BR112020022168A2

BR112020022168A2 - células-tronco imaturas de polpa dentária e métodos de uso para tratar falência da medula óssea

Info

Publication number: BR112020022168A2
Application number: BR112020022168-6A
Authority: BR
Inventors: Irina Kerkis; Cristiane Valverde WENCESLAU; Vivian Fonseca Gonzaga
Original assignee: Avita International Ltd.; Fundação Butantan
Priority date: 2018-04-30
Filing date: 2019-04-30
Publication date: 2021-01-26
Also published as: US20210236557A1; WO2019211734A1

Abstract

A presente invenção refere-se ao campo das células- tronco adultas com origem na crista neural embrionária, em particular, células-tronco imaturas da polpa dentária (CTIPD). A invenção divulga composições e métodos úteis para a prevenção ou tratamento de uma ampla gama de doenças que levam a ou derivam de falência da medula óssea (FMO), Síndromes de Radiação Aguda ou lesão química através do uso de população isolada de CTIPD com manipulação in vitro mínima.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: “CÉLULAS-

TRONCO IMATURAS DE POLPA DENTÁRIA E MÉTODOS DE USO PARA TRATAR FALÊNCIA DA MEDULA ÓSSEA” REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica a prioridade e o benefício dos Pedidos de Patente Provisórios dos EUA Nº 62/664.894 depositados em 30 de abril de 2018. O conteúdo o qual é incorporado aqui por referência em sua totalidade.

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA EM SUA TOTALIDADE

[002] Este pedido cita a Patente EUA nº 9.790.468, depositada em 14 de março de 2014. O conteúdo da qual é incorporado neste documento por referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[003] A presente invenção se refere a células-tronco adultas com origem na crista neural embrionária. Mais especificamente, esta divulgação se refere a células-tronco multifuncionais da polpa dentária imaturas (CTIPDh), composições farmacêuticas que compreendem CTIPDh e métodos de tratamento de condições associadas à falência da medula óssea (FMO).

[004] A medula óssea vermelha (MO) é um tecido pegajoso, complexo e heterogêneo encontrado na cavidade medular dos ossos longos e nas cavidades dos ossos esponjosos do corpo. É anatomicamente constituído pelas células do estroma (fibroblastos, células reticulares adventícias, adipócitos e outras) responsáveis pela estrutura do tecido e pelas células do parênquima (células hematopoiéticas - células produtoras de sangue). Para fabricar essas células produtoras de sangue, a MO contém um pool de células-tronco hematopoiéticas (CTHs), que são células que se auto renovam e se diferenciam em células sanguíneas vermelhas (eritrócitos) e brancas (leucócitos) e geram megacariócitos e produzem plaquetas (PLT). Apenas as células hematopoiéticas maduras entram na corrente sanguínea. Com a idade, o BM vermelho tende a ser substituído pelo BM amarelo, que é composto principalmente de células de gordura.

[005] O estroma da MO é um elemento chave da hematopoiese que fornece o suporte estrutural e fisiológico para a produção de células sanguíneas. Também consiste em uma população heterogênea de diferentes tipos de células, entre as quais está uma população rara de células progenitoras esqueléticas não hematopoiéticas denominadas células estromais da medula óssea (CEMO). A MO vermelha (medula hematopoiética) e o estroma são componentes cruciais do microambiente hematopoiético, pois interagem e produzem juntos - ou individualmente - o crescimento humoral e/ou fatores inibitórios necessários para manter a hematopoiese normal, essencial para a vida e a saúde humana.

[006] MO pode ser suscetível a dois tipos de síndromes de falha: hereditária ou adquirida. As síndromes de falência da medula óssea hereditária (FMO) são um grupo de doenças caracterizadas por FMO em associação com uma ou mais anomalias somáticas. Geralmente é diagnosticado na infância e transmitido de pai para filho por meio da associação com alguma anormalidade genética, que pode causar a anemia aplástica (AA) e predisposição ao câncer.

Jovens e adultos podem desenvolver o FMO adquirido, que pode ser causado por diferentes fatores extrínsecos e intrínsecos, incluindo produtos químicos, irradiação, tratamentos de quimioterapia e danos ao sistema imunológico.

[007] Entre as doenças FMO, o AA adquirido é mais comum. O AA foi descrito pela primeira vez em 1888 por Paul Erich meramente como uma MO “vazia” com substituição por células de gordura e agora é definido por precursores hematopoiéticos diminuídos na MO, resultando em hipoplasia da MO, pancitopenia no sangue periférico (SP) e reposição precoce de gordura. A fisiopatologia de AA pode ser imunomediada; as células T expandidas oligoclonais destroem as células-tronco autólogas induzindo a apoptose; O fator de transcrição T-bet (T-box expresso em células T) é regulado positivamente em células T de pacientes com AA e níveis diminuídos de células T regulatórias também são observados. Uma pequena proporção de casos adquiridos compartilha a fisiopatologia com a doença hereditária - telômeros encurtados.

[008] O tratamento da AA adquirida depende da idade do paciente, saúde e gravidade da doença. Para tratar casos moderados de AA adquirida, geralmente são necessárias transfusões de sangue e cuidados de suporte com um antibiótico. No entanto, muitos casos moderados podem progredir para AA severa (AAS). Portanto, para tratar AAS adquirida, o transplante de CTHs de doador irmão compatível é uma questão de escolha, o que em alguns casos é satisfatoriamente eficaz. Pode ser usado em combinação com terapias imunossupressoras (IS). No entanto, a maioria dos pacientes não tem acesso ao transplante CTHs imediato devido à falta de um irmão doador compatível.

[009] No entanto, o sucesso do transplante de CTHs é limitado devido a complicações tardias, como rejeição do enxerto e recaída devido ao ataque autoimune ressurgente e, mais frequentemente, devido ao desenvolvimento de doença enxerto contra hospedeiro (GVHD), enquanto a falta de resposta, a recidiva e a evolução clonal limitam o sucesso das drogas de supressão imunológica. Assim, há necessidade de células-tronco que se auto renovem, possam se diferenciar em células multi linhagens e não levem a complicações tardias.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0010] A presente invenção fornece composições e métodos úteis para tratar ou prevenir a falência da medula óssea.

[0011] Em certos aspectos, o método envolve tipicamente a administração de uma composição compreendendo uma população de células-tronco da polpa dentária imatura isolada (CTIPD) em uma quantidade suficiente para tratar ou prevenir a falência da medula óssea.

[0012] Em uma modalidade exemplar, o método de tratamento ou prevenção de falência da medula óssea compreende a administração de CTIPDs capazes de migrar para a medula óssea do indivíduo.

[0013] Em outra modalidade exemplar, o método trata ou previne a falência da medula óssea causada pela exposição à radiação. Em uma implementação particular, a falência da medula óssea é causada por uma exposição à radiação em uma dose de 1 a 30 Gy. Em outra implementação particular, a composição é administrada entre 24 e 60 horas após a exposição à radiação.

[0014] Em uma modalidade, as CTIPDs estão em uma quantidade suficiente para aumentar os precursores de fibroblastos na medula óssea do indivíduo.

[0015] Em outra modalidade, as CTIPDs estão em uma quantidade suficiente para aumentar a contagem de eritrócitos (glóbulos vermelhos) na medula óssea do indivíduo.

[0016] Em outra modalidade, as CTIPDs estão em uma quantidade suficiente para aumentar o nível de hematócrito na medula óssea do indivíduo.

[0017] Em um aspecto, as CTIPDs estão em uma quantidade suficiente para aumentar a contagem de leucócitos (leucócitos) na medula óssea do indivíduo.

[0018] Em outro aspecto, as CTIPDs estão em uma quantidade suficiente para aumentar megacariócitos, células Sca-1-positivas, células Nestina-positivas, células fibronectina-positivas, células CD44-positivas ou uma combinação das mesmas na medula óssea do indivíduo.

[0019] Em um aspecto adicional, as CTIPDs estão em uma quantidade suficiente para aumentar a celularidade da medula óssea no indivíduo.

[0020] Em uma implementação, as CTIPDs estão em uma quantidade suficiente para aumentar a remodelação da matriz extracelular na medula óssea do indivíduo.

[0021] Em outra implementação, as CTIPDs estão em uma quantidade suficiente para reduzir a apoptose de células da medula óssea no indivíduo.

[0022] Em uma implementação adicional, as CTIPDs estão em uma quantidade suficiente para reduzir os níveis séricos de TNF-α e/ou IL-17A no indivíduo.

[0023] Em uma modalidade, as CTIPDs estão em uma quantidade suficiente para aumentar os níveis séricos de IL-4 e/ou IL-10 no indivíduo.

[0024] Em outra modalidade, as CTIPDs estão em uma quantidade suficiente para melhorar a recuperação hematopoiética por ao menos 6 meses.

[0025] Em um aspecto, o método compreende a administração da composição por ao menos duas vezes. Em uma modalidade particular, as administrações consecutivas têm um intervalo de entre 10 e 20 dias.

[0026] Em outros aspectos, a presente invenção fornece uma composição para tratar ou prevenir a insuficiência da medula óssea. Normalmente, a composição compreende uma população de células-tronco imaturas da polpa dentária humana (CTIPDh) preparadas pela obtenção de uma polpa dentária (PD); estabelecer uma cultura de explante colocando o PD em uma superfície de plástico em um meio de cultura e permitindo que as CTIPDs migrem para fora do PD; passagem das CTIPDs para expandir a cultura do explante; transferir mecanicamente o PD para uma superfície de plástico diferente no meio de cultura; e coletar as CTIPDs que aderem à superfície de plástico da cultura de explante,

a população de CTIPDs compreendendo CTIPDs. Em modalidades particulares, as CTIPDs são obtidas após cinco transferências e quatro ou cinco passagens.

[0027] Em uma implementação do método ou composição, pelo menos 80% das CTIPDs expressam CD117 (c-kit) e/ou Fibronectina.

[0028] Em outra implementação, 96% a 99% das CTIPDh são positivas para um ou mais dos seguintes marcadores: CD105, CD73, CD44, CD117, Nestina, Vimentina e Fibronectina.

[0029] Em uma implementação particular, 96% a 99% dos CTIPDs são negativas para um ou mais dos seguintes marcadores: CD45, CD34-negativo e HLA DR.

[0030] Em certas modalidades, a composição inclui ainda células-tronco da medula óssea, células-tronco hematopoiéticas ou ambas.

[0031] Em certas modalidades exemplares, o indivíduo é humano e/ou as CTIPDs são alogênicas.

[0032] Composições exemplares que são úteis compreendem 5x106-1x109 de CTIPDs.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0033] A FIG. 1 representa árvore de ontologia de desenvolvimento embrionário (adaptado de http://discovery.lifemapsc.com/) demonstrando a diferença na origem embrionária observada em células tronco mesenquimais (CTM) e semelhantes à CTM. Os tecidos embrionários iniciais se originam do ectoderma, mesoderma, endoderme (não mostrado) e mesoderma extraembrionário.

Tanto a medula óssea quanto as CTM do tecido adiposo se originam do mesoderma. As células semelhantes às CTM da polpa dentária originam-se da ectoderme.

[0034] A FIG. 2 representa um esquema não limitado de tratamento de falência da medula óssea usando terapia com CTIPDh. A ordem cronológica: Pré-irradiação (D0) seguida de irradiação, os animais recebem três administrações de CTIPDh: 48 horas após a irradiação (D2), 15 dias após a primeira administração (D17) e 15 dias após a segunda administração (D32). A eutanásia foi realizada 30 dias após a terceira administração (D62). Amostras de sangue foram coletadas em D0, 2, 17, 32 e 62, e o baço foi coletado em D62.

[0035] As FIGs. 3A-3E mostram imunomarcação positiva (FITC) para expressão de CD90, Fibronectina, Nestina, Vimentina e CD44 em CTIPDh. O núcleo é corado com DAPI.

Barras de escala = 5pm. FIG. 3F quantifica a porcentagem de CTIPDh que expressam marcadores de CTM indicados usando citometria de fluxo.

[0036] As FIGs. 4A-4C comparam a massa corpórea entre os grupos de tratamento com CTIPDh e sem tratamento. A massa corpórea aumentou significativamente em D32 (*, P +

0,05) e D62 (***, P + 0,001). Os asteriscos indicam significância estatística (ANOVA).

[0037] As FIGs. 5A-5B comparam as contagens de eritrócitos (glóbulos vermelhos) entre os grupos de tratamento com CTIPDh e os sem tratamento. O grupo de tratado com CTIPDh exibe uma diminuição significativa em D2 (**, P + 0,01) e D17 (***, P + 0,001), uma recuperação significativa (##, P +0,01) em D32 e mantendo contagens normais de eritrócitos (> 11x106/qL) até D62. O grupo sem tratamento com CTIPDh exibe quedas consecutivas na contagem de eritrócitos até D62. Antes da irradiação (D0), não foi detectada diferença estatisticamente significativa entre os grupos.

[0038] As FIGs. 6A-6B comparam os níveis de hematócrito (HTC%) entre os grupos de tratamento com CTIPDh e sem tratamento. O grupo de tratamento com CTIPDh exibe uma diminuição significativa em D2 (**, P + 0,01) e D17 (***, P + 0,001), uma recuperação significativa (##, P + 0,01) em D32 e manutenção dos níveis normais de hematócrito (> 50%) até D62. O grupo sem tratamento exibe uma redução significativa em D2 (**, P + 0,01), o pico de redução em D17 (***, P + 0,001), e a redução dura até D62 (**, P + 0,01). Asterisco indica significância estatística (ANOVA).

Antes da irradiação (D0), não foi detectada diferença estatisticamente significativa entre os grupos.

[0039] As FIGs. 7A-7C comparam as contagens de leucócitos (células brancas do sangue) (x103/qL) entre os grupos de tratamento com CTIPDh e não-tratamento. O grupo de tratamento com CTIPDh exibe uma redução significativa dos valores absolutos de leucócitos em D2 (***), D17, (***,), D32 (**) e D62 (**), e uma recuperação significativa (###) no D32. O grupo sem tratamento apresenta uma redução significativa após a irradiação (***), que foi mantida até D62 (***). Asterisco indica significância estatística (ANOVA), P + 0,01 (**), P <0,001 (***) e P + 0,001 (###). Antes da irradiação (D0), não foi detectada diferença estatisticamente significativa entre os grupos.

[0040] As FIGs. 8A-8D comparam microfotografia de seções de MO coradas com hematoxilina e eosina em uma ampliação de 40x ou 200x. Sem irradiação, os canais medulares são preenchidos com elementos hematopoiéticos na MO. A irradiação causa uma diminuição na celularidade, uma região maior do estroma medular (indicada pelas setas), e células vermelhas do sangue infiltradas (FIG. 8D) (indicado pelo asterisco maior em vermelho) na MO do grupo irradiado (48 horas após irradiação).

[0041] As FIGs. 9A-9F comparam microfotografia de seções de MOI coradas com hematoxilina e eosina com ampliação de 40x ou 200x. A MO do grupo de tratado com

CTIPDh exibe canal medular preenchido com elementos medulares (FIGs. 9A-9B). A MO do grupo sem tratamento exibe hipoplasia medular devido à diminuição da celularidade e reposição de gordura (FIGs. 9C-9D) e aplasia de MO com ausência de células (FIGs. 9E-9F). O estroma medular é indicado pela seta vermelha mais curta, as células de gordura são indicadas por setas pretas mais longas e os eritrócitos infiltrados são indicados pelo asterisco.

[0042] As FIGs. 10A-10F comparam a microfotografia dos esfregaços de MO em uma ampliação de 200x, 400x ou 1000x.

Elementos hematopoiéticos, precursores hematopoiéticos (FIGs. 10A-10B) e megacariócitos (FIG. 10C) do grupo de tratado com CTIPDh são indicados por setas vermelhas e mais curtas. FIGs. 10D-10F representam MO do grupo sem tratamento. Observe uma diminuição dos elementos hematopoiéticos. FIGs. 10E-10F representam células adiposas que substituíram os elementos hematopoiéticos (indicados por setas pretas mais longas).

[0043] As FIGs. HA-HG representa microfotografia do ensaio da unidade formadora de colônias (UFC-F) derivado da lavagem medular de animais tratados com CTIPDh. FIG. HA representa placa de cultura de 6 poços após 21 dias de cultura corado com cristal violeta. FIGs. HB-HG representam colônias de células.

[0044] As FIGs. 12A-12G representam microfotografia do ensaio da unidade formadora de colônias (UFC-F) derivado da MO de animais não tratados com CTIPDh.

[0045] As FIGs. 13. Comparam o número de UFC-F nos grupos não irradiados, irradiados sem tratamento com CTIPDh e tratamento com CTIPDh 48 horas após a irradiação. As unidades formadoras de colônias foram reduzidas significativamente 48 horas após a irradiação (***). A redução não foi recuperada no grupo não tratado (***). O tratamento com CTIPDh aumentou significativamente a eficiência de geração de UFC (##). O asterisco indica significância estatística (ANOVA) na redução dos níveis de UFC entre os grupos experimentais P + 0,001 (***) e P +0,01. (##) indica significância estatística no aumento do número de UFCs.

[0046] As FIGs. 14A-14D representam histogramas representativos da análise de citometria de fluxo do fenótipo de p53 na medula óssea analisada em: controle (FIG. 14A), tratamento com CTIPDh 48 horas após a irradiação (FIG. 14B) e irradiação sem tratamento com CTIPDh (FIG. 14C). FIG. 14D representa a porcentagem de células imunopositivas para p53. Há um aumento significativo (*) de células positivas para p53 48 horas após a irradiação em relação ao controle. Há uma diminuição de células positivas para p53 em ambos os grupos experimentais, e o grupo tratado com CTIPDh tem uma média menor de células positivas para p53 do que o grupo não tratado. Os asteriscos indicam significância estatística (ANOVA) entre 48 horas após a irradiação e controle, P +0,05 (*). Os gráficos são gerados pelo software GraphPad Prism 5 (GraphPad; PRISM, 2007). FIGs. 14E-14G1 representam anticorpo anti-p53 de imunohistoquímica (cor marrom). O tratamento com CTIPDh promoveu maior proteção das células da MO afetadas após a irradiação.

[0047] As FIGs. 15A-15D representam histogramas representativos da análise de citometria de fluxo do fenótipo de fibronectina na medula óssea analisada em: controle (FIG. 15A), tratamento com CTIPDh 48 horas após a irradiação (FIG. 15B) e irradiação sem tratamento com CDTIPDh (FIG. 15C). FIG. 15D representa a porcentagem de células imunopositivas à fibronectina. Há diminuição significativa de células positivas para fibronectina (*) 48 horas após a irradiação em relação ao controle. Há um aumento em ambos os grupos experimentais, sendo a tratada com CTIPDh maior do que o não tratado. Os asteriscos indicam significância estatística (ANOVA) entre irradiação e controle, P +0,05 (*). Os gráficos são gerados pelo software GraphPad Prism 5 (GraphPad; PRISM, 2007).

[0048] As FIGs. 16A-16D representam microfotografia da imunocitofluorescência (FIGs. 16A-16B), imunocitoquímica

(FIGs. 16C-16D) e ensaios de imuno-histoquímica (FIGs. 16E- 16F) da fibronectina do filamento intermediário no aspirado da MO do grupo tratado com CTIPDh ou do grupo não tratado.

A fibronectina foi detectada no citoplasma dos grupos tratados (FIGs. 16A, 16C e 16E) e grupos não tratados (FIGs. 16B, 16D e 16F) na MO (FIGs. 16A-16B), as células do aspirado medular cultivadas in vitro (FIGs. 16C-16D) e a matriz extracelular da MO (FIGs. 16E-16F). A seta branca mostra células marcadas com FITC com morfologia fibroblastóide (FIG. 16C) do grupo tratado. Observe a falta de células marcadas no grupo não tratado (FIG. 16D).

[0049] As FIGs. 17A-17D representam histogramas representativos da análise de citometria de fluxo do fenótipo Nestina na medula óssea. Controle (FIG. 17A), tratamento com CTIPDh 48 horas após a irradiação (FIG. 17B) e irradiação sem tratamento com CTIPDh (FIG. 17C). FIG. 17D representa a porcentagem de células imunopositivas à fibronectina. Há diminuição significativa de células Nestina-positivas (*) 48 horas após a irradiação e no grupo não tratado (**) em relação ao controle. Há um aumento no grupo tratado com CTIPDh (#) em relação à irradiação. Os asteriscos indicam significância estatística (ANOVA) entre os grupos, P +0,05 (*) e P +0,01 (**). # indica significância estatística no aumento da expressão da Nestina, P +0,05 (#).

[0050] As FIGs. 18A-18F representam imunomarcação para Nestina observada em grupos tratados (FIGs. 18A, 18C e 18E) e não tratados (FIGs. 18B, 18D e 18F). As imunomarcações positivas para Nestina foram observadas no citoplasma da MO (FIGs. 18A-18B), nas células do aspirado medular cultivadas in vitro (FIGs. 18C-18D) e na matriz extracelular da MO (FIGs. 18E-18F).

[0051] As FIGs. 19A-19D representam histogramas representativos da análise de citometria de fluxo do fenótipo CD105 na medula óssea. Controle (FIG. 19A), tratamento com CTIPDh 48 horas após a irradiação (FIG. 19B) e irradiação sem tratamento com CTIPDh (FIG.19C). FIG. 19D representa a porcentagem de células CDl05-imunopositivas.

Há tendência de aumento de células CD105 positivas no grupo tratado com CTIPDh (#) em relação ao grupo irradiado. Não foi observada significância estatística entre os grupos.

[0052] As FIGs. 20A-20D representam histogramas representativos da análise de citometria de fluxo do fenótipo C-kit na medula óssea. Controle (FIG. 20A), tratamento com CTIPDh 48 horas após a irradiação (FIG. 20B) e irradiação sem tratamento com CTIPDh (FIG. 20C). FIG. 20D representa a porcentagem de células C-kit-positivas. Há uma leve diminuição nas células C-kit positivas 48 horas após a irradiação em relação ao controle. Há um aumento de células

C-kit-positivas no grupo tratado com CTIPDh em comparação com o grupo não tratado.

[0053] As FIGs. 21A-21F representam imunomarcação para C-kit em grupos tratados (FIGs. 21A, 21C e 21E) e não tratados (FIGs. 21B, 21D e 21F). A imunocoloração positiva para C-kit é observada no citoplasma da MO (FIGs. 21A-21B), as células do aspirado medular cultivadas in vitro (FIGs.

21C-21D) e a matriz extracelular da MO (FIGs. 21E-21F).

[0054] As FIGs. 22A-22D representam histogramas representativos da análise de citometria de fluxo do fenótipo CD34 na medula óssea analisado em: controle (FIG.

22A), tratamento com CTIPDh 48 horas após a irradiação (FIG. 22B) e irradiação sem tratamento com CTIPDh (FIG.

22C). FIG. 22D representa a porcentagem de células Sca-l- positivas. Houve diminuição das células CD34-positivas 48 horas após a irradiação em relação ao controle. Houve aumentos em ambos os grupos experimentais, com um aumento maior no grupo tratado com CTIPDh.

[0055] As FIGs. 23A-23F representam a imunomarcação de CD34 em grupos tratados (FIGs. 23A, 23C e 23E) e não tratados (FIGs. 23B, 23D e FIG. 23F). A imunocoloração positiva de CD34 é observada no citoplasma da MO (FIGs.

23A-23B), as células do aspirado medular cultivadas in vitro (FIGs. 23C-23D) e a matriz extracelular da MO (FIGs.

23E-23F).

[0056] As FIGs. 24A-24D representam histogramas representativos da análise de citometria de fluxo do fenótipo Sca-1 na medula óssea analisado em: controle (FIG.

24A), tratamento com CTIPDh 48 horas após a irradiação (FIG. 24B) e irradiação sem tratamento com CTIPDh (FIG.

24C) FIG. 24D representa a porcentagem de células C-kit- positivas. Há um ligeiro aumento de células Sca-l-positivas 48 horas após a irradiação em relação ao controle. Há um aumento de células Sca-l-positivas no grupo tratado com CTIPDh em comparação com o grupo não tratado.

[0057] As FIGs. 25A-25F representam a imunomarcação de Sca-1 em grupos tratados (FIGs. 25A, 25C e 25E) e não tratados (FIGs. 25B, 25D e 25F). A imunocoloração positiva de Sca-1 é observada no citoplasma da MO (FIGs. 25A-25B), nas células do aspirado medular cultivadas in vitro (FIGs.

25C-25D) e na matriz extracelular da MO (FIGs. 25E-25F).

[0058] As FIGs. 26A-26D representam histogramas representativos da análise de citometria de fluxo do fenótipo CD45 na medula óssea analisada em: controle (FIG.

26A), tratamento com CTIPDh 48 horas após a irradiação (FIG. 26B) e irradiação sem tratamento com CTIPDh (FIG.

26C). FIG. 26D representa a porcentagem de células positivas para CD45. Há uma diminuição dramática de células CD45-positivas 48 horas após a irradiação em relação ao controle. Há um aumento significativo de células positivas para CD45 no grupo tratado com CTIPDh em comparação com o grupo não tratado.

[0059] As FIGs. 27A-27F representam a imunomarcação de CD45 em grupos tratados (FIGs. 27A, 27C e 27E) e não tratados (FIGs. 27B, 27D e 27F). A imunocoloração positiva de CD45 é observada no citoplasma da MO (FIGs. 27A-27B), nas células do aspirado medular cultivadas in vitro (FIGs.

27C-27D) e na matriz extracelular da MO (FIGs. 27E- 27F).

[0060] As FIGs. 28A-28D representam histogramas representativos da análise de citometria de fluxo do fenótipo CD44 na medula óssea analisada em: controle (FIG.

28A), tratamento com CTIPDh 48 horas após a irradiação (FIG. 28B) e irradiação sem tratamento com CTIPDh (FIG.

28C). FIG. 28D representa a porcentagem de células positivas para CD44. Há uma diminuição dramática de células positivas para CD44 48 horas após a irradiação em relação ao controle. Há um aumento significativo de células positivas para CD44 no grupo tratado com CTIPDh em comparação com o grupo não tratado. Os asteriscos indicam significância estatística (ANOVA) entre 48 horas após a irradiação e controle, P +0,05 (*). # indica significância estatística no aumento da expressão de células positivas para CD44, P +0,05 (#).

[0061] As FIGs. 29A-29F representam imunomarcação de CD44 em grupos tratados (FIGs. 29A, 29C e 29E) e não tratados ((FIGs. 29B, 29D e 29F). A imunomarcação positiva para CD44 é observada no citoplasma da MO (FIGs. 29A- 29B), as células do aspirado medular cultivadas in vitro (FIGs.

29C-29D) e a matriz extracelular da MO (FIGs. 29E-29F).

[0062] As FIGs. 30A-30D representam histogramas representativos da análise de citometria de fluxo do fenótipo CD90 na medula óssea analisada em: controle (FIG.

30A), tratamento com CTIPDh 48 horas após a irradiação (FIG. 30B) e irradiação sem tratamento com CTIPDh (FIG.

30C). FIG. 30D representa a porcentagem de células positivas para CD90. Há diminuição das células CD90 positivas 48 horas após a irradiação em relação ao controle. Há um aumento de células CD90-positivas no grupo tratado com CTIPDh em comparação com o grupo não tratado.

[0063] As FIGs. 31A-31F representam a imunomarcação de CD90 em grupos tratados (FIGs. 31A, 31C e 31E) e não tratados (FIGs. 31B, 31D e 31F). A imunocoloração positiva para CD90 foi observada no citoplasma da MO (FIGs. 31A- 31B), nas células do aspirado medular cultivadas in vitro (FIGs. 31C-31D) e na matriz extracelular da MO (FIGs. 31E- 31F).

[0064] As FIGs. 32A-32F representam imuno-histoquímica que demonstra marcação positiva para anticorpo anti-humano na MO de grupos tratados com CTIPDh (FIGs. 32A-32C) e uma ausência de qualquer marcação no grupo não tratado (FIGs.

32D-32F). As setas indicam células imunopositivas na presença do anticorpo anti-núcleo humano.

[0065] As FIGs. 33A-33C representam imuno-histoquímica que demonstra marcação positiva para anticorpo anti-humano em baço de camundongo do grupo tratado com CTIPDh. As setas indicam células imunopositivas na presença do anticorpo anti-núcleo humano.

[0066] As FIGs. 34A-34C representam valores de eritrócitos (FIG. 34A), hematócrito (FIG. 34B) e leucócitos (FIG. 34C) nos grupos tratados com CTIPDh (D62 ou 6 meses) ou não tratado (D62 ou 6 meses). Os gráficos mostram tendência de normalização do sangue em todos os índices hematimétricos avaliados, com recuperação mais lenta nos animais não tratados. Os gráficos são gerados pelo software GraphPad Prism 5 (GraphPad; PRISM, 2007).

[0067] As Figuras 35A-35D representam fotomicrografia da MO do grupo de longo prazo (6 meses) corado com hematoxilina e eosina em uma ampliação de 100x e 200x.

(FIGs. 35A-35B) o canal medular é preenchido com elementos hematopoiéticos no grupo tratado (6 meses). (FIGs. 35C-35D) hipocelularidade medular com reposição de gordura (seta vermelha) no grupo não tratado de longo prazo (6 meses).

[0068] As FIGs. 36A-36B representam a porcentagem de células positivas para p53 (FIG. 36A), positivas para fibronectina (FIG. 36B) no grupo tratado com CTIPDh (D62 ou 6 meses) ou não tratado (D62 ou 6 meses).

[0069] As FIGs. 37A-37B representam a porcentagem de células positivas para Nestina (FIG. 37A), C-kit-positivas (FIG. 37B) no grupo tratado com CTIPDh (D62 ou 6 meses) ou não tratado (D62 ou 6 meses).

[0070] As FIGs. 38A-38B representam a porcentagem de células positivas para CDl05 (FIG. 38A), células positivas para CD90 (FIG. 38B) no grupo tratado com CTIPDh (D62 ou 6 meses) ou não tratado (D62 ou 6 meses).

[0071] As FIGs. 39A-39B representam a porcentagem de células Sca-l-positivas (FIG. 39A), CD34- positivas (FIG.

39B) no grupo tratado com CTIPDh (D62 ou 6 meses) ou não tratado (D62 ou 6 meses).

[0072] As FIGs. 40A-40B representam a porcentagem de células positivas para CD45 (FIG. 40A), células positivas para CD44 (FIG. 40B) no grupo tratado com CTIPDh (D62 ou 6 meses) ou não tratado (D62 ou 6 meses).

[0073] As Figuras 41A-41D representam microfotografia que demonstra efeitos positivos da CTIPDh após radiação iônica nos camundongos tratados (FIGs. 41A-41B) ou não tratados (FIGs. 41C-41D). (FIGs. 41A-41B) Observe a presença de cabelo (seta vermelha) e bigodes (seta branca).

(FIGs. 41C-41D) Observe a ausência de cabelo (seta vermelha) e bigodes (seta branca).

[0074] A FIG. 42 representa dados de secreção de TNF- alfa. Após a irradiação (D2), a concentração de TNF-alfa aumentou em relação ao grupo controle (D0). Após a primeira terapia (D17) houve diferença entre os grupos tratados e não tratados com CTIPDh, onde o grupo tratado apresentou níveis mais baixos. No D32, embora tenha apresentado diferença significativa entre os grupos, os níveis foram maiores do que no D17. Um mês após a terceira terapia (D62) os níveis estavam abaixo do controle, sem diferença entre eles, mas o grupo tratado com valores menos expressivos que o grupo não tratado.

[0075] A FIG. 43A-43B representam dados de secreção de IL4. (FIG. 43A) Em D17, após a primeira terapia, os níveis de IL-4 foram mais elevados no grupo tratado com CTIPDh, o mesmo ocorre em D32. No D62, os níveis de IL-4 destacam-se no grupo que recebeu o tratamento com CTIPDh. (FIG. 43B).

Após a primeira terapia (D17), o grupo de tratado com CTIPDh apresentou níveis mais elevados em relação aos animais não tratados. Após a segunda terapia (D32), os valores de IL-10 permaneceram semelhantes ao D17, em que o grupo de tratamento com CTIPDh apresentou valores maiores do que o grupo não tratado. Já ao final do teste (D62), o grupo tratado apresentou um aumento significativo em relação ao não tratado.

[0076] A FIG. 44 representa dados de secreção de IL- 17A. Após a irradiação (D2) o nível de IL-17A foi reduzido em comparação ao controle. Após (D17), o nível de IL-17A foi estatisticamente menor em comparação ao grupo não tratado. Após a segunda terapia (D32), o grupo tratado com CTIPDh foi mantido com níveis mais baixos de IL-17A em comparação com o grupo não tratado. No final de (D62), mais uma vez o nível de IL-17A foi estatisticamente menor no grupo tratado com CTIPDh em comparação com o grupo não tratado.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0077] A seguinte descrição inclui informações que podem ser úteis na compreensão de aspectos das divulgações.

Não é uma admissão de que qualquer uma das informações fornecidas neste documento seja da técnica anterior relevante para as invenções atualmente reivindicadas, ou que qualquer publicação especificamente ou implicitamente referenciada seja da técnica anterior.

[0078] Conforme usado neste documento, o verbo "compreender" como é usado nesta descrição e as reivindicações e suas conjugações são usadas em seu sentido não limitativo para significar que os itens após a palavra estão incluídos, mas os itens não mencionados especificamente não são excluídos. Além disso, a referência a um elemento pelo artigo indefinido “um” ou “uma” não exclui a possibilidade de que mais de um dos elementos estejam presentes, a menos que o contexto exija claramente que haja um e apenas um dos elementos. O artigo indefinido "um" ou "uma", portanto, geralmente significa "pelo menos um".

[0079] Conforme usado neste documento, o termo "paciente" ou "indivíduo" é um mamífero incluindo, mas não se limitando a um ser humano, camundongo, rato, porquinho- da-índia, cachorro, gato, cavalo, vaca, porco ou primata não humano, como um macaco, chimpanzé, babuíno ou rhesus.

[0080] Conforme usado neste documento, o termo "Matrigel" refere-se a uma mistura de proteínas gelatinosas secretadas por células de sarcoma de camundongo Engelbreth- Holm-Swarm (EHS) que se assemelham ao ambiente extracelular complexo encontrado em muitos tecidos.

[0081] Um "ciclo de coleta" constitui uma transferência do PD para um novo recipiente de cultura de células após a aderência e crescimento das CTIDPh seguido pela preservação (por exemplo, criopreservação) e/ou subcultura do resultado das CTIPDh.

[0082] Tal como aqui utilizado, "condições de hipóxia" compreendem a cultura das células em condições de cultura compreendendo ou equivalente a: (i) um máximo entre cerca de 0,5% e 1%, ou um máximo entre cerca de 0,5% e 15% oxigênio (O); (ii) cerca de 0,05%, 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%,

0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1% ou 2% ou 5% de oxigênio (Oz); (iii) entre cerca de 0,1% e 2% de oxigênio (Oz); ou qualquer um de (i), (ii) ou (iii) com 5 a 7% COC.

[0083] Conforme usado neste documento, o termo "células-tronco" refere-se a células imaturas não especializadas que, sob certas condições, podem se diferenciar em células funcionais maduras.

[0084] Conforme usado neste documento, o termo "IDPSC" ou "hIDPSC" refere-se a uma célula-tronco indiferenciada que é capaz de se diferenciar em um amplo espectro de tipos de células, incluindo, mas não se limitando a células de sistemas neurais centrais e periféricos, por exemplo, neurônios, astrócitos, células ganglionares e/ou oligodendrócitos.

[0085] Conforme usado neste documento, os termos "cultura de células" ou "células em cultura" referem-se a células ou tecidos que são mantidos, cultivados em um ambiente artificial in vitro.

[0086] Conforme usado neste documento, o termo "pluripotente" refere-se a células precursoras que podem formar qualquer célula adulta.

[0087] Conforme usado neste documento, o termo "tratar" refere-se a cuidar medicamente ou lidar com uma condição (como uma doença ou lesão).

[0088] Conforme usado neste documento, o termo "prevenção" refere-se a cuidar medicamente ou lidar com um indivíduo para inibir ou reduzir a probabilidade de ocorrer uma condição (como uma doença ou lesão).

[0089] Conforme usado neste documento, o termo "indiferenciado" refere-se a células cultivadas que apresentam características morfológicas de células indiferenciadas, distinguindo-as das células diferenciadas.

[0090] Conforme usado neste documento, o termo população de células "substancialmente homogênea" refere-se a uma população de células em que a maioria (por exemplo, entre cerca de 50% a cerca de 90%) do número total de células tem uma característica de interesse especificada (por exemplo, expressão de CD44, CD90, Nestina, Vimentina e Fibronectina).

[0091] Tal como aqui utilizado, o termo "co-expresso" refere-se à detecção simultânea de dois ou mais marcadores moleculares, por exemplo, Nestina, Vimentina e Fibronectina na mesma população de células, de preferência na mesma célula.

[0092] Conforme usado neste documento, os termos "manutenção de cultura (de células)", "proliferação", "propagação", "expansão" e "crescimento" referem-se à sobrevivência contínua de uma célula ou população de células com um aumento no número de células.

[0093] Conforme usado neste documento, os termos "celularidade da medula óssea" referem-se à proporção de volume de hematopoese e gordura.

[0094] Conforme usado neste documento em relação ao cultivo e expansão de células, o termo "grande escala" se refere ao isolamento de PD e cultivo de CT sob condições que permitem pelo menos a duplicação de células após cada ciclo de coleta não enzimática.

[0095] Conforme usado neste documento, o termo "células-tronco mesenquimais (CTMs)" refere-se a células estromais multipotentes que podem se auto-renovar por divisão e podem se diferenciar em uma variedade de tipos de células, incluindo osteoblastos (células ósseas), condrócitos (células de cartilagem), miócitos (células musculares) e adipócitos (células de gordura que dão origem ao tecido adiposo da medula).

[0096] Conforme usado neste documento, o termo "condição" refere-se a um estado anormal de saúde que interfere nas sensações normais ou regulares de bem-estar, que inclui doença, ou seja, um distúrbio de estrutura ou função no indivíduo.

[0097] A presente invenção fornece métodos úteis de tratamento, inibição ou prevenção de uma condição (por exemplo, uma doença ou uma lesão) em um indivíduo. O método compreende a administração a um indivíduo em necessidade de uma população de células semelhantes a CTMs isoladas de um tecido de origem embrionária da crista neural em uma quantidade suficiente para tratar, inibir ou prevenir a condição no indivíduo.

[0098] A presente invenção também fornece uma composição compreendendo uma população de células semelhantes a CTMs isoladas de um tecido de origem embrionária da crista neural.

[0099] Em algumas modalidades não limitativas, a condição leva a ou deriva de FMO. Exemplos não limitativos incluem anemia aplástica, anemia de fanconi, disceratose congênita, síndrome de Shwachman-Diamond, anemia Diamond- Blackfan, neutropenia congênita grave (por exemplo, síndrome de Kostmann) e trombocitopenia amegacariocítica congênita.

[00100] A FMO pode ser herdado ou adquirido.

Exemplos não limitativos das causas de FMO adquirida incluem lesão química, exposição à radiação, quimioterapia e danos ao sistema imunológico, etc. Em certas implementações não limitativas, a dose da exposição à radiação está entre 0,1 a 30 Gy ou qualquer intervalo de número entre, por exemplo, 0,1 a 25 Gy, 0,1 a 20 Gy, 0,1 a 15 Gy, 0,1 a 10 Gy, 0,1 a 6 Gy, 0,5 a 25 Gy, 0,5 a 20 Gy, 0,5 a 15 Gy, 0,5 a 10 Gy, 0,5 a 6 Gy, 1 a 20 Gy, 1 a 15 Gy,

1 a 10 Gy, 1 a 6 Gy, 2 a 15 Gy, 2 a 10 Gy, 2 a 6 Gy, 4 a 10 Gy e 4 a 6 Gy etc.

[00101] Exemplos não limitativos do indivíduo incluem humano, camundongo, rato, porquinho da índia ou cachorro. Em modalidades preferidas, o indivíduo é humano, por exemplo, uma vítima de acidente de irradiação (por exemplo, exposto a bomba atômica ou acidentes de exposição à radiação), um paciente com leucemia mielóide (por exemplo, 2-3 anos após a exposição à radiação), ou um paciente tem reação inflamatória na MO.

[00102] Em outras modalidades não limitativas, o tecido de origem embrionária da crista neural consiste em uma polpa dentária de um dente selecionado de um dente decíduo, um dente permanente e um terceiro molar.

[00103] As células semelhantes a CTM são células- tronco da polpa dentária imaturas (CTIPDs), por exemplo, CTIPDs pós-natais humanos (CTIPDhs). A população de CTIPDs (por exemplo, CTIPDh) pode ser uma população essencialmente fenotipicamente uniforme que é multifuncional. Em algumas implementações não limitantes, a população de CTIPDs (por exemplo, hIDPSCs) é autóloga. Em outras implementações não limitativas, a população de CTIPDs (por exemplo, CTIPDhs) é alogênica. Em implementações preferenciais não limitantes, os CTIPDs (por exemplo, CTIPDhs) não se diferenciam em células sanguíneas intrínsecas.

[00104] Em implementações preferenciais não limitativas, as CTIPDs (por exemplo, CTIPDhs) são capazes de migrar para a medula óssea e/ou baço do indivíduo. Em outras implementações não limitativas, as CTIPDs (por exemplo, CTIPDhs) migram e se alojam na medula óssea e/ou baço do indivíduo.

[00105] Em outras implementações não limitativas, uma fração da população expressa pelo menos um marcador de células-tronco mesenquimais (CTM). Exemplos não limitativos dos marcadores CTM incluem Nestina, CD105, CD90, CD73, CD44, CD29, CD117 (c-kit), Nestina, Vimentina e Fibronectina, etc. Em implementações preferidas, não limitantes, o marcador para CTM compreende CD117 (c-kit) e/ou Fibronectina. Em outras implementações não limitativas, o marcador CTM compreende CD105, CD90, CD44 e Nestin.

[00106] A expressão dos marcadores de CTM acima é terapeuticamente importante para o tratamento de FMO. As células-tronco positivas para Nestina exibem potencial de angiogênese e são essenciais para a manutenção de CTH.

Todos os tipos de células do nicho CTH, incluindo células endoteliais, Células Estromais Perivasculares, Osteoblastos Endosteais E Pericitos, expressam Nestina, indicando que as células que expressam nestina são importantes para o nicho CTH. O CD90 é expresso em células hematopoiéticas em estágio inicial. As células CD90-positivas medeiam a reconstituição hematopoiética e o enxerto de longo prazo e estão envolvidas na melhoria da eficiência do transplante de medula óssea humana. O CD44 desempenha um papel importante na manutenção da haste hematopoiética e pools de progenitores, migração de CTH e homing. A fibronectina (FN) é uma glicoproteína de matriz extracelular (MC) que desempenha um papel vital na hematopoiese: proporcionando uma ancoragem e agindo como um estímulo proliferativo para progenitores eritróides e primitivos. A vimentina é crucial para regular a diferenciação de monócitos/macrófagos durante a maturação das células sanguíneas. Portanto, essas cinco moléculas podem contribuir para a reconstrução hematopoiética de diferentes maneiras.

[00107] Em outras implementações não limitativas, a fração da população carece de expressão de CD34, CD45, CD14 e/ou HLA ABC. Em outras implementações não limitativas, a fração da população expressa um baixo nível de HLA ABC.

[00108] Em algumas implementações não limitativas, a fração está entre 60% e 100%, ou qualquer número percentual entre, por exemplo, 65 a 100%, 65 a 99%, 70 a 99%, 70 a 98%, 75 a 98%, 75 a 97%, 80 a 97%, 80 a 96%, 85 a 96%, 85 a 95%, 90 a 95%, 96 a 99% e 90 a 100%. Em outras implementações não limitativas, a fração é de pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 96%.

[00109] Em uma implementação preferencial não limitativa, 96 a 99% das CTIPD (por exemplo, CTIPDhs) são CD105+, CD73+, CD90+, CD29+, CD44+, CD117+ (c-kit+), Nestina+, Vimentina+ e Fibronectina+, CD45, CD34, HLA DR e HLA ABC (baixo). Os referidos biomarcadores são impressões digitais de assinatura celular definidas típicas para CTMs com características clássicas de tipo de célula multipotente.

[00110] Em certas modalidades não limitativas, a composição é administrada após um evento crítico selecionado do grupo que consiste em: exposição à radiação, diagnóstico de pancitopenia, diagnóstico de aplasia da medula óssea, diagnóstico de hipoplasia da medula óssea e combinações dos mesmos. O intervalo de tempo entre o evento crítico e a administração inicial pode ser de cerca de 12 (por exemplo, 10-14) horas, cerca de 18 (por exemplo, 14- 22) horas, cerca de 24 (por exemplo, 19-29) horas, cerca de 30 (por exemplo , 24-36) horas, cerca de 36 (por exemplo, 29-43) horas, cerca de 48 (por exemplo, 38-58) horas, cerca de 54 (por exemplo, 43-65) horas, cerca de 60 (por exemplo, 48-72) horas , cerca de 66 (por exemplo, 53-79) horas, cerca de 72 (por exemplo, 58-86) horas, cerca de 78 (por exemplo, 63-93) horas, cerca de 84 (por exemplo, 67-101)

horas, cerca de 90 (por exemplo, 72-118) horas, ou cerca de 96 (por exemplo, 77-123) horas. Em implementações preferenciais não limitativas, a composição é administrada 12 a 96 horas após o evento crítico (por exemplo, exposição à radiação), ou qualquer número entre, por exemplo, 12-84 horas, 18-84 horas, 18-72 horas, 24-72 horas, 24-60 horas, 36-60 horas ou 36-48 horas, etc. No caso de AA, a composição é administrada cerca de 12, cerca de 18, cerca de 24, cerca de 30, cerca de 36, cerca de 48, cerca de 54, cerca de 60, cerca de 66, cerca de 72, cerca de 78, cerca de 84, cerca de 90 ou cerca de 96 horas após o indivíduo humano apresentar pancitopenia e/ou aplasia/hipoplasia de médula óssea.

[00111] Em modalidades preferenciais não limitantes, as CTIPDs administradas (por exemplo, CTIPDh) estão em uma quantidade suficiente para aumentar as contagens de eritrócitos (RBC), níveis de hematócrito e/ou leucócitos (WBC) na medula óssea do indivíduo. Por exemplo, após a irradiação, as CTIPDs administradas (por exemplo, CTIPDh) estão em uma quantidade suficiente para normalizar as contagens de eritrócitos, níveis de hematócrito e/ou contagens de leucócitos. Em algumas implementações não limitativas, o aumento em comparação com o controle sem tratamento é de pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos

15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, ou pelo menos 50%.

[00112] Em algumas implementações não limitativas, as CTIPDs administradas (por exemplo, CTIPDh) estão em uma quantidade suficiente para melhorar a função plaquetária, aumentar as unidades formadoras de colônias de fibroblastos da medula óssea (UFC-F) após a ablação da medula óssea, promover a recuperação do osso componentes celulares da medula óssea e/ou acelerar a recuperação dos componentes celulares da medula óssea. A composição pode promover e/ou acelerar a recuperação dos componentes celulares da medula óssea, aumentando os precursores hematopoiéticos e/ou células nucleadas (por exemplo, megacariócitos e estroma com diferentes graus de maturação).

[00113] Em outras implementações não limitativas, as CTIPDs administradas (por exemplo, CTIPDh) estão em uma quantidade suficiente para reduzir a apoptose das células da medula óssea no indivíduo, por exemplo, reduzindo o número de células que expressam p53. Após a irradiação, ocorre apoptose relacionada à regulação do oncogene e anti- oncogene. O P53 é um biomarcador importante para a apoptose e, ao diminuir o número de células p53+ na medula óssea, pode promover a recuperação do meio da medula óssea por um mecanismo anti-apoptótico.

[00114] Em outras implementações não limitativas, as CTIPDs administradas (por exemplo, CTIPDh) estão em uma quantidade suficiente para modular a reação inflamatória do organismo em resposta a danos causados por irradiação e/ou lesão ou doença da MO.

[00115] Em ainda outras implementações não limitativas, as CTIPDs administradas (por exemplo, CTIPDh) estão em uma quantidade suficiente para aumentar as células positivas para Nestina, células positivas para CD44, células positivas para CD45, células positivas para CD105, células positivas pa Sca-1 e/ou células positivas para Nestina e/ou reduzem as células positivas para p53 na medula óssea do indivíduo. As células Sca-1-positivas são progenitoras de CTH; As células CD105-positivas são células-tronco hematopoiéticas/progenitoras; As células CD45-positivas são células de antígeno de linhagem hematopoiética restrita; Células Nestina-positivas suportam hematopoiese (estroma) no nicho HSC da medula óssea; e as células positivas para CD44 regulam a distribuição de progenitores hematopoiéticos.

[00116] Em algumas implementações não limitativas, as CTIPDs administradas (por exemplo, CTIPDh) estão em uma quantidade suficiente para facilitar a recuperação da produção e distribuição de CTH/progenitores na medula óssea do indivíduo e/ou restabelecer a hematopoese no indivíduo medula óssea. Em outras implementações não limitativas, as CTIPDs administradas (por exemplo, CTIPDh) estão em uma quantidade suficiente para promover a recuperação do nicho vascular da MO e/ou reconstrução da hematopoese. AA prejudica o microambiente medular e a angiogênese, diminui os vasos endoteliais ao diminuir as células progenitoras endoteliais proliferativas positivas para Nestina e CD105.

[00117] Em outras implementações não limitativas as CTIPDs administradas (por exemplo, CTIPDh) estão em uma quantidade suficiente para aumentar a regeneração de componentes de nicho de CTH, aumentando o número e/ou a atividade da unidade formadora de colônias da medula óssea da Nestina intrínseca - CTMs positivas. Em outras implementações não limitativas, as CTIPDs administradas (por exemplo, CTIPDh) estão em uma quantidade suficiente para promover a regeneração do nicho estromal no indivíduo após receber irradiação por enriquecimento de células positivas para CD105 intrínsecas, células positivas para CD44 e/ou células positivas para CD90 na medula óssea do indivíduo. Melhorar o enriquecimento da medula óssea com progenitores endoteliais intrínsecos Nestina e CD105- positivos promove a recuperação do nicho vascular da medula óssea e angiogênese em um indivíduo após a irradiação.

[00118] Em algumas implementações não limitativas, as CTIPDs administradas (por exemplo, CTIPDh) estão em uma quantidade suficiente para promover a recuperação de nicho hematopoiético, por exemplo, aumentando a proliferação de células da MO intrínsecas e/ou aumentando as células Sca-1- positivas e/ou preservação de células Sca-1 intrínsecas e quiescentes. Sca-1 desempenha um papel crítico na ativação de CTH e na autorrenovação de CTHs.

[00119] Em outras implementações não limitativas, as CTIPDs administradas (por exemplo, CTIPDh) estão em uma quantidade suficiente para promover a recuperação de nicho de CTHs e a reconstrução da hematopoese, por exemplo, aumentando as células CD45-positivas na medula óssea do indivíduo. O nicho de células-tronco hematopoiéticas (CTHs) é um microambiente complexo que proporciona a sobrevivência, expansão e diferenciação de CTHs quiescentes, bem como a migração de precursores hematopoiéticos para reabastecer o sangue. O nicho de CTHs é composto de CTHs primitivas, células reticulares, células endoteliais, osteoblastos formadores de osso e osteoclastos. Além disso, as evidências revelaram o papel da tirosina fosfatase transmembrana hematopoiética, CD45, no nicho de CTH. O CD45 é expresso em todos os leucócitos.

[00120] Em ainda outras implementações não limitativas, as CTIPDs administradas (por exemplo, CTIPDh) estão em uma quantidade suficiente para aumentar o homing das células progenitoras para o microambiente da MO e/ou o tráfego de células dentro do microambiente da MO, por exemplo, aumentando o CD44-células positivas. As células progenitoras mielóides e eritróides medeiam a ativação e o homing dos linfócitos. Essas células expressam uma molécula de adesão, CD44. As interações adesivas causam o homing das células progenitoras ao microambiente MO e provavelmente contribuem para o tráfego de células dentro do microambiente MO. O CD44 desempenha uma variedade de funções na hematopoese humana.

[00121] Em outras implementações não limitantes, as CTIPDs administradas (por exemplo, CTIPDh) estão em uma quantidade suficiente para tratar AA, promovendo a diferenciação, recuperando o nicho vascular na MO, reduzindo a apoptose, modulando a reação inflamatória e/ou recuperando componentes celulares da medula óssea.

[00122] Em ainda outras implementações não limitativas, as CTIPDs administradas (por exemplo, CTIPDh) estão em uma quantidade suficiente para promover a síntese de Fibronectina e remodelação da matriz extracelular, para preservar a audição e/ou a capacidade de cheirar no indivíduo após a radiação; para reduzir os efeitos colaterais da irradiação e/ou para proteger contra os efeitos colaterais da irradiação de longo prazo ou FMO, promovendo aumento de peso. A radiação provoca perda de audição e alterações temporárias no olfato. A terapia para tratamento de câncer usa a irradiação de forma intensiva, especialmente nas doenças hematológicas. A irradiação causa danos aos tecidos ao redor do tumor, o que pode causar graves complicações aos pacientes. Os seres humanos frequentemente perdem peso devido a doenças ou lesões.

[00123] Em outras implementações não limitativas, as CTIPDs administradas (por exemplo, CTIPDh) estão em uma quantidade suficiente para levar à recuperação parcial ou completa da hematopoese na MO no indivíduo, por exemplo, reverter uma contagem de parâmetro hematopoiético após a irradiação.

[00124] Em outras implementações não limitativas, as CTIPDs administradas (por exemplo, CTIPDh) estão em uma quantidade suficiente para promover a remodelação da matriz extracelular, por exemplo, aumentando as células semelhantes a fibroblastos positivos para fibronectina e fibronectina com uma formação de matriz extracelular característica em uma extensa rede na MO do indivíduo. A matriz extracelular (MEC) é um compartimento dinâmico e versátil que oferece suporte ao desenvolvimento, função e reparo dos órgãos. MEC é um componente relevante do nicho de células-tronco, que tem um papel principal na regulação das propriedades, sobrevivência, motilidade, diferenciação e comunicação das células-tronco. A fibronectina, envolvida na adesão, crescimento, migração e diferenciação celular, apoia a função normal de um organismo.

[00125] Em ainda outras implementações não limitativas, as CTIPDs administradas (por exemplo, CTIPDh) estão em uma quantidade suficiente para aumentar a regeneração da medula óssea, por exemplo, reduzindo ou eliminando elementos gordurosos na medula óssea do indivíduo. Os adipócitos demonstraram ser reguladores negativos das células progenitoras hematopoiéticas, portanto, o aumento do nível de adipócitos na medula diminui o conteúdo de células progenitoras hematopoiéticas levando à depleção das células progenitoras hematopoiéticas.

[00126] Em algumas implementações não limitativas, as CTIPDs administradas (por exemplo, CTIPDh) estão em uma quantidade suficiente para suprimir o desenvolvimento de adipócitos intrínsecos e/ou aumentar a regeneração ou recuperação hematopoiética da medula óssea no indivíduo. Em outras implementações não limitativas, as CTIPDs administradas (por exemplo, CTIPDh) estão em uma quantidade suficiente para facilitar a recuperação da saúde imunológica, funções do timo e do baço e/ou hematopoese da medula óssea, por exemplo, suprimindo adipócitos intrínsecos no indivíduo após a irradiação. Como o FMO é definida como a incapacidade de produzir o número adequado de células sanguíneas necessárias para controlar a função imunológica, a depleção das células progenitoras hematopoiéticas comprometeria a saúde imunológica e afetaria a medula óssea, o timo e o baço. A função do timo é produzir células T maduras, enquanto o baço é um filtro imunológico do sangue composto por células B, células T, macrófagos, células dendríticas, células naturais killer e hemácias.

[00127] Em outras implementações não limitativas, as CTIPDs administradas (por exemplo, CTIPDh) estão em uma quantidade suficiente para atenuar a inflamação do indivíduo, por exemplo, por ação anti-inflamatória, estabilizando os níveis de IL-17A e/ou aumentando IL-4 e/ou secreção de IL-10. A secreção de citocinas modula a inflamação e diminui a secreção inflamatória de citocinas procarióticas; estabilizar os níveis de IL-17A previne a progressão da inflamação; e a indução da resposta tardia de IL-17A reduz a inflamação crônica. Em uma implementação preferencial não limitativa, as CTIPDs estão em uma quantidade suficiente para reduzir os níveis séricos de TNF-e, IL-17A ou ambos no indivíduo. Em outra implementação preferida, não limitante, os CTIPDs estão em uma quantidade suficiente para aumentar os níveis séricos de IL-4, IL-10 ou ambos no indivíduo.

[00128] Em ainda outras implementações não limitantes, as CTIPDs administradas (por exemplo, CTIPDh) estão em uma quantidade suficiente para proteger contra irradiação e/ou acelerar a recuperação da hematopoese e do microambiente hematopoiético na medula óssea do indivíduo.

[00129] Em algumas implementações não limitativas, o aumento, diminuição, aceleração é entre 5% e 300%, ou qualquer número percentual entre, por exemplo, 5 a 250%, 5- 200%, 5 a 150%, 5 a 100%, 5 a 50%, 5 a 25%, 10 a 300%, 10 a 250%, 10 a 200%, 10 a 150%, 10 a 100%, 10 a 50%, 10 a 25%, 15 a 300%, 15 a 250%, 15 a 200%, 15 a 150%, 15 a 100%, 15 a 50%, 15 a 25%, 20 a 300%, 20 a 250%, 20 a 200%, 20 a 150%, 20 a 100%, 20 a 50%, 20 a 40%, 25 a 300%, 25 a 250%, 25 a 200%, 25 a 150%, 25 a 100%, 25 a 50%, 30 a 300%, 30 a 250%, 30 a 200%, 30 a 150%, 30 a 100%, 30 a 50%, 50 a 300%, 50 a 250%, 50 a 200%, 50 a 150% ou 50 a 100%, etc. Em outras implementações não limitativas, o aumento, diminuição, aceleração é de pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15% , pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 100%, pelo menos 200%, pelo menos 300% , e/c.

[00130] Em certas modalidades não limitativas, a composição compreende entre 10 5 e 1010 de CTIPD (por exemplo, CTIPDh), ou qualquer intervalo de número entre, por exemplo, 105 a 109, 105 a 108, 105 a 107, 105 a 106, 5x105 a 108, 5x105 a 108, 5x105 a 106, 106 a 106, 106 a 1010, , 106 a 109, , 106 a 108 , 106 a 107, 5x106 a 1010, 5x106 a 109 , 5x106 a 108, 5x106 a 107, 5x106 a 106, 107 a 1010, 107 a 109, 107 a 108, 5x107 a 1010, 5x106 a 109, 108 a 1010, 108 a 109, 5x108 a 1010 ou 109 a 1010 de células. Em uma implementação preferencial não limitativa, a composição compreende 5x106- 109 CTIPDs (por exemplo, CTIPDhs).

[00131] Em algumas modalidades não limitativas, as CTIPD (por exemplo, CTIPDh estão entre 0,5x10 5 e 1,5x109 por kg de peso corporal do indivíduo por transplante, ou qualquer número entre, por exemplo, 0.5x10 5-1.5x108,

0.5x105-1.5x107, 0. 5x105-1. 5x106, 1x105-1. 5x109, 1x105-

1.5X10', 1X105-1.5X107, 1X105-1.5X106, 3X105-1.5X109, 3X105-

1.5X10', 3X105-1.5X107, 3X105-1.5X106, 0.5X106-1. 5X109, 0.

5X106-1. 5X10', 0. 5X106-1. 5X107, 0. 5X106-1. 5X106,1X107-

1.5X109, 1X107-1.5X10', 1X107-1.5X107, 3X107-1.5X109, 3X107-

1.5X108, 0.5X108-1.5x10.

[00132] Em outras modalidades não limitativas, as CTIPDs (por exemplo, CTIPDhs) são cerca de 1x10 5 (por exemplo, 0,8 x 105-1,2x105), cerca de 2,5x105 (por exemplo, 2x105-3x105), cerca de 5x105 (por exemplo, 4x105-6x105 ), cerca de 7,5x105 (por exemplo, 6x105-9x105), cerca de 1x106 (por exemplo, 0,8 x106-1,2x106),cerca de 2x106 (por exemplo, 1,6 x106-2,4x106), cerca de 2,5x106 (por exemplo, 2x106- 4x106), cerca de 5x106 (por exemplo, 4x106-6x106), cerca de

7,5x106 (por exemplo, 6x106-9x106), cerca de 1x107 (por exemplo, 0,8x107-1,2x107), cerca de 2,5x107 (por exemplo, 2x107-3x107), cerca de 5x107 (por exemplo, 4 x106-6x106), cerca de 7,5x107 (por exemplo, 6x107-9x107), cerca de 1x108 (por exemplo, 0,8 x10 8-1,2x108), cerca de 2.5x108 (por exemplo, 2x108-3x108), cerca de 5x108 (por exemplo, 4x108- 6x108), cerca de 7,5x108 (por exemplo, 6x108-9x108), ou 1x109 (por exemplo, 0,8 x10 9-1,2x109) por kg do indivíduo por transplante.

[00133] Em algumas modalidades não limitativas, as CTIPDs (por exemplo, CTIPDhs) são administradas em uma quantidade farmaceuticamente eficaz. Tal como aqui utilizado, a frase "quantidade farmaceuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade suficiente para tratar uma doença, condição ou distúrbio. O nível da dosagem eficaz pode ser determinado de acordo com a gravidade da doença; a idade, peso, saúde e sexo de um paciente; a sensibilidade ao medicamento em um paciente; o tempo de administração, rota e taxa de liberação; a duração do tratamento; ou elementos incluindo drogas que são misturadas ou usadas simultaneamente com a composição de algumas modalidades, ou outros elementos bem conhecidos no campo médico. Por exemplo, a dosagem das CTIPDs varia dentro de uma ampla faixa e é determinada de acordo com as necessidades dos indivíduos em casos específicos. Geralmente, no caso de administração parenteral, as CTIPDs são geralmente administradas em uma quantidade entre 1x10 5 e 1x107, por exemplo, 2x105-8x106, 4x105-8x106, 4x105- 6x106, 6x105-6x106, 6x105-4x106, 8x105-4x106, 8x105-3x106, 9x105-3x106, 9x105- 2x106 ou 1x106-2x106. Cerca de 1x107, cerca de 1x108, cerca de 1x109 ou cerca de 1x1010 células/kg de peso corporal do indivíduo. Além disso, a composição de algumas modalidades e outras substâncias de tratamento de doenças conhecidas na técnica podem ser administradas simultaneamente ou sequencialmente a um indivíduo.

[00134] Em certas modalidades não limitativas, a composição é administrada pelo menos duas vezes, pelo menos três vezes, pelo menos quatro vezes ou pelo menos cinco vezes. Em algumas implementações não limitativas, a composição é administrada cerca de uma vez por mês, cerca de uma vez a cada 2 meses, cerca de uma vez a cada 3 meses, cerca de uma vez a cada 4 meses, cerca de uma vez a cada 5 meses, cerca de uma vez a cada 6 meses, cerca de uma vez a cada 7 meses, cerca de uma vez a cada 8 meses, cerca de uma vez a cada 9 meses, cerca de uma vez a cada 10 meses, cerca de uma vez a cada 11 meses, cerca de uma vez por ano, ou cerca de uma vez a cada dois anos.

[00135] Em outras implementações não limitativas, o intervalo entre a administração é entre 4 e 60 dias, ou qualquer número entre, por exemplo, 4-50 dias, 5-50 dias,

5-40 dias, 6-40 dias, 6 -30 dias, 8-30 dias, 8-20 dias ou 10-20 dias, etc. Em ainda outras implementações não limitativas, o intervalo entre a administração é de cerca de 5 (por exemplo, 4-6) dias, cerca de 10 (por exemplo , 8- 12) dias, cerca de 15 (por exemplo, 12-18) dias, cerca de 20 (por exemplo, 16-24) dias, cerca de 25 (por exemplo, 20- 30) dias, cerca de 30 (por exemplo, 24-36) dias , cerca de 45 (por exemplo, 36-54) dias, cerca de 60 (por exemplo, 48- 72) dias. Em outras implementações não limitativas, três administrações equivalem a um ciclo, repetido após cerca de 1 mês, cerca de 2 meses, cerca de 3 meses, cerca de 4 meses, cerca de 5 meses, cerca de 6 meses, cerca de 7 meses, cerca de 8 meses, cerca de 9 meses, cerca de 10 meses, cerca de 11 meses, cerca de um ano ou cerca de dois anos.

[00136] Em certas implementações não limitativas, uma ou mais melhorias clínicas são observadas após a 1ª, 2ª ou 3ª administração da composição. Em outras implementações não limitativas, uma ou mais melhorias clínicas duram pelo menos 1 mês, pelo menos 2 meses, pelo menos 3 meses, pelo menos 4 meses, pelo menos 5 meses ou pelo menos 6 meses. Em outras implementações não limitativas, nenhuma reversão aparente da recuperação da hematopoese é observável.

[00137] Em algumas implementações não limitativas, a composição que compreende CTIPDs alogênicas é administrada pelo menos três vezes com um intervalo de cerca de um mês, não induzindo respostas imunológicas sem aplicar protocolos imunossupressores.

[00138] Em algumas modalidades não limitativas, as CTIPDs administradas (por exemplo, CTIPDh) são em uma quantidade suficiente para fornecer a longo prazo (por exemplo, seis meses) e recuperação hematopoiética estável, melhorando a função do estroma, hematopoiético e nicho vascular, remodelação da matriz extracelular, supressão do desenvolvimento do tecido adiposo, ação antiapoptótica na medula óssea, fornecendo proteção contínua da hematopoese, angiogênese e/ou estimulação da proliferação celular.

[00139] Em outras modalidades não limitativas, a composição compreende ainda células-tronco da medula óssea.

Em algumas implementações não limitativas, as células- tronco da medula óssea são autólogas. Em outras implementações não limitativas, as células-tronco da medula óssea são alogênicas. Em outras modalidades não limitativas, a composição compreende ainda células-tronco hematopoiéticas (CTHs). Em algumas implementações não limitativas, as CTHS são autólogas. Em outras implementações não limitantes, as CTHs são alogênicas. Em uma modalidade preferencial não limitativa, as CTHs estão entre 1x106/kg e 1x107/kg do indivíduo por transplante. Em outras implementações não limitativas, as CTIPDs, CTH e/ou células mononucleares da MO são administrados em uma quantidade suficiente para proteger a medula óssea de danos clínicos degenerativos, perda de tecido ou funcionamento celular. Em outras implementações não limitativas, as CTMs com CTHs autólogas ou alogênicas levam a um enxerto mais robusto e melhores efeitos terapêuticos do que o co- transplante de CTMs com células da MO mononucleares autólogas ou alogênicas.

[00140] As CTIPDs (por exemplo, CTIPDh) podem ser administradas por via intravenosa, intraperitoneal ou usando infusão intraóssea que é o processo de injeção direta no osso. A irradiação ativa as vias moleculares que aumentam a liberação de quimiocinas teciduais, que atraem as CTMs para os tecidos lesados. Em certas modalidades, as CTIPDs são administradas por via intravenosa ou intraperitoneal, o que permite que as CTIPDs migrem para a MO e evitem a reação inflamatória. A infusão intraóssea fornece um ponto de entrada não dobrável no sistema venoso sistêmico. Essa técnica também pode ser usada para fornecer fluidos e medicamentos quando o acesso intravenoso não estiver disponível ou não for viável. O FDA aprovou dispositivos intra-ósseos automáticos para administração de fluidos e medicamentos, proporcionando acesso rápido e seguro ao sistema vascular do paciente. Em algumas implementações não limitativas, as CTIPDs (por exemplo,

CTIPDh) são administrados por via intravenosa. Em outras implementações não limitativas, as CTIPDs (por exemplo, CTIPDh) são administrados usando infusão intraóssea.

[00141] Em algumas modalidades não limitativas, as composições são administradas localmente ou sistemicamente, por exemplo, requerem manipulações ex vivo ou in vivo para obter atividade terapêutica para induzir um efeito local (por exemplo, um efeito regenerativo direto de CTIPDs em contato com tecido degenerativo afetando a proliferação/morte celular, a integridade do tecido e a funcionalidade) e/ou devido a um efeito sistêmico (por exemplo, liberando fatores tróficos protetores e reduzindo os níveis de citocinas pró-inflamatórias).

[00142] Exemplos não limitativos das vias de administração incluem métodos médicos conhecidos de tratamento de FMO, degenerativo, dano clínico reprodutivo e/ou para prevenir o indivíduo, tecido, células de danos futuros. O tratamento com CTIPD aqui engloba anular, inibir substancialmente, retardar ou reverter a progressão de uma condição, melhorando substancialmente os sintomas clínicos ou prevenindo ou reduzindo substancialmente o aparecimento de sintomas clínicos.

[00143] De acordo com alguns aspectos, um indivíduo com FMO é administrado com CTIPDs indiferenciadas. De acordo com outros aspectos, um indivíduo com FMO é administrado com CTIPDs induzidas a sofrer diferenciação especial (progenitores). CTIPDs, por exemplo, podem ser injetados diretamente no loci/cavidade/meio da doença, transplantados em outro lugar no corpo, ou podem ser aderidos a um andaime ou veículo de entrega e inseridos/transplantados/enxertados cirurgicamente em um local aceitável no corpo. Normalmente, as CTIPDs são administradas em uma quantidade terapeuticamente eficaz que é suficiente para prevenir ou tratar a FMO por meio de várias vias de administração, incluindo intravenosa, intraperitoneal e infusão intraóssea, que é preferencial.

[00144] Em algumas modalidades não limitativas, a população de CTIPDs (por exemplo, CTIPDhs) é preparada por: a) obtenção de uma polpa dentária (PD); b) lavagem da PD com solução contendo antibióticos; c) estabelecer uma cultura de explante, colocando o PD em uma superfície de plástico em um meio de cultura; d) transferir mecanicamente o PD para uma superfície de plástico diferente no meio de cultura; e) repetir as etapas (c) e (d); f) coletar as CTIPDhs que aderem à superfície de plástico da cultura de explante. Em outras implementações não limitativas, a preparação da população de CTIPDhs compreendendo ainda a passagem da cultura de explante de CTIPDhs da etapa c) antes da coleta, em que a passagem compreende tratar enzimaticamente as CTIPDs (por exemplo, CTIPDhs) e expandir a cultura de explante. Em ainda outras implementações não limitativas, a população de CTIPDs (por exemplo, CTIPDhs) compreende CTIPDs após 2, 3, 4, 5, 6 e/ou 7 passagens. Em implementações preferidas, a população de CTIPDs (por exemplo, CTIPDhs) compreende CTIPDs após 4 e/ou 5 passagens.

[00145] Em algumas implementações não limitativas, a população de CTIPDs (por exemplo, CTIPDhs) é obtida após pelo menos 3, 4, 5, 6 e/ou 7 ciclos de colheita. Em implementações preferidas, a população de CTIPDs (por exemplo, CTIPDhs) é obtida após pelo menos 5 ciclos de coleta.

[00146] Em algumas modalidades não limitativas, a população de CTIPDs (por exemplo, CTIPDhs) é preparada usando a tecnologia Cellavita seguida por uma expansão in vitro. Em outras modalidades não limitantes, a população de CTIPDs (por exemplo, CTIPDhs) são células-tronco jovens minimamente manipuladas em passagens baixas e PDs sem perder sua stemness.

[00147] Várias modalidades das divulgações contempladas são ainda ilustradas pelos seguintes exemplos que não devem ser interpretados como limitantes. O conteúdo de todas as referências, patentes e pedidos de patentes publicados citados ao longo deste pedido, bem como as

Figuras, são incorporados neste documento por referência em sua totalidade para todos os fins.

EXEMPLOS

[00148] Os aspectos desta divulgação aqui descritos se referem a um método de tratamento FMO usando população única e mista de células-tronco adultas humanas multipotentes derivadas de germe dentário (o germe dentário são células embrionárias primitivas que são os precursores dos dentes), polpa dentária primária de dentes decíduos, terceiros molares e permanentes (ver Lizier et al. (2012) PLoS ONE 7: e39885).

[00149] A referida população mista compreende CTMs, pericitos e células neuroepiteliais capazes de se diferenciar em endoderme, ectoderme e camadas germinativas embrionárias do mesoderma.

[00150] Uma outra modalidade se refere a um método de derivação contínua de CTIPDs a partir do cultivo prolongado de explante PD dental ex vivo através de múltiplos ciclos de coleta.

[00151] O referido método permite um número inesperado e quase ilimitado de ciclos de coleta/derivação e, portanto, pode reduzir o número de passagem de CTIPDs para obter um número semelhante de células como métodos relatados anteriormente.

[00152] O referido método divulgado é fácil de executar e diminui a probabilidade de ocorrência de mutações genômicas espontâneas e eventuais anormalidades cariotípicas. Mutações genômicas espontâneas ou anormalidades cariotípicas podem surgir durante múltiplas passagens em células-tronco, que ocorrem em métodos tradicionais para derivação de CTIPDs usando digestão enzimática da polpa dentária.

[00153] O número de células-tronco que apresentam um fenótipo CTM/pericito é diverso em diferentes populações de CTMs do tecido dentário e apresenta variações individuais.

Portanto, uma vantagem significativa para a cultura derivada de um único doador para vários lotes inclui variabilidade, consistência e reprodutibilidade reduzidas.

[00154] A título de exemplo, usando o referido método, é possível derivar uma quantidade terapeuticamente suficiente de CTIPDs de passagem baixa derivados de PDs de um único doador que podem ser obtidos de pelo menos um dente decíduo ou opcionalmente quatro dentes superiores e quatro "leite" inferiores dentes que podem ser armazenados ou preservados e usados conforme necessário.

[00155] Uma modalidade adicional se refere a um método em que um número clinicamente suficiente de CTIPDs pode ser obtido em um número de passagem baixo.

[00156] As células-tronco são autorrenováveis e podem se diferenciar em células multi-linhagem. Eles são divididos em três classes principais: células-tronco embrionárias (CTEs), células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) e células-tronco adultas. As células-tronco mesenquimais (CTMs) são células-tronco adultas, que podem ser encontradas na medula óssea, sangue do cordão umbilical (CU) e na geléia de Wharton, tecido adiposo (TA), tecido da polpa dentária (PD), líquido amniótico e outros fetos e tecidos pós-natais. As CTMs são células-tronco multipotentes não hematopoiéticas, capazes de se diferenciar em linhagens mesodérmicas, como osteócitos, adipócitos e condrócitos. CTMs expressam marcadores de superfície celular como um cluster de diferenciação CD73, CD90, CD105, CD29 e CD44. As CTMs não apresentam expressão de CD34, CD45, CD14 e HLA (antígeno leucocitário humano) - DR. Pela primeira vez, essas células foram obtidas da medula óssea.

[00157] As CTMs são uma ferramenta eficaz no tratamento de doenças crônicas, devido às propriedades imunomoduladoras, capacidade de secretar citocinas e imunorreceptores que regulam o microambiente no ambiente hospedeiro. CTMs têm finalidade funcional diferente quando comparados com CTEs e iPSCs, que é limitada pela regeneração do tecido. O maior desafio do uso de CTMs em terapia celular e medicina regenerativa é obter um grande número de células sem perder sua potência durante a subcultura e em passagens superiores. Foi demonstrado, por exemplo, que MO humano e CTMs derivadas de tecido adiposo tornam-se senescentes, exibindo potencial de diferenciação restrito, encurtamento do comprimento dos telômeros e alterações morfológicas quando eles foram progressivamente cultivados em passagens mais altas e alto tempo de duplicação populacional (DP). Além disso, a cultura de longo prazo de CTMs aumenta a probabilidade de ocorrência de mutação e transformação maligna.

[00158] Além disso, embora as CTMs pertençam à mesma classe de células-tronco - adultas, elas são derivadas de diferentes fontes e podem possuir um potencial de diferenciação e função biológica distintos, que depende de sua origem embrionária e de tecido adulto (FIG. 1). Além disso, foram encontradas diferenças profundas no potencial de desenvolvimento entre as fontes de CTMs, o que pode implicar no uso clínico das CTMs. Nesse sentido, foi postulado recentemente que “as CTMs de diferentes fontes têm propriedades de diferenciação radicalmente diferentes” (Sacchetti et al., 2016). As CTMs são isoladas de tecidos que podem possuir origem embrionária mesoderme, endoderme, ectoderme e mesoderme extraembrionário. As CTMs derivadas da medula óssea e do tecido adiposo são originadas do mesoderma, enquanto as CTM derivadas, por exemplo, do cordão umbilical e da placenta são de origem mesoderme extraembrionária. As células-tronco da polpa dentária são de origem ectoderma; mais precisamente, eles são derivados da crista neural (CN). Em contraste com o mesoderma, o NC é a fonte de uma variedade de CTMs denominados mesectoderme ou ectomesênquima. Assim, CTMs isoladas de fontes diferentes são desejáveis para fornecer produtos para o tratamento de FMO.

[00159] Hierarquicamente o mesectoderma é anterior ao ectomesênquima. O mesectoderma origina-se da formação das meninges e torna-se células pigmentares. O ectomesênquima é uma peça-chave para a formação dos tecidos duros e moles da cabeça e do pescoço, como ossos, músculos, dentes e arcos faríngeos. Antes da presente invenção, nem o mesectoderma nem o ectomesênquima eram conhecidos por contribuir para a formação de células hematopoiéticas ou por apoiar ou regular a hematopoese. As células do estroma e as células-tronco hematopoiéticas são derivadas da mesoderme embrionária e encontradas na medula óssea vermelha, que é um componente do núcleo da maioria dos ossos. Portanto, embora a origem do mesoderma seja conhecida como essencial para o tratamento do BMF, é inesperado que as células-tronco do mesectoderma ou do ectomesênquima sejam capazes de suportar e regular a hematopoese.

[00160] Vantagens para o uso de células-tronco de polpa dentária imaturas (CTIPDs) -Cellavita TM (U.S. PAT.

No. 9.790.468) para o tratamento de FMO incluem a capacidade de expandir significativamente os CTIPDs em cultura após o isolamento seguindo a tecnologia Cellavita.

Esta tecnologia evita a subcultura em passagens mais altas e tempo de duplicação da população (DP) alto, bem como a indução de senescimento, potencial de diferenciação restrito, encurtamento do comprimento do telômero, alterações morfológicas e probabilidade de transformação maligna.

[00161] Ao contrário de CTM de outras fontes adultas que não se propagam bem em cultura, CTIPDs podem ser muito expandidas em cultura e reter a capacidade de se diferenciar em uma pluralidade de produtos celulares. Por exemplo, uma polpa dentária pode fornecer um lote de CTIPDs o suficiente para tratar um grande número de pacientes (35- 100), o que também ajuda a padronizar os resultados clínicos.

[00162] São descritos neste documento o padrão e as características distintas de uma população mista de células-tronco da polpa dentária imaturas humanas isoladas de seu nicho localizado na região central da polpa coronal e radicular, que contém grandes troncos nervosos e vasos sanguíneos. Mais especificamente, essa região pode ser identificada como a camada mais interna da polpa, que é uma zona rica em células e contém fibroblastos e células-tronco indiferenciadas em estreita associação com os vasos sanguíneos. Um novo fenótipo imaturo de células-tronco da polpa dentária é descrito e caracterizado pela expressão de marcas registradas de células-tronco semelhantes a mesenquimais, semelhantes a limbo e neuronais/neuroepiteliais. As CTIPDs são células multipotentes, que podem produzir vários tipos de células diferenciadas terminalmente derivadas das três camadas germinativas, a endoderme, a ectoderme e a mesoderme.

[00163] Durante o desenvolvimento e em um organismo adulto, as células-tronco podem ser encontradas em um microambiente especial denominado nicho de células-tronco.

Um nicho é um sítio anatômico especializado, que interage com as células-tronco. A hipótese é que um nicho de células-tronco impede a diferenciação e, portanto, regula seu destino. Durante o desenvolvimento embrionário, os fatores de nicho atuam sobre as células-tronco embrionárias induzindo sua proliferação ou diferenciação. Essas alterações ocorrem devido à alteração da expressão de genes e proteínas específicas levando ao desenvolvimento do feto e formação de todo o organismo. Durante o período pós-natal da vida humana, especialmente na infância, os nichos de células-tronco produzem continuamente células especializadas que são necessárias para completar o desenvolvimento. Em um organismo adulto, o nicho mantém as células-tronco adultas em estado quiescente. A ativação das células-tronco ocorre em resposta à lesão do tecido quando o microambiente circundante está enviando sinais às células-tronco para promover a autorrenovação, proliferação e diferenciação para restaurar os tecidos danificados.

Vários fatores estão envolvidos na regulação do comportamento das células-tronco dentro do nicho. Em primeiro lugar, as interações célula-célula entre células- tronco, bem como interações entre células-tronco e células diferenciadas vizinhas, interações entre células-tronco e moléculas de adesão, componentes da matriz extracelular, a tensão de oxigênio, fatores de crescimento, citocinas e a natureza físico-química do ambiente, incluindo o pH, a força iônica (por exemplo, concentração de Ca2+) e metabólitos como ATP também são importantes. Essa interação recíproca entre as células-tronco e o nicho ocorre durante o desenvolvimento e é mantida durante a idade adulta.

[00164] O conhecimento sobre nichos de células- tronco in vivo é muito relevante porque pode ajudar a desenvolver condições de cultivo de células in vitro e a preservar a haste celular após o isolamento. A identificação de tais nichos em diferentes tecidos e a descoberta de seus componentes e funcionamento são essenciais para as terapias regenerativas. Este conhecimento fornecerá informações sobre vários componentes, que são importantes para a proliferação e diferenciação celular durante o crescimento, expansão e diferenciação in vitro de células-tronco, que devem ser controlados em frascos ou placas para fornecer uma quantidade suficiente do tipo de célula adequado antes de serem introduzidos de volta ao paciente para terapia. As células-tronco adultas permanecem em um estado indiferenciado ao longo da vida adulta. No entanto, quando são cultivadas in vitro, muitas vezes passam por um processo de “envelhecimento” no qual sua morfologia é alterada e sua capacidade proliferativa diminui. As condições corretas de cultivo de células-tronco adultas precisam melhorar para que as células-tronco adultas possam manter sua qualidade de tronco ao longo do tempo.

[00165] Duas populações de células-tronco multipotentes, CTH e CTM, compõem a medula óssea. As CTHs controlam as linhagens de células imunológicas, e as CTMs dão origem às células ósseas, cartilaginosas, musculares, tendinosas, ligamentares e de gordura. Em um organismo adulto, as CTHs da medula óssea têm seu nicho composto por osteoblastos subendosteais, células endoteliais sinusoidais e células estromais da medula óssea, como fibroblastos, monócitos e adipócitos.

[00166] Recentemente, foram descritos dois tipos de CTMs na medula óssea de ossos longos com função de nicho de CTH especializada. Essas CTMs compreendem populações diferentes e têm funções distintas. Assim, as células negativas da Nestina derivadas do mesoderma perdem sua atividade logo após o nascimento. Em contraste, as células quiescentes derivadas da crista neural positivas para Nestina preservam sua atividade de MSC na idade adulta, diferenciando-se em CTMs formadoras de nicho de CTHs. Essas células Nestina-positivas ajudam a estabelecer o nicho CTHs secretando fator 1 derivado de células do estroma (SDFI), também denominado CXCL12, conhecido por manter a população de CTH e progenitores linfóides dentro da medula óssea.

Ambas as populações dependem uma da outra para sobreviver.

[00167] Os estudos mostraram que, no caso de transplante de medula óssea, CTHs co-transplantadas com CTMs demonstram um melhor enxerto. Além disso, dados recentes sugerem que as CTMs da medula óssea possuem fatores regulatórios que controlam a capacidade proliferativa das CTHs.

[00168] As células-tronco da polpa dentária são um tipo de células-tronco somáticas que estão presentes no tecido da polpa dentária dentro da dentina dos dentes e que são capazes de se diferenciar em polpa dentária, dentina e semelhantes (capazes de se diferenciar principalmente em odontoblastos). As células-tronco da polpa dentária podem ser obtidas pela extirpação do tecido da polpa dentária de (i) um dente extraído por uma questão de conveniência no tratamento ortodôntico ou um dente extraído por causa de doença periodontal e semelhantes, ou de (ii) um dente do siso (também conhecido como um terceiro molar) extraído por uma questão de conveniência no tratamento ortodôntico ou no tratamento da periodontite do dente do siso e semelhantes.

[00169] Embora qualquer dente que retenha o tecido da polpa dental possa ser usado como uma fonte de células- tronco da polpa dentária, é preferível selecionar um dente que seja rico em células-tronco da polpa dentária com um alto potencial de proliferação.

[00170] Uma fonte adequada de células-tronco da polpa dentária é o tecido da polpa dental derivado de um dente do siso de um jovem (por exemplo, em humanos, cerca de 12-16 anos) tendo o dente do siso extraído para fins ortodônticos. Os dentes do siso nessas idades ainda estão no meio da formação da raiz dentária durante o estágio inicial de diferenciação dentária e são caracterizados por uma alta abundância de tecido da polpa dentária, uma densidade relativamente alta de células-tronco da polpa dentária e um potencial muito alto para sua proliferação.

[00171] Como os dentes do siso às vezes são extraídos para fins ortodônticos em outras faixas etárias, e porque o tecido da polpa dentária pode ser obtido de outros dentes que não os do siso, extraído por uma questão de conveniência, a disponibilidade desses dentes extraídos é alta.

[00172] Outras fontes potenciais de células-tronco da polpa dentária incluem dentes extraídos para o tratamento de doença periodontal, dentes do siso extraídos por causa da periodontite do dente do siso e semelhantes.

Nesse caso, tem como desvantagem um maior risco de contaminação e menor obtenção de tecido pulpar dentário.

Devido à facilidade de obtenção desses dentes de adultos (principalmente idosos), esses materiais podem servir como uma importante fonte de células-tronco da polpa dentária quando o transplante autólogo de células ou tecido diferenciado dessas células é desejado.

[00173] As células-tronco da polpa dentária que podem ser utilizadas na presente invenção podem ser derivadas de mamíferos. Embora as células-tronco da polpa dentária possam ser coletadas de qualquer espécie animal, é particularmente preferível que as células-tronco da polpa dentária sejam coletadas do paciente ou de outra pessoa que compartilhe o mesmo tipo de antígeno leucocitário humano (HLA) devido à ausência de rejeição do enxerto, quando as células-tronco obtidas são utilizadas na medicina regenerativa humana. Quando as células-tronco não são administradas (ou seja, transplantadas) a um ser humano, mas são usadas, por exemplo, como uma fonte de células para triagem para determinar a presença ou ausência de suscetibilidade do paciente a medicamentos e reações adversas a medicamentos, a polpa dentária as células-tronco devem ser coletadas do paciente ou de outra pessoa que compartilhe o mesmo polimorfismo genético correlacionado à suscetibilidade ao medicamento e às reações adversas ao medicamento.

[00174] Várias empresas criaram bancos de dentes para isolar CTMs/pericitos dos tecidos dentários e explorar o potencial desta abordagem nova e inovadora para preservar células-tronco de dentes decíduos e outras fontes dentais.

Nos EUA, StemSave, BioEden e Store-A-Tooth são empresas envolvidas no armazenamento de células-tronco dentárias. No Japão, os primeiros bancos de dentes foram estabelecidos na Universidade de Hiroshima e na Universidade de Nagoya.

Exemplo 1. Procedimentos Experimentais Células-tronco imaturas da polpa dentária

[00175] A polpa dentária (PD) foi extraída de dentes decíduos humanos esfoliados normais de crianças de 5 a 7 anos de idade (10 pacientes) com consentimento dos pacientes. As CTIPDh foram obtidas de PD humana usando o método de explante. Para o isolamento de CTIPDh, usamos meio de cultura descrito anteriormente em Kerkis et al.,

2006. Resumidamente: meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM)/Ham's F12 (1: 1, Invitrogen, Carlsbad, Califórnia, EUA) suplementado com 15% de soro fetal bovino (FBS, HyClone, Logan, Utah, EUA), penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 pg/ml, L-glutamina 2 mM e aminoácidos não essenciais 2 mM.

[00176] Além disso, para o cultivo de CTIPDh, o meio de cultura basal descrito acima foi alterado para meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM)/Ham's F12 (1: 1, Invitrogen, Carlsbad, Califórnia, EUA) suplementado com 10% de soro fetal bovino (HyClone, Logan, UT-USA), 1% de penicilina e estreptomicina (Gibco) e 1% de aminoácidos não essenciais (ANE-Gibco). O DMEM/F12 possui L-glutamina em sua formulação. Observou-se que a suplementação do meio com L-glutamina adicional aumenta a agregação de células- tronco, que podem entupir a veia durante o transplante de células-tronco, podendo até causar a morte do receptor.

[00177] As células foram obtidas após 5 transferências de polpa dentária, nenhum agrupamento foi feito e utilizado para inoculação nas passagens 4 ou 5, preferencialmente. As células foram incubadas a 37°C em 5% COC e ambiente de alta umidade.

Hemograma

[00178] A coleta de sangue foi realizada usando o tubo BD Vacutainer (BD Diagnostics, São Paulo, SP, Brasil), no volume aproximadamente de 250-500 qL com EDTA K2 que foram adicionados para preservar a morfologia celular. Após a coleta, os elementos celulares foram contados usando o analisador hematológico automatizado mindray BC-2800Vet.

[00179] As análises morfológicas foram realizadas através de esfregaços sanguíneos corados com o corante Panótico Instant Prov NewProv® (NewProv – Produtos para Laboratório, Pinhais, PR., Brasil) e também utilizando o microscópio Nikon DS-Ri1. Além disso, o quadro clínico dos animais foi avaliado ao longo do experimento, agregando e complementando os dados obtidos pelo contador automático.

Coleta de aspirado medular

[00180] O aspirado medular foi coletado dos ossos do fêmur e úmero após a eutanásia dos animais. Para realizar este procedimento, o osso foi dissecado, as epífises proximais foram removidas e o conteúdo medular foi coletado com o auxílio de uma seringa (1 mL) e uma agulha (13x4.5 - 26G ’/z BD R). Após a coleta do aspirado medular, foram realizadas contagens celulares absolutas na câmara de Newbauer, e alíquotas das amostras de MO foram utilizadas para os ensaios de UFC-F, citometria de fluxo e esfregaço de MO, de acordo com cada protocolo.

Unidade de formação de colônia (UFC-F)

[00181] Células derivadas do aspirado da MO foram submetidas ao ensaio UFC-F para comparar a capacidade clonogênica das células da MO tratadas com CTIPDh e o grupo não tratado. As células foram contadas na câmara de Neubauer e 4x105 de células viáveis foram plaqueadas em triplicata em placa de cultivo celular de 33 mm de diâmetro TPP R (Techno Plastic Products, Zollstrasse, Trasadingen, Suíça). Meio de cultura DMEM-Low Glucose Gibco * M (Life Technologies, Carlsbad, Califórnia, EUA) contendo 10% de Soro Fetal Bovino 1% de aminoácidos não essenciais, 1% de L-Glutamina e 1% de antibiótico (100 U/ml de penicilina e 100 qg/ml estreptomicina) Invitrogen * M (Invitrogen Corporation Carlsbad, Calif., EUA), e as células foram mantidas em atmosfera umidificada a 37 ° C em 5% de COC. As células foram mantidas por 21 dias em meio de cultura trocado a cada três dias. Após 21 dias, as células foram fixadas em solução de paraformaldeído 4% por 24 horas. As células foram então desidratadas em uma bateria de 100%, 95%, 80% e 50% de álcoois por 3 minutos cada, lavadas com água destilada e então coradas com 1% de cristal Merck R (Merck Millipore, Darmstadt, Alemanha) por 10 minutos para contar as colônias formadas.

Citometria de Fluxo

[00182] Alíquotas de 1x106 células da MO aspiradas previamente foram fixadas em paraformaldeído 0,1% por 20 minutos, em seguida as células foram lavadas duas vezes com PBS por 5 minutos. Em seguida, 0,1% Sigma R Triton X-100 (Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, EUA) foi adicionado por 20 minutos nas alíquotas para proporcionar a permeabilização das células. As células foram novamente centrifugadas em PBS durante 5 minutos a 2000 RPM. As células foram então incubadas com solução de BSA a 5% (Sigma R) para bloquear ligações inespecíficas (durante 30 minutos). Posteriormente, as células foram lavadas 1x PBS por 5 minutos e incubadas com os anticorpos primários descritos na Tabela 1 overnight. As células foram então lavadas 1x PBS por 5 minutos para remoção do anticorpo primário e incubadas com os anticorpos secundários descritos na Tabela 2 por 1 hora. Por fim, as amostras foram lavadas mais uma vez por 5 minutos. O sobrenadante foi descartado e o pellet foi ressuspenso em 100 microlitros de PBS, e as células foram lidas e analisadas pelo citômetro de fluxo BD Accuri'R c6. Os resultados foram analisados pelo software FlowJo V.10. 1

[00183] Tabela 1. Anticorpos primários usados em ensaios de citometria de fluxo (FACS) para caracterizar as células do aspirado de MO, em imunohistoquímica (IHC) para caracterizar tecido medular, em imunocitofluorescência (ICF) para caracterizar células da MO in vitro, e em imunocitoquímica (ICQ) para caracterizar células do aspirado de MO.

Anticorpo Espécie Marca Diluição FACS IHQ ICF ICQ CD 34 Cabra Santa Cruz Biotechnolo RO 1:100 X X X X CD 44 Rato R AbCamO 1:100 X X X X CD 45 Rato R AbCamO 1:100 X X X X CD 90 Rato R AbCamO 1:100 X X X X CD105 Coelho R AbCamO 1:200 X C-kit Coelho Santa Cruz Biotechnolo R O 1:100 X X X X Fibronectina Coelho Dak OR 1:200 X X X X Nestina Coelho R AbCamO 1:200 X X X X Núcleo Humano Camundon R AbCamO 1:500 X go p53 Coelho R AbCamO 1:200 X Sca-1 Rato AbcamoR 1:100 X X X X Vimentina Cabra Santa Cruz Biotechnolo R O 1:100 X

[00184] Tabela 2. Anticorpos secundários usados em ensaios de citometria de fluxo (FACS) para caracterizar células da MO, em imunohistoquímica (IHC) para caracterizar o tecido medular, em imunocitofluorescência (ICF) para caracterizar células da MO in vitro, e em imunocitoquímica (ICQ) para caracterizar as células do aspirado de MO.

Anticorpo Espécie Marca Diluição FACS IHQ ICF ICQ Anti-Cabra IgG (H+L) (Alexa Cabra ThermoFisher 1:200 X Fluo 647 conjugado) ScientiflC@ Anti-Cabra IgG (FITC Cabra Santa Cruz 1:100 conjugado) X Biotechnology@ Anti-Cabra IgG (HRP Cabra Dakoo 1:100 conjugado) X X Anti-Coelho IgG (H+L) Coelho ThermoFisher 1:200 X (Alexa ScientiflC@ Fluo 633 conjugado) Anti-Coelho IgG (FITC Coelho Santa Cruz 1:100 conjugado) Biotech nology@ X Anti-Camundongo/Anti-Coelho Camundong Envision + Link Duplo (HRP o/Coelho Dakoo X X conjugado) Anti-Rato IgG (FITC Rato Santa Cruz 1:100 X X conjugado) Biotechnology@ Anti-Rato IgG (HRP Rato Dakoo 1:100 conjugado) X X

Coleta de tecido medular e do baço

[00185] Após a eutanásia dos animais, foram realizadas coletas do tecido medular e do baço para as análises histológicas e imunohistoquímicas, para isto as amostras foram fixadas em paraformaldeído 10% (Sigma R).

Descalcificação

[00186] Após a fixação, os ossos foram descalcificados com a solução contendo 5,5 g de EDTA (Sigma R), 10 ml de Formol (Sigma R) e 90 ml de água destilada. O material foi coberto com a solução pelo menos 40 vezes e foi trocado a cada 3 dias por 2 semanas.

Histoquímica

[00187] As lâminas histológicas foram coradas pelo método de hematoxilina-eosina (Merck R) para avaliar danos do tecido medular e do baço. Para a técnica da hematoxilina-eosina, as amostras foram previamente lavadas em água corrente, processadas e incluídas em parafina (Sigma R), e foram cortadas em cortes histológicos de 4 micrômetros em lâminas silanizadas. As lâminas passaram então pelo processo de desparafinização com Xilol I por 20 minutos e Xilol II por 20 minutos a temperatura ambiente.

Depois foi realizada a etapa de hidratação, que consiste na utilização inicialmente de álcool absoluto por 2 minutos e de álcool etílico nas concentrações 95%, 80% e 70% durante 2 minutos cada. Em seguida as lâminas foram lavadas em água corrente e água destilada, e então submersas em Hematoxilina de Harris (Merck®) durante 2 minutos procedendo a lavagem em água corrente por 15 segundos e lavagem em água destilada. As lâminas então sofreram um processo de desidratação com álcool etílico nas concentrações de 50%, 80%, 95% durante 2 minutos cada. Logo após foram submersas na eosina por 30 segundos, seguidas de álcool I 95% e álcool II 95% por 2 minutos cada, e pela bateria de álcoois absoluto I, II e III. Após, as lâminas foram diafanizadas com Xilol I, II e III por 2 minutos cada. Para a finalização, as lâminas foram seladas com Permount Mounting Medium (VWR Laboratories, Radnor, Pensilvânia, EUA) e visualizadas com o microscópio óptico Nikon DS-Ri.

Imunohistoquímica

[00188] Para a realizar a técnica de imunohistoquímica, as amostras foram fixadas em paraformaldeído a 10% e lavadas em água corrente, processadas e incluídas em parafina, em seguida foram realizados cortes histológicos em lâminas silanizadas. As lâminas passaram então pelo processo de desparafinização com Xilol I por 20 minutos e Xilol II por 20 minutos a temperatura ambiente. Depois foi realizada a etapa de hidratação, que consiste na utilização de álcool etílico nas concentrações 100% e 95% durante 4 minutos cada. Em seguida, as lâminas foram então submersas em Hidróxido de Amônia (10% em álcool etílico 95%) por 10 minutos, seguidas de quatro lavagens com água destilada por 5 minutos. As lâminas foram submetidas à recuperação antigênica em tampão citrato por 5 minutos a 95 °C em panela de pressão, seguidas de 3 lavagens em água destilada por 5 minutos.

Foram realizados dois banhos de 10 minutos cada em peróxido de hidrogênio 6% metanol na proporção 1:1, para o bloqueio da peroxidase endógena, seguido de duas lavagens de água destilada por 5 minutos.

[00189] Após essa etapa as lâminas foram incubadas com os anticorpos primários descritos na Tabela 1, em câmara úmida overnight a 4 °C. No dia seguinte, as lâminas foram lavadas em PBS por 5 minutos. Então, os anticorpos secundários descritos na Tabela 2 foram incubados por 1 hora em câmara úmida e temperatura ambiente. Após, foram realizadas duas lavagens com PBS por 5 minutos para a retirada do anticorpo secundário e foi pipetado 100 μL de cromógeno (DAB Kit) Zymed® (Zymed Laboratories, São Francisco, Califórnia, EUA) nos cortes de 3 a 5 minutos. As lâminas foram lavadas em água destilada por 5 minutos.

Foram então submersas em Hematoxilina de Mayer (Merck®) durante 1 minuto e procedeu a lavagem em água corrente por 15 segundos e lavagem em água destilada por 5 minutos. As lâminas então sofreram um processo de desidratação em bateria ascendente de álcool etílico nas concentrações de 50%, 80%, 95% durante 2 minutos cada, e 100% durante 6 minutos. Após, as lâminas foram diafanizadas com Xilol I, II e III por 2 minutos cada. Para a finalização, as lâminas foram seladas com Permount Mounting Medium e visualizadas com o microscópio óptico Nikon DS-Ri1.

Imunocitofluorescência

[00190] As células da MO cresceram sob lamínulas de vidro na concentração de 2x104 e após atingirem a confluência de 50-60% foram fixadas em solução de paraformaldeído a 4% (Sigma®). Para retirar o paraformaldeído as células foram lavadas 2 vezes com solução PBS por 5 minutos, seguida da adição de Triton 0,1% (Sigma®) por 20 minutos, para permeabilizar a membrana celular. Depois, as células foram lavadas 2 vezes com solução de PBS por 5 minutos e adicionado BSA a 5% (Sigma®) por 40 minutos. Com isso, foram adicionados anticorpos primários descritos na Tabela 1 e incubados a 4 °C overnight.

[00191] Então, as células foram lavadas duas vezes com solução PBS por 5 minutos para a retirada de anticorpos primários. Depois, foram adicionados os anticorpos secundários descritos na Tabela 2 por uma hora a temperatura ambiente. As lamínulas foram retiradas das placas de cultivo e lavadas com kit vectashield com DAPI

Vector® (Vector Laboratories, Ltd., Burlingame, Califórnia, EUA) para a análise no microscópio de fluorescência NIKON DS-Ri1 (com luz de excitação a lâmpada HBO para o fluorocromo DAPI, laser de excitação 488 nm para FITC).

Citospin

[00192] Foram separadas alíquotas de aspirado medular na concentração de 5x104 de células. As amostras foram fixadas a 4% de paraformaldeído (Sigma®) por 24 horas. Depois, foram lavadas 1x com PBS e centrifugadas a 2000 RPM por 5 minutos. Em seguida foram descartados os sobrenadantes e o pellet das amostras foram ressuspendidos em 300 μL de BSA 5% (Sigma®).

[00193] Posteriormente, foram montadas lâminas silanizadas no aparelho de citospin e pipetados 300 μL de amostra. Então, foram centrifugadas a 2000 RPM por 5 minutos na centrífuga especializada Thermo Shandon Cytospin® 4.

Imunoquímica

[00194] As lâminas na concentração de 5x104 de células de MO (concentradas previamente através da técnica de citospin) foram lavadas duas vezes com PBS por 5 minutos. A seguir foi adicionado Triton X-100 a 0,1% (Sigma®) por 20 minutos nas alíquotas que necessitavam de permeabilização celular. As células foram novamente lavadas com PBS por 5 minutos. Após, as células foram incubadas com solução de BSA a 5% (Sigma®) para bloquear ligações inespecíficas (por 40 minutos). Em seguida, as amostras foram lavadas 1x com PBS por 5 minutos e incubadas com os anticorpos primários descritos na Tabela 1 overnight a 4°C.

No dia seguinte, as lâminas foram lavadas em PBS por 5 minutos. Então, os anticorpos secundários descritos na Tabela 2 foram incubados por 1 hora em câmara úmida e temperatura ambiente. Após, foram realizadas duas lavagens com PBS por 5 minutos para a retirada do anticorpo secundário e foi pipetado 100 μL de cromógeno (DAB Kit, Zymed Laboratories®) nas lâminas de 3 a 5 minutos. As lâminas foram lavadas em água destilada por 5 minutos.

Foram então submersas em Hematoxilina de Mayer (Merck®) durante 1 minuto e procedeu a lavagem em água corrente por 15 segundos e lavagem em água destilada por 5 minutos. Para a finalização, as lâminas foram fechadas com meio de montagem aquoso Abcam® (Abcam Plc., Cambridge, Reino Unido) e esmalte, e visualizadas com auxílio do microscópio óptico Nikon DS-Ri.

Análise de resultados

[00195] Após a realização dos experimentos, as análises estatísticas dos resultados pelos testes one way ANOVA, two way (ANOVA) foram realizadas utilizando o software GraphPad Prism 5.0 (GraphPad; PRISM, 2007).

Exemplo 2. Modelo AA e desenho experimental.

[00196] Para induzir AA, 40 camundongos isogênicos fêmeas da linha C57 preto/6, com 4 semanas de idade, receberam irradiação de corpo inteiro em uma fonte panorâmica de radiação contendo Cobalto 60, com taxa média de 11,60 kg e 40 cm de distância da fonte. A dose utilizada foi de 6 Gy, por ser considerada moderada a grave. O tempo de exposição dos animais na câmara de irradiação foi de 31 minutos. Cada gaiola continha três animais, com comida e água servidas ad libitum. Os ciclos de luz foram mantidos e a temperatura foi mantida a 19-22 ° C. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais do Instituto Butantan. Número do processo 01201/14.

[00197] Os camundongos irradiados após 48 horas de irradiação foram divididos em 2 grupos (FIG. 2, Tabela 3): • Grupo tratado com CTIPDh: animais irradiados + transplante com CTIPDh via intraperitoneal usando 1x106 células. N = 20 animais; • Grupo não tratado com CTIPDh: animais irradiados + solução de PBS. N = 20.

[00198] Os animais receberam o primeiro transplante de 1x106 CTIPDh após 48 horas do processo de irradiação, o segundo transplante foi realizado 15 dias após o primeiro transplante, e o terceiro transplante foi realizado 15 dias após o segundo transplante, totalizando três transplantes de células (FIG. 2, Tabela 3).

Tabela 3. Projeto experimental Grupos Tratamento No. Controle Não irradiado (fisiológico normal) 10 Irradiado Irradiado e eutanasiado após 48 horas 10 Tratamento Irradiado + injeção intraperitoneal com células CTIPDh (1x10‘) 40 Sem tratamento Irradiado + injeção intraperitoneal com solução salina 40 Longo Período Irradiado + injeção intraperitoneal com células CTIPDh (1x10‘) 5 tratamento após 6 meses Longo Período Irradiado + injeção intraperitoneal com solução salina após 6 5 Sem tratamento meses

[00199] Os animais foram tratados por meio de injeção intraperitoneal (IP). Uma grande vantagem do uso da via IP é a possibilidade de administrar um grande número de células, pois o peritônio é capaz de alta absorção devido à sua alta vascularização.

[00200] Para o transplante IP, 1x106 CTIPDh foram ressuspensos em 100 microlitros de solução salina e, em seguida, injetados na cavidade abdomino pélvica com uma seringa de insulina. Os animais foram acompanhados por 30 dias após a data do último transplante de células. Nesse momento, os animais foram eutanasiados em câmara COC para coleta de ossos longos (fêmur e úmero) e baço.

[00201] Os hemogramas foram realizados nos seguintes momentos: antes da irradiação (D0), após a irradiação (D2), 15 dias após cada transplante (D17 e D32) e 30 dias após o terceiro transplante (D62) (FIG. 2) O controle da massa corpórea dos animais foi realizado no mesmo intervalo cronológico.

[00202] Seis animais que não foram irradiados para controle do estudo foram separados, e seis animais que sofreram irradiação foram eutanasiados 48 horas após a irradiação para comprovar a eficiência da radiação como modelo de indução de AA.

• Grupo de controle (A): Animais não irradiados (tipo selvagem) N = 6 animais; • Grupo de controle (B): animais não irradiados tratados com CTIPDh = 6 animais; • Grupo irradiado: Animais irradiados e eutanasiados 48 horas após irradiação, N = 6 animais.

[00203] Estudos adicionais foram realizados para avaliar a persistência do tratamento; portanto, um grupo de longo prazo foi incluído no projeto experimental. Nesse grupo, uma parte dos animais experimentais (n = 10) não foram eutanasiados após o período proposto neste estudo (D62). Esses animais permaneceram um período de 6 meses após o D62.

• Grupo 6 meses pós-D62 Tratado (irradiado + tratado com CTIPDh + 6 meses), N = 5 animais; • Grupo 6 meses pós-D62 Não tratado (irradiado + sem tratamento + 6 meses), N = 5 animais.

Exemplo 3. Expressão de marcadores seletivos envolvidos na hematopoiese por CTIPDh.

[00204] As passagens P4 ou P5 de CTIPDh foram usadas. As características imunofenotípicas de CTIPDh descritas anteriormente (KERKIS et al., 2006; LIZIER et al., 2012) foram confirmadas em nosso presente estudo (dados não mostrados).

[00205] Os ensaios de imunocitofluorescência foram realizados usando anticorpos contra CD90, Fibronectina, Nestina, Vimentina ou CD44. Todos esses marcadores eram imunopositivos em CTIPDh. A imunomarcação de CD90 foi detectada na membrana celular por FITC (seta branca) (FIG.

3A). As imunomarcações de Fibronectina, Nestina, Vimentina e CD44 foram detectadas no citoplasma por FITC (seta branca) (FIGs. 3A-3E).

[00206] A FIG. A análise de citometria de fluxo 3F demonstra a expressão de marcadores de CTM adicionais que são positivos em CTIPDh: CD90 “; CD73 “, CD105“ e Nestina “. A expressão destes marcadores e outros que apresentados na FIG. 3 foram observados entre cerca de 80% e 100% das células. FIG. 3F também demonstra que essas células são negativas para CD11B; CD45; CD34; CD19 e HLA-DR. No geral, podemos descrever o perfil imunológico dessas células como CD90 “; CD73 “, CD105“, Nestina “, CD44“, Vimentina “, Fibronectina “/CD11B; CD45; CD34; CD19, HLA-DR.

Exemplo 4. Peso corpóreo

[00207] O peso corpóreo dos animais foi avaliado antes da irradiação (D0), 48 horas após a irradiação (D2), e 15 dias após cada transplante com CTIPDh, primeiro transplante (D17); segundo transplante (D32) e 30 dias após o terceiro transplante (D62/eutanásia).

[00208] Os camundongos de ambos os grupos experimentais não mostraram diminuição significativa na massa corporal 48 horas após a irradiação (6 Gy) (D2).

Porém, os animais que receberam o 2º transplante de CTIPDh (D32) apresentaram ganho significativo de peso corporal (P + 0,05) em relação ao D2 (48 horas após a irradiação). Este ganho foi mais significativo após o terceiro transplante (D62) (P <0,001) (FIG. 4C). Enquanto isso, os animais do grupo não tratado (irradiação + solução salina) não mostraram nenhuma mudança significativa em sua massa corporal durante o tratamento (FIGs. 4A-4B).

Exemplo 5. Monitoramento de parâmetros hematimétricos

ERITRÓCITOS

[00209] O hemograma mostrou uma diminuição significativa no número de eritrócitos após a irradiação (D2) em ambos os grupos experimentais (tratados com IDPSCs e não tratados) (P<0,01), que atingiu valores abaixo da referência de camundongos normais (> 11x106/qL). Esses dados mostram a eficácia da irradiação na dose de 6 Gy.

Vale a pena mencionar que houve uma diminuição mais pronunciada nos valores de eritrócitos em D17 (P + 0,001) em ambos os grupos experimentais (tratados com CTIPDh e não tratados) (FIGs. 5A-5E). Porém, no D32 os animais tratados com CTIPDh apresentaram aumento significativo (P + 0,05) no número absoluto de eritrócitos em relação à queda indicada no D17 (representado por ##), atingindo valores de referência normais. Esse perfil foi observado até o final do período de estudo (D62). Enquanto o número absoluto de eritrócitos dos animais no grupo não tratado permaneceu abaixo dos valores de referência até D62 (P + 0,01) (FIGs.

5A-5B).

[00210] A comparação entre os grupos mostra que os animais que receberam tratamento com CTIPDh apresentaram níveis de eritrócitos maiores do que o grupo que não recebeu o tratamento, que não foi capaz nem mesmo de atingir os valores de referência normais (> 11x106/qL) até o final do estudo.

[00211] As CTIPDh também foram transplantados em animais de tipo selvagem (Grupo de controle B), que não receberam irradiação. A comparação entre os grupos de controle A e B não demonstrou nenhuma diferença nos níveis de eritrócitos (FIGs. 5C-5E). Valores de referência para hemograma (Rato): Eritrócitos (RBC = 7-11x 106/qL).

VALORES DE HEMATÓCRITO

[00212] Os resultados mostraram uma queda significativa nos valores de hematócrito em ambos os grupos experimentais logo após a irradiação (D2) (P + 0,01). Esta decadência continuou no D17 (P + 0,001) em relação ao D0, atingindo valores abaixo de 50%, considerados inferiores ao nível de referência normal para camundongos (WEISS; WARDROP, 2010) (FIGs. 6A-6B). Porém, no D32, o grupo tratamento com CTIPDh apresentou aumento significativo no percentual de hematócrito (P + 0,01) (representado por ##) em relação ao D17, recuperando os valores normais para as espécies, que permaneceram até D62. Enquanto o grupo não tratado com CTIPDh não recuperou os níveis normais de hematócrito até D62 (P +0,01) (FIGs. 6A-6B).

[00213] Ao comparar os valores de hematócrito entre os grupos tratados e não tratados com CTIPDh, foi possível observar que os animais que receberam o tratamento foram capazes de normalizar os níveis de hematócrito após o segundo transplante (D32). Apresentaram percentual de hematócrito superior ao dos animais não tratados, que não recuperaram o valor do hematócrito normal de acordo com a referência ao final deste estudo (> 50%).

[00214] As CTIPDh foram transplantados em animais de tipo selvagem (grupo de controle B), que não receberam irradiação. A comparação entre os grupos de controle A e B não demonstrou nenhuma diferença na porcentagem de hematócrito (FIG. 5D). Valores de referência para hemograma (rato): eritrócitos (RBC = 7-11x 106/qL).

LEUCÓCITOS

[00215] Os valores absolutos de leucócitos em ambos os grupos experimentais (tratados com CTIPDh e não tratados) tiveram uma redução significativa após a irradiação (D2) (P + 0,001). A diminuição dos valores absolutos dos leucócitos permaneceu em todos os pontos analisados até o final do estudo (D17, D32 e D62) em ambos os grupos experimentais (P + 0,001). Esses resultados demonstram que os níveis de leucócitos tiveram uma redução maior em comparação aos níveis de eritrócitos e hematócrito. Isso pode ser explicado pelo fato de que o sistema imunológico responde rapidamente e é muito sensível à irradiação de todo o corpo, principalmente devido à tendência dos linfócitos a sofrerem apoptose. Na verdade, a taxa de diminuição do número de linfócitos no sangue periférico ocorre nos primeiros dias após a exposição à radiação. Outro fator importante a se considerar é que o sangue periférico possui um número elevado de linfócitos circulantes, portanto, a redução no número dessa linhagem é mais significativa. Além disso, o sistema hematopoiético é extremamente sensível à radiação ionizante.

[00216] Apenas o grupo tratado com CTIPDh mostrou uma ligeira recuperação nos níveis de leucócitos totais após o segundo transplante de células (D32) (P + 0,001) (representado por ###) em D2. No entanto, os animais não tratados não apresentaram variação significativa nos valores absolutos de leucócitos em D17, D32 e D62 (FIGs.

7A-7C).

[00217] Embora os leucócitos tenham apresentado uma diminuição significativa durante o período de estudo em ambos os grupos experimentais até o final do estudo (D62), houve um aumento nos níveis de leucócitos no grupo CTIPDh, embora não tenha atingido níveis normais para a espécie, enquanto isso não foi observado em animais não tratados.

[00218] Ao comparar os valores de leucócitos totais entre os grupos experimentais, uma contagem de leucócitos mais alta foi observada após o primeiro transplante de CTIPDh, o que é significativo após o segundo transplante de células (P + 0,05) (FIGs. 7A-7B).

[00219] As CTIPDh foram transplantados em animais de tipo selvagem (Grupo de controle B), que não receberam irradiação. A comparação entre os grupos de controle A e B mostrou uma ligeira diferença no nível de leucócitos (FIG.

5E). No entanto, esses valores não excedem os valores de referência estabelecidos para hemograma (Mouse): Leucócitos (WBC = 2-10x103/qL).

Exemplo 6. Alterações morfológicas observadas na medula óssea antes e após a irradiação e transplante de CTIPDh.

[00220] Após a irradiação (48 horas), a medula óssea apresentava destruição tecidual, com lesão disseminada ao longo do tecido medular e redução da celularidade (hipoplasia/aplasia medular), em comparação com MO de animal normal (sem irradiação). Identificamos alguns elementos hematopoiéticos. Estes incluem uma ausência de megacariócitos, uma infiltração de glóbulos vermelhos, uma maior quantidade de estroma espinhal e substituição de elementos gordurosos em algumas regiões da BM (FIGs. 8A- 8B). Esses achados histológicos são semelhantes aos descritos na literatura para modelos experimentais de mielossupressão ou mieloablação com radiação ionizante em doses a partir de 4 Gy. Essas alterações morfológicas são consequências do impacto da radiação nos tecidos, resultando em lesão tecidual por estresse oxidativo e inflamação, que alteram o microambiente celular e principalmente os nichos de células hematopoiéticas mais sensíveis aos danos da radiação.

[00221] A celularidade da MO em animais tratados com CTIPDh foi semelhante ao grupo não irradiado, com ausência de células adiposas (FIGs. 9A-9B). Os resultados sugerem que os CTIPDh podem regenerar MO após a irradiação.

Resultados diferentes foram observados nos animais do grupo não tratado com CTIPDh. Nesse grupo, o MO dos animais irradiados ainda apresentava mieloablação parcial ou total, com redução dos elementos celulares em geral, sendo algumas regiões marcadas pela substituição de células adiposas (FIGs. 9C-9E). Em alguns casos, o dano foi muito grave e incompatível com a vida (FIG. 9F).

ANÁLISE DA MEDULA ÓSSEA

[00222] Os resultados obtidos após a análise de esfregaço de medula óssea corroboram com os resultados histológicos apresentados acima. No D62 (eutanásia), os camundongos tratados com CTIPDh apresentaram maior celularidade, com presença de precursores hematopoiéticos e células nucleadas em diferentes graus de maturação, como megacariócitos (FIGs. 10A-10C). Enquanto o grupo não tratado apresentou baixa celularidade, marcada pela presença de grande número de adipócitos e uma ausência de precursores hematopoiéticos e megacariócitos (FIGs. 10D- 10E).

[00223] Sabe-se que a trombocitopenia é um dos índices hematimétricos mais importantes para AA que tornam os pacientes que apresentam esta doença expostos à hemorragia. Além disso, a deficiência de plaquetas pode causar hematomas (e edema da medula óssea ou contusão óssea), que são infiltrações de sangue (glóbulos vermelhos)

no canal medular devido à ruptura dos capilares. Esses infiltrados foram encontrados em MO de animais após irradiação e em MO de animais não tratados com CTIPDh.

[00224] A ausência de megacariócitos na MO após irradiação e sem tratamento com CTIPDh pode ser observada em animais com AA (FIG. 10E). Enquanto nos camundongos tratados com CTIPDh, foi possível visualizar a presença de megacariócitos (FIG. 10C). Portanto, esses dados fornecem evidências indiretas de que o tratamento com CTIPDh também pode induzir uma melhora na função plaquetária.

[00225] Juntos, esses resultados (esfregaço e histologia de MO) demonstram a eficácia de CTIPDh na recuperação dos componentes celulares de MO em camundongos irradiados.

FIBROBLASTOS DE UNIDADE FORMADORA DE COLÔNIA

[00226] Sabe-se que a radiação na dose de 10 Gy reduz a capacidade proliferativa das células MO. Assim, avaliamos se as CTIPDh transplantados podem influenciar a capacidade proliferativa das células MO em camundongos irradiados. O aspirado de MO foi coletado e o ensaio UFC-F foi realizado. Uma maior capacidade de formar UFC-F foi observada no grupo tratado com CTIPDh (FIGs. 11A-11G e FIGs. 12A-12G).

[00227] A análise estatística do número de colônias formadas foi realizada para determinar a influência das

CTIPDh na formação de UFC. Foi possível observar uma diminuição significativa (P + 0,001) no número de colônias nos animais com irradiação (48 horas) em relação aos animais sem irradiação. Essa redução na capacidade clonogênica das células MO também foi significativa (P + 0,001) nos animais não tratados com CTIPDh em comparação com o controle (sem irradiação). No entanto, em animais que receberam tratamento com CTIPDh, nenhuma diminuição significativa no número de UFCs foi observada em comparação com o controle (FIGs. 12A-12G). Além disso, uma diferença significativa (P + 0,05) (representada por ##) foi observada entre os grupos experimentais, onde os animais que receberam CTIPDh apresentaram maior número de UFC em comparação ao grupo não tratado.

[00228] Diante dos resultados acima, podemos concluir que a irradiação na dose de 6 Gy afeta a formação de UFC-F e que o transplante de CTIPDh protege as células MO após a irradiação. Este é um resultado importante porque as células da MO têm um papel fundamental no suporte da hematopoiese.

Exemplo 7. Avaliação da contribuição funcional de CTIPDh na função hematopoiética e estromal da medula óssea em camundongos.

[00229] A apoptose é considerada a principal causa de lesão de MO por irradiação. A ocorrência de apoptose está relacionada à regulação do oncogene e anti-oncogene. A proteína citoplasmática p53 é um importante biomarcador para apoptose. P53 controla a mudança da fase G1 para a fase S no ciclo celular e, assim, determina se as células entrarão na fase S (do ciclo celular) e/ou continuarão para a apoptose celular. As células hematopoéticas são altamente sensíveis aos danos da radiação e mesmo a exposição a níveis relativamente baixos pode resultar em FMO. A irradiação MO é um importante modelo experimental para estudo em doenças hematológicas. Nossos resultados demonstraram que a irradiação na dose de 6 Gy resultou em morte celular MO por apoptose. A análise de citometria de fluxo demonstrou que após irradiação (48 horas), quase 50% das células MO estavam apoptóticas (média de 43,8% de células positivas para p53). Enquanto apenas 4,46% das células no grupo de controle (sem radiação) eram p53- positivas (P + 0,05) (FIGs. 14A-14G1).

[00230] No final deste estudo (D62), a expressão de p53 foi reduzida em ambos os grupos experimentais. Nesse mesmo período, o grupo tratado com CTIPDh apresentou menor número de células p53 “(média: 17,75%) em comparação com o grupo não tratado (média: 31,35%) (FIG. 14D). Este achado demonstra um possível efeito anti-apoptótico da CTIPDh nas células da MO.

AÇÃO DE CTIPDh NA MATRIZ EXTRACELULAR DA MO

[00231] Após a irradiação na dose de 6 Gy, foi observada uma redução da Fibronectina (P + 0,05) (média: 11,7% de células positivas para fibronectina) em comparação com os animais do grupo controle (média: 52,63% de Fibronectina- células positivas). No entanto, não observamos uma diferença significativa entre os grupos tratados e não tratados na porcentagem de células positivas para fibronectina (FIGs. 15A-15D).

[00232] Comparamos a expressão de Fibronectina em animais tratados com CTIPDh versus animais não tratados usando imunocitoquímica, imunocitofluorescência e análise imuno-histoquímica (FIGs. 16A-16F). O aspirado de MO no grupo tratado com CTIPDh mostrou células de fibronectina “com morfologia semelhante a fibroblastos característica que é diferente daquelas de animais não tratados (FIGs.

16C-16D). A fibronectina, uma proteína da matriz extracelular, foi observada em ambos os grupos, mas tem um padrão distinto de localização na matriz extracelular (FIGs. 16E-16F). Alta quantidade de fibronectina com uma formação de matriz extracelular característica em uma rede extensa foi observada no osso seguinte de camundongos irradiados e tratados com CTIPDh (FIG. 16E). No grupo não tratado, foram observadas fibras brutas de fibronectina entre as células adiposas (FIG. 16F). Estas descobertas sugerem um papel para as CTIPDh na remodelação da matriz.

AÇÃO CITPD NO NICHO VASCULAR Nestin

[00233] Outro componente MO, o nicho vascular, é composto por células endoteliais, progenitores endoteliais e CTM. Nestina, um filamento intermediário em progenitores neurais, também se expressa em progenitores endoteliais proliferativos e tem papel fundamental na angiogênese. Além disso, a Nestina é amplamente expressa em células perivasculares, CTMs e CTIPD que são derivadas da crista neural. A Nestina pode ser usada como um biomarcador de nicho vascular (progenitores endoteliais).

[00234] Os resultados obtidos pela análise de citometria de fluxo mostraram que a radiação causou uma diminuição significativa no número de células positivas para Nestina (P + 0,05) (média: 16,6% de células positivas para Nestina) em comparação com o grupo controle (não irradiadas) (média: 50,53% de células positivas para Nestina) (FIGs. 17A-17D). A diminuição dos precursores endoteliais também foi observada em pacientes com AA que têm vasos endoteliais comprometidos devido à doença. Após o transplante com CTIPDh (D62), foi observado que o número de células positivas para Nestina aumentou significativamente (P + 0,05) no grupo tratado com CTIPDh (média: 41,6% de células positivas para Nestina) em comparação com o grupo não tratado. Curiosamente, o grupo que não recebeu tratamento mostrou uma diminuição significativa (P +0,05 **) (média: 16,4% de células positivas para Nestina) até o final do estudo (FIG. 17D).

[00235] Além disso, a alta expressão de Nestina no endotélio dos vasos sinusóides foi observada no grupo tratado com CTIPDh usando imuno-histoquímica. Nenhuma tal marcação, além de uma diminuição dos vasos sinusoidais da área estudada, foi observada no grupo não tratado (FIGs.

18A-18F).

CD105

[00236] Resultados semelhantes foram obtidos com CD105, que também é expresso em progenitores endoteliais, células endoteliais, bem como em células estromais (CTMs).

[00237] A irradiação (48 horas) ocasionou diminuição da expressão de CD105 em relação ao grupo controle. Esses resultados corroboram os relatados para pacientes com AA que apresentam comprometimento dos vasos endoteliais devido à doença. O tratamento com CTIPDh aparentemente recuperou a expressão de CD105. Enquanto uma ligeira redução na expressão de CD105 permaneceu no grupo não tratado até o final do estudo (FIGs. 19A-19D).

[00238] Dado que o microambiente medular e a angiogênese estão prejudicados em AA, levando à diminuição das células endoteliais e de seus progenitores, o aumento de células progenitoras endoteliais proliferativas positivas para Nestina e CD105 positivas é importante para a proteção dessas células e a melhora de angiogênese.

AÇÃO DE CTIPD EM NICHO HEMATOPOIÉTICO CD34, C-kit e Sca-1

[00239] Um dos benefícios das CTMs na hematopoiese é seu papel na secreção de vários fatores de crescimento e citocinas que suportam o crescimento e a diferenciação da linhagem hematopoiética. Diferentes estudos demonstram que as CTMs estimulam CTHs in vivo e in vitro.

[00240] As CTMs secretam um grande número de interleucinas que atuam diretamente na hematopoiese, como IL-6, IL-7, IL-8, IL-11, IL-14, IL-15, ligante Flt-3 e células-tronco fator. Porém, após a irradiação, ocorre uma redução significativa de CTHs e CTMs no canal medular, o que consequentemente afeta a produção de toda a linha de sangue. CTHs de camundongo expressam os marcadores de células-tronco hematopoiéticas, como Sca-1, C-kit e CD34.

Para verificar os mecanismos de ação dos CTIPDh em CTHs e seus progenitores, foram utilizados os anticorpos CD44, CD45, CD34, C-kit e Sca-1 em ensaios de quantificação de citometria de fluxo e imunoistoquímica e imunocitoquímica.

[00241] Apesar de ser um marcador importante dos CTHs, o C-kit também é um marcador de precursores, progenitores multipotentes e progenitores de linhagens comprometidas. O C-kit é expresso em vários tipos de células da MO e exerce um amplo espectro de ação.

Observamos uma diferença entre os grupos experimentais (tratados e não tratados com CTIPDh). A expressão do C-kit é ligeiramente maior no grupo não tratado em comparação com o grupo tratado com CTIPDh (FIGs. 20A-20D e 21A-21F). A radiação na dose de 6 Gy reduziu a população de células positivas para CD34 (26,15% de células positivas para CD34) em comparação com o controle (41,5% de células positivas para CD34) (FIGs. 22A-22D e 23A-23F).

[00242] Sca-1 mostrou desempenhar um papel importante na ativação e auto renovação de CTHs. Quando CTHs são estimulados, eles deixam seu estado quiescente e expressam Sca-1 para promover a auto renovação. Foi sugerido que a radiação causa um desequilíbrio homeostático do nicho medular e, consequentemente, promove um forte estímulo de Sca-1 para a auto renovação das CTHs restantes para compensar outras células MO comprometidas. Aqui, após a irradiação, um ligeiro aumento do Sca-1 foi observado (FIGs. 24A-24D e 25A-25F). No entanto, a radiação proporcionou estresse oxidativo contínuo, resultando em diminuição das CTHs até o final do estudo (D2). Isso pode explicar a diminuição da expressão de Sca-1 no grupo não tratado. No entanto, o grupo tratado com CTIPDh mantém o nível de expressão de Sca-1 semelhante ao controle (sem irradiação), sugerindo que As CTIPDh podem proteger CTHs contra irradiação, estimular a proliferação de CTH ou ambos.

[00243] Reduções de CD34 (26,15% de células positivas para CD34) e c-kit (38,5% de células positivas para c-kit) foram observadas após a irradiação em comparação com o normal (41,5% de células positivas para CD34 e 44,26% de c células-kit-positivas). No entanto, não houve redução significativa na porcentagem de células Sca- l-positivas 48 horas após a irradiação (14,1% de células Sca-l-positivas) em comparação com o controle (sem radiação) (12,6% de células Sca-l-positivas) ( FIGs. 20, 22 e 24).

[00244] Diferenças na expressão de marcadores hematopoiéticos foram observadas entre os grupos tratados com CTIPDh e não tratados. O grupo tratado com CTIPDh teve uma porcentagem maior de células imunopositivas para marcadores de HSCs e progenitores (11,3% Sca-l-positivo, 33,6% c-kit-positivo e 53,45% CD34-positivo) em comparação com o grupo não tratado (5,06% Sca-l-positivo, 28,9% c-kit- positivo e 45,35% CD34-positivo)(FIGs. 20, 22 e 24).

[00245] A recuperação parcial de CTHs e seus precursores em camundongos irradiados após o transplante de CTIPDh sugere que as CTIPDh têm um papel na estimulação da hematopoiese.

CD45

[00246] Após a exposição à radiação, os leucócitos são os mais afetados, tornando-os células representativas para confirmação de AA. O CD45, um marcador de superfície celular dos leucócitos, desempenha uma função importante nos leucócitos, principalmente na ativação dos linfócitos T. Aqui, uma diminuição na expressão de CD45 foi detectada após a irradiação (48 horas) (7,1% de células positivas para CD45) em comparação com o grupo de controle (23,11% de células positivas para CD45) (FIGs. 26A-D). Esses dados confirmaram a eficácia do modelo experimental utilizado neste estudo. Além disso, o tratamento com CTIPDh promoveu um aumento significativo na proporção de linfócitos CD45- positivos e seus progenitores (33,5% de células CD45- positivas), maior do que no grupo não tratado (14,8% de células CD45-positivas) (FIG. 26D). A imunocitofluorescência e a análise imunocitoquímica corroboraram ainda mais nossos achados. O aspirado de MO mostrou um maior número de células positivas para CD45 no grupo tratado em relação ao grupo não tratado (FIG. 27A- 27F).

CD44

[00247] CD44, uma molécula de adesão celular, é fundamental na manutenção de pools de precursores e migração de CTHs. CD44 é expresso em linfócitos, progenitores e CTM. Após a irradiação, houve redução significativa de células positivas para CD44 (P + 0,05) (média: 1,2% de células positivas para CD44) em relação ao grupo controle (46,26% de células positivas para CD44).

Assim, as células CD44-positivas são extremamente sensíveis aos danos da irradiação. Após o transplante de CTIPDh, houve uma recuperação significativa de células positivas para CD44 no grupo tratado com CTIPDh (P + 0,05) (51,9% de células positivas para CD44) e no grupo não tratado (média de 40,55% de células positivas para CD44) (FIGs. 28A-28D e 29A-29F). Finalmente, o aspirado medular também demonstrou uma maior porcentagem de células positivas para CD44 no grupo tratado com CTIPDh em comparação com o grupo não tratado (FIG. 28D).

[00248] A hematopoiese é um processo complexo. A hematopoiese depende de um conjunto de CTHs e células progenitoras para manter o estado quiescente e proteger contra agressões citotóxicas, como irradiação para produção adequada de células sanguíneas ao longo da vida (auto- renovação celular). Quiescência e auto-renovação são duas características importantes dos CTHs. Seguindo o estímulo, as CTHs se auto renovam para manter o pool celular em seu nicho ou se proliferam e se diferenciam em células progenitoras, eventualmente dando origem a células diferenciadas no sangue periférico. Nossos resultados sugerem fortemente que as CTIPDh podem fornecer estimulação para as células hematopoiéticas intrínsecas.

AÇÃO DA CTIPDh NO NICHO ESTROMAL CD90

[00249] CTMs estão naturalmente presentes no estroma medular e são importantes na reconstituição do microambiente medular por meio da secreção de vários fatores de crescimento e interleucinas, como IL-6, IL-7, IL-8, IL-11, IL-14, IL-15, ligante Flt-3 e fator de células-tronco. Estudos in vivo também demonstraram o potencial das CTMs na hematopoiese. O co-transplante de CTM com CTHs fornece vários benefícios para o transplante celular bem-sucedido para os pacientes, incluindo facilitar o enxerto e facilitar a recuperação da hematopoiese.

[00250] CTMs são células heterogêneas que expressam marcadores como CD44, C105 e CD90. Usamos anticorpos contra CD90 para determinar os efeitos da radiação em CTMs e benefícios terapêuticos adicionais do transplante de CTIPDh. CD90 é um marcador de superfície altamente expresso em CTMs e CTIPDh (CAPLAN et al., 2006; KERKIS et al., 2006). A citometria de fluxo demonstrou que a irradiação causou uma diminuição nas células positivas para CD90 (11,5%) em relação ao controle (18,4%). As células CD90- positivas estão ligeiramente aumentadas no grupo tratado com CTIPDh (29,9%) em comparação com o grupo não tratado

(26,42%) (Figura 30A-D). Os ensaios de imunocitofluorescência e imunocitoquímica corroboram os resultados da citometria de fluxo, detectando uma maior porcentagem de células positivas para CD90 no grupo tratado com CTIPDh (FIGs. 31A-31F). Esses resultados são consistentes com uma expressão aumentada de CD44 e CD105, que também são marcadores CTM.

Exemplo 8. CTIPDh migrando e homing na MO.

[00251] Embora as CTIPDh tenham sido administrados por via intraperitoneal, eles foram capazes de migrar e para casa em BM. Usando um anticorpo anti-núcleo humano; CTIPDh foram identificadas na MO murina (FIGs. 32A-32C).

Homing não foi observado no grupo não tratado (FIGs. 32D- 32F). É importante ressaltar que até o momento, não houve estudos para demonstrar que as CTMs podem migrar para MO em modelos de camundongo de AA ou síndrome de radiação aguda.

Também observamos o homing CTIPDh no baço do grupo tratado (FIGs. 33 A-33C), mas não no grupo não tratado (dados não mostrados).

Exemplo 9. Efeitos a longo prazo do transplante de CTIPDh em modelo animal AA.

[00252] Para investigar se a recuperação dos parâmetros sanguíneos promovidos pelo transplante de CTIPDh (D62) foi revertida, um acompanhamento de longo prazo (6 meses) foi realizado usando indexação hematimétrica,

citometria de fluxo e histologia convencional. Os dados foram comparados com a mesma análise nos animais sacrificados no D62.

[00253] Os índices hematimétricos (eritrócitos, hematócrito e leucócitos) avaliados dentro de 6 meses após o terceiro transplante (Pós-D62) não mostraram uma diferença significativa em comparação com D62 (FIGs. 34A- 34C). No entanto, uma ligeira diminuição nos parâmetros sanguíneos foi observada após 6 meses, que não foi estatisticamente significativa. No entanto, o resultado sugere que as células do sangue periférico apresentam uma tendência de preservar a recuperação da MO “arquivada” após o transplante de CTIPDh.

[00254] A histologia da MO do grupo experimental de longo prazo (6 meses) foi realizada, e o resultado mostrou que a celularidade de MO no grupo tratado com CTIPDh foi preservada (FIGs. 35A-35B). A MO do grupo não tratado demonstrou a persistência de uma hipocelularidade com substituição de gordura (FIGs. 35C-35D) em comparação com a MO no grupo tratado com CTIPDh, mostrando canal medular totalmente preenchido e de alta celularidade (FIGs. 35A- 35B). Esses dados suportam o potencial regenerativo de CTIPDh em AA.

[00255] A morte celular também foi analisada neste grupo de longo prazo. Os resultados revelaram que a exposição à irradiação ainda afeta a MO (após 5 meses), evidenciada pela maior expressão de p53 no grupo não tratado (FIG. 36A). Em contraste, a expressão de p53 foi significativamente menor no grupo tratado com CTIPDh.

Assim, as CTIPDh podem diminuir o efeito colateral da morte celular causada pela radiação mesmo após seis meses.

[00256] A expressão de biomarcadores também foi analisada no grupo de longo prazo (FIGs. 36B-36C, 37A-37C e 40A-40C). Em geral, a expressão de marcadores estromais e hematopoiéticos diminuiu ligeiramente ao longo do tempo (6 meses) em ambos os grupos experimentais. No entanto, nenhuma diferença significativa na expressão do marcador foi observada entre os grupos de curto e longo prazo. O transplante de CTIPDh parece apoiar a regeneração de células intrínsecas BM após a exposição à irradiação de 6 Gy.

Exemplo 10. Benefícios do transplante de CTIPDh nos efeitos colaterais da radioterapia

[00257] A radiação iônica afeta um organismo vivo inteiro. As reações agudas à radiação causam estresse oxidativo e inflamação que alteram o microambiente e danificam os tecidos normais. A perda de cabelo é um dos primeiros danos perceptíveis. Aqui, o grupo tratado com CTIPDh não apresentou queda de cabelo e vibrissas até o final do estudo (D62) (FIGs. 41A- 41B). Em contraste, o grupo não tratado apresentou perda significativa de cabelo e das vibrissas após a irradiação (FIGs. 41C-41D).

[00258] Estudos anteriores mostraram que a radiação de corpo inteiro na dose de 6 Gy causa danos na pele (cerca de 2%) e que o transplante de CTMs diretamente na área lesada regenera rapidamente a lesão induzida por radiação.

A queda de cabelo induzida por radiação é causada por defeitos irreversíveis na autorrenovação e/ou desenvolvimento de células-tronco de melanócitos foliculares nos folículos capilares. Nossos resultados demonstram a preservação dos pelos em animais, que receberam radiação iônica e transplante de CTIPDh. Isso não foi observado em animais que não receberam terapia de CTIPDh. Esses dados sugerem ainda os efeitos protetores das CTIPDh contra os danos da irradiação iônica. Em contraste com estudos anteriores, que demonstraram efeito local após aplicação tópica de CTM, a presente invenção fornece efeitos protetores generalizados com infusão de CTIPDh sistêmica.

Exemplo 11. Dosagem de citocinas do plasma sanguíneo por CBA - Cytometric Bead Array.

[00259] A dosagem de citocinas foi realizada a partir do plasma sanguíneo dos animais, previamente armazenado em freezer a -80 ° C. Um novo kit, o CBA murino (Th1/Th2/Th17) fornecido pela empresa BD, foi utilizado para realizar os níveis plasmáticos de citocinas: Interleucina-2 (IL-2), Interleucina-4 (IL4), Interleucina-6 (IL-6 ), Interferon-y (IFN-y), Fator de necrose tumoral alfa (TNF-alfa), Interleucina-17A (IL-17A). As amostras foram lidas pelo Citômetro de Fluxo BD Canto II do Laboratório de Imunoquímica do Instituto Butantan, e o resultado obtido foi analisado pelo software FCAP Array Software v3.0. Após a realização dos experimentos, os dois grupos foram comparados por meio de análise estatística de duas vias (ANOVA) com o software GraphPad Prism 5.0 (GRAPHPAD; PRISM, 2007). Consideraremos esses valores de P menores que 0,05 como significativos.

[00260] O fator de necrose tumoral (TNF) é uma citocina pleiotrópica conhecida por sua citotoxicidade tumoral, além de ser um potente mediador inflamatório e regulador das funções homeostáticas e da imunidade antimicrobiana. É produzida por linfócitos T ativados e macrófagos ativados. O TNF-alfa é uma citocina pró- inflamatória capaz de atuar na sua forma solúvel ou associada à membrana celular. A citocina TNF-alfa tem se mostrado um importante regulador da proliferação, sobrevivência, diferenciação e apoptose celular, por meio de dois receptores transmembrana, TNFR1 e TNFR2.

[00261] Os dados apresentados pelo gráfico (FIG. 42) sugerem que a maior participação da citocina TNF-alfa ocorre nas primeiras horas após a estimulação (D2), onde sua transcrição provoca a liberação de diversos fatores que promovem o quadro agudo inflamação no animal. Embora os níveis de TNF-alfa em animais não tratados tendam a diminuir ao longo do ensaio. Assim como apresentado no trabalho de DE AGUIAR et al., 2018, a terapia celular com CTIPDh promove a redução dos níveis de TNF-alfa em animais de forma mais eficiente e rápida em comparação com aqueles que não receberam tratamento. Dessa forma, pode-se sugerir que a terapia celular com CTIPDh promoveu a redução dos níveis séricos de TNF-alfa, promovendo a atenuação da inflamação e preservando a homeostase do animal.

[00262] A interleucina-4 é uma citocina multifuncional que participa da regulação do sistema imunológico em vários níveis. Conhecida como fator de crescimento e sobrevivência de linfócitos, a citocina IL-4 também atua como fator de diferenciação e estimulação dos linfócitos B. É produzida a partir da estimulação de receptores de células T CD4 + e CD8 +, além de basófilos e mastócitos. Foi demonstrado que a IL-4 tem um importante papel antinflamatório, atuando na sobrevivência leucocitária e na reparação tecidual, ativando a via “alternativa” dos macrófagos. Além disso, a IL-4 é capaz de induzir a inibição da citocina pró-inflamatória TNF-alfa por meio do fator de transcrição STAT6.

[00263] Os dados do gráfico (FIG. 43A) mostram que após a irradiação (D2) houve uma grande diminuição dos valores de IL-4 em relação a D0 devido ao aumento da inflamação causada pela radiação iônica. Durante as três terapias com CTIPDh (D17, D32 e D62) é possível observar que os níveis de IL-4 no grupo tratado com CTIPDh são mais elevados em relação ao grupo não tratado, que apresenta apenas uma diminuição constante da IL-4. No D62, o grupo que recebeu tratamento com CTIPDh apresentou um aumento significativo em comparação ao grupo sem tratamento.

[00264] Assim, é possível sugerir que o tratamento com CTIPDh pode ter promovido ação antiinflamatória, aumentando os níveis secretados de IL-4 nos animais que receberam o transplante de CTIPDh. Além disso, também é possível sugerir que o aumento da IL-4 pode ter levado à diminuição da citocina TNF-alfa, uma vez que esse resultado corrobora com o também encontrado no TNF-alfa. Isso sugere outro benefício da terapia celular com CTIPDh.

[00265] A interleucina-10 é uma citocina com fortes propriedades anti-inflamatórias, protegendo o corpo de danos de inflamação e restabelecendo a homeostase.

Produzida por uma variedade de células, a IL-10 pode ser secretada na fase aguda e/ou crônica da inflamação. A citocina IL-10 atua limitando as respostas das células do perfil Th1 e Th2, inibindo assim a secreção de citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias.

[00266] Os dados apresentados no gráfico mostram (FIG. 43B) que após a irradiação (D2) os níveis de IL-10 caíram acentuadamente em comparação com o período antes da irradiação (D0). No entanto, após a primeira terapia (D17), os níveis de IL-10 apenas no grupo que recebeu terapia celular com CTIPDh aumentou em relação a D2.

[00267] Ao longo do período de tratamento (D17, D32 e D62), o grupo tratado com CTIPDh teve o nível mais alto de IL-10 em comparação com o grupo não tratado. Um mês após a terceira terapia (D62), o nível de IL-10 no grupo que recebeu CTIPDh aumentou tanto que apresentou um aumento significativo (*) em relação ao grupo que não recebeu o tratamento, mesmo atingindo valor próximo a esse encontrado antes da irradiação (D0).

[00268] Como a IL-10 é uma citocina com potentes propriedades anti-inflamatórias, é possível sugerir que o tratamento de terapia celular com a CTIPDh pode ter estimulado a secreção de citocinas IL-10 e, consequentemente, modulado a inflamação e diminuído a secreção inflamatória de citocinas procarióticas.

[00269] A interleucina-17A é secretada predominantemente por células do perfil Th17, a citocina IL-17A é importante no desenvolvimento de doenças inflamatórias, sendo caracterizada, portanto, pró- inflamatória. A expressão de IL-17A está aumentada na doença autoimune. Os dados apresentados no gráfico (FIG.

44) mostram que após a irradiação (D2), os níveis de IL-17A foram reduzidos em relação a D0. Já após a primeira terapia com CTIPDh (D17), os níveis de IL-17A no grupo que não recebeu tratamento apresentaram aumento significativo em relação ao grupo tratado. Após a segunda terapia (D32), os níveis de IL-17A permaneceram mais baixos no grupo tratado com CTIPDh em comparação com o grupo não tratado. Por fim, no D62, o grupo tratado apresentou níveis estabilizados e baixos, enquanto o grupo que não recebeu tratamento novamente apresentou aumento significativo em relação ao tratamento.

[00270] Assim, é possível sugerir que a IL-17A apresentou resposta tardia, demonstrando assim um possível papel na inflamação crônica. Além disso, a terapia com células CTIPDh demonstrou estabilizar os níveis de IL-17A, evitando a progressão da inflamação nos animais tratados.

Enquanto a ausência do tratamento apenas promoveu a continuação do aumento da inflamação.

[00271] Os dados apresentados foram importantes, pois sugerem que a célula CTIPDh, um tipo de CTM que possui propriedades antiinflamatórias, pode assim promover a modulação da inflamação.

REFERÊNCIAS

[00272] 1. Caplan & Dennis, Mesenchymal Stem Cells as Trophic Mediators, 98 J. Cell Biochem. 5, 1076-84 (2006).

2. Hu et al., The Radiation Protection and Therapy Effects ofMesenchymal Stem Cells in Mice with Acute Radiation Injury, 83 Br. J. Radiol. 985, 52-8 (2010).

3. Ivanova et al., Dissecting Self-Renewal in Stem Cells with RNA Interference, 442 Nature 7102, 533-38 (2006).

4. Kerkis et al., Isolation and Characterization ofa Population oflmmature Dental Pulp Stem Cells expressing OCT-4 & Other Embryonic Stem Cell Markers, 184 Cells Tissues Organs. 3-4, 105-16 (2006).

5. Lizier et al., Scaling-Up of Dental Pulp Stem Cells Isolated from Multiple Niches, 7 PLoS ONE 6, e39885 (2012).

6. Sacchetti et al., No Identical “Mesenchymal Stem Cells” at Different Times and Sites: Human Committed Progenitors of Distinct Origin and Differentiation Potential Are Incorporated as Adventitial Cells in Microvessels, 6 Stem Cell Reports 6, 897-913 (2016).

7. Takahashi & Yamanaka, Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors, 126 Cell 4, 663-76 (2006).

8. Weiss & Wardrop, Schalm's Veterinary Hematology, WILEY-BLACKWELL (2011).

9. US Patent No. 9,790,468

10. PCT/US2013/047435

11. US8545833 B2

12. US20130273011 A1

13. WO2010033285 A2

14. WO2012127320 A1

15. WO2013012698 A1

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método de tratamento ou prevenção de insuficiência da medula óssea caracterizado pelo fato de que compreende a administração a um indivíduo de uma composição compreendendo uma população de células-tronco da polpa dentária imatura (CTIPDs) isoladas, em que as CTIPDs estão em uma quantidade suficiente para tratar ou prevenir a insuficiência da medula óssea no indivíduo.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as CTIPDs administradas são capazes de migrar para a medula óssea do indivíduo.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a falha da medula óssea é causada por uma exposição à radiação a uma dose de 1 a 30 Gy.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a composição é administrada entre 24 e 60 horas após a exposição à radiação.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que as CTIPDs estão em uma quantidade suficiente para aumentar os precursores de fibroblastos na medula óssea do indivíduo.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que as CTIPDs estão em uma quantidade suficiente para aumentar a contagem de eritrócitos (glóbulos vermelhos) na medula óssea do indivíduo.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que as CTIPDs estão em uma quantidade suficiente para aumentar o nível de hematócrito na medula óssea do indivíduo.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que as CTIPDs estão em uma quantidade suficiente para aumentar a contagem de leucócitos (glóbulos brancos) na medula óssea do indivíduo.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que as CTIPDs estão em uma quantidade suficiente para aumentar megacariócitos, células Sca-1-positivas, células Nestina- positivas, células fibronectina-positivas, células CD44- positivas ou uma combinação na medula óssea do indivíduo.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que as CTIPDs estão em uma quantidade suficiente para aumentar a celularidade da medula óssea no indivíduo.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que as CTIPDs estão em uma quantidade suficiente para aumentar a remodelação da matriz extracelular na medula óssea do indivíduo.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que as CTIPDs estão em uma quantidade suficiente para reduzir a apoptose de células da medula óssea no indivíduo.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que as CTIPDs estão em uma quantidade suficiente para reduzir os níveis séricos de TNF-α, IL-17A ou ambos no indivíduo.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que as CTIPDs estão em uma quantidade suficiente para aumentar os níveis séricos de IL-4, IL-10 ou ambos no indivíduo.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que as CTIPDs estão em uma quantidade suficiente para melhorar a recuperação hematopoiética por pelo menos 6 meses.

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a composição é administrada pelo menos duas vezes em um intervalo de entre 10 e 20 dias.

17. Composição para o tratamento de falência da medula óssea caracterizada pelo fato de que compreende uma população de células-tronco imaturas da polpa dentária (CTIPDs), preparada pela obtenção de uma polpa dentária

(PD); estabelecer uma cultura de explante colocando o PD em uma superfície de plástico em um meio de cultura e permitindo que as CTIPDs migrem para fora do PD; passagem das CTIPDs para expandir a cultura do explante; transferir mecanicamente o PD para uma superfície de plástico diferente no meio de cultura; e coletar as CTIPDs que aderem à superfície de plástico da cultura de explante, a população de CTIPDs que compreende CTIPDs, em que as CTIPDs são obtidas após cinco transferências e quatro ou cinco passagens.

18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou composição, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que pelo menos 80% das CTIPDs expressam CD117 (c-kit), Fibronectina ou ambos.

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou composição, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que 96% a 99% das CTIPDs são células CD105-positivas.

20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou composição, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que 96% a 99% das CTIPDs são células CD73-positivas.

21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou composição, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que 96% a 99% das CTIPDs são células CD90-positivas.

22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou composição, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que 96% a 99% das CTIPDs são células CD44-positivas.

23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou composição, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que 96% a 99% das CTIPDs são células positivas para CD117.

24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou composição, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que 96% a 99% das CTIPDs são células Nestina-positivas.

25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou composição, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que 96% a 99% das CTIPDs são células positivas para Vimentina.

26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou composição, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que 96% a 99% das CTIPDs são células positivas para Fibronectina.

27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou composição, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que 96% a 99%

das CTIPDs são células CD45-, CD34- e/ou HLA DR-negativas.

28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou composição, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a composição compreende ainda células-tronco da medula óssea, células-tronco hematopoiéticas ou ambas.

29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou composição, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é humano e as CTIPDs são alogênicas.

30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou composição, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a composição compreende 5x10 6-1x109 CTIPDs.