JP6557147B2 - Ｈｂ９調節物を用いたヒト胚性幹細胞の膵臓内分泌細胞への分化 - Google Patents

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、その全てが参照により組み込まれている、米国特許仮出願第６１／７４７，６７２号明細書（２０１２年１２月３１日出願）に基づく優先権を主張する。

（発明の分野）
本発明は、細胞分化の分野にある。より詳細には、本発明は、膵臓内胚葉及び内分泌細胞中のＨＢ９の調節物として、特定の甲状腺ホルモン又はその類似体、及びＡＬＫ５阻害剤の利用を含む。

Ｉ型糖尿病に対する細胞置換療法における進展、及び移植可能ランゲルハンス島の欠乏が、生着に対して適切なインスリン産出細胞、又はβ細胞の供給源を開発することに集中した興味を持つ。１つのアプローチは、胚性幹細胞のような、多能性幹細胞からの、機能的β細胞の製造である。

脊椎動物の胚発生において、多能性細胞は、原腸形成として公知のプロセスにて、３つの胚葉（外胚葉、中胚葉、及び内胚葉）を含む細胞のグループを生じる。例えば、甲状腺、胸腺、膵臓、腸、及び肝臓などの組織は、内胚葉から中間ステージを経て発達する。このプロセスにおける中間ステージは、胚体内胚葉の形成である。

原腸形成の終了までに、内胚葉は、内胚葉の前部、中間、及び後部の領域を特異的にマークする因子のパネルの発現によって認識することができる前部−後部ドメインに分割される。例えば、ＣＤＸ１、２及び４が、内胚葉の後部領域を同定する一方で、ＨＨＥＸ及びＳＯＸ２は、前部領域を同定する。

内胚葉組織の移行は、内胚葉を腸管の領域化に役立つ異なった中胚葉組織に近接させる。これは、ＦＧＦｓ、ＷＮＴＳ、ＴＧＦ−β、レチノイン酸（ＲＡ）及びＢＭＰリガンド及びそれらのアンタゴニストのような、分泌因子の多血症によって達成される。例えば、ＦＧＦ４及びＢＭＰは推定後腸内胚葉においてＣＤＸ２の発現を促進し、前方の遺伝子ＨＨＥＸ及びＳＯＸ２の発現を阻害する（２０００ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２７：１５６３〜１５６７）。ＷＮＴシグナル伝達はまた、後腸の発達を促進し、前腸の運命を阻害するために、ＦＧＦシグナル伝達と平行して作用することが示されている（２００７ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３４：２２０７〜２２１７）。最後に、間葉による分泌レチノイン酸が、前腸−後腸境界を制御する（２００２ Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ，１２：１２１５〜１２２０）。

特異的転写因子の発現レベルは、組織の同一性を指定するために使用できる可能性がある。原腸管への胚体内胚葉の形質転換中に、腸管は、制限された遺伝子発現パターンにより分子レベルで観察することができる広いドメインに領域化される。腸管中の領域化された膵臓ドメインが、ＰＤＸ１の非常に高い発現と、ＣＤＸ２及びＳＯＸ２の非常に低い発現を示す。ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＰＴＦ１Ａ及びＮＫＸ２．２が、膵臓組織中で高く発現し、ＣＤＸ２の発現が、腸組織にて高い。

膵臓の形成は、胚体内胚葉の膵臓内胚葉への分化により起こる。背側と腹側の膵臓ドメインは、前腸上皮から生じる。前腸はまた、食道、気管、肺、甲状腺、胃、肝臓及び胆管系に対して上昇を与える。

膵臓内胚葉の細胞は膵臓−十二指腸ホメオボックス遺伝子ＰＤＸ１を発現する。ＰＤＸ１が存在しない場合、膵臓は、腹側芽及び背側芽の形成を越えて発達しない。したがって、ＰＤＸ１の発現は、膵臓器官形成において重要な工程を印している。成熟膵臓は、膵臓内胚葉の分化より発生する、外分泌及び内分泌組織両方を含む。

Ｄ'Ａｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．は、高濃度のアクチビン及び低血清の存在下、ヒト胚性幹細胞由来胚体内胚葉の濃縮培養の製造を記述している（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００５，２３：１５３４〜１５４１；米国特許第７，７０４，７３８号明細書）。マウスの腎臓カプセルの元でこれらの細胞を移植することは、内皮性組織の特徴を有するより成熟した細胞への分化となることが報告された（米国特許第７，７０４，７３８号明細書）ヒト胚性幹細胞由来胚体内胚葉細胞はさらに、ＦＧＦ１０及びレチノイン酸の添加後、ＰＤＸ１陽性細胞へ分化可能である（米国特許第２００５／０２６６５５４号明細書）。免疫欠損マウスにおける脂肪パッド中の、これらの膵臓前駆細胞の続く移植が、３〜４ヶ月の成熟化期間に続く、機能的膵臓内分泌細胞の形成となった（米国特許第７，９９３，９２０号明細書及び同第７，５３４，６０８号明細書）。

Ｆｉｓｋからは、ヒト胚性幹細胞からの膵島細胞の産生のための系を報告している（米国特許第７，０３３，８３１号明細書）。この場合、分化経路は３つの段階に分割された。ヒト胚性幹細胞は、最初に、酪酸ナトリウムとアクチビンＡとの組み合わせを用いて内胚葉に分化された（米国特許第７，３２６，５７２号明細書）。次に細胞をＮｏｇｇｉｎなどのＢＭＰアンタゴニストと共に、ＥＧＦ又はベータセルリンと組み合わせて培養して、ＰＤＸ１陽性細胞を生成する。最終分化は、ニコチンアミドにより誘発された。

低分子阻害剤もまた、膵臓内分泌前駆細胞の誘導のために使用されている。例えば、ＴＧＦ−β受容体及びＢＭＰ受容体の低分子阻害剤（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２０１１、１３８：８６１〜８７１、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ２０１１、６０：２３９〜２４７）は、膵臓内分泌細胞の数を有意に増強するために使用されてきた。加えて、低分子活性化剤もまた、胚体内胚葉細胞又は膵臓前駆細胞を生成するために使用されている（Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００９、２１：７２７〜７３２；Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２００９，５：２５８〜２６５）。

（またＨＩＸＢ９及びＮＭＸ１として知られる）ＨＢ９は、およそ胚性日８にて開始する膵臓発生において、早期に発現したＢＨＬＨ転写活性化因子タンパク質である。ＨＢ９はまた、ノトコード及び脊髄にて発現する。ＨＢ９の発現は、一過性であり、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１発現細胞にて発現している膵臓上皮にて、約１０．５日でピークとなる。約１２．５日にて、ＨＢ９発現は減少し、後期ステージで、β細胞にのみ制限されるようになる。ＨＩＸＢ９の無変異に対するマウスホモ接合体において、膵臓の背葉が、発生を失敗する（Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２３：６７〜７０、１９９９；Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２３：７１〜７５：１９９９）。ＨＢ９−／−β細胞は、低レベルのグルコーストランスポーター、ＧＬＵＴ２及びＮＫＸ６．１を発現する。さらに、ＨＢ９−／−膵臓は、インスリン陽性細胞の数において、有意な減少を示すが、一方で、他の膵臓ホルモンの発現に有意に影響を与えない。したがって、ＨＢ９の時間制御が、正常β細胞発生及び機能に必須である。β細胞中でＨＢ９発現を制御している因子について、よくわかっていないけれども、ゼブラフィッシュにおける最近の研究は、レチノイン酸が、ＨＢ９の発現を正に制御することを示唆している（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３８、４５９６〜４６０８、２０１１）。

甲状腺ホルモン、チロキシン（「Ｔ４」）とトリオドチロニン（「Ｔ３］）は、甲状腺によって産出されるチロシンに基づくホルモンであり、主として代謝の制御に応答性である。血中の甲状腺ホルモンの主要な形態は、Ｔ４であり、Ｔ３より長い半減期を有する。血中に放出されたＴ３に対するＴ４の比は、およそ２０対１である。Ｔ４は、脱ヨウ要素酵素によって、細胞内で、より活性なＴ３（Ｔ４に比べて、３〜４倍強力である）に変換される。

Ｔ３は、甲状腺ホルモン受容体、ＴＲα１及びＴＲβ１（ＴＲ）に結合する。ＴＲは、核ホルモン受容体であり、レチノイドＸ受容体にヘテロ二量体化する。二量体が、リガンドが存在しない状態で、甲状腺応答要素（ＴＲＥｓ）に結合し、転写抑制剤として働く。Ｔ３のＴＲへの結合が、ＴＲＥ依存遺伝子の抑圧を減少させ、種々の標的遺伝子の発現を誘導する。多数の研究が、β細胞増殖の増加、アポトーシスの減少及びインスリン分泌の改善におけるＴ３の役割を示した一方で、細胞分化におけるその役割は未定義である。

トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）は、増殖制御、分化、遊走、細胞生存、線維化及び発生運命の特性化を含む、多くの生物学的工程に関与する多面発現生サイトカインの大きなファミリーのメンバーである。ＴＧＦ−βスーパーファミリ−メンバーは、ＩＩ型及びＩ型受容体を含む、受容体複合体を通してシグナル伝達する。（アクチビン及びＧＤＦｓ（増殖分化因子）のような）ＴＧＦ−Ｂリガンドが、Ｉ型受容体と共に、ＩＩ型受容体を有する。ＩＩ型受容体は、複合体中のＩ型受容体をリン酸化及び活性化する。５つの哺乳類ＩＩ型受容体、ＴβＲ−ＩＩ、ＡｃｔＲ−ＩＩ、ＡｃｔＲ−ＩＩＢ、ＢＭＰＲ−ＩＩ及びＡＭＨＲ−ＩＩと、７つのＩ型受容体（ＡＬＫｓ １〜７）がある。アクチビンと関連リガンドは、ＡｃｔＲ−ＩＩ又はＡｃｔＡＲ−ＩＩＢ、及びＡＬＫ４及びＡＬＫ５の組合せを介してシグナル伝達し、ＢＭＰは、ＡｃｔＲ−ＩＩ、ＡｃｔＲ−ＩＩＢ又はＢＭＰＲ−ＩＩとのＡＬＫ２、ＡＬＫ３及びＡＬＫ６の組合せを通してシグナル伝達する。ＡＭＨはＡＬＫ６とのＡＭＨＲ−ＩＩの複合体を通してシグナル伝達し、結節性は、ＡｃｔＲ−ＩＩＢとＡＬＫ７の複合体を通してシグナル伝達することが最近示された（Ｃｅｌｌ．２００３，１１３（６）：６８５〜７００）。適切な受容体へのＴＧＦ−Ｂリガンドの結合に続いて、次のシグナルが、主に、Ｓｍａｄｓの複合体の活性化を通して、核に形質導入される。活性化に際して、Ｉ型受容体が、Ｓｍａｄの受容体制御ファミリーのメンバーをリン酸化する。これは、それらを活性化し、それらが、共通の媒体ＳｍａｄであるＳｍａｄ４との複合体を形成することを可能にする。Ｓｍａｄｓ １、５及び８は、ＡＬＫｓ １、２、３及び６に対する基質であり、一方で、Ｓｍａｄｓ ２及び３は、ＡＬＫｓ ４、５及び７に対する基質である（ＦＡＳＥＢ Ｊ、１３，２０１５〜２１２４）。活性化Ｓｍａｄ複合体は、核内に集積し、一方でこれらは、標的遺伝子の転写、とりわけ、他の特定のＤＮＡ−結合転写因子にて、直接関与される。ＴＧＦ−βに対する受容体を選択的に阻害する化合物が、治療適用のため、及び種々の幹細胞集団からの再プログラミング及び分化の文脈において、細胞運命を調節するために、開発されてきた。とりわけ、ＡＬＫ５阻害剤が、内分泌運命への胚性幹細胞の直接分化のために、先に使用されてきた（Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２０１１，６０（１）：２３９〜４７）。

一般に、前駆細胞を、機能的β細胞に分化する工程は、種々のステージを通して進む。また、コミットメントのステージを通して進行して、インビトロにてヒト胚性幹細胞（「ｈＥＳ」）をβ−細胞に似た細胞へ指向することはチャレンジングであり、ｈＥＳからの機能的β−細胞の製造は、直接的な工程ではない。前駆細胞を分化させる工程における各段階は、固有のチャレンジを提示する。工程が、ヒト多能性幹細胞のような前駆細胞から膵臓細胞を製造するためのプロトコールを改善することにおいて実施されるけれども、機能的内分泌細胞、とりわけβ細胞をもたらすプロトコールを製造する必要性がまだ存在する。

Ａ〜Ｃは、実施例１にて概要を示したような、膵臓内胚葉／内分泌前駆体に分化したヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の、以下の遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写している。ＰＤＸ１（図１Ａ）；ＮＫＸ６．１（図１Ｂ）；及びＨＢ９（図１Ｃ）。 Ａ〜Ｃは、実施例１にて概要を示したような、膵臓内胚葉／内分泌前駆体に分化したヒト胚性幹細胞株Ｈ１のＦＡＣＳ解析の結果を示す。ＰＤＸ１（図２Ａ）、ＮＫＸ６．１（図２Ｂ）及びＨＢ９（図２Ｃ）。 Ａ及びＢは、ＮＸＫ６．１、インスリン又はＨＢ９に対して免疫染色した細胞のイメージを示す。細胞を、実施例１にて概要を示したような、膵臓内胚葉／内分泌前駆体に分化させた。図３Ａは、ＮＫＸ６．１（左手パネル）及びインスリン（右手パネル）に対する免疫染色を示す。図３Ｂは、ＨＢ９（左手パネル）とインスリン（右手パネル）に対する免疫染色を示す。 Ａ、Ｂ、及びＣは、実施例２にて概要を示したように、ステージ４〜６に分化した胚性幹細胞Ｈ１の、ステージ４、３日目（パネルＡ）、ステージ５、４日目（パネルＢ）及びステージ６、３日目（パネルＣ）における、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１及びＨＢ９のパーセント発現に対するＦＡＣＳデータを描写する。 実施例２にて概要を示したように分化した細胞に対して、ステージ２〜６でのヒト膵島と比較した、ＨＢ９のｍＲＮＡ発現を示す。 実施例２にて概要を示したように分化し、ＮＸＫ６．１（左手パネル）及びＨＢ９（右手パネル）に対して免疫染色した、ステージ４、３日目細胞のイメージを描写している。 Ａ〜Ｊは、実施例２にて概要を示したように、ステージ４に分化し、次いで、ステージ４のみ、ステージ４〜ステージ５、又はステージ４〜ステージ６で処理した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の、以下の遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ解析からのデータを示す。図６Ａ〜６Ｊは、以下に対するデータを示す。ＮＫＸ６．１（図６Ａ）、ＰＤＸ１（図６Ｂ）、ＮＫＸ２．２（図６Ｃ）、グルカゴン（図６Ｄ）、インスリン（図６Ｅ）、ソマトスタチン（図６Ｆ）、ＣＤＸ２（図６Ｇ）、アルブミン（図６Ｈ）、ガストリン（図６Ｉ）及びＳＯＸ２（図６Ｊ）。 Ａ及びＢは、対照（図７Ａ）、及び実施例２にて概要を示すように処理した培養液（図７Ｂ）の免疫染色の結果を示す。対照（図７Ａ）とステージ６にて処理した培養液（図（７Ｂ）は、ステージ６での対照（図６Ａ）と比較して、Ｔ３処理群（図７Ｂ）中のＨＢ９陽性細胞の数の有意な増加を明らかにした。 Ａ及びＢは、実施例３にて概要を示したように、ステージ６にて分化させた細胞に対する、ステージ６、７日目でのＮＫＸ６．１及びＨＢ９に対する免疫染色を描写する。Ｃは、実施例３にて概要を示したように、ステージ６まで分化させた、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞中の、ＨＢ９の発現のリアルタイムＰＣＲからのデータを描写する。 Ａ及びＢは、実施例３にて概要を示したように、ステージ６まで分化させた、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞中のＨＢ９の、それぞれステージ６、５日目と１５日目での、ＦＡＣＳデータを描写する。 Ａ〜Ｅは、実施例４にて概要を示したプロトコールにしたがって分化した細胞に対する、ステージ６、６日目でのＮＫＸ６．１とＨＢ９に対する免疫染色を描写する。用量依存様式にて、Ｔ３が、ＮＫＸ６．１陽性膵臓内胚葉前駆細胞中のＨＢ９陽性細胞の数を有意に増強する。 Ａ〜Ｌは、実施例４にて概要を示したように、ステージ６まで分化したヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞中の、以下の遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する。ＳＯＸ２（図１１Ａ）、ｍＮＫＸ６．１（図１１Ｂ）、ＮＫＸ２．２（図１１Ｃ）、ガストリン（図１１Ｄ）、ＰＤＸ１（図１１Ｅ）、ＮＧＮ３（図１１Ｆ）、ＰＡＸ６（図１１Ｇ）、ＰＡＸ４（図１１Ｈ）、インスリン（図１１Ｉ）、グルカゴン（図１１Ｊ）、グレリン（図１１Ｋ）及びソマトスタチン（図１１Ｌ）。

本発明の以下の詳細な記述は、付随する図面と一緒に読む場合に、よりよく理解されるであろう。図面は、本発明の特定の実施形態を図示する目的のために提供される。しかしながら、本発明は、示した精密な配置、例及び道具に制限はされない。開示を明確にするために、そして制限の方法ではなく、本発明の詳細な記述は、本発明の特定の特徴、実施形態又は適用を記述、又は例示する副項目に分けられる。

本発明は、特定の培養順序において、特定の甲状腺ホルモン又はその類似体、ＡＬＫ５（ＴＧＦ−βＩ型受容体キナーゼ）阻害剤の利用を介して、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１及びＨＢ９に対して陽性の膵臓内胚葉細胞の発生に関する。したがって、本発明は、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１及びＨＢ９を発現するβ細胞系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に、多能性幹細胞から誘導した細胞を分化させるための、インビトロ細胞培養液を提供する。本発明はさらに、インビトロ細胞培養液を介したそのような細胞を得るための方法を提供する。特定の実施形態において、本発明は、Ｔ３、Ｔ４又はその類似体の封入が、β細胞への分化を促進するために、分化している細胞内でのＨＢ９タンパク質発現の誘発因子として働くことの発見に基づく。ＨＢ９は、ステージ３又はステージ４でのタンパク質レベルで発現されない。したがって、本発明は、ＨＢ９タンパク質発現を制御することによって、幹細胞を分化する方法を提供する。特に、本発明は、特定の培養順序にて、Ｔ３又はＴ４、又はその類似体、及びＡＬＫ５阻害剤の利用を介した、ＨＫＸ６．１、ＰＤＸ１及びＨＢ９に対して陽性の膵臓内胚葉細胞の発生に対して提供する。

定義
幹細胞は、単一細胞レベルでの自己再生能及び分化能の両方によって定義される未分化細胞である。幹細胞は、自己再生前駆細胞、非再生性前駆細胞、及び最終分化細胞を含む子孫細胞を生成することができる。幹細胞はまた、インビトロでの、複数の胚葉（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）から種々の細胞系統の機能細胞へ分化させるそれらの能力によって特徴付けられる。幹細胞は、移植後に複数の胚葉の組織を生じさせ、線維芽細胞に注入後、実質的に（全てではないとしても）ほとんどの組織に寄与する。

幹細胞は、それらの発生上の潜在能力によって分類される。多能性幹細胞は、全ての胚性細胞型を形成することが可能である。

分化は、未特定化（未確定）又はほとんど特定されていない細胞が、例えば神経細胞又は筋肉細胞のような、特定化した細胞の特徴を獲得する工程である。分化した細胞は、細胞の系統の範囲内で、より特殊化した（「確定した」）位置を呈している細胞である。分化プロセスに適用した際の用語「確定した」は、通常の環境下で特定の細胞型又は細胞型の小集合に分化し続ける分化経路の地点に進行しており、通常の環境下で異なる細胞型に分化し、又はより分化されていない細胞型に戻ることができない細胞を指す。「脱分化」とは、細胞が細胞の系統内においてより特殊化（又は確定）していない位置へと戻る工程のことを指す。本明細書で使用するように、細胞の系統は、細胞の遺伝性を定義し、すなわち、どの細胞がくるのか、及び何の細胞が形成されるのか、を定義する。ある細胞の系統とは、所定の発生及び分化の遺伝体系内にその細胞を位置付けるものである。系統特異的マーカーとは、対象とする系統の細胞の表現型と特異的に関連した特徴を指し、分化決定されていない細胞の、対象とする系統への分化を評価するために使用することができる。

本明細書で使用するところの「マーカー」は、対象の細胞中で差異的に発現する核酸又はポリペプチド分子である。この文脈において、差異的な発現とは、未分化細胞と比較して、陽性マーカーのレベルの増加、及び陰性マーカーのレベルの減少を意味する。マーカー核酸又はポリペプチドの検出可能なレベルは、他の細胞と比較して対象とする細胞において充分に高いか又は低いことから、当該技術分野において知られる各種の方法のいずれを用いても対象とする細胞を他の細胞から識別及び区別することが可能である。

本明細書で使用するように、細胞は、特定のマーカーが、細胞内で十分検出される時に、特定のマーカー「に対して陽性」であるか、「陽性」である。同様に、細胞は、特定のマーカーが、細胞内で十分検出されない時に、特定のマーカー「に対して陰性」であるか、「陰性」である。特に、ＦＡＣＳによる陽性は、通常２％より多く、一方でＦＡＣＳによる陰性閾値は通常１％未満である。ＰＣＲによる陽性は通常、３４サイクル（Ｃｔｓ）未満であり、一方で、ＰＣＲによる陰性は、通常３４．５サイクルより大きい。

静的インビトロ細胞培養中の多能性幹細胞の、機能性膵臓内分泌細胞への分化を複製する試みにおいて、分化工程はしばしば、いくつかの連続ステージを通して処理することとして見られる。特に、分化工程は、６ステージを通して処理することとして一般に見られる。本段階的処理において、「ステージ１」は、分化工程における第一段階を意味し、多能性幹細胞の、胚体内胚葉細胞に特徴的マーカーを発現している細胞（本明細書以下あるいは、「ステージ１細胞」と呼ぶ）への分化を意味する。「ステージ２」は、第二段階、胚体内胚葉細胞に特徴的マーカーを発現している細胞の、腸管細胞に特徴的マーカーを発現している細胞（本明細書以下あるいは、「ステージ２細胞」と呼ぶ）への分化を指す。「ステージ３」は、第三段階、腸管細胞に特徴的マーカーを発現している細胞の、前腸内胚葉細胞に特徴的マーカーを発現している細胞（本明細書以下あるいは、「ステージ３細胞」と呼ぶ）への分化を指す。「ステージ４」は、第四段階、前腸内胚葉細胞に特徴的マーカーを発現している細胞を、膵臓前腸前駆細胞に特徴的マーカーを発現している細胞（本明細書以下あるいは、「ステージ４細胞」と呼ぶ）への分化を指す。「ステージ５」は、第五段階、膵臓前腸前駆細胞の特徴的マーカーを発現している細胞の、膵臓内肺葉細胞及び／又は膵臓内分泌前駆細胞の特徴的マーカーを発現している細胞（本明細書以下、合わせて「膵臓内肺葉／内分泌前駆細胞」又あるいは、「ステージ５細胞」と呼ぶ）への分化を指す。「ステージ６」は、膵臓内胚葉／内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞の、膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞への分化を指す（本明細書以下、あるいは、「ステージ６細胞」と呼ぶ。

しかしながら、特定の集団中の全ての細胞が、同一の速度で、これらのステージを通して進むわけではないことが留意されるべきである。結果として、とりわけ後期分化ステージにて、集団に存在する主要な細胞よりも、少なく、又は多く、分化経路を下って進んだ細胞の存在を検出することは、インビトロ細胞培養において、一般的ではない。例えば、ステージ５での細胞培養の間、膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーの発現が見られることは一般的ではない。本発明を例示する目的のために、以上で同定したステージに関連した種々の細胞型の特徴を本明細書で記述する。

本明細書で使用するところの「胚体内胚葉細胞」は、原腸形成の間に外胚葉から発生する細胞の特徴を有し、胃腸管及びその誘導体を形成する細胞を指す。胚体内胚葉細胞は、少なくとも１つの以下のマーカーを発現する。ＦＯＸＡ２（又は、肝細胞核因子３−β（「ＨＮＦ３β」）としても知られている）、ＧＡＴＡ４、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、ＯＴＸ２、グーセコイド、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９及びＭＩＸＬ１。胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーには、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２及びＳＯＸ１７が含まれる。したがって、胚体内胚葉細胞は、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２及びＳＯＸ１７のそれらの発現によって特徴付けられて良い。さらに、時間の長さに依存して、細胞が、ステージ１に留まることが許容され、ＨＮＦ−４αの増加が観察されうる。

本明細書で使用するところの「腸管細胞」は、肺、肝臓、膵臓、胃及び腸のような全ての内胚葉性器官を形成可能な、胚体内胚葉から由来する細胞を指す。腸管細胞は、胚体内胚葉細胞によって発現したものよりも、実質的に増加したＨＮＦ４αの発現によって特徴付けられて良い。例えば、ＨＮＦ４αのｍＲＮＡ発現における１０〜４０倍増加が、ステージ２の間観察されうる。

本明細書で使用するところの「前腸内胚葉細胞」は、食道、肺、胃、肝臓、膵臓、胆嚢及び十二指腸の一部を形成する内胚葉細胞を指す。前腸内胚葉細胞は、少なくとも１つの以下のマーカーを発現する。ＰＤＸ１、ＦＯＸＡ２、ＣＤＸ２、ＳＯＸ２及びＨＮＦ４α。前腸内胚葉細胞は、腸管細胞と比較して、ＰＤＸ１の発現における増加によって特徴付けられて良い。例えば、ステージ３培養にて５０パーセントより多くの細胞が、ＰＤＸ１を典型的に発現している。

本明細書で使用するところの「膵臓前腸前駆細胞」は、以下のマーカー、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＨＮＦ６、ＮＧＮ３、ＳＯＸ９、ＰＡＸ４、ＰＡＸ６、ＩＳＬ１、ガストリン、ＦＯＸＡ２、ＰＴＦ１ａ、ＰＲＯＸ１及びＨＮＦ４αの少なくとも１つを発現する細胞を指す。膵臓前腸前駆細胞は、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１及びＳＯＸ９の発現に対して陽性であることによって特徴付けられて良い。

本明細書で使用するところの「膵臓内胚葉細胞」は、以下のマーカーの少なくとも１つを発現する細胞を指す。ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＨＮＦ１β、ＰＴＦ１α、ＨＮＦ６、ＨＮＦ４α、ＳＯＸ９、ＮＧＮ３、ガストリン、ＨＢ９又はＰＲＯＸ１。膵臓内胚葉細胞は、ＣＤＸ２又はＳＯＸ２の実質的発現の欠如によって特徴付けられて良い。

本明細書で使用するところの「膵臓内分泌前駆細胞」は、膵臓ホルモン発現細胞になることが可能な膵臓内胚葉細胞を意味する。膵臓内分泌前駆細胞は、以下のマーカー、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮｅｕｒｏＤ１、ＩＳＬ１、ＰＡＸ４、ＰＡＸ６又はＡＲＸの少なくとも１つを発現する。膵臓内分泌前駆細胞は、ＮＫＸ２．２及びＮｅｕｒｏＤ１の発現によって特徴付けられてよい。

本明細書で使用するところの「膵臓内分泌細胞」は、以下のホルモン、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、グレリン及び膵臓ポリペプチドの少なくとも１つを発現可能な細胞を指す。これらのホルモンに加えて、膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーとしては、１つ又は２つ以上の、ＮＧＮ３、ＮｅｕｒｏＤ１、ＩＳＬ１、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４、ＡＲＸ、ＮＫＸ２．２及びＰＡＸ６が挙げられる。β細胞に特徴的なマーカーを発現している膵臓内分泌細胞は、インスリンと、以下の転写因子、ＰＤＸ１、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＮｅｕｒｏＤ１、ＩＳＬ１、ＨＮＦ３β、ＭＡＦＡ及びＰＡＸ６の少なくとも１つの発現によって特徴付けることができる。

「ｄ１」、「１ｄ」及び「１日目」、「ｄ２」、「２ｄ」及び「２日目」は、本明細書で互換的に使用される。これらの数字の組み合わせは、本願の段階的分化プロトコール中の異なるステージにおけるインキュベーションの特定の日を指す。

「グルコース」は、デキストロース、天然に一般に見られる糖を指すために本明細書で使用される。

「ＮｅｕｒｏＤ１」は、膵臓内分泌前駆細胞において発現するタンパク質と、それをコードしている遺伝子を同定するために本明細書で使用される。

「ＬＤＮ−１９３１８９」は、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡから、商標ＳＴＥＭＯＬＥＣＵＬＥ（商標）のもと利用可能な、（塩酸（６−（４−（２−ピペリジン−１−イル）エトキシ）フェニル）−３−（ピリジン−４−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン；ＤＭ−３１８９）ＢＭＰ受容体阻害剤を指す。

多能性幹細胞の特徴付け、供給源、増殖及び培養
Ａ．多能性幹細胞の特徴付け
多能性幹細胞は、１つ又は２つ以上の、ステージ特異的胚性抗原（ＳＳＥＡ）３及び４と、Ｔｒａ−１−６０及びＴｒａ−１−８１抗体（Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５〜１１４７）を用いて検出可能なマーカーを発現してよい。インビトロでの多能性幹細胞の分化は、Ｔｒａ−１−６０及びＴｒａ−１−８１発現の欠損をもたらす。未分化多能性幹細胞は典型的に、アルカリホスファターゼ活性を有し、これは、４％パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、次いで製造業者（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）によって記述されたように、基質としてＶＥＣＴＯＲ（（登録商標））Ｒｅｄで発色させることによって検出可能である。未分化の多能性幹細胞はまた、ＲＴ−ＰＣＲにより検出されるように、一般にＯＣＴ４及びＴＥＲＴも発現する。

増殖した多能性幹細胞の他の望ましい表現型は、全ての３つの胚性層、内胚葉、中胚葉及び外胚葉組織の細胞へ分化する潜在力である。幹細胞の多能性は、例えば、細胞を、種々の組合せ免疫欠損（「ＳＣＩＤ」）マウスに注入し、４％パラホルムアルデヒドを用いて形成する奇形種を固定し、次いでこれら３つの胚性層からの細胞型の証拠を組織学的に試験することによって、確かめて良い。代替的に、多能性は、胚様体を形成し、この胚様体を３つの胚葉に関連したマーカーの存在に関して評価することにより決定することができる。

増殖させた多能性幹細胞株は、標準的なＧバンド法を使用し、対応する霊長類種の発表されている核型と比較することで、核型を決定することができる。細胞が正倍数体であることを意味する、「星状核型」を有する細胞を得ることが望ましく、そこでは全てのヒトクロモソームが存在し、著しく変化しない。

Ｂ．多能性幹細胞の供給源
使用してよい多能性幹細胞の例示型としては、妊娠の間、典型的には、しかし必須では無く、妊娠のおよそ１０〜１２週前のいずれかの時間に取った、（例えば胚胎盤のような）前胚性組織、胚性組織、又は胎児組織を含む、多能性細胞の確立された株が挙げられる。非限定例は、例えばヒト胚性幹細胞株Ｈ１、Ｈ７及びＨ９（ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）のような、ヒト胚性幹細胞又はヒト胚性生殖細胞の確立された株が挙げられる。フィーダー細胞のない状態ですでに培養した多能性幹細胞集団から取った細胞もまた好適である。ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びＺＦＰ４２（Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ２０１１，１２：１６５〜１８５、又はＩＰＳ，Ｃｅｌｌ，１２６（４）：６６３〜６７６を参照）のようないくつかの多能性関連転写因子の強制発現を用いて、成人体細胞から由来する、人工多能性幹細胞（ＩＰＳ）又は再プログラムされた多能性細胞もまた使用してよい。本発明の方法に使用されるヒト胚性幹細胞は、Ｔｈｏｍｓｏｎらによって記述されたように調製してもよい（米国特許第５，８４３，７８０号；Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２８２：１１４５〜１１４７；Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １９９８，３８：１３３〜１６５；Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９５，９２：７８４４〜７８４８）。ＢＧ０１ｖ（ＢｒｅｓａＧｅｎ，Ａｔｈｅｎｓ，Ｇａ）のような変異体ヒト胚性幹細胞株、又はＴａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １３１：１〜１２（２００７）にて開示された細胞のような、成人ヒト体細胞から由来した細胞もまた使用してよい。特定の実施形態において、本発明での使用に好適な多能性幹細胞は、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ４：１６〜１９，２００９）；Ｍａｈｅｒａｌｉ ｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １：５５〜７０，２００７）；Ｓｔａｄｔｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２：２３０〜２４０）；Ｎａｋａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２６：１０１〜１０６，２００８）；Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ １３１：８６１〜８７２，２００７）及び米国特許第２０１１／０１０４８０５号明細書に記述された方法にしたがって誘導してよい。特定の実施形態において、多能性幹細胞は、非胚性由来のものであってよい。これらの参照、特許、特許出願の全てが、とりわけ、多能性細胞の単離、培養、膨張及び分化に関連するので、その全てが参照により本明細書に組み込まれている。

Ｃ．多能性幹細胞の膨張及び培養
１つの実施形態において、多能性幹細胞は典型的には、種々の方法にて、多能性幹細胞を支持するフィーダー細胞の層上で培養する。あるいは、多能性幹細胞を、フィーダー細胞を実質的に含まない培養系中で培養するが、それにもかかわらず、実質的な分化なしに、多能性幹細胞の増殖を支持する。分化なしでフィーダーを含まない培養液中の多能性幹細胞の増殖が、他の細胞型と先に培養することによって条件付けした培地を用いて支持される。あるいは、分化なしにフィーダーを含まない培養液中の多能性幹細胞の増殖が、化学的に規定された培地を用いて支持される。

多能性細胞は、種々のフィーダー層を用いて培養中に、又はマトリックスタンパク質コート容器を用いることによって、簡単に増殖し得る。あるいは、ｍＴｅｓｒ（（登録商標））１培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）のような規定された培地との組合せでの化学的に規定された表面を、細胞の常用膨張のために使用してよい。多能性細胞は、酵素消化、機械的分離、又はＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）のような種々のカルシウムキレータを用いて、培養プレートから簡単に除去してよい。あるいは、多能性細胞を、任意のマトリックスタンパク質又はフィーダー層のない状態で、懸濁液中で膨張させて良い。

多能性幹細胞を膨張させ、培養する多くの異なる方法を、請求された発明にて使用してよい。例えば、本発明の方法は、Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｒｉｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．及び米国特許第２００２／００７２１１７号明細書の方法を用いてよい。Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８：３９９〜４０４（２０００））及びＴｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５〜１１４７（１９９８））は、マウス胚性線維芽細胞フィーダー細胞層を用いて、ヒト線維芽細胞からの多能性幹細胞の培養を開示している。Ｒｉｃｈａｒｄｓ ｅｔ ａｌ．（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２１：５４６〜５５６，２００３）は、ヒト多能性幹細胞培養を支持するそれらの能力に関して、１１の異なるヒト成人、胎児及び新生児フィーダー細胞層のパネルを評価し、成人皮膚線維芽細胞フィーダー上で培養したヒト胚性幹細胞株が、ヒト胚性幹細胞形態を維持し、多能性のままであることが留意される。米国特許第２００２／００７２１１７号明細書は、フィーダーを含まない培養液中での霊長類多能性幹細胞の増殖を支持する培地を産出する細胞株を開示している。使用される細胞株は、胚組織から得た又は胚性幹細胞から分化した間葉系細胞株、及び線維芽細胞様細胞株である。米国特許第２００２／０７２１１７号明細書はまた、霊長類フィーダー細胞層としての、細胞株の利用を開示する。

多能性幹細胞を膨張し、培養する他の好適な方法が、例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｓｔｏｊｋｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｙａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．及びＡｍｉｔ ｅｔ ａｌ．にて開示されている。Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２３：１２２１〜１２２７，２００５）は、ヒト胚性幹細胞から由来したフィーダー細胞上、ヒト多能性幹細胞の長期増殖のための方法を開示する。Ｓｔｏｊｋｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２００５ ２３：３０６〜３１４，２００５）は、ヒト胚性幹細胞の自発的分化から由来するフィーダー細胞系を開示する。Ｍｉｙａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２２：４３３〜４４０，２００４）は、ヒト胎盤から得たフィーダー細胞の供給源を開示している。Ａｍｉｔ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ ６８：２１５０〜２１５６，２００３）は、ヒト包皮から由来するフィーダー細胞層を開示する。

他の実施形態において、多能性幹細胞を膨張し培養する好適な方法は、例えば、Ｉｎｚｕｎｚａ ｅｔ ａｌ．，米国特許第６，６４２，０４８号明細書、国際特許第２００５／０１４７９９号パンフレット、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．及び米国特許第２００７／００１００１号明細書に開示される。Ｉｎｚｕｎｚａ ｅｔ ａｌ．（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２３：５４４〜５４９，２００５）は、ヒト多能性幹細胞包皮線維芽細胞からのフィーダー細胞層を開示している。米国特許第６，６４２，０４８号明細書は、フィーダーを含まない培養液中の霊長類多能性幹細胞の増殖を支持する培地と、そのような培地の産出のために有用な細胞株を開示している。米国特許第６，６４２，０４８号明細書は、胚性組織から得、胚性幹細胞から分化した、間葉及び線維芽細胞様細胞株、並びにそのような細胞株を誘導し、培地を処理し、そのような培地を使用して幹細胞を増殖する方法を報告する。国際特許第２００５／０１４７９９号明細書は、哺乳動物細胞の保持、増殖及び分化のための条件培地を開示する。国際特許第２００５／０１４７９９号は、本開示を介して製造した培養培地は、齧歯類細胞、とりわけ分化し、不死化したトランスジェニック肝細胞、ＭＭＨ（Ｍｅｔ Ｍｕｒｉｎｅ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｒｅ）という名前のものの、細胞分泌活性によって条件づけられることを報告する。Ｘｕ ｅｔ ａｌ．（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２２：９７２〜９８０，２００４）は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素を過剰発現するように、遺伝的に改変したヒト胚性幹細胞誘導体から得た、条件培地を開示する。米国特許第２００７／００１００１１号パンフレットは、多能性幹細胞の維持のための、化学的に規定された培養培地を開示する。

代替的な培養系は、胚性幹細胞の増殖を促進することができる増殖因子で補充された無血清培地を使用する。そのような培地系の例としては、Ｃｈｅｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｖｅｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．及び米国特許第２００５／０１４８０７０号明細書が挙げられるが、これらに限定はされない。Ｃｈｅｏｎ ｅｔ ａｌ．（ＢｉｏＲｅｐｒｏｄ ＤＯＩ：１０．１０９５／ｂｉｏｌｒｅｐｒｏｄ．１０５．０４６８７０、Ｏｃｔｏｂｅｒ １９、２００５）は、胚性幹細胞が、胚性幹細胞自己再生を引き起こすことが可能な、異なる増殖因子を加えた未条件付け血清置換（ＳＲ）培地中で維持される、フィーダーを含まない、血清を含まない培養系を開示する。Ｌｅｖｅｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２４：５６８〜５７４，２００６）は、ｂＦＧＦを加えた培地を用いて、線維芽細胞又は条件培地のない状態での、ヒト胚性幹細胞の長期培養のための方法を開示する。米国特許第２００５／０１４８０７０号明細書は、血清なし、及び線維芽細胞フィーダー細胞なしの規定培地中、ヒト胚性幹細胞を培養する方法を開示し、本方法には、アルブミン、アミノ酸、ビタミン、ミネラル、少なくとも１つのトランスフェリン又はトランスフェリン基質、少なくとも１つのインスリン又はインスリン基質を含む培養培地中で幹細胞を培養することを含み、培養培地は、哺乳動物胎児血清を実質的に含まず、線維芽細胞増殖因子シグナル伝達受容体を活性化可能な、線維芽細胞増殖因子、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌを含み、増殖因子が、ただ線維芽細胞フィーダー層以外の供給源から供給され、培地が、フィーダー細胞又は条件培地なしに、未分化状態で、幹細胞の増殖を支持した。

多能性幹細胞を培養し、膨張する他の好適な方法が、米国特許第２００５／０２３３４４６号明細書、同６６，８００，４８０号明細書、同２００５／０２４４９６２号明細書及び国際特許第２００５／０６５３５４号パンフレットにて開示される。米国特許第２００５／０２３３４４６号明細書は、未分化の霊長類原発幹細胞を含む、幹細胞を培養することにおいて有用な規定培地を開示している。溶液中、培地は、培養されている幹細胞と比較して実質的に等張である。該培養液中、特定の培地は、塩基培地及び原発幹細胞の実質的に未分化の増殖を支持するのに必要な量の各ｂＦＧＦ、インスリン及びアスコルビン酸を含む。米国特許第６，８００，４８０号明細書は、霊長類由来原発幹細胞を、実質的に未分化の状態で増殖させるための細胞培養培地が、霊長類由来原発幹細胞の増殖を支持するために効果的である、低浸透圧、低内毒素基礎培地を含んで提供されることを報告している。特許第６，８００，４８０号明細書は、基礎培地が、霊長類由来原発幹細胞の増殖を支持するのに効果的な栄養血清と、フィーダー細胞からなる群から選択される基質、及びフィーダー細胞由来の細胞外マトリックス成分と組み合わされることをさらに報告している。本培地はさらに、非必須アミノ酸、抗酸化剤、及びヌクレオシド及びピルビン酸塩からなる群から選択される第一増殖因子を含むと留意される。米国特許第２００５／０２４４９６２号明細書は、本開示の１つの態様が、霊長類胚性幹細胞を培養する方法を提供することと、培養中の幹細胞が、哺乳動物胎児血清を実質的に含まず（好ましくはまた任意の動物血清を実質的に含まず）、ただ線維芽細胞フィーダー層以外の供給源から供給される線維芽細胞増殖因子の存在下であることを報告している。

国際特許第２００５／０６５３５４号パンフレットは、基礎培地、ｂＦＧＦ、インスリン及びアスコルビン酸を含む実質的にフィーダーを含まず、血清を含まない、規定された等張培養培地を開示する。さらに、国際特許第２００５／０８６８４５号パンフレットは、未分化幹細胞の維持のための方法を開示し、前記方法には、幹細胞を、望む結果を達成するために十分な時間、未分化な状態に細胞を維持するのに十分な量の、タンパク質のトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）ファミリーのメンバー、タンパク質の線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリーのメンバー、又はニコチンアミド（ＮＩＣ）に曝露することが含まれる。

多能性幹細胞は、好適な培養基質上に播くことができる。１つの実施形態において、好適な培養基質は、基底膜から由来するもののような、又は、接着分子受容体−リガンド結合の部分を形成し得る、細胞外マトリックス成分である。１つの実施形態において、好適な培養基質は、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）である。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）は、室温でゲル化し、再構成基底膜を形成する、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ Ｓｗａｒｍ腫瘍細胞からの可溶性調製物である。

他の細胞外マトリックス成分及び成分混合物が、代替物として好適である。増殖させる細胞型に応じて、これは、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、エンタクチン、ヘパラン硫塩、及び同様物を、単独で又は様々な組み合わせで含み得る。

多能性幹細胞を、好適な分布で、培地の存在下、基質上にプレートしてよく、細胞生存、伝播及び望む特徴の保持を促進する。全てのこれらの特徴は、播種分布に対する注意深い注意からの利益であり、当業者によって簡単に決定されうる。好適な培養培地は、以下の成分、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹにより商標ＧＩＢＣＯ（商標）（Ｐａｒｔ番号１１９６５−０９２）の下販売されているダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹにより商標ＧＩＢＣＯ（商標）（Ｐａｒｔ番号１０８２９−０１８）の下販売されている、ノックアウトダルベッコ変法イーグル培地（ＫＯ ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２／５０％ ＤＭＥＭ基礎培地、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹにより商標ＧＩＢＣＯ（商標）（Ｐａｒｔ番号１１５０３９−０２７）の下販売されている、２００ｍＭ Ｌ−グルタミン、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹにより商標ＧＩＢＣＯ（商標）（Ｐａｒｔ番号１１１４０−０５０）の下販売されている非必須アミノ酸溶液、β−メルカプトエタノール、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＬＬＣ Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯにより販売されている（Ｐａｒｔ番号７５２２）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹにより商標ＧＩＢＣＯ（商標）（Ｐａｒｔ番号１３２５６−０２９）の下販売されているヒト組換え体塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）から作製されて良い。

多能性幹細胞の分化
多能性幹細胞は、β細胞に向かって分化するにつれ、それぞれが、特定のマーカーが存在する、又は存在しないことによって特徴付けられて良い、種々のステージを通して分化する。これらのステージへの細胞の分化は、圧力、又は培養培地に加えた特定の因子の欠如を含む、特定の培養条件によって達成される。一般に、本分化は、多能性幹細胞の、胚体内胚葉への分化を含んでよい。これらの胚体内胚葉細胞は次いで、腸管細胞にさらに分化し、続いて前腸内胚葉細胞に分化してよい。前腸内胚葉細胞は、膵臓前腸前駆細胞に分化してよく、これは続いて、膵臓内胚葉細胞、膵臓内分泌前駆細胞又は両方に分化可能である。これらの細胞は次いで、（β細胞のような）膵臓ホルモン産出細胞に分化してよい。

本発明は、（Ｔ３、Ｔ３の類似体、Ｔ４、Ｔ４の類似体、又はそれらの組合せ（合わせて本明細書以下「Ｔ３／Ｔ４」と呼ぶ）のような）甲状腺ホルモンと、ＡＬＫ５阻害剤を用いる、膵臓内分泌細胞への、多能性肝細胞のステージ化分化を提供する。本発明はまた、（Ｔ３／Ｔ４のような）甲状腺ホルモン又はＡＬＫ５阻害剤を用いて、膵臓内分泌細胞への、多能性幹細胞のステージ化分化を提供する。好適な甲状腺ホルモン類似体としては、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．カタログ番号＃４５５４から入手可能なＧＣ−１（Ｓｏｂｅｒｔｉｒｏｍｅ）、ＤＩＴＰＡ（３，５−ジヨードチロプロピオン酸）、Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００８，１１１：２６２〜２６７及びＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ２００３，１００：１００６７〜１００７２にて議論されるＫＢ−１４１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ２００７，１０４：１５４９０〜１５４９５にて議論されるＭＢ０７３４４、ＰＬｏＳ Ｏｎｏ，２０１０，５ｅ８７２２及びＪ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．２００９，５０：９３８〜９４４にて議論されるＴ０６８１、及びＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２０１０ ｅ８７２２及びＥｎｄｏｃｒ Ｐｒａｃｔ．２０１２，１８（６）：９５４〜９６４にて議論されるＧＣ−２４が挙げられ、これらの開示はその全てが参照により本明細書に組み込まれている。有用なＡＬＫ５阻害剤としては、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（Ｅｎｚｏ，Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）、ＡＬＫ５ｉ（Ａｘｘｏｒａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＳＤ２０８（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ（ＭＮ））、ＴＧＦ−Ｂ阻害剤ＳＢ４３１５４２（Ｘｃｅｓｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ））、ＩＴＤ−１（Ｘｃｅｓｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ））、ＬＹ２１０９７６１（Ｘｃｅｓｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ））、Ａ８３−０１（Ｘｃｅｓｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ））、ＬＹ２１５７２９９（Ｘｃｅｓｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ））、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ Ｖ（ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ Ｉ（ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ ＩＶ（ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ ＶＩＩ（ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ ＶＩＩＩ（ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ ＩＩ（ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ ＶＩ（ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ ＩＩＩ（ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）が挙げられる。

多能性幹細胞の、膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞への分化
多能性幹細胞の特徴は当業者に公知であり、多能性幹細胞の更なる特徴は、継続して同定されている。多能性幹細胞マーカーとしては、例えば、以下の、ＡＢＣＧ２、クリプト、ＦＯＸＤ３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４５、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０及びＴＲＡ−１−８１の１つ又は２つ以上の発現が含まれる。

例示多能性幹細胞としては、ヒト胚性幹細胞株Ｈ９（ＮＩＨコート：ＷＡ０９）、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（ＮＩＨコード：ＷＡ０１）、ヒト胚性幹細胞株Ｈ７（ＮＩＨコード：ＷＡ０７）、及びヒト胚性幹細胞株ＳＡ００２（Ｃｅｌｌｒｔｉｓ，Ｓｅｗｄｅｎ）が挙げられる。また、以下の多能性細胞に特徴的なマーカー、ＡＢＣＧ２、クリプト、ＣＤ９、ＦＯＸＤ３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４５、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０及びＴＲＡ−１−８１の少なくとも１つを発現する細胞が好適である。

胚体内胚葉系統に特徴的なマーカー、少なくとも１つを発現している細胞が、本発明における使用のためにまた好適である。本発明の１つの実施形態において、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、霊長類原始線条前駆細胞である。他の実施形態において、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、中胚葉細胞である。他の実施形態において、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、胚体内胚葉細胞である。

また、少なくとも１つの膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現している細胞が、本発明における利用のために好適である。本発明の１つの実施形態において、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１の発現が、ＣＤＸ２及びＳＯＸ２の発現より実質的に高い、膵臓内分泌細胞である。ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１の発現が、ＣＤＸ２又はＳＯＸ２の発現よりも少なくとも２倍高い細胞がとりわけ有用である。

１つの実施形態において、膵臓内分泌細胞は、以下のホルモン：インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン又は膵臓ポリペプチドの少なくとも１つを発現可能な膵臓内分泌細胞が製造される。膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを少なくとも１つ発現している前駆細胞が、本発明における利用のために好適である本発明の１つの好ましい実施形態において、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内分泌細胞である。好ましい実施形態において、膵臓内分泌細胞は、インスリン産出β細胞である。

本発明の特定の実施形態において、膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に到着するために、多能性幹細胞、又は人工多能性幹細胞、好ましくは多能性幹細胞で開始するプロトコールを使用する。本プロトコールは、以下のステージを含む。
ステージ１：細胞培養株から得た、胚性幹細胞のような、多能性幹細胞を、適切な因子で処理して、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞への分化を誘導する。
ステージ２：ステージ１からの細胞を、適切な因子で処理して、腸管細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞へのさらなる分化を誘導する。
ステージ３：ステージ２からの細胞を、適切な因子で処理して、前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞へのさらなる分化を誘導する。
ステージ４：ステージ３からの細胞を、（特定の実施形態において、Ｔ３／Ｔ４を含む）適切な因子で処理して、膵臓前腸前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞へのさらなる分化を誘導する。
ステージ５：ステージ４からの細胞を、（特定の実施形態において、（ｉ）Ｔ３／Ｔ４、（ｉｉ）ＡＬＫ５阻害剤、又は（ｉｉｉ）Ｔ３／Ｔ４及びＡＬＫ５阻害剤両方を含む）適切な因子で処理して、膵臓内胚葉／内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞へのさらなる分化を誘導する。
ステージ６：ステージ５からの細胞を、（特定の実施形態において、Ｔ３／Ｔ４、ＡＬＫ５阻害剤、又は両方を含む）適切な因子で処理して、膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞へのさらなる分化を誘導する。

特定の実施形態において、本発明は、膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に、多能性幹細胞を分化させることを包含する一方で、本発明はまた、膵臓内分泌細胞に向かう他の中間ステージからの結果である細胞を分化することを包含する。特に、本発明は、膵臓前腸前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞の、膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞への分化を包含する。さらに、工程が分離ステージで記述されるけれども、分化工程を通した細胞の処理並びに工程は、連続性又は持続性であってよい。

培養又は単離された細胞中のタンパク質及び核酸マーカーの発現を評価する方法は、当該技術分野にて標準的である。これらの方法としては、ＲＴ−ＰＣＲ、ノザンブロット、インサイチューハイブリッド形成（例えばＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ｌ．，ｅｄｓ．２００１補遺を参照）、及び免疫アッセイ（切断材料の免疫染色化学解析のような、ウエスタンブロッティング、及び無傷細胞中でアクセス可能なマーカーに対する、フローサイトメトリ解析（ＦＡＣＳ）（例えばＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈｒｂｏｒ Ｌｂｏｒｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９８）を参照）免疫アッセイが挙げられる。さらに、分化の効率は、対象の細胞型に特徴的なマーカーを発現している細胞によって発現されたタンパク質マーカーを特異的に認識する（抗体のような）薬剤へ、処理した細胞集団を曝露することによって決定されてよい。

分化細胞をまた、さらに精製しても良い。例えば、多能性幹細胞を、本発明の方法で処理した後、分化した細胞を、処理した細胞集団を、精製している分化細胞によって特徴的に発現されたタンパク質マーカーを特異的に認識する（抗体のような）薬剤に曝露することによって精製してよい。
ステージ１：多能性幹細胞の、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞への分化

多能性幹細胞は、当該技術分野で公知の任意の好適な方法によって、又は本発明で提案される任意の方法によって、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させてよい。多能性幹細胞を、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させるための好適な方法は、多能性幹細胞、及び胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞への多能性幹細胞の分化に関するとして、その全てが参照により組み込まれている、米国特許第２００７／０２５４３５９号明細書、米国特許第２００９／０１７０１９８号明細書、米国特許第２００９／０１７０１９８号明細書、米国特許第２０１１／００９１９７１号明細書、米国特許第２０１０／００１５７１１号明細書、米国特許第２０１０／００１５７１１号明細書、米国特許第２０１２／０１９０１１１号明細書、米国特許第２０１２／０１９０１１２号明細書、米国特許第２０１２／０１９６３６５号明細書、米国特許第２０１０００１５７１１号明細書、米国特許第２０１２／０１９０１１１号明細書、米国特許第２０１２／０１９０１１２号明細書、米国特許第２０１２／０１９６３６５号明細書、米国特許第２０１０００１５７１１号明細書、米国特許第２０１２／０１９０１１１号明細書、米国特許第２０１２／０１９０１１２号明細書、米国特許第２０１２／０１９６３６５号明細書、米国特許仮出願第６１／０７６，９００号明細書、米国特許仮出願第６１／０７６，９０８号明細書、及び米国特許仮出願第６１／０７６，９１５号明細書に開示されている。

本発明の１つの実施形態において、多能性幹細胞を、アクチビンＡ及びＷｎｔ３Ａを補充した培地で処理し、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞の発生とする。処理は、多能性幹細胞を、約５０ｎｇ／ｍｌ〜約１５０ｎｇ／ｍｌ、あるいは約７５ｎｇ／ｋｍｌ〜約１２５ｎｇ／ｍｌ、あるいは約１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを含む培地と接触させることを含んでよい。処理はまた、細胞を、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約５０ｎｇ／ｍｌ、あるいは約１５ｎｇ／ｍｌ〜約３０ｎｇ／ｍｌ、あるいは約２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３Ａと接触させることを含んでよい。多能性細胞を、およそ２〜５日間、好ましくは２〜３日間培養して、それらの胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞への分化を促進してよい。１つの実施形態において、細胞を、アクチビンＡとＷｎｔ３の存在下で１日培養し、続いてアクチビンＡ（Ｗｎｔ３Ａが存在せず）の存在下、残りの時間培養する。

本発明の他の実施形態において、多能性幹細胞を、増殖分化因子８（「ＧＦＤ８」）と（その全てが参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第２０１０／００１５７１１号明細書にて開示される環状アニリン−ピリジノトリアジン化合物のような）グルカゴンシンターゼキナーゼ−３β（「ＧＳＫ３β」）阻害剤を補充した培地で処理して、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞への分化を誘導する。好ましいＧＳＫ３β阻害剤は、本明細書で（「ＭＣＸ化合物」）と呼ぶ、１４−プロパ−２−エン−１−イル−３，５，７，１４，１７，２３，２７−ヘプタアザテトラシクロ［１９．３．１．１〜２，６〜．１〜８，１２〜］ヘプタコサ−１（２５）、２（２７）、３，５，８（２６）、９，１１，２１，２３−ノネン−１６−オンである。処理は、多能性幹細胞を、約５０ｎｇ／ｍｌ〜約１５０ｎｇ／ｍｌ、あるいは約７５ｎｇ／ｋｍｌ〜約１２５ｎｇ／ｍｌ、あるいは約１００ｎｇ／ｍｌのＧＤＦ８を補充した培地と接触させることを含んでよい。処理はまた、細胞を約０．１〜５μＭ、あるいは約０．５〜約２．５μＭ、好ましくは約１μＭのＭＣＸ化合物と接触させることを含んでもよい。多能性幹細胞を、およそ２〜５日間、好ましくは約３〜４間培養し、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞へのそれらの分化を促進してよい。１つの実施形態において、細胞を、ＧＤＦ８とＭＣＸ化合物の存在下、１日培養し、続いて、ＧＤＦ８と低濃度のＭＣＸ化合物の存在下、１日培養し、続いて、ＧＤＦ８の存在下、ＭＣＸ化合物のない状態で１日培養してよい。特に、細胞を、ＧＤＦ８と約１μＭのＭＣＸ化合物の存在下で１日培養し、続いてＧＤＦ８と約０．１μＭのＭＣＸ化合物の存在下で１日培養し、続いてＧＤＦ８の存在下、ＭＣＸ化合物のない状態で、１日培養してよい。他の実施形態において、細胞を、ＧＤＦ８と約１μＭのＭＣＸ化合物の存在下、１日培養し、続いて、ＧＤＦ８と、約０．１μＭ ＭＣＸ化合物の存在下、１日培養する。

胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞の発生は、特定のプロトコールに従う前、及び後に、マーカーの存在に関して試験することによって決定してよい。多能性幹細胞は、典型的にはそのようなマーカーを発現しない。したがって、多能性細胞の分化は、細胞が、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現し始めた時に検出可能である。
ステージ２：胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している、腸管細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞への分化

胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を、腸管細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞へさらに分化してよい。１つの実施形態において、腸管細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞の形成には、胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現している細胞を、線維芽細胞増殖因子（「ＦＧＦ」）７又はＦＧＦ１０を含む培地で培養して、これらの細胞を分化させることが含まれる。例えば、培養培地には、約２５ｎｇ／ｍｌ〜約７５ｎｇ／ｍｌ、あるいは約３０ｎｇ／ｍＬ〜約６０ｎｇ／ｍｌ、あるいは約５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ７又はＦＧＦ１０、好ましくはＦＧＦ７を含んでよい。細胞を、約２〜３日、好ましくは約２日間、これらの条件下で培養してよい。

他の実施形態において、腸管細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞への分化には、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を、ＦＧＦ７又はＦＧＦ１０及びアスコルビン酸（ビタミンＣ）と培養することが含まれる。培養培地は、約０．１ｍＭ〜約０．５ｍＭアスコルビン酸、あるいは約０．２ｍＭ〜約０．４ｍＭ、あるいは約０．２５ｍＭのアスコルビン酸を含んでよい。培養培地はまた、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約３５ｎｇ／ｍｌ、あるいは約１５ｎｇ／ｍｌ〜約３０ｎｇ／ｍｌ、あるいは約２５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ７又はＦＧＦ１０、好ましくはＦＧＦ７を含んでもよい。例えば、培養培地は、約０．２５ｍＭのアスコルビン酸と約２５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ７を含んでよい。１つの実施形態において、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を、ＦＧＦ７とアスコルビン酸とで、２日間処理する。
ステージ３：腸管細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞の、前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞への分化

腸管細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞をさらに、前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化してよい。１つの実施形態において、ステージ２細胞をさらに、これらの細胞を、（シクロパミン又はＭＲＴ１０（Ｎ−［［［３−ベンゾイルアミノ）フェニル］アミノ］チオキソメチル］−３，４，５−トリメトキシベンズアミド））又はシクロパミンのような）Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ（「ＳＭＯ」）受容体阻害剤、又は（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ １（「ＳＡＮＴ−１」）（（Ｅ）−４−ベンジル−Ｎ−（（３，５−ジメチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）メチレンピペラジン−１−アミン）のような）Ｓｏｎｉｃ Ｈｅｄｇｅｈｏｇ（「ＳＨＨ」）シグナル伝達経路アンタゴニスト、又はＨｅｄｇｅｈｏｇ Ｐａｔｈｗａｙ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １（「ＨＰＩ−１」）（２−メトキシエチル１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−４（３−ヒドロキシフェニル）−７−（２−メトキシフェニル）−２−メチル−５−オキソ−３−キノリンカルボキシレート））、レチノイン酸、及びＮｏｇｇｉｎを補充した培養培地中で培養することによって、ステージ３細胞に分化させる。あるいは、培地には、ＳＭＯ阻害剤、ＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニスト、レチノイン酸及びＮｏｇｇｉｎを補充してよい。細胞を、およそ２〜４日間、好ましくは２日間培養してよい。１つの実施形態において、培地には、約０．１μＭ〜約０．３μＭのＳＡＮＴ−１、約０．５μＭ〜約３μＭのレチノイン酸及び約７５ｎｇ／ｍｌ〜約１２５ｎｇ／ｍｌのＮｏｇｇｉｎを補充する。他の実施形態において、培地には、約０．２５μＭのＳＡＮＴ−１、約２μＭのレチノイン酸及び約１００ｎｇ／ｍｌのＮｏｇｇｉｎを補充する。

他の実施形態において、ステージ２細胞を、ＦＧＦ７又はＦＧＦ１０、レチノイン酸、（ＭＲＴ１０又はシクロパミンのような）ＳＭＯ受容体阻害剤又は（ＳＡＮＴ−１又はＨＰＩ−１のような）ＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニスト、（（（２Ｓ，５Ｓ）−（Ｅ，Ｅ）−８−（５−（４−トリフルオロメチル）フェニル）−２，４−ペンタジエノイルイルアミノ）ベンゾラクタム（「ＴＰＢ」））ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）のようなタンパク質キナーゼＣ（「ＰＫＣ」）アクチベータ、ホルボール−１２，１３−ジブチルート（「ＰＤＢｕ」）、ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（「ＰＭＡ］）、又はインドラクタムＶ（「ＩＬＶ」））、（ＬＤＮ−１９３１８９、Ｎｏｇｇｉｎ又はＣｈｏｒｄｉｎのような）骨形態形成タンパク質（「ＢＭＰ」）阻害剤、及びアスコルビン酸を補充した培地で処理することによって、ステージ２細胞をさらにステージ３細胞に分化させる。他の実施形態において、培地に、ＦＧＦ７又はＦＨＦ１０、レチノイン酸、ＳＭＯ阻害剤、（ＳＡＮＴ−１のような）ＳＨＨシグナル伝達アンタゴニスト、（ＴＰＢのような）ＰＫＣアクチベータ、（ＬＤＮ−１９３１８９のような）ＢＭＰ阻害剤及びアスコルビン酸を補充してよい。細胞を、これらの増殖因子、低分子アゴニスト、及びアンタゴニストとの存在下、約２〜４日間、好ましくは約２〜３日間、培養してよい。

１つの実施形態において、培地には、約１５ｎｇ／ｍｌ〜約３５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ７、約０．５μＭ〜約２μＭのレチノイン酸、約０．１μＭ〜約０．４μＭのＳＡＮＴ−１、約１００ｎＭ〜約３００ｎＭのＴＲＢ、約５０ｎＭ〜約２００ｎＭのＬＤＮ−１９３１８９、及び約０．１５ｍＭ〜約０．３５ｍＭのアスコルビン酸を補充してよい。他の実施形態において、培地には、約２５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ７、約１μＭのレチノイン酸、約０．２５μＭのＳＡＮＴ−１、約２００ｎＭのＴＰＢ、約１００ｎＭのＬＤＮ−１９３１８９、及び約０．２５ｍＭのアスコルビン酸を補充する。
ステージ４〜６：甲状腺ホルモンＴ３／Ｔ４又はＡＬＫ５阻害剤、又はＴ３／Ｔ４及びＡＬＫ５阻害剤両方を補充した培養培地での処理による、前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞の、膵臓内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞への分化。

本発明は、甲状腺ホルモンＴ３／Ｔ４又はＡＬＫ５阻害剤、又はＴ３／Ｔ４及びＡＬＫ５阻害剤両方を補充した培養培地での処理による、前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞のさらなる分化を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、１つ以上のこれらのステージにて、（ａ）Ｔ３、（ｂ）ＡＬＫ５阻害剤、又は（ｃ）Ｔ３とＡＬＫ５阻害剤両方を補充した培養培地での処理による、ステージ４〜ステージ６でのそのような細胞の更なる分化を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、以下
ａ．多能性幹細胞を培養することと、
ｂ．多能性幹細胞を、前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化することと、
ｃ．（ｉ）Ｔ３／Ｔ４、（ｉｉ）ＡＬＫ５阻害剤、又は（ｉｉｉ）Ｔ３／Ｔ４とＡＬＫ５阻害剤両方を補充した培地での処理によって、前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を、多能性幹細胞からの膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化すること、とを含む、多能性幹細胞からの膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を製造するための方法を提供する。

１つの実施形態において、膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞は、β細胞である。他の実施形態において、得られた細胞は、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１及びＨＢ−９に対して陽性である。本方法は、ＮＫＸ６．１陽性膵臓内胚葉前駆細胞中のＨＢ陽性細胞の数を増強してよい。本方法はまた、ＮＫＸ２．２又はＳＯＸ２、又は両方の発現、並びにアルブミン発現も減少させて良い。本方法はまた、Ｔ３／Ｔ４を補充した培地中の、膵臓内胚葉／内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を培養することによって、β細胞を含む、膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞も提供してよい。多能性幹細胞から、膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を製造する方法は、表Ｉ〜ＩＩＩにて示した、又は本明細書で記述した培養条件を利用してよい。１つの実施形態において、ＡＬＫ５阻害剤は、ＳＤ２０８（（２−（５−クロロ−２−フルオロフェニル）プテリジン−４−イル］ピリジン−４−イルーアミン）である。他の実施形態において、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（（２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジン）、ＡＬＸ−２７０−４４５、ＥＮＺＯ、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）も使用可能である。

Ｔ３／Ｔ４、ＡＬＫ５阻害剤、又は両方を補充した培養培地での、ステージ４〜６の細胞の処理は、種々の利点を提供する。例えば、ステージ４〜ステージ６での甲状腺ホルモンの添加は、グルカゴン、ソマトスタチンオ及びグレリンを有意にダウンレギュレートし、一方でステージ５にて、インスリン発現を穏やかに増加させる。ステージ４〜６でのＴ３／Ｔ４の添加はまた、ＮＫＸ２．２の発現を有意に減少させるように見え、一方でＮＫＸ６．１及びＰＤＸ１発現には影響がない。さらに、ステージ４〜６のＴ３／Ｔ４添加が、ＳＯＸ２（胃マーカー）とアルブミン（肝臓マーカー）発現を抑制し、一方でＣＤＸ２（腸マーカー）発現に影響を与えない。さらに、未処理対照と比較して、ステージ４でのＴ３での処理は、ステージ６でのＨＢ９陽性細胞の数を増加させる。さらに、Ｔ３処理は、ＨＢ９を発現するＮＫＸ６．１陽性細胞の数の増加をもたらした。ＡＬＫ５阻害剤とＴ３／Ｔ４両方への遅延性曝露は、ＮＫＸ６．１の強い発現を維持する一方で、ＨＢ９の発現を有意に増強するように見える。培養培地へのＴ３／Ｔ４の封入は、用量依存様式で、ＮＫＸ６．１陽性膵臓内胚葉前駆細胞中の、ＨＢ９陽性細胞の数を有意に増強するように見える。

したがって、特定の実施形態において、本発明は、少なくとも甲状腺ホルモンＴ３／Ｔ４を補充した培地での処理によって、ステージ４〜ステージ６にて提供された分化した細胞中のグルカゴン、ソマトスタチン及びグレリンをダウンレギュレートする方法を提供する。さらに、本発明はまた、少なくとも甲状腺ホルモンＴ３／Ｔ４を補充した培地での処理によって、ＮＫＸ６．１とＰＤＸ１を発現する、ステージ４〜ステージ６にて提供された分化した細胞中のＮＫＸ２．２発現を減少させる方法を提供する。さらに、本発明は、甲状腺ホルモンＴ３／Ｔ４と、任意にＡＬＫ５阻害剤を有する培地中で培養することによって、ＨＢ９を発現しているＮＫＸ６．１陽性細胞を増やすための方法を提供する。特定の実施形態において、本方法は、表Ｉ〜ＩＩＩにて示した培養条件を使用する。

本発明の１つの実施形態は、甲状腺ホルモンＴ３／Ｔ４、ＡＬＫ５阻害剤、又は（Ｔ３とＡＬＫ５阻害剤のような）両方を補充した培地での処理によって、前腸内胚葉に特徴的なマーカーを発現している細胞を、β細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞へ分化させることを含む、β細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を形成する方法である。得られる細胞は、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１及びＨｂ−９に対して陽性である。本方法は、ＮＫＸ６．１陽性膵臓内胚葉前駆細胞中、ＨＢ９陽性細胞の数を増強するために使用してよい。本方法はまた、ＮＫＸ２．２の発現を減少させるために使用してもよい。さらに、本方法は、ＳＯＸ２とアルブミン発現を抑制するために使用してもよい。甲状腺ホルモンは、Ｔ３であってよい。本方法はまた、Ｔ３及びＡＬＫ５阻害剤を補充した培地で培養されない細胞と比較して、ＨＢ９発現を増強するために使用してもよい。さらに、本方法は、膵臓内胚葉／内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を、Ｔ３．Ｔ４を補充した培地中で培養することによって、β細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞の形成を含む。本発明は、本明細書で記述した表Ｉ〜ＩＩＩにて示した、又は本明細書で記述した培養条件を使用してよい。

本発明のまた他の実施形態は、Ｔ３／Ｔ４及びＡＬＫ５阻害剤を補充した培地中で細胞を培養することによって、膵臓前腸前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞、膵臓内胚葉／内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞、又は膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞内の、グルカゴン、ソマトスタチン及びグレリンをダウンレギュレートする方法である。培地にさらに、ＳＭＯ阻害剤、（ＳＡＮＴ−１のような）ＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニスト、レチノイン酸及びアスコルビン酸を補充してよい。あるいは、培地にさらに、ＳＭＯ阻害剤又はＳＨＨシグナル経路アンタゴニスト、レチノイン酸及びアスコルビン酸を補充してよい。とりわけステージ４にて使用した時に、培地に好ましくはＦＧＦ７を補充してよい。特定の実施形態において、本方法は、表Ｉ〜ＩＩＩにて示した、又は本明細書で記述した培養条件を使用する。

とりわけ、特定の実施形態において、細胞を、本発明の方法での使用のために好適な例示培養条件を示す、以下の表Ｉにて概略を示したように、ステージ４〜ステージ６（すなわちステージ４とステージ５とステージ６にて、又はステージ４とステージ５にて、又はステージ５とステージ６にて、又はステージ４とステージ６にて）処理してよい。特定の実施形態において、１つのステージ（例えばステージ４）での任意の１つの処理を、他のステージ（例えばステージ５）での任意の１つの処理と組み合わせて良い。（例えばステージ４）は、他のステージ（例えばステージ５）での任意の１つの処理と組み合わせてよい。

他の実施形態において、本発明は、多能性幹細胞から由来する細胞を、膵臓内分泌β細胞に特徴的なマーカー、並びにＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１及びＨＢ９を発現している細胞へ分化させるための、インビトロ細胞培養液を提供する。本細胞培養液は培養容器と、分化培地と、多能性幹細胞から由来した分化した細胞の集団と、を含む。本細胞培養液は、分化した細胞の集団を提供し、そこで、少なくとも１０％の分化した細胞がＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１及びＨＢ９を発現する。本細胞培養液中で有用な培地が、表Ｉ〜ＩＩＩにて列記されており、好ましくは、Ｔ３／Ｔ４又はＡＬＫ５阻害剤、又は両方を含む。

Ｔ３が一般に好ましい一方で、他の甲状腺ホルモンを、Ｔ３の代わりに使用してよい。特に、Ｔ４を、Ｔ３、並びにＴ３とＴ４の好適な類似体の代わりに使用してよい。好適な甲状腺ホルモン類似体としては、Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．カタログ番号４５５４から入手可能なＧＣ−１（Ｓｏｂｅｒｔｉｒｏｍｅ）、ＤＩＴＰＡ（３，５−ジヨードチロプロピオン酸）、Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００８，１１１：２６２〜２６７及びＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ２００３，１００：１００６７〜１００７２にて議論されるＫＢ−１４１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ２００７，１０４：１５４９０〜１５４９５にて議論されるＭＢ０７３４４、ＰＬｏＳ Ｏｎｏ，２０１０，５ｅ８７２２及びＪ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ ２００９，５０：９３８〜９４４にて議論されるＴ０６８１、及びＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２０１０ ｅ８７２２及びＥｎｄｏｃｒ．Ｐｒａｃｔ．２０１２，１８（６）：９５４〜９６４にて議論されるＧＣ−２４が挙げられ、これらの開示はその全てが本明細書にて参照により組み込まれている。Ｔ３、ＡＬＫ５阻害剤、ＳＡＮＴ−１、レチノイン酸、アスコルビン酸、ＦＧＦ７、ＬＤＮ−１９３１８９及びＴＰＢは、各ステージで変化してよい。これらの成分の例示好適な範囲を、以下表ＵＩＩで示す。

１つの実施形態において、本発明の方法には、前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を、ＳＡＮＴ−１、レチノイン酸（「ＲＡ」）、ＦＧＦ７、ＬＤＮ−１９３１８９、アスコルビン酸及びＴＰＢを補充した培地で、２〜４日間、好ましくは約３日間、処理して、それらを、膵臓前腸前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化することを含む。特に、ステージ３細胞を、約０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１、約１００ｎＭ ＲＡ、約２ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ７、約１００ｎＭ ＬＤＮ−１９３１８９及び約０．２５ｍＭアスコルビン酸、及び約１００ｎＭ ＴＰＢを補充した培地で、３日間処理してよい。１つの実施形態において、培地にさらに、約１μＭのＴ３のような、Ｔ３を補充する。他の実施形態において、培地に、約１μＭ ＡＬＫ５阻害剤のような、ＡＬＫ５阻害剤を補充してよい。

他の実施形態において、本発明の方法には、膵臓前腸前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を、ＳＡＮＴ−１、ＲＡ、アスコルビン酸及びＡＬＫ５阻害剤を補充した培地で、約２〜３日間処理して、この細胞を、膵臓内胚葉／内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させることが含まれる。特定の実施形態において、培地にはさらにＴ３を補充してよい。１つの実施形態において、約０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１、約５０ｎＭ ＲＡ、約０．２５ｍＭアスコルビン酸及び約５００ｎＭ ＡＬＫ５阻害剤を補充した培地で細胞を処理することによって、ステージ４細胞が、ステージ５細胞まで分化する。他の実施形態において、ステージ４細胞はさらに、約０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１、約５０ｎＭ ＲＡ、約０．２５ｍＭアスコルビン酸、約１μＭ ＡＬＫ５阻害剤及び０〜１０００（例えば、１００）ｎＭ Ｔ３／Ｔ４を補充した培地で細胞を、約２〜４日間、好ましくは約３日間、処理することによって、ステージ５細胞まで分化する。１００）ｎＭ Ｔ３／Ｔ４を補充した培地で細胞を、約２〜４日間、好ましくは約３日間、処理することによって１つの実施形態において、本明細書の実施形態にしたがって誘導したステージ４細胞を使用し、ステージ５細胞まで分化させ、一方他の実施形態において、他のプロトコールにしたがって誘導したステージ４細胞を使用してよい。

本発明の１つの実施形態において、膵臓内胚葉／内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を、ＳＡＮＴ−１、ＲＡ、アスコルビン酸及び（１）Ｔ３／Ｔ４又は（２）Ｔ３／Ｔ４とＡＬＫ５阻害剤いずれかを補充した培地で、約２〜４日間、好ましくは約３日間、これらを処理することによって、膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる。例えば、ステージ５細胞を、約０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１、約５０ｎＭ ＲＡ、約０．２５ｍＭアスコルビン酸、及び約１μＭのＴ３／Ｔ４を補充した培地での、３日間の処理によって、ステージ６細胞まで分化させてよい。あるいは、ステージ５細胞を、約０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１、約５０ｎＭ ＲＡ、約０．２５ｍＭアスコルビン酸、約５００ｎＭ ＡＬＫ５阻害剤及び１０ｎＭ Ｔ３／Ｔ４を補充した培地での、約３日間の処理によって、ステージ６細胞まで分化させてよい。あるいは、ステージ５細胞を、約０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１、約５ｎ０ｎＭ ＲＡ、約０．２５ｍＭアスコルビン酸、約１μＭ ＡＬＫ５阻害剤及び０〜１０００ｎＭ Ｔ３／Ｔ４を補充した培地での、約３日間の処理によって、ステージ６細胞に分化させてよい。細胞をさらに、望むように、例えば合計約１５日間、そのような培地中で培養してよい。

１つの実施形態において、本発明の実施形態にしたがって誘導したステージ５細胞を使用し、ステージ６細胞に分化させ、一方他の実施形態において、他のプロトコールにしたがって誘導したステージ５細胞を使用してもよい。

本発明の１つの態様は、Ｔ３／Ｔ４又はＡＬＫ５阻害剤、又はその組合せを含む培地中、ステージ４〜ステージ６細胞を処理することによって、ＨＢ９の発現を増強する方法を提供する。ステージ４、ステージ５及びステージ６細胞は、それぞれ、膵臓前腸前駆細胞、膵臓内胚葉／内分泌前駆細胞、及び膵臓内分泌細胞であってよい。いくつかの実施形態において、処理した細胞集団は、未処理培養液の少なくとも２倍のＨＢ９タンパク質を発現する。他の実施形態において、インスリンの発現レベルは、未処理培養液と比較して、処理培養液中で正に影響を受ける。しかしながら、ソマトスタチン、グレリン及びグルカゴンの発現は、処理対未処理培養液で減少する。追加の実施形態において、ステージ５細胞は、ＣＤＸ２又はＳＯＸ２を実質的に発現しない。

さらなる実施形態において、本発明は、ステージ４〜ステージ６細胞を、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１及びＨＢ９タンパク質に対して陽性の膵臓内胚葉系統細胞の集団を発生させるのに十分な量のＴ３／Ｔ４又はＡＬＫ５阻害剤、又はこれらの組合せを含む培地中で培養することを含む、多能性細胞を分化する段階的方法に関する。他の実施形態において、少なくとも５％のＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１共陽性細胞が、ＨＢ９タンパク質を発現する。また他の実施形態において、少なくとも１０％のＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１共陽性細胞が、ＨＢ９タンパク質を発現する。また他の実施形態において、少なくとも２０％のＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１共陽性細胞が、ＨＢ９タンパク質を発現する。他の実施形態において、少なくとも３０％のＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１共陽性細胞が、ＨＢ９タンパク質を発現する。他の実施形態において、少なくとも４０％のＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１共陽性細胞が、ＨＢ９タンパク質を発現する。他の実施形態において、少なくとも５０％のＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１共陽性細胞が、ＨＢ９タンパク質を発現する。他の実施形態において、少なくとも６０％のＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１共陽性細胞が、ＨＢ９タンパク質を発現する。他の実施形態において、少なくとも７０％のＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１共陽性細胞が、ＨＢ９タンパク質を発現する。他の実施形態において、少なくとも８０％のＰＤＸ及びＮＫＸ６．１共陽性細胞が、ＨＢ９タンパク質を発現する。また他の実施形態において、少なくとも９０％のＰＤＸ及びＮＫＸ６．１共陽性細胞が、ＨＢ９タンパク質を発現する。他の実施形態において、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１共陽性細胞が、ＨＢ９タンパク質を発現する。

いくつかの実施形態において、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１及びＨＢ９タンパク質陽性細胞からなる膵臓内胚葉系統細胞集団を、機能的膵臓内分泌細胞へのさらなるインビボ成熟化のために、糖尿病動物へ移植する。他の実施形態において、本発明はまた、本発明の方法によって調製した、インスリン及びＮＫＸ６．１発現細胞を包含する。また他の実施形態において、本発明は、多能性幹細胞のような前駆細胞を、ＨＢ９を発現している膵臓内胚葉系統の細胞へ分化する段階的工程を包含する。本発明の方法は、１つ又は２つ以上のこれらの段階を含む。特に、本方法は、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞へ、多能性幹細胞を分化させる段階を包含する。本段階は、およそ３日間かかる場合がある。これらの細胞を次いで、適切な条件下で細胞を培養することによって、腸管細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる。１つの実施形態において、細胞を、およそ２日間培養する。腸管細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を次いで、前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる。この分化は、およそ２日間、細胞を培養することによって達成してよい。さらなる実施形態において、多能性幹細胞は、ヒト胚性多能性幹細胞である。

これらの細胞を次いで、膵臓前腸前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させ、続いて膵臓内胚葉／内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させてよく、次いで膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させてよい。ＨＢ９を発現している膵臓内胚葉系統細胞への分化を達成するために、膵臓前腸前駆細胞、及び膵臓内胚葉／内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を、アクチビン受容体阻害剤（好ましくはＡＬＫ５阻害剤）及び／又はＴ３／Ｔ４甲状腺ホルモンの１つ又は２つ以上と共に培養してよい。１つの実施形態において、膵臓前腸前駆細胞、及び膵臓内胚葉／内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を、Ｔ３／Ｔ４と培養する。他の実施形態において、膵臓前腸前駆細胞、及び膵臓内胚葉／内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を、アクチビン受容体阻害剤と培養する。他の実施形態において、細胞を、アクチビン受容体阻害剤と、Ｔ３／Ｔ４両方と培養する。本発明の方法は、ＨＢ９を発現している膵臓内胚葉系統の細胞へ分化可能でありうる任意の細胞に好適である。表ＩＩＩは、本発明の方法の実施形態での利用に好適な例示培養条件を図示している。以下表ＩＩＩにて使用するように、「ＭＣＸ」は、ＭＸＣ化合物であり、「ＡＡ」はアクチビンであり、「ＡＬＫ５ ｉｎｈ．」は、ＡＬＫ５阻害剤であり、「ＲＡ］はレチノイン酸であり、「Ｖｉｔ．Ｃ」はアスコルビン酸であり、「ｉｎｈ．」は阻害剤であり、「ａｃｔ」はアクチベータである。特定の実施形態において、１つのステージ（例えばステージ１、２、３、４、５又は６のいずれか１つ）での処理のいずれか１つを、他のステージ（例えば、ステージ１、２、３、４、５又は６のいずれか１つ）でのいずれか１つの処理と組み合わせて良い。

以下余白

１つの実施形態において、本発明は、ＡＬＫ５阻害剤を含む培地中の、膵臓内胚葉系統細胞の集団を培養することによる、ＨＢ９の発現を増強する方法を提供する。いくつかの実施形態において、膵臓内胚葉系統細胞の集団は、ＣＤＸ２又はＳＯＸ２を実質的に発現しない。他の実施形態において、膵臓内胚葉系統細胞の集団は、多能性細胞の段階的な分化によって得る。追加の実施形態において、多能性細胞は、ヒト胚性多能性細胞である。

１つの実施形態において、本発明は、ＡＬＫ５阻害剤を含む培地中、膵臓内胚葉系統細胞の集団を培養することによる、ＨＢ９の発現を増強する方法を提供する。いくつかの実施形態において、膵臓内胚葉系統細胞の集団を、多能性細胞の段階的分化によって得る。いくつかの実施形態において、多能性細胞は、ヒト胚性多能性細胞である。

好ましい実施形態において、本発明は、ＡＬＫ５阻害剤とＴ３を含む培地中、膵臓内胚葉系統細胞の集団を培養することによる、ＨＢ９の発現を増強する方法に関する。いくつかの実施形態において、膵臓内胚葉系統細胞の集団を、多能性細胞の段階的分化によって得る。追加の実施形態において、多能性細胞は、ヒト胚性多能性細胞である。

他の実施形態において、本発明は、十分な量のＴ３、ＡＬＫ５阻害剤又はその組合せを含む培地中でそのような細胞を処理することによる、ＰＤＸ及びＮＫＸ６．１共発現細胞中のＨＢ９の発現を増強する方法に関する。

本発明の１つの実施形態は、（ａ）多能性肝細胞を培養することと、（ｂ）多能性幹細胞を、前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化することと、（ｃ）Ｔ３／Ｔ４、又はＡＬＫ５阻害剤、又は両方を補充した培地での処理によって、前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を、β細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化することと、の段階を含む、多能性幹細胞からβ細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を製造するための方法である。得られた細胞は、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１及びＨｂ−９に対して陽性であってよい。本方法は、膵臓内胚葉前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している、ＮＫＸ６．１陽性細胞中の、ＨＢ９陽性細胞の数を増強するために使用してよい。本方法は、ＮＫＸ２．２の発現を減少させるために使用してもよい。さらに、本方法は、ＳＯＸ２及びアルブミン発現を抑制する。さらに、本方法は、インスリンを発現している細胞の収率を増加させるために使用してよい。

１つの実施形態において、Ｔ３を使用する。本方法には、Ｔ３及びＡＬＫ５阻害剤を補充した培地中で細胞を培養することが含まれてよい。本方法はまた、Ｔ３及びＡＬＫ５阻害剤を補充した培地で培養しない細胞と比較して、ＨＢ９発現を増強してよい。培地はまた、任意の１つ又は２つ以上（例えば１、２、３又は全て）のＳＭＯ阻害剤、（ＳＡＮＴ−１のような）ＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニスト、レチノイン酸及びアスコルビン酸と補充してよい。１つの実施形態において、本方法は、ＡＬＫ５阻害剤をさらに補充しても良い、Ｔ３を補充した培地中、膵臓内胚葉／内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を培養することによる、β細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を提供する。

本発明の他の実施形態は、Ｔ３／Ｔ４、ＡＬＫ５阻害剤又は両方を補充した培地での処理による、腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を、β細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞へ分化することを含む、β細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を提供する方法である。特定の実施形態において、培地にさらに、ＢＭＰ受容体阻害剤とＰＫＣアクチベータを補充する。得られた細胞は、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１及びＨｂ−９に対して好ましくは陽性である。本方法は、ＮＫＸ６．１陽性膵臓内胚葉前駆細胞中のＨＢ９陽性細胞の数を増強し、ＮＫＸ２．２の発現を減少させ、及び／又はＳＯＸ２及びアルブミン発現を抑制するために使用してよい。好ましい実施形態において、Ｔ３を使用する。本方法はまた、Ｔ３とＡＬＫ５阻害剤を補充した培地中で細胞を培養することを含んでよい。本方法はまた、Ｔ３及びＡＬＫ５阻害剤を補充した培地で培養しない細胞と比較した時に、ＨＢ９発現を増強してもよい。さらに、本方法には、Ｔ３及び任意にＡＬＫ５阻害剤を補充した培地中の膵臓内胚葉／内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を培養することによる、β細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞の形成が含まれてよい。

本発明のまた他の実施形態は、Ｔ３／Ｔ４及びＡＬＫ５阻害剤を補充した培地中、膵臓前腸前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を培養することによる、ＨＢ９発現を増加させ、ＳＯＸ２とアルブミン発現を抑制する方法である。本発明の他の実施形態は、Ｔ３／Ｔ４及びＡＬＫ５阻害剤を補充した培地中で細胞を培養することを含む、膵臓前腸前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞、膵臓内胚葉／内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞、又は内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞中の、グルカゴン、ソマトスタチン及びグレリンをダウンレギュレートする方法である。培地にはさらに、１つ又は２つ以上のＳＭＯ阻害剤、（ＳＡＮＴ−１のような）ＳＨＨシグナル伝達アンタゴニスト、レチノイン酸及びアスコルビン酸を補充してよい。１つの実施形態において、細胞は、ステージ４細胞であり、培地にさらに、ＦＧＦ７が補充される。

本発明はまた、本発明の方法によって得ることが可能な細胞、又は細胞の集団を提供する。本発明はまた、本発明の方法によって得た細胞、又は細胞の集団を提供する。

本発明は、処置方法を提供する。とりわけ、本発明は、糖尿病を患っている、又発達するリスクのある患者を処置する方法を提供する。

本発明はまた、処置方法での使用のための、本発明の方法によって得ることが可能、もしくは得た細胞又は細胞の集団を提供する。特に、本発明は、糖尿病を患っている、又は発達するリスクのある患者を処置する方法における使用のための、本発明の方法によって得ることが可能、もしくは得た細胞又は細胞の集団を提供する。

糖尿病は１型、又は２型糖尿病であってよい。

１つの実施形態において、処置法には、患者に、本発明の方法によって得た、又は得ることが可能な細胞を移植することが含まれる。

１つの実施形態において、処置方法には、例えば本明細書で記述するように、多能性幹細胞をインビトロにて、ステージ１、ステージ２、ステージ３、ステージ４、ステージ５又はステージ６細胞に分化させることと、患者に、分化した細胞を移植することと、が含まれる。

１つの実施形態において、本発明はさらに、多能性幹細胞を分化させる段階の前に、例えば、本明細書で記述したように、多能性幹細胞を培養する段階を含む。

１つの実施形態において、方法にはさらに、移植の段階の後、インビボで、細胞を分化させる段階が含まれる。

１つの実施形態において、患者は哺乳動物、好ましくはヒトである。

１つの実施形態において、細胞を、分散した細胞として移植してよく、又は肝門脈内に浸出してよいクラスタを形成してよい。あるいは細胞は、生体適合性の分解性ポリマー支持体、多孔性の非分解性デバイス内に提供されてもよく、又は宿主免疫応答から保護されるよう封入されてもよい。細胞は、レシピエント内の適切な部位内に埋め込まれてもよい。埋め込み部位としては、例えば肝臓、天然の膵臓、腎被膜下空間、網、腹膜、漿膜下空間、腸、胃、又は皮下ポケットが挙げられる。

インビボにて、移植した細胞のさらなる分化、生存又は活性を増強するために、増殖因子、抗酸化剤又は抗炎症剤のような追加因子を、細胞の投与前、同時又は後に投与可能である。これらの因子は、内在性細胞により分泌され、投与された細胞にインサイチューで曝露されてもよい。埋め込まれた細胞には、当該技術分野で既知の内因性の及び外因性の投与された増殖因子の任意の組み合わせにより、分化を誘発させることもできる。

埋め込みに使用する細胞の量は、患者の状態及び治療に対する応答を含む、いくつかの様々な因子に基づいて当業者により決定され得る。

１つの実施形態において、処置方法にはさらに、移植の前の、三次元支持体内への細胞の組込が含まれる。細胞は、患者に埋め込む前に、インビトロでこの支持体上に維持してもよい。あるいは細胞を含む支持体を、インビトロでさらに培養することなく直接患者に埋め込んでもよい。支持体は、場合により、埋め込まれた細胞の生存及び機能を亢進する少なくとも１つの医薬品を組み込んでもよい。

本文書を通して引用した発行物は、その全てが参照により本明細書に組み込まれている。本発明はさらに、以下の実施例によってさらに例示されるが、これに限定はされない。

（実施例１）
ヒト多能性細胞から由来した膵臓内胚葉集団を産出している先に発行されたプロトコールは、実質的にＨＢ９タンパク質を発現しない。
本例は、本実施例にて記述したような多能性幹細胞から由来する細胞中のＨＢ９の発現パターンの同定を指向する。ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（継代４０）を、１０μＭのＹ２７６３２（Ｒｏｃｋ阻害剤、カタログ番号Ｙ０５０３、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を補充したｍＴＥＳＲ（（登録商標））１培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｎｄａ）中のＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：３０希釈；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）−コートディッシュ上に、１×１０⁵細胞／ｃｍ²にて、単一細胞として播いた。播種４８時間後、培養液を、不完全ＰＢＳ（Ｍｇ又はＣａなしのリン酸緩衝食塩水）で洗浄した。培養液を次いで、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、６１，２０１６，２０１２にて先に記述されたように、膵臓内胚葉／内分泌前駆細胞に分化された。使用した分化プロトコールは以下のようであった。
ａ．１：３０ ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）コート表面上にプレートした未分化Ｈ１細胞の６０〜７０％コンフルエント接着培養液を、０．２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｙｔａｈ）、１００ｎｇ／ｍｌアクチビン−Ａ（ＡＡ；Ｐｅｐｒｏ−ｔｅｃｈ；Ｒｏｃｈｙ Ｈｉｌｌ，ＮＪ）及び２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充したＧＩＢＣＯ（（登録商標））ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、１日目のみ曝露した。次の２日間、細胞を、０．５％ ＦＢＳと１００ｎｇ／ｍｌ ＡＡを含むＧＩＢＣＯ（（登録商標）））ＲＰＭＩ中で培養した。
ｂ．（ａ）から得られた細胞を、２％ ＦＢＳと５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ７（Ｐｅｐｒｏ−ｔｅｃｈ）を補充したＤＭＥＭ−１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、３日間曝露した。
ｃ．（ｂ）から得られた培養液を、０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、２μＭレチノイン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１００ｎｇ／ｍｌのＮｏｇｇｉｎ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）及び１％（ｖ／ｖ）の、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹにより商標Ｂ２７（（登録商標））の下売られている栄養補助物（カタログ番号：１７５０４０４４）を補充した、ＤＭＥＭ−ＨＧ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、４日間続けた。
ｄ．（ｃ）から得られた細胞を、単層フォーマットにて、０．１μＭ ＡＬＫ５阻害剤（ＡＬＫ５ｉ；Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）、１００ｎｇ／ｍＬのＮｏｇｇｉｎ、５００ｎＭ ＴＰＢ（（２Ｓ，５Ｓ）−（Ｅ，Ｅ）−８−（５−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）−２，４−ペンタジエノイルアミノ）ベンゾラクタム、ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ ＮＪ）及び１％ Ｂ２７で補充したＤＭＥＭ−ＨＧ培地中で３日間培養した。培養の最後の日のために、細胞を５ｍｇ／ｍＬジスパーゼで５分間処理し、続いて穏やかにピペッティングして、混合し、細胞クラスタ（１００ミクロン未満）に破壊した。細胞クラスタを、使い捨てポリスチレン１２５ｍｌ Ｓｐｉｎｎｅｒ Ｆｌａｓｋ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移し、１μＭ ＡＬＫ５阻害剤、１００ｎｇ Ｎｏｇｇｉｎ及び１％ Ｂ２７を補充したＤＭＥＭ−ＨＧを含む懸濁液中、終夜８０〜１００ｒｐｍにて回転させた。

（ｄ）の最後に、ｍＲＮＡを、関連する膵臓内胚葉／内分泌遺伝子のＰＣＲ解析のために回収した。トータルＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ（（登録商標））Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ；Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で抽出し、製造業者の説明書にしたがって、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて逆転写した。ｃＤＮＡを、カスタムＴａｑｍａｎ（（登録商標））Ａｒｒａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上へ前もってロードしたＴａｑｍａｎ（（登録商標）） Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ ＭｉｘとＴａｑｍａｎ（（登録商標））Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓを用いて増幅した。データを、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて解析し、ΔΔＣｔ法（すなわち、内部標準と相関したｑＰＣＲ結果（ΔΔＣｔ＝ΔＣｔ_試料−ΔＣｔ_reference））を用いて、未分化ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞に対して標準化した。全てのプライマーは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入された。ＦＡＣＳ及び免疫蛍光解析を、先に記述された（Ｄｉａｂｅｔｅｓ，６１，２０１２６，２０１２）ように実施した。ＨＢ９抗体は、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｏｗａ，Ｉｏｗａ）から得た。実施例で使用したように、Ｙ２７６３２（（１Ｒ，４ｒ）−４−（（Ｒ）−１−アミノエチル）−Ｎ−（ピリジン−４−イル）シクロヘキサンカルボキシアミド）は、細胞透過性低分子Ｒｈｏ−関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤である。

図１Ａ〜図１Ｃは、実施例１に概要を示したように、膵臓内胚葉／内分泌前駆体に分化したヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを記述している。ＰＤＸ１（図１Ａ）、ＮＫＸ６．１（図１Ｂ）及びＨＢ９（図１Ｃ）。図１で示すように、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１及びＨＢ９の強力なｍＲＮＡ発現がこれらの培養液中で検出された。さらに、ＨＢ９のｍＲＮＡ発現が、ヒト死体小島と比較して、これらの細胞において等しいか、より高かった。しかしながら、図２にて示したように、ＰＤＸ１とＮＫＸ６．１に対する遺伝子発現データが、ＦＡＣＳ解析によって測定されるように、相当するタンパク質の高発現と一致した一方で、ＨＢ９のｍＲＮＡ発現は、ＨＢ９のタンパク質発現と不一致であった。（ｄ）の完了に続く日、すなわち５日目に、およそ１％の細胞が、ＨＢ９に対して陽性であり、一方でおよそ５０％の細胞が、ＮＫＸ６．１陽性であり、およそ９０％がＰＤＸ１陽性であった。細胞クラスタの免疫染色が又、ＦＡＣＳデータを確認した。図３Ａ〜Ｂにて示すように、有意な数のＮＫＸ６．１陽性細胞と、わずかなインスリン陽性細胞がクラスタ内に存在した。しかしながら、免疫染色によって検出されたＨＢ９陽性細胞は存在しなかった（図３Ｂ）。

（実施例２）
ステージ４〜ステージ６でのＴ３の添加は、ＨＢ９陽性細胞の数を増強する
本実施例は、ＨＢ９陽性細胞の数を有意に増強するための、ステージ４〜ステージ６でのＴ３の添加を指向する。

ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（継代４０）の細胞を、１０μＭのＹ２７６３２を補充した、ｍＴｅＳＲ（（登録商標））１培地中、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）１：３０希釈；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）−コートディッシュ上で、１×１０⁵細胞／ｃｍ²にて、単一細胞として播いた。播種４８時間後、培養液を、不完全ＰＢＳ（Ｍｇ又はＣａなしのリン酸緩衝食塩水）で洗浄した。培養液を次いで、以下に概要を記したプロトコールによって、膵臓内胚葉／内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化した。

ａ．ステージ１（３日間）幹細胞を、２％脂肪酸フリーＢＳＡ（Ｐｒｏｌｉａｎｔ、カタログ番号６８７００）、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ３１８７）、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号３５０５０−０７９）、４．５ｍＭ Ｄ−グルコース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｇ８７６９）、１００ｎｇ／ｍｌ ＧＤＦ８（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）及び１μＭ ＭＣＸ化合物を補充した、ＭＣＤＢ−１３１培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１０３７２−０１９）中で１日培養した。細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭ Ｄ−グルコース、１００ｎｇ／ｍｌ ＧＤＦ８及び０．１μＭ ＭＣＸ化合物を補充したＭＣＤＢ−１３１培地中、さらに１日培養した。細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭ Ｄ−グルコース及び１００ｎｇ／ｍｌ ＧＤＦ８を補充したＭＣＤＢ−１３１培地中、さらに１日培養した。
ｂ．ステージ２（２日間）：ステージ１細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭ Ｄ−グルコース、０．２５ｍＭアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）及び２５ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ７（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）を補充したＭＣＤＢ−１３１培地で２日間処理した。
ｃ．ステージ３（２日間）：ステージ２細胞を次いで、ＩＴＳ−ＸＧｉｂｃｏ（登録商標）Ｉｎｓｕｌｉｎ，−Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ−Ｓｅｌｅｎｉｕｍ−Ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａ）の１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１７ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）、１μＭ ＲＡ（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）、２５ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ７、０．２５ｍＭアスコルビン酸、２００ｎＭ ＴＰＢ（ＰＫＣアクチベータ、カタログ番号５６５７４０、ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）及び１００ｎＭ ＬＤＮ−１９３１８９（ＢＭＰ受容体阻害剤、カタログ番号０４−００１９、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）を補充したＭＣＤＢ−１３１培地で、２日間処理した。
ｄ．ステージ４（３日間）：ステージ３細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）の１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１７ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１、１００ｎＭ ＲＡ、２ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ７、１００ｎＭ ＬＤＮ−１９３１８９、０．２５ｍＭアスコルビン酸、１０ｎＭ Ｔ３（Ｔ６３９７，Ｓｉｇｍａ）及び１００ｎＭ ＴＰＢを補充したＭＣＤＢ−１３１培地で、３日間処理した。
ｅ．ステージ５（３日間）：ステージ４細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１５ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１、５０ｎＭ ＲＡ、０．２５ｍＭアスコルビン酸、１０ｎＭ Ｔ３、５０ｎＭ ＬＤＮ−１９３１８９、５００ｎＭ ＡＬＫ５阻害剤ＳＤ２０８を補充した、ＭＣＤＢ−１３１培地で、３日間処理した。ＳＤ２０８は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ２００７，７２：１５２−１６１に開示された、式Ｉに示した構造を有する、（２−（５−クロロ−２−フルオロフェニル）プテリジン−４−イル］ピリジン−４−イル−アミン）は、２，４−二置換プテリジンである。ＳＤ２０８は、２，４−二置換プテリジン、ＴＧＦ−βＲＩキナーゼのＡＴＰ−競合阻害剤である。

ｆ．ステージ６（３〜１５日間）：ステージ５細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１５ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１、５０ｎＭ ＲＡ、０．０２５ｍＭアスコルビン酸、５００ｎＭ ＡＬＫ５阻害剤、０．１ｎＭ Ｔ３を補充したＭＣＤＢ−１３１培地で、３日間処理した。

いくつかの培養液にて、１μＭ Ｔ３（Ｔ６３９７、Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）を、ステージ４〜６に加えた。ステージ４〜６の最後に、対照と処理した培養液を、ＦＡＣＳと免疫染色によって解析した。さらに、ｍＲＮＡを、ステージ２〜６で、対照と処理した培養液に対して回収した。

図４は、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１及びＨＢ９に対する、ステージ４（図４Ａ）、ステージ５（図４Ｂ）及びステージ６（図４Ｃ）でのＦＡＣＳデータを描写している。実施例１からのデータと一致して、ステージ４〜６で、実質的な数のＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１陽性細胞が存在したけれども、ＨＢ９の発現は非常に低かった。ステージ５にてピークとなったＨＢ９に対する発現は、ステージ６で消滅した。全体として、実施例２にて概要を記したプロトコールを用いて発生した細胞に対するＨＢ９の発現は、実施例１にて概要を記したプロトコールを用いて発生した細胞と比較してより高かった。図５Ａは、ステージ２〜６での、ヒト膵島と比較して、ＨＢ９のｍＲＮＡ発現を示す。実施例１と同様に、ステージ３〜４でのＨＢ９のｍＲＮＡ発現レベルがヒト膵島と等価であったけれども、ＨＢ９タンパク質発現がステージ４にて非常に低かった（図５Ｂ）。

図６Ａ〜６Ｊは、実施例２にて概要を説明したようにステージ４で分化し、ステージ４のみ、ステージ４〜ステージ５、又はステージ４〜ステージ６で処理した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１中の以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析んからのデータを描写する。ＮＫＸ６．１（図６Ａ）、ＰＤＸ１（図６Ｂ）、ＮＫＸ２．２（図６Ｃ）、グルカゴン（図６Ｄ）、インスリン（図６Ｅ）、ソマトスタチン（図６Ｆ）、ＣＤＸ２（図６Ｇ）、アルブミン（図６Ｈ）、ガストリン（図６Ｉ）及びＳＯＸ２（図６Ｊ）。ステージ４〜６でのＴ３の添加は、グルカゴン、ソマトスタチン及びグレリンを有意にダウンレギュレートし、一方で、ステージ５にてインスリン発現が穏やかに増加した。ステージ４〜６でのＴ３の添加は、ＮＫＸ２．２の発現を有意に減少させたように見え、一方でＮＫＸ６．１とＰＤＸ１発現に明確な影響は無かった。さらに、Ｔ３添加は、ＳＯＸ２（胃マーカー）及びアルブミン（肝マーカー）発現を抑制する一方で、ＣＤＸ２（腸マーカー）発現に影響は無かった。ステージ６での対照及び処理した培養液の免疫染色は、ステージ６での対照（図７Ａ）と比較して、Ｔ３処理群（図７Ｂ）中のＨＢ９陽性細胞の数での有意な増加を明らかにした。さらに、増加量のＮＫＸ６．１陽性細胞が、Ｔ３処理培養液中のＨＢ９の発現を示した。

（実施例３）
ステージ６でのＴ３とＡＬＫ５阻害剤での組合せ処理は、
ＨＢ９の発現を増強する本実施例は、ステージ６での培地中の、ＡＬＫ５阻害剤とＴ３の組合せが、ＨＢ９の発現を有意にブーストすることが明らかであることを実証する。

ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（継代４０）の細胞を、１０μＭのＹ２７６３２を補充した、ｍＴｅＳＲ（（登録商標））１培地中、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：３０希釈；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）−コートディッシュ上で、１×１０⁵細胞／ｃｍ²にて、単一細胞として播いた。播種４８時間後、培養液を、不完全ＰＢＳ（Ｍｇ又はＣａなしのリン酸緩衝食塩水）で洗浄した。培養液を次いで、以下に概要を記したプロトコールによって、膵臓内胚葉／内分泌系統に分化した。
ａ．ステージ１（３日間）：細胞を、２％脂肪酸フリーＢＳＡ（Ｐｒｏｌｉａｎｔ、カタログ番号６８７００）、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ３１８７）、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号３５０５０−０７９）、４．５ｍＭ Ｄ−グルコース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｇ８７６９）、１００ｎｇ／ｍｌ ＧＤＦ８（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）及び１μＭ ＭＣＸ化合物を補充した、ＭＣＤＢ−１３１培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１０３７２−０１９）中で１日間培養した。細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭ Ｄ−グルコース、１００ｎｇ／ｍｌ ＧＤＦ８及び０．１μＭ ＭＣＸ化合物を補充したＭＣＤＢ−１３１培地中、さらに１日培養した。細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭ Ｄ−グルコース及び１００ｎｇ／ｍｌ ＧＤＦ８を補充したＭＣＤＢ−１３１培地中、さらに１日培養した。
ｂ．ステージ２（２日間）：ステージ１細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭ Ｄ−グルコース、０．２５ｍＭアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）及び２５ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ７（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）を補充したＭＣＤＢ−１３１培地で２日間処理した。
ｃ．ステージ３（２日間）：ステージ２細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）の１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１７ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）、１μＭ ＲＡ（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）、２５ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ７、０．２５ｍＭアスコルビン酸、２００ｎＭ ＴＰＢ（ＰＫＣアクチベータ、カタログ番号５６５７４０、ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）及び１００ｎＭ ＬＤＮ−１９３１８９（ＢＭＰ受容体阻害剤、カタログ番号０４−００１９、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）を補充したＭＣＤＢ−１３１培地で、２日間処理した。
ｄ．図テージ４（３日間）ステージ３細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）の１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１７ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）、１００ｎＭ ＲＡ、２ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ７、１００ｎＭ ＬＤＮ−１９３１８９、０．２５ｍＭアスコルビン酸、１０ｎＭ Ｔ３（Ｔ６３９７，Ｓｉｇｍａ）及び１００ｎＭ ＴＰＢ及び１μＭ Ｔ３を補充したＭＣＤＢ−１３１培地で、３日間処理した。
ｅ．ステージ５（３日間）：ステージ４細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１５ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１、５０ｎＭ ＲＡ、０．２５ｍＭアスコルビン酸、１μＭ Ｔ３、５０ｎＭ ＬＤＮ−１９３１８９、１０００ｎＭ ＡＬＫ５阻害剤ＳＤ２０８及び１００ｎＭのＴ３を補充した、ＭＣＤＢ−１３１培地で、３日間処理した。
ｆ．ステージ６（３〜１５日間）：ステージ５細胞を、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１５ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１、５００ｎＭ ＡＬＫ５阻害剤、５０ｎＭ ＲＡ、０．２５ｍＭアスコルビン酸、及び１０ｎＭ Ｔ３を補充した、ＭＣＤＢ−１３１培地で、３日間処理した。

図８Ａと８Ｂは、ステージ６、７日目でのＮＫＸ６．１とＨＢ９に対する免疫染色を描写している。図８Ｃは、実施例３にて概要を示した、ステージ６まで分化した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の、ＨＢ９の発現のリアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写する、免疫染色イメージと一緒に、ＨＢ９のｍＲＮＡ発現は、ＡＬＫ５阻害剤とＴ３への延長した曝露が、ＮＫＸ６．１の強力な発現を維持する一方で、ＨＢ９の発現を有意に増強するように見えることを示す。図９Ａ及び９Ｂは、それぞれステージ６、５日目及び１５日目でのＦＡＣＳデータを描写している。ステージ６細胞の有意な画分は、ステージ６、１５日目の培養液中、ＨＢ９の発現を示す。

（実施例４）
用量依存様式でのＴ３は、ＨＢ９の発現を増強する
本実施例は、用量依存様式でのＴ３が、ステージ６でのＮＫＸ６．１の発現を維持する一方で、ＨＢ９の発現を増強するために使用してよいことを示す。ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（継代４０）の細胞を、１０μＭのＹ２７６３２を補充した、ｍＴｅＳＲ（（登録商標））１培地中、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）１：３０希釈；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）−コートディッシュ上で、１×１０⁵細胞／ｃｍ²にて、単一細胞として播いた。播種の４８時間後に、培養物は、不完全なＰＢＳ（Ｍｇ又はＣａを含まないリン酸緩衝生理食塩水）中で洗浄した。培養液を次いで、以下に概要を記したプロトコールによって、膵臓内胚葉／内分泌前駆細胞の特徴であるマーカーを発現している細胞に分化した。
ａ．ステージ１（３日間）：細胞を、２％脂肪酸フリーＢＳＡ（Ｐｒｏｌｉａｎｔ、カタログ番号６８７００）、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ３１８７）、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号３５０５０−０７９）、４．５ｍＭ Ｄ−グルコース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｇ８７６９）、１００ｎｇ／ｍｌ ＧＤＦ８（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）及び１μＭ ＭＣＸ化合物を補充した、ＭＣＤＢ−１３１培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ カタログ番号１０３７２−０１９）中で１日間培養した。細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭ Ｄ−グルコース、１００ｎｇ／ｍｌ ＧＤＦ８及び０．１μＭ ＭＣＸ化合物を補充したＭＣＤＢ−１３１培地中、さらに１日培養した。細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭ Ｄ−グルコース及び１００ｎｇ／ｍｌ ＧＤＦ８を補充したＭＣＤＢ−１３１培地中、さらに１日培養した。
ｂ．ステージ２（２日間）：ステージ１細胞を次いで、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１× ＧｌｕａｔＭａｘＴＭ、４．５ｍＭ Ｄ−グルコース、０．２５ｍＭアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）及び２５ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ７（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）を補充したＭＣＤＢ−１３１培地で２日間処理した。
ｃ．ステージ３（２日間）ステージ２細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａ）の１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１７ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）、１μＭ ＲＡ（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）、２５ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ７、０．２５ｍＭアスコルビン酸、２００ｎＭ ＴＰＢ（ＰＫＣアクチベータ、カタログ番号５６５７４０、ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）及び１００ｎＭ ＬＤＮ−１９３１８９（ＢＭＰ受容体阻害剤、カタログ番号０４−００１９、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）を補充したＭＣＤＢ−１３１培地で、２日間処理した。
ｄ．ステージ４（３日間）：ステージ３細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）の１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１７ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）、１００ｎＭ ＲＡ、２ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ７、１００ｎＭ ＬＤＮ−１９３１８９、０．２５ｍＭアスコルビン酸、及び１００ｎＭ ＴＰＢを補充したＭＣＤＢ−１３１培地で、３日間処理した。
ｅ．ステージ５（３日間）：ステージ４細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１５ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１、５０ｎＭ ＲＡ、０．２５ｍＭアスコルビン酸、１μＭ ＡＬＫ５阻害剤ＳＤ２０８、及び０〜１０００ｎＭ Ｔ３を補充した、ＭＣＤＢ−１３１培地で、３日間処理した。
ｆ．ステージ６（６日間）：ステージ５細胞を次いで、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、４．５ｍＭグルコース、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１５ｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、２％脂肪酸フリーＢＳＡ、０．２５μＭ ＳＡＮＴ−１、５００ｎＭ ＡＬＫ５阻害剤、５０ｎＭ ＲＡ、０．２５ｍＭアスコルビン酸、及び０〜１０００ｎＭ Ｔ３を補充した、ＭＣＤＢ−１３１培地で、６日間処理した。

図１０Ａ〜１０Ｅは、ステージ６、６日目でのＮＫＸ６．１及びＨＢ９に対する免疫染色を描写している。用量依存様式でのＴ３は、ＮＫＸ６．１陽性膵臓内胚葉前駆細胞中の、ＨＢ９陽性細胞の数を有意に増強した。図１１Ａ〜１１Ｌは、実施例４にて概要を記したようにステージ６まで分化したヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞中の、以下の遺伝子の発現の、リアルタイムＰＣＲ解析からのデータを描写している。ＳＯＸ２（図１１Ａ）、ＮＫＸ６．１（図１１Ｂ）、ＫＮＫＸ２．２（図１１Ｃ）、ガストリン（図１１Ｄ）、ＰＤＸ１（図１１Ｅ）、ＮＧＮ３（図１１Ｆ）、ＰＡＸ６（図１１Ｇ）、ＰＡＸ４（図１１Ｈ）、インスリン（図１１Ｉ）、グルカゴン（図１１Ｊ）、グレリン（図１１Ｋ）、及びソマトスタチン（図１１Ｌ）。

以上、本発明を、様々な特定の材料、手順及び実施例を参照しながら本明細書に説明及び例示したが、本発明は、その目的のために選択された特定の材料及び手順の組み合わせに限定されない点は理解されるであろう。 当業者には認識されるように、このような細部には多くの変更を行い得ることが示唆される。 本明細書及び実施例はあくまで例示的なものとしてみなされるべきものであり、発明の真の範囲及び趣旨は以下の「特許請求の範囲」によって示されるものである。 本出願において引用される参照文献、特許及び特許出願は、いずれもそれらの全容を参照により本明細書に援用するものとする。
本発明は以下を提供する。
[１]
多能性幹細胞から膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞を産出する方法であって、
ａ．多能性幹細胞を培養することと、
ｂ．多能性幹細胞を、前腸内胚葉細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させることと、
ｃ．トリヨードチロニン、チロキシン、トリヨードチロニンの類似体、チロキシンの類似体及びその混合物から選択される甲状腺ホルモン、又はＡＬＫ５阻害剤、又は甲状腺ホルモンとＡＬＫ５阻害剤両方を補足した培地での処理によって、前腸内胚葉細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させることと、の段階を含む方法。
[２]
得られる細胞の少なくとも１０パーセントが、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１及びＨＢ９に対して陽性である、請求項１に記載の方法。
[３]
ＮＫＸ６．１陽性膵臓内胚葉前駆細胞中のＨＢ９の発現を増強する、請求項１に記載の方法。
[４]
ＮＫＸ２．２の発現を減少させる、請求項１に記載の方法。
[５]
ＳＯＸ２とアルブミン発現を抑制する、請求項１に記載の方法。
[６]
前記甲状腺ホルモンがトリヨードチロニンである、請求項１に記載の方法。
[７]
段階（ｃ）が、トリヨードチロニンとＡＬＫ５阻害剤を補足した培地中で培養することを含む、請求項１に記載の方法。
[８]
トリヨードチロニンとＡＬＫ５阻害剤を補足した培地で培養されない細胞に対して、ＨＢ９発現を増強する、請求項７に記載の方法。
[９]
前記段階（ｃ）の培地にさらに、ＳＡＮＴ−１、レチノイン酸及びアスコルビン酸を補足する、請求項１に記載の方法。
[１０]
段階（ｃ）にさらに、トリヨードチロニンを補足した培地中、膵臓内胚葉／内分泌前駆細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞を培養することによる、膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞の形成が含まれる、請求項１に記載の方法。
[１１]
前記培地にさらに、ＡＬＫ５阻害剤を補足する、請求項１０に記載の方法。
[１２]
トリヨードチロニン、チロキシン、トリヨードチロニンの類似体、チロキシンの類似体及びその混合物から選択される甲状腺ホルモン、又はＡＬＫ５阻害剤、又は甲状腺ホルモンとＡＬＫ５阻害剤両方を補足した培地での処理によって、前腸内胚葉細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させることを含む、膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞を産出する方法。
[１３]
得られた細胞の少なくとも１０パーセントが、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１及びＨＢ９に対して陽性である、請求項１２に記載の方法。
[１４]
ＮＫＸ６．１陽性膵臓内胚葉前駆細胞中のＨＢ９の発現を増強する、請求項１２に記載の方法。
[１５]
ＮＫＸ２．２の発現を減少させる、請求項１２に記載の方法。
[１６]
ＳＯＸ２及びアルブミン発現を抑制する、請求項１２に記載の方法。
[１７]
前記甲状腺ホルモンが、トリヨードチロニンである、請求項１２に記載の方法。
[１８]
トリヨードチロニンとＡＬＫ５阻害剤を補足した培地中で培養することを含む、請求項１２に記載の方法。
[１９]
トリヨードチロニンとＡＬＫ５阻害剤を補足した培地で培養されない細胞と比較した時に、ＨＢ９発現を増強する、請求項１８に記載の方法。
[２０]
さらに、トリヨードチロニンを補足した培地中で、膵臓内胚葉／内分泌前駆細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞を培養することによる、膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞の形成が含まれる、請求項１２に記載の方法。
[２１]
前記培地にさらに、ＡＬＫ５阻害剤を補足する、請求項２０に記載の方法。
[２２]
前記培地にさらに、ＢＭＰ受容体阻害剤と、ＰＫＣアクチベータを補足する、請求項１２に記載の方法。
[２３]
トリヨードチロニンとＡＬＫ５阻害剤を補足する培地中、膵臓前腸前駆細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞を培養することを含む、（ａ）ＨＢ９発現を増加させ、（ｂ）ＳＯＸ２とアルブミン発現を抑制する、方法。
[２４]
トリヨードチロニンと、ＡＬＫ５阻害剤を補足した培地中で前記細胞を培養することを含む、膵臓前腸前駆細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞、膵臓内胚葉／内分泌前駆細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞、又は膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞中の、グルカゴン、ソマトスタチン及びグレリンをダウンレギュレートする方法。
[２５]
前記培地にさらに、ＳＡＮＴ−１、レチノイン酸及びアスコルビン酸を補足する、請求項２４に記載の方法。
[２６]
前記細胞が、膵臓前腸前駆細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞であり、前記培地にさらに、ＦＧＦ７を補足する、請求項２５に記載の方法。
[２７]
前記ＡＬＫ５阻害剤が、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、ＡＬＫ５ｉ、ＳＤ２０８、ＴＧＦ−Ｂ阻害剤 ＳＢ４３１５４２、ＩＴＤ−１、ＬＹ２１０９７６１、Ａ８３−０１、ＬＹ２１５７２９９、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ Ｖ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ Ｉ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ ＩＶ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ ＶＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ ＶＩＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ ＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ ＶＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ ＩＩＩからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
[２８]
前記ＡＬＫ５阻害剤が、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩである、請求項２７に記載の方法。
[２９]
前記ＡＬＫ５阻害剤が、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、ＡＬＫ５ｉ、ＳＤ２０８、ＴＧＦ−Ｂ阻害剤ＳＢ４３１５４２、ＩＴＤ−１、ＬＹ２１０９７６１、Ａ８３−０１、ＬＹ２１５７２９９、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ Ｖ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ Ｉ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ ＩＶ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ ＶＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ ＶＩＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ ＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ ＶＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ ＩＩＩからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
[３０]
前記ＡＬＫ５阻害剤が、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩである、請求項２９に記載の方法。
[３１]
前記ＢＭＰ受容体阻害剤が、ＬＤＮ−１９３１８９、Ｎｏｇｇｉｎ及びＣｈｏｒｄｉｎから選択され、前記ＰＫＣアクチベータが、ＴＰＢ、ＰＤＢｕ、ＰＭＡ及びＩＬＶから選択される、請求項２２に記載の方法。
[３２]
ａ．培養容器と、
ｂ．大量の分化培地と、
ｃ．多能性幹細胞から誘導した分化した細胞の集団であって、少なくとも１０パーセントの前記分化した細胞が、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１及びＨＢ９を共発現する、分化した細胞の集団と、を含む多能性幹細胞から誘導した細胞を分化するためのインビトロ細胞培養。
[３３]
前記分化培地が、トリヨードチロニン、チロキシン、トリヨードチロニンの類似体、チロキシンの類似体及びその混合物から選択される甲状腺ホルモン、又はＡＬＫ５阻害剤、又は甲状腺ホルモンとＡＬＫ５阻害剤両方を補足した増殖培地を含む、請求項３２に記載の細胞培養液。
[３４]
前記増殖培地が、ＭＣＤＢ１３１である、請求項３３に記載の細胞培養。
[３５]
前記分化した細胞が、膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞を含む、請求項３２に記載の細胞培養。
[３６]
前記増殖培地にさらに、１つ又は２つ以上の
ａ．ＭＲＴ１０又はシクロパミンから選択されるスムーズンド受容体阻害剤と、
ｂ．ＳＡＮＴ−１又はＨＰＩ−１から選択されるＳＨＨシグナル伝達経路アゴニストと、
ｃ．ＬＤＮ−１９３１８９、Ｎｏｇｇｉｎ又はＣｈｏｒｄｉｎから選択されるＢＭＰ受容体阻害剤と、
ｄ．ＴＰＢ、ＰＤＢｕ、ＰＭＡ及びＩＬＶから選択されるＰＫＣアクチベータと、
ｅ．ＦＧＦ７又はＦＧＦ１０から選択される線維芽細胞増殖因子と、
ｆ．レチノイン酸と、
ｇ．アスコルビン酸と、
ｈ．ヘパリンと、
ｉ．硫酸亜鉛と、が補足される、請求項３３に記載の細胞培養液。
[３７]
前記増殖培地にさらに、ＳＡＮＴ−１、レチノイン酸及びアスコルビン酸を補足する、請求項３６に記載の細胞培養液。
[３８]
膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している分化した多能性幹細胞の集団を含むインビトロ細胞培養液であって、少なくとも１０パーセントの前記細胞が、ＨＢ９、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を発現する、インビトロ細胞培養液。
[３９]
ＮＫＸ６．１とＰＤＸ１両方を発現する前記細胞の少なくとも３０パーセントが、ＨＢ９も発現する、請求項３８に記載の細胞培養液。
[４０]
ＮＫＸ６．１とＰＤＸ１両方を発現する前記細胞の少なくとも５０パーセントが、ＨＢ９も発現する、請求項３８に記載の細胞培養液。
[４１]
ＮＫＸ６．１とＰＤＸ１両方を発現する前記細胞の少なくとも８０パーセントが、ＨＢ９も発現する、請求項３８に記載の細胞培養液。
[４２]
膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している前記細胞が、インスリンを産出する、請求項１に記載の方法。
[４３]
膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している前記細胞が、インスリンを産出する、請求項１２に記載の方法。
[４４]
前記分化した細胞が、β細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞を含む、請求項３５に記載の細胞培養液。
[４５]
前記分化した細胞が、インスリンを産出する、請求項４４に記載の細胞培養液。
[４６]
トリヨードチロニン、チロキシン、トリヨードチロニンの類似体、チロキシンの類似体及びその混合物から選択される甲状腺ホルモン、又はＡＬＫ５阻害剤、又は甲状腺ホルモンとＡＬＫ５阻害剤両方を補足した増殖培地中で、多能性幹細胞から誘導した細胞を培養することを含む、膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞を産出するための方法。
[４７]
多能性幹細胞から誘導した細胞を、約３〜約９日間、前記増殖培地中で培養する、請求項４６に記載の方法。
[４８]
前記細胞を、甲状腺ホルモンを補足するが、ＡＬＫ５阻害剤は補足しない第一増殖培地中、約２〜３日間培養し、続いて、得られた細胞集団を、甲状腺ホルモンとＡＬＫ５阻害剤両方を補足した追加的増殖培地中、約３〜６日間培養する、請求項４７に記載の方法。
[４９]
前記細胞をさらに、前記甲状腺ホルモンを含むが、ＡＬＫ５阻害剤を含まない培地中、約３日間培養する、請求項４８に記載の方法。
[５０]
前記甲状腺ホルモンが、トリヨードチロニンである、請求項４８に記載の方法。
[５１]
前記ＡＬＫ５阻害剤が、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、ＡＬＫ５ｉ、ＳＤ２０８、ＴＧＦ−Ｂ阻害剤ＳＢ４３１５４２、ＩＴＤ−１、ＬＹ２１０９７６１、Ａ８３−０１、ＬＹ２１５７２９９、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ Ｖ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ Ｉ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ ＩＶ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ ＶＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ ＶＩＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ ＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ ＶＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ ＩＩＩからなる群から選択される、請求項４８に記載の方法。
[５２]
膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している前記細胞が、インスリンを発現する、請求項４６に記載の方法。
[５３]
前記細胞を、トリヨードチロニン、チロキシン、トリヨードチロニンの類似体、チロキシンの類似体及びその混合物から選択される甲状腺ホルモン、又はＡＬＫ５阻害剤、又は甲状腺ホルモンとＡＬＫ５阻害剤両方を補足した増殖培地中で培養させることを含む、多能性幹細胞又はそれより誘導した細胞の分化を介して、β細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞の収率を増加させるための方法。
[５４]
前記甲状腺ホルモンが、トリヨードチロニンである、請求項５３に記載の方法。
[５５]
β細胞の特徴的なマーカーを発現している前記細胞が、インスリンを発現する、請求項５４に記載の方法。

Claims (10)

1. ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１共発現ヒト細胞の集団中のＨＢ９の発現を増強する方法であって、
   十分な量のトリヨードチロニン（Ｔ３）とＡＬＫ５阻害剤を含む培地中でヒト細胞の集団を処理することによるものであり、
   前記ヒト細胞の集団は、膵臓前腸前駆細胞（ステージ４）、及び／又は膵臓内胚葉細胞／膵臓内分泌前駆細胞（ステージ５）、及び／又は膵臓内分泌細胞（ステージ６）を含み、
   前記ヒト細胞の集団は、ヒト多能性幹細胞の分化により得られたものである、方法。
2. 前記ヒト細胞の集団中のＮＫＸ２．２の発現を減少させる、及び／又はＳＯＸ２とアルブミン発現を抑制する、請求項１に記載の方法。
3. ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１共発現ヒト細胞の集団中のＨＢ９の発現を増強する方法であって、
   十分な量のトリヨードチロニン（Ｔ３）を含む培地中でヒト細胞の集団を処理することによるものであり、
   前記ヒト細胞の集団は、前腸内胚葉細胞を含み、
   前記ヒト細胞の集団は、ヒト多能性幹細胞の分化により得られたものである、方法。
4. 前記培地がさらに、ＳＡＮＴ−１、レチノイン酸、アスコルビン酸、ＢＭＰ受容体阻害剤、及びＰＫＣアクチベータの１つ以上で補充されている、請求項３に記載の方法。
5. 前記ＢＭＰ受容体阻害剤がＬＤＮ−１９３１８９、Ｎｏｇｇｉｎ及びＣｈｏｒｄｉｎから選択される、及び／又は前記ＰＫＣアクチベータがＴＰＢ、ＰＤＢｕ、ＰＭＡ及びＩＬＶから選択される、請求項４に記載の方法。
6. 膵臓内分泌細胞の形成が含まれ、
   前記膵臓内分泌細胞が、ＮＧＮ３、ＮｅｕｒｏＤ１、ＩＳＬ１、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４、ＡＲＸ、ＮＫＸ２．２及びＰＡＸ６の１つ以上を発現する、
   請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. （ａ）ヒト多能性幹細胞を培養する工程と、
   （ｂ）前記ヒト多能性幹細胞を（ｉ）アクチビンＡ及びＷｎｔ３Ａ、又は（ｉｉ）ＧＤＦ−８と１４−プロパ−２−エン−１−イル−３，５，７，１４，１７，２３，２７−ヘプタアザテトラシクロ［１９．３．１．１〜２，６〜．１〜８，１２〜］ヘプタコサ−１（２５）、２（２７）、３，５，８（２６）、９，１１，２１，２３−ノネン−１６−オンで処理することにより、前記ヒト多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統細胞に分化させる工程と、
   （ｃ）前記胚体内胚葉系統細胞をＦＧＦ７とアスコルビン酸で処理することにより、前記胚体内胚葉系統細胞を、腸管細胞に分化させる工程と、
   （ｄ）前記腸管細胞を（１）ＳＡＮＴ−１、レチノイン酸、及びｎｏｇｇｉｎ、又は（２）ＦＧＦ−７、レチノイン酸、ＳＡＮＴ−１、ＰＫＣアクチベータ、ＢＭＰ阻害剤、及びアスコルビン酸で処理することにより、前記腸管細胞を、前腸内胚葉細胞に分化させる工程と、
   をさらに含み、
   前記胚体内胚葉系統細胞が以下のマーカー：ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ４、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、ＯＴＸ２、グーセコイド、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９及びＭＩＸＬ１の少なくとも１つを発現し、
   前記前腸内胚葉細胞が以下のマーカー：ＰＤＸ１、ＦＯＸＡ２、ＣＤＸ２、ＳＯＸ２及びＨＮＦ４αの少なくとも１つを発現する、
   請求項１又は２に記載の方法。
8. 前記ヒト細胞の集団はヒト膵臓前腸前駆細胞を含み、
   ＳＯＸ２とアルブミン発現が、Ｔ３とＡＬＫ５阻害剤を補充した培地中での前記膵臓前腸前駆細胞の分化の間に抑制され、
   前記膵臓前腸前駆細胞がＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＨＮＦ６、ＮＧＮ３、ＳＯＸ９、ＰＡＸ４、ＰＡＸ６、ＩＳＬ１、ガストリン、ＦＯＸＡ２、ＰＴＦ１ａ、ＰＲＯＸ１及びＨＮＦ４αの１つ以上を発現する、
   請求項２に記載の方法。
9. 前記ＡＬＫ５阻害剤が、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、ＡＬＫ５ｉ、ＳＤ２０８、ＴＧＦ−Ｂ阻害剤 ＳＢ４３１５４２、ＴＴＤ−Ｉ、ＬＹ２１０９７６１、Ａ８３−０１、ＬＹ２１５７２９９、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ Ｖ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ Ｉ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ ＩＶ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ ＶＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ ＶＩＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ ＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ ＶＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ ＩＩＩからなる群から選択される、又は前記ＡＬＫ５阻害剤が、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記膵臓内分泌細胞が、インスリンを産出する、請求項１〜２、及び６〜９のいずれか１項に記載の方法。