向沉淀中加入混合液混匀后离心，取上清液，在上清液中加入重悬液和BSA混匀，将所得上清液固化在载体膜上，得到人体液中抗GABABR自身抗体的检测材料；
其中，混合液由重悬液和蔗糖混合而成，蔗糖的体积摩尔浓度为1.9～5mol/L；重悬液由0.6％～1％NaCl、0.05％～0.1％NP40和1xPI混合而成。
2.如权利要求1所述的人体液中抗GABABR自身抗体的检测材料的制备方法，其特征在于，所述的步骤1具体包括以下步骤：
步骤1.1：通过人工合成或者PCR方法获得GABABR的CDS序列作为目的基因，在目的基因两端加设SalI/NotI的酶切位点；
步骤1.2：将带有酶切位点的目的基因插入17T2A质粒载体中，插入位点为SalI/NotI，得到重组质粒，将该重组质粒命名为17T2A-GABABR；
步骤1.3：对重组质粒17T2A-GABABR进行测序，将测序正确的带有目的基因的菌种扩大培养后进行质粒提取，得到重组质粒载体17T2A-GABABR。
3.如权利要求1所述的人体液中抗GABABR自身抗体的检测材料的制备方法，其特征在于，所述的步骤2中使用PEI转染方法、lipofectamin2000、lipofectamin3000、lipA或电转法将17T2A-GABABR转染入293T细胞中，其中，电转条件为1500V～2000V、25μF、200Ω。
4.如权利要求1所述的人体液中抗GABABR自身抗体的检测材料的制备方法，其特征在于，所述的载体膜为硝酸纤维素膜、PVDF膜、尼龙膜、具有蛋白吸附能力的玻片、塑料材质的细胞培养皿或培养板。
5.权利要求1至4任一项所述的制备方法制备的人体液中抗GABABR自身抗体的检测材料，其特征在于，该检测材料包括载体膜和固化在载体膜上的从17T2A-GABABR-293T细胞提取的膜蛋白-细胞膜复合物。
6.将权利要求1至5任一项所述的人体液中抗GABABR自身抗体的检测材料用于检测样品中的GABABR抗体。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，检测样品中的GABABR抗体的检测过程具体包括：将待检测样品和封闭材料混合后孵育，孵育后加入到权利要求1至6任一项所述的抗GABABR自身抗体的检测材料中再次孵育，洗涤，加入AP标记羊抗人IgG二抗孵育后进行底物显色；
其中，封闭材料包括经过处理的载体膜和固化在处理后载体膜上的17T2A-293T细胞蛋白；所述的载体膜的处理过程为：将载体膜加入2～4mol/L的蔗糖溶液中，在100℃烘干20-30min或者37℃烘干8～16h。
8.权利要求7所述的封闭材料的制备方法，其特征在于，包括：将载体膜加入2～4mol/L的蔗糖溶液中，在100℃烘干20-30min或者37℃烘干8～16h；然后将提取的17T2A-293T细胞蛋白固化在处理后的载体膜上，得到封闭材料。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111693693A (zh) * 2020-06-29 2020-09-22 陕西脉元生物科技有限公司 人体液中肌炎、重症肌无力自身抗体检测试剂盒及方法
CN111751526A (zh) * 2020-06-29 2020-10-09 陕西脉元生物科技有限公司 人体液中抗gm、iidd、nr自身抗体检测试剂盒及方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104017827A (zh) * 2014-04-04 2014-09-03 天津医科大学总医院 一种慢病毒质粒表达载体及其构建方法和应用
CN107022548A (zh) * 2017-03-22 2017-08-08 陕西脉元生物科技有限公司 一种人体抗aqp4自身抗体检测材料及其制备方法
CN107556380A (zh) * 2017-09-04 2018-01-09 肇庆大华农生物药品有限公司 一种减少抗猪圆环病毒多克隆抗体中非特异性抗体的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104017827A (zh) * 2014-04-04 2014-09-03 天津医科大学总医院 一种慢病毒质粒表达载体及其构建方法和应用
CN107022548A (zh) * 2017-03-22 2017-08-08 陕西脉元生物科技有限公司 一种人体抗aqp4自身抗体检测材料及其制备方法
CN107556380A (zh) * 2017-09-04 2018-01-09 肇庆大华农生物药品有限公司 一种减少抗猪圆环病毒多克隆抗体中非特异性抗体的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ERIC P O"KEEFE，王秀英 译: "核酸转运：慢病毒和逆转录病毒载体", 《HTTP://WWW.LABOME.CN/METHOD/NUCLEIC-ACID-DELIVERY-LENTIVIRAL-AND-RETROVIRAL-VECTORS.HTML》 *
MCCRACKEN, LINDSEY等: "Improving the antibody-based evaluation of autoimmune encephalitis", 《NEUROLOGY-NEUROIMMUNOLOGY & NEUROINFLAMMATION》 *
祝婧烨等: "b 型流感嗜血杆菌多糖ELISA检测方法的建立", 《中国生物制品学杂志》 *
谢浩等: "去垢剂在膜蛋白研究中的应用", 《生物技术通报》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111693693A (zh) * 2020-06-29 2020-09-22 陕西脉元生物科技有限公司 人体液中肌炎、重症肌无力自身抗体检测试剂盒及方法
CN111751526A (zh) * 2020-06-29 2020-10-09 陕西脉元生物科技有限公司 人体液中抗gm、iidd、nr自身抗体检测试剂盒及方法
CN111693693B (zh) * 2020-06-29 2022-03-04 陕西脉元生物科技有限公司 人体液中肌炎、重症肌无力自身抗体检测试剂盒及方法

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