CN107556380A - 一种减少抗猪圆环病毒多克隆抗体中非特异性抗体的方法 - Google Patents

一种减少抗猪圆环病毒多克隆抗体中非特异性抗体的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种减少抗猪圆环病毒多克隆抗体中非特异性抗体的方法，具体为：通过应用PK‑15细胞碎片及由不同动物血清包被的ELISA板与抗猪圆环病毒多克隆抗体在常温下培育，使抗猪圆环病毒多克隆抗体中的非特异性抗体与PK‑15细胞碎片及ELISA板中的抗原相结合，进而除去抗猪圆环病毒多克隆抗体中的部分非特异性抗体。本发明的方法可以有效降低抗猪圆环病毒多克隆抗体中的非特异性抗体含量。

Description

一种减少抗猪圆环病毒多克隆抗体中非特异性抗体的方法
技术领域
本发明属于兽用生物制品行业，涉及一种减少抗猪圆环病毒多克隆抗体中非特异性抗体的方法。
背景技术
现有技术中抗猪圆环病毒多克隆抗体的制备主要采用猪圆环病毒作为抗原刺激机体，使机体通过免疫学反应，合成并分泌与抗原有特异性结合能力抗体，进而产生抗猪圆环病毒多克隆抗体。但动物在生长的过程中会接触或感染无数种微生物，而这些微生物都会刺激机体产生对猪圆环病毒具有非特异性的抗体，导致通过感染机体得到的抗猪圆环病毒多克隆抗体中具有多种非特异性抗体，降低抗猪圆环病毒多克隆抗体中特异性抗体含量，进而导致多克隆抗体会与不同抗原具有非常强的交叉反应，影响抗猪圆环病毒多克隆抗体在生物实验中的应用。因此，如何减少抗猪圆环病毒多克隆抗体中非特异性抗体对于抗猪圆环病毒多克隆抗体的应用非常重要。
发明内容
本发明提供了一种减少抗猪圆环病毒多克隆抗体中非特异性抗体的方法，以解决现有技术中抗猪圆环病毒的多克隆抗体中非特异性抗体含量过多的问题。
本发明的具体技术方案如下，一种减少抗猪圆环病毒多克隆抗体中非特异性抗体的方法，包括以下步骤：
步骤一：获取PK-15细胞碎片；
步骤二：分别使用血清含量为1-10vol％的鸡血清包被液、牛血清包被液、羊血清包被液、猪血清包被液、小鼠血清包被液、大鼠血清包被液、兔血清包被液包被ELISA板，洗涤后，分别得到包被鸡血清、牛血清、羊血清、猪血清、小鼠血清、大鼠血清、兔血清的ELISA板；
步骤三：稀释抗猪圆环病毒多克隆抗体；
步骤四：取稀释后的抗猪圆环病毒多克隆抗体与PK-15细胞碎片培育结合，离心，收集上清液；
步骤五：将步骤四所获得的上清液加入到步骤二所获得的包被血清的ELISA板中的一种中，培育后收集ELISA板中液体；
步骤六：将步骤五所获得的液体加入到剩下的包被血清的ELISA板中的一种中，培育后收集ELISA板中液体，重复步骤六，直到液体与所有的包被血清的ELISA板均进行过接触培育，最终收集到的液体即为减少了非特异性抗体的抗猪圆环病毒多克隆抗体。
进一步地，步骤一中PK-15细胞碎片通过以下方式获取：待PK-15细胞生长致密后，去除培养基，消化，1500-3000rpm/min离心后去上清，加入PBS溶液反复冻融后8000rpm/min离心，去上清液，从而获得PK-15的细胞碎片。
进一步地，步骤二中血清包被液中血清含量为4-8vol％，且包被后的ELISA板使用含有0.05％吐温的PBS溶液洗涤3次。
进一步地，步骤二中血清包被液中血清含量为5-7vol％。
进一步地，步骤三中使用含有0.005-0.1vol％吐温-20的PBS溶液稀释抗猪圆环病毒多克隆抗体，稀释比例为5-40倍。
进一步地，步骤三中吐温-20的含量为0.005-0.05vol％，稀释比例为10-20倍。
进一步地，步骤四中培育结合温度为常温，培育结合时间为1-5h，离心转速为8000rpm/min，离心时间为10-30min。
进一步地，步骤五和步骤六中，培育温度为常温，培育时间为2-5h。
进一步地，步骤五和步骤六中培育时间不低于2h。
进一步地，步骤二中的血清包被液中含有碳酸盐0.05mol/L，pH值为9-10。
本发明相对于现有技术，通过使稀释过的猪圆环病毒多克隆抗体与繁殖猪圆环病毒专用的PK-15细胞碎片相互结合，使抗猪圆环病毒多克隆抗体中的非特异性抗体与PK-15细胞碎片中的相应抗原结合，减少抗猪圆环病毒多克隆抗体中的非特异性抗体含量。此外，通过使抗猪圆环病毒多克隆抗体与依次与采用不同动物血清包被的ELISA板进行常温培育，使抗猪圆环病毒多克隆抗体中的非特异性抗体与不同动物血清中的抗原相结合，固定在ELISA板上，从而进一步降低抗猪圆环病毒多克隆抗体中的非特异性抗体含量。抗圆环病毒的多克隆抗体通过本发明的方法处理后，其非特异性抗体降低25倍以上。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。
PK-15细胞，又称猪肾传代细胞，主要用于病毒的培养，猪圆环病毒对此细胞特别敏感。
按照传统方法使用猪圆环病毒抗原免疫猪，制备猪圆环病毒的多克隆抗体。
实施例1
1.获得PK-15细胞碎片
PK-15细胞在T225的扁瓶上生长致密后，倒掉DMEM培养基，加入含有0.25％胰酶的消化液，细胞消化好后吸出胰酶，加入20mL PBS溶液吹散并回收细胞，取细胞液于50mL离心管中，在2000rpm/min的条件下离心15min，除去上清液，加入20mL 0.01M的PBS溶液，在-20℃下反复冻融后，以8000rpm/min的条件离心10-30min，弃去上清液，从而获得PK-15的细胞碎片。
2.制备包被有不同血清浓度的ELISA板
分别使用含量有5vol％鸡血清、5vol％牛血清，5vol％羊血清，5vol％猪血清，5vol％小鼠血清，5vol％大鼠血清，5vol％兔血清的不同ELISA包被液(含碳酸盐0.05mol/L，pH值为9.6)按照每孔300ul的添加量对ELISA板进行包被，2-4℃下孵育过夜后，倒掉液体，使用含有0.05vol％吐温20的0.01M PBS溶液每次每孔300ul的标准洗涤3次，并倒掉溶液，取ELISA板在37℃下干燥2h后，在2-4℃条件下保存；
3.通过PK-15细胞碎片去除抗猪圆环病毒多克隆抗体中非特异性抗体
使用吐温-20含量为0.01％的0.01MPBS溶液稀释抗猪圆环病毒多克隆抗体至10倍体积，把稀释好的多克隆抗体与步骤一所获得的PK-15细胞碎片相互结合，在常温下培育2h后，以8000rpm/min的条件离心30min，收集上清液。
4.通过不同动物血清包被的ELISA板去除抗猪圆环病毒多克隆抗体中非特异性抗体
4.1将步骤3所得的上清液和包被鸡血清的ELISA板在常温下结合2h，每孔200ul；
4.2把步骤4.1的ELISA板中液体转移到包被牛血清的ELISA中，每孔200ul，相互结合，常温，2h；
4.3把步骤4.2的ELISA板中液体转移到包被羊血清的ELISA中，每孔200ul，相互结合，常温，2h；
4.4把步骤4.3的ELISA板中液体转移到包被猪血清的ELISA中，每孔200ul，相互结合，常温，2h；
4.5把步骤4.4的ELISA板中液体转移到包被小鼠血清的ELISA中，每孔200ul，相互结合，常温，2h；
4.6把步骤4.5的ELISA板中液体转移到包被大鼠血清的ELISA中，每孔200ul，相互结合，常温，2h；
4.7把步骤4.6的ELISA板中液体转移到包被兔血清的ELISA中，每孔200ul，相互结合，常温，2h,最终收集到的液体即为减少了非特异性抗体的抗猪圆环病毒多克隆抗体。
5.检测液体中抗圆环病毒特异性抗体和非特异性抗体的浓度
5.1按照常规方法制备包被好圆环病毒的ELISA板；
5.2按照常规方法制备包被好牛血清白蛋白的ELISA板；
5.3将步骤4中最终获得的ELISA板中的液体用0.01MPBS按照5倍、25倍、125倍、625倍、3125倍和15625倍的比例稀释，按照50ul每孔加入步骤5.1和5.2所获得的ELISA板中，37℃下孵育2h。
4)使用0.02mol/L PBS(pH7.4)+0.05％Tween-20溶液对ELISA板洗涤3次，加入HRP-羊抗猪IgG二抗，每孔50ul，37℃下孵育1h；
5)加入TMB反应显色，10min，然后取ELISA板于450nm波长的ELISA读板机中进行读数。
对照实施例1
本发明对照实施例抗猪圆环病毒多克隆抗体的处理方法如下：取实施例1步骤3中未稀释的抗猪圆环病毒多克隆抗体，使用吐温-20含量为0.01％的0.01MPBS溶液稀释抗猪圆环病毒多克隆抗体至10倍体积。对照实施例1中抗圆环病毒特异性抗体和非特异性抗体的浓度的检测方法同实施例1步骤5。
表1：抗猪圆环病毒多克隆抗体中非特异性抗体取出情况
如表1所示，实施例及对照实施例中的多克隆抗体在与包被猪圆环病毒的ELISA板反应显色时具有相近的测试结果，说明实施例及对照实施例中针对猪圆环病毒具有特异性的抗体含量相近，进而说明经本发明处理方法不会对猪圆环病毒特异性抗体含量造成明显损失，具有较高的应用价值。此外，实施例中的多克隆抗体在与包被牛血清白蛋白的ELISA板反应显色时，显色结果随着多克隆抗体稀释倍数的增多而明显下降。相比之下，对照实施例中的多克隆抗体与包被牛血清白蛋白的ELISA板反应显色后，所得数值非常相近，要明显高于相同稀释倍数下实施例中多克隆抗体的测试数值，说明对照实施例的多克隆抗体中含有大量的非特异性抗体可与牛血清白蛋白结合，而实施例中的多克隆抗体含有较少的非特异性抗体。因此，依据实验结果可以确认，本发明所公开的方法能够高效除去猪圆环病毒多克隆抗体中的非特异性抗体，在提高多克隆抗体中特异性抗体含量的同时不会造成特异性抗体的大量损失，具有较好的应用价值。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，技术人员阅读本申请说明书后依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，但这些修改或变更均未脱离本发明申请待批权利要求保护范围之内。

Claims (10)

1.一种减少抗猪圆环病毒多克隆抗体中非特异性抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：获取PK-15细胞碎片；
步骤二：分别使用血清含量为1-10vol％的鸡血清包被液、牛血清包被液、羊血清包被液、猪血清包被液、小鼠血清包被液、大鼠血清包被液、兔血清包被液包被ELISA板，洗涤后，分别得到包被鸡血清、牛血清、羊血清、猪血清、小鼠血清、大鼠血清、兔血清的ELISA板；
步骤三：稀释抗猪圆环病毒多克隆抗体；
步骤四：取稀释后的抗猪圆环病毒多克隆抗体与PK-15细胞碎片培育结合，离心，收集上清液；
步骤五：将步骤四所获得的上清液加入到步骤二所获得的包被血清的ELISA板中的一种中，培育后收集ELISA板中液体；
步骤六：将步骤五所获得的液体加入到剩下的包被血清的ELISA板中的一种中，培育后收集ELISA板中液体，重复步骤六，直到液体与所有的包被血清的ELISA板均进行过接触培育，最终收集到的液体即为减少了非特异性抗体的抗猪圆环病毒多克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤一中PK-15细胞碎片通过以下方式获取：待PK-15细胞生长致密后，去除培养基，消化，1500-3000rpm/min离心后去上清，加入PBS溶液反复冻融后8000rpm/min离心，去上清液，从而获得PK-15的细胞碎片。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤二中血清包被液中血清含量为4-8vol％，且包被后的ELISA板使用含有0.05％吐温的PBS溶液洗涤3次。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述血清包被液中血清含量为5-7vol％。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤三中使用含有0.005-0.1vol％吐温-20的PBS溶液稀释抗猪圆环病毒多克隆抗体，稀释比例为5-40倍。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，吐温-20的含量为0.005-0.05vol％，稀释比例为10-20倍。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤四中培育结合温度为常温，培育结合时间为1-5h，离心转速为8000rpm/min，离心时间为10-30min。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤五和步骤六中，培育温度为常温，培育时间为2-5h。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，培育时间不低于2h。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤二中的血清包被液中含有碳酸盐0.05mol/L，pH值为9-10。
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