JP2020141704A - Ｈｂ９調節物を用いたヒト胚性幹細胞の膵臓内分泌細胞への分化 - Google Patents

Ｈｂ９調節物を用いたヒト胚性幹細胞の膵臓内分泌細胞への分化 Download PDF

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Abstract

【課題】ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１及びＨＢ９を発現している膵臓内胚葉細胞への多能性幹細胞の分化を促進する方法の提供。【解決手段】多能性幹細胞から膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を製造する方法であって、ａ．多能性幹細胞を培養することと、ｂ．多能性幹細胞を、前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させることと、ｃ．トリヨードチロニン、チロキシン、トリヨードチロニンの類似体、チロキシンの類似体及びその混合物から選択される甲状腺ホルモン、又はＡＬＫ５阻害剤、又は甲状腺ホルモンとＡＬＫ５阻害剤両方を補充した培地での処理によって、前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させることと、の段階を含む方法。【選択図】なし

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、その全てが参照により組み込まれている、米国特許仮出願第６１／７４７，
６７２号明細書（２０１２年１２月３１日出願）に基づく優先権を主張する。
（発明の分野）
本発明は、細胞分化の分野にある。より詳細には、本発明は、膵臓内胚葉及び内分泌細
胞中のＨＢ９の調節物として、特定の甲状腺ホルモン又はその類似体、及びＡＬＫ５阻害
剤の利用を含む。
Ｉ型糖尿病に対する細胞置換療法における進展、及び移植可能ランゲルハンス島の欠乏
が、生着に対して適切なインスリン産出細胞、又はβ細胞の供給源を開発することに集中
した興味を持つ。１つのアプローチは、胚性幹細胞のような、多能性幹細胞からの、機能
的β細胞の製造である。
脊椎動物の胚発生において、多能性細胞は、原腸形成として公知のプロセスにて、３つ
の胚葉（外胚葉、中胚葉、及び内胚葉）を含む細胞のグループを生じる。例えば、甲状腺
、胸腺、膵臓、腸、及び肝臓などの組織は、内胚葉から中間ステージを経て発達する。こ
のプロセスにおける中間ステージは、胚体内胚葉の形成である。
原腸形成の終了までに、内胚葉は、内胚葉の前部、中間、及び後部の領域を特異的にマ
ークする因子のパネルの発現によって認識することができる前部−後部ドメインに分割さ
れる。例えば、ＣＤＸ１、２及び４が、内胚葉の後部領域を同定する一方で、ＨＨＥＸ及
びＳＯＸ２は、前部領域を同定する。
内胚葉組織の移行は、内胚葉を腸管の領域化に役立つ異なった中胚葉組織に近接させる
。これは、ＦＧＦｓ、ＷＮＴＳ、ＴＧＦ−β、レチノイン酸（ＲＡ）及びＢＭＰリガンド
及びそれらのアンタゴニストのような、分泌因子の多血症によって達成される。例えば、
ＦＧＦ４及びＢＭＰは推定後腸内胚葉においてＣＤＸ２の発現を促進し、前方の遺伝子Ｈ
ＨＥＸ及びＳＯＸ２の発現を阻害する（２０００ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２７：１
５６３〜１５６７）。ＷＮＴシグナル伝達はまた、後腸の発達を促進し、前腸の運命を阻
害するために、ＦＧＦシグナル伝達と平行して作用することが示されている（２００７
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３４：２２０７〜２２１７）。最後に、間葉による分泌レチ
ノイン酸が、前腸−後腸境界を制御する（２００２ Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ，１２：１２１
５〜１２２０）。
特異的転写因子の発現レベルは、組織の同一性を指定するために使用できる可能性があ
る。原腸管への胚体内胚葉の形質転換中に、腸管は、制限された遺伝子発現パターンによ
り分子レベルで観察することができる広いドメインに領域化される。腸管中の領域化され
た膵臓ドメインが、ＰＤＸ１の非常に高い発現と、ＣＤＸ２及びＳＯＸ２の非常に低い発
現を示す。ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＰＴＦ１Ａ及びＮＫＸ２．２が、膵臓組織中で高く
発現し、ＣＤＸ２の発現が、腸組織にて高い。
膵臓の形成は、胚体内胚葉の膵臓内胚葉への分化により起こる。背側と腹側の膵臓ドメ
インは、前腸上皮から生じる。前腸はまた、食道、気管、肺、甲状腺、胃、肝臓及び胆管
系に対して上昇を与える。
膵臓内胚葉の細胞は膵臓−十二指腸ホメオボックス遺伝子ＰＤＸ１を発現する。ＰＤＸ
１が存在しない場合、膵臓は、腹側芽及び背側芽の形成を越えて発達しない。したがって
、ＰＤＸ１の発現は、膵臓器官形成において重要な工程を印している。成熟膵臓は、膵臓
内胚葉の分化より発生する、外分泌及び内分泌組織両方を含む。
Ｄ'Ａｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．は、高濃度のアクチビン及び低血清の存在下、ヒト胚性
幹細胞由来胚体内胚葉の濃縮培養の製造を記述している（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ ２００５，２３：１５３４〜１５４１；米国特許第７，７０４，７３８号
明細書）。マウスの腎臓カプセルの元でこれらの細胞を移植することは、内皮性組織の特
徴を有するより成熟した細胞への分化となることが報告された（米国特許第７，７０４，
７３８号明細書）ヒト胚性幹細胞由来胚体内胚葉細胞はさらに、ＦＧＦ１０及びレチノイ
ン酸の添加後、ＰＤＸ１陽性細胞へ分化可能である（米国特許第２００５／０２６６５５
４号明細書）。免疫欠損マウスにおける脂肪パッド中の、これらの膵臓前駆細胞の続く移
植が、３〜４ヶ月の成熟化期間に続く、機能的膵臓内分泌細胞の形成となった（米国特許
第７，９９３，９２０号明細書及び同第７，５３４，６０８号明細書）。
Ｆｉｓｋからは、ヒト胚性幹細胞からの膵島細胞の産生のための系を報告している（米
国特許第７，０３３，８３１号明細書）。この場合、分化経路は３つの段階に分割された
。ヒト胚性幹細胞は、最初に、酪酸ナトリウムとアクチビンＡとの組み合わせを用いて内
胚葉に分化された（米国特許第７，３２６，５７２号明細書）。次に細胞をＮｏｇｇｉｎ
などのＢＭＰアンタゴニストと共に、ＥＧＦ又はベータセルリンと組み合わせて培養して
、ＰＤＸ１陽性細胞を生成する。最終分化は、ニコチンアミドにより誘発された。
低分子阻害剤もまた、膵臓内分泌前駆細胞の誘導のために使用されている。例えば、Ｔ
ＧＦ−β受容体及びＢＭＰ受容体の低分子阻害剤（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２０１１、
１３８：８６１〜８７１、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ２０１１、６０：２３９〜２４７）は、膵
臓内分泌細胞の数を有意に増強するために使用されてきた。加えて、低分子活性化剤もま
た、胚体内胚葉細胞又は膵臓前駆細胞を生成するために使用されている（Ｃｕｒｒ Ｏｐ
ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００９、２１：７２７〜７３２；Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍ
Ｂｉｏｌ ２００９，５：２５８〜２６５）。
（またＨＩＸＢ９及びＮＭＸ１として知られる）ＨＢ９は、およそ胚性日８にて開始す
る膵臓発生において、早期に発現したＢＨＬＨ転写活性化因子タンパク質である。ＨＢ９
はまた、ノトコード及び脊髄にて発現する。ＨＢ９の発現は、一過性であり、ＰＤＸ１及
びＮＫＸ６．１発現細胞にて発現している膵臓上皮にて、約１０．５日でピークとなる。
約１２．５日にて、ＨＢ９発現は減少し、後期ステージで、β細胞にのみ制限されるよう
になる。ＨＩＸＢ９の無変異に対するマウスホモ接合体において、膵臓の背葉が、発生を
失敗する（Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２３：６７〜７０、１９９９；Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２
３：７１〜７５：１９９９）。ＨＢ９−／−β細胞は、低レベルのグルコーストランスポ
ーター、ＧＬＵＴ２及びＮＫＸ６．１を発現する。さらに、ＨＢ９−／−膵臓は、インス
リン陽性細胞の数において、有意な減少を示すが、一方で、他の膵臓ホルモンの発現に有
意に影響を与えない。したがって、ＨＢ９の時間制御が、正常β細胞発生及び機能に必須
である。β細胞中でＨＢ９発現を制御している因子について、よくわかっていないけれど
も、ゼブラフィッシュにおける最近の研究は、レチノイン酸が、ＨＢ９の発現を正に制御
することを示唆している（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３８、４５９６〜４６０８、２０
１１）。
甲状腺ホルモン、チロキシン（「Ｔ４」）とトリオドチロニン（「Ｔ３］）は、甲状腺
によって産出されるチロシンに基づくホルモンであり、主として代謝の制御に応答性であ
る。血中の甲状腺ホルモンの主要な形態は、Ｔ４であり、Ｔ３より長い半減期を有する。
血中に放出されたＴ３に対するＴ４の比は、およそ２０対１である。Ｔ４は、脱ヨウ要素
酵素によって、細胞内で、より活性なＴ３（Ｔ４に比べて、３〜４倍強力である）に変換
される。
Ｔ３は、甲状腺ホルモン受容体、ＴＲα１及びＴＲβ１（ＴＲ）に結合する。ＴＲは、
核ホルモン受容体であり、レチノイドＸ受容体にヘテロ二量体化する。二量体が、リガン
ドが存在しない状態で、甲状腺応答要素（ＴＲＥｓ）に結合し、転写抑制剤として働く。
Ｔ３のＴＲへの結合が、ＴＲＥ依存遺伝子の抑圧を減少させ、種々の標的遺伝子の発現を
誘導する。多数の研究が、β細胞増殖の増加、アポトーシスの減少及びインスリン分泌の
改善におけるＴ３の役割を示した一方で、細胞分化におけるその役割は未定義である。
トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）は、増殖制御、分化、遊走、細胞生
存、線維化及び発生運命の特性化を含む、多くの生物学的工程に関与する多面発現生サイ
トカインの大きなファミリーのメンバーである。ＴＧＦ−βスーパーファミリ−メンバー
は、ＩＩ型及びＩ型受容体を含む、受容体複合体を通してシグナル伝達する。（アクチビ
ン及びＧＤＦｓ（増殖分化因子）のような）ＴＧＦ−Ｂリガンドが、Ｉ型受容体と共に、
ＩＩ型受容体を有する。ＩＩ型受容体は、複合体中のＩ型受容体をリン酸化及び活性化す
る。５つの哺乳類ＩＩ型受容体、ＴβＲ−ＩＩ、ＡｃｔＲ−ＩＩ、ＡｃｔＲ−ＩＩＢ、Ｂ
ＭＰＲ−ＩＩ及びＡＭＨＲ−ＩＩと、７つのＩ型受容体（ＡＬＫｓ １〜７）がある。ア
クチビンと関連リガンドは、ＡｃｔＲ−ＩＩ又はＡｃｔＡＲ−ＩＩＢ、及びＡＬＫ４及び
ＡＬＫ５の組合せを介してシグナル伝達し、ＢＭＰは、ＡｃｔＲ−ＩＩ、ＡｃｔＲ−ＩＩ
Ｂ又はＢＭＰＲ−ＩＩとのＡＬＫ２、ＡＬＫ３及びＡＬＫ６の組合せを通してシグナル伝
達する。ＡＭＨはＡＬＫ６とのＡＭＨＲ−ＩＩの複合体を通してシグナル伝達し、結節性
は、ＡｃｔＲ−ＩＩＢとＡＬＫ７の複合体を通してシグナル伝達することが最近示された
（Ｃｅｌｌ．２００３，１１３（６）：６８５〜７００）。適切な受容体へのＴＧＦ−Ｂ
リガンドの結合に続いて、次のシグナルが、主に、Ｓｍａｄｓの複合体の活性化を通して
、核に形質導入される。活性化に際して、Ｉ型受容体が、Ｓｍａｄの受容体制御ファミリ
ーのメンバーをリン酸化する。これは、それらを活性化し、それらが、共通の媒体Ｓｍａ
ｄであるＳｍａｄ４との複合体を形成することを可能にする。Ｓｍａｄｓ １、５及び８
は、ＡＬＫｓ １、２、３及び６に対する基質であり、一方で、Ｓｍａｄｓ ２及び３は
、ＡＬＫｓ ４、５及び７に対する基質である（ＦＡＳＥＢ Ｊ、１３，２０１５〜２１
２４）。活性化Ｓｍａｄ複合体は、核内に集積し、一方でこれらは、標的遺伝子の転写、
とりわけ、他の特定のＤＮＡ−結合転写因子にて、直接関与される。ＴＧＦ−βに対する
受容体を選択的に阻害する化合物が、治療適用のため、及び種々の幹細胞集団からの再プ
ログラミング及び分化の文脈において、細胞運命を調節するために、開発されてきた。と
りわけ、ＡＬＫ５阻害剤が、内分泌運命への胚性幹細胞の直接分化のために、先に使用さ
れてきた（Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２０１１，６０（１）：２３９〜４７）。
一般に、前駆細胞を、機能的β細胞に分化する工程は、種々のステージを通して進む。
また、コミットメントのステージを通して進行して、インビトロにてヒト胚性幹細胞（「
ｈＥＳ」）をβ−細胞に似た細胞へ指向することはチャレンジングであり、ｈＥＳからの
機能的β−細胞の製造は、直接的な工程ではない。前駆細胞を分化させる工程における各
段階は、固有のチャレンジを提示する。工程が、ヒト多能性幹細胞のような前駆細胞から
膵臓細胞を製造するためのプロトコールを改善することにおいて実施されるけれども、機
能的内分泌細胞、とりわけβ細胞をもたらすプロトコールを製造する必要性がまだ存在す
る。
Ａ〜Ｃは、実施例１にて概要を示したような、膵臓内胚葉／内分泌前駆体に分化したヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の、以下の遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写している。ＰＤＸ１（図１Ａ）；ＮＫＸ６．１（図１Ｂ）；及びＨＢ９（図１Ｃ）。 Ａ〜Ｃは、実施例１にて概要を示したような、膵臓内胚葉／内分泌前駆体に分化したヒト胚性幹細胞株Ｈ１のＦＡＣＳ解析の結果を示す。ＰＤＸ１（図２Ａ）、ＮＫＸ６．１（図２Ｂ）及びＨＢ９（図２Ｃ）。 Ａ及びＢは、ＮＸＫ６．１、インスリン又はＨＢ９に対して免疫染色した細胞のイメージを示す。細胞を、実施例１にて概要を示したような、膵臓内胚葉／内分泌前駆体に分化させた。図３Ａは、ＮＫＸ６．１（左手パネル）及びインスリン（右手パネル）に対する免疫染色を示す。図３Ｂは、ＨＢ９（左手パネル）とインスリン（右手パネル）に対する免疫染色を示す。 Ａ、Ｂ、及びＣは、実施例２にて概要を示したように、ステージ４〜６に分化した胚性幹細胞Ｈ１の、ステージ４、３日目（パネルＡ）、ステージ５、４日目（パネルＢ）及びステージ６、３日目（パネルＣ）における、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１及びＨＢ９のパーセント発現に対するＦＡＣＳデータを描写する。 実施例２にて概要を示したように分化した細胞に対して、ステージ２〜６でのヒト膵島と比較した、ＨＢ９のｍＲＮＡ発現を示す。 実施例２にて概要を示したように分化し、ＮＸＫ６．１（左手パネル）及びＨＢ９（右手パネル）に対して免疫染色した、ステージ４、３日目細胞のイメージを描写している。 Ａ〜Ｊは、実施例２にて概要を示したように、ステージ４に分化し、次いで、ステージ４のみ、ステージ４〜ステージ５、又はステージ４〜ステージ６で処理した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の、以下の遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ解析からのデータを示す。図６Ａ〜６Ｊは、以下に対するデータを示す。ＮＫＸ６．１（図６Ａ）、ＰＤＸ１（図６Ｂ）、ＮＫＸ２．２（図６Ｃ）、グルカゴン（図６Ｄ）、インスリン（図６Ｅ）、ソマトスタチン（図６Ｆ）、ＣＤＸ２（図６Ｇ）、アルブミン（図６Ｈ）、ガストリン（図６Ｉ）及びＳＯＸ２（図６Ｊ）。 Ａ及びＢは、対照（図７Ａ）、及び実施例２にて概要を示すように処理した培養液（図７Ｂ）の免疫染色の結果を示す。対照（図７Ａ）とステージ６にて処理した培養液（図（７Ｂ）は、ステージ６での対照（図６Ａ）と比較して、Ｔ３処理群（図７Ｂ）中のＨＢ９陽性細胞の数の有意な増加を明らかにした。 Ａ及びＢは、実施例３にて概要を示したように、ステージ６にて分化させた細胞に対する、ステージ６、７日目でのＮＫＸ６．１及びＨＢ９に対する免疫染色を描写する。Ｃは、実施例３にて概要を示したように、ステージ６まで分化させた、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞中の、ＨＢ９の発現のリアルタイムＰＣＲからのデータを描写する。 Ａ及びＢは、実施例３にて概要を示したように、ステージ６まで分化させた、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞中のＨＢ９の、それぞれステージ６、５日目と１５日目での、ＦＡＣＳデータを描写する。 Ａ〜Ｅは、実施例４にて概要を示したプロトコールにしたがって分化した細胞に対する、ステージ６、６日目でのＮＫＸ６．１とＨＢ９に対する免疫染色を描写する。用量依存様式にて、Ｔ３が、ＮＫＸ６．１陽性膵臓内胚葉前駆細胞中のＨＢ９陽性細胞の数を有意に増強する。 Ａ〜Ｌは、実施例４にて概要を示したように、ステージ６まで分化したヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞中の、以下の遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＳＯＸ２（図１１Ａ）、ｍＮＫＸ６．１（図１１Ｂ）、ＮＫＸ２．２（図１１Ｃ）、ガストリン（図１１Ｄ）、ＰＤＸ１（図１１Ｅ）、ＮＧＮ３（図１１Ｆ）、ＰＡＸ６（図１１Ｇ）、ＰＡＸ４（図１１Ｈ）、インスリン（図１１Ｉ）、グルカゴン（図１１Ｊ）、グレリン（図１１Ｋ）及びソマトスタチン（図１１Ｌ）。
本発明の以下の詳細な記述は、付随する図面と一緒に読む場合に、よりよく理解される
であろう。図面は、本発明の特定の実施形態を図示する目的のために提供される。しかし
ながら、本発明は、示した精密な配置、例及び道具に制限はされない。開示を明確にする
ために、そして制限の方法ではなく、本発明の詳細な記述は、本発明の特定の特徴、実施
形態又は適用を記述、又は例示する副項目に分けられる。
本発明は、特定の培養順序において、特定の甲状腺ホルモン又はその類似体、ＡＬＫ５
（ＴＧＦ−βＩ型受容体キナーゼ）阻害剤の利用を介して、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１及び
ＨＢ９に対して陽性の膵臓内胚葉細胞の発生に関する。したがって、本発明は、ＮＫＸ６
．１、ＰＤＸ１及びＨＢ９を発現するβ細胞系統に特徴的なマーカーを発現している細胞
に、多能性幹細胞から誘導した細胞を分化させるための、インビトロ細胞培養液を提供す
る。本発明はさらに、インビトロ細胞培養液を介したそのような細胞を得るための方法を
提供する。特定の実施形態において、本発明は、Ｔ３、Ｔ４又はその類似体の封入が、β
細胞への分化を促進するために、分化している細胞内でのＨＢ９タンパク質発現の誘発因
子として働くことの発見に基づく。ＨＢ９は、ステージ３又はステージ４でのタンパク質
レベルで発現されない。したがって、本発明は、ＨＢ９タンパク質発現を制御することに
よって、幹細胞を分化する方法を提供する。特に、本発明は、特定の培養順序にて、Ｔ３
又はＴ４、又はその類似体、及びＡＬＫ５阻害剤の利用を介した、ＨＫＸ６．１、ＰＤＸ
１及びＨＢ９に対して陽性の膵臓内胚葉細胞の発生に対して提供する。
定義
幹細胞は、単一細胞レベルでの自己再生能及び分化能の両方によって定義される未分化
細胞である。幹細胞は、自己再生前駆細胞、非再生性前駆細胞、及び最終分化細胞を含む
子孫細胞を生成することができる。幹細胞はまた、インビトロでの、複数の胚葉（内胚葉
、中胚葉及び外胚葉）から種々の細胞系統の機能細胞へ分化させるそれらの能力によって
特徴付けられる。幹細胞は、移植後に複数の胚葉の組織を生じさせ、線維芽細胞に注入後
、実質的に（全てではないとしても）ほとんどの組織に寄与する。
幹細胞は、それらの発生上の潜在能力によって分類される。多能性幹細胞は、全ての胚
性細胞型を形成することが可能である。
分化は、未特定化（未確定）又はほとんど特定されていない細胞が、例えば神経細胞又
は筋肉細胞のような、特定化した細胞の特徴を獲得する工程である。分化した細胞は、細
胞の系統の範囲内で、より特殊化した（「確定した」）位置を呈している細胞である。分
化プロセスに適用した際の用語「確定した」は、通常の環境下で特定の細胞型又は細胞型
の小集合に分化し続ける分化経路の地点に進行しており、通常の環境下で異なる細胞型に
分化し、又はより分化されていない細胞型に戻ることができない細胞を指す。「脱分化」
とは、細胞が細胞の系統内においてより特殊化（又は確定）していない位置へと戻る工程
のことを指す。本明細書で使用するように、細胞の系統は、細胞の遺伝性を定義し、すな
わち、どの細胞がくるのか、及び何の細胞が形成されるのか、を定義する。ある細胞の系
統とは、所定の発生及び分化の遺伝体系内にその細胞を位置付けるものである。系統特異
的マーカーとは、対象とする系統の細胞の表現型と特異的に関連した特徴を指し、分化決
定されていない細胞の、対象とする系統への分化を評価するために使用することができる
。
本明細書で使用するところの「マーカー」は、対象の細胞中で差異的に発現する核酸又
はポリペプチド分子である。この文脈において、差異的な発現とは、未分化細胞と比較し
て、陽性マーカーのレベルの増加、及び陰性マーカーのレベルの減少を意味する。マーカ
ー核酸又はポリペプチドの検出可能なレベルは、他の細胞と比較して対象とする細胞にお
いて充分に高いか又は低いことから、当該技術分野において知られる各種の方法のいずれ
を用いても対象とする細胞を他の細胞から識別及び区別することが可能である。
本明細書で使用するように、細胞は、特定のマーカーが、細胞内で十分検出される時に
、特定のマーカー「に対して陽性」であるか、「陽性」である。同様に、細胞は、特定の
マーカーが、細胞内で十分検出されない時に、特定のマーカー「に対して陰性」であるか
、「陰性」である。特に、ＦＡＣＳによる陽性は、通常２％より多く、一方でＦＡＣＳに
よる陰性閾値は通常１％未満である。ＰＣＲによる陽性は通常、３４サイクル（Ｃｔｓ）
未満であり、一方で、ＰＣＲによる陰性は、通常３４．５サイクルより大きい。
静的インビトロ細胞培養中の多能性幹細胞の、機能性膵臓内分泌細胞への分化を複製す
る試みにおいて、分化工程はしばしば、いくつかの連続ステージを通して処理することと
して見られる。特に、分化工程は、６ステージを通して処理することとして一般に見られ
る。本段階的処理において、「ステージ１」は、分化工程における第一段階を意味し、多
能性幹細胞の、胚体内胚葉細胞に特徴的マーカーを発現している細胞（本明細書以下ある
いは、「ステージ１細胞」と呼ぶ）への分化を意味する。「ステージ２」は、第二段階、
胚体内胚葉細胞に特徴的マーカーを発現している細胞の、腸管細胞に特徴的マーカーを発
現している細胞（本明細書以下あるいは、「ステージ２細胞」と呼ぶ）への分化を指す。
「ステージ３」は、第三段階、腸管細胞に特徴的マーカーを発現している細胞の、前腸内
胚葉細胞に特徴的マーカーを発現している細胞（本明細書以下あるいは、「ステージ３細
胞」と呼ぶ）への分化を指す。「ステージ４」は、第四段階、前腸内胚葉細胞に特徴的マ
ーカーを発現している細胞を、膵臓前腸前駆細胞に特徴的マーカーを発現している細胞（
本明細書以下あるいは、「ステージ４細胞」と呼ぶ）への分化を指す。「ステージ５」は
、第五段階、膵臓前腸前駆細胞の特徴的マーカーを発現している細胞の、膵臓内肺葉細胞
及び／又は膵臓内分泌前駆細胞の特徴的マーカーを発現している細胞（本明細書以下、合
わせて「膵臓内肺葉／内分泌前駆細胞」又あるいは、「ステージ５細胞」と呼ぶ）への分
化を指す。「ステージ６」は、膵臓内胚葉／内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現し
ている細胞の、膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞への分化を指す（
本明細書以下、あるいは、「ステージ６細胞」と呼ぶ。
しかしながら、特定の集団中の全ての細胞が、同一の速度で、これらのステージを通し
て進むわけではないことが留意されるべきである。結果として、とりわけ後期分化ステー
ジにて、集団に存在する主要な細胞よりも、少なく、又は多く、分化経路を下って進んだ
細胞の存在を検出することは、インビトロ細胞培養において、一般的ではない。例えば、
ステージ５での細胞培養の間、膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーの発現が見られること
は一般的ではない。本発明を例示する目的のために、以上で同定したステージに関連した
種々の細胞型の特徴を本明細書で記述する。
本明細書で使用するところの「胚体内胚葉細胞」は、原腸形成の間に外胚葉から発生す
る細胞の特徴を有し、胃腸管及びその誘導体を形成する細胞を指す。胚体内胚葉細胞は、
少なくとも１つの以下のマーカーを発現する。ＦＯＸＡ２（又は、肝細胞核因子３−β（
「ＨＮＦ３β」）としても知られている）、ＧＡＴＡ４、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、Ｂｒ
ａｃｈｙｕｒｙ、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、ＯＴＸ２、グーセコイド、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９及
びＭＩＸＬ１。胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーには、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２及びＳ
ＯＸ１７が含まれる。したがって、胚体内胚葉細胞は、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２及びＳＯ
Ｘ１７のそれらの発現によって特徴付けられて良い。さらに、時間の長さに依存して、細
胞が、ステージ１に留まることが許容され、ＨＮＦ−４αの増加が観察されうる。
本明細書で使用するところの「腸管細胞」は、肺、肝臓、膵臓、胃及び腸のような全て
の内胚葉性器官を形成可能な、胚体内胚葉から由来する細胞を指す。腸管細胞は、胚体内
胚葉細胞によって発現したものよりも、実質的に増加したＨＮＦ４αの発現によって特徴
付けられて良い。例えば、ＨＮＦ４αのｍＲＮＡ発現における１０〜４０倍増加が、ステ
ージ２の間観察されうる。
本明細書で使用するところの「前腸内胚葉細胞」は、食道、肺、胃、肝臓、膵臓、胆嚢
及び十二指腸の一部を形成する内胚葉細胞を指す。前腸内胚葉細胞は、少なくとも１つの
以下のマーカーを発現する。ＰＤＸ１、ＦＯＸＡ２、ＣＤＸ２、ＳＯＸ２及びＨＮＦ４α
。前腸内胚葉細胞は、腸管細胞と比較して、ＰＤＸ１の発現における増加によって特徴付
けられて良い。例えば、ステージ３培養にて５０パーセントより多くの細胞が、ＰＤＸ１
を典型的に発現している。
本明細書で使用するところの「膵臓前腸前駆細胞」は、以下のマーカー、ＰＤＸ１、Ｎ
ＫＸ６．１、ＨＮＦ６、ＮＧＮ３、ＳＯＸ９、ＰＡＸ４、ＰＡＸ６、ＩＳＬ１、ガストリ
ン、ＦＯＸＡ２、ＰＴＦ１ａ、ＰＲＯＸ１及びＨＮＦ４αの少なくとも１つを発現する細
胞を指す。膵臓前腸前駆細胞は、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１及びＳＯＸ９の発現に対して陽
性であることによって特徴付けられて良い。
本明細書で使用するところの「膵臓内胚葉細胞」は、以下のマーカーの少なくとも１つ
を発現する細胞を指す。ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＨＮＦ１β、ＰＴＦ１α、ＨＮＦ６、
ＨＮＦ４α、ＳＯＸ９、ＮＧＮ３、ガストリン、ＨＢ９又はＰＲＯＸ１。膵臓内胚葉細胞
は、ＣＤＸ２又はＳＯＸ２の実質的発現の欠如によって特徴付けられて良い。
本明細書で使用するところの「膵臓内分泌前駆細胞」は、膵臓ホルモン発現細胞になる
ことが可能な膵臓内胚葉細胞を意味する。膵臓内分泌前駆細胞は、以下のマーカー、ＮＧ
Ｎ３、ＮＫＸ２．２、ＮｅｕｒｏＤ１、ＩＳＬ１、ＰＡＸ４、ＰＡＸ６又はＡＲＸの少な
くとも１つを発現する。膵臓内分泌前駆細胞は、ＮＫＸ２．２及びＮｅｕｒｏＤ１の発現
によって特徴付けられてよい。
本明細書で使用するところの「膵臓内分泌細胞」は、以下のホルモン、インスリン、グ
ルカゴン、ソマトスタチン、グレリン及び膵臓ポリペプチドの少なくとも１つを発現可能
な細胞を指す。これらのホルモンに加えて、膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーとしては
、１つ又は２つ以上の、ＮＧＮ３、ＮｅｕｒｏＤ１、ＩＳＬ１、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１
、ＰＡＸ４、ＡＲＸ、ＮＫＸ２．２及びＰＡＸ６が挙げられる。β細胞に特徴的なマーカ
ーを発現している膵臓内分泌細胞は、インスリンと、以下の転写因子、ＰＤＸ１、ＮＫＸ
２．２、ＮＫＸ６．１、ＮｅｕｒｏＤ１、ＩＳＬ１、ＨＮＦ３β、ＭＡＦＡ及びＰＡＸ６
の少なくとも１つの発現によって特徴付けることができる。
「ｄ１」、「１ｄ」及び「１日目」、「ｄ２」、「２ｄ」及び「２日目」は、本明細書
で互換的に使用される。これらの数字の組み合わせは、本願の段階的分化プロトコール中
の異なるステージにおけるインキュベーションの特定の日を指す。
「グルコース」は、デキストロース、天然に一般に見られる糖を指すために本明細書で
使用される。
「ＮｅｕｒｏＤ１」は、膵臓内分泌前駆細胞において発現するタンパク質と、それをコ
ードしている遺伝子を同定するために本明細書で使用される。
「ＬＤＮ−１９３１８９」は、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍ
Ａ，ＵＳＡから、商標ＳＴＥＭＯＬＥＣＵＬＥ（商標）のもと利用可能な、（塩酸（６−
（４−（２−ピペリジン−１−イル）エトキシ）フェニル）−３−（ピリジン−４−イル
）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン；ＤＭ−３１８９）ＢＭＰ受容体阻害剤を指す。
多能性幹細胞の特徴付け、供給源、増殖及び培養
Ａ．多能性幹細胞の特徴付け
多能性幹細胞は、１つ又は２つ以上の、ステージ特異的胚性抗原（ＳＳＥＡ）３及び４
と、Ｔｒａ−１−６０及びＴｒａ−１−８１抗体（Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．１９９
８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５〜１１４７）を用いて検出可能なマーカーを発現
してよい。インビトロでの多能性幹細胞の分化は、Ｔｒａ−１−６０及びＴｒａ−１−８
１発現の欠損をもたらす。未分化多能性幹細胞は典型的に、アルカリホスファターゼ活性
を有し、これは、４％パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、次いで製造業者（Ｖｅｃｔ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）によって記述されたように、基質とし
てＶＥＣＴＯＲ（（登録商標））Ｒｅｄで発色させることによって検出可能である。未分
化の多能性幹細胞はまた、ＲＴ−ＰＣＲにより検出されるように、一般にＯＣＴ４及びＴ
ＥＲＴも発現する。
増殖した多能性幹細胞の他の望ましい表現型は、全ての３つの胚性層、内胚葉、中胚葉
及び外胚葉組織の細胞へ分化する潜在力である。幹細胞の多能性は、例えば、細胞を、種
々の組合せ免疫欠損（「ＳＣＩＤ」）マウスに注入し、４％パラホルムアルデヒドを用い
て形成する奇形種を固定し、次いでこれら３つの胚性層からの細胞型の証拠を組織学的に
試験することによって、確かめて良い。代替的に、多能性は、胚様体を形成し、この胚様
体を３つの胚葉に関連したマーカーの存在に関して評価することにより決定することがで
きる。
増殖させた多能性幹細胞株は、標準的なＧバンド法を使用し、対応する霊長類種の発表
されている核型と比較することで、核型を決定することができる。細胞が正倍数体である
ことを意味する、「星状核型」を有する細胞を得ることが望ましく、そこでは全てのヒト
クロモソームが存在し、著しく変化しない。
Ｂ．多能性幹細胞の供給源
使用してよい多能性幹細胞の例示型としては、妊娠の間、典型的には、しかし必須では
無く、妊娠のおよそ１０〜１２週前のいずれかの時間に取った、（例えば胚胎盤のような
）前胚性組織、胚性組織、又は胎児組織を含む、多能性細胞の確立された株が挙げられる
。非限定例は、例えばヒト胚性幹細胞株Ｈ１、Ｈ７及びＨ９（ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）のような、ヒト胚性幹細
胞又はヒト胚性生殖細胞の確立された株が挙げられる。フィーダー細胞のない状態ですで
に培養した多能性幹細胞集団から取った細胞もまた好適である。ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、
ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びＺＦＰ４２（Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｈｕｍ Ｇ
ｅｎｅｔ ２０１１，１２：１６５〜１８５、又はＩＰＳ，Ｃｅｌｌ，１２６（４）：６
６３〜６７６を参照）のようないくつかの多能性関連転写因子の強制発現を用いて、成人
体細胞から由来する、人工多能性幹細胞（ＩＰＳ）又は再プログラムされた多能性細胞も
また使用してよい。本発明の方法に使用されるヒト胚性幹細胞は、Ｔｈｏｍｓｏｎらによ
って記述されたように調製してもよい（米国特許第５，８４３，７８０号；Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，１９９８，２８２：１１４５〜１１４７；Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １
９９８，３８：１３３〜１６５；Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．
１９９５，９２：７８４４〜７８４８）。ＢＧ０１ｖ（ＢｒｅｓａＧｅｎ，Ａｔｈｅｎｓ
，Ｇａ）のような変異体ヒト胚性幹細胞株、又はＴａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃ
ｅｌｌ １３１：１〜１２（２００７）にて開示された細胞のような、成人ヒト体細胞か
ら由来した細胞もまた使用してよい。特定の実施形態において、本発明での使用に好適な
多能性幹細胞は、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ４：１６〜１９
，２００９）；Ｍａｈｅｒａｌｉ ｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １：
５５〜７０，２００７）；Ｓｔａｄｔｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃ
ｅｌｌ ２：２３０〜２４０）；Ｎａｋａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌ ２６：１０１〜１０６，２００８）；Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａ
ｌ．（Ｃｅｌｌ １３１：８６１〜８７２，２００７）及び米国特許第２０１１／０１０
４８０５号明細書に記述された方法にしたがって誘導してよい。特定の実施形態において
、多能性幹細胞は、非胚性由来のものであってよい。これらの参照、特許、特許出願の全
てが、とりわけ、多能性細胞の単離、培養、膨張及び分化に関連するので、その全てが参
照により本明細書に組み込まれている。
Ｃ．多能性幹細胞の膨張及び培養
１つの実施形態において、多能性幹細胞は典型的には、種々の方法にて、多能性幹細胞
を支持するフィーダー細胞の層上で培養する。あるいは、多能性幹細胞を、フィーダー細
胞を実質的に含まない培養系中で培養するが、それにもかかわらず、実質的な分化なしに
、多能性幹細胞の増殖を支持する。分化なしでフィーダーを含まない培養液中の多能性幹
細胞の増殖が、他の細胞型と先に培養することによって条件付けした培地を用いて支持さ
れる。あるいは、分化なしにフィーダーを含まない培養液中の多能性幹細胞の増殖が、化
学的に規定された培地を用いて支持される。
多能性細胞は、種々のフィーダー層を用いて培養中に、又はマトリックスタンパク質コ
ート容器を用いることによって、簡単に増殖し得る。あるいは、ｍＴｅｓｒ（（登録商標
））１培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａ
ｎａｄａ）のような規定された培地との組合せでの化学的に規定された表面を、細胞の常
用膨張のために使用してよい。多能性細胞は、酵素消化、機械的分離、又はＥＤＴＡ（エ
チレンジアミンテトラ酢酸）のような種々のカルシウムキレータを用いて、培養プレート
から簡単に除去してよい。あるいは、多能性細胞を、任意のマトリックスタンパク質又は
フィーダー層のない状態で、懸濁液中で膨張させて良い。
多能性幹細胞を膨張させ、培養する多くの異なる方法を、請求された発明にて使用して
よい。例えば、本発明の方法は、Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ
ｅｔ ａｌ．Ｒｉｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．及び米国特許第２００２／００７２１１７号
明細書の方法を用いてよい。Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８：３９９〜４０４（２０００））及びＴｈｏｍｐｓｏｎ ｅ
ｔ ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５〜１１４７（１９９８））は、マウス胚
性線維芽細胞フィーダー細胞層を用いて、ヒト線維芽細胞からの多能性幹細胞の培養を開
示している。Ｒｉｃｈａｒｄｓ ｅｔ ａｌ．（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２１：５４６〜
５５６，２００３）は、ヒト多能性幹細胞培養を支持するそれらの能力に関して、１１の
異なるヒト成人、胎児及び新生児フィーダー細胞層のパネルを評価し、成人皮膚線維芽細
胞フィーダー上で培養したヒト胚性幹細胞株が、ヒト胚性幹細胞形態を維持し、多能性の
ままであることが留意される。米国特許第２００２／００７２１１７号明細書は、フィー
ダーを含まない培養液中での霊長類多能性幹細胞の増殖を支持する培地を産出する細胞株
を開示している。使用される細胞株は、胚組織から得た又は胚性幹細胞から分化した間葉
系細胞株、及び線維芽細胞様細胞株である。米国特許第２００２／０７２１１７号明細書
はまた、霊長類フィーダー細胞層としての、細胞株の利用を開示する。
多能性幹細胞を膨張し、培養する他の好適な方法が、例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，
Ｓｔｏｊｋｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｙａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．及びＡｍｉｔ ｅ
ｔ ａｌ．にて開示されている。Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２３
：１２２１〜１２２７，２００５）は、ヒト胚性幹細胞から由来したフィーダー細胞上、
ヒト多能性幹細胞の長期増殖のための方法を開示する。Ｓｔｏｊｋｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ
．（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２００５ ２３：３０６〜３１４，２００５）は、ヒト胚性
幹細胞の自発的分化から由来するフィーダー細胞系を開示する。Ｍｉｙａｍｏｔｏ ｅｔ
ａｌ．（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２２：４３３〜４４０，２００４）は、ヒト胎盤から
得たフィーダー細胞の供給源を開示している。Ａｍｉｔ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｌ．Ｒｅ
ｐｒｏｄ ６８：２１５０〜２１５６，２００３）は、ヒト包皮から由来するフィーダー
細胞層を開示する。
他の実施形態において、多能性幹細胞を膨張し培養する好適な方法は、例えば、Ｉｎｚ
ｕｎｚａ ｅｔ ａｌ．，米国特許第６，６４２，０４８号明細書、国際特許第２００５
／０１４７９９号パンフレット、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．及び米国特許第２００７／００１０
０１号明細書に開示される。Ｉｎｚｕｎｚａ ｅｔ ａｌ．（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２
３：５４４〜５４９，２００５）は、ヒト多能性幹細胞包皮線維芽細胞からのフィーダー
細胞層を開示している。米国特許第６，６４２，０４８号明細書は、フィーダーを含まな
い培養液中の霊長類多能性幹細胞の増殖を支持する培地と、そのような培地の産出のため
に有用な細胞株を開示している。米国特許第６，６４２，０４８号明細書は、胚性組織か
ら得、胚性幹細胞から分化した、間葉及び線維芽細胞様細胞株、並びにそのような細胞株
を誘導し、培地を処理し、そのような培地を使用して幹細胞を増殖する方法を報告する。
国際特許第２００５／０１４７９９号明細書は、哺乳動物細胞の保持、増殖及び分化のた
めの条件培地を開示する。国際特許第２００５／０１４７９９号は、本開示を介して製造
した培養培地は、齧歯類細胞、とりわけ分化し、不死化したトランスジェニック肝細胞、
ＭＭＨ（Ｍｅｔ Ｍｕｒｉｎｅ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｒｅ）という名前のものの、細胞分
泌活性によって条件づけられることを報告する。Ｘｕ ｅｔ ａｌ．（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌ
ｌｓ ２２：９７２〜９８０，２００４）は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素を過剰発現す
るように、遺伝的に改変したヒト胚性幹細胞誘導体から得た、条件培地を開示する。米国
特許第２００７／００１００１１号パンフレットは、多能性幹細胞の維持のための、化学
的に規定された培養培地を開示する。
代替的な培養系は、胚性幹細胞の増殖を促進することができる増殖因子で補充された無
血清培地を使用する。そのような培地系の例としては、Ｃｈｅｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅ
ｖｅｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．及び米国特許第２００５／０１４８０７０号明細書が挙
げられるが、これらに限定はされない。Ｃｈｅｏｎ ｅｔ ａｌ．（ＢｉｏＲｅｐｒｏｄ
ＤＯＩ：１０．１０９５／ｂｉｏｌｒｅｐｒｏｄ．１０５．０４６８７０、Ｏｃｔｏｂ
ｅｒ １９、２００５）は、胚性幹細胞が、胚性幹細胞自己再生を引き起こすことが可能
な、異なる増殖因子を加えた未条件付け血清置換（ＳＲ）培地中で維持される、フィーダ
ーを含まない、血清を含まない培養系を開示する。Ｌｅｖｅｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．
（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２４：５６８〜５７４，２００６）は、ｂＦＧＦを加えた培地
を用いて、線維芽細胞又は条件培地のない状態での、ヒト胚性幹細胞の長期培養のための
方法を開示する。米国特許第２００５／０１４８０７０号明細書は、血清なし、及び線維
芽細胞フィーダー細胞なしの規定培地中、ヒト胚性幹細胞を培養する方法を開示し、本方
法には、アルブミン、アミノ酸、ビタミン、ミネラル、少なくとも１つのトランスフェリ
ン又はトランスフェリン基質、少なくとも１つのインスリン又はインスリン基質を含む培
養培地中で幹細胞を培養することを含み、培養培地は、哺乳動物胎児血清を実質的に含ま
ず、線維芽細胞増殖因子シグナル伝達受容体を活性化可能な、線維芽細胞増殖因子、少な
くとも約１００ｎｇ／ｍｌを含み、増殖因子が、ただ線維芽細胞フィーダー層以外の供給
源から供給され、培地が、フィーダー細胞又は条件培地なしに、未分化状態で、幹細胞の
増殖を支持した。
多能性幹細胞を培養し、膨張する他の好適な方法が、米国特許第２００５／０２３３４
４６号明細書、同６６，８００，４８０号明細書、同２００５／０２４４９６２号明細書
及び国際特許第２００５／０６５３５４号パンフレットにて開示される。米国特許第２０
０５／０２３３４４６号明細書は、未分化の霊長類原発幹細胞を含む、幹細胞を培養する
ことにおいて有用な規定培地を開示している。溶液中、培地は、培養されている幹細胞と
比較して実質的に等張である。該培養液中、特定の培地は、塩基培地及び原発幹細胞の実
質的に未分化の増殖を支持するのに必要な量の各ｂＦＧＦ、インスリン及びアスコルビン
酸を含む。米国特許第６，８００，４８０号明細書は、霊長類由来原発幹細胞を、実質的
に未分化の状態で増殖させるための細胞培養培地が、霊長類由来原発幹細胞の増殖を支持
するために効果的である、低浸透圧、低内毒素基礎培地を含んで提供されることを報告し
ている。特許第６，８００，４８０号明細書は、基礎培地が、霊長類由来原発幹細胞の増
殖を支持するのに効果的な栄養血清と、フィーダー細胞からなる群から選択される基質、
及びフィーダー細胞由来の細胞外マトリックス成分と組み合わされることをさらに報告し
ている。本培地はさらに、非必須アミノ酸、抗酸化剤、及びヌクレオシド及びピルビン酸
塩からなる群から選択される第一増殖因子を含むと留意される。米国特許第２００５／０
２４４９６２号明細書は、本開示の１つの態様が、霊長類胚性幹細胞を培養する方法を提
供することと、培養中の幹細胞が、哺乳動物胎児血清を実質的に含まず（好ましくはまた
任意の動物血清を実質的に含まず）、ただ線維芽細胞フィーダー層以外の供給源から供給
される線維芽細胞増殖因子の存在下であることを報告している。
国際特許第２００５／０６５３５４号パンフレットは、基礎培地、ｂＦＧＦ、インスリ
ン及びアスコルビン酸を含む実質的にフィーダーを含まず、血清を含まない、規定された
等張培養培地を開示する。さらに、国際特許第２００５／０８６８４５号パンフレットは
、未分化幹細胞の維持のための方法を開示し、前記方法には、幹細胞を、望む結果を達成
するために十分な時間、未分化な状態に細胞を維持するのに十分な量の、タンパク質のト
ランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）ファミリーのメンバー、タンパク質の線
維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリーのメンバー、又はニコチンアミド（ＮＩＣ）に曝
露することが含まれる。
多能性幹細胞は、好適な培養基質上に播くことができる。１つの実施形態において、好
適な培養基質は、基底膜から由来するもののような、又は、接着分子受容体−リガンド結
合の部分を形成し得る、細胞外マトリックス成分である。１つの実施形態において、好適
な培養基質は、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）である
。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）は、室温でゲル化し、再構成基底膜を形成する、Ｅｎｇｅｌ
ｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ Ｓｗａｒｍ腫瘍細胞からの可溶性調製物である。
他の細胞外マトリックス成分及び成分混合物が、代替物として好適である。増殖させる
細胞型に応じて、これは、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、エンタクチ
ン、ヘパラン硫塩、及び同様物を、単独で又は様々な組み合わせで含み得る。
多能性幹細胞を、好適な分布で、培地の存在下、基質上にプレートしてよく、細胞生存
、伝播及び望む特徴の保持を促進する。全てのこれらの特徴は、播種分布に対する注意深
い注意からの利益であり、当業者によって簡単に決定されうる。好適な培養培地は、以下
の成分、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇｒａｎｄ
Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹにより商標ＧＩＢＣＯ（商標）（Ｐａｒｔ番号１１９６５−０９２）
の下販売されているダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹにより商標Ｇ
ＩＢＣＯ（商標）（Ｐａｒｔ番号１０８２９−０１８）の下販売されている、ノックアウ
トダルベッコ変法イーグル培地（ＫＯ ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２／５０％ ＤＭＥＭ基礎
培地、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇｒａｎｄ Ｉ
ｓｌａｎｄ，ＮＹにより商標ＧＩＢＣＯ（商標）（Ｐａｒｔ番号１１５０３９−０２７）
の下販売されている、２００ｍＭ Ｌ−グルタミン、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ
ｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹにより商標ＧＩＢＣＯ（
商標）（Ｐａｒｔ番号１１１４０−０５０）の下販売されている非必須アミノ酸溶液、β
−メルカプトエタノール、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＬＬＣ Ｓａ
ｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯにより販売されている（Ｐａｒｔ番号７５２２）、Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ
により商標ＧＩＢＣＯ（商標）（Ｐａｒｔ番号１３２５６−０２９）の下販売されている
ヒト組換え体塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）から作製されて良い。
多能性幹細胞の分化
多能性幹細胞は、β細胞に向かって分化するにつれ、それぞれが、特定のマーカーが存
在する、又は存在しないことによって特徴付けられて良い、種々のステージを通して分化
する。これらのステージへの細胞の分化は、圧力、又は培養培地に加えた特定の因子の欠
如を含む、特定の培養条件によって達成される。一般に、本分化は、多能性幹細胞の、胚
体内胚葉への分化を含んでよい。これらの胚体内胚葉細胞は次いで、腸管細胞にさらに分
化し、続いて前腸内胚葉細胞に分化してよい。前腸内胚葉細胞は、膵臓前腸前駆細胞に分
化してよく、これは続いて、膵臓内胚葉細胞、膵臓内分泌前駆細胞又は両方に分化可能で
ある。これらの細胞は次いで、（β細胞のような）膵臓ホルモン産出細胞に分化してよい
。
本発明は、（Ｔ３、Ｔ３の類似体、Ｔ４、Ｔ４の類似体、又はそれらの組合せ（合わせ
て本明細書以下「Ｔ３／Ｔ４」と呼ぶ）のような）甲状腺ホルモンと、ＡＬＫ５阻害剤を
用いる、膵臓内分泌細胞への、多能性肝細胞のステージ化分化を提供する。本発明はまた
、（Ｔ３／Ｔ４のような）甲状腺ホルモン又はＡＬＫ５阻害剤を用いて、膵臓内分泌細胞
への、多能性幹細胞のステージ化分化を提供する。好適な甲状腺ホルモン類似体としては
、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．カタログ番号＃４５５４から入手可能なＧＣ−１（
Ｓｏｂｅｒｔｉｒｏｍｅ）、ＤＩＴＰＡ（３，５−ジヨードチロプロピオン酸）、Ｊ．Ｓ
ｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００８，１１１：２６２〜２６７
及びＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ２００３，１００：１００６７〜１０
０７２にて議論されるＫＢ−１４１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ２０
０７，１０４：１５４９０〜１５４９５にて議論されるＭＢ０７３４４、ＰＬｏＳ Ｏｎ
ｏ，２０１０，５ｅ８７２２及びＪ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．２００９，５０：９３８〜９
４４にて議論されるＴ０６８１、及びＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２０１０ ｅ８７２２及びＥｎ
ｄｏｃｒ Ｐｒａｃｔ．２０１２，１８（６）：９５４〜９６４にて議論されるＧＣ−２
４が挙げられ、これらの開示はその全てが参照により本明細書に組み込まれている。有用
なＡＬＫ５阻害剤としては、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（Ｅｎｚｏ，Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，
ＮＹ）、ＡＬＫ５ｉ（Ａｘｘｏｒａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＳＤ２０８（Ｒ＆Ｄ
ｓｙｓｔｅｍｓ（ＭＮ））、ＴＧＦ−Ｂ阻害剤ＳＢ４３１５４２（Ｘｃｅｓｓ Ｂｉｏ
ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ））、ＩＴＤ−１（Ｘｃｅｓｓ Ｂｉｏｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ（ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ））、ＬＹ２１０９７６１（Ｘｃｅｓｓ Ｂｉｏ
ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ））、Ａ８３−０１（Ｘｃｅｓｓ Ｂｉｏｓ
ｃｉｅｎｃｅｓ（ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ））、ＬＹ２１５７２９９（Ｘｃｅｓｓ Ｂｉ
ｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ））、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ Ｖ（ＥＭ
Ｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ Ｉ（Ｅ
ＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ ＩＶ
（ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ
ＶＩＩ（ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）、ＴＧＦ−β受容体ｉ
ｎｈ ＶＩＩＩ（ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）、ＴＧＦ−β
受容体ｉｎｈ ＩＩ（ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）、ＴＧＦ
−β受容体ｉｎｈ ＶＩ（ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）、Ｔ
ＧＦ−β受容体ｉｎｈ ＩＩＩ（ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ
）が挙げられる。
多能性幹細胞の、膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞への分化
多能性幹細胞の特徴は当業者に公知であり、多能性幹細胞の更なる特徴は、継続して同
定されている。多能性幹細胞マーカーとしては、例えば、以下の、ＡＢＣＧ２、クリプト
、ＦＯＸＤ３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４５、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、Ｎ
ＡＮＯＧ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−
１−６０及びＴＲＡ−１−８１の１つ又は２つ以上の発現が含まれる。
例示多能性幹細胞としては、ヒト胚性幹細胞株Ｈ９（ＮＩＨコート：ＷＡ０９）、ヒト
胚性幹細胞株Ｈ１（ＮＩＨコード：ＷＡ０１）、ヒト胚性幹細胞株Ｈ７（ＮＩＨコード：
ＷＡ０７）、及びヒト胚性幹細胞株ＳＡ００２（Ｃｅｌｌｒｔｉｓ，Ｓｅｗｄｅｎ）が挙
げられる。また、以下の多能性細胞に特徴的なマーカー、ＡＢＣＧ２、クリプト、ＣＤ９
、ＦＯＸＤ３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４５、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、Ｎ
ＡＮＯＧ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−
１−６０及びＴＲＡ−１−８１の少なくとも１つを発現する細胞が好適である。
胚体内胚葉系統に特徴的なマーカー、少なくとも１つを発現している細胞が、本発明に
おける使用のためにまた好適である。本発明の１つの実施形態において、胚体内胚葉系統
に特徴的なマーカーを発現している細胞は、霊長類原始線条前駆細胞である。他の実施形
態において、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、中胚葉細胞であ
る。他の実施形態において、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、
胚体内胚葉細胞である。
また、少なくとも１つの膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現している細胞が、本
発明における利用のために好適である。本発明の１つの実施形態において、膵臓内分泌系
統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１の発現が、ＣＤ
Ｘ２及びＳＯＸ２の発現より実質的に高い、膵臓内分泌細胞である。ＰＤＸ１及びＮＫＸ
６．１の発現が、ＣＤＸ２又はＳＯＸ２の発現よりも少なくとも２倍高い細胞がとりわけ
有用である。
１つの実施形態において、膵臓内分泌細胞は、以下のホルモン：インスリン、グルカゴ
ン、ソマトスタチン又は膵臓ポリペプチドの少なくとも１つを発現可能な膵臓内分泌細胞
が製造される。膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを少なくとも１つ発現している前駆細
胞が、本発明における利用のために好適である本発明の１つの好ましい実施形態において
、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内分泌細胞である。好
ましい実施形態において、膵臓内分泌細胞は、インスリン産出β細胞である。
本発明の特定の実施形態において、膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している
細胞に到着するために、多能性幹細胞、又は人工多能性幹細胞、好ましくは多能性幹細胞
で開始するプロトコールを使用する。本プロトコールは、以下のステージを含む。
ステージ１：細胞培養株から得た、胚性幹細胞のような、多能性幹細胞を、適切な因子
で処理して、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞への分化を誘導する
。
ステージ２：ステージ１からの細胞を、適切な因子で処理して、腸管細胞に特徴的なマ
ーカーを発現している細胞へのさらなる分化を誘導する。
ステージ３：ステージ２からの細胞を、適切な因子で処理して、前腸内胚葉細胞に特徴
的なマーカーを発現している細胞へのさらなる分化を誘導する。
ステージ４：ステージ３からの細胞を、（特定の実施形態において、Ｔ３／Ｔ４を含む
）適切な因子で処理して、膵臓前腸前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞への
さらなる分化を誘導する。
ステージ５：ステージ４からの細胞を、（特定の実施形態において、（ｉ）Ｔ３／Ｔ４
、（ｉｉ）ＡＬＫ５阻害剤、又は（ｉｉｉ）Ｔ３／Ｔ４及びＡＬＫ５阻害剤両方を含む）
適切な因子で処理して、膵臓内胚葉／内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している
細胞へのさらなる分化を誘導する。
ステージ６：ステージ５からの細胞を、（特定の実施形態において、Ｔ３／Ｔ４、ＡＬ
Ｋ５阻害剤、又は両方を含む）適切な因子で処理して、膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカ
ーを発現している細胞へのさらなる分化を誘導する。
特定の実施形態において、本発明は、膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現してい
る細胞に、多能性幹細胞を分化させることを包含する一方で、本発明はまた、膵臓内分泌
細胞に向かう他の中間ステージからの結果である細胞を分化することを包含する。特に、
本発明は、膵臓前腸前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞の、膵臓内分泌細胞
に特徴的なマーカーを発現している細胞への分化を包含する。さらに、工程が分離ステー
ジで記述されるけれども、分化工程を通した細胞の処理並びに工程は、連続性又は持続性
であってよい。
培養又は単離された細胞中のタンパク質及び核酸マーカーの発現を評価する方法は、当
該技術分野にて標準的である。これらの方法としては、ＲＴ−ＰＣＲ、ノザンブロット、
インサイチューハイブリッド形成（例えばＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ｌ．，ｅｄｓ．２００１
補遺を参照）、及び免疫アッセイ（切断材料の免疫染色化学解析のような、ウエスタンブ
ロッティング、及び無傷細胞中でアクセス可能なマーカーに対する、フローサイトメトリ
解析（ＦＡＣＳ）（例えばＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏ
ｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈｒｂｏｒ Ｌｂｏｒｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９８）を参照）免疫アッ
セイが挙げられる。さらに、分化の効率は、対象の細胞型に特徴的なマーカーを発現して
いる細胞によって発現されたタンパク質マーカーを特異的に認識する（抗体のような）薬
剤へ、処理した細胞集団を曝露することによって決定されてよい。
分化細胞をまた、さらに精製しても良い。例えば、多能性幹細胞を、本発明の方法で処
理した後、分化した細胞を、処理した細胞集団を、精製している分化細胞によって特徴的
に発現されたタンパク質マーカーを特異的に認識する（抗体のような）薬剤に曝露するこ
とによって精製してよい。
ステージ１：多能性幹細胞の、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞
への分化
多能性幹細胞は、当該技術分野で公知の任意の好適な方法によって、又は本発明で提案
される任意の方法によって、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に分
化させてよい。多能性幹細胞を、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞
に分化させるための好適な方法は、多能性幹細胞、及び胚体内胚葉系統に特徴的なマーカ
ーを発現している細胞への多能性幹細胞の分化に関するとして、その全てが参照により組
み込まれている、米国特許第２００７／０２５４３５９号明細書、米国特許第２００９／
０１７０１９８号明細書、米国特許第２００９／０１７０１９８号明細書、米国特許第２
０１１／００９１９７１号明細書、米国特許第２０１０／００１５７１１号明細書、米国
特許第２０１０／００１５７１１号明細書、米国特許第２０１２／０１９０１１１号明細
書、米国特許第２０１２／０１９０１１２号明細書、米国特許第２０１２／０１９６３６
５号明細書、米国特許第２０１０００１５７１１号明細書、米国特許第２０１２／０１９
０１１１号明細書、米国特許第２０１２／０１９０１１２号明細書、米国特許第２０１２
／０１９６３６５号明細書、米国特許第２０１０００１５７１１号明細書、米国特許第２
０１２／０１９０１１１号明細書、米国特許第２０１２／０１９０１１２号明細書、米国
特許第２０１２／０１９６３６５号明細書、米国特許仮出願第６１／０７６，９００号明
細書、米国特許仮出願第６１／０７６，９０８号明細書、及び米国特許仮出願第６１／０
７６，９１５号明細書に開示されている。
本発明の１つの実施形態において、多能性幹細胞を、アクチビンＡ及びＷｎｔ３Ａを補
充した培地で処理し、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞の発生とす
る。処理は、多能性幹細胞を、約５０ｎｇ／ｍｌ〜約１５０ｎｇ／ｍｌ、あるいは約７５
ｎｇ／ｋｍｌ〜約１２５ｎｇ／ｍｌ、あるいは約１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを含む
培地と接触させることを含んでよい。処理はまた、細胞を、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約５０ｎ
ｇ／ｍｌ、あるいは約１５ｎｇ／ｍｌ〜約３０ｎｇ／ｍｌ、あるいは約２０ｎｇ／ｍｌの
Ｗｎｔ３Ａと接触させることを含んでよい。多能性細胞を、およそ２〜５日間、好ましく
は２〜３日間培養して、それらの胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞
への分化を促進してよい。１つの実施形態において、細胞を、アクチビンＡとＷｎｔ３の
存在下で１日培養し、続いてアクチビンＡ（Ｗｎｔ３Ａが存在せず）の存在下、残りの時
間培養する。
本発明の他の実施形態において、多能性幹細胞を、増殖分化因子８（「ＧＦＤ８」）と
（その全てが参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第２０１０／００１５７
１１号明細書にて開示される環状アニリン−ピリジノトリアジン化合物のような）グルカ
ゴンシンターゼキナーゼ−３β（「ＧＳＫ３β」）阻害剤を補充した培地で処理して、胚
体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞への分化を誘導する。好ましいＧＳ
Ｋ３β阻害剤は、本明細書で（「ＭＣＸ化合物」）と呼ぶ、１４−プロパ−２−エン−１
−イル−３，５，７，１４，１７，２３，２７−ヘプタアザテトラシクロ［１９．３．１
．１〜２，６〜．１〜８，１２〜］ヘプタコサ−１（２５）、２（２７）、３，５，８（
２６）、９，１１，２１，２３−ノネン−１６−オンである。処理は、多能性幹細胞を、
約５０ｎｇ／ｍｌ〜約１５０ｎｇ／ｍｌ、あるいは約７５ｎｇ／ｋｍｌ〜約１２５ｎｇ／
ｍｌ、あるいは約１００ｎｇ／ｍｌのＧＤＦ８を補充した培地と接触させることを含んで
よい。処理はまた、細胞を約０．１〜５μＭ、あるいは約０．５〜約２．５μＭ、好まし
くは約１μＭのＭＣＸ化合物と接触させることを含んでもよい。多能性幹細胞を、およそ
２〜５日間、好ましくは約３〜４間培養し、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現し
ている細胞へのそれらの分化を促進してよい。１つの実施形態において、細胞を、ＧＤＦ
８とＭＣＸ化合物の存在下、１日培養し、続いて、ＧＤＦ８と低濃度のＭＣＸ化合物の存
在下、１日培養し、続いて、ＧＤＦ８の存在下、ＭＣＸ化合物のない状態で１日培養して
よい。特に、細胞を、ＧＤＦ８と約１μＭのＭＣＸ化合物の存在下で１日培養し、続いて
ＧＤＦ８と約０．１μＭのＭＣＸ化合物の存在下で１日培養し、続いてＧＤＦ８の存在下
、ＭＣＸ化合物のない状態で、１日培養してよい。他の実施形態において、細胞を、ＧＤ
Ｆ８と約１μＭのＭＣＸ化合物の存在下、１日培養し、続いて、ＧＤＦ８と、約０．１μ
Ｍ ＭＣＸ化合物の存在下、１日培養する。
胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞の発生は、特定のプロトコール
に従う前、及び後に、マーカーの存在に関して試験することによって決定してよい。多能
性幹細胞は、典型的にはそのようなマーカーを発現しない。したがって、多能性細胞の分
化は、細胞が、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現し始めた時に検出可能である。
ステージ２：胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している、腸管細胞に特徴的な
マーカーを発現している細胞への分化
胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を、腸管細胞に特徴的なマーカ
ーを発現している細胞へさらに分化してよい。１つの実施形態において、腸管細胞に特徴
的なマーカーを発現している細胞の形成には、胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現して
いる細胞を、線維芽細胞増殖因子（「ＦＧＦ」）７又はＦＧＦ１０を含む培地で培養して
、これらの細胞を分化させることが含まれる。例えば、培養培地には、約２５ｎｇ／ｍｌ
〜約７５ｎｇ／ｍｌ、あるいは約３０ｎｇ／ｍＬ〜約６０ｎｇ／ｍｌ、あるいは約５０ｎ
ｇ／ｍｌのＦＧＦ７又はＦＧＦ１０、好ましくはＦＧＦ７を含んでよい。細胞を、約２〜
３日、好ましくは約２日間、これらの条件下で培養してよい。
他の実施形態において、腸管細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞への分化には
、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を、ＦＧＦ７又はＦＧＦ１０及
びアスコルビン酸（ビタミンＣ）と培養することが含まれる。培養培地は、約０．１ｍＭ
〜約０．５ｍＭアスコルビン酸、あるいは約０．２ｍＭ〜約０．４ｍＭ、あるいは約０．
２５ｍＭのアスコルビン酸を含んでよい。培養培地はまた、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約３５ｎ
ｇ／ｍｌ、あるいは約１５ｎｇ／ｍｌ〜約３０ｎｇ／ｍｌ、あるいは約２５ｎｇ／ｍｌの
ＦＧＦ７又はＦＧＦ１０、好ましくはＦＧＦ７を含んでもよい。例えば、培養培地は、約
０．２５ｍＭのアスコルビン酸と約２５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ７を含んでよい。１つの実施
形態において、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を、ＦＧＦ７とア
スコルビン酸とで、２日間処理する。
ステージ３：腸管細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞の、前腸内胚葉細胞に特
徴的なマーカーを発現している細胞への分化
腸管細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞をさらに、前腸内胚葉細胞に特徴的な
マーカーを発現している細胞に分化してよい。１つの実施形態において、ステージ２細胞
をさらに、これらの細胞を、（シクロパミン又はＭＲＴ１０（Ｎ−［［［３−ベンゾイル
アミノ）フェニル］アミノ］チオキソメチル］−３，４，５−トリメトキシベンズアミド
））又はシクロパミンのような）Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ（「ＳＭＯ」）受容体阻害剤、又
は（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ １（「ＳＡＮＴ−１」）（（Ｅ）−
４−ベンジル−Ｎ−（（３，５−ジメチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル
）メチレンピペラジン−１−アミン）のような）Ｓｏｎｉｃ Ｈｅｄｇｅｈｏｇ（「ＳＨ
Ｈ」）シグナル伝達経路アンタゴニスト、又はＨｅｄｇｅｈｏｇ Ｐａｔｈｗａｙ Ｉｎ
ｈｉｂｉｔｏｒ １（「ＨＰＩ−１」）（２−メトキシエチル１，４，５，６，７，８−
ヘキサヒドロ−４（３−ヒドロキシフェニル）−７−（２−メトキシフェニル）−２−メ
チル−５−オキソ−３−キノリンカルボキシレート））、レチノイン酸、及びＮｏｇｇｉ
ｎを補充した培養培地中で培養することによって、ステージ３細胞に分化させる。あるい
は、培地には、ＳＭＯ阻害剤、ＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニスト、レチノイン酸及
びＮｏｇｇｉｎを補充してよい。細胞を、およそ２〜４日間、好ましくは２日間培養して
よい。１つの実施形態において、培地には、約０．１μＭ〜約０．３μＭのＳＡＮＴ−１
、約０．５μＭ〜約３μＭのレチノイン酸及び約７５ｎｇ／ｍｌ〜約１２５ｎｇ／ｍｌの
Ｎｏｇｇｉｎを補充する。他の実施形態において、培地には、約０．２５μＭのＳＡＮＴ
−１、約２μＭのレチノイン酸及び約１００ｎｇ／ｍｌのＮｏｇｇｉｎを補充する。
他の実施形態において、ステージ２細胞を、ＦＧＦ７又はＦＧＦ１０、レチノイン酸、
（ＭＲＴ１０又はシクロパミンのような）ＳＭＯ受容体阻害剤又は（ＳＡＮＴ−１又はＨ
ＰＩ−１のような）ＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニスト、（（（２Ｓ，５Ｓ）−（Ｅ
，Ｅ）−８−（５−（４−トリフルオロメチル）フェニル）−２，４−ペンタジエノイル
イルアミノ）ベンゾラクタム（「ＴＰＢ」））ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，
Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）のようなタンパク質キナーゼＣ（「ＰＫＣ」）アクチベータ
、ホルボール−１２，１３−ジブチルート（「ＰＤＢｕ」）、ホルボール−１２−ミリス
テート−１３−アセテート（「ＰＭＡ］）、又はインドラクタムＶ（「ＩＬＶ」））、（
ＬＤＮ−１９３１８９、Ｎｏｇｇｉｎ又はＣｈｏｒｄｉｎのような）骨形態形成タンパク
質（「ＢＭＰ」）阻害剤、及びアスコルビン酸を補充した培地で処理することによって、
ステージ２細胞をさらにステージ３細胞に分化させる。他の実施形態において、培地に、
ＦＧＦ７又はＦＨＦ１０、レチノイン酸、ＳＭＯ阻害剤、（ＳＡＮＴ−１のような）ＳＨ
Ｈシグナル伝達アンタゴニスト、（ＴＰＢのような）ＰＫＣアクチベータ、（ＬＤＮ−１
９３１８９のような）ＢＭＰ阻害剤及びアスコルビン酸を補充してよい。細胞を、これら
の増殖因子、低分子アゴニスト、及びアンタゴニストとの存在下、約２〜４日間、好まし
くは約２〜３日間、培養してよい。
１つの実施形態において、培地には、約１５ｎｇ／ｍｌ〜約３５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ７
、約０．５μＭ〜約２μＭのレチノイン酸、約０．１μＭ〜約０．４μＭのＳＡＮＴ−１
、約１００ｎＭ〜約３００ｎＭのＴＲＢ、約５０ｎＭ〜約２００ｎＭのＬＤＮ−１９３１
８９、及び約０．１５ｍＭ〜約０．３５ｍＭのアスコルビン酸を補充してよい。他の実施
形態において、培地には、約２５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ７、約１μＭのレチノイン酸、約０
．２５μＭのＳＡＮＴ−１、約２００ｎＭのＴＰＢ、約１００ｎＭのＬＤＮ−１９３１８
９、及び約０．２５ｍＭのアスコルビン酸を補充する。
ステージ４〜６：甲状腺ホルモンＴ３／Ｔ４又はＡＬＫ５阻害剤、又はＴ３／Ｔ４及び
ＡＬＫ５阻害剤両方を補充した培養培地での処理による、前腸内胚葉細胞に特徴的なマー
カーを発現している細胞の、膵臓内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞への
分化。
本発明は、甲状腺ホルモンＴ３／Ｔ４又はＡＬＫ５阻害剤、又はＴ３／Ｔ４及びＡＬＫ
５阻害剤両方を補充した培養培地での処理による、前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを
発現している細胞のさらなる分化を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、
１つ以上のこれらのステージにて、（ａ）Ｔ３、（ｂ）ＡＬＫ５阻害剤、又は（ｃ）Ｔ３
とＡＬＫ５阻害剤両方を補充した培養培地での処理による、ステージ４〜ステージ６での
そのような細胞の更なる分化を提供する。
１つの実施形態において、本発明は、以下
ａ．多能性幹細胞を培養することと、
ｂ．多能性幹細胞を、前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化す
ることと、
ｃ．（ｉ）Ｔ３／Ｔ４、（ｉｉ）ＡＬＫ５阻害剤、又は（ｉｉｉ）Ｔ３／Ｔ４とＡＬＫ
５阻害剤両方を補充した培地での処理によって、前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発
現している細胞を、多能性幹細胞からの膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現してい
る細胞に分化すること、とを含む、多能性幹細胞からの膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカ
ーを発現している細胞を製造するための方法を提供する。
１つの実施形態において、膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞は、
β細胞である。他の実施形態において、得られた細胞は、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１及びＨ
Ｂ−９に対して陽性である。本方法は、ＮＫＸ６．１陽性膵臓内胚葉前駆細胞中のＨＢ陽
性細胞の数を増強してよい。本方法はまた、ＮＫＸ２．２又はＳＯＸ２、又は両方の発現
、並びにアルブミン発現も減少させて良い。本方法はまた、Ｔ３／Ｔ４を補充した培地中
の、膵臓内胚葉／内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を培養することによ
って、β細胞を含む、膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞も提供して
よい。多能性幹細胞から、膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を製造
する方法は、表Ｉ〜ＩＩＩにて示した、又は本明細書で記述した培養条件を利用してよい
。１つの実施形態において、ＡＬＫ５阻害剤は、ＳＤ２０８（（２−（５−クロロ−２−
フルオロフェニル）プテリジン−４−イル］ピリジン−４−イルーアミン）である。他の
実施形態において、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（（２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル
）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジン）、ＡＬＸ−２７０−４４５
、ＥＮＺＯ、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）も使用可能である。
Ｔ３／Ｔ４、ＡＬＫ５阻害剤、又は両方を補充した培養培地での、ステージ４〜６の細
胞の処理は、種々の利点を提供する。例えば、ステージ４〜ステージ６での甲状腺ホルモ
ンの添加は、グルカゴン、ソマトスタチンオ及びグレリンを有意にダウンレギュレートし
、一方でステージ５にて、インスリン発現を穏やかに増加させる。ステージ４〜６でのＴ
３／Ｔ４の添加はまた、ＮＫＸ２．２の発現を有意に減少させるように見え、一方でＮＫ
Ｘ６．１及びＰＤＸ１発現には影響がない。さらに、ステージ４〜６のＴ３／Ｔ４添加が
、ＳＯＸ２（胃マーカー）とアルブミン（肝臓マーカー）発現を抑制し、一方でＣＤＸ２
（腸マーカー）発現に影響を与えない。さらに、未処理対照と比較して、ステージ４での
Ｔ３での処理は、ステージ６でのＨＢ９陽性細胞の数を増加させる。さらに、Ｔ３処理は
、ＨＢ９を発現するＮＫＸ６．１陽性細胞の数の増加をもたらした。ＡＬＫ５阻害剤とＴ
３／Ｔ４両方への遅延性曝露は、ＮＫＸ６．１の強い発現を維持する一方で、ＨＢ９の発
現を有意に増強するように見える。培養培地へのＴ３／Ｔ４の封入は、用量依存様式で、
ＮＫＸ６．１陽性膵臓内胚葉前駆細胞中の、ＨＢ９陽性細胞の数を有意に増強するように
見える。
したがって、特定の実施形態において、本発明は、少なくとも甲状腺ホルモンＴ３／Ｔ
４を補充した培地での処理によって、ステージ４〜ステージ６にて提供された分化した細
胞中のグルカゴン、ソマトスタチン及びグレリンをダウンレギュレートする方法を提供す
る。さらに、本発明はまた、少なくとも甲状腺ホルモンＴ３／Ｔ４を補充した培地での処
理によって、ＮＫＸ６．１とＰＤＸ１を発現する、ステージ４〜ステージ６にて提供され
た分化した細胞中のＮＫＸ２．２発現を減少させる方法を提供する。さらに、本発明は、
甲状腺ホルモンＴ３／Ｔ４と、任意にＡＬＫ５阻害剤を有する培地中で培養することによ
って、ＨＢ９を発現しているＮＫＸ６．１陽性細胞を増やすための方法を提供する。特定
の実施形態において、本方法は、表Ｉ〜ＩＩＩにて示した培養条件を使用する。
本発明の１つの実施形態は、甲状腺ホルモンＴ３／Ｔ４、ＡＬＫ５阻害剤、又は（Ｔ３
とＡＬＫ５阻害剤のような）両方を補充した培地での処理によって、前腸内胚葉に特徴的
なマーカーを発現している細胞を、β細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞へ分化
させることを含む、β細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を形成する方法である
。得られる細胞は、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１及びＨｂ−９に対して陽性である。本方法は
、ＮＫＸ６．１陽性膵臓内胚葉前駆細胞中、ＨＢ９陽性細胞の数を増強するために使用し
てよい。本方法はまた、ＮＫＸ２．２の発現を減少させるために使用してもよい。さらに
、本方法は、ＳＯＸ２とアルブミン発現を抑制するために使用してもよい。甲状腺ホルモ
ンは、Ｔ３であってよい。本方法はまた、Ｔ３及びＡＬＫ５阻害剤を補充した培地で培養
されない細胞と比較して、ＨＢ９発現を増強するために使用してもよい。さらに、本方法
は、膵臓内胚葉／内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を、Ｔ３．Ｔ４
を補充した培地中で培養することによって、β細胞に特徴的なマーカーを発現している細
胞の形成を含む。本発明は、本明細書で記述した表Ｉ〜ＩＩＩにて示した、又は本明細書
で記述した培養条件を使用してよい。
本発明のまた他の実施形態は、Ｔ３／Ｔ４及びＡＬＫ５阻害剤を補充した培地中で細胞
を培養することによって、膵臓前腸前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞、膵
臓内胚葉／内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞、又は膵臓内分泌細胞
に特徴的なマーカーを発現している細胞内の、グルカゴン、ソマトスタチン及びグレリン
をダウンレギュレートする方法である。培地にさらに、ＳＭＯ阻害剤、（ＳＡＮＴ−１の
ような）ＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニスト、レチノイン酸及びアスコルビン酸を補
充してよい。あるいは、培地にさらに、ＳＭＯ阻害剤又はＳＨＨシグナル経路アンタゴニ
スト、レチノイン酸及びアスコルビン酸を補充してよい。とりわけステージ４にて使用し
た時に、培地に好ましくはＦＧＦ７を補充してよい。特定の実施形態において、本方法は
、表Ｉ〜ＩＩＩにて示した、又は本明細書で記述した培養条件を使用する。
とりわけ、特定の実施形態において、細胞を、本発明の方法での使用のために好適な例
示培養条件を示す、以下の表Ｉにて概略を示したように、ステージ４〜ステージ６（すな
わちステージ４とステージ５とステージ６にて、又はステージ４とステージ５にて、又は
ステージ５とステージ６にて、又はステージ４とステージ６にて）処理してよい。特定の
実施形態において、１つのステージ（例えばステージ４）での任意の１つの処理を、他の
ステージ（例えばステージ５）での任意の１つの処理と組み合わせて良い。（例えばステ
ージ４）は、他のステージ（例えばステージ５）での任意の１つの処理と組み合わせてよ
い。
他の実施形態において、本発明は、多能性幹細胞から由来する細胞を、膵臓内分泌β細
胞に特徴的なマーカー、並びにＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１及びＨＢ９を発現している細胞へ
分化させるための、インビトロ細胞培養液を提供する。本細胞培養液は培養容器と、分化
培地と、多能性幹細胞から由来した分化した細胞の集団と、を含む。本細胞培養液は、分
化した細胞の集団を提供し、そこで、少なくとも１０％の分化した細胞がＰＤＸ１、ＮＫ
Ｘ６．１及びＨＢ９を発現する。本細胞培養液中で有用な培地が、表Ｉ〜ＩＩＩにて列記
されており、好ましくは、Ｔ３／Ｔ４又はＡＬＫ５阻害剤、又は両方を含む。
Ｔ３が一般に好ましい一方で、他の甲状腺ホルモンを、Ｔ３の代わりに使用してよい。
特に、Ｔ４を、Ｔ３、並びにＴ３とＴ４の好適な類似体の代わりに使用してよい。好適な
甲状腺ホルモン類似体としては、Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．カタログ番号４
５５４から入手可能なＧＣ−１（Ｓｏｂｅｒｔｉｒｏｍｅ）、ＤＩＴＰＡ（３，５−ジヨ
ードチロプロピオン酸）、Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２
００８，１１１：２６２〜２６７及びＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ２０
０３，１００：１００６７〜１００７２にて議論されるＫＢ−１４１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ２００７，１０４：１５４９０〜１５４９５にて議論される
ＭＢ０７３４４、ＰＬｏＳ Ｏｎｏ，２０１０，５ｅ８７２２及びＪ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅ
ｓ ２００９，５０：９３８〜９４４にて議論されるＴ０６８１、及びＰＬｏＳ Ｏｎｅ
，２０１０ ｅ８７２２及びＥｎｄｏｃｒ．Ｐｒａｃｔ．２０１２，１８（６）：９５４
〜９６４にて議論されるＧＣ−２４が挙げられ、これらの開示はその全てが本明細書にて
参照により組み込まれている。Ｔ３、ＡＬＫ５阻害剤、ＳＡＮＴ−１、レチノイン酸、ア
スコルビン酸、ＦＧＦ７、ＬＤＮ−１９３１８９及びＴＰＢは、各ステージで変化してよ
い。これらの成分の例示好適な範囲を、以下表ＵＩＩで示す。
１つの実施形態において、本発明の方法には、前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発
現している細胞を、ＳＡＮＴ−１、レチノイン酸（「ＲＡ」）、ＦＧＦ７、ＬＤＮ−１９
３１８９、アスコルビン酸及びＴＰＢを補充した培地で、２〜４日間、好ましくは約３日
間、処理して、それらを、膵臓前腸前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に分
化することを含む。特に、ステージ３細胞を、約０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１、約１００
ｎＭ ＲＡ、約２ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ７、約１００ｎＭ ＬＤＮ−１９３１８９及び約０
．２５ｍＭアスコルビン酸、及び約１００ｎＭ ＴＰＢを補充した培地で、３日間処理し
てよい。１つの実施形態において、培地にさらに、約１μＭのＴ３のような、Ｔ３を補充
する。他の実施形態において、培地に、約１μＭ ＡＬＫ５阻害剤のような、ＡＬＫ５阻
害剤を補充してよい。
他の実施形態において、本発明の方法には、膵臓前腸前駆細胞に特徴的なマーカーを発
現している細胞を、ＳＡＮＴ−１、ＲＡ、アスコルビン酸及びＡＬＫ５阻害剤を補充した
培地で、約２〜３日間処理して、この細胞を、膵臓内胚葉／内分泌前駆細胞に特徴的なマ
ーカーを発現している細胞に分化させることが含まれる。特定の実施形態において、培地
にはさらにＴ３を補充してよい。１つの実施形態において、約０．２５μＭ ＳＡＮＴ−
１、約５０ｎＭ ＲＡ、約０．２５ｍＭアスコルビン酸及び約５００ｎＭ ＡＬＫ５阻害
剤を補充した培地で細胞を処理することによって、ステージ４細胞が、ステージ５細胞ま
で分化する。他の実施形態において、ステージ４細胞はさらに、約０．２５μＭ ＳＡＮ
Ｔ−１、約５０ｎＭ ＲＡ、約０．２５ｍＭアスコルビン酸、約１μＭ ＡＬＫ５阻害剤
及び０〜１０００（例えば、１００）ｎＭ Ｔ３／Ｔ４を補充した培地で細胞を、約２〜
４日間、好ましくは約３日間、処理することによって、ステージ５細胞まで分化する。１
００）ｎＭ Ｔ３／Ｔ４を補充した培地で細胞を、約２〜４日間、好ましくは約３日間、
処理することによって１つの実施形態において、本明細書の実施形態にしたがって誘導し
たステージ４細胞を使用し、ステージ５細胞まで分化させ、一方他の実施形態において、
他のプロトコールにしたがって誘導したステージ４細胞を使用してよい。
本発明の１つの実施形態において、膵臓内胚葉／内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを
発現している細胞を、ＳＡＮＴ−１、ＲＡ、アスコルビン酸及び（１）Ｔ３／Ｔ４又は（
２）Ｔ３／Ｔ４とＡＬＫ５阻害剤いずれかを補充した培地で、約２〜４日間、好ましくは
約３日間、これらを処理することによって、膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現し
ている細胞に分化させる。例えば、ステージ５細胞を、約０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１、
約５０ｎＭ ＲＡ、約０．２５ｍＭアスコルビン酸、及び約１μＭのＴ３／Ｔ４を補充し
た培地での、３日間の処理によって、ステージ６細胞まで分化させてよい。あるいは、ス
テージ５細胞を、約０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１、約５０ｎＭ ＲＡ、約０．２５ｍＭア
スコルビン酸、約５００ｎＭ ＡＬＫ５阻害剤及び１０ｎＭ Ｔ３／Ｔ４を補充した培地
での、約３日間の処理によって、ステージ６細胞まで分化させてよい。あるいは、ステー
ジ５細胞を、約０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１、約５ｎ０ｎＭ ＲＡ、約０．２５ｍＭアス
コルビン酸、約１μＭ ＡＬＫ５阻害剤及び０〜１０００ｎＭ Ｔ３／Ｔ４を補充した培
地での、約３日間の処理によって、ステージ６細胞に分化させてよい。細胞をさらに、望
むように、例えば合計約１５日間、そのような培地中で培養してよい。
１つの実施形態において、本発明の実施形態にしたがって誘導したステージ５細胞を使
用し、ステージ６細胞に分化させ、一方他の実施形態において、他のプロトコールにした
がって誘導したステージ５細胞を使用してもよい。
本発明の１つの態様は、Ｔ３／Ｔ４又はＡＬＫ５阻害剤、又はその組合せを含む培地中
、ステージ４〜ステージ６細胞を処理することによって、ＨＢ９の発現を増強する方法を
提供する。ステージ４、ステージ５及びステージ６細胞は、それぞれ、膵臓前腸前駆細胞
、膵臓内胚葉／内分泌前駆細胞、及び膵臓内分泌細胞であってよい。いくつかの実施形態
において、処理した細胞集団は、未処理培養液の少なくとも２倍のＨＢ９タンパク質を発
現する。他の実施形態において、インスリンの発現レベルは、未処理培養液と比較して、
処理培養液中で正に影響を受ける。しかしながら、ソマトスタチン、グレリン及びグルカ
ゴンの発現は、処理対未処理培養液で減少する。追加の実施形態において、ステージ５細
胞は、ＣＤＸ２又はＳＯＸ２を実質的に発現しない。
さらなる実施形態において、本発明は、ステージ４〜ステージ６細胞を、ＮＫＸ６．１
、ＰＤＸ１及びＨＢ９タンパク質に対して陽性の膵臓内胚葉系統細胞の集団を発生させる
のに十分な量のＴ３／Ｔ４又はＡＬＫ５阻害剤、又はこれらの組合せを含む培地中で培養
することを含む、多能性細胞を分化する段階的方法に関する。他の実施形態において、少
なくとも５％のＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１共陽性細胞が、ＨＢ９タンパク質を発現する。
また他の実施形態において、少なくとも１０％のＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１共陽性細胞が
、ＨＢ９タンパク質を発現する。また他の実施形態において、少なくとも２０％のＰＤＸ
１及びＮＫＸ６．１共陽性細胞が、ＨＢ９タンパク質を発現する。他の実施形態において
、少なくとも３０％のＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１共陽性細胞が、ＨＢ９タンパク質を発現
する。他の実施形態において、少なくとも４０％のＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１共陽性細胞
が、ＨＢ９タンパク質を発現する。他の実施形態において、少なくとも５０％のＰＤＸ１
及びＮＫＸ６．１共陽性細胞が、ＨＢ９タンパク質を発現する。他の実施形態において、
少なくとも６０％のＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１共陽性細胞が、ＨＢ９タンパク質を発現す
る。他の実施形態において、少なくとも７０％のＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１共陽性細胞が
、ＨＢ９タンパク質を発現する。他の実施形態において、少なくとも８０％のＰＤＸ及び
ＮＫＸ６．１共陽性細胞が、ＨＢ９タンパク質を発現する。また他の実施形態において、
少なくとも９０％のＰＤＸ及びＮＫＸ６．１共陽性細胞が、ＨＢ９タンパク質を発現する
。他の実施形態において、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％
、９７％、９８％又は９９％のＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１共陽性細胞が、ＨＢ９タンパク
質を発現する。
いくつかの実施形態において、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１及びＨＢ９タンパク質陽性細胞
からなる膵臓内胚葉系統細胞集団を、機能的膵臓内分泌細胞へのさらなるインビボ成熟化
のために、糖尿病動物へ移植する。他の実施形態において、本発明はまた、本発明の方法
によって調製した、インスリン及びＮＫＸ６．１発現細胞を包含する。また他の実施形態
において、本発明は、多能性幹細胞のような前駆細胞を、ＨＢ９を発現している膵臓内胚
葉系統の細胞へ分化する段階的工程を包含する。本発明の方法は、１つ又は２つ以上のこ
れらの段階を含む。特に、本方法は、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している
細胞へ、多能性幹細胞を分化させる段階を包含する。本段階は、およそ３日間かかる場合
がある。これらの細胞を次いで、適切な条件下で細胞を培養することによって、腸管細胞
に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる。１つの実施形態において、細胞を
、およそ２日間培養する。腸管細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を次いで、前
腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる。この分化は、およそ
２日間、細胞を培養することによって達成してよい。さらなる実施形態において、多能性
幹細胞は、ヒト胚性多能性幹細胞である。
これらの細胞を次いで、膵臓前腸前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に分
化させ、続いて膵臓内胚葉／内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に分
化させてよく、次いで膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させ
てよい。ＨＢ９を発現している膵臓内胚葉系統細胞への分化を達成するために、膵臓前腸
前駆細胞、及び膵臓内胚葉／内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を、
アクチビン受容体阻害剤（好ましくはＡＬＫ５阻害剤）及び／又はＴ３／Ｔ４甲状腺ホル
モンの１つ又は２つ以上と共に培養してよい。１つの実施形態において、膵臓前腸前駆細
胞、及び膵臓内胚葉／内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を、Ｔ３／
Ｔ４と培養する。他の実施形態において、膵臓前腸前駆細胞、及び膵臓内胚葉／内分泌前
駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を、アクチビン受容体阻害剤と培養する。
他の実施形態において、細胞を、アクチビン受容体阻害剤と、Ｔ３／Ｔ４両方と培養する
。本発明の方法は、ＨＢ９を発現している膵臓内胚葉系統の細胞へ分化可能でありうる任
意の細胞に好適である。表ＩＩＩは、本発明の方法の実施形態での利用に好適な例示培養
条件を図示している。以下表ＩＩＩにて使用するように、「ＭＣＸ」は、ＭＸＣ化合物で
あり、「ＡＡ」はアクチビンであり、「ＡＬＫ５ ｉｎｈ．」は、ＡＬＫ５阻害剤であり
、「ＲＡ］はレチノイン酸であり、「Ｖｉｔ．Ｃ」はアスコルビン酸であり、「ｉｎｈ．
」は阻害剤であり、「ａｃｔ」はアクチベータである。特定の実施形態において、１つの
ステージ（例えばステージ１、２、３、４、５又は６のいずれか１つ）での処理のいずれ
か１つを、他のステージ（例えば、ステージ１、２、３、４、５又は６のいずれか１つ）
でのいずれか１つの処理と組み合わせて良い。
以下余白
１つの実施形態において、本発明は、ＡＬＫ５阻害剤を含む培地中の、膵臓内胚葉系統
細胞の集団を培養することによる、ＨＢ９の発現を増強する方法を提供する。いくつかの
実施形態において、膵臓内胚葉系統細胞の集団は、ＣＤＸ２又はＳＯＸ２を実質的に発現
しない。他の実施形態において、膵臓内胚葉系統細胞の集団は、多能性細胞の段階的な分
化によって得る。追加の実施形態において、多能性細胞は、ヒト胚性多能性細胞である。
１つの実施形態において、本発明は、ＡＬＫ５阻害剤を含む培地中、膵臓内胚葉系統細
胞の集団を培養することによる、ＨＢ９の発現を増強する方法を提供する。いくつかの実
施形態において、膵臓内胚葉系統細胞の集団を、多能性細胞の段階的分化によって得る。
いくつかの実施形態において、多能性細胞は、ヒト胚性多能性細胞である。
好ましい実施形態において、本発明は、ＡＬＫ５阻害剤とＴ３を含む培地中、膵臓内胚
葉系統細胞の集団を培養することによる、ＨＢ９の発現を増強する方法に関する。いくつ
かの実施形態において、膵臓内胚葉系統細胞の集団を、多能性細胞の段階的分化によって
得る。追加の実施形態において、多能性細胞は、ヒト胚性多能性細胞である。
他の実施形態において、本発明は、十分な量のＴ３、ＡＬＫ５阻害剤又はその組合せを
含む培地中でそのような細胞を処理することによる、ＰＤＸ及びＮＫＸ６．１共発現細胞
中のＨＢ９の発現を増強する方法に関する。
本発明の１つの実施形態は、（ａ）多能性肝細胞を培養することと、（ｂ）多能性幹細
胞を、前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化することと、（ｃ）
Ｔ３／Ｔ４、又はＡＬＫ５阻害剤、又は両方を補充した培地での処理によって、前腸内胚
葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を、β細胞に特徴的なマーカーを発現して
いる細胞に分化することと、の段階を含む、多能性幹細胞からβ細胞に特徴的なマーカー
を発現している細胞を製造するための方法である。得られた細胞は、ＮＫＸ６．１、ＰＤ
Ｘ１及びＨｂ−９に対して陽性であってよい。本方法は、膵臓内胚葉前駆細胞に特徴的な
マーカーを発現している、ＮＫＸ６．１陽性細胞中の、ＨＢ９陽性細胞の数を増強するた
めに使用してよい。本方法は、ＮＫＸ２．２の発現を減少させるために使用してもよい。
さらに、本方法は、ＳＯＸ２及びアルブミン発現を抑制する。さらに、本方法は、インス
リンを発現している細胞の収率を増加させるために使用してよい。
１つの実施形態において、Ｔ３を使用する。本方法には、Ｔ３及びＡＬＫ５阻害剤を補
充した培地中で細胞を培養することが含まれてよい。本方法はまた、Ｔ３及びＡＬＫ５阻
害剤を補充した培地で培養しない細胞と比較して、ＨＢ９発現を増強してよい。培地はま
た、任意の１つ又は２つ以上（例えば１、２、３又は全て）のＳＭＯ阻害剤、（ＳＡＮＴ
−１のような）ＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニスト、レチノイン酸及びアスコルビン
酸と補充してよい。１つの実施形態において、本方法は、ＡＬＫ５阻害剤をさらに補充し
ても良い、Ｔ３を補充した培地中、膵臓内胚葉／内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発
現している細胞を培養することによる、β細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を
提供する。
本発明の他の実施形態は、Ｔ３／Ｔ４、ＡＬＫ５阻害剤又は両方を補充した培地での処
理による、腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を、β細胞に特徴的なマ
ーカーを発現している細胞へ分化することを含む、β細胞に特徴的なマーカーを発現して
いる細胞を提供する方法である。特定の実施形態において、培地にさらに、ＢＭＰ受容体
阻害剤とＰＫＣアクチベータを補充する。得られた細胞は、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１及び
Ｈｂ−９に対して好ましくは陽性である。本方法は、ＮＫＸ６．１陽性膵臓内胚葉前駆細
胞中のＨＢ９陽性細胞の数を増強し、ＮＫＸ２．２の発現を減少させ、及び／又はＳＯＸ
２及びアルブミン発現を抑制するために使用してよい。好ましい実施形態において、Ｔ３
を使用する。本方法はまた、Ｔ３とＡＬＫ５阻害剤を補充した培地中で細胞を培養するこ
とを含んでよい。本方法はまた、Ｔ３及びＡＬＫ５阻害剤を補充した培地で培養しない細
胞と比較した時に、ＨＢ９発現を増強してもよい。さらに、本方法には、Ｔ３及び任意に
ＡＬＫ５阻害剤を補充した培地中の膵臓内胚葉／内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発
現している細胞を培養することによる、β細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞の
形成が含まれてよい。
本発明のまた他の実施形態は、Ｔ３／Ｔ４及びＡＬＫ５阻害剤を補充した培地中、膵臓
前腸前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を培養することによる、ＨＢ９発現
を増加させ、ＳＯＸ２とアルブミン発現を抑制する方法である。本発明の他の実施形態は
、Ｔ３／Ｔ４及びＡＬＫ５阻害剤を補充した培地中で細胞を培養することを含む、膵臓前
腸前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞、膵臓内胚葉／内分泌前駆細胞に特徴
的なマーカーを発現している細胞、又は内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細
胞中の、グルカゴン、ソマトスタチン及びグレリンをダウンレギュレートする方法である
。培地にはさらに、１つ又は２つ以上のＳＭＯ阻害剤、（ＳＡＮＴ−１のような）ＳＨＨ
シグナル伝達アンタゴニスト、レチノイン酸及びアスコルビン酸を補充してよい。１つの
実施形態において、細胞は、ステージ４細胞であり、培地にさらに、ＦＧＦ７が補充され
る。
本発明はまた、本発明の方法によって得ることが可能な細胞、又は細胞の集団を提供す
る。本発明はまた、本発明の方法によって得た細胞、又は細胞の集団を提供する。
本発明は、処置方法を提供する。とりわけ、本発明は、糖尿病を患っている、又発達す
るリスクのある患者を処置する方法を提供する。
本発明はまた、処置方法での使用のための、本発明の方法によって得ることが可能、も
しくは得た細胞又は細胞の集団を提供する。特に、本発明は、糖尿病を患っている、又は
発達するリスクのある患者を処置する方法における使用のための、本発明の方法によって
得ることが可能、もしくは得た細胞又は細胞の集団を提供する。
糖尿病は１型、又は２型糖尿病であってよい。
１つの実施形態において、処置法には、患者に、本発明の方法によって得た、又は得る
ことが可能な細胞を移植することが含まれる。
１つの実施形態において、処置方法には、例えば本明細書で記述するように、多能性幹
細胞をインビトロにて、ステージ１、ステージ２、ステージ３、ステージ４、ステージ５
又はステージ６細胞に分化させることと、患者に、分化した細胞を移植することと、が含
まれる。
１つの実施形態において、本発明はさらに、多能性幹細胞を分化させる段階の前に、例
えば、本明細書で記述したように、多能性幹細胞を培養する段階を含む。
１つの実施形態において、方法にはさらに、移植の段階の後、インビボで、細胞を分化
させる段階が含まれる。
１つの実施形態において、患者は哺乳動物、好ましくはヒトである。
１つの実施形態において、細胞を、分散した細胞として移植してよく、又は肝門脈内に
浸出してよいクラスタを形成してよい。あるいは細胞は、生体適合性の分解性ポリマー支
持体、多孔性の非分解性デバイス内に提供されてもよく、又は宿主免疫応答から保護され
るよう封入されてもよい。細胞は、レシピエント内の適切な部位内に埋め込まれてもよい
。埋め込み部位としては、例えば肝臓、天然の膵臓、腎被膜下空間、網、腹膜、漿膜下空
間、腸、胃、又は皮下ポケットが挙げられる。
インビボにて、移植した細胞のさらなる分化、生存又は活性を増強するために、増殖因
子、抗酸化剤又は抗炎症剤のような追加因子を、細胞の投与前、同時又は後に投与可能で
ある。これらの因子は、内在性細胞により分泌され、投与された細胞にインサイチューで
曝露されてもよい。埋め込まれた細胞には、当該技術分野で既知の内因性の及び外因性の
投与された増殖因子の任意の組み合わせにより、分化を誘発させることもできる。
埋め込みに使用する細胞の量は、患者の状態及び治療に対する応答を含む、いくつかの
様々な因子に基づいて当業者により決定され得る。
１つの実施形態において、処置方法にはさらに、移植の前の、三次元支持体内への細胞
の組込が含まれる。細胞は、患者に埋め込む前に、インビトロでこの支持体上に維持して
もよい。あるいは細胞を含む支持体を、インビトロでさらに培養することなく直接患者に
埋め込んでもよい。支持体は、場合により、埋め込まれた細胞の生存及び機能を亢進する
少なくとも１つの医薬品を組み込んでもよい。
本文書を通して引用した発行物は、その全てが参照により本明細書に組み込まれている
。本発明はさらに、以下の実施例によってさらに例示されるが、これに限定はされない。
（実施例１）
ヒト多能性細胞から由来した膵臓内胚葉集団を産出している先に発行されたプロトコールは、実質的にＨＢ９タンパク質を発現しない。
本例は、本実施例にて記述したような多能性幹細胞から由来する細胞中のＨＢ９の発現パターンの同定を指向する。ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（継代４０）の細胞を、１０μＭのＹ２７６３２（Ｒｏｃｋ阻害剤、カタログ番号Ｙ０５０３、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を補充したＭＴＥＳＲ（（登録商標））１培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｎｄａ）中のＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：３０希釈；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）−コートディッシュ上に、１×１０5細胞／ｃｍ2にて、単一細胞として播いた。播種４８時間後、培養液を、不完全ＰＢＳ（Ｍｇ又はＣａなしのリン酸緩衝食塩水）で洗浄した。培養液を次いで、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、６１，２０１６，２０１２にて先に記述されたように、膵臓内胚葉／内分泌前駆細胞に分化された。使用した分化プロトコールは以下のようであった。
ａ．１：３０ ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）コート表面上にプレートした未分化Ｈ１細胞の６０〜７０％コンフルエント接着培養液を、０．２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｕｔａｈ）、１００ｎｇ／ｍｌアクチビン−Ａ（ＡＡ；Ｐｅｐｒｏ−ｔｅｃｈ；Ｒｏｃｈｙ Ｈｉｌｌ，ＮＪ）及び２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３Ａ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、１日目のみ曝露した。次の２日間、細胞を、０．５％ ＦＢＳと１００ｎｇ／ｍｌ ＡＡを含むＲＰＭＩ中で培養した。
ｂ．（ａ）から得られた細胞を、２％ ＦＢＳと５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ７（Ｐｅｐｒｏ−ｔｅｃｈ）を補充したＤＭＥＭ−Ｆ１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、３日間曝露した。
ｃ．（ｂ）から得られた培養液を、０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、２μＭレチノイン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１００ｎｇ／ｍｌのＮｏｇｇｉｎ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）及び１％（ｖ／ｖ）の、商標Ｂ２７（（登録商標））の下売られている栄養補助物（カタログ番号：１７５０４０４４，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を補充した、ＤＭＥＭ−ＨＧ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、４日間続けた。
ｄ．（ｃ）から得られた細胞を、単層フォーマットにて、１μＭ ＡＬＫ５阻害剤（ＡＬＫ５ｉ；Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）、１００ｎｇ／ｍＬのＮｏｇｇｉｎ、５０ｎＭ ＴＰＢ（（２Ｓ，５Ｓ）−（Ｅ，Ｅ）−８−（５−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）−２，４−ペンタジエノイルアミノ）ベンゾラクタム、ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ ＮＪ）及び１％ Ｂ２７で補充したＤＭＥＭ−ＨＧ培地中で３日間培養した。培養の最後の日のために、細胞を５ｍｇ／ｍＬジスパーゼで５分間処理し、続いて穏やかにピペッティングして、混合し、細胞塊（１００ミクロン未満）に破壊した。細胞クラスタを、使い捨てポリスチレン１２５ｍｌ Ｓｐｉｎｎｅｒ Ｆｌａｓｋ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移し、１μＭ ＡＬＫ５阻害剤、１００ｎｇ／ｍｌ Ｎｏｇｇｉｎ及び１％ Ｂ２７を補充したＤＭＥＭ−ＨＧを含む懸濁液中、終夜８０〜１００ｒｐｍにて回転させた。
（ｄ）の最後に、ｍＲＮＡを、関連する膵臓内胚葉／内分泌遺伝子のＰＣＲ解析のために回収した。トータルＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ（（登録商標））Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ；Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で抽出し、製造業者の説明書にしたがって、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて逆転写した。ｃＤＮＡを、カスタムＴａｑｍａｎ（（登録商標））Ａｒｒａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上へ前もってロードしたＴａｑｍａｎ（（登録商標）） Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ ＭｉｘとＴａｑｍａｎ（（登録商標））Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓを用いて増幅した。データを、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて解析し、ΔΔＣｔ法（すなわち、内部標準で補正したｑＰＣＲ結果（ΔΔＣｔ＝ΔＣｔ試料−ΔＣｔreference））を用いて、未分化ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞に対して標準化した。全てのプライマーは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入された。ＦＡＣＳ及び免疫蛍光解析を、先に記述された（Ｄｉａｂｅｔｅｓ，６１，２０１２６，２０１２）ように実施した。ＨＢ９抗体は、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｏｗａ，Ｉｏｗａ）から得た。実施例で使用したように、Ｙ２７６３２（（１Ｒ，４ｒ）−４−（（Ｒ）−１−アミノエチル）−Ｎ−（ピリジン−４−イル）シクロヘキサンカルボキシアミド）は、細胞透過性低分子Ｒｈｏ−関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤である。
図１Ａ〜図１Ｃは、実施例１に概要を示したように、膵臓内胚葉／内分泌前駆体に分化
したヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析か
らのデータを記述している。ＰＤＸ１（図１Ａ）、ＮＫＸ６．１（図１Ｂ）及びＨＢ９（
図１Ｃ）。図１で示すように、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１及びＨＢ９の強力なｍＲＮＡ発現
がこれらの培養液中で検出された。さらに、ＨＢ９のｍＲＮＡ発現が、ヒト死体小島と比
較して、これらの細胞において等しいか、より高かった。しかしながら、図２にて示した
ように、ＰＤＸ１とＮＫＸ６．１に対する遺伝子発現データが、ＦＡＣＳ解析によって測
定されるように、相当するタンパク質の高発現と一致した一方で、ＨＢ９のｍＲＮＡ発現
は、ＨＢ９のタンパク質発現と不一致であった。（ｄ）の完了に続く日、すなわち５日目
に、およそ１％の細胞が、ＨＢ９に対して陽性であり、一方でおよそ５０％の細胞が、Ｎ
ＫＸ６．１陽性であり、およそ９０％がＰＤＸ１陽性であった。細胞クラスタの免疫染色
が又、ＦＡＣＳデータを確認した。図３Ａ〜Ｂにて示すように、有意な数のＮＫＸ６．１
陽性細胞と、わずかなインスリン陽性細胞がクラスタ内に存在した。しかしながら、免疫
染色によって検出されたＨＢ９陽性細胞は存在しなかった（図３Ｂ）。
（実施例２）
ステージ４〜ステージ６でのＴ３の添加は、ＨＢ９陽性細胞の数を増強する
本実施例は、ＨＢ９陽性細胞の数を有意に増強するための、ステージ４〜ステージ６で
のＴ３の添加を指向する。
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（継代４０）の細胞を、１０μＭのＹ２７６３２を補充した、ｍＴｅＳＲ（（登録商標））１培地中、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：３０希釈；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）−コートディッシュ上で、１×１０5細胞／ｃｍ2にて、単一細胞として播いた。播種４８時間後、培養液を、不完全ＰＢＳ（Ｍｇ又はＣａなしのリン酸緩衝食塩水）で洗浄した。培養液を次いで、以下に概要を記したプロトコールによって、膵臓内胚葉／内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化した。
ａ．ステージ１（３日間）：幹細胞を、２％脂肪酸フリーＢＳＡ（Ｐｒｏｌｉａｎｔ、カタログ番号６８７００）、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ３１８７）、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号３５０５０−０７９）、４．５ｍＭ Ｄ−グルコース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｇ８７６９）、１００ｎｇ／ｍｌ ＧＤＦ８（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）及び１μＭ ＭＣＸ化合物を補充した、ＭＣＤＢ−１３１培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１０３７２−０１９）中で１日培養した。細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭ Ｄ−グルコース、１００ｎｇ／ｍｌ ＧＤＦ８及び０．１μＭ ＭＣＸ化合物を補充したＭＣＤＢ−１３１培地中、さらに１日培養した。細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭ Ｄ−グルコース及び１００ｎｇ／ｍｌ ＧＤＦ８を補充したＭＣＤＢ−１３１培地中、さらに１日培養した。
ｂ．ステージ２（２日間）：ステージ１細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭ Ｄ−グルコース、０．２５ｍＭアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）及び２５ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ７（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）を補充したＭＣＤＢ−１３１培地で２日間処理した。
ｃ．ステージ３（２日間）：ステージ２細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘ（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）Ｉｎｓｕｌｉｎ，−Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ−Ｓｅｌｅｎｉｕｍ−Ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａ）の１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１７ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）、１μＭ ＲＡ（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）、２５ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ７、０．２５ｍＭアスコルビン酸、２００ｎＭ ＴＰＢ（ＰＫＣアクチベータ、カタログ番号５６５７４０、ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）及び１００ｎＭ ＬＤＮ（ＢＭＰ受容体阻害剤、カタログ番号０４−００１９、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）を補充したＭＣＤＢ−１３１培地で、２日間処理した。
ｄ．ステージ４（３日間）：ステージ３細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１７ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１、１００ｎＭ ＲＡ、２ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ７、１００ｎＭ ＬＤＮ−１９３１８９、０．２５ｍＭアスコルビン酸、及び１００ｎＭ ＴＰＢを補充したＭＣＤＢ−１３１培地で、３日間処理した。
ｅ．ステージ５（３日間）：ステージ４細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１５ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１、５０ｎＭ ＲＡ、０．２５ｍＭアスコルビン酸、および５００ｎＭ ＡＬＫ５阻害剤ＳＤ２０８を補充した、ＭＣＤＢ−１３１培地で、３日間処理した。ＳＤ２０８は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ２００７，７２：１５２−１６１に開示された、式Ｉの構造を有する、（２−（５−クロロ−２−フルオロフェニル）プテリジン−４−イル］ピリジン−４−イル−アミン）である。ＳＤ２０８は、２，４−二置換プテリジン、ＴＧＦ−βＲＩキナーゼのＡＴＰ−競合阻害剤である。
ｆ．ステージ６（３〜１５日間）：ステージ５細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１５ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１、５０ｎＭ ＲＡ、０．２５ｍＭアスコルビン酸を補充したＭＣＤＢ−１３１培地で、３日間処理した。
いくつかの培養液にて、１μＭ Ｔ３（Ｔ６３９７、Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）を、ステージ
４〜６に加えた。ステージ４〜６の最後に、対照と処理した培養液を、ＦＡＣＳと免疫染
色によって解析した。さらに、ｍＲＮＡを、ステージ２〜６で、対照と処理した培養液に
対して回収した。
図４は、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１及びＨＢ９に対する、ステージ４（図４Ａ）、ステージ５（図４Ｂ）及びステージ６（図４Ｃ）でのＦＡＣＳデータを描写している。実施例１からのデータと一致して、ステージ４〜６で、実質的な数のＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１陽性細胞が存在したけれども、ＨＢ９の発現は非常に低かった。ステージ５にてピークとなったＨＢ９に対する発現は、ステージ６で減少した。全体として、実施例２にて概要を記したプロトコールを用いて発生した細胞に対するＨＢ９の発現は、実施例１にて概要を記したプロトコールを用いて発生した細胞と比較してより高かった。図５Ａは、ステージ２〜６での、ヒト膵島と比較して、ＨＢ９のｍＲＮＡ発現を示す。実施例１と同様に、ステージ３〜４でのＨＢ９のｍＲＮＡ発現レベルがヒト膵島と等価であったけれども、ＨＢ９タンパク質発現がステージ４にて非常に低かった（図５Ｂ）。
図６Ａ〜６Ｊは、実施例２にて概要を説明したようにステージ４で分化し、ステージ４のみ、ステージ４〜ステージ５、又はステージ４〜ステージ６で処理した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１中の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＮＫＸ６．１（図６Ａ）、ＰＤＸ１（図６Ｂ）、ＮＫＸ２．２（図６Ｃ）、グルカゴン（図６Ｄ）、インスリン（図６Ｅ）、ソマトスタチン（図６Ｆ）、ＣＤＸ２（図６Ｇ）、アルブミン（図６Ｈ）、ガストリン（図６Ｉ）及びＳＯＸ２（図６Ｊ）。ステージ４〜６でのＴ３の添加は、グルカゴン、ソマトスタチン及びグレリンを有意にダウンレギュレートし、一方で、ステージ５にてインスリン発現が穏やかに増加した。ステージ４〜６でのＴ３の添加は、ＮＫＸ２．２の発現を有意に減少させたように見え、一方でＮＫＸ６．１とＰＤＸ１発現に明確な影響は無かった。さらに、Ｔ３添加は、ＳＯＸ２（胃マーカー）及びアルブミン（肝マーカー）発現を抑制する一方で、ＣＤＸ２（腸マーカー）発現に影響は無かった。ステージ６での対照及び処理した培養液の免疫染色は、ステージ６での対照（図７Ａ）と比較して、Ｔ３処理群（図７Ｂ）中のＨＢ９陽性細胞の数での有意な増加を明らかにした。さらに、増加量のＮＫＸ６．１陽性細胞が、Ｔ３処理培養液中のＨＢ９の発現を示した。
（実施例３）
ステージ６でのＴ３とＡＬＫ５阻害剤での組合せ処理は、ＨＢ９の発現を増強する
本実施例は、ステージ６での培地中の、ＡＬＫ５阻害剤とＴ３の組合せが、ＨＢ９の発現を有意にブーストすることが明らかであることを実証する。
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（継代４０）の細胞を、１０μＭのＹ２７６３２を補充した、ｍＴｅＳＲ（（登録商標））１培地中、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：３０希釈；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）−コートディッシュ上で、１×１０5細胞／ｃｍ2にて、単一細胞として播いた。播種４８時間後、培養液を、不完全ＰＢＳ（Ｍｇ又はＣａなしのリン酸緩衝食塩水）で洗浄した。培養液を次いで、以下に概要を記したプロトコールによって、膵臓内胚葉／内分泌系統に分化した。
ａ．ステージ１（３日間）：細胞を、２％脂肪酸フリーＢＳＡ（Ｐｒｏｌｉａｎｔ、カタログ番号６８７００）、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ３１８７）、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号３５０５０−０７９）、４．５ｍＭ Ｄ−グルコース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｇ８７６９）、１００ｎｇ／ｍｌ ＧＤＦ８（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）及び１μＭ ＭＣＸ化合物を補充した、ＭＣＤＢ−１３１培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１０３７２−０１９）中で１日間培養した。細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭ Ｄ−グルコース、１００ｎｇ／ｍｌ ＧＤＦ８及び０．１μＭ ＭＣＸ化合物を補充したＭＣＤＢ−１３１培地中、さらに１日培養した。細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭ Ｄ−グルコース及び１００ｎｇ／ｍｌ ＧＤＦ８を補充したＭＣＤＢ−１３１培地中、さらに１日培養した。
ｂ．ステージ２（２日間）：ステージ１細胞を、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭ Ｄ−グルコース、０．２５ｍＭアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）及び２５ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ７（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）を補充したＭＣＤＢ−１３１培地で２日間処理した。
ｃ．ステージ３（２日間）：ステージ２細胞を、ＩＴＳ−Ｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）の１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１７ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）、１μＭ ＲＡ（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）、２５ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ７、０．２５ｍＭアスコルビン酸、２００ｎＭ ＴＰＢ（ＰＫＣアクチベータ、カタログ番号５６５７４０、ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）及び１００ｎＭ ＬＤＮ（ＢＭＰ受容体阻害剤、カタログ番号０４−００１９、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）を補充したＭＣＤＢ−１３１培地で、２日間処理した。
ｄ．図テージ４（３日間）：ステージ３細胞を、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１７ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１、１００ｎＭ ＲＡ、２ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ７、１００ｎＭ ＬＤＮ−１９３１８９、０．２５ｍＭアスコルビン酸、１００ｎＭ ＴＰＢ及び１μＭ Ｔ３を補充したＭＣＤＢ−１３１培地で、３日間処理した。
ｅ．ステージ５（３日間）：ステージ４細胞を、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１５ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１、５０ｎＭ ＲＡ、０．２５ｍＭアスコルビン酸、１μＭ ＡＬＫ５阻害剤ＳＤ２０８及び１００ｎＭのＴ３を補充した、ＭＣＤＢ−１３１培地で、３日間処理した。
ｆ．ステージ６（３〜１５日間）：ステージ５細胞を、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１５ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１、５００ｎＭ ＡＬＫ５阻害剤、５０ｎＭ ＲＡ、０．２５ｍＭアスコルビン酸、及び１０ｎＭ Ｔ３を補充した、ＭＣＤＢ−１３１培地で、３日間処理した。
図８Ａと８Ｂは、ステージ６、７日目でのＮＫＸ６．１とＨＢ９に対する免疫染色を描写している。図８Ｃは、実施例３にて概要を示した、ステージ６まで分化した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の、ＨＢ９の発現のリアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。免疫染色イメージと一緒に、ＨＢ９のｍＲＮＡ発現は、ＡＬＫ５阻害剤とＴ３への延長した曝露が、ＮＫＸ６．１の強力な発現を維持する一方で、ＨＢ９の発現を有意に増強するように見えることを示す。図９Ａ及び９Ｂは、それぞれステージ６、５日目及び１５日目でのＦＡＣＳデータを描写している。ステージ６細胞の有意な画分は、ステージ６、１５日目の培養液中、ＨＢ９の発現を示す。
（実施例４）
用量依存様式でのＴ３は、ＨＢ９の発現を増強する
本実施例は、用量依存様式でのＴ３が、ステージ６でのＮＫＸ６．１の発現を維持する一方で、ＨＢ９の発現を増強するために使用してよいことを示す。ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（継代４０）の細胞を、１０μＭのＹ２７６３２を補充した、ｍＴｅＳＲ（（登録商標））１培地中、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：３０希釈；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）−コートディッシュ上で、１×１０5細胞／ｃｍ2にて、単一細胞として播いた。播種の４８時間後に、培養物は、不完全なＰＢＳ（Ｍｇ又はＣａを含まないリン酸緩衝生理食塩水）中で洗浄した。培養液を次いで、以下に概要を記したプロトコールによって、膵臓内胚葉／内分泌前駆細胞の特徴であるマーカーを発現している細胞に分化した。
ａ．ステージ１（３日間）：細胞を、２％脂肪酸フリーＢＳＡ（Ｐｒｏｌｉａｎｔ、カタログ番号６８７００）、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ３１８７）、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号３５０５０−０７９）、４．５ｍＭ Ｄ−グルコース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｇ８７６９）、１００ｎｇ／ｍｌ ＧＤＦ８（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）及び１μＭ ＭＣＸ化合物を補充した、ＭＣＤＢ−１３１培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ カタログ番号１０３７２−０１９）中で１日間培養した。細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭ Ｄ−グルコース、１００ｎｇ／ｍｌ ＧＤＦ８及び０．１μＭ ＭＣＸ化合物を補充したＭＣＤＢ−１３１培地中、さらに１日培養した。細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭ Ｄ−グルコース及び１００ｎｇ／ｍｌ ＧＤＦ８を補充したＭＣＤＢ−１３１培地中、さらに１日培養した。
ｂ．ステージ２（２日間）：ステージ１細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１× ＧｌｕａｔＭａｘＴＭ、４．５ｍＭ Ｄ−グルコース、０．２５ｍＭアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）及び２５ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ７（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）を補充したＭＣＤＢ−１３１培地で２日間処理した。
ｃ．ステージ３（２日間）：ステージ２細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａ）の１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１７ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）、１μＭ ＲＡ（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）、２５ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ７、０．２５ｍＭアスコルビン酸、２００ｎＭ ＴＰＢ（ＰＫＣアクチベータ、カタログ番号５６５７４０、ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）及び１００ｎＭ ＬＤＮ（ＢＭＰ受容体阻害剤、カタログ番号０４−００１９、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）を補充したＭＣＤＢ−１３１培地で、２日間処理した。
ｄ．ステージ４（３日間）：ステージ３細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１７ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１、１００ｎＭ ＲＡ、２ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ７、１００ｎＭ ＬＤＮ−１９３１８９、０．２５ｍＭアスコルビン酸、及び１００ｎＭ ＴＰＢを補充したＭＣＤＢ−１３１培地で、３日間処理した。
ｅ．ステージ５（３日間）：ステージ４細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１５ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１、５０ｎＭ ＲＡ、０．２５ｍＭアスコルビン酸、１μＭ ＡＬＫ５阻害剤ＳＤ２０８、及び０〜１０００ｎＭ Ｔ３を補充した、ＭＣＤＢ−１３１培地で、３日間処理した。
ｆ．ステージ６（６日間）：ステージ５細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１５ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１、５００ｎＭ ＡＬＫ５阻害剤、５０ｎＭ ＲＡ、０．２５ｍＭアスコルビン酸、及び０〜１０００ｎＭ Ｔ３を補充した、ＭＣＤＢ−１３１培地で、６日間処理した。
図１０Ａ〜１０Ｅは、ステージ６、６日目でのＮＫＸ６．１及びＨＢ９に対する免疫染
色を描写している。用量依存様式でのＴ３は、ＮＫＸ６．１陽性膵臓内胚葉前駆細胞中の
、ＨＢ９陽性細胞の数を有意に増強した。図１１Ａ〜１１Ｌは、実施例４にて概要を記し
たようにステージ６まで分化したヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞中の、以下の遺伝子の発現
の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写している。ＳＯＸ２（図１１Ａ）、ＮＫ
Ｘ６．１（図１１Ｂ）、ＫＮＫＸ２．２（図１１Ｃ）、ガストリン（図１１Ｄ）、ＰＤＸ
１（図１１Ｅ）、ＮＧＮ３（図１１Ｆ）、ＰＡＸ６（図１１Ｇ）、ＰＡＸ４（図１１Ｈ）
、インスリン（図１１Ｉ）、グルカゴン（図１１Ｊ）、グレリン（図１１Ｋ）、及びソマ
トスタチン（図１１Ｌ）。
以上、本発明を、様々な特定の材料、手順及び実施例を参照しながら本明細書に説明及
び例示したが、本発明は、その目的のために選択された特定の材料及び手順の組み合わせ
に限定されない点は理解されるであろう。当業者には認識されるように、このような細部
には多くの変更を行い得ることが示唆される。本明細書及び実施例はあくまで例示的なも
のとしてみなされるべきものであり、発明の真の範囲及び趣旨は以下の「特許請求の範囲
」によって示されるものである。本出願において引用される参照文献、特許及び特許出願
は、いずれもその全てが参照により本明細書にに組み込まれているものとする。
以上、本発明を、様々な特定の材料、手順及び実施例を参照しながら本明細書に説明及び例示したが、本発明は、その目的のために選択された特定の材料及び手順の組み合わせに限定されない点は理解されるであろう。当業者には認識されるように、このような細部には多くの変更を行い得ることが示唆される。本明細書及び実施例はあくまで例示的なものとしてみなされるべきものであり、発明の真の範囲及び趣旨は以下の「特許請求の範囲」によって示されるものである。本出願において引用される参照文献、特許及び特許出願は、いずれもそれらの全容を参照により本明細書に援用するものとする。

以下の態様を包含し得る。
[１]
多能性幹細胞から膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞を産出する方
法であって、
ａ．多能性幹細胞を培養することと、
ｂ．多能性幹細胞を、前腸内胚葉細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞に分化さ
せることと、
ｃ．トリヨードチロニン、チロキシン、トリヨードチロニンの類似体、チロキシンの類
似体及びその混合物から選択される甲状腺ホルモン、又はＡＬＫ５阻害剤、又は甲状腺ホ
ルモンとＡＬＫ５阻害剤両方を補足した培地での処理によって、前腸内胚葉細胞の特徴的
なマーカーを発現している細胞を、膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している細
胞に分化させることと、の段階を含む方法。
[２]
得られる細胞の少なくとも１０パーセントが、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１及びＨＢ９に対
して陽性である、請求項１に記載の方法。
[３]
ＮＫＸ６．１陽性膵臓内胚葉前駆細胞中のＨＢ９の発現を増強する、請求項１に記載の
方法。
[４]
ＮＫＸ２．２の発現を減少させる、請求項１に記載の方法。
[５]
ＳＯＸ２とアルブミン発現を抑制する、請求項１に記載の方法。
[６]
前記甲状腺ホルモンがトリヨードチロニンである、請求項１に記載の方法。
[７]
段階（ｃ）が、トリヨードチロニンとＡＬＫ５阻害剤を補足した培地中で培養すること
を含む、請求項１に記載の方法。
[８]
トリヨードチロニンとＡＬＫ５阻害剤を補足した培地で培養されない細胞に対して、Ｈ
Ｂ９発現を増強する、請求項７に記載の方法。
[９]
前記段階（ｃ）の培地にさらに、ＳＡＮＴ−１、レチノイン酸及びアスコルビン酸を補
足する、請求項１に記載の方法。
[１０]
段階（ｃ）にさらに、トリヨードチロニンを補足した培地中、膵臓内胚葉／内分泌前駆
細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞を培養することによる、膵臓内分泌細胞の特
徴的なマーカーを発現している細胞の形成が含まれる、請求項１に記載の方法。
[１１]
前記培地にさらに、ＡＬＫ５阻害剤を補足する、請求項１０に記載の方法。
[１２]
トリヨードチロニン、チロキシン、トリヨードチロニンの類似体、チロキシンの類似体
及びその混合物から選択される甲状腺ホルモン、又はＡＬＫ５阻害剤、又は甲状腺ホルモ
ンとＡＬＫ５阻害剤両方を補足した培地での処理によって、前腸内胚葉細胞の特徴的なマ
ーカーを発現している細胞を、膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞に
分化させることを含む、膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞を産出す
る方法。
[１３]
得られた細胞の少なくとも１０パーセントが、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１及びＨＢ９に対
して陽性である、請求項１２に記載の方法。
[１４]
ＮＫＸ６．１陽性膵臓内胚葉前駆細胞中のＨＢ９の発現を増強する、請求項１２に記載
の方法。
[１５]
ＮＫＸ２．２の発現を減少させる、請求項１２に記載の方法。
[１６]
ＳＯＸ２及びアルブミン発現を抑制する、請求項１２に記載の方法。
[１７]
前記甲状腺ホルモンが、トリヨードチロニンである、請求項１２に記載の方法。
[１８]
トリヨードチロニンとＡＬＫ５阻害剤を補足した培地中で培養することを含む、請求項
１２に記載の方法。
[１９]
トリヨードチロニンとＡＬＫ５阻害剤を補足した培地で培養されない細胞と比較した時
に、ＨＢ９発現を増強する、請求項１８に記載の方法。
[２０]
さらに、トリヨードチロニンを補足した培地中で、膵臓内胚葉／内分泌前駆細胞の特徴
的なマーカーを発現している細胞を培養することによる、膵臓内分泌細胞の特徴的なマー
カーを発現している細胞の形成が含まれる、請求項１２に記載の方法。
[２１]
前記培地にさらに、ＡＬＫ５阻害剤を補足する、請求項２０に記載の方法。
[２２]
前記培地にさらに、ＢＭＰ受容体阻害剤と、ＰＫＣアクチベータを補足する、請求項１
２に記載の方法。
[２３]
トリヨードチロニンとＡＬＫ５阻害剤を補足する培地中、膵臓前腸前駆細胞の特徴的な
マーカーを発現している細胞を培養することを含む、（ａ）ＨＢ９発現を増加させ、（ｂ
）ＳＯＸ２とアルブミン発現を抑制する、方法。
[２４]
トリヨードチロニンと、ＡＬＫ５阻害剤を補足した培地中で前記細胞を培養することを
含む、膵臓前腸前駆細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞、膵臓内胚葉／内分泌前
駆細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞、又は膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカー
を発現している細胞中の、グルカゴン、ソマトスタチン及びグレリンをダウンレギュレー
トする方法。
[２５]
前記培地にさらに、ＳＡＮＴ−１、レチノイン酸及びアスコルビン酸を補足する、請求
項２４に記載の方法。
[２６]
前記細胞が、膵臓前腸前駆細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞であり、前記培
地にさらに、ＦＧＦ７を補足する、請求項２５に記載の方法。
[２７]
前記ＡＬＫ５阻害剤が、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、ＡＬＫ５ｉ、ＳＤ２０８、ＴＧＦ−Ｂ阻
害剤 ＳＢ４３１５４２、ＩＴＤ−１、ＬＹ２１０９７６１、Ａ８３−０１、ＬＹ２１５
７２９９、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ Ｖ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ Ｉ、ＴＧＦ−β受容
体ｉｎｈ ＩＶ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ ＶＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ ＶＩＩＩ
、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ ＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ ＶＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉ
ｎｈ ＩＩＩからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
[２８]
前記ＡＬＫ５阻害剤が、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩである、請求項２７に記載の方法。
[２９]
前記ＡＬＫ５阻害剤が、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、ＡＬＫ５ｉ、ＳＤ２０８、ＴＧＦ−Ｂ阻
害剤ＳＢ４３１５４２、ＩＴＤ−１、ＬＹ２１０９７６１、Ａ８３−０１、ＬＹ２１５７
２９９、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ Ｖ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ Ｉ、ＴＧＦ−β受容体
ｉｎｈ ＩＶ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ ＶＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ ＶＩＩＩ、
ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ ＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ ＶＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎ
ｈ ＩＩＩからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
[３０]
前記ＡＬＫ５阻害剤が、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩである、請求項２９に記載の方法。
[３１]
前記ＢＭＰ受容体阻害剤が、ＬＤＮ−１９３１８９、Ｎｏｇｇｉｎ及びＣｈｏｒｄｉｎ
から選択され、前記ＰＫＣアクチベータが、ＴＰＢ、ＰＤＢｕ、ＰＭＡ及びＩＬＶから選
択される、請求項２２に記載の方法。
[３２]
ａ．培養容器と、
ｂ．大量の分化培地と、
ｃ．多能性幹細胞から誘導した分化した細胞の集団であって、少なくとも１０パーセン
トの前記分化した細胞が、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１及びＨＢ９を共発現する、分化した細
胞の集団と、を含む多能性幹細胞から誘導した細胞を分化するためのインビトロ細胞培養
。
[３３]
前記分化培地が、トリヨードチロニン、チロキシン、トリヨードチロニンの類似体、チ
ロキシンの類似体及びその混合物から選択される甲状腺ホルモン、又はＡＬＫ５阻害剤、
又は甲状腺ホルモンとＡＬＫ５阻害剤両方を補足した増殖培地を含む、請求項３２に記載
の細胞培養液。
[３４]
前記増殖培地が、ＭＣＤＢ１３１である、請求項３３に記載の細胞培養。
[３５]
前記分化した細胞が、膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞を含む、
請求項３２に記載の細胞培養。
[３６]
前記増殖培地にさらに、１つ又は２つ以上の
ａ．ＭＲＴ１０又はシクロパミンから選択されるスムーズンド受容体阻害剤と、
ｂ．ＳＡＮＴ−１又はＨＰＩ−１から選択されるＳＨＨシグナル伝達経路アゴニストと
、
ｃ．ＬＤＮ−１９３１８９、Ｎｏｇｇｉｎ又はＣｈｏｒｄｉｎから選択されるＢＭＰ受
容体阻害剤と、
ｄ．ＴＰＢ、ＰＤＢｕ、ＰＭＡ及びＩＬＶから選択されるＰＫＣアクチベータと、
ｅ．ＦＧＦ７又はＦＧＦ１０から選択される線維芽細胞増殖因子と、
ｆ．レチノイン酸と、
ｇ．アスコルビン酸と、
ｈ．ヘパリンと、
ｉ．硫酸亜鉛と、が補足される、請求項３３に記載の細胞培養液。
[３７]
前記増殖培地にさらに、ＳＡＮＴ−１、レチノイン酸及びアスコルビン酸を補足する、
請求項３６に記載の細胞培養液。
[３８]
膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している分化した多能性幹細胞の集団を含む
インビトロ細胞培養液であって、少なくとも１０パーセントの前記細胞が、ＨＢ９、ＰＤ
Ｘ１及びＮＫＸ６．１を発現する、インビトロ細胞培養液。
[３９]
ＮＫＸ６．１とＰＤＸ１両方を発現する前記細胞の少なくとも３０パーセントが、ＨＢ
９も発現する、請求項３８に記載の細胞培養液。
[４０]
ＮＫＸ６．１とＰＤＸ１両方を発現する前記細胞の少なくとも５０パーセントが、ＨＢ
９も発現する、請求項３８に記載の細胞培養液。
[４１]
ＮＫＸ６．１とＰＤＸ１両方を発現する前記細胞の少なくとも８０パーセントが、ＨＢ
９も発現する、請求項３８に記載の細胞培養液。
[４２]
膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している前記細胞が、インスリンを産出する
、請求項１に記載の方法。
[４３]
膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している前記細胞が、インスリンを産出する
、請求項１２に記載の方法。
[４４]
前記分化した細胞が、β細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞を含む、請求項３
５に記載の細胞培養液。
[４５]
前記分化した細胞が、インスリンを産出する、請求項４４に記載の細胞培養液。
[４６]
トリヨードチロニン、チロキシン、トリヨードチロニンの類似体、チロキシンの類似体
及びその混合物から選択される甲状腺ホルモン、又はＡＬＫ５阻害剤、又は甲状腺ホルモ
ンとＡＬＫ５阻害剤両方を補足した増殖培地中で、多能性幹細胞から誘導した細胞を培養
することを含む、膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞を産出するため
の方法。
[４７]
多能性幹細胞から誘導した細胞を、約３〜約９日間、前記増殖培地中で培養する、請求
項４６に記載の方法。
[４８]
前記細胞を、甲状腺ホルモンを補足するが、ＡＬＫ５阻害剤は補足しない第一増殖培地
中、約２〜３日間培養し、続いて、得られた細胞集団を、甲状腺ホルモンとＡＬＫ５阻害
剤両方を補足した追加的増殖培地中、約３〜６日間培養する、請求項４７に記載の方法。
[４９]
前記細胞をさらに、前記甲状腺ホルモンを含むが、ＡＬＫ５阻害剤を含まない培地中、
約３日間培養する、請求項４８に記載の方法。
[５０]
前記甲状腺ホルモンが、トリヨードチロニンである、請求項４８に記載の方法。
[５１]
前記ＡＬＫ５阻害剤が、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、ＡＬＫ５ｉ、ＳＤ２０８、ＴＧＦ−Ｂ阻
害剤ＳＢ４３１５４２、ＩＴＤ−１、ＬＹ２１０９７６１、Ａ８３−０１、ＬＹ２１５７
２９９、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ Ｖ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ Ｉ、ＴＧＦ−β受容体
ｉｎｈ ＩＶ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ ＶＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ ＶＩＩＩ、
ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ ＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ ＶＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎ
ｈ ＩＩＩからなる群から選択される、請求項４８に記載の方法。
[５２]
膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している前記細胞が、インスリンを発現する
、請求項４６に記載の方法。
[５３]
前記細胞を、トリヨードチロニン、チロキシン、トリヨードチロニンの類似体、チロキ
シンの類似体及びその混合物から選択される甲状腺ホルモン、又はＡＬＫ５阻害剤、又は
甲状腺ホルモンとＡＬＫ５阻害剤両方を補足した増殖培地中で培養させることを含む、多
能性幹細胞又はそれより誘導した細胞の分化を介して、β細胞の特徴的なマーカーを発現
している細胞の収率を増加させるための方法。
[５４]
前記甲状腺ホルモンが、トリヨードチロニンである、請求項５３に記載の方法。
[５５]
β細胞の特徴的なマーカーを発現している前記細胞が、インスリンを発現する、請求項
５４に記載の方法。

Claims (55)

  1. 多能性幹細胞から膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を製造する方
    法であって、
    ａ．多能性幹細胞を培養することと、
    ｂ．多能性幹細胞を、前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化さ
    せることと、
    ｃ．トリヨードチロニン、チロキシン、トリヨードチロニンの類似体、チロキシンの類
    似体及びその混合物から選択される甲状腺ホルモン、又はＡＬＫ５阻害剤、又は甲状腺ホ
    ルモンとＡＬＫ５阻害剤両方を補充した培地での処理によって、前腸内胚葉細胞に特徴的
    なマーカーを発現している細胞を、膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細
    胞に分化させることと、の段階を含む方法。
  2. 得られる細胞の少なくとも１０パーセントが、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１及びＨＢ９に対
    して陽性である、請求項１に記載の方法。
  3. ＮＫＸ６．１陽性膵臓内胚葉前駆細胞中のＨＢ９の発現を増強する、請求項１に記載の
    方法。
  4. ＮＫＸ２．２の発現を減少させる、請求項１に記載の方法。
  5. ＳＯＸ２とアルブミン発現を抑制する、請求項１に記載の方法。
  6. 前記甲状腺ホルモンがトリヨードチロニンである、請求項１に記載の方法。
  7. 段階（ｃ）が、トリヨードチロニンとＡＬＫ５阻害剤を補充した培地中で培養すること
    を含む、請求項１に記載の方法。
  8. トリヨードチロニンとＡＬＫ５阻害剤を補充した培地で培養されない細胞に対して、Ｈ
    Ｂ９発現を増強する、請求項７に記載の方法。
  9. 前記段階（ｃ）の培地にさらに、ＳＡＮＴ−１、レチノイン酸及びアスコルビン酸を補
    充する、請求項１に記載の方法。
  10. 段階（ｃ）にさらに、トリヨードチロニンを補充した培地中、膵臓内胚葉／内分泌前駆
    細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を培養することによる、膵臓内分泌細胞に特
    徴的なマーカーを発現している細胞の形成が含まれる、請求項１に記載の方法。
  11. 前記培地にさらに、ＡＬＫ５阻害剤を補充する、請求項１０に記載の方法。
  12. トリヨードチロニン、チロキシン、トリヨードチロニンの類似体、チロキシンの類似体
    及びその混合物から選択される甲状腺ホルモン、又はＡＬＫ５阻害剤、又は甲状腺ホルモ
    ンとＡＬＫ５阻害剤両方を補充した培地での処理によって、前腸内胚葉細胞に特徴的なマ
    ーカーを発現している細胞を、膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に
    分化させることを含む、膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を製造す
    る方法。
  13. 得られた細胞の少なくとも１０パーセントが、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１及びＨＢ９に対
    して陽性である、請求項１２に記載の方法。
  14. ＮＫＸ６．１陽性膵臓内胚葉前駆細胞中のＨＢ９の発現を増強する、請求項１２に記載
    の方法。
  15. ＮＫＸ２．２の発現を減少させる、請求項１２に記載の方法。
  16. ＳＯＸ２及びアルブミン発現を抑制する、請求項１２に記載の方法。
  17. 前記甲状腺ホルモンが、トリヨードチロニンである、請求項１２に記載の方法。
  18. トリヨードチロニンとＡＬＫ５阻害剤を補充した培地中で培養することを含む、請求項
    １２に記載の方法。
  19. トリヨードチロニンとＡＬＫ５阻害剤を補充した培地で培養されない細胞と比較した時
    に、ＨＢ９発現を増強する、請求項１８に記載の方法。
  20. さらに、トリヨードチロニンを補充した培地中で、膵臓内胚葉／内分泌前駆細胞に特徴
    的なマーカーを発現している細胞を培養することによる、膵臓内分泌細胞に特徴的なマー
    カーを発現している細胞の形成が含まれる、請求項１２に記載の方法。
  21. 前記培地にさらに、ＡＬＫ５阻害剤を補充する、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記培地にさらに、ＢＭＰ受容体阻害剤と、ＰＫＣアクチベータを補充する、請求項１
    ２に記載の方法。
  23. トリヨードチロニンとＡＬＫ５阻害剤を補充する培地中、膵臓前腸前駆細胞に特徴的な
    マーカーを発現している細胞を培養することを含む、（ａ）ＨＢ９発現を増加させ、（ｂ
    ）ＳＯＸ２とアルブミン発現を抑制する、方法。
  24. トリヨードチロニンと、ＡＬＫ５阻害剤を補充した培地中で前記細胞を培養することを
    含む、膵臓前腸前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞、膵臓内胚葉／内分泌前
    駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞、又は膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカー
    を発現している細胞中の、グルカゴン、ソマトスタチン及びグレリンをダウンレギュレー
    トする方法。
  25. 前記培地にさらに、ＳＡＮＴ−１、レチノイン酸及びアスコルビン酸を補充する、請求
    項２４に記載の方法。
  26. 前記細胞が、膵臓前腸前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞であり、前記培
    地にさらに、ＦＧＦ７を補充する、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記ＡＬＫ５阻害剤が、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、ＡＬＫ５ｉ、ＳＤ２０８、ＴＧＦ−Ｂ阻
    害剤 ＳＢ４３１５４２、ＩＴＤ−１、ＬＹ２１０９７６１、Ａ８３−０１、ＬＹ２１５
    ７２９９、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ Ｖ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ Ｉ、ＴＧＦ−β受容
    体ｉｎｈ ＩＶ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ ＶＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ ＶＩＩＩ
    、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ ＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ ＶＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉ
    ｎｈ ＩＩＩからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
  28. 前記ＡＬＫ５阻害剤が、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩである、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記ＡＬＫ５阻害剤が、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、ＡＬＫ５ｉ、ＳＤ２０８、ＴＧＦ−Ｂ阻
    害剤ＳＢ４３１５４２、ＩＴＤ−１、ＬＹ２１０９７６１、Ａ８３−０１、ＬＹ２１５７
    ２９９、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ Ｖ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ Ｉ、ＴＧＦ−β受容体
    ｉｎｈ ＩＶ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ ＶＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ ＶＩＩＩ、
    ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ ＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ ＶＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎ
    ｈ ＩＩＩからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
  30. 前記ＡＬＫ５阻害剤が、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩである、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記ＢＭＰ受容体阻害剤が、ＬＤＮ−１９３１８９、Ｎｏｇｇｉｎ及びＣｈｏｒｄｉｎ
    から選択され、前記ＰＫＣアクチベータが、ＴＰＢ、ＰＤＢｕ、ＰＭＡ及びＩＬＶから選
    択される、請求項２２に記載の方法。
  32. ａ．培養容器と、
    ｂ．大量の分化培地と、
    ｃ．多能性幹細胞から誘導した分化した細胞の集団であって、少なくとも１０パーセン
    トの前記分化した細胞が、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１及びＨＢ９を共発現する、分化した細
    胞の集団と、を含む多能性幹細胞から誘導した細胞を分化するためのインビトロ細胞培養
    。
  33. 前記分化培地が、トリヨードチロニン、チロキシン、トリヨードチロニンの類似体、チ
    ロキシンの類似体及びその混合物から選択される甲状腺ホルモン、又はＡＬＫ５阻害剤、
    又は甲状腺ホルモンとＡＬＫ５阻害剤両方を補充した増殖培地を含む、請求項３２に記載
    の細胞培養液。
  34. 前記増殖培地が、ＭＣＤＢ１３１である、請求項３３に記載の細胞培養。
  35. 前記分化した細胞が、膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を含む、
    請求項３２に記載の細胞培養。
  36. 前記増殖培地にさらに、１つ又は２つ以上の
    ａ．ＭＲＴ１０又はシクロパミンから選択される滑らかにされた受容体阻害剤と、
    ｂ．ＳＡＮＴ−１又はＨＰＩ−１から選択されるＳＨＨシグナル伝達経路アゴニストと
    、
    ｃ．ＬＤＮ−１９３１８９、Ｎｏｇｇｉｎ又はＣｈｏｒｄｉｎから選択されるＢＭＰ受
    容体阻害剤と、
    ｄ．ＴＰＢ、ＰＤＢｕ、ＰＭＡ及びＩＬＶから選択されるＰＫＣアクチベータと、
    ｅ．ＦＧＦ７又はＦＧＦ１０から選択される線維芽細胞増殖因子と、
    ｆ．レチノイン酸と、
    ｇ．アスコルビン酸と、
    ｈ．ヘパリンと、
    ｉ．硫酸亜鉛と、が補充される、請求項３３に記載の細胞培養液。
  37. 前記増殖培地にさらに、ＳＡＮＴ−１、レチノイン酸及びアスコルビン酸を補充する、
    請求項３６に記載の細胞培養液。
  38. 膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している分化した多能性幹細胞の集団を含む
    インビトロ細胞培養液であって、少なくとも１０パーセントの前記細胞が、ＨＢ９、ＰＤ
    Ｘ１及びＮＫＸ６．１を発現する、インビトロ細胞培養液。
  39. ＮＫＸ６．１とＰＤＸ１両方を発現する前記細胞の少なくとも３０パーセントが、ＨＢ
    ９も発現する、請求項３８に記載の細胞培養液。
  40. ＮＫＸ６．１とＰＤＸ１両方を発現する前記細胞の少なくとも５０パーセントが、ＨＢ
    ９も発現する、請求項３８に記載の細胞培養液。
  41. ＮＫＸ６．１とＰＤＸ１両方を発現する前記細胞の少なくとも８０パーセントが、ＨＢ
    ９も発現する、請求項３８に記載の細胞培養液。
  42. 膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している前記細胞が、インスリンを産出する
    、請求項１に記載の方法。
  43. 膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している前記細胞が、インスリンを産出する
    、請求項１２に記載の方法。
  44. 前記分化した細胞が、β細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を含む、請求項３
    ５に記載の細胞培養液。
  45. 前記分化した細胞が、インスリンを産出する、請求項４４に記載の細胞培養液。
  46. トリヨードチロニン、チロキシン、トリヨードチロニンの類似体、チロキシンの類似体
    及びその混合物から選択される甲状腺ホルモン、又はＡＬＫ５阻害剤、又は甲状腺ホルモ
    ンとＡＬＫ５阻害剤両方を補充した増殖培地中で、多能性幹細胞から誘導した細胞を培養
    することを含む、膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を製造するため
    の方法。
  47. 多能性幹細胞から誘導した細胞を、約３〜約９日間、前記増殖培地中で培養する、請求
    項４６に記載の方法。
  48. 前記細胞を、甲状腺ホルモンを補充するが、ＡＬＫ５阻害剤は補充しない第一増殖培地
    中、約２〜３日間培養し、続いて、得られた細胞集団を、甲状腺ホルモンとＡＬＫ５阻害
    剤両方を補充した追加的増殖培地中、約３〜６日間培養する、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記細胞をさらに、前記甲状腺ホルモンを含むが、ＡＬＫ５阻害剤を含まない培地中、
    約３日間培養する、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記甲状腺ホルモンが、トリヨードチロニンである、請求項４８に記載の方法。
  51. 前記ＡＬＫ５阻害剤が、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、ＡＬＫ５ｉ、ＳＤ２０８、ＴＧＦ−Ｂ阻
    害剤ＳＢ４３１５４２、ＩＴＤ−１、ＬＹ２１０９７６１、Ａ８３−０１、ＬＹ２１５７
    ２９９、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ Ｖ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ Ｉ、ＴＧＦ−β受容体
    ｉｎｈ ＩＶ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ ＶＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ ＶＩＩＩ、
    ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ ＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ ＶＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎ
    ｈ ＩＩＩからなる群から選択される、請求項４８に記載の方法。
  52. 膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している前記細胞が、インスリンを発現する
    、請求項４６に記載の方法。
  53. 前記細胞を、トリヨードチロニン、チロキシン、トリヨードチロニンの類似体、チロキ
    シンの類似体及びその混合物から選択される甲状腺ホルモン、又はＡＬＫ５阻害剤、又は
    甲状腺ホルモンとＡＬＫ５阻害剤両方を補充した増殖培地中で培養させることを含む、多
    能性幹細胞又はそれより誘導した細胞の分化を介して、β細胞に特徴的なマーカーを発現
    している細胞の収率を増加させるための方法。
  54. 前記甲状腺ホルモンが、トリヨードチロニンである、請求項５３に記載の方法。
  55. β細胞に特徴的なマーカーを発現している前記細胞が、インスリンを発現する、請求項
    ５４に記載の方法。
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